Synthesis and Characterization of the Precursor - ETH E

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Dissertation ETH No. 15061
Synthesis and Characterization
of the Precursor of Neuropeptide Y
A dissertation submitted to the
Swiss Federal Institute of Technology Zurich
for the degree of
Doctor of Natural Sciences
presented by
Regula A,gnes von Eggelkraut-Gottanka
Apothekerin
Eberhard-Karls Universität Tübingen
born February 22, 1974
citizen of Germany
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. G. Folkers, examiner
Prof. Dr. A. G. Beck-Sickinger, co-examiner
2003
Summary
10
SUMMARY
Similar to many other hormones and neurotransmitters, neuropeptide Y (NPY)
is derived from a larger precursor molecule, the 69 amino acid pro-neuropeptide Y
(proNPY). Precursor proteins undergo a highly specific conversion process to yield
their biologically active products. As part of a finely tuned regulation network, the
biosynthesis of hormones and neuropeptides plays a major role in many
physiological and pathophysiological processes. Diseases such as diabetes,
obesity and diverse sorts of cancer could be associated with dysfunctions in the
biosynthetic pathways. The discovery of key steps opens up the possibility to
intervene specifically in these processes implying a great potential for the
development of novel therapeutic agents.
In the past decades, great advances have been made in the understanding of
biosynthesis of hormones and its regulation mechanisms (Chapter 1). A family of
mammalian proteases, the subtilisin/kexin-like prohormone convertases (PC),
could be identified to c1eave precursors at mono- or paired basic sites. The so far
known
members
PC1/3,
PC2,
furin/PACE,
PACE4,
PC4,
PC5/6
and
PC7/SPC7/LPC/PC8 show a high substrate specificity which distinguishes
between possible precursor substrates and processing sites. Distinct secondary
structure formations of the precursor in the vicinity of the basic cleavage site were
found to be important for the enzymatic recognition.
ProNPY undergoes c1eavage at a single dibasic site (Lys38_Arg 39) which is
preferably carried out by PC1/3. Further trimming by carboxypeptidase B-like
enzyme and peptidyl glycine a-amidating monooxygenase (PAM) yields amidated
. NPY and the C-terminal flanking peptide of NPY (CPON). NPY has been reported
to be involved in diverse biological functions both centrally as weil as in the
periphery. CPON is co-Iocalized with NPY, however its importance is so far
unknown.
To further investigate how prohormone convertases are involved in the proNPY
processing and how the characteristics of the proNPY substrate itself contribute to
the specific recognition by the enzyme in vivo and in vitra studies are required.
Summary
11
The aim of this work was to provide powerful tools for the detailed
characterization of proNPY which would include enzymatic cleavage assays,
amino acid replacement and structural determination studies.
Solid-phase peptide synthesis (SPPS) is the method of choice for the
incorporation of chemical modifications Iike fluorescent or biotin tags into a
molecule. Such modifications will facilitate to follow the ongoing cleavage process
in an enzymatic assay. Furthermore, amino acids can be easily exchanged by i.e.
alanine or non canonical amino acids. Altering the protein structure and function
could give new insights into structure-activity determinants and the biological role
of the NPY precursor. ProNPY with its 69 amino acids, however, is too long for the
chemical synthesis in one step by SPPS. In vitro assays have been therefore
performed on shortened proNPY analogues revealing that PC1/3 and PC2 are
responsible for the proNPY c1eavage whereas PC1/3 is superior to PC2.
Particularly arginines within the sequence were found to be crucial for the
enzymatic processing (Chapter 2). Nevertheless, since substrate length might
discriminate PC c1eavage subsequent studies require full-Iength proNPY.
The development of the native chemical Iigation (NCL) method enabled the
access to proteins of up to - 100 amino acids. In a chemoselective reaction, a
synthetic peptide/protein segment bearing aC-terminal thioester is joined to a
second synthetic peptide/protein segment containing an N-terminal cysteine
residue. A native peptide bond is obtained at the site of ligation. Up to now only a
few strategies for the Fmoc-based (Fmoc=9-fluorenylmethyloxycarbonyl) SPPS of
peptide thioesters have been reported because of the susceptibility of the thioester
linkage to strong nucleophiles such as piperidine that is used for the removal of
Fmoc groups. Moreover, these strategies either applied special agents/linkers or
caused undesirable side-reactions. A new fast, efficient and simple preparation
method remained to be established. These needs are fulfilled by the method
presented here (Chapter 3). The protected peptide acids were synthesized via
Fmoc-strategy on commercially available 2-chlorotrityl resin (CI-trityl resin),
c1eaved from the resin and the C-terminal carboxylic group was directly converted
to the corresponding thioester. After c1eavage of the side-chain protecting groups
high amounts of the thioester product were obtained. NCL of this thioester
Summary
12
segment and the C-terminal segment containing a carboxyfluorescence (CF) label
and the N-terminal cysteine yielded full-Iength proNPY analogues.
For structural investigations by means of circular dichroism (CD) and nuclear
magnetic resonance (NMR) spectroscopy the full-Iength proNPY was necessary
without alterations in the sequence. The IMPACT system (intein-mediated
purification with an affinity chitin-binding tag) was applied for the recombinant
synthesis of proNPY 1-69 (Chapter 4). The gene encoding proNPY 1-69 was
cloned in-frame into an expression vector upstream of a modified intein and a
chitin-binding domain (CBD). The fusion protein expressed in E. eoli cells could be
selectively loaded onto a chitin-column via the CBD. Fm the cleavage of the fusion
protein, the system is based on the self-splicing activity of inteins which can be
considered as protein equivalents of the RNA introns. Addition of thiol induced
intein-splicing releasing the desired full-Iength proNPY in high purity and quantity.
The first CD data indicated that proNPY is less structured than NPY but also
contains the a-helix motif. A higher structural flexibility in the part of the rnolecule
which includes the PC cleavage site is in good agreement with findings for other
precursors. The IMPACT system was furthermore compatible with isotopic labeling
of proNPY 1-69 which will be used for subsequent NMR studies. Extraordinary
high yields of 15N-labeled proNPY 1-69 could be achieved.
In order to increase the availability of various proNPY analogues the method of
expressed protein ligation (EPL) was applied (Chapter 5). EPL is based on the
principle of NCL but either one or both ligation partners are obtained
recombinantly. For the semisynthesis of proNPY analogues, two different ligation
sites have been chosen. A cysteine was incorporated instead of the naturally
occurring Ser41 or Thr55 to allow the ligation reaction between the thioester and the
. cysteine fragment. The thioester fragment was recombinantly synthesized using
the IMPACT system. With optimized conditions for the protein purification and
isolation high yields of both thioester fragments, proNPY 1-40 and 1-54, could be
accomplished.
Ligation
between the
two
thioester
fragments
and their
corresponding synthetic C-terminal counterparts resulted in the formation of five
full-Iength proNPY analogues. Two of them included a CF label in the synthetic
part, one a biotin label and two were without any label. Western blot and dotblot
analyses revealed that all five analogues are recognized by antibodies direeted
Summary
13
against NPY or against the CPON. The introduced changes disturbed neither the
recognition by the antibodies nor the binding of streptavidin demonstrating that
none of them influences significantly the protein structure. We could show that
EPL is a powerful technique for the semisynthesis of chemically modified proNPY
analogues.
The
assembly
of
the
C-terminal,
cysteine-bearing
proNPY
fragment
[C41,K68]proNPY 1-40 by SPPS, which was used for both NCL and EPL, proved to
be more difficult than expected (Chapter 5). Various approaches recommended for
overcoming difficult peptide sequences have been investigated but only the
incorporation of two pseudo-proline derivatives could lead to sufficiently pure
amounts of the proNPY fragment. Such secondary amino acid surrogates are
known to kink the peptide backbone enabling to disrupt aggregation or secondary
structure formations. Since particularly the part of the proNPY sequence adjacent
to the cleavage site caused the synthetic problems, the presence of distinct
structural features is supposed for this region.
The methods of NCL and EPL require both specific N-terminal amino acids at
the ligation site (cysteine, selenocysteine, glycine) reducing their general
applicability to protein synthesis. A novel Iigation approach was therefore
developed, the so called expressed enzymatic ligation (EEL), which combined the
advantages of recombinant thioester expression using the IMPACT system with
those of the substrate mimetic strategy (Chapter 6). The thioester group of the Nterminal fragment proNPY 1-40 was designed as a protease-specific leaving group
(carboxymethyl
mercaptan
(SCM),
carboxypropyl
mercaptan
(SCP)
or
mercaptoethanesulfonic acid (MESNA)). The Glu/Asp-specific serine protease VB
from Staphylococcus aureus could recognize the thioester group and catalyzed
the ligation step of this acyl donor component to various acyl acceptors such as
chemically modified derivatives of proNPY 41-69 and several model peptides. The
EEL strategy proved to be a novel promising approach for the semisynthesis of
chemically modified proteins. It broadens the diversity of techniques which led to
the preparation of various proNPY analogues now available for subsequent
characterization.
Zusammenfassung
14
ZUSAMMENFASSUNG
Wie viele andere Hormone und Neurotransmitter leitet sich auch Neuropeptid Y
(NPY) von einem größeren Vorläufermolekül ab, dem 69 Aminosäure langen ProNeuropeptid Y (ProNPY). Vorläuferproteine unterliegen einem hochspezifischen
Umwandlungsprozess, durch welchen deren biologisch aktive Produkte entstehen.
Die Biosynthese von Hormonen und
Neuropeptiden ist Teil eines fein
abgestimmten Regulationsnetzwerks und spielt daher eine wichtige Rolle bei
vielen physiologischen und pathophysiologischen Vorgängen. Krankheiten wie
Diabetes,
Obesitas
und
verschiedene
Tumorerkrankungen
konnten
mit
Dysfunktionen in biosynthetischen Stoffwechselwegen in Verbindung gebracht
werden. Die Entdeckung von Schlüsselschritten eröffnet die Möglichkeit spezifisch
in solche Prozesse eingreifen zu können und impliziert daher ein großes Potential
für die Entwicklung neuer Therapeutika.
In den letzten Jahrzehnten wurden große Fortschritte erzielt in der Aufklärung
der Biosynthese der Hormonvorläufer und deren Regulationsmechanismen
(Kapitel 1). Eine Familie von Säugetierproteasen, die Subtilisin/Kexin-ähnlichen
Prohormon-Convertasen (PC), konnte bestimmt werden, die Vorläuferproteine an
mono- oder gepaarten basischen Stellen zu spalten. Die bislang bekannten
Mitglieder PC1/3, PC2, furin/PACE, PACE4, PC4, PC5/6 and PC7/SPC7/LPC/PC8
zeigen eine hohe Substratspezifität, die zwischen möglichen Vorläufersubstraten
und Prozessierungsstellen unterscheidet. Bestimmte Sekundärstrukturen des
Vorläuferproteins in der Umgebung der basischen SpaltsteIle konnten als
bedeutend für die Enzymerkennung identifiziert werden.
ProNPY wird an einer einzelnen dibasischen Stelle (Lys38_Arg 39) vorzugsweise
von PC1/3 gespalten. Weitere Prozessierung durch Carboxypeptidase Bähnlichem Enzym und Peptidylglycin-a.-amidierende Monooxygenase (PAM)
resultiert in amidiertem NPY und dem C-terminal flankierenden Peptid von NPY
(CPON). NPY besitzt sowohl zentral als auch in der Peripherie vielfältige
Funktionen. CPON ist co-lokalisiert mit NPY, seine Bedeutung ist jedoch bislang
ungeklärt.
Zusammenfassung
15
Um weitreichender zu untersuchen, wie Prohormone-Convertasen an der
Prozessierung von ProNPY beteiligt sind und in welcher Weise die Eigenschaften
des ProNPY-Substrates selbst zur spezifischen Erkennung durch das Enzym
beitragen, sind in vtvo- and in vitra-Studien notwendig.
Das Ziel dieser Arbeit war es, geeignete Werkzeuge für die detaillierte
Charakterisierung von ProNPY bereitzustellen, die in enzymatischen Spaltassays
und Studien mittels Aminosäure-Austausch und zur Strukturaufklärung eingesetzt
werden können.
Die Peptidfestphasensynthese (SPPS) ist die Methode der Wahl für den Einbau
chemischer Modifikationen in ein Molekül, wie z. B. einer Fluoreszenz- oder
Biotinmarkierung. Solche Modifikationen werden es erleichtern, in Enzymassays
den ablaufenden Spaltungsvorgang leichter verfolgen zu können. Darüber hinaus
können Aminosäuren leicht ausgetauscht werden gegen z. B. Alanin oder nicht
kanonische Aminosäuren. Das Ändern der Proteinstruktur und -funktion kann
neue Einblicke in Struktur-Aktivitäts-Wechselwirkungen geben und helfen, die
biologische Funktion des NPY-Vorläufers aufzuklären. ProNPY ist mit seinen 69
Aminosäuren jedoch zu lang für die Synthese in einem Schritt mittels SPPS. In
vitra-Assays sind daher an verkürzten ProNPY-Analoga durchgeführt worden. Es
konnte dabei gezeigt werden, dass PC1/3 and PC2 für die Spaltung von ProNPY
verantwortlich sind, wobei PC1/3 PC2 überlegen ist. Besonders Arginine in der
Sequenz waren wichtig für die enzymatische Prozessierung (Kapitel 2).
Weiterführende Studien bedürfen jedoch ProNPY in voller Länge, da die
Substratlänge eventuell einen Einfluss auf die Umsetzung mit PC hat.
Die Entwicklung der Methode der Nativen Chemischen Ligation (NCL, engi.:
native chemical ligation) ermöglichte den Zugang zu Proteinen mit bis zu - 100
Aminosäuren. In einer chemoselektiven Reaktion wird ein synthetisches Peptidoder Proteinsegment, das C-terminal eine Thioestergruppe aufweist, mit einem
zweiten synthetischen Peptid- oder Proteinsegment mit einem N-terminalen
Cysteinrest verknüpft. Eine native Peptidbindung wird an der Ligationsstelle
erhalten. Bislang wurden nur wenige SPPS-Strategien für eine Fmoc-basierende
(Fmoc=9-fluorenylmethyloxycarbonyl) Herstellung von Peptidthioestern berichtet.
Grund hierfür ist die Empfindlichkeit der Thioesterbindung gegenüber starken
Nukleophilen wie Piperidin, das zur Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppen
Zusammenfassung
16
verwendet wird. Weiterhin haben diese Strategien entweder spezielle Agentien
oder Linker verwendet oder haben ungewünschte Nebenreaktionen ausgelöst.
Eine neue schnelle, effiziente und einfache Herstellungsmethode war demnach
notwendig. Diese Bedingungen sind bei der hier präsentierten Methode erfüllt
(Kapitel 3). Die geschützten Peptidsäuren werden an einem kommerziell
erhältlichen 2-Chlorotrityl-Harz (CI-trityl-Harz) mittels Fmoc-Strategie synthetisiert,
vollgeschützt vom Harz abgespalten und die C-terminale Caroxylgruppe direkt
zum entsprechenden Thioester umgewandelt. Nach Abspaltung der SeitenkettenSchutzgruppen wird das Thioesterprodukt in hohen Ausbeuten erhalten. NCL an
das C-terminale Segment, das eine Carboxyf1uoreszenz (CF)-Markierung und das
N-terminale Cystein enthielt, ergab das gesamte ProNPY-Analogon.
Für Untersuchungen mittels Circulardichroismus (CD) and Kernmagnetischer
Resonanz-Spektroskopie (NMR, eng!.: nuc!ear magnetic resonance) war ProNPY
in voller Länge und ohne Veränderungen in der Struktur erforderlich. Das
IMPACT-System (intein-mediated purification with an affinity chitin-binding tag)
wurde zur rekombinanten Herstellung von ProNPY 1-69 eingesetzt (Kapitel 4).
Das für ProNPY 1-69 codierende Gen wurde in einen Expressionsvektor im
Leseraster
und vorgeschaltet
zu
einem
modifizierten
Chitinbindungsdomäne (CBD) kloniert. Das in E.
co!i
Intein
und
einer
Zellen exprimierte
Fusionsprotein konnte über die CBD selektiv auf eine Chitinsäule geladen werden.
Zur Spaltung des Fusionsproteins nützt das System die autokatalytische
Spaltungsaktivität von Inteinen, die als Äquivalente zu den Introns der RNA
betrachtet werden können. Zusatz von Thiol induzierte die Intein-Spaltung und
setzte das gewünschte ProNPY in voller Länge mit großer Reinheit und Menge
frei. Die ersten CD-Daten lassen erkennen, dass ProNPY weniger strukturiert ist
. als NPY, jedoch auch das a-Helix-Motiv enthält. Eine größere strukturelle
Flexibilität in dem Molekülteil, in dem sich die PC-Spaltstelle befindet, ist in guter
Übereinstimmung mit Daten anderer Vorläuferproteine. Das IMPACT-System war
darüber hinaus kompatibel mit der Isotopenmarkierung von ProNPY 1-69, das in
nachfolgenden NMR-Studien eingesetzt werden wird. Außerordentlich hohe
Ausbeuten an 15N-markiertem ProNPY 1-69 konnten erzielt werden.
Um weitere, verschiedenartige ProNPY-Analoga zur Verfügung zu haben, wurde
die Methode der exprimierten Proteinligation (EPL, eng!.: expressed protein
Zusammenfassung
17
ligation) angewendet (Kapitel 5). EPL basiert auf dem Prinzip der NCL, jedoch wird
entweder ein Ligationspartner oder beide rekombinant gewonnen. Für die
Semisynthese von ProNPY-Analoga sind zwei verschiedene Ligationsstellen
gewählt worden. Ein Cystein wurde anstelle des natürlich vorkommenden Ser41
bzw. Thr55 inkorporiert, um die anschließende Ligationsreaktion zwischen dem
Thioester- und dem Cysteinfragment zu ermöglichen. Das Thioesterfragment
wurde rekombinant unter Verwendung des IMPACT-Systems hergestellt. Unter
optimierten Bedingungen für die Proteinaufreinigung und -isolierung konnten hohe
Ausbeuten für beide Thioesterfragmente, ProNPY 1-40 und 1-54, erzielt werden.
Durch Ligation zwischen den beiden Thioesterfragmenten mit ihren jeweiligen
synthetischen C-terminalen Gegenstücken wurden fünf ProNPY-Analoga in voller
Länge gewonnen. Zwei von ihnen enthielten eine CF-Markierung im synthetischen
Teil, eines eine Biotin-Markierung und zwei waren ohne Markierung. Western Blotund Dotblot-Analysen zeigten, dass alle fünf Analoga von Antikörpern erkannt
werden, die gegen NPY bzw. gegen CPON gerichtet sind. Die eingeführten
Änderungen im Molekül störten weder die Erkennung durch die Antikörper noch
die Bindung von Streptavidin. Das verdeutlicht, dass keine dieser Änderungen
signifikant die Proteinstruktur beeinflusst. Wir konnten zeigen, dass EPL eine
geeignete Technik für die Semisynthese von chemisch modifizierten ProNPYAnaloga darstellt.
Die Festphasenpeptidsynthese des C-terminalen, Cystein tragenden ProNPYFragments [C41,K68]ProNPY 1-40, das sowohl für NCL als auch für EPL eingesetzt
wurde, stellte sich als schwieriger heraus als vermutet (Kapitel 5). Verschiedene
Ansätze, die zur Ermöglichung der Synthese schwieriger Peptidsequenzen
empfohlen sind, wurden getestet, jedoch erbrachte nur der Einbau von zwei
Pseudoprolin-Derivaten ausreichend reine Mengen an ProNPY-Fragment. Ein
derartiger sekundärer Aminosäureersatz ist bekannt, das Peptidrückgrat krümmen
zu können und dadurch Aggregat- oder Sekundärstrukturbildungen aufzubrechen.
Da besonders der Sequenzteil von ProNPY um die SpaltsteIle Probleme bei der
Synthese bereitete, können bestimmte strukturelle Eigenschaften für diese Region
angenommen werden.
Die Methoden der NCL und EPL benötigen beide spezifische N-terminale
Aminosäuren an der Ligationsstelle (Cystein, Selenocystein, Glycin), was die
Zusammenfassung
18
generelle Anwendbarkeit für die Proteinsynthese verringert. Es wurde daher ein
neuer Ligationsansatz entwickelt, die sogenannte Exprimierte Enzymatische
Ligation (EEL, eng/.: expressed enzymatic ligation), die die Vorteile der
rekombinanten Thioesterherstellung mittels IMPACT-System mit denen der
Substratmimetika-Strategie vereinigt (Kapitel 6). Die Thioestergruppe des Nterminalen Fragments ProNPY 1-40 wurde als spezifische Abgangsgruppe für
Proteasen konzipiert (Carboxymethylmercaptan (SCM), Carboxypropylmercaptan
(SCP),
Mercaptoethansulfonsäure
(MESNA)).
Die
Glu/Asp-spezifische
Serinprotease V8 aus Staphylococcus aureus konnte die Thioestergruppe
erkennen
und
katalysierte
den
Ligationsschritt
von
dieser
Acyldonator-
Komponente an verschiedene Acylakzeptoren wie die chemisch modifizierten
Derivate von ProNPY 41-69 und einige Modellpeptide. Die EEL-Strategie erwies
sich als neuer vielversprechender Ansatz für die Semisynthese chemisch
modifizierter Proteine. Sie erweiterte die Bandbreite an Techniken, die zur
Herstellung von verschiedenen ProNPY-Analoga eingesetzt wurden. Diese stehen
nun zur weiteren Charakterisierung zur Verfügung.
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