Bestimmung der Virulenz von Virusisolaten der Klassischen

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Aus dem Institut für Virologie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Bestimmung der Virulenz von Virusisolaten
der Klassischen Schweinepest
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Claudia Bunzenthal
aus Kassel
Hannover 2003
Wissenschaftliche Betreuung:
Apl. Prof. Dr. Irene Greiser-Wilke
1. Gutachter:
Apl. Prof. Dr. Irene Greiser-Wilke
2. Gutachter:
Prof. Dr. Michael Wendt
Tag der mündlichen Prüfung:
24.11.2003
Meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
13
2. Literaturübersicht
15
2.1
VIRUS DER KLASSISCHEN SCHWEINEPEST
15
2.1.1
TAXONOMIE
15
2.1.2
CHARAKTERISIERUNG DES VIRUS
16
2.1.2.1
Morphologie
16
2.1.2.2
Genom
16
2.1.2.3
Virale Proteine
17
2.1.2.4
Kreuzreaktivität
18
2.1.2.5
Tenazität
18
2.1.2.6
Genetische Typisierung von KSPV-Isolaten
19
2.2
KLINIK UND PATHOLOGIE
21
2.2.1
ÜBERTRAGUNG
21
2.2.2
VERLAUFSFORMEN DER KLASSISCHEN SCHWEINEPEST
22
2.2.2.1
Akute Verlaufsformen
22
2.2.2.2
Chronische Verlaufsformen
24
2.2.2.3
Pränatale Infektion
25
2.2.4
PATHOGENESE
26
2.3
VIRULENZ UND WIRTSFAKTOREN
29
2.3.1
VIRULENZ
29
2.3.1.1
Charakterisierung der Virulenz des KSPV aufgrund klinischer
Symptome und pathologischer Veränderungen
31
2.3.1.2
Differenzierung der Virulenz des KSPV durch „in-vitro“-Unterschiede
33
2.3.1.3
Genetische Marker für die Virulenz des KSPV
34
2.3.2
WIRTSFAKTOREN
35
3. Eigene Untersuchungen
36
3.1
MATERIAL
36
3.1.1
TIERE UND VERSUCHSAUFBAU
36
3.1.2
GEWINNUNG UND AUFBEREITUNG DER BLUTPROBEN
37
3.1.3
KSP-VIREN
38
3.1.4
ANTIKÖRPER
38
3.1.5
ZELLINIE PORCINE KIDNEY (15) AMSTERDAM (PK(15)A)
39
3.1.6
SONSTIGE MATERIALIEN
39
3.2
METHODEN
40
3.2.1
BESTIMMUNG DES CLINICAL SCORE (CS)
40
3.2.2
BESTIMMUNG DES PATHOLOGICAL SCORE (PS)
43
3.2.3
ZELLKULTURTECHNIK
45
3.2.4
VIRUSVERMEHRUNG UND VIRUSERNTE
46
3.2.5
VIRUSISOLIERUNG AUS DER LEUKOZYTENFRAKTION
46
3.2.5.1
Gewinnung und Reinigung der Leukozyten
47
3.2.5.2
Virusisolierung über zwei Zellpassagen
47
3.2.6
VIRUSTITRATION
48
3.2.7
VIRUSNEUTRALISATIONSTEST
49
3.2.8
DIREKTE IMMUNFÄRBUNG
51
3.2.9
ZÄHLUNG DER LEUKOZYTEN
52
3.2.10
STATISTIK
52
4. Ergebnisse
53
4.1
BESTIMMUNG DER VIRULENZ VON VIER KSPV-FELDISOLATEN
53
4.1.1
BESTIMMUNG DES CLINICAL SCORE (CS)
53
4.1.1.1
CSF 0650
53
4.1.1.2
CSF 0695
54
4.1.1.3
CSF 0634
55
4.1.1.4
CSF 0277
55
4.1.2
BESTIMMUNG DES PATHOLOGICAL SCORE (PS)
62
4.1.2.1
CSF 0650
62
4.1.2.2
CSF 0695
63
4.1.2.3
CSF 0634
63
4.1.2.4
CSF 0277
64
4.1.3
LEUKOZYTENZAHL
67
4.1.3.1
Einbeziehung der Leukozytenzahl in das Schema zur Beurteilung
der Virulenz der KSPV-Isolate
70
4.1.4
VIRUSISOLIERUNG AUS DER LEUKOZYTENFRAKTION
71
4.1.5
VIRUSTITER IM SERUM
73
4.1.6
BILDUNG NEUTRALISIERENDER ANTIKÖRPER
74
4.1.6.1
Einbeziehung der Bildung neutralisierender Antikörper in das
Schema zur Beurteilung der Virulenz der KSPV-Isolate
4.1.7
77
ERNEUTE BEWERTUNG DER VIRULENZ DER VIER
KSPV-FELDISOLATE UNTER BERÜCKSICHTIGUNG
ZUSÄTZLICHER PARAMETER
4.2
78
VERGLEICH DES KRANKHEITSVERLAUFES DER KSP VON
REINZUCHT-UND KREUZUNGSTIEREN
79
4.2.1
BESTIMMUNG DES CLINICAL SCORE (CS)
79
4.2.1.1
CSF 0277
79
4.2.1.2
CSF 0634
80
4.2.2
BESTIMMUNG DES PATHOLOGICAL SCORE (PS)
86
4.2.2.1
CSF 0277
86
4.2.2.2
CSF 0634
87
4.2.3
LEUKOZYTENZAHL
91
4.2.4
VIRUSISOLIERUNG AUS DER LEUKOZYTENFRAKTION
93
4.2.5
VIRUSTITER IM SERUM
95
4.2.6
BILDUNG NEUTRALISIERENDER ANTIKÖRPER
96
5. Diskussion
99
6. Zusammenfassung
113
7. Literaturverzeichnis
117
8. Anhang
138
8.1
TABELLEN
138
8.2
ZUSAMMENSETZUNG DER VERWENDETEN
MEDIEN UND REAGENZIEN
150
8.2.1
ZELLKULTURMEDIEN
150
8.2.2
REAGENZIEN
151
8.2.2.1
Puffer
151
8.2.2.2
Lösungen
152
8.3
SONSTIGE CHEMIKALIEN
153
8.4
GERÄTE UND GEBRAUCHSGEGENSTÄNDE
154
8.5
VERBRAUCHSMITTEL
155
8.6
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
157
8.7
TABELLENVERZEICHNIS
159
Verzeichnis der Abkürzungen
al.
alii, andere
AEC
3-Amino-9-Ethylcarbazol
Ak
Antikörper
A. bidest. ster.
Aqua bidestillata sterilis, zweifach destilliertes steriles Wasser
ATV
adjusted trypsin-versen
BD
Border Disease
BDV
Border Disease Virus
BVD
Bovine Virusdiarrhoe
BVDV
Virus der BVD
CS
clinical score, klinische Punktzahl
CSF
Classical Swine Fever, KSP
C-Stamm
engl. chinese strain
d
Tag
DIF
Direkte Immunfärbung
DIK
disseminierte intravasale Gerinnung
DL
Deutsche Landrasse
Dt. Landrasse
Deutsche Landrasse
DNA
deoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure
EDulb
EMEM modifiziert nach Dulbecco und Freeman
EDTA
Ethylendiamintetrazetat-Dinatriumsalz
EMEM
Earle’ s minimum essential medium
EU
Europäische Union
EURL
Europäisches Referenzlabor für KSP
Fa.
Firma
FKS
fetales Kälberserum
g
Erdanziehungs-Konstante
G
giga (x 109)
h
Stunde
H
Hybridschweine
IRES
Internal Ribosomal Entry Site
kb
Kilobasen
KID50
kulturinfektiöse Dosis 50 %
KSP
Klassische Schweinepest
KSPV
Virus der Klassischen Schweinepest
l
Liter
log10
Zehnerlogarithmus
µ
mikro (x10-6)
m
milli (x10-3)
mAk
monoklonale Antikörper
min
Minute
MKS
Maul- und Klauenseuche
n
nano (x10-9)
nAk
neutralisierende Antikörper
ND50
neutralisierende Dosis 50%
nm
Nanometer
nt
Nukleotide
NTR
nichttranslatierte Region
NVSL
National Veterinary Services Laboratory
OIE
Office International des Epizooties
PBS
phosphate buffered saline, phosphatgepufferte Kochsalzlösung
PBSM
PBS ohne Calcium- und Magnesiumionen
pH-Wert
negativer dekadischer Logarithmus der Hydroniumionen-Konzentration
p.i.
post infectionem, nach Infektion
PK
porcine kidney
PLA
peroxidase-linked antibody assay
PO
Peroxidase
PS
pathological score, pathologische Punktzahl
RNA
ribonucleic acid, Ribonucleinsäure
RNase
Ribonuklease
Sek
Sekunde
SPF
Spezifisch-Pathogen-Frei
T
Thymin
T (°C)
Temperatur (in Grad Celsius)
VNT
Virusneutralisationstest
1. Einleitung
Die Klassische Schweinepest (KSP) wird durch ein Virus des Genus Pestivirus,
Familie Flaviviridae, verursacht. Das Virus der Klassischen Schweinepest (KSPV) ist
serologisch
einheitlich,
kann
aber
durch
Sequenzvergleiche
bestimmter
Genomabschnitte in drei genetische Gruppen und mehrere Subgruppen unterteilt
werden. Die natürlichen Wirte dieses behüllten RNA-Virus sind Haus- und
Wildschweine (sus scrofa).
Die Infektion mit dem KSPV zählt zu den wichtigsten Tierseuchen weltweit und
Seuchenzüge verursachen hohe wirtschaftliche Schäden. Die Erkrankung wurde von
dem Office international des épizooties (OIE) auf die Liste A gesetzt. Die
Bekämpfungsmaßnahmen sind, basierend auf der Richtlinie 2001/89/EC, innerhalb
der Europäischen Union (EU) einheitlich geregelt. Sie bestehen in der Tötung aller
Tiere eines betroffenen Bestandes und in der Einrichtung von Sperr- und
Beobachtungsgebieten. Die prophylaktische Impfung von Hausschweinen ist seit
1992 verboten.
Das KSPV zeigt eine große Variationsbreite bezüglich seiner Virulenz. Die Virulenz
der KSPV-Stämme wird u. a. für die unterschiedlichen klinischen Verlaufsformen der
Erkrankung verantwortlich gemacht. Hoch virulente Virusstämme führen zu akuten
Erkrankungen mit hoher Mortalität, während moderat virulente Stämme subakute
oder chronische Erkrankungen auslösen können. Infektionen mit schwach virulenten
Stämmen werden mit milden oder subklinischen Krankheitsverläufen in Verbindung
gebracht. Neben der Virulenz des Erregers beeinflussen auch Wirtsfaktoren, wie
Alter, Rasse und Immunstatus der Tiere den Krankheitsverlauf der KSP.
Während der Seuchenzüge der Jahre 1993-1995 und 1997/1998 in den
Mitgliedsstaaten der EU traten vermehrt „atypische Krankheitsverläufe“ auf, für die
Virusisolate von moderater bis schwacher Virulenz verantwortlich gemacht wurden.
Neben diesen Beobachtungen ist jedoch über Virulenzfaktoren und über mögliche
Ursachen für die unterschiedlich stark ausgeprägten Krankheitsbilder wenig bekannt.
14
Einleitung
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein in der Literatur beschriebenes
Untersuchungsschema, das Virusisolate des KSPV anhand einer klinisch ermittelten
Punktzahl (Clinical Score) in verschiedene Virulenzkategorien einteilt, auf seine
Gültigkeit und Anwendbarkeit zu überprüfen und ggf. durch weitere Parameter zu
ergänzen. Um festzustellen, ob es Unterschiede im klinischen Verlauf der KSP und
damit in der Bewertung der Virulenz einzelner Virusisolate gibt, wurden Schweine mit
jeweils einem von vier verschiedenen Virusisolaten infiziert. Zudem wurde
untersucht, ob die Infektion von Reinzucht- und Kreuzungstieren unter gleichen
Bedingungen zu einer vergleichbaren Bewertung der Virulenz führt.
2. Literaturübersicht
2.1 Virus der Klassischen Schweinepest
2.1.1 Taxonomie
Das Virus der Klassischen Schweinepest (KSPV) gehört zum Genus Pestivirus,
Familie Flaviviridae (WESTAWAY et al., 1985, HORZINEK, 1991). Zu diesem Genus
gehören weiterhin das Virus der Bovinen Virusdiarrhoe (BVDV) und das Virus der
Border Disease (BVD) der Schafe. Das Genus Pestivirus bildet zusammen mit den
Genera Flavivirus und Hepacivirus die Familie der Flaviviridae. Das Genus
Hepacivirus beinhaltet das humane Hepatitis-C-Virus. Zum Genus Flavivirus gehören
u. a. das Gelbfiebervirus und das Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus des
Menschen, das Louping-Ill-Virus, das Wesselbron-Disease-Virus der Schafe sowie
das Meningoenzephalitis-Virus der Pute (WENGLER et al., 1995).
16
Literaturübersicht
2.1.2 Charakterisierung des Virus
2.1.2.1 Morphologie
Pestiviren sind sphärische, behüllte RNA-Viren mit einem Durchmesser von 40 bis 60
nm (MOENNIG u. PLAGEMANN, 1992) und einem ikosaedrischen Nukleokapsid mit
einer Größe von etwa 30 nm (HORZINEK et al., 1967). Auf der Oberfläche der
Lipidhülle besitzen Pestiviren unregelmäßig gestaltete, 6-8 nm große Projektionen
(HORZINEK et al., 1967, ENZMANN u. WEILAND, 1978).
2.1.2.2 Genom
Das Genom der Pestiviren besteht aus einem einzelsträngigen, linearen RNAMolekül, das in Plusstrangorientierung vorliegt (MOORMANN et al., 1990). Die RNA
hat eine Länge von ca. 12,5 Kilobasen (kb) und besitzt einen einzigen offenen
Leserahmen, der die Information für ein Polyprotein von etwa 3900 Aminosäuren
enthält (COLLETT et al., 1988, MEYERS et al., 1989, MOORMANN et al., 1990). Der
Leserahmen wird am 5´-Ende und am 3´-Ende von nichttranslatierten Regionen
(NTR) flankiert (MOORMANN u. HULST, 1988, RÜMENAPF et al., 1989), die beide
hochkonserviert sind (MEYERS et al., 1989, MOORMANN et al., 1990). Das 5’NTR
bildet die Internal Ribosomal Entry Site (IRES), die für eine cap-unabhängige
Bindung an die Ribosomen verantwortlich ist (SIZOWA et al., 1998). Die Funktion der
3’NTR ist bisher nicht geklärt.
Literaturübersicht
17
2.1.2.3 Virale Proteine
Das Genom der Pestiviren kodiert für ein einziges Polyprotein, dass während und
nach der Translation von zellulären und viralen Proteasen prozessiert wird
(COLLETT et al., 1988, RÜMENAPF et al., 1993 MEYERS et al., 1996). So
entstehen die vier Strukturproteine, zu denen das core-Protein (c) und die
Glykoproteine Erns, E1 und E2 gehören sowie die sieben Nichtstrukturproteine, Npro,
p7, NS2-3, NS4A, NS4B, NS5A , NS5B (COLLETT et al., 1991). Das Strukturprotein
E2 ist im Wesentlichen für die Bildung neutralisierender Antikörper (nAk)
verantwortlich (GREISER-WILKE et al., 1990, WEILAND et al., 1990). Antikörper, die
gegen das Erns gerichtet sind, besitzen nur schwach neutralisierende Eigenschaften
(RÜMENAPF et al., 1991, WEILAND et al., 1992). Das Strukturprotein E2 weist die
geringste Homologie in der Aminosäuresequenz innerhalb des KSPV (80%) und
innerhalb des Genus Pestivirus (60%) auf. Im Gegensatz dazu ist das
Nichtstrukturprotein NS3 mit über 90% das am stärksten konservierte Protein der
Pestiviren (MEYERS et al., 1989). Die Genomorganisation ist in Abb. 1 dargestellt.
pro
N
C
rns
E
E1
E2
7
p
NS2-3
NS4A
NS4B
NS5A-B
5’
3’
Strukturproteine
NS2
NS3
NS5A
NS5B
Abb. 1: Genomorganisation des KSPV (modifiziert nach MEYERS und THIEL, 1996)
18
Literaturübersicht
2.1.2.4 Wirtsspezifität und serologische Verwandtschaft
Pestiviren können Speziesbarrieren überwinden (MOENNIG u. PLAGEMANN, 1992).
Durch engen Kontakt von Schweinen und Rindern können sich Schweine mit BVDV
infizieren. Natürliche Infektionen führen beim Schwein selten zu klinischen
Symptomen, die Tiere bilden aber neutralisierende Antikörper (nAk), die auch KSPV
neutralisieren (DAHLE et al., 1987a). Experimentell konnten Rinder, Schafe (DAHLE
et al., 1987b), Ziegen (SHIMUZU u. KUMAGAI, 1989) und Hirsche (LOAN u.
STORM, 1968) mit KSPV infiziert werden, ohne dass jedoch eine natürliche
Übertragung nachgewiesen wurde.
Die enge serologische Verwandtschaft zwischen KSPV und BVDV wurde erstmals
von DARBYSHIRE (1960) mittels Immunodiffussion mit polyklonalem Antiserum
erkannt und später durch Kreuzneutralisationstests bestätigt (SNOWDON u.
FRENCH, 1968, LIESS et al., 1976, 1977, NEUKIRCH et al., 1980). Mit der
Entwicklung monoklonaler Antikörper (mAk) wurde eine sichere Differenzierung
zwischen den verschiedenen Pestiviren ermöglicht (WENSVOORT et al., 1986,
GREISER-WILKE et al., 1990, MOENNIG u. PLAGEMANN, 1992). Gegen das NS3
gerichtete monoklonale Antikörper sind meist panpestivirus-spezifisch (EDWARDS et
al., 1989). Hingegen ermöglichen monoklonale Antikörper, die gegen die
Strukturproteine E2 und Erns gerichtet sind, eine Differenzierung zwischen den
verschieden Pestiviren und zwischen Virusisolaten einer Spezies (CAY et al., 1989,
KOSMIDOU et al., 1995).
2.1.2.5 Tenazität
Die Überlebenszeit des Virus in der Umwelt ist sehr variabel und wird von
verschiedenen Faktoren beeinflusst.
Aufgrund seiner Lipidhülle wird das KSPV durch lipidlösliche Substanzen wie Äther,
Chloroform und Detergenzien inaktiviert (KUBIN et al., 1967, MOENNIG, 1988). Die
Infektiosität wird durch Hitze (60°C für 10 min.) und durch UV-Strahlung aufgehoben
Literaturübersicht
19
(KUBIN et al., 1967). Das Virus ist relativ stabil in einem pH-Bereich von 5-10, pHWerte unter 4 und über 10 führen zu einer Virusschädigung (DEPNER et al., 1992,
EDWARDS, 2000). In Fleisch und Fleischprodukten findet das Virus aufgrund des
hohen Protein- und Feuchtigkeitsgehaltes gute Überlebensbedingungen. Die
Überlebensdauer
hängt
von
der
Verarbeitungsform
ab.
In
gefrorenem
Schweinefleisch konnte das KSPV noch nach vier Jahren nachgewiesen werden
(EDWARDS, 2000), in geräuchertem Fleisch werden Überlebenszeiten von 17 bis
188 Tagen beschrieben (McKERCHER et al., 1978).
2.1.2.6 Genetische Typisierung von KSPV-Isolaten
Durch die genetische Typisierung ist es möglich, den Verwandtschaftsgrad zwischen
verschiedenen Isolaten des KSPV zu ermitteln. Dies ist hilfreich bei der
Klassifizierung der verschiedenen Virusisolate und kann Auskunft über die
epidemiologischen Zusammenhänge einzelner Seuchenzüge geben (PATON et al.,
2000).
Durch
Sequenzvergleiche
bestimmter
Genomabschnitte
und
anschließende
phylogenetische Analyse kann man KSPV genetischen Gruppen zuordnen
(HOFMANN et al., 1994, LOWINGS et al., 1996, GREISER-WILKE et al., 1998,
PATON et al., 2000). Besonders geeignet für diese vergleichende Analyse sind
Genomabschnitte des E2-Glykoproteins bestehend aus 190 Nukleotiden (nt) und die
5´-NTR-Region (150nt), sowie Fragmente des 3’-Endes des Nichtstrukturproteins
NS5B (PATON et al., 2000). Aufgrund dieser Untersuchungen wurde das KSPV in
drei genetische Gruppen unterteilt, die wiederum mehrere Untergruppen enthalten
(PATON et al., 2000). Die Gruppe 1 mit den Untergruppen 1.1, 1.2 und 1.3 beinhaltet
Impfvirusstämme, Isolate aus Westeuropa, Großbritannien und den USA aus den
1940er und 1950er Jahren sowie aus Japan aus den 1960er Jahren. Daneben
enthält diese Gruppe noch Isolate aus Brasilien und Korea aus den 1980er Jahren
und Isolate aus der Ukraine, Kroatien, Mexiko, Thailand, China und der Karibik aus
den 1990er Jahren. Die Gruppe 2 ist in die Untergruppen 2.1, 2.2 und 2.3 unterteilt.
20
Literaturübersicht
Jede dieser Untergruppen enthält Isolate aus Westeuropa aus den 1980er und
1990er Jahren. In die Untergruppe 2.1 wurden neben Isolaten aus Westeuropa
außerdem noch Isolate aus Malaysia (1980er Jahre) und aus Osteuropa aus den
1990er Jahren eingeteilt. Die Untergruppe 2.2 beinhaltet noch zusätzlich Isolate aus
Singapur (1980er Jahre) und Thailand (1990er Jahre) und in der Untergruppe 2.3
befinden sich zusätzlich Isolate aus Japan (1970er Jahre) und Osteuropa (1990er
Jahre). In der Gruppe 3 (Untergruppen 3.1, 3.2, 3.3, 3.4) befinden sich Isolate aus
Großbritannien (1960er Jahre), Korea (1980er und 1990er Jahre), Thailand (1990er
Jahre) und Japan (1970er Jahre) und Taiwan (1990er Jahre) (PATON et al., 2000).
Die Analyse der Seuchenausbrüche in Europa in den letzten zehn Jahren zeigte,
dass die meisten Virusisolate zu einer der Untergruppen der Gruppe 2 gehörten
(MOENNIG et al., 2002). Die letzten großen Seuchenzüge in Deutschland, den
Niederlanden, Italien, Spanien und Belgien in 1997/1998 (GREISER-WILKE et al.,
2000b) und in Großbritannien im Jahre 2000 (SANDVIK et al., 2000) wurden durch
Virusisolate der Genogruppe 2.1 verursacht. In Europa scheinen nur in Russland
noch Isolate der Gruppe 1 aufzutreten. Viren der Gruppe 1.2 wurden ebenfalls in
Kuba entdeckt und Viren der Gruppe 1.3 in der Karibik. Virusisolate der Gruppe 3
beschränken sich derzeit auf Asien (MOENNIG et al., 2002).
Literaturübersicht
21
2.2 Klinik und Pathologie
2.2.1 Übertragung
Unter natürlichen Bedingungen erfolgt die Übertragung des KSPV oronasal (DUNNE,
1970). Durch direkten Kontakt zwischen infizierten und empfänglichen Tieren, durch
Verfütterung von virushaltigen, nicht ausreichend erhitzten Speiseabfällen oder durch
mechanische Vektoren, wie z. B. Transportfahrzeuge, Stallgeräte oder Personen,
wird das Virus weiterverbreitet (VAN OIRSCHOT, 1999). Auch eine Übertragung
durch den Deckakt oder die künstliche Besamung ist möglich, da das Virus im
Sperma von infizierten Ebern nachgewiesen werden konnte (DE SMIT et al., 1999,
FLOEGEL et al., 2000). Die Virusausscheidung erfolgt über Sekrete und Exkrete, wie
Speichel, Konjunktivalflüssigkeit, Urin und Faezes (VAN OIRSCHOT, 1999).
Tragende, infizierte Sauen können das Virus auf die Feten übertragen (VAN
OIRSCHOT, 1979a,b, MEYERS et al., 1981).
Natürliche Wirte des KSPV sind Hausschweine und Wildschweine (DUNNE, 1970,
DEPNER et al., 1995, LADDOMADA, 2000). Infizierte Wildschweine können als
Erregerreservoir dienen und sind somit eine ständige Infektionsgefahr für die
Hausschweinepopulation (MOENNIG, 2000).
22
Literaturübersicht
2.2.2 Verlaufsformen der Klassischen Schweinepest
Bei der Infektion mit dem KSPV kann man zwischen der postnatalen und der
pränatalen Infektion unterscheiden (VAN OIRSCHOT, 1999).
Nach postnataler Infektion sind verschiedene Verlaufsformen möglich: die akutletale, die akut-transiente und die chronische Verlaufsform (DEPNER et al., 1996a,
VAN OIRSCHOT, 1999). Diese systematische Einteilung hat primär eine didaktische
Bedeutung und besitzt nur eine Gültigkeit bei der Betrachtung einzelner Tiere. Unter
Feldbedingungen ist es schwieriger, die klaren, aus Experimenten bekannten
Verlaufsformen zu erkennen, da der genaue Infektionszeitpunkt nicht bekannt ist und
mehrere Krankheitsbilder gleichzeitig auftreten können (DEPNER et al., 1996a).
2.2.2.1 Akute Verlaufsformen
Das erste Anzeichen einer Infektion mit dem Virus der klassischen Schweinepest ist
ein Ansteigen der Körpertemperatur auf über 41°C (VAN OIRSCHOT, 1999).
Bei der peraktuten Verlaufsform der Erkrankung ist hohes Fieber meist das einzige
klinische Symptom, bevor die Schweine plötzlich zwei bis fünf Tage nach der
Infektion verenden (DUNNE, 1970). Auch pathologisch-anatomisch lassen sich bei
diesem Verlauf oft nur Schocksymptome feststellen (TRAUTWEIN, 1988).
Die akut-letale Form ist gekennzeichnet durch Fieber, Apathie und Anorexie,
Konjunktivitis,
Erbrechen,
Verstopfung
gefolgt
von
Durchfall,
vergrößerten
Lymphknoten und respiratorischen Symptomen. Oft treten neurologische Symptome
auf. Die Tiere taumeln und zeigen eine Schwäche in der Hinterhand, bis hin zu einer
vollständigen
Lähmung.
Die
klassischen
Hautveränderungen
in
Form
von
petechialen bis flächenhaften Blutungen treten in der Endphase der Erkrankung auf
und sind besonders an den Ohren, dem Unterbauch, der Schulter- und Kreuzregion
und den Gliedmaßen zu finden (VAN OIRSCHOT, 1999). Die Tiere verenden 10 bis
20 Tage (akut) oder 20 bis 30 Tage (subakut) nach der Infektion (DUNNE, 1970).
Literaturübersicht
23
Im Sektionsbild findet man vor allem Veränderungen an den Lymphknoten, den
Nieren und der Milz. Die Lymphknoten sind geschwollen, ödematös und
hämorrhagisch. An den Nieren können petechiale bis ekchymale Blutungen
auftreten. Petechien kann man auch in der Harnblase, der Epiglottis, dem Herzen
sowie dem Brust- und Bauchfell feststellen. Das Auftreten von Milzinfarkten gilt als
fast pathognomisch für KSP (VAN OIRSCHOT, 1999). Außerdem kann in vielen
Fällen eine nichteitrige Enzephalitis diagnostiziert werden (GRUBER et al., 1995).
Überleben die Tiere eine akute Erkrankung, bildet sich nach zwei bis vier Wochen
eine effektive Immunantwort aus, mit maximalen Titern nach drei bis vier Monaten.
Bei letal verlaufender KSP sind meist nur geringe Mengen neutralisierender
Antikörper kurz vor Verenden der Tiere nachweisbar. (BOEHM et al., 1966,
RESSANG, 1973, LIESS et al., 1977, DEPNER et al., 1994).
Neben dem akuten Verlauf mit hohen Mortalitätsraten treten mildere Verlaufsformen
und transiente Infektionen mit vollständiger Genesung auf, die die Diagnose der KSP
erschweren. Bei der akut-transienten Verlaufsform kann zwar Virus- bzw. Antigen im
Untersuchungsmaterial
nachgewiesen
werden,
aber
die
klinischen
Untersuchungsergebnisse weisen nicht unbedingt auf KSP hin. Das Fieber dauert
nur einige Tage an und das Allgemeinbefinden bessert sich rasch wieder. Typische
hämorrhagische oder zentralnervöse Störungen treten nicht auf. Deshalb spricht man
in diesem Fall auch von einem „atypischen“ Verlauf (DAHLE u. LIESS, 1992,
DEPNER et al., 1996a).
24
Literaturübersicht
2.2.2.2 Chronische Verlaufsform
Die
chronische
Form
der
KSPV-Infektion
ist
gekennzeichnet
durch
eine
Krankheitsdauer von mehr als 30 Tagen (MENGELING u. PACKER, 1969) und wird
möglicherweise durch moderat virulentes Virus hervorgerufen (CABREY et al., 1977,
VAN OIRSCHOT, 1999).
Chronisch erkrankte Schweine können mehr als 100 Tage überleben, aber die
Erkrankung verläuft letztendlich immer letal (MENGELING u. PACKER, 1969, VAN
OIRSCHOT, 1999). Diese Form der KSP zeigt einen protrahierten Verlauf. Es kann
abwechselnd
zu
Phasen
klinischer
Besserung,
gefolgt
von
erneuten
Krankheitsschüben kommen (DEPNER et al., 1996a, b). MENGELING und PACKER
(1969) haben die chronische Verlaufsform in drei Phasen eingeteilt. In der ersten
Phase sind mehr oder weniger ausgeprägte Symptome einer akuten Erkrankung
festzustellen, in der zweiten Phase kommt es zu einer kurzfristigen Verbesserung
des
Gesundheitszustandes
der
Tiere,
die
dritte
Phase
führt
mit
einem
Wiederauftreten der klinischen Symptome zum Tod der Schweine.
Die für KSP „typischen“ Symptome fehlen meist, die Tiere zeigen intermittierendes
Fieber, Appetitlosigkeit, Durchfall, Alopezie und Dermatitis. Die Schweine kümmern
und sind mehr oder weniger deutlich in ihrer Entwicklung gestört (DEPNER et al.,
1996a). Chronisch kranke Tiere scheiden permanent Virus aus und sind somit eine
ständige Infektionsquelle. Bei Nichterkennen der Infektion können sie eine wichtige
Rolle bei der Weiterverbreitung der Seuche spielen (DEPNER et al., 1996b).
Neutralisierende Antikörper sind nur kurzfristig in der Phase der klinischen
Besserung um die 4. Infektionswoche nachweisbar. Zu diesem Zeitpunkt kann es
auch zu einem vorübergehenden Verschwinden der Virämie kommen (MENGELING
u. PACKER, 1969, DEPNER et al., 1996b, VAN OIRSCHOT, 1999).
Die pathologisch-anatomischen Veränderungen sind weniger ausgeprägt als bei
akuter Schweinepest. Auffällig ist eine Depletion der Lymphozyten in den
Lymphorganen. Thymusatrophie und eine durch Immunkomplexe hervorgerufene
Glomerulonephritis
können
beobachtet
werden.
Knopfförmige
Ulzerationen
Literaturübersicht
25
(engl. button ulcers) in Caecum und Colon sind eine bei chronischer Schweinepest
oft anzutreffende pathologische Veränderung (VAN OIRSCHOT, 1999).
2.2.2.3 Pränatale Infektion
Bei tragenden Sauen kommt es nach Infektion mit dem KSPV zu einer
transplazentaren Virusübertragung (VAN OIRSCHOT u. TERPSTRA, 1977).
Die
Folgen
einer
in
utero-Infektion
hängen
im
Wesentlichen
vom
Entwicklungsstadium der Feten zum Zeitpunkt der Infektion ab und von der Virulenz
des Erregers (MOENNIG u. PLAGEMANN, 1992). Eine Infektion in der frühen Phase
der Gestation (vor dem 41. Tag) führt meist zu Aborten oder Totgeburten,
Mumifikationen oder Missbildungen. Erfolgt die Infektion um den 50. bis 70. Tag der
Trächtigkeit, kann es zur Geburt persistent virämischer Ferkel kommen (VAN
OIRSCHOT u. TERPSTRA, 1977, MEYERS et al., 1981). Nach dem 85. Tag der
Trächtigkeit werden nicht-virämische Tiere geboren (MOENNIG u. PLAGEMANN,
1992).
Persistent virämische Ferkel können bei der Geburt völlig gesund erscheinen, sie
entwickeln aber dann die sogenannte Spätform („late onset“) der KSP und verenden
schließlich. Die Tiere fallen durch Wachstumsstörungen, Kümmern, Anorexie,
Konjunktivitis, Dermatitis und Bewegungsstörungen auf, wobei die Symptome
unterschiedlich stark ausgeprägt sein können. Kongenital infizierte virämische Ferkel
sind immuntolerant gegenüber dem KSPV, sie sind jedoch zu einer Immunantwort
gegenüber anderen Erregern fähig (VAN OIRSCHOT, 1999). Schweine, die an der
Spätform der KSP erkrankt sind, können bis zu 11 Monaten überleben. Sie scheiden
konstant große Mengen Virus aus und sind somit eine gefährliche Infektionsquelle
und von Bedeutung bei der Weiterverbreitung der KSP (VAN OIRSCHOT u.
TERPSTRA, 1977).
26
Literaturübersicht
2.2.4 Pathogenese
Unter natürlichen Bedingungen erfolgt die Übertragung des KSPV oronasal.
Gelegentlich wurde auch eine Infektion über die Konjunktival – oder Genitalschleimhäute beobachtet (VAN OIRSCHOT, 1999).
Die primäre Virusvermehrung findet in den Tonsillen statt (DUNNE, 1959,
RESSANG, 1973). Auch nach intramuskulärer und subkutaner Applikation konnte
das Virus in hoher Konzentration hier nachgewiesen werden (LIN et al., 1969,
MENGELING u. PACKER, 1969).
Anfangs infiziert das KSPV die Epithelzellen an der Oberfläche und in den Krypten
der Tonsillen, wo das Virus schon nach ungefähr sieben Stunden post infectionem
(p.i.) nachgewiesen werden kann. Von hier aus findet die Weiterverbreitung in das
umgebende lymphoretikuläre Gewebe und über die Lymphgefäße in die regionären
Lymphknoten statt. Nach Virusvermehrung in den regionären Lymphknoten und
anschließender Virusausbreitung über das Blutgefäßsystem mit massiver Virämie,
kommt es zu einer sekundären Virusvermehrung in der Milz, im Knochenmark, in den
viszeralen Lymphknoten und im lymphatischen Gewebe des Darms. Die Virustiter in
Lymphorganen sind generell höher als in parenchymatösen Organen (RESSANG,
1973). Die Hauptzielzellen für das KSPV sind Endothelzellen, lymphoretikuläre
Zellen, Makrophagen und Epithelzellen (MOENNIG, 2000). Die Virusausbreitung im
Organismus ist nach 5-6 Tagen abgeschlossen (RESSANG, 1973).
Die
Infektion
mit
dem
KSPV
verursacht
eine
schwere
Leukopenie
und
Immunsuppression, die schon vor dem Auftreten von Fieber beobachtet werden kann
(TRAUTWEIN, 1988). Das Virus hat eine ausgeprägte Affinität für Zellen der
lymphoretikulären Organe, wo es eine schwere Depletion der Lymphozyten
verursacht (LIESS, 1987), wobei im Endstadium einer letalen Infektion, sowohl im
Lymphgewebe als auch im peripheren Blut, vor allem eine dramatische
Verminderung der B-Lymphozyten zu beobachten ist (SUSA et al., 1992). Schon zu
Beginn der Erkrankung kommt es zu einer Virusvermehrung in den Keimzentren der
Lymphorgane. Zuerst findet eine Virusvermehrung in den B-Follikeln und
Epithelzellen der Tonsillen, sowie in den B-Follikeln der regionären Lymphknoten und
Literaturübersicht
27
der Peyerschen Platten statt. Erst danach kommt es zu einer Weiterverbreitung des
Virus in anderes Lymphgewebe und zu einer Infektion von Endothelzellen und
anderen Epithelzellen (SUSA et al., 1992).
Obwohl alle Leukozytensubpopulationen durch das KSPV infiziert werden können
(SOOS
et
al.,
2000),
wurden
unreife
Granulozyten
und
Monozyten
als
Hauptzielzellen für das Virus im peripheren Blut 7-10 Tage p.i. identifiziert
(SUMMERFIELD et al., 1998). Unreife Granulozyten, die normalerweise nur im
Knochenmark anzutreffen sind, finden sich vermehrt im Blut infizierter Tiere, wobei
die Anzahl der reifen Granulozyten vermindert ist. Reife Granulozyten aus dem Blut
sind in vitro nicht empfänglich für KSPV, jedoch lassen sich unreife Granulozyten aus
dem Knochenmark infizieren. Deshalb wird angenommen, dass in vivo die initiale
Infektion unreife Myeloblasten betrifft, die sich dann weiter zu reifen Granulozyten
differenzieren und weiterhin virales Antigen enthalten (SUMMERFIELD et al., 1998).
Der Beginn der Lymphopenie und der Anstieg der unreifen Granulozyten im
peripheren Blut zeigt sich, je nach Virusisolat, deutlich ein bis vier Tage bevor Virus
oder virale RNA in den Leukozyten nachgewiesen werden kann. Diese Feststellung
führte zu der Hypothese, dass die Leukopenie nicht durch direkte Virusschädigung,
sondern
indirekt
virusinduzierte
über
Störung
Virus-Wirt-Interaktionen
der
Myeloidzellfunktion
hervorgerufen
wird
als
wird.
Ursache
Eine
diskutiert
(SUMMERFIELD et al., 2000).
Die akute Schweinepest ist in der Endphase der Erkrankung unter anderem durch
das Auftreten zahlreicher Blutungen in verschiedenen Organen gekennzeichnet
(HEENE et al., 1971). Im Vordergrund der Gerinnungsstörungen steht ein massiver
Thrombozytenabfall, der schon ab dem zweiten Tag nach der Infektion deutlich wird.
Dies wird zum einen durch eine direkte Thrombozytenschädigung durch das Virus
(WEISS et al., 1973) und zum anderen durch eine fortschreitende massive
Degeneration der Megakaryozyten erklärt (HOFFMANN et al., 1971b). GOMEZVILLAMANDOS (1998) konnte nachweisen, dass zwei Tage nach der Infektion 2,59%
der
Megakaryozyten
mit
dem
KSPV
infiziert
waren,
und
dass
die
Plättchenfreisetzung aus den infizierten Megakaryozyten die Verbreitung des Virus
unterstützt.
28
Literaturübersicht
Das Auftreten von Mikrothromben in verschiedenen Organen zeigt morphologisch
das Bild einer disseminierten intravasalen Gerinnung (DIK) (HOFFMANN et al.,
1971a).
Bei
gerinnungsanalytischen
Untersuchungen
wurden
zahlreiche
Hämostasedefekte gefunden, die im Sinne einer DIK (Verbrauchskoagulopathie)
gedeutet werden können (HEENE, 1971). Bei der akuten Schweinepest erfolgt die
Aktivierung
der
Gerinnungskaskade
vor
allem
durch
die
Freisetzung
prokoagulatorischer Substanzen (Gewebethromboplastine) aus virusgeschädigten
Zellen, z.B. lymphatischen Geweben. Außerdem können die bei der KSP
auftretenden
Endothelläsionen
verstärken (HOFFMANN, 1976).
die
Verbrauchskoagulopathie
auslösen
oder
Literaturübersicht
29
2.3 Virulenz und Wirtsfaktoren
2.3.1 Virulenz
Unter der Virulenz eines Erregers versteht man den Grad seiner krankmachenden
Eigenschaften. Da die Virulenz innerhalb einer Erregerart sehr stark variieren kann,
bezieht sie sich immer auf einen bestimmten Erregerstamm unter definierten
Infektions- und Wirtsbedingungen (ROLLE u. MAYR, 1993).
Das Virus der Klassischen Schweinepest zeigt eine sehr große Variationsbreite
hinsichtlich seiner Virulenz. Es lassen sich avirulente und virulente Stämme
voneinander unterscheiden. Die avirulenten Stämme, die meist durch Attenuierung in
heterologen Wirten, z.B. Kaninchen, entstanden sind, werden als Impfstämme
genutzt
(MOENNIG u. PLAGEMANN, 1992). Die virulenten Vertreter des KSPV
werden in der Literatur oft in Gruppen von hoher, moderater und schwacher Virulenz
eingeteilt. Es wurden mehrfach Studien durchgeführt, um die Virulenz bestimmter
KSPV-Stämme zu quantifizieren, wobei jedoch eine klare Definition bisher nicht
vorliegt. Es gibt verschiedene Ansätze, die Virulenz des KSPV zu bestimmen.
Folgende Kriterien wurden zur Charakterisierung herangezogen:
ð Mortalität, klinische Symptome, pathologische Veränderungen (CARBREY et
al., 1977, VAN OIRSCHOT, 1988, WOOD et al., 1988, KAMOLSIRIPRICHAIPORN
et al., 1992, MITTELHOLZER et al., 2000).
ð Wachstumseigenschaften in Zellkulturen (AYNAUD et al., 1972, 1976, VAN
OIRSCHOT, 1988, MITTELHOZER et al., 2000).
ð Veränderungen auf der Genomebene (MOORMANN et al., 1996, BJORKLUND
et al., 1998, MEYERS et al., 1999, MAYER et al., 2002).
30
Literaturübersicht
Vor 1980 traten vor allem perakute und akute Verlaufsformen mit hoher Mortalität,
möglicherweise
ausgelöst durch hochvirulentes Virus, auf. In den letzten
Jahrzehnten wurden jedoch vermehrt inapparente oder atypische Formen der KSP
beobachtet, die mit Virusisolaten von moderater oder schwacher Virulenz in
Verbindung gebracht wurden (PLATEAU et al., 1980, MOENNIG u. PLAGEMANN,
1992, DEPNER et al., 1996b, TERPSTRA et al., 2000).
Von 135 Feldisolaten, die in den letzten zehn Jahren vor der KSP-Eradikation in den
USA getestet wurden, waren 27% schwach virulent und 22% avirulent (CABREY et
al., 1980), wobei allerdings nicht erwähnt wurde, welche Kriterien der Einteilung der
Virulenz zugrunde lagen.
Die Virulenz des KSPV scheint eine unstabile Eigenschaft zu sein, da sie sich im
Verlauf eines Seuchenzuges auch ändern kann (ANON., 1977). Es wurde über eine
Virulenzsteigerung nach mehreren Passagen in Schweinen berichtet (KORN et al.,
1964). Eine Virulenzminderung konnte durch wiederholte Passagen in Zellkulturen
oder in Kaninchen oder Ziegen erreicht werden (VAN OIRSCHOT, 1988).
Neben der Virulenz des Erregers sind für den Krankheitsverlauf auch noch andere
Faktoren wichtig. Dazu zählen die Virusdosis (DAHLE u. LIESS, 1995), der
Infektionsmodus (LIESS et al., 1977), Herkunft und Reinheit des Inokulums (DAHLE
u. LIESS, 1995) und zahlreiche Wirtsfaktoren, wie z.B. das Alter der Tiere (DAHLE u.
LIESS, 1995, DEPNER et al., 1996a). Deshalb ist es von großer Bedeutung, dass
bei der Beurteilung der Virulenz in Tierversuchen standardisierte Bedingungen
gewährleistet sind, die die oben genannten Faktoren berücksichtigen (DAHLE u.
LIESS, 1995).
Literaturübersicht
31
2.3.1.1 Charakterisierung der Virulenz des KSPV aufgrund klinischer Symptome und
pathologischer Veränderungen.
Üblicherweise basiert die Charakterisierung der Virulenz auf der Beurteilung klinischpathologischer Symptome und der Mortalität.
CARBREY et al. (1977) unterteilten KSPV-Isolate in hoch virulent, schwach virulent
und
avirulent,
sowie
in
Isolate,
die
persistierende
Infektionen
auslösten.
Hochvirulente Isolate führten zu einer schweren Erkrankung mit letalem Ausgang.
Bei der Sektion zeigten sich KSP-typische Veränderungen und das Virus konnte aus
Organproben isoliert werden. Schwach virulente Isolate führten nach einem
protrahierten
Krankheitsverlauf
zum
Tode
der
Tiere
oder
zur
Genesung.
Pathologische Veränderungen waren schwach ausgeprägt, aber das Virus konnte
aus Organproben isoliert werden. Avirulente Isolate lösten keine Erkrankung aus und
führten zu einer belastbaren Immunität. Isolate, die eine persistierende Infektion
hervorriefen, wurden gesondert aufgeführt. KAMOLSIRIPRICHAIPORN et al. (1992)
haben zwei KSPV-Stämme (NSW, WEYBRIDGE) bezüglich ihrer Pathogenität im
Tierversuch miteinander verglichen. Der NSW-Stamm zeigte im Vergleich zum
WEYBRIDGE-Stamm einen späteren Fieberbeginn, mildere klinische Symptome,
eine nicht so ausgeprägte Leukopenie und weniger deutliche pathologische
Veränderungen. Aufgrund der Tatsache, dass der WEYBRIDGE-Stamm bei allen
Schweinen eine akut-letale Erkrankung auslöste, wurde er als hoch virulent
eingestuft. Der NSW-Stamm verursachte nur einen milden Krankheitsverlauf und
wurde als schwach virulent charakterisiert. Die Virustiter in den meisten Organproben
und dem Blut waren für den WEYBRIDGE-Stamm signifikant höher als bei dem
NSW-Stamm.
Die Klassifizierung der Virulenz durch VAN OIRSCHOT (1988) berücksichtigte nur
die Mortalität, während Faktoren, die den Verlauf der Erkrankung beeinflussen, kaum
oder gar nicht erwähnt wurden. Nach seiner Definition töteten hoch virulente Stämme
nahezu alle Tiere, unabhängig vom Alter. Bei der akut-letalen Form der KSP,
ausgelöst durch ein hoch virulentes Virus, war die Virusausbreitung im Organismus
gekennzeichnet durch eine lymphatische, virämische und viszerale Phase. Das Virus
32
Literaturübersicht
vermehrte sich zu hohen Titern in den Zielzellen und die Virusausbreitung war in der
Regel schon nach 5 bis 6 Tagen abgeschlossen. Es kam zu einer persistierenden
Leukopenie, die bis zum Tode der Tiere bestehen blieb. Die Infektion breitete sich
schnell in einem Bestand aus. Moderat virulente Stämme verursachten einen
subakuten bis chronischen Krankheitsverlauf, der zum Tod oder zur Genesung der
Tiere führte. Die Infektion mit moderat virulentem Virus war besonders durch die
große Variationsbreite im klinischen Bild gekennzeichnet. Schwach virulentes Virus
führte zu keinen oder nur wenigen Krankheitssymptomen, konnte aber nach
transplazentarer Übertragung negative Folgen für die Feten haben. Die postnatale
Infektion mit schwach virulentem Virus blieb meist auf die lymphatische Phase der
Erkrankung beschränkt. Kam es zu einer Virämie, so war diese meist von kurzer
Dauer und es wurden nur niedrige Virustiter erreicht. Schweine, die mit schwach
virulentem Virus infiziert waren, zeigten eine transiente Leukopenie. Allerdings
konnte nach Infektion von Schweinen mit den schwach virulenten Stämmen Bergen,
Henken und Zoelen kein signifikanter Abfall der Leukozyten festgestellt werden
(STEGEMANN et al., 2000). Im Bestand breitete sich die Infektion nur langsam aus.
Avirulente Stämme waren apathogen, dabei handelte es sich meist um attenuierte
Impfstämme (VAN OIRSCHOT, 1988).
Im Gegensatz zu VAN OIRSCHOT (1988) haben MITTELHOLZER et al. (2000) bei
der Einteilung der Virulenz die klinischen Symptome und deren Ausprägungsgrad mit
einbezogen. Sie entwickelten ein Untersuchungsschema, das 10 KSP-relevante
Symptome berücksichtigt (Untersuchungsschema s. Kapitel 3.2.1). Je nach
Ausprägungsgrad wurde jedes Symptom mit 0-3 Punkten beurteilt (0 = kein
Symptom, 1 = wenig verändert, 2 = deutliches klinisches Symptom, 3 = schweres
KSP-Symptom). Damit konnte eine maximale Punktzahl von 30 pro Tag und Tier
erreicht werden. Zusätzlich wurde der Fieberverlauf berücksichtigt. Sieben KSPVStämme wurden untersucht. Hierzu wurden ca. 30 kg schwere spezifisch
pathogenfreie Schweine (SPF) mit einer Inokulationsdosis von 106 KID50 intranasal
infiziert. KSPV-Stämme, die eine Punktzahl von >15 und Fieber >41 °C erreichten,
wurden als hoch virulent klassifiziert (BRESCIA, EYSTRUP, KOSLOV). Stämme, die
eine Punktzahl zwischen 5 und 15 und Fieber >40 °C <41 °C erreichten, wurden als
Literaturübersicht
33
moderat virulent eingestuft. Zu den moderat virulenten Vertretern gehörten ein
gentechnisch hergestellter Klon von Alfort 187, vA187-1 (RUGGLI et al., 1996), und
der zytopathogene Vertreter desselben Klons, cp vA187-1 (MITTELHOLZER et al.,
1997). Schwach virulente Stämme wurden durch eine Punktzahl < 5 definiert. Bei
avirulenten Stämmen beträgt der Clinical Score immer 0. Hierzu zählten der KSPVStamm vA187-ubi, bei dem das Npro-Gen durch ein murines Ubiquitin-Gen ersetzt
wurde (TRATSCHIN et al., 1998) und der Stamm CAP, der aus einer persistent
infizierten porzinen Zellinie stammt. Die Tatsache, dass der zytopathogene Partner
(cp vA187-1) des Klons Alfort (vA187-1) und dieser Klon selbst einen sehr ähnlichen
Krankheitsverlauf verursachten, deutet darauf hin, dass Zytopathogenität in vitro
nicht mit der Virulenz in vivo korreliert (MITTELHOLZER et al., 2000).
2.3.1.2 Differenzierung der Virulenz des KSPV durch „in-vitro“-Unterschiede
Neben der Unterscheidung im Tierversuch wurden auch „in-vitro“-Unterschiede zur
Differenzierung der Virulenz der verschiedenen Stämme beschrieben. Hoch virulente
Stämme wuchsen optimal bei einer Temperatur zwischen 39°C und 40°C,
wohingegen das Temperaturoptimum von schwach virulenten Stämmen zwischen
33°C und 34°C lag. Außerdem zeigten hoch virulente Stämme eine größere
Hitzeresistenz bei 56°C (AYNAUD et al., 1976). Virulentes Virus vermehrte sich
schneller und zu höheren Titern in Zellkulturen als weniger virulentes Virus (VAN
OIRSCHOT, 1988). Im Zellkulturüberstand konnte bei Infektion der Zellen mit
hochvirulentem Virus ein höherer Titer nachgewiesen werden als bei Infektion mit
schwach virulentem Virus (MITTELHOLZER et al., 2000). Nach der Infektion von
PK(15)-Zellen mit hoch virulentem Virus waren bei der Immunfluoreszenztechnik
große, stark fluoreszierende Foci sichtbar, während schwach oder moderat virulente
Stämme nur kleine, schwach fluoreszierende Foci hervorriefen (VAN OIRSCHOT,
1988).
34
Literaturübersicht
2.3.1.3 Genetische Marker für die Virulenz des KSPV
Eine Erklärung für die unterschiedliche Virulenz der KSPV-Stämme auf molekularer
Ebene gibt es bisher nicht, ebenso ist der molekulare Mechanismus der Attenuierung
noch nicht endgültig geklärt. Diskutiert wird z.Zt. ob eine T-reiche Insertion von ca. 13
Nucleotiden, die in der 3’ nichttranslatierten Region verschiedener Impfstämme
(C-Stamm, HCLV u.a.) vorhanden ist, eine Rolle bei der Attenuierung spielt
(MOORMANN et al., 1996, WONG et al., 2001, WU et al., 2001). Die Sequenzen der
5’- und 3’-nichttranslatierten Regionen sind von Bedeutung bei der Erkennung der
RNA durch die virale Replikase und damit für die Virusreplikation (MOORMANN et
al., 1996). Die Insertion führt zu einer Änderung der Sekundärstruktur und war
möglicherweise für die verminderte Replikationsrate der Impfstämme verantwortlich.
Bisher wurde bei keinem virulenten Stamm eine solche Insertion gefunden (WU et
al., 2001). Allerdings war bei einigen der untersuchten Impfstämme diese Insertion
ebenfalls nicht vorhanden (BJORKLUND et al., 1998).
Es konnte gezeigt werden, dass hoch virulente KSP-Stämme nach Entfernen des
Nichtstrukturproteins Npro avirulent wurden. Allerdings kam es nach Austausch des
Npro eines hoch virulenten Stammes durch das Npro eines schwach virulenten
Stammes zu keiner Virulenzänderung (MAYER et al., 2002). Mutanten des KSPVStammes Alfort/Tübingen, bei denen die RNase-Aktivität des Glykoproteins Erns
inaktiviert wurde, waren im Tierversuch apathogen. Der kausale Zusammenhang
zwischen der Enzyminaktivierung und der Attenuierung konnte bisher jedoch noch
nicht bewiesen werden (MEYERS et al., 1999).
Literaturübersicht
35
2.3.2 Wirtsfaktoren
Der Krankheitsverlauf der KSP wird nicht nur von der Virulenz des jeweiligen Isolates
bestimmt. Wirtsfaktoren, wie Alter, Ernährungszustand, Immunkompetenz und die
Genetik der Tiere, haben ebenfalls einen Einfluss auf das Krankheitsgeschehen
(VAN OIRSCHOT, 1988, DEPNER et al., 1996a, 1997).
Ein wichtiger Faktor, der den Verlauf der Infektion beeinflusst, ist das Alter der Tiere.
Die Morbitität und Mortalität sinkt mit zunehmendem Alter. Während Saug- und
Absatzferkel schwer erkrankten und die Sterblichkeit hoch war, zeigten adulte Tiere
bei Infektion mit dem gleichen Isolat oft nur einen milden bis subklinischen
Krankheitsverlauf (DEPNER et al., 1996a).
Bei der transplazentaren Infektion sind die Folgen wesentlich vom Zeitpunkt der
Infektion und damit von der Entwicklung des Immunsystems des Fetus abhängig. Je
nach Trächtigkeitstadium kam es zu Aborten, Totgeburten, Mumifikationen und
Missbildungen oder zur Geburt persistent virämischer Ferkel (MEYERS et al., 1981,
VAN OIRSCHOT et al., 1999).
Aufgrund der Vermutung, dass auch genetische Faktoren für die verschiedenen
Krankheitsbilder der KSP verantwortlich sind, wurden fünf halothan-negative
Absatzferkel der Deutschen Landrasse (DL) und fünf gleichaltrige halothan-positive
Kreuzungstiere (DL x Pietrain) mit der gleichen Virusdosis infiziert (DEPNER et al.,
1997). Während die DL-Tiere akut erkrankten, zeigten nur zwei Kreuzungstiere die
akute Form der KSP. Bei einem Kreuzungstier konnte die mild-transiente Form der
KSP diagnostiziert werden und zwei Tiere erkrankten an der chronischen Form der
KSP. Auch beim Vergleich der Körpertemperaturen zwischen diesen beiden Gruppen
waren deutliche Unterschiede festzustellen. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin,
dass die KSPV-Infektion auch von der genetischen Konstitution des Wirtes bestimmt
sein könnte (DEPNER et al., 1997).
3. Eigene Untersuchungen
3.1 Material
3.1.1 Tiere und Versuchsaufbau
Im Europäischen Referenzlabor für Klassische Schweinepest (EURL) in Hannover
wurden zwei Tierversuche (Aktenzeichen: 01A 78) mit folgenden Zielsetzungen
durchgeführt:
1. Bestimmung der Virulenz von vier KSPV-Feldisolaten
2. Vergleich des Krankheitsverlaufes der KSP von Reinzucht- und Kreuzungstieren
Bei den Tieren des ersten Versuches handelte es sich um Absatzferkel der
Deutschen Landrasse (DL), die zu Versuchsbeginn ein Alter von acht Wochen
hatten. Sie wurden einmal am Tag mit kommerziell erhältlichem Futter, speziell für ihr
Alter, gefüttert. Ein vor Beginn des Versuches durchgeführter serologischer Test auf
neutralisierende Antikörper gegen Pestiviren war negativ.
Zur Infektion wurden vier verschiedene KSPV-Feldisolate (CSF 0650, CSF 0695,
CSF 0634 und CSF 0277) verwendet. Mit jedem Virusisolat wurden jeweils fünf
Schweine infiziert, die zusammen in einer Isolierstalleinheit gehalten wurden.
Zwischen den einzelnen Isolierstalleinheiten bestand keine Verbindung. Die
Schweine wurden mit 5 ml virushaltigem Zellkulturüberstand, der eine Virusdosis von
104 KID50 enthielt, intranasal infiziert. Während des gesamten Versuches wurden die
Tiere täglich nach einem vorgegebenen Schema (s. Kap. 3.2.1) klinisch untersucht.
Die rektale Körpertemperatur wurde ebenfalls täglich ermittelt. Als Kontrolltiere
dienten zwei Schweine, die unter den gleichen Bedingungen gehalten wurden wie
die Versuchstiere, jedoch nicht infiziert wurden.
Eigene Untersuchungen
37
Im zweiten Tierversuch dienten Schweine der Deutschen Landrasse und
Hybridschweine
(DL
×
Pietrain)
als
Versuchstiere.
Die
Tiere
waren
zu
Versuchsbeginn acht Wochen alt. Die Haltung der Tiere, die Virusdosis, der
Inokulationsweg sowie die klinische und postmortale Untersuchung waren mit den
Bedingungen im ersten Tierversuch identisch. Eine vor Beginn des Versuches
durchgeführte serologische Untersuchung auf neutralisierende Antikörper gegen
Pestiviren war bei allen Schweinen negativ. Im ersten Versuchsdurchgang wurden je
fünf Schweine beider Rassen mit dem zuvor als moderat virulent klassifizierten
Virusisolat CSF 0277 infiziert. Im zweiten Versuchsdurchgang erhielten je fünf
weitere Tiere der Deutschen Landrasse und fünf Hybridschweine das als hoch
virulent eingestufte Virusisolat CSF 0634. Bei beiden Versuchsdurchgängen dienten
je zwei nicht infizierte Schweine als Kontrolltiere.
Bei
beiden
Tierversuchen
richtete
sich
die
Versuchsdauer
nach
dem
Krankheitsverlauf der KSP. Moribunde Tiere wurden aus Gründen des Tierschutzes
beim Vorliegen eines CS von mindestens 15 euthanasiert. Die euthanasierten
Schweine wurden noch am selben Tag in einer Sektion auf pathologische
Veränderungen untersucht. Die Schweine, die sich von der Infektion erholten,
wurden nach vollständiger Genesung und Entwicklung einer effektiven Immunantwort
gegen das KSPV euthanasiert und ebenfalls einer Sektion unterzogen.
3.1.2 Gewinnung und Aufbereitung der Blutproben
Für hämatologische, serologische und virologische Untersuchungen wurden den
Schweinen zweimal wöchentlich Blutproben aus der Jugularvene entnommen. Vor
Beginn der Versuche fand eine einmalige Blutentnahme statt. Es wurden
kommerziell erhältliche Blutentnahmeröhrchen der Fa. KABE® Labortechnik GmbH
verwendet. Die Weiterverarbeitung des für virologische und hämatologische
Untersuchungen entnommene EDTA-Blutes erfolgte noch am selben Tag. Das zur
Serumgewinnung entnommene Blut wurde für 15 Min. bei ca. 1200 x g/min
zentrifugiert, in Plastikröhrchen portioniert und bei –80 °C aufbewahrt.
38
Eigene Untersuchungen
3.1.3 KSP-Viren
Die KSPV-Isolate stammten aus der Virusbank des Europäischen Referenzlabors für
KSP in Hannover und sind in der Datenbank des Referenzlabors registriert
(GREISER-WILKE et al., 2000a). Die Datenbank ist im World Wide Web (WWW)
unter der Adresse http://viro08.tiho-hannover.de/eg/csf präsentiert. Benutzer erhalten
nach Registrierung und Vergabe eines Passwortes Zugang zu der Datenbank.
Das CSF-Isolat 0277 wurde 1997 bei einem KSP-Ausbruch in Nordrhein-Westfalen
aus einem Hausschwein isoliert. Aufgrund der phylogenetischen Analyse konnte es
dem Genotyp 2.1 Paderborn zugeordnet werden (GREISER-WILKE et al., 2000b).
Das CSF-Isolat 0634 stammt aus Niedersachsen, wo es 1999 aus einem
Hausschwein isoliert wurde. Es wurde in die Genotypgruppe 2.3 Uelzen eingeordnet
(WONNEMANN et al., 2001). Dieser Typ zirkuliert auch in der Wildschweinepopulation in Niedersachsen (FRITZEMEIER et al., 2000).
Das CSF-Isolat 0695 wurde 1996 aus einem Hausschwein in Russland isoliert. Es
wurde dem Genotyp 1.1 zugeordnet, der die in Russland zirkulierenden Virusisolate
repräsentiert (VLASOVA et al., 2000).
Das CSF-Isolat 0650 aus Guatemala gehört aufgrund der phylogenetischen Analyse
dem Genotyp 1.3 an. Es wurde 1999 im National Veterinary Services Laboratory
(NVSL), Ames, Iowa, USA aus Organmaterial eines Hausschweines isoliert
(FLOEGEL-NIESMANN, persönliche Mitteilung). Die beiden Isolate CSF 0650 und
CSF 0695 waren bisher nicht im Tierversuch charakterisiert worden.
Der KSPV-Referenzstamm Alfort/187 (DAHLE u. LIESS, 1995) wurde als
Positivkontrolle bei der Virusisolierung eingesetzt.
Eigene Untersuchungen
39
3.1.4 Antikörper
Der Nachweis des KSP-Virus erfolgte mit dem anti-BVD monoklonalen Antikörper
(mAk)
BVD/C16,
der
gegen
das
bei
allen
Pestiviren
stark
konservierte
Nichtstrukturprotein NS2-3 gerichtet ist (GREISER-WILKE et al., 1992). Er wurde im
Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover hergestellt (PETERS et
al., 1986) und wird in der Schweinepestdiagnostik routinemäßig eingesetzt
(FLOEGEL-NIESMANN, persönliche Mitteilung). Der Antikörper lag als Peroxidase
(PO)-Konjugat vor.
3.1.5 Zelllinie Porcine Kidney (15) Amsterdam (PK(15)A)
Bei der Zelllinie PK(15)A (porcine kidney (15) Amsterdam) handelt es sich um eine
permanente epitheloide Zelllinie, die im Europäischen Referenzlabor für KSP in
Hannover als Referenzzelllinie für die KSP-Diagnostik und KSPV-Vermehrung
eingesetzt wird. Sie wurde 1974 durch Einzelzellklonierung erhalten. Die Klone sind
frei von BVDV und Mykoplasmen. Die Kultivierung erfolgte mit EMEM (Earle’s
Minimum Essential Medium) unter Zusatz von 5 % fetalem Kälberserum (FKS),
welches auf Abwesenheit von BVDV und Antikörpern (Ak) gegen BVDV untersucht
wurde (genaue Zusammensetzung unter 8.2.1)
3.1.6 Sonstige Materialien
Rezepturen für Zellkulturmedien, Lösungen und Puffer sind im Anhang unter 8.2 zu
finden. Zusätzlich verwendete Chemikalien sind in 8.3 zusammengefasst. Die
benutzten Geräte und Gebrauchsgegenstände sind in 8.4 aufgeführt. Die
verwendeten Verbrauchsmittel sind unter 8.5 zusammengestellt.
Eigene Untersuchungen
40
3.2 Methoden
3.2.1 Bestimmung des Clinical Score (nach Mittelholzer et al., 2000)
Zur Charakterisierung der Virulenz von KSPV-Isolaten und zum Vergleich des
Krankheitsverlaufes bei Tieren verschiedener Rassen wurde ein standardisiertes
Untersuchungsschema verwendet, das den Krankheitsverlauf über einen klinischen
Schlüssel (Tab. 2) festhält. Dabei wurden neun KSP-relevante klinische Parameter
untersucht und je nach Ausprägungsgrad mit einer Punktzahl von 0 bis 3 bewertet.
Nach deren Addition ergab sich für jeden Tag die klinische Punktzahl (Clinical Score)
eine Tieres. Für jedes Tier wurde die maximal erreichte Punkzahl (CS), die ein Tier
im Verlauf der Infektion erreichte, gewertet. Eine maximale Punktzahl von 27 war zu
erreichen. Der durchschnittliche Clinical Score (Ø) wurde für jedes KSPV-Isolat
berechnet (Summe CS der Einzeltiere/Anzahl der Tiere).
Das Untersuchungsschema von MITTELHOLZER et al. (2000) enthält zehn
Parameter. Der Parameter „Futter im Trog“ konnte in der vorliegenden Arbeit
aufgrund der Tierhaltung nicht bewertet werden. Aus diesem Grund wurde die von
MITTELHOLZER et al. (2000) gewählte Grenze für hoch virulente Isolate von >15 auf
>14 gesenkt.
Die Einteilung der KSP-Viren in die verschiedenen Kategorien der Virulenz erfolgte
wie in Tab. 1 beschrieben.
Tab. 1: Einteilung der Virulenz
Virulenz
Clinical Score
Fieber in °C
Hoch virulent
>14
>41 °C
Moderat virulent
>5 ≤14
>40 °C <40 °C
Schwach virulent
0-5
<40 °C
Avirulent
0
–
Eigene Untersuchungen
41
Tab. 2: Klinischer Schlüssel zur Bestimmung des Clinical Score (CS) nach
MITTELHOLZER et al. (2000)
Nr.
Parameter
1.
Lebhaftigkeit
2.
3.
4.
5.
Haltung
Nährzustand
Atmung
Gang
Ausprägungsgrad
CS
- aufmerksam, neugierig, steht sofort auf
0
- etwas müde, steht zögernd, aber selbständig auf
1
- müde, steht nur unter Zwang auf, liegt wieder ab
2
- schläfrig, nicht zum Aufstehen zu bewegen
3
- entspannte Haltung, gerader Rücken
0
- beim Aufstehen steif, aufgekrümmter Rücken
1
- aufgekrümmter Rücken, steifer Gang über längere Zeit
2
- stark aufgekrümmter Rücken oder steht nicht auf
3
- voller Bauch, rund
0
- leerer Bauch
1
- leerer Bauch, schwache Bemuskelung
2
- eingefallene Flanken, Wirbeln und Rippen sichtbar
3
- Atemfrequenz 10-15/min
0
- Atemfrequenz > 20/min
1
- Atemfrequenz > 20/min, deutliche Atembewegung
2
- Atemfrequenz > 30/min, Maulatmung
3
- koordinierte Bewegungen ohne Unsicherheiten
0
- unsicherer Gang, korrigiert überkreuzte Beine zögernd
1
- deutliche Ataxie/ Hinterhandschwäche, gehfähig
2
- schwere Lähmungserscheinungen, nicht gehfähig
3
Eigene Untersuchungen
42
6.
Haut
- gleichmäßig hellrosa, Borsten anliegend
0
- gerötete Hautbereiche
1
- blaurot verfärbte, kalte Hautbereiche, einzelne
punktförmige Blutungen
2
- schwarzblaue Verfärbung, keine Sensibilität,
7.
Augen/Konjunktiven
8.
9.
10.
Appetit
Kotabsatz
großflächige Hautblutungen
3
- blassrosa
0
- gerötet, klares Sekret
1
- stark gerötet, trübes Sekret
2
- stark gerötet, eitriges Sekret, Gefäßinjektion
3
- gierig auf angebotenes Futter
0
- frißt angebotenes Futter zögernd
1
- frißt angebotenes Futter nicht, schnuppert aber daran
2
- frißt nichts, kein Interesse an Futter
3
- geformter Kot, Menge normal
0
- leichter Durchfall
1
- dünnbreiiger Durchfall
2
- wässriger (blutiger) Durchfall
3
Futter im Trog - Trog leer, sauber ausgefressen
0
(nicht bewertet)
- Trog fast leer, wenig Futterreste übrig
1
- Futter nur teilweise gefressen, viel Futter übrig
2
- Trog noch voll, nichts gefressen
3
Eigene Untersuchungen
43
3.2.2 Bestimmung des Pathological Score
Analog zur Bestimmung des Clinical Score wurde auch für die postmortale
Untersuchung ein standardisiertes Untersuchungsschema verwendet, das die
pathologischen Veränderungen über einen pathologischen Schlüssel (Tab. 3)
festhält. Dabei wurden zehn KSP-relevante, pathologische Parameter untersucht und
je nach Ausprägungsgrad mit einer Punktzahl von 0 bis 3 bewertet. Nach deren
Addition ergab sich die pathologische Punktzahl (Pathological Score). Eine maximale
Punktzahl
von
30
durchschnittliche
war
zu
Pathological
erreichen.
Score
Für
(PS)
jedes
KSPV-Isolat
berechnet
(Summe
wurde
PS
der
der
Einzeltiere/Anzahl der Tiere). Bei allen Schweinen wurde eine pathologische
Untersuchung durchgeführt. Moribunde Tiere wurden aus Gründen des Tierschutzes
beim Vorliegen eines CS von mindestens 15 euthanasiert. Schweine, die sich von
der Infektion erholten, wurden nach vollständiger Genesung euthanasiert.
Tab. 3: Pathologischer Schlüssel zur Bestimmung des Pathological Score (PS)
Nr.
Parameter
1.
Haut
2.
PS
- gerötete Hautbereiche
1
- einzelne punktförmige Blutungen
2
- großflächige Hautblutungen
3
- einzelne Petechien
1
- Petechien an mehreren Lokalisationen
2
- multiple Petechien
3
- Schwellung
1
- Schwellung und unregelmäßige Hämorrhagien
2
- Schwellung und generalisierte Hämorrhagien
3
Subkutis und
Serosen
3.
Ausprägungsgrad
Lnn.
inguinales
Eigene Untersuchungen
44
4.
Lnn.
mandibulares
5.
7.
8.
9.
- Schwellung und unregelmäßige Hämorrhagien
2
- Schwellung und generalisierte Hämorrhagien
3
- Schwellung
1
- Schwellung und unregelmäßige Hämorrhagien
2
- Schwellung und generalisierte Hämorrhagien
3
- Schwellung
1
- Erythem
2
- Nekrose
3
- kleiner Milzinfarkt
1
- deutlicher Milzinfarkt
2
- multiple hämorrhagische Milzinfarkte
3
- einzelne Petechien
1
- Petechien an mehreren Lokalisationen
2
- multiple Petechien
3
- Erythem
1
- Erythem und kleine Nekrose
2
- multiple Nekrosen oder „button ulcer“
3
- Bronchitis
1
- Bronchopneumonie oder Pleuritis
2
- Bronchopneumonie und Pleuritis
3
Tonsillen
Milz
Nieren
Ileum und
Rektum
10.
1
Ln.
ileocaecalis
6.
- Schwellung
Respirationstrakt
Eigene Untersuchungen
45
3.2.3 Zellkulturtechnik
Die Kultivierung und Vermehrung der PK(15)A-Zelllinie erfolgte in 75 cm2 Plastikzellkulturflaschen unter Verwendung von EMEM-Kulturmedium mit 5 % FKS. Die
Inkubation der Zellen erfolgte bei 37 °C im Brutschrank. Nach drei bis vier Tagen war
der Zellrasen konfluent. Wurde nur eine Zellpassage pro Woche benötigt, erfolgte
nach vier Tagen ein Mediumwechsel. Täglich erfolgte eine makroskopische und
mikroskopische Kontrolle der Zellkultur, wobei die Mediumfarbe (pH-Wert),
eventuelle Trübungen des Mediums (Kontaminationen) und der Zellrasen selbst
beurteilt wurden. Zur Zellpassagierung wurde das Medium abpipettiert und der
Zellrasen mit 5 ml ATV (adjusted trypsin-versen)-Lösung ca. 30 Sekunden
gewaschen. Nach Entfernung der Waschlösung wurde 2 ml frisches ATV
hinzugegeben. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C ca. 15 min, bis sich der Zellrasen
abgelöst hatte. Nach Zugabe von 8 ml Kulturmedium wurden die Zellen durch
mehrmaliges auf- und abpipettieren vereinzelt und so eine homogene Zellsuspension
hergestellt. Die Zellzahl wurde mit der Thoma-Zählkammer bestimmt und die
entsprechende Menge Zellsuspension (Zellzahl: 1,6 x 106 Zellen) in eine neue
Zellkulturflasche pipettiert. Dann wurde 20 ml frisches Kulturmedium hinzugefügt. Bei
Zellkulturröhrchen, Makro- und Mikrotiterplatten wurde die ermittelte Menge
Zellsuspension zunächst auf das benötigte Gesamtvolumen mit Kulturmedium
aufgefüllt, bevor die Kulturgefäße befüllt wurden.
46
Eigene Untersuchungen
3.2.4 Virusvermehrung und Virusernte
Die vier verwendeten Virusisolate wurden vermehrt, um einen Vorrat für die
Tierversuche und die Virusneutralisationstests anzulegen. Zu einer am Vortag
angesetzten Zellkulturflasche (75 cm2) mit PK(15)A-Zellen (Zelleinsaat: 1,6 x 106
Zellen) wurde, nach Entfernen des Mediums, 1 ml der jeweiligen Virussuspension
hinzugefügt. Die Kulturflaschen wurden bei 37 °C für 1 bis 2 Stunden inkubiert. Dabei
wurden sie alle 15 min geschwenkt, um eine gleichmäßige Virusadsorption zu
gewährleisten. Danach wurde frisches Medium (EMEM mit 10% FKS) aufgefüllt.
Nach 72 h Inkubation bei 37 °C wurden die Zellkulturflaschen bei –80 °C tiefgefroren.
Zur Virusernte wurde das Zell-Virus-Gemisch zügig aufgetaut und bei 4 °C für 15 min
bei 800 x g zentrifugiert. Der Zellkulturüberstand wurde portioniert und bei –80 °C
gelagert.
3.2.5 Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion
Die Virusisolierung ist der „Goldstandard“ zum labordiagnostischen Nachweis des
KSPV (ANON., 2000). Zur Virusisolierung eignen sich Leukozyten, die aus
Blutproben mit Zusatz von Gerinnungshemmern, z.B. EDTA oder Heparin gewonnen
werden. Durch den Zusatz von EDTA-Dextran Lösung zu der Blutprobe wurden die
roten und weißen Blutzellen voneinander getrennt. Die Erythrozyten sedimentierten
und die Leukozyten verbanden sich mit dem Dextran und verblieben im Überstand.
Durch die Inokulation der Leukozyten auf PK(15)A-Zellen erfolgte eine Vermehrung
des möglicherweise vorhandenen Virus über zwei Passagen.
Eigene Untersuchungen
47
3.2.5.1 Gewinnung und Reinigung der Leukozyten
Zu ca. 10 ml EDTA-Blut wurden 0,5 ml EDTA-Dextran-Lösung hinzugefügt. Nach
vorsichtigem Schwenken wurde dieses Gemisch 1-3 h bei Raumtemperatur inkubiert,
bis sich eine deutliche obere weiße Phase abgesetzt hatte. Der weiße
leukozytenhaltige Überstand wurde abpipettiert und 10 min bei 450 x g zentrifugiert.
Nach der Zentrifugation waren die Leukozyten als weißes Pellet zu sehen. Der
Überstand wurde dekantiert und das Leukozytenpellet in 3-5 ml PBSM (engl.
phosphate buffered saline minus, phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Kalzium
u. Magnesium) resuspendiert und erneut zentrifugiert. Dieser Waschvorgang wurde
noch zweimal wiederholt. Danach wurde das Leukozytenpellet in 2 ml PBSM
aufgenommen und bei –80 °C tiefgefroren.
3.2.5.2 Virusisolierung über zwei Zellkulturpassagen
Zellkulturröhrchen mit PK(15)A-Zellen (Zelleinsaat: 8,5 x 104 Zellen) wurden 24 h bei
37 °C inkubiert. Das Kulturmedium wurde abgenommen und 200 µl der wieder
aufgetauten
Leukozytensuspension
hinzugefügt.
Je
Probe
wurden
zwei
Zellkulturröhrchen beimpft. Es folgte eine Inkubation für 1-2 h bei 37 °C.
Anschließend wurde jedes Kulturröhrchen zweimal mit 1,5 ml PBSM gewaschen und
mit 1 ml Kulturmedium (EMEM mit Antibiotikazusatz (Penicillin/Streptomycin) und
10% FKS) aufgefüllt. Für 72 h wurden die Röhrchen bei 37 °C inkubiert und danach
bei –80 °C für mindestens 1 h tiefgefroren. Anschließend wurden die wieder
aufgetauten Kulturröhrchen bei 800 x g für 10 min zentrifugiert. Von diesem
Überstand wurden 200 µl in eine Vertiefung einer, am Vortag angesetzten,
Makrotiterplatte mit PK(15)A-Zellen (Zelleinsaat: 1,6 x 106 Zellen) gegeben. Es folgte
eine Inkubation für 1-2 h bei 37 °C im Brutschrank mit Zusatz von 4% CO2. Danach
wurden die Vertiefungen mit 1 ml Kulturmedium (EMEM mit Antibiotikazusatz und 5%
FKS) befüllt. Nach einer Inkubation von drei Tagen bei 37 °C im 4% CO2-Brutschrank
erfolgte der KSPV-Nachweis auf der Makrotiterplatte mit der Direkten Immunfärbung
(DIF).
Eigene Untersuchungen
48
3.2.6 Virustitration
Zur Quantifizierung des Virusgehaltes diente die Virustitration. Hier wurde mittels
einer Endpunktverdünnungsmethode der Titer einer Virussuspension oder der
Virustiter im Serum bestimmt. Von der zu titrierenden Virussuspension wurde eine
Verdünnungsreihe in log10-Stufen von 10-1 bis 10-8 in EDulb-Medium mit
Antibiotikazusatz und 5% FKS hergestellt. Von jeder Verdünnungsstufe wurden je
100 µl in 4 Kavitäten einer Mikrotiterplatte gefüllt. Zusätzlich wurden als Zellkontrolle
je 100 µl Medium in 4 Kavitäten pipettiert. Anschließend wurde jede Kavität mit 50 µl
einer auf 354.000 Zellen pro ml eingestellten Zellsuspension von PK(15)A-Zellen
beschickt. Die Mikrotiterplatten wurden für 72 h bei 37 °C im 4% CO2-Brutschrank
inkubiert. Das Virusantigen wurde durch die Direkte Immunfärbung nachgewiesen.
Die Berechnung des Titers (50% kulturinfektiöse Dosis, KID50 ) erfolgte nach der
Formel von KÄRBER (1931):
log KID50 = L1,0 – Lint (S-0,5)
Dabei sind
L1,0 = Logarithmus der höchsten Verdünnung mit der Reaktionsrate (R) 1,0
L int = Logarithmus des Intervalles (int)
S = Summe der Reaktionsraten, begonnen bei der letzten Reaktionsrate, die 1,0
beträgt.
Eigene Untersuchungen
49
3.2.7 Virusneutralisationstest
Der Virusneutralisationstest (VNT) diente dem serologischen Nachweis von
spezifischen Antikörpern. Die auf Antikörper gegen das KSPV zu untersuchende
Serumprobe wurde mit einer definierten Virusmenge inkubiert. Danach wurden für
das KSPV empfängliche Zellen hinzugefügt und der Ansatz kultiviert. Befanden sich
homologe Antikörper in der Serumprobe, kam es zu einer Neutralisation der
Infektiosität der Viruspartikel, und die empfänglichen Zellen konnten nicht mehr
infiziert werden. Durch Anlegen einer Verdünnungsreihe der Serumprobe ließ sich
der Antikörpertiter berechnen. Dazu wurde in einer Mikrotiterplatte eine Serumverdünnungsreihe in 2er Stufen von 1:5 bis 1:640 hergestellt. Pro Verdünnungsstufe
wurden zwei Kavitäten beschickt. In jede Kavität der Testplatte wurde das gleiche
Volumen einer Virussuspension des homologen Virus mit einem Virusgehalt von
100 KID50/50µl hinzugefügt. Die Mikrotiterplatte wurde für 1 h bei 37 °C in einer
feuchten Kammer im 4% CO2-Brutschrank inkubiert. Danach wurden in jede Kavität
50 µl einer Zellsuspension von PK(15)A-Zellen (354.000 Zellen/ml) pipettiert und die
Mikrotiterplatte für 72 h bei 37 °C in einer feuchten Kammer inkubiert. Der
Virusantigennachweis erfolgte durch die Direkte Immunfärbung. Zur Überprüfung des
Virustiters der eingesetzten Virussuspension wurde eine Rücktitration durchgeführt.
Dabei wurde eine Verdünnungsreihe der Testvirussuspension bis 10-4 titriert
(Durchführung wie in Kap. 3.2.5).
Eigene Untersuchungen
50
Die Berechnung des Neutralisationstiters (50% Neutralisationsdosis, ND50) erfolgte
nach der Formel von KÄRBER (1931):
(ND50) = L1,0 – Lint (S-0,5)
Dabei ist
L1,0 = Logarithmus der höchsten Verdünnung mit der Reaktionsrate (R) 1,0
L int = Logarithmus des Intervalles (int)
S = Summe der Reaktionsraten, begonnen bei der letzten Reaktionsrate, die 1,0
beträgt
Eigene Untersuchungen
51
3.2.8 Direkte Immunfärbung
Der KSP-Virusantigennachweis erfolgte mit dem monoklonalen Antikörper BVD/C16,
der pestivirusspezifisch ist und als PO-Konjugat vorlag.
Der sich in der Mikro- oder Makrotiterplatte befindende Zellrasen wurde nach
Entfernung des Kulturmediums einmal mit 1/3 PBS (engl. phosphate buffered saline,
phosphatgepufferte Kochsalzlösung) gewaschen und nach gründlichem Absaugen
der Waschlösung mit der Vakuumpumpe für 3 h bei 80 °C hitzefixiert. Nach der
Hitzefixation wurde der Zellrasen einmal zum Anfeuchten mit PBS/Tween (Zusatz
von
0,01%
Tween20)
gewaschen.
Danach
wurde
das
Konjugat
des
peroxidasegekoppelten mAk BVD/C16 in der benötigten Gebrauchsverdünnung in
die Kavitäten pipettiert. Pro Mikrotiterplattenvertiefung wurden 50 µl und pro
Makroplattenvertiefung 200 µl Konjugat benötigt. Nach einer Stunde Inkubation bei
37 °C wurde der Zellrasen dreimal mit PBS/Tween und einmal mit A. bidest.
gewaschen. Nach Entfernen der Waschlösung wurden die Kavitäten mit dem
chromogenen Substrat 3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC) beschickt (Mikrotiterplatte:
50 µl, Makrotiterplatte: 200 µl). Dieses wurde aus einer AEC-DimethylformamidStammlösung,
Natriumazetatpuffer und 3%iger H202 frisch angesetzt. Das
Wasserstoffperoxid diente als Substrat der Peroxidase. Die Umsetzung führte zu
einem roten Niederschlag im Bereich des Zytoplasmas der fixierten und infizierten
Zellen. Nach ca. 10-20 min war das Zytoplasma deutlich gefärbt. Die SubstratLösung wurde abpipettiert und durch zweimaliges Waschen mit A. bidest. vollständig
vom Zellrasen entfernt. Die Auswertung der Platten erfolgte lichtmikroskopisch. Eine
Kavität galt als positiv, sobald das Zytoplasma einer Zelle gefärbt war. Der Zellkern
musste ungefärbt sein.
52
Eigene Untersuchungen
3.2.9 Zählung der Leukozyten
Die Bestimmung der Gesamtleukozytenzahl erfolgte mit der Zählkammermethode. In
eine trockene Leukozytenpipette wurde vorher gemischtes EDTA-Vollblut bis zur
Marke 0,5 aufgezogen. Die Pipettenspitze wurde außen vorsichtig von anhaftendem
Blut gereinigt und das Blut etwas hochgezogen, so dass die Spitze blutfrei war. Bis
zur Marke 11 wurde zur Lyse der Erythrozyten nun Essigsäure (2%) aufgezogen und
die Pipette mit Daumen und Mittelfinger verschlossen und etwa eine Minute
gemischt. Die Auszählung der Leukozyten erfolgte in einer Neubauer-Zählkammer.
3.2.10 Statistik
Nach der Prüfung der Leukozytenwerte auf Normalverteilung mit dem Shapiro-WilkTest wurden die Messdaten der Hybridschweine und der Schweine der Deutschen
Landrasse anhand einer einfaktoriellen Varianzanalyse ausgewertet. Dabei wurden
an jedem Messtag die Daten der beiden Gruppen verglichen.
4. Ergebnisse
4.1 Bestimmung der Virulenz von vier KSPV-Feldisolaten
4.1.1 Bestimmung des Clinical Score
Neun KSP-relevante klinische Parameter wurden untersucht und je nach
Ausprägungsgrad des Symptoms mit einer Punktzahl von 0 bis 3 bewertet. Nach
deren Addition ergab sich für jeden Tag die klinische Punktzahl (Clinical Score) eines
Tieres. Der unten angegebene Clinical Score (CS) entspricht der maximalen
Punktzahl, die ein Tier im Verlauf der Infektion erreichte. Für jedes KSPV-Isolat
wurde der durchschnittliche Clinical Score berechnet (Summe des maximalen
Clinical Score der Einzeltiere/Anzahl der Tiere).
4.1.1.1 CSF 0650
Die fünf Schweine der ersten Gruppe (Tiere Nr. 80-83 und 102) wurden mit dem
Isolat CSF 0650, Genotyp 1.3, infiziert. Die Inkubationszeit (Zeit zwischen Infektion
und Anstieg der Körpertemperatur auf ≥ 40 °C) lag zwischen vier und fünf Tagen.
Bei drei Schweinen stieg die Körpertemperatur auf über 41 °C an, bei zwei Tieren lag
das Temperaturmaximum zwischen 40 °C und 41 °C (Abb. 3 und Tab. 29 im
Anhang). Die Tiere wurden apathisch und fraßen kaum bis gar nicht mehr. Bei allen
Tieren waren in der zweiten Infektionswoche dünnflüssig-wässriger Durchfall, eine
starke Schwellung der Inguinallymphknoten und eine deutliche Konjunktivitis
feststellbar. Ein Schwein (Tier 81) erkrankte an der akut-letalen Verlaufsform der
KSP und musste 12 dpi euthanasiert werden. In der Endphase der Erkrankung zeigte
das Schwein zentralnervöse Störungen. Nach anfänglicher leichter Ataxie kam es zu
Ergebnisse
54
einer schlaffen Lähmung der Hintergliedmaßen. Die übrigen vier Schweine erholten
sich von der Infektion. Nach 10 bis 14 Tagen konnte kein Fieber mehr festgestellt
werden, und das Allgemeinbefinden der Tiere verbesserte sich rasch. Der
Clinical Score (CS) lag bei den vier genesenen Tieren zwischen 7 und 10. Das
verendete Schwein erreichte einen CS von 16 (Abb. 2 und Tab. 4). Die Mortalität
betrug 20% (Abb. 10). Der durchschnittlliche Clinical Score für das Isolat CSF 0650
für die Tage 10,14 und 18 p.i. und der durchschnittliche maximal erreichte CS
(CSmax) unter Einbeziehung der Mortalität sind in Tab. 5 dargestellt.
4.1.1.2 CSF 0695
Die Inkubationszeit lag bei den Tieren (Tiere Nr. 84-88), die mit CSF 0695,
Genotyp 1.1, infiziert wurden, zwischen 3 und 4 Tagen. Bei vier Tieren kam es zu
einem Anstieg der Körpertemperatur auf über 41 °C, bei Schwein 86 lag die
maximale Körpertemperatur zwischen 40 °C und 41 °C (Abb. 5 und Tab. 30 im
Anhang). Die Schweine waren somnolent und fraßen kaum bis gar nicht mehr.
Neben vergrößerten Inguinallymphknoten und Konjunktivitis konnte dünnflüssigwässriger Durchfall beobachtet werden. Zwei Tiere (Tier 85 und Tier 87) erkrankten
an der akut-letalen Form der KSP und mussten 11 bzw. 13 dpi euthanasiert werden.
Sie
entwickelten
ausgeprägte
neurologische
Störungen.
Daneben
konnten
punktförmige bis flächenhafte Hautblutungen festgestellt werden, die sich besonders
an den Ohren und am Unterbauch zeigten. Tier 85 zeigte in der Endphase der
Erkrankung blutig-wässrigen Durchfall. Die anderen drei Tiere erholten sich von der
Infektion. Nach 14 Tagen konnte kein Fieber mehr festgestellt werden, und es trat
eine rasche Besserung des Allgemeinbefindens ein. Die zwei verendeten Tiere
erreichten einen CS von 17.
Bei den drei genesenen Schweinen lag der CS
zwischen 10 und 13 (Abb. 4 und Tabelle 4).
Die Mortalität betrug 40% (Abb. 10). Der durchschnittlliche Clinical Score für das
Isolat CSF 0695 für die Tage 10,14 und 18 p.i. und der durchschnittliche maximal
erreichte CS (CSmax) unter Einbeziehung der Mortalität sind in Tab. 5 dargestellt.
Ergebnisse
55
4.1.1.3 CSF 0634
Die Tiere (Tiere Nr. 89-93), die mit CSF 0634 infiziert wurden, entwickelten alle die
akut-letale Verlaufsform der KSP. Die Inkubationszeit betrug 6-8 Tage. Bei allen
Tieren stieg die Körpertemperatur auf über 41 °C (Abb. 7 und Tab. 31 im Anhang).
Nach 13-20 Tagen starben die Tiere oder sie mussten euthanasiert werden. Neben
Somnolenz, Anorexie, Konjunktivitis und Durchfall zeigten sich in der Endphase der
Erkrankung
hochgradige
neurologische
Störungen
und
Hautblutungen.
Der
Clinical Score lag zwischen 15 und 22 (Abb. 6 und Tab. 4). Die Mortalität betrug
100% (Abb. 10). Der durchschnittlliche Clinical Score für das Isolat CSF 0634 für die
Tage 10,14 und 18 p.i. und der durchschnittliche maximal erreichte CS (CSmax) unter
Einbeziehung der Mortalität sind in Tab. 5 dargestellt.
4.1.1.4 CSF 0277
Die Inkubationszeit betrug bei diesem Isolat 6 Tage (Tiere Nr. 94-98). Bei zwei Tieren
stieg die Körpertemperatur auf über 41 °C, die übrigen drei Schweine erreichten
Werte zwischen 40 °C und 41 °C. (Abb. 9 und Tab. 32 im Anhang). Zwischen dem
11. bis 18. Tag nach der Infektion verendeten drei Tiere (Tier 94, 95 und Tier 98),
oder sie mussten euthanasiert werden. Neben Somnolenz, Anorexie, Durchfall und
Konjunktivitis fielen neurologische Störungen auf. Zwei Tiere erholten sich von der
Infektion. Nach ca. 14 dpi konnte kein Fieber mehr festgestellt werden. Die
verendeten Schweine erreichten einen Clinical Score von 6, 14 bzw. 16. Der Clinical
Score der zwei genesenen Schweine lag zwischen 6 und 9 (Abb. 8 und Tab. 4). Die
Mortalität betrug 60% (Abb. 10). Der durchschnittlliche Clinical Score für das Isolat
CSF 0277 für die Tage 10,14 und 18 p.i. und der durchschnittliche maximal erreichte
CS (CSmax) unter Einbeziehung der Mortalität sind in Tab. 5 dargestellt.
Ergebnisse
56
CSF 0650 (1.3)
18
16
Clinical Score
14
12
10
8
6
4
2
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
dpi
Tier 80
Tier 81
Tier 82
Tier 83
Tier 102
Abb. 2: Clinical Score bei Infektion mit CSF 0650 (Genotyp 1.3)
(Tier 81: moribund euthanasiert)
CSF 0650 (1.3)
43
T (°C)
42
41
40
39
38
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
dpi
Tier 80
Tier 81
Tier 82
Tier 83
Abb. 3: Temperaturverlauf bei Infektion mit CSF 650 (Genotyp 1.3)
Tier 102
Ergebnisse
57
CSF 0695 (1.1)
18
16
C lin ica l Sc ore
14
12
10
8
6
4
2
0
0
2
4
6
Tier 84
8
10
d pi
Tier 85
12
Tier 86
14
16
18
Tier 87
20
Tier 88
Abb. 4: Clinical Score bei Infektion mit CSF 0695 (Genotyp 1.1)
(Tiere 85 u. 87: moribund euthanasiert)
CSF 0695 (1.1)
43
T (°C)
42
41
40
39
38
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
dpi
Tier 84
Tier 85
Tier 86
Tier 87
Abb. 5: Temperaturverlauf bei Infektion mit CSF 0695 (Genotyp 1.1)
Tier 88
Ergebnisse
58
CSF 0634 (2.3)
24
Clinical Score
22
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
dpi
Tier 89
Tier 90
Tier 91
Tier 92
Tier 93
Abb. 6: Clinical Score bei Infektion mit CSF 0634 (Genotyp 2.3)
(Tiere 89-93: moribund euthanasiert)
CSF 0634 (2.3)
43
T (°C)
42
41
40
39
38
0
2
Tier 89
4
6
Tier 90
8
10
d pi
Tier 91
12
14
16
18
Tier 92
Abb. 7: Temperaturverlauf bei Infektion mit CSF 0634 (Genotyp 2.3)
20
Tier 93
Ergebnisse
59
CSF 0277 (2.1)
18
Clinical Score
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
dpi
Tier 94
Tier 95
Tier 96
Tier 97
Tier 98
Abb. 8: Clinical Score bei Infektion mit CSF 0277 (Genotyp 2.1)
(Tiere 94, 95 u. 98: moribund euthanasiert)
CSF 0277 (2.1)
43
42
T (°C)
41
40
39
38
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
dpi
Tier 94
Tier 95
Tier 96
Tier 97
Abb. 9: Temperaturverlauf bei Infektion mit CSF 0277 (Genotyp 2.1)
Tier 98
Ergebnisse
60
Tab. 4: Vergleich des Clinical Score (CS) und der Inkubationszeit bei Infektion mit
den vier KSPV-Isolaten. Der durchschnittliche CS (Ø) wurde für jedes CSFIsolat berechnet.
CSF-Isolat
CSF 0650
CSF 0695
CSF 0634
CSF 0277
Tiere Nr.
CS
80
10
81
16
82
9
83
8
102
7
84
13
85
17
86
10
87
17
88
10
89
18
90
15
91
22
92
16
93
17
94
6
95
14
96
9
97
6
98
16
CS (Ø)
Inkubationszeit (dpi)
10
4-5
13,4
3-4
17,6
6-8
10,2
6
Aufgrund der geringen Tierzahl pro Gruppe war eine statistische Auswertung des
Clinical Score nicht möglich.
Ergebnisse
61
100
Mortalität (%)
80
60
40
20
0
10 dpi
14 dpi
CSF 0650
18 dpi
CSF 0695
22 dpi
CSF 0634
CSF 0277
Abb. 10: Mortalitätsrate (%) bei Infektion mit den vier KSPV-Isolaten
Tab. 5: Vergleich des Clinical Score (CS) der vier KSPV-Isolate an Tag 10, 14 und
18 p.i. mit dem maximal erreichten Clinical Score (CSmax). Bei der
Berechnung des CS und des CS(max) wurde die Mortalität berücksichtigt*.
KSPV-Isolat
CS 10 dpi
CS 14 dpi** CS 18 dpi**
CSF 0650
9,6
7,6
7,6
11
CSF 0695
12,2
11,8
13,2
14,4
CSF 0634
3
14,8
18,8
20,6
CSF 0277
6
8,6
10
12,2
* Bewertung der Mortalität: 0%:
> 0% - 40%:
> 40% < 80%:
80% - 100%:
CS(max)
0 Punkte
1 Punkt
2 Punkte
3 Punkte
** Bei Tieren, die vor 14 dpi bzw. 18 dpi starben, wurde der CS des Todestages
mit in die Berechnung einbezogen.
Ergebnisse
62
4.1.2 Bestimmung des Pathological Score (PS)
Bei der postmortalen Untersuchung wurden zehn KSP-relevante Parameter
untersucht und je nach Ausprägungsgrad mit einer Punktzahl von 0 bis 3 bewertet.
Nach deren Addition ergab sich die pathologische Punktzahl (Pathological Score)
eines Tieres. Für jedes KSPV-Isolat wurde der durchschnittliche Pathological Score
(PS gesamt) berechnet (Summe des PS der Einzeltiere/Anzahl der Tiere). Ferner
wurde für jeden Parameter die durchschnittliche Punktzahl berechnet (Summe der
Punktzahl der Einzeltiere/Anzahl der Tiere).
4.1.2.1 CSF 0650
Tier 81 erkrankte an der akut-letalen Verlaufsform der KSP und musste 12 dpi
euthanasiert werden. Bei der Sektion fielen vor allem stark vergrößerte,
hämorrhagische Lymphknoten (Lnn. inguinales, Lnn. mandibulares, Ln. Ileocaecalis)
auf. An den Nieren waren einzelne Petechien sichtbar, und an der Milz befand sich
ein Randinfarkt. Tier 81 erreichte einen Pathological Score (PS) von 12. Die übrigen
vier Schweine erholten sich von der Infektion. Bei der Sektion konnten, außer
vergrößerten,
teilweise
hämorrhagischen
Lymphknoten,
keine
weiteren
pathologischen Veränderungen festgestellt werden. Der PS der genesenen
Schweine lag zwischen 3 und 5. Der durchschnittliche PS für das Isolat CSF 0650
betrug 5,6. Der PS für die einzelnen Tiere ist in Abb. 11 dargestellt. Die
durchschnittliche Punktzahl für jeden der zehn Parameter und für jedes CSF-Isolat
(PS gesamt) ist in Tab. 6 aufgeführt.
Ergebnisse
63
4.1.2.2 CSF 0695
Tier 85 und Tier 87 erkrankten an der akut-letalen Form der KSP und wurden
11 bzw. 13 dpi euthanasiert. An der äußeren Haut, der Subkutis und den Serosen
zeigten sich punktförmige bis flächenhafte Blutungen. Beide Tiere hatten stark
vergrößerte, hämorrhagische Lymphknoten (Lnn. inguinales, Lnn. mandibulares,
Ln. ileocaecalis). Petechiale Blutungen konnten auch an den Nieren festgestellt
werden. Bei Tier 87 befanden sich an den Tonsillen und der Ileocaecalpapille
ausgeprägte Nekrosen. Tier 85 erreichte einen PS von 17. Der PS von Tier 87
betrug 24. Die übrigen drei Schweine erholten sich von der Infektion. Die
pathologischen Veränderungen beschränkten sich auf die Lymphknoten. Der PS der
genesenen Schweine lag zwischen zwei und drei. Der durchschnittliche PS für das
Isolat CSF 0695 betrug 9,4. Der PS für die einzelnen Tiere ist in Abb. 12 dargestellt.
Die durchschnittliche Punktzahl für jeden der zehn Parameter und für jedes
CSF-Isolat (PS gesamt) ist in Tab. 6 aufgeführt.
4.1.2.3 CSF 0634
Die fünf Tiere entwickelten die akut-letale Verlaufsform der KSP. Bei allen Tieren
waren unterschiedlich stark ausgeprägte Hämorrhagien an der äußeren Haut, der
Subkutis,
den
Serosen
und
den
Nieren
feststellbar.
Die
Lymphknoten
(Lnn. inguinales, Lnn. mandibulares, Ln. ileocaecalis) waren stark vergrößert und
hämorrhagisch. Bei zwei Tieren befanden sich an der Milz Randinfarkte. Bei allen
Tieren zeigten sich an der Ileocaecalpapille kleine Nekrosen. Bei drei Schweinen lag
eine katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie vor. Der durchschnittliche PS für
dieses Isolat betrug 15,4. Der PS für die einzelnen Tiere ist in Abb. 13 dargestellt.
Die durchschnittliche Punktzahl für jeden der zehn Parameter und für jedes
CSF-Isolat (PS gesamt) ist in Tab. 6 aufgeführt.
Ergebnisse
64
4.1.2.4 CSF 0277
Drei Tiere entwickelten die akut-letale Form der KSP. Tier 94 zeigte petechiale
Blutungen an der äußeren Haut, der Subkutis und den Serosen. Bei allen Tieren
waren die Lymphknoten (Lnn. inguinales, Lnn. mandibulares, Ln. ileocaecalis)
vergrößert und teilweise hämorrhagisch. Bei Tier 97 war eine deutliche Schwellung
der Tonsillen feststellbar und bei Tier 94 zeigten sich Nekrosen an der
Ileocaecalpapille. Bei Tier 98 lag eine katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie vor.
Der durchschnittliche PS für das Isolat CSF 0277 betrug 5,0. Der PS für die
einzelnen Tiere ist in Abb. 14 dargestellt. Die durchschnittliche Punktzahl für jeden
der zehn Parameter und für jedes CSF-Isolat (PS gesamt) ist in Tab. 6 aufgeführt.
Tab. 6: Pathological Score bei Infektion mit den vier KSPV-Isolaten. Für jeden
Parameter wurde die durchschnittliche Punktzahl (0-3) berechnet.
CSF 0650
CSF 0695
CSF 0634
CSF 0277
0,2
1,2
2,2
0,4
0
1,0
2,0
0,4
Lnn. inguinales
1,4
1,6
2,4
1,2
Lnn. mandibulares
2,0
1,4
2,4
1,0
Ln. ileocaecalis
1,4
1,4
1,8
0,8
0
1,0
0
0,2
Milz
0,2
0
0,4
0
Nieren
0,2
1,0
0,8
0
Ileum
0
0,8
2,2
0,4
Respirationstrakt
0,2
0
1,2
0,6
PS gesamt
5,6
9,4
15,4
5,0
Haut
Subkutis/Serosen
Tonsillen
Aufgrund der geringen Tierzahl pro Gruppe war eine statistische Auswertung des
Pathological Score nicht möglich.
Ergebnisse
65
CSF 0650 (1.3)
30
Pathological Score
25
20
15
10
5
0
Tier 80**
Tier 81*
Tier 82**
Tier 83**
Tier 102**
Abb. 11: Pathological Score bei Infektion mit CSF 0650 (Genotyp 1.3)
CSF 0695 (1.1)
30
Pathological Score
25
20
15
10
5
0
Tier 84**
Tier 85*
Tier 86**
Tier 87*
Tier 88**
Abb. 12: Pathological Score bei Infektion mit CSF 0695 (Genotyp 1.1)
* moribund euthanasiert; **rekonvaleszent euthanasiert
Ergebnisse
66
CSF 0634 (2.3)
30
Pathological Score
25
20
15
10
5
0
Tier 89*
Tier 90*
Tier 91*
Tier 92*
Tier 93*
Abb. 13: Pathological Score bei Infektion mit CSF 0634 (Genotyp 2.3)
CSF 0277 (2.1)
30
Pathological Score
25
20
15
10
5
0
Tier 94*
Tier 95*
Tier 96**
Tier 97**
Tier 98*
Abb. 14: Pathological Score bei Infektion mit CSF 0277 (Genotyp 2.1)
* moribund euthanasiert; **rekonvaleszent euthanasiert
Ergebnisse
67
4.1.3 Leukozytenzahl
Die Infektion mit dem KSP-Virus führte bei allen Schweinen zu einem Absinken der
Leukozytenzahl unter 10 G/l. Die Tiere, die an der akut-letalen Form der KSP
erkrankten, entwickelten eine persistierende Leukopenie. Bei den rekonvaleszenten
Tieren normalisierten sich die Leukozytenzahlen wieder (Tab. 33 bis 36 im Anhang).
Bei mit Isolat CSF 0650 infizierten Tieren sanken die Leukozyten auf durchschnittlich
8,5 G/l. Die Tiere, die mit Isolat CSF 0695 infiziert worden waren, zeigten einen
Abfall der Leukozyten auf durchschnittlich 7,5 G/l und bei mit Isolat CSF 0634
infizierten Tieren sanken die Leukozyten im Mittel auf 5,8 G/l. Die Leukozyten fielen
bei mit Isolat CSF 0277 infizierten Tieren auf durchschnittlich 9,4 G/l. Für jedes
KSPV-Isolat sind die Leukozytenzahlen unter Angabe des Mittelwertes und der
Standardabweichung (MW ± s) in Abb. 15 dargestellt. Aufgrund der großen Streuung
der Messwerte zwischen moribunden und rekonvaleszenten Tieren einer Gruppe
sind die Leukozytenwerte für jedes Tier in den Abb. 16 bis 19 dargestellt.
30
25
G/l
20
15
10
5
0
0 dpi
CSF 0650
4 dpi
CSF 0695
7 dpi
dpi
11 dpi
CSF 0634
14 dpi
CSF 0277
Abb. 15: Leukozytenzahlen bei Infektion mit den vier KSPV-Isolaten (MW ± s)
Ergebnisse
68
CSF 0650 (1.3)
30
25
G/l
20
15
10
5
0
0
4
7
11
14
18
21
dpi
Tier 80
Tier 81
Tier 82
Tier 83
Tier 102
Abb. 16: Leukozytenzahlen bei Infektion mit CSF 0650 (Genotyp 1.3)
CSF 0695 (1.1)
30
25
G/l
20
15
10
5
0
0
Tier 84
4
7
Tier 85
11
dpi
Tier 86
14
18
21
Tier 87
Abb. 17: Leukozytenzahlen bei Infektion mit CSF 0695 (Genotyp 1.1)
Tier 88
Ergebnisse
69
CSF 0634 (2.3)
30
25
G/l
20
15
10
5
0
0
4
7
11
14
18
dpi
Tier 89
Tier 90
Tier 91
Tier 92
Tier 93
Abb. 18: Leukozytenzahlen bei Infektion mit CSF 0634 (Genotyp 2.3)
CSF 0277 (2.1)
30
25
G/l
20
15
10
5
0
0
Tier 95
4
7
11
dpi
Tier 96
14
Tier 97
18
21
Tier 98
Abb. 19: Leukozytenzahlen bei Infektion mit CSF 0277 (Genotyp 2.1);
Tier 94: Blutentnahme nicht möglich
Ergebnisse
70
4.1.3.1 Einbeziehung der Leukozytenzahl in das Schema zur Beurteilung der
Virulenz der KSPV-Isolate.
Elf von 20 Schweinen entwickelten die akut-letale Form der KSP. Bei diesen Tieren
sanken die Leukozyten unter 6,5 G/l. Bei sieben von neun rekonvaleszenten Tieren
lagen die niedrigsten Leukozytenwerte über 6,5 G/l. Zwei rekonvaleszente Schweine
zeigten ein vorübergehendes Absinken der Leukozyten unter 6,5 G/l.
Folgende Bewertung der Leukozytenzahl wird vorgeschlagen:
≥ 10 G/l:
0 Punkte
8,5 – 9,99 G/l:
1 Punkt
6,5 – 8,49 G/l:
2 Punkte
< 6,5 G/l:
3 Punkte
Ergebnisse
71
4.1.4 Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion
Das KSP-Virus konnte bei allen Tieren spätestens 7 Tage nach der Infektion aus der
Leukozytenfraktion isoliert werden. Bei drei Tieren, die mit Isolat CSF 0650 infiziert
worden waren, war die Virusanzucht bereits 4 dpi positiv. Ebenso war bei allen
Schweinen, die Isolat CSF 0695 erhielten, die Virusisolierung 4 dpi möglich.
Isolat CSF 0634 konnte erst 7 dpi aus den Leukozyten reisoliert werden und bei
Isolat CSF 0277 war nur ein Schwein 4 dpi positiv. Die Virusisolierung aus den
Leukozyten war bei den Schweinen, die verendeten oder euthanasiert wurden,
während der gesamten Krankheitsdauer positiv. Bei den rekonvaleszenten
Schweinen konnte das KSP-Virus nach der Genesung nicht mehr nachgewiesen
werden. Die Ergebnisse der Virusisolierung aus den Leukozyten für die vier KSPVIsolate sind in den Tab. 7 bis 10 dargestellt.
Tab. 7: Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion von Schweinen, die mit
CSF 0650 infiziert worden waren.
0 dpi
4 dpi
7 dpi
11 dpi
14 dpi
18 dpi
Tier 80
neg
pos
pos
pos
pos
neg
Tier 81
neg
pos
pos
pos
*
*
Tier 82
neg
neg
pos
pos
neg
*
Tier 83
neg
pos
pos
pos
neg
*
Tier 102
neg
neg
pos
neg
*
*
neg: Virusisolierung negativ;
pos: Virusisolierung positiv
* fehlende Werte in den Tabellen: Tiere bereits verstorben/euthanasiert
Ergebnisse
72
Tab. 8: Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion von Schweinen, die mit
CSF 0695 infiziert worden waren.
0 dpi
4 dpi
7 dpi
11 dpi
14 dpi
Tier 84
neg
pos
pos
neg
*
Tier 85
neg
pos
pos
pos
*
Tier 86
neg
pos
pos
pos
neg
Tier 87
neg
pos
pos
pos
*
Tier 88
neg
pos
pos
neg
*
neg : Virusisolierung negativ;
pos : Virusisolierung positiv
Tab. 9: Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion von Schweinen, die mit
CSF 0634 infiziert worden waren.
0 dpi
4 dpi
7 dpi
11 dpi
14 dpi
18 dpi
20 dpi
Tier 89
neg
neg
pos
pos
pos
*
*
Tier 90
neg
neg
pos
pos
pos
*
*
Tier 91
neg
neg
pos
pos
pos
*
*
Tier 92
neg
neg
pos
pos
pos
pos
pos
Tier 93
neg
neg
pos
pos
pos
pos
*
neg : Virusisolierung negativ;
pos : Virusisolierung positiv
* fehlende Werte in den Tabellen: Tiere bereits verstorben/euthanasiert
Ergebnisse
73
Tab. 10: Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion von Schweinen, die mit
CSF 0277 infiziert worden waren.
0 dpi
4 dpi
7 dpi
11 dpi
14 dpi
18 dpi
21 dpi
Tier 94
neg
pos
pos
pos
pos
pos
*
Tier 95
neg
neg
pos
pos
*
*
*
Tier 96
neg
neg
pos
pos
neg
*
*
Tier 97
neg
neg
pos
pos
pos
pos
neg
Tier 98
neg
neg
pos
pos
pos
*
*
neg : Virusisolierung negativ;
pos : Virusisolierung positiv
4.1.5 Virustiter im Serum
Der Virustiter im Serum wurde bei allen Tieren für den Tag 7 p.i. bestimmt. Der
Virustiter lag bei den Tieren, die mit den KSPV-Isolaten CSF 0650 und CSF 0277
infiziert worden waren, zwischen 102,7 KID50/ml und 104,5 KID50/ml.
Die Schweine, die mit dem KSPV-Isolat 0695 infiziert worden waren, erreichten einen
Virustiter zwischen 102 KID50/ml und 104,5 KID50/ml. Bei Infektion mit dem
KSPV-Isolat CSF 0634 wurde ein Virustiter zwischen 103 KID50/ml und 104 KID50/ml
erreicht (Tab. 11).
* fehlende Werte in den Tabellen: Tiere bereits verstorben/euthanasiert
Ergebnisse
74
Tab. 11: Vergleich der Virustiter (log10 KID50/ml) der vier KSPV-Isolate, die am Tag
7 p.i. im Serum erreicht wurden. Für jedes Virusisolat sind die Virustiter der
Einzeltiere und der durchschnittliche Virustiter (Ø) angegeben.
CSF-Isolat
Titer der
Einzeltiere
Ø Titer
CSF 0650
CSF 0695
CSF 0634
CSF 0277
3,7
4,2
3,5
3,2
4,5
4,5
3,0
4,5
2,7
2,2
3,7
2,7
3,5
4,2
4,0
3,7
3,0
2,0
3,0
3,0
3,5
3,4
3,4
3,4
4.1.5 Bildung neutralisierender Antikörper
Die Serumproben wurden auf das Vorhandensein neutralisierender Antikörper (nAk)
gegen das jeweilige homologe Virus getestet. Bei moribunden Tieren konnten keine
neutralisierenden Antikörper (Titer < 5) oder nur niedrige Titer in der Terminalphase
der Erkrankung nachgewiesen werden. Die rekonvaleszenten Tiere entwickelten ab
14 Tagen p.i. Antikörper, nur bei Tier 97 waren die ersten neutralisierenden
Antikörper erst an Tag 21 p.i. festzustellen. Bei Infektion mit CSF 0650 lagen die
Antikörpertiter zwischen 80 ND50 (21 dpi) und 1600 ND50 (33 dpi). Die Titer bei
Isolat CSF 0695 variierten zwischen 40 ND50 (21 dpi) und 160 ND50 (28 dpi). Die
Antikörpertiter bei Infektion mit CSF 0277 lagen 28 dpi zwischen 240 und 640 ND50.
Bei den Tieren, die mit CSF 0634 infiziert worden waren, konnten keine
neutralisierenden Antikörper festgestellt werden (Tab. 12 bis 15).
Ergebnisse
75
Tab. 12: Titer der neutralisierenden Antikörper (ND50) bei Infektion mit CSF 0650
Tiere
11dpi
12dpi
14dpi
18dpi
21dpi
25dpi
28dpi
33dpi
80
<5
n.u.
80
480
640
480
480
1600
81
<5
<5
*
*
*
*
*
*
82
<5
n.u.
80
240
640
480
480
*
83
<5
n.u.
10
30
30
40
160
160
102
<5
n.u.
30
30
80
*
*
*
Tab. 13: Titer der neutralisierenden Antikörper (ND50) bei Infektion mit CSF 0695
Tiere
11dpi
13dpi
14dpi
18dpi
21dpi
25dpi
28dpi
84
<5
n.u.
20
30
40
60
160
85
<5
*
*
*
*
*
*
86
<5
n.u.
15
15
30
40
40
87
<5
40
*
*
*
*
*
88
<5
n.u.
40
40
40
*
*
* fehlende Werte in den Tabellen: Tiere bereits verstorben/euthanasiert;
kursiv: Tiere moribund euthanasiert
n.u.: nicht untersucht
Ergebnisse
76
Tab. 14: Titer der neutralisierenden Antikörper (ND50) bei Infektion mit CSF 0634
Tiere
11dpi
13dpi
14dpi
17dpi
18dpi
20dpi
89
<5
n.u.
<5
*
*
*
90
<5
n.u.
<5
*
*
*
91
<5
<5
*
*
*
*
92
<5
n.u.
<5
n.u.
<5
<5
93
<5
n.u.
<5
<5
*
*
Tab. 15: Titer der neutralisierenden Antikörper (ND50) bei Infektion mit CSF 0277
Tiere
11dpi
14dpi
18dpi
21dpi
25dpi
28dpi
94
<5
<5
<5
*
*
*
95
<5
*
*
*
*
*
96
<5
15
240
240
240
240
97
<5
<5
<5
60
120
640
98
<5
<5
*
*
*
*
* fehlende Werte in den Tabellen: Tiere bereits verstorben/euthanasiert;
kursiv: Tiere moribund euthanasiert
n.u.: nicht untersucht
Ergebnisse
77
4.1.5.1 Einbeziehung der Bildung neutralisierender Antikörper in das Schema zur
Beurteilung der Virulenz der KSPV-Isolate.
Bei acht der neun rekonvaleszenten Schweine konnten 14 dpi neutralisierende
Antikörper nachgewiesen werden. Nur ein Schwein, das an der akut-letalen Form der
KSP erkrankt war, zeigte zu diesem Zeitpunkt eine Antikörperbildung (Tab. 16).
Folgende Bewertung der Bildung neutralisierender Antikörper (14 dpi) wird
vorgeschlagen:
nAk < 5: 3 Punkte
nAk > 5: 0 Punkte
Tab. 16: Vergleich der Bildung neutralisierender Antikörper am Tag 14 p.i.. Für
jedes
Virusisolat
sind
die
Antikörpertiter
(ND50)
angegeben.
CSF 0650
CSF 0695
CSF 0634
CSF 0277
80*
20*
<5
<5
< 5**
< 5**
<5
< 5**
80*
15*
< 5**
15*
10*
40**
<5
< 5*
30*
40*
<5
<5
* rekonvaleszente Tiere
** Tiere schon vor 14 dpi euthanasiert
der
Einzeltiere
Ergebnisse
78
4.1.6
Erneute
Bewertung
der
Virulenz
der
vier
KSPV-Isolate
unter
Berücksichtigung zusätzlicher Parameter.
Zusätzlich zu den 9 Parametern des Untersuchungsschemas von MITTELHOLZER
et al. (2000) wurden die Mortalität (Tab. 5), die Leukozytenzahl (s. Kap. 4.1.3.1) und
die Bildung neutralisierender Antikörper (s. Kap. 4.1.5.1) zur Bestimmung des
Clinical Score herangezogen. Ein maximaler CS von 36 war zu erreichen. Nach dem
modifizierten Bewertungsschema wurden KSPV-Feldisolate, die eine Punktzahl von
> 18 erreichten als hoch virulent klassifiziert. Isolate, die eine Punktzahl zwischen 6
und 18 erreichten, wurden als moderat virulent eingestuft. Schwach virulente Isolate
wurden durch eine Punktzahl < 6 definiert.
Tab. 17: Clinical Score (CS Ø) nach MITTELHOLZER et al. (2000) und nach dem
modifizierten Bewertungsschema (CSmod)
KSPV-Isolate
(CS)
(CSmod)
Virulenz
CSF 0650
10
13,6
moderat
CSF 0695
13,4
17,2
moderat
CSF 0634
17,6
26,6
hoch
CSF 0277
10,2
16,8
moderat
Ergebnisse
4.2
Vergleich
79
des
Krankheitsverlaufes
der
KSP
von
Reinzucht-
und
Kreuzungstieren
4.2.1 Bestimmung des Clinical Score
Neun KSP-relevante klinische Parameter wurden untersucht und je nach
Ausprägungsgrad des Symptoms mit einer Punktzahl von 0 bis 3 bewertet. Nach
deren Addition ergab sich für jeden Tag die klinische Punktzahl (Clinical Score) eines
Tieres. Der unten angegebene Clinical Score entspricht der maximalen Punktzahl,
die ein Tier im Verlauf der Infektion erreichte. Für jedes KSPV-Isolat wurde der
durchschnittliche Clinical Score berechnet (Summe des maximalen Clinical Score der
Einzeltiere/Anzahl der Tiere). Zusätzlich wurde der Clinical Score nach dem
modifizierten Bewertungsschema (s. Kap. 4.1.6) bestimmt (CSmod).
4.2.1.1 CSF 0277
Fünf
Hybridschweine
(Tiere
Nr.
134-138)
und
fünf
Schweine
der
Deutschen Landrasse (Tiere Nr. 129-133) wurden mit der gleichen Virusdosis
(104 KID50) des Isolates CSF 0277, Genotyp 2.1 Paderborn, infiziert. Die
Inkubationszeit betrug bei den Hybridschweinen 6-8 Tage, bei den Schweinen der
Deutschen Landrasse lag sie zwischen 5 und 7 Tagen. Bei allen Tieren blieb die
Körpertemperatur unter 41 °C (Abb. 21 u. 23 und Tab. 37 u. 38 im Anhang). Alle
zehn Schweine durchliefen eine akut-transiente Form der KSP-Virusinfektion. Die
Tiere waren apathisch und fraßen schlecht. Das Fieber dauerte nur einige Tage an,
danach trat eine rasche Besserung des Allgemeinbefindens ein. Während der
zweiten Infektionswoche war für einige Tage Durchfall feststellbar. Typische
hämorrhagische oder zentralnervöse Symptome traten nicht auf. Die Hybridschweine
erreichten einen Clinical Score von 5-7. Der Clinical Score der Deutschen Landrasse
lag zwischen 5 und 8 (Abb. 20 u. 22 und Tab. 18). Der modifizierte CSmod
Ergebnisse
80
(s. Kap. 4.1.6) ist in Tab. 18 dargestellt. Die Mortalität betrug bei beiden
Gruppen 0%.
4.2.1.2 CSF 0634
Fünf
Hybridschweine
(Tiere
Nr.
146-150)
und
fünf
Schweine
der
Deutschen Landrasse (Tiere Nr. 141-145) wurden mit der gleichen Virusdosis
(104 KID50) des Isolates CSF 0634 infiziert. Bei beiden Gruppen lag die
Inkubationszeit zwischen 5 und 7 Tagen und bei allen Tieren stieg die
Körpertemperatur auf > 41 °C (Abb. 25 u. 27 und Tab. 39 u. 40 im Anhang). Die
Tiere waren apathisch und fraßen kaum bis gar nicht mehr. Neben einer starken
Schwellung der Inguinallymphknoten und Konjunktivitis war in der zweiten
Infektionswoche dünnflüssig-wässriger Durchfall feststellbar. Bei allen Tieren zeigten
sich neurologische Störungen, die von einer leichten Ataxie bis zur vollständigen
Lähmung der Hintergliedmaßen reichten. Alle Tiere der beiden Gruppen entwickelten
die akut-letale Form der KSP-Virusinfektion. Die Schweine der Deutschen Landrasse
mussten zwischen dem 13. und 25. Tag nach der Infektion euthanasiert werden. Der
Clinical Score lag zwischen 15 und 21( Abb. 24 und Tab. 18).
Die Hybridschweine mussten zwischen dem 15. und 20. Tag nach der Infektion
euthanasiert werden. Der Clinical Score lag zwischen 18 und 20 (Abb. 26 und Tab.
18). Der modifizierte CSmod ist in Tab. 18 dargestellt.
Die Mortalität betrug bei beiden Gruppen 100%.
Ergebnisse
81
CSF 0277 (Dt. Landrasse)
18
16
Clinical Score
14
12
10
8
6
4
2
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
dpi
Tier 129
Tier 130
Tier 131
Tier 132
Tier 133
Abb. 20: Clinical Score bei Infektion mit CSF 0277 (Deutsche Landrasse)
CSF 0277 (Dt. Landrasse)
43
T (°C)
42
41
40
39
38
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
dpi
Tier 129
Tier 130
Tier 131
Tier 132
Tier 133
Abb. 21: Temperaturverlauf bei Infektion mit CSF 0277 (Deutsche Landrasse)
Ergebnisse
82
CSF 0277 (Hybridschweine)
18
16
Clinical Score
14
12
10
8
6
4
2
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
dpi
Tier 134
Tier 135
Tier 136
Tier 137
Tier 138
Abb. 22: Clinical Score bei Infektion mit CSF 0277 (Hybridschweine)
CSF 0277 (Hybridschweine)
43
T (°C)
42
41
40
39
38
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
dpi
Tier 134
Tier 135
Tier 136
Tier 137
Tier 138
Abb. 23: Temperaturverlauf bei Infektion mit CSF 0277 (Hybridschweine)
Ergebnisse
83
CSF 0634 (Dt. Landrasse)
25
Clinical Score
20
15
10
5
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
dpi
Tier 141
Tier 142
Tier 143
Tier 144
Tier 145
Abb. 24: Clinical Score bei Infektion mit CSF 0634 (Deutsche Landrasse)
(Tiere 141-145 moribund euthanasiert)
CSF 0634 (Dt. Landrasse)
43
T (°C)
42
41
40
39
38
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
dpi
Tier 141
Tier 142
Tier 143
Tier 144
Tier 145
Abb. 25: Temperaturverlauf bei Infektion mit CSF 0634 (Deutsche Landrasse)
Ergebnisse
84
CSF 0634 (Hybridschweine)
25
Clinical Score
20
15
10
5
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
dpi
Tier 146
Tier 147
Tier 148
Tier 149
Tier 150
Abb. 26: Clinical Score bei Infektion mit CSF 0634 (Hybridschweine)
(Tiere 146-150 moribund euthanasiert)
CSF 0634 (Hybridschweine)
43
T (°C)
42
41
40
39
38
0
2
Tier 146
4
6
Tier 147
8
10
12
dpi
Tier 148
14
16
Tier 149
18
20
Tier 150
Abb. 27: Temperaturverlauf bei Infektion mit CSF 0634 (Hybridschweine)
Ergebnisse
85
Tab. 18: Vergleich
des
Clinical
Score
(CS)
und
der
Inkubationszeit
von
Hybridschweinen (H) und Schweinen der Dt. Landrasse (DL), die mit
CSF 0277 und CSF 0634 infiziert worden waren. Für jede Gruppe wurde
der
durchschnittliche
durchschnittliche
CS
Clinical
(Ø)
berechnet.
Score
nach
Zusätzlich
dem
wurde
modifizierten
Bewertungsschema bestimmt (CSmod).
CSF-
Tiere
Isolat
Nr.
CS
129
8
130
5
CSF 0277
131
7
(DL)
132
8
133
5
134
5
135
5
CSF 0277
136
5
(H)
137
7
138
6
141
15
142
15
CSF 0634
143
16
(DL)
144
16
145
21
146
20
147
19
CSF 0634
148
21
(H)
149
18
150
20
Inkubations-
CS (Ø)
CSmod
6,6
8
5-7
5,6
7,4
6-8
16,6
25,6
5-7
19,6
28
5-7
der
zeit (dpi)
86
Ergebnisse
4.2.2 Bestimmung des Pathological Score (PS)
Bei der postmortalen Untersuchung wurden zehn KSP-relevante Parameter
untersucht und je nach Ausprägungsgrad mit einer Punktzahl von 0 bis 3 bewertet.
Nach deren Addition ergab sich die pathologische Punktzahl (Pathological Score)
eines Tieres. Für jedes KSPV-Isolat wurde der durchschnittliche Pathological Score
(PS gesamt) berechnet (Summe des PS der Einzeltiere/Anzahl der Tiere). Ferner
wurde für jeden Parameter die durchschnittliche Punktzahl berechnet (Summe der
Punktzahl der Einzeltiere/Anzahl der Tiere).
4.2.2.1 CSF 0277
Die fünf Hybridschweine und die fünf Schweine der Deutschen Landrasse erkrankten
an der akut-transienten Verlaufsform der KSP. Die Tiere wurden zwischen dem
21 und 42. Tag p.i. euthanasiert. Bei der Sektion zeigten sich keine KSP-typischen
pathologischen Veränderungen. Bei allen Schweinen waren die Inguinallymphknoten
und teilweise auch die Mandibularlymphknoten und der Ln. ileocaecalis geringgradig
vergrößert. Der PS der Tiere beider Gruppen lag zwischen 1 und 3. Der
durchschnittliche PS betrug für die Hybridschweine 1,8 und für die Schweine der
Deutschen Landrasse 1,6. Der PS für die einzelnen Tiere ist in den Abb. 28 und 29
dargestellt. Die durchschnittliche Punktzahl pro Tier für jeden der zehn Parameter
und für jedes CSF-Isolat ( PS gesamt) ist in Tab. 19 aufgeführt.
Ergebnisse
87
4.2.2.2 CSF 0634
Die fünf Schweine der Deutschen Landrasse und die fünf Hybridschweine erkrankten
an der akut-letalen Verlaufsform der KSP. Die Tiere entwickelten unterschiedlich
stark ausgeprägte Hämorrhagien an der äußeren Haut, der Subkutis, den Serosen
und
den
Nieren.
Die
Lymphknoten
(Lnn.
inguinales,
Lnn.
mandibulares,
Ln. ileocaecalis) waren stark vergrößert und hämorrhagisch. Bei einem Schwein
zeigten sich an den Tonsillen ausgeprägte Nekrosen. An der Milz eines Tieres war
ein Randinfarkt feststellbar. Bei vier Schweinen lag eine geringgradige, akute,
katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie vor. Der PS der Deutschen Landrasse lag
zwischen 14 und 18 und der PS der Hybridschweine zwischen 12 und 20. Der
durchschnittliche PS betrug für die Hybridschweine 15 und für die Schweine der
Deutschen Landrasse 15,8. Der PS für die einzelnen Tiere ist in den Abb. 30 und 31
dargestellt. Die durchschnittliche Punktzahl für jeden der zehn Parameter und für
jedes CSF-Isolat (PS gesamt) ist in Tab. 19 aufgeführt.
Ergebnisse
88
Tab. 19: Vergleich des Pathological Score (PS) von Hybridschweinen (H) und
Schweinen der Deutschen Landrasse (DL) bei Infektion mit CSF 0277 und
CSF 0634. Für jeden Parameter wurde die durchschnittliche Punktzahl
(0-3) berechnet.
CSF 0277
CSF 0277
CSF 0634
CSF 0634
(DL)
(H)
(DL)
(H)
0
0
1,6
1,2
0
0
1,2
0,8
Lnn. inguinales
1,0
1,0
3,0
3,0
Lnn. mandibulares
0,4
0,4
3,0
2,6
Ln. ileocaecalis
0,2
0,4
2,4
2,2
Tonsillen
0
0
0,8
0,8
Milz
0
0
0,2
0
Nieren
0
0
2,4
2,6
Ileum
0
0
0,4
1,2
Respirationstrakt
0
0
0,8
0,8
1,6
1,8
15,8
15,0
Haut
Subkutis/Serosen
PS gesamt
Ergebnisse
89
CSF 0277 (Dt. Landrasse)
30
Pathological Score
25
20
15
10
5
0
Tier 129**
Tier 130**
Tier 131**
Tier 132**
Tier 133**
Abb. 28: Pathological Score bei Infektion mit CSF 0277 (Deutsche Landrasse)
CSF 0277 (Hybridschweine)
30
Pathological Score
25
20
15
10
5
0
Tier 134**
Tier 135**
Tier 136**
Tier 137**
Tier 138**
Abb. 29: Pathological Score bei Infektion mit CSF 0277 (Hybridschweine)
**rekonvaleszent euthanasiert
Ergebnisse
90
CSF 0634 (Dt. Landrasse)
30
Pathological Score
25
20
15
10
5
0
Tier 141*
Tier 142*
Tier 143*
Tier 144*
Tier 145*
Abb. 30: Pathological Score bei Infektion mit CSF 0634 (Deutsche Landrasse)
CSF 0634 (Hybridschweine)
30
Pathological Score
25
20
15
10
5
0
Tier 146*
Tier 147*
Tier 148*
Tier 149*
Tier 150*
Abb. 31: Pathological Score bei Infektion mit CSF 0634 (Hybridschweine)
* moribund euthanasiert
Ergebnisse
91
4.2.3 Leukozytenzahl
Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den Leukozytenzahlen der
Hybridschweine und der Deutschen Landrasse (Abb. 33 und 34). Deshalb wurden
die Werte der beiden Gruppen für die Isolate CSF 0277 und CSF 0634 unter Angabe
des Mittelwertes und der Standardabweichung (MW ± s) zusammengefasst (Abb.32).
Die Schweine der Deutschen Landrasse und die Hybridschweine, die mit dem
KSPV-Isolat CSF 0277 infiziert wurden, entwickelten zwischen dem 4. und 7.
Tag p.i.. eine vorübergehende Leukopenie. Die Werte sanken durchschnittlich bis auf
8,9 G/l. Mit der Besserung des Allgemeinbefindens nach der 2. Infektionswoche
normalisierten sich die Leukozytenzahlen wieder (Tab. 41 und 42 im Anhang).
Bei den 10 Tieren, die mit dem KSPV-Isolat 0634 infiziert wurden, war ab 4
Tagen p.i.
eine
persistierende
Leukopenie
feststellbar.
Die
Werte
sanken
durchschnittlich bis auf 5,7 G/l (Tab. 43 und 44 im Anhang).
Leukozyten
25
20
G/l
15
10
5
0
0 dpi
4 dpi
7 dpi
11 dpi
14 dpi
18 dpi
dpi
CSF 0277
CSF 0634
Abb. 32: Leukozytenzahlen bei Infektion mit CSF 0277 und CSF 0634 (MW ± s)
Ergebnisse
92
Leukozyten CSF 0277
30
25
G/l
20
15
10
5
0
0 dpi
4 dpi
7 dpi
11 dpi
14 dpi
18 dpi
21 dpi
dpi
DL
H
Abb. 33: Leukozytenzahlen der Deutschen Landrasse (DL) und der Hybridschweine (H) bei Infektion mit CSF 0277 (MW ± s)*
Leukozyten CSF 0634
30
25
G/l
20
15
10
5
0
0 dpi
4dpi
7dpi
11 dpi
14 dpi
18 dpi
dpi
DL
H
Abb. 34: Leukozytenzahlen der Deutschen Landrasse (DL) und der Hybridschweine (H) bei Infektion mit CSF 0634 (MW ± s)*
* keine signifikanten Unterschiede zwischen den Leukozytenzahlen der beiden Gruppen
Ergebnisse
93
4.2.4 Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion
Das KSP-Virus konnte bei den fünf Tieren der Deutschen Landrasse und den fünf
Hybridschweinen, die mit dem Isolat CSF 0277 infiziert wurden, 7 Tage p.i. aus den
Leukozyten isoliert werden. Bei vier Schweinen der Deutschen Landrasse und zwei
Hybridschweinen gelang die Virusisolierung bereits 4 dpi. 14 Tage p.i. war in beiden
Gruppen nur noch je ein Schwein viruspositiv und 18 Tage p.i. konnte bei keinem der
Schweine das KSP-Virus mehr in der Leukozytenfraktion nachgewiesen werden
(Tab. 20 und 21).
Die Tiere der beiden Gruppen, die mit dem Isolat CSF 0634 infiziert wurden, waren
7 Tage p.i. viruspositiv. Bei allen 10 Schweinen konnte das KSP-Virus während der
gesamten Krankheitsdauer aus der Leukozytenfraktion isoliert werden. Bei vier
Schweinen der Deutschen Landrasse und drei Hybridschweinen war schon
4 Tage p.i. eine Virusisolierung aus den Leukozyten möglich (Tab. 22 und 23).
Tab. 20: Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion von Schweinen der
Deutschen Landrasse, die mit CSF 0277 infiziert worden waren.
0 dpi
4 dpi
7 dpi
11 dpi
14 dpi
18 dpi
Tier 129
neg
neg
pos
pos
pos
neg
Tier 130
neg
pos
pos
pos
neg
neg
Tier 131
neg
pos
pos
neg
neg
neg
Tier 132
neg
pos
pos
pos
neg
neg
Tier 133
neg
pos
pos
pos
neg
neg
neg : Virusisolierung negativ;
pos : Virusisolierung positiv
* fehlende Werte in den Tabellen: Tiere bereits verstorben/euthanasiert
Ergebnisse
94
Tab. 21: Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion von Hybridschweinen, die mit
CSF 0277 infiziert worden waren.
0 dpi
4 dpi
7 dpi
11 dpi
14 dpi
18 dpi
Tier 134
neg
pos
pos
pos
neg
neg
Tier 135
neg
neg
pos
neg
neg
neg
Tier 136
neg
pos
pos
pos
pos
neg
Tier 137
neg
neg
pos
pos
neg
neg
Tier 138
neg
neg
pos
pos
neg
neg
neg : Virusisolierung negativ;
pos : Virusisolierung positiv
Tab. 22: Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion von Schweinen der
Deutschen Landrasse, die mit CSF 0634 infiziert worden waren.
0 dpi
4 dpi
7 dpi
11 dpi 14 dpi 18 dpi 21 dpi 25 dpi
Tier 141
neg
pos
pos
pos
pos
pos
pos
pos
Tier 142
neg
neg
pos
pos
pos
pos
pos
*
Tier 143
neg
pos
pos
pos
pos
pos
pos
pos
Tier 144
neg
pos
pos
pos
pos
pos
pos
pos
Tier 145
neg
pos
pos
pos
*
*
*
*
neg : Virusisolierung negativ;
pos : Virusisolierung positiv
* fehlende Werte in den Tabellen: Tiere bereits verstorben/euthanasiert
Ergebnisse
95
Tab. 23: Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion von Hybridschweinen, die mit
CSF 0634 infiziert worden waren.
0 dpi
4 dpi
7 dpi
11 dpi
14 dpi
18 dpi
20 dpi
Tier 146
neg
neg
pos
pos
pos
pos
pos
Tier 147
neg
neg
pos
pos
pos
pos
*
Tier 148
neg
pos
pos
pos
pos
*
*
Tier 149
neg
pos
pos
pos
pos
pos
*
Tier 150
neg
pos
pos
pos
pos
pos
*
neg : Virusisolierung negativ;
pos : Virusisolierung positiv
4.2.5 Virustiter im Serum
Der Virustiter im Serum wurde für den Tag 7 p. i. ermittelt. Die Virustiter der
Deutschen Landrasse (CSF 0277) lagen zwischen 102,7 KID50/ml und 104,2 KID50/ml.
Die Hybridschweine (CSF 0277) erreichten einen Virustiter zwischen 103 KID50/ml
und 104,2 KID50/ml. Bei Infektion mit dem KSPV-Isolat CSF 0634 lagen die Virustiter
der Hybridschweine zwischen 103,2 KID50/ml und 104,2 KID50/ml. Die Tiere der
Deutschen Landrasse erreichten einen Virustiter zwischen 103,2 KID50/ml und
104 KID50/ml. Die Virustiter der Einzeltiere und die durchschnittlichen Virustiter für
jedes Virusisolat sind in Tab. 24 dargestellt.
* fehlende Werte in den Tabellen: Tiere bereits verstorben/euthanasiert
Ergebnisse
96
Tab. 24: Vergleich der Virustiter (log10 KID50/ml) der Hybridschweine und der
Schweine der Deutschen Landrasse, die am Tag 7 p.i. erreicht wurden. Für
jedes Virusisolat sind die Virustiter der Einzeltiere und der durchschnittliche
Virustiter (Ø) angegeben.
CSF-Isolat
Titer der
Einzeltiere
Ø Titer
CSF 0277
CSF 0277
CSF 0634
CSF 0634
(DL)
(H)
(DL)
(H)
4,0
3,2
3,2
3,2
3,5
3,0
3,0
3,5
4,2
3,7
3,7
3,7
3,7
4,0
3,7
4,0
2,7
4,2
4,0
4,2
3,6
3,6
3,5
3,7
4.2.6 Bildung neutralisierender Antikörper
Die Serumproben wurden auf das Vorhandensein neutralisierender Antikörper (nAk)
gegen das jeweilige homologe Virus getestet. Drei Tiere der Deutschen Landrasse
und drei Hybridschweine, die mit dem CSF-Isolat 0634 infiziert worden waren,
entwickelten keine Antikörper (Titer < 5). Die übrigen Tiere dieser beiden Gruppen
zeigten
in
der
Terminalphase
der
Erkrankung
ab
Tag
18
p.i.
eine
Antikörperentwicklung. Nur bei einem Tier konnten schon 14 dpi neutralisierende
Antikörper nachgewiesen werden (Tab. 25 und 26). Bei Infektion mit CSF 0277
erholten sich alle 10 Schweine von der KSP-Infektion. Die rekonvaleszenten Tiere
entwickelten ab 14 dpi unterschiedlich hohe Antikörpertiter. Die Antikörpertiter der
Hybridschweine lagen 25 dpi zwischen 80 ND50 und 480 ND50. Die Schweine der
Deutschen Landrasse hatten 25 dpi einen Titer zwischen 30 ND50 und 160 ND50
(Tab. 27 und 28).
Ergebnisse
97
Tab. 25: Titer der neutralisierenden Antikörper (ND50) bei Infektion mit CSF 0634
(Deutsche Landrasse)
Tiere
11dpi
13dpi
14 dpi
18 dpi
21 dpi
25 dpi
141
<5
n.u.
40
120
480
480
142
<5
n.u.
<5
<5
<5
*
143
<5
n.u.
<5
15
20
20
144
<5
n.u.
<5
<5
<5
<5
145
<5
<5
*
*
*
*
Tab. 26: Titer der neutralisierenden Antikörper (ND50) bei Infektion mit CSF 0634
(Hybridschweine)
Tiere
11dpi
14 dpi
16dpi
18 dpi
20 dpi
146
<5
<5
n.u.
40
60
147
<5
<5
n.u.
80
120
148
<5
<5
*
*
*
149
<5
<5
n.u.
<5
*
150
<5
<5
<5
*
*
* fehlende Werte in den Tabellen: Tiere bereits verstorben/euthanasiert;
kursiv: Tiere moribund euthanasiert
n.u.: nicht untersucht
Ergebnisse
98
Tab. 27: Titer der neutralisierenden Antikörper (ND50) bei Infektion mit CSF 0277
(Deutsche Landrasse)
Tiere
11dpi
14 dpi
18 dpi
21 dpi
25 dpi
129
<5
7,5
60
60
60
130
<5
7,5
20
40
40
131
<5
7,5
60
60
80
132
<5
15
30
30
30
133
<5
10
40
120
160
Tab. 28: Titer der neutralisierenden Antikörper (ND50) bei Infektion mit CSF 0277
(Hybridschweine)
Tiere
11dpi
14 dpi
18 dpi
21 dpi
25 dpi
134
<5
15
30
80
80
135
<5
7,5
80
120
320
136
<5
15
60
160
320
137
<5
15
120
320
480
138
<5
15
160
320
480
5. Diskussion
Die Infektion mit dem Virus der Klassischen Schweinepest kann zu sehr
unterschiedlichen Krankheitsverläufen führen. Neben der akut-letalen Form treten
mildere akut-transiente, inapparente und chronische Verlaufsformen auf (DEPNER et
al., 1996a). Außerdem kann das Virus bei tragenden Tieren die Plazentaschranke
überwinden (VAN OIRSCHOT u. TERPSTRA, 1977). Der Verlauf einer Infektion mit
dem KSPV wird durch verschiedene Faktoren bestimmt. Neben der Virulenz des
jeweiligen Virusisolates beeinflussen auch Wirtsfaktoren, wie z.B. Alter sowie
Konstitution und Kondition der Tiere, den Verlauf der Erkrankung (DAHLE u. LIESS,
1995, DEPNER et al., 1997). Spezifische Virulenzfaktoren sind bisher nicht bekannt.
Die Einteilung der Viren in hoch, moderat und schwach virulent beruht einerseits auf
Beobachtungen in Tierbeständen nach einem KSP-Ausbruch (ELBERS et al., 1999).
Andererseits wurde eine kleine Anzahl von Isolaten aufgrund ihres Verhaltens in der
Zellkultur (AYNAUD et al., 1976, VAN OIRSCHOT, 1988, MITTELHOLZER et al.,
2000) und anhand einer klinisch ermittelten Punktzahl (Clinical Score) in
verschiedene Virulenzkategorien eingeteilt (MITTELHOLZER et al., 2000).
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, dieses Untersuchungsschema von Mittelholzer
et al. (2000) auf seine Gültigkeit und Anwendbarkeit zu überprüfen. Dazu wurden vier
KSPV-Feldisolate,
die
unterschiedlichen
genetischen
Typen
angehören,
im
Tierversuch getestet und entsprechend dem oben genannten Schema klassifiziert.
Darüber hinaus wurde die Eignung weiterer Parameter für eine Charakterisierung der
Virulenz überprüft. Hierzu zählten die Inkubationszeit, die Mortalitätsrate, die
Bestimmung der Leukozytenzahl, der Beginn und die Dauer der Virämie und die
Höhe des Virustiters im Serum sowie die Bildung neutralisierender Antikörper. Ferner
wurde ein neu entwickelter Pathological Score auf seine Anwendbarkeit für die
Charakterisierung der Virulenz getestet.
Zudem sollte ermittelt werden, ob es Unterschiede im klinischen Verlauf der KSP und
damit in der Bewertung der Virulenz einzelner Virusisolate gibt, wenn man unter
gleichen Bedingungen Reinzucht- und Kreuzungstiere infiziert.
100
Diskussion
5.1 Auswahl der Virusisolate und der Versuchstiere
Bei der Auswahl der Virusisolate wurde berücksichtigt, dass Primärausbrüche bei
Hausschweinen häufig durch direkten oder indirekten Kontakt zu infizierten
Wildschweinen oder durch illegale Verfütterung von Speiseabfällen hervorgerufen
werden (FRITZEMEIER et al., 2000).
Die Isolate CSF 0277 (Genotyp 2.1 Paderborn) und CSF 0634 (Genotyp 2.3 Uelzen)
wurden bei KSP-Ausbrüchen in Deutschland Ende der 1990er Jahre aus
Hausschweinen isoliert. Der KSP-Virustyp 2.3 Uelzen zirkuliert seit 1992 in der
Wildschweinepopulation in Niedersachsen (FRITZEMEIER et al., 2000).
Die beiden Virusisolate des Genotyps 1 repräsentieren KSP-Epidemien außerhalb
der EU. Das Isolat CSF 0650 (Genotyp 1.2) stammt aus Mittelamerika und das Isolat
CSF 0695 (Genotyp 1.1) aus Russland. Beide KSPV-Isolate wurden Ende der
1990er Jahre aus Hausschweinen isoliert. Sie wurden bisher noch nicht im
Tierversuch charakterisiert. Es besteht auch bei der KSP die Gefahr der
Neueinschleppung des Virus in die Mitgliedsstaaten der EU, wie bei dem Maul- und
Klauenseuche (MKS)-Ausbruch 2001 in Großbritannien geschehen (DAVIES et al.,
2002).
Da das Alter der Tiere einen großen Einfluss auf den Krankheitsverlauf hat
(DEPNER et al., 1996a), wurden Schweine einer Altersgruppe (ca. 8 Wochen)
infiziert. Im ersten Tierversuch, in dem die vier Virusisolate getestet wurden, dienten
Schweine der Deutschen Landrasse (DL) als Versuchstiere. Im zweiten Tierversuch
wurden zum Vergleich des Krankheitsverlaufes von Reinzucht- und Kreuzungstieren
Hybridschweine (DL x Pietrain) und DL-Schweine mit zwei der zuvor verwendeten
Virusisolate, die als hoch bzw. moderat virulent klassifiziert wurden, infiziert. Es
wurde der Vergleich zwischen Kreuzungs- und Reinzuchttieren gewählt, da
Kreuzungstiere gegenüber Reinzuchttieren eine Überlegenheit in verschiedenen
Parametern der immunologischen Abwehr, z.B. Zahl der Blutleukozyten, SerumImmunglobulinkonzentration an IgG, IgM und IgA, Phagozytosefähigkeit peripherer
Granulozyten aufweisen (BUSCHMANN et al., 1985).
Diskussion
101
Neben dem Alter kann auch die Virusdosis den Verlauf der Erkrankung beeinflussen.
Für den KSP-Stamm Alfort/187 (CSF 0902) konnte gezeigt werden, dass der
klinische Verlauf von der Höhe der applizierten Virusdosis abhing (DAHLE u. LIESS,
1995). Allerdings wurde in weiteren Infektionsversuchen deutlich, dass die
Infektionsdosis eine weniger bedeutende Rolle spielt als das Alter. Ferkel erkrankten
und starben trotz minimaler Virusdosen, während ältere Tiere auch nach Infektion mit
sehr hohen Dosen an infektiösem Virus klinisch inapparente oder milde Infektionen
durchliefen (DEPNER et al., 1996a). Zur Vergleichbarkeit der Ergebnisse wurden die
Schweine in der vorliegenden Arbeit mit der gleichen Virusdosis infiziert. Als
Infektionsweg wurde die intranasale Inokulation gewählt, da die oronasale Infektion
den natürlichen Übertragungsweg darstellt (VAN OIRSCHOT, 1999).
5.2 Beurteilung des Untersuchungsschemas von MITTELHOLZER et al. (2000)
Zur
Charakterisierung
Untersuchungsschema,
Ausprägungsgrad
der
das
bewertet
Virulenz
klinische
und
einen
diente
Symptome
Vergleich
ein
der
semiquantitatives
KSP
zwischen
und
deren
verschiedenen
Tierexperimenten erlauben soll. Anhand des Schemas kann des weiteren der Verlauf
der Erkrankung verfolgt werden, und Unterschiede in der Bewertung der klinischen
Symptome durch verschiedene Untersucher werden minimiert. Dieses von
MITTELHOLZER et al. (2000) vorgeschlagene Untersuchungsschema beruht auf der
Beurteilung von Einzeltieren und enthält 10 KSP-relevante Parameter (Lebhaftigkeit,
Haltung, Nährzustand, Atmung, Gang, Haut, Konjunktiven, Appetit, Kotabsatz, Futter
im Trog), die je nach Schwere des Symptoms mit 0-3 Punkten beurteilt werden
können. Damit kann eine maximale klinische Punktzahl (Clinical Score) von 30 pro
Tag und Tier erreicht werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden nur neun der zehn Parameter beurteilt. Der im
Untersuchungsschema aufgeführte Parameter „Futter im Trog“, der die im Trog
zurückgelassene Futtermenge bewertet, ist nur zufriedenstellend zu beurteilen, wenn
die Schweine einzeln gehalten werden. In den hier durchgeführten Tierversuchen
Diskussion
102
war dies nicht möglich, da je fünf Schweine gemeinsam in einer Isolierstalleinheit
untergebracht waren. Abgesehen davon wird das Fressverhalten der Tiere schon
durch den Parameter „Appetit“ abgedeckt. Die Doppelbewertung der Futteraufnahme
rechtfertigt
das
Herausnehmen
Untersuchungsschema,
da
des
dieser
Punktes
„Futter
im
Trog“
aus
dem
Parameter sonst unverhältnismäßig stark
berücksichtigt würde. Die Parameter Lebhaftigkeit, Haltung und Gang beinhalten alle
bei der Vergabe von 3 Punkten das Symptom „Festliegen“. Trotz der starken
Bewertung dieses Symptoms wurden keine Veränderungen der drei Parameter
vorgenommen, da sie jeweils unterschiedliche Krankheitsmerkmale beurteilen
(Allgemeinbefinden, neurologische Störungen). Der maximal erreichbare Clinical
Score lag somit bei 27. In Anlehnung an MITTELHOLZER et al. (2000) wurden KSPVirusisolate, die einen Clinical Score von > 14 erreichten, als hoch virulent
klassifiziert. Isolate, bei denen der maximale Clinical Score zwischen 5 und 14 lag,
wurden als moderat virulent eingestuft und schwach virulente Isolate wurden durch
eine Punktzahl von < 5 definiert.
Vier KSPV-Feldisolate wurden anhand des Bewertungsschemas im ersten
Tierversuch klassifiziert. Für jedes Virusisolat wurde der durchschnittliche Clinical
Score berechnet. Zur Berechnung des Mittelwertes wurde der maximale Clinical
Score eines jeden Tieres herangezogen, auch wenn dieser an unterschiedlichen
Tagen p.i. (post infectionem) erreicht wurde. Eine Bewertung des Clinical Score zu
einem bestimmten Zeitpunkt, z.B. 10, 14 oder 18 dpi führte zu einem verfälschten
Ergebnis, da es die Tiere, die zwischen diesen Zeitpunkten die stärksten
Krankheitserscheinungen zeigten, nicht berücksichtigen würde. Dies war besonders
dann der Fall, wenn Schweine sich von der Infektion erholten.
Das
KSPV-Feldisolat
CSF
0634
(Genotyp
2.3
Uelzen)
erreichte
einen
durchschnittlichen Clinical Score von 17,6 und wurde als hoch virulent klassifiziert.
Das Isolat CSF 0277 (Genotyp 2.1. Paderborn) erreichte einen durchschnittlichen
Clinical Score von 10,2 und wurde als moderat virulent eingestuft. Dieses Isolat
wurde
auch
in
anderen
Untersuchungen
als
moderat
(STEGEMANN et al., 2000, UTTENTHAL et al., 2001, 2003).
virulent klassifiziert
Diskussion
103
Bei Infektion mit dem Isolat CSF 0695 (Genotyp 1.3) konnte ein durchschnittlicher
Clinical Score von 13,4 ermittelt werden. Dieses Isolat wurde daraufhin ebenfalls als
moderat virulent eingestuft. Das KSP-Feldisolat CSF 0650 (Genotyp 1.1) erreichte
einen durchschnittlichen Clinical Score von 10, und es gilt damit ebenfalls als
moderat virulent.
Eine eindeutige Zuordnung zu einer Virulenzkategorie war nur bei dem KSPV-Isolat
CSF 0634 für alle Tiere möglich. Dieses Isolat wurde als hoch virulent eingestuft,
denn sowohl im ersten als auch im zweiten Tierversuch erreichten alle 15 Schweine
einen Clinical Score > 14 (hoch virulent). Die anderen drei Isolate wurden aufgrund
des durchschnittlichen Clinical Score als moderat virulent eingestuft. Allerdings
erreichten hier die Tiere, die einen letalen Krankheitsverlauf entwickelten, einen
Clinical Score, der größer war als 14. Würde man die Tiere mit letalen
Krankheitsverläufen isoliert betrachten, so müsste man auch diese Isolate als hoch
virulent einstufen. Bei den genesenen Tieren lag der Clinical Score zwischen 5 und
14 (moderat virulent). Die Klassifizierung dieser Isolate als moderat virulent ist
gerechtfertigt, da ein Isolat, bei dem mehr als 20% der Tiere die Infektion überleben,
nicht als hoch virulent eingestuft werden kann. Die Beobachtung, dass ein KSPVirusisolat zu sehr unterschiedlichen Krankheitsverläufen führen kann, obwohl die
infizierten Tiere das gleiche Alter hatten, der gleichen Rasse angehörten und mit der
gleichen Virusdosis infiziert worden waren, stimmt mit Ergebnissen früherer
Infektionsversuche
im
EURL
überein
(FLOEGEL-NIESMANN,
persönliche
Mitteilung). Dies wird besonders beim Vergleich des Clinical Score und der Mortalität
der Tiergruppen deutlich, die mit dem Isolat CSF 0277 infiziert wurden. Im ersten
Tierversuch lag der Clinical Score für dieses Isolat bei 10,2 und die Mortalität betrug
60%. Die zwei Gruppen, die im zweiten Tierversuch mit dem gleichen Isolat infiziert
wurden, zeigten einen deutlich milderen Krankheitsverlauf. Hier lag der Clinical Score
zwischen 5,6 und 6,6 und die Mortalität betrug 0%. In beiden Tierversuchen wurde
das Virusisolat als moderat virulent eingestuft. Es zeigte sich aber hier sehr deutlich,
dass die Variationsbreite im Krankheitsverlauf bei moderat virulenten Virusisolaten
sehr groß sein kann. Aufgrund dessen ist die von MITTELHOLZER et al. (2000)
gewählte Tierzahl von zwei Tieren pro Isolat zu gering, um reproduzierbare
104
Diskussion
Ergebnisse zu erhalten. Die Tierzahl ist in einem Tierversuch immer limitiert
(Tierschutz, Praktikabilität usw.), aber die Infektion von zwei Tieren pro Isolat lässt
keine statistisch signifikanten Aussagen zu. Die geringe Tierzahl ist eine mögliche
Erklärung dafür, dass bei den Untersuchungen von MITTELHOLZER et al. (2000)
eine einheitliche Zuordnung zu einer Virulenzkategorie auch bei moderat virulentem
Virus für alle Tiere möglich war. Zum anderen wurden in dieser Studie zum
überwiegenden Teil gentechnisch klonierte Virusstämme verwendet, während in der
vorliegenden Arbeit Feldisolate untersucht wurden. Diese Isolate können Mutanten
verschiedener Pathogenität enthalten oder defekte interferierende Viruspartikel, die
möglicherweise den Verlauf der Erkrankung beeinflussen (DAHLE u. LIESS, 1995).
Außerdem stammten die von MITTELHOLZER et al. (2000) infizierten Tiere aus
einer SPF-Zucht, während die im EURL verwendeten Schweine aus einer
konventionellen Haltung stammten und damit der mikrobielle Status der Tiere nicht
definiert war. Nicht-SPF-Tiere entwickelten eine schwerere klinische Verlaufsform der
KSP im Vergleich zu SPF-Tieren, wenn sie unter gleichen Bedingungen infiziert
wurden (RUGGLI, persönliche Mitteilung).
Das von MITTELHOLZER et al. (2000) vorgeschlagene Untersuchungsschema ist
zur Beurteilung der Virulenz des KSPV in Tierversuchen geeignet, mit der
Einschränkung, dass eine ausreichende Zahl von Probanden pro Virusisolat infiziert
werden muss. Eine Anzahl von mindestens fünf Tieren wird empfohlen, um den
großen Unterschieden im Krankheitsverlauf mit moderat virulenten Virusisolaten
Rechnung zu tragen. Außerdem sollte der durchschnittliche Clinical Score (CS) aus
den Maximalwerten der einzelnen Tiere berechnet werden (Summe maximaler CS
der Einzeltiere/Anzahl der Tiere), um auch bei moderat virulentem Virus eine
Klassifizierung zu ermöglichen. Das Schema kann helfen, die Klassifizierung des
KSPV in hoch, moderat und schwach virulente Isolate zwischen verschiedenen
Labors vergleichbar zu machen.
Für die Beurteilung der Virulenz eines KSPV-Isolates in einem Bestand ist das
Untersuchungsschema nicht geeignet, da Infektionszeitpunkt und Verlauf der
Infektion nicht bekannt sind. Die Bewertung würde hier nur eine Momentaufnahme
darstellen, und der maximale Clinical Score könnte somit nicht bestimmt werden.
Diskussion
5.3
Vergleich
105
des
Krankheitsverlaufes
der
KSP
von
Reinzucht-
und
Kreuzungstieren
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit lag darin zu untersuchen, ob es
Unterschiede in der Bewertung der Virulenz eines Virusisolates gibt, wenn man unter
gleichen Bedingungen Reinzucht- und Kreuzungstiere infiziert.
Da ein Virusisolat auch unter möglichst gleichen Infektionsbedingungen in einem
Tierversuch zu unterschiedlichen Krankheitsverläufen führen kann, wurde gefolgert,
dass der Infektionsverlauf der KSP auch von Wirtsfaktoren wie Alter, Rasse und
Immunstatus abhängig sein muss (DEPNER, 1996a, b). In einer Studie fielen
Unterschiede in den Krankheitsverläufen bei Infektion von je fünf Hybridschweinen
(DL x Pietrain) und DL-Schweinen mit dem Isolat Visbek/Han95 (CSF 0123) auf
(DEPNER et al., 1997). Die fünf DL-Schweine entwickelten die akute Verlaufsform
der KSP, während dies nur bei zwei Hybridschweinen der Fall war. Ein
Hybridschwein erholte sich von der Infektion und zwei Tiere durchliefen die
chronische Form der KSP. Würde man die Virulenz des in diesem Versuch
eingesetzten Virus aufgrund der Ergebnisse mit den DL-Schweinen beurteilen, so
müsste man das Virus als hoch virulent einstufen. Die Ergebnisse der
Kreuzungstiere andererseits würden auf schwächere Virulenz des Virus schließen
lassen (DEPNER et al., 1997).
Im hier durchgeführten zweiten Tierversuch wurden je fünf Hybridschweine und DLSchweine intranasal mit der gleichen Virusdosis der KSPV-Isolate CSF 0277 und
CSF 0634 infiziert. Es wurden je ein hoch bzw. moderat virulentes Virusisolat
gewählt, um den Einfluss der Virulenz beim Vergleich des Krankheitsverlaufes von
Reinzucht- und Kreuzungstieren zu berücksichtigen. Bei Infektion mit dem zuvor als
moderat virulent eingestuftem Isolat CSF 0277 durchliefen alle 10 Schweine eine
transiente Verlaufsform der KSP. Die Mortalität betrug bei beiden Gruppen 0%. Die
Hybridschweine erreichten einen Clinical Score von 5,6 und die DL-Schweine von
6,6. In beiden Fällen wurde das Virusisolat CSF 0277 als moderat virulent eingestuft.
Die Tiere beider Gruppen, die mit dem zuvor als hoch virulent charakterisierten Isolat
CSF 0634 infiziert wurden, erkrankten alle an der akut-letalen Form der KSP. Die
Diskussion
106
Mortalität betrug in beiden Gruppen 100%. Die DL-Schweine erreichten einen
Clinical Score von 16,6 und die Hybridschweine von 19,6. Das Virusisolat CSF 0634
konnte in beiden Gruppen jeweils als hoch virulent charakterisiert werden.
Unterschiede in der klinischen Verlaufsform der KSP zwischen den Kreuzungstieren
und den Reinzuchttieren, wie für das Isolat Visbek/Han95 (CSF 0123) beschrieben,
konnten bei den beiden hier verwendeten Isolaten nicht festgestellt werden. Auch
beim Vergleich der pathologischen Veränderungen, dem Beginn und der Dauer der
Virämie, der Höhe des Virustiter im Serum (7 dpi) und der Bildung neutralisierender
Antikörper waren keine signifikanten Unterschiede zwischen den Hybridschweinen
und den DL-Schweinen festzustellen. Mit dem Isolat Visbek/Han95, das als moderat
virulent gilt, konnten alle bekannten Krankheitsverläufe der KSP-Virusinfektion (akutletal, akut-transient, chronisch) auch in DL-Schweinen induziert werden (DEPNER et
al., 1996b). Aufgrund dessen und der Ergebnisse dieses Tierversuches kann
gefolgert werden, dass allein Faktoren, die in dem Unterschied zwischen Reinzuchtund
Kreuzungstieren
begründet
liegen,
nicht
die
stark
variierenden
Krankheitsverläufe der KSP erklären können. Welchen Einfluss Wirtsfaktoren wie
z.B. die Rasse auf den Verlauf der Erkrankung haben, bleibt weiterhin ungeklärt. Das
Alter und der Immunstatus der Schweine spielen möglicherweise eine größere Rolle
für den Verlauf der KSP-Virusinfektion als die Rasse.
Diskussion
107
5.4 Eignung weiterer Parameter für Charakterisierung der Virulenz des KSPV
Zusätzlich zu den im Untersuchungsschema von MITTELHOLZER et al. (2000)
aufgeführten Merkmalen wurde die Eignung weiterer Parameter für die Bestimmung
der Virulenz von KSPV-Isolaten untersucht. Es wurde geprüft, ob die Inkubationszeit
und die Mortalitätsrate, die Bestimmung der Leukozytenzahl, der Beginn und die
Dauer der Virämie und die Höhe des Virustiters im Serum sowie die Bildung
neutralisierender Antikörper eine sinnvolle Ergänzung zum Clinical Score darstellen.
Des weiteren wurde ein neu entwickelter Pathological Score (PS) auf seine
Anwendbarkeit für die Charakterisierung der Virulenz überprüft.
5.4.1 Pathological Score
Für die postmortale Untersuchung (Sektion) wurde ein Untersuchungsschema
entwickelt, das ausgewählte pathologische Veränderungen beinhaltet und angelehnt
an den Clinical Score mit Punkten bewertet. Zehn KSP-relevante Parameter wurden
untersucht und je nach Ausprägungsgrad der Veränderung mit einer Punktzahl von
0-3 bewertet. Nach deren Addition ergab sich eine pathologische Punktzahl
(Pathological Score) von maximal 30 pro Tier. Es wurde überprüft, ob eine Einteilung der getesteten Virusisolate in hoch (PS > 15), moderat (PS 5-15) und
schwach (PS < 5) in Anlehnung an den Clinical Score möglich war.
Bei der postmortalen Untersuchung wurde deutlich, dass die oft in der Literatur
beschriebenen pathologischen Veränderungen für die KSP, wie z.B. Nekrosen an
den Tonsillen oder Randinfarkte der Milz (DUNNE, 1970, VAN OIRSCHOT, 1999) bei
den hier verwendeten KSPV-Isolaten eine untergeordnete Rolle spielten. Nur bei den
Tieren, die mit dem Isolat CSF 0634 infiziert worden waren und bei zwei Tieren, die
das Isolat CSF 0695 erhielten, zeigte sich das hämorrhagische Krankheitsbild der
KSP (DUNNE, 1970, VAN OIRSCHOT, 1999). Bei allen Isolaten waren jedoch die
Lymphknoten (Lnn. inguinales, Lnn. mandibulares, Ln. Ileocaecalis) die am stärksten
betroffenen Organe. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass bei vergrößerten,
Diskussion
108
hämorrhagischen Lymphknoten auch KSP als Differentialdiagnose berücksichtigt
werden sollte.
Eine Einteilung der KSPV-Isolate in hoch, moderat und schwach virulent analog zum
Clinical Score war nicht möglich. Besonders bei Tieren, die zwar deutliche klinische
Symptome zeigten, sich jedoch von der Infektion erholten, waren nach der Genesung
zum Zeitpunkt der Sektion kaum pathologische Veränderungen festzustellen. Dies
wurde besonders im zweiten Tierversuch deutlich, wo das Isolat CSF 0277, das nach
dem Clinical Score als moderat virulent eingestuft wurde, im Pathological Score nur
einen Wert < 5 (schwach virulent) erreichte. Kaum ausgeprägte pathologische
Veränderungen wurde ebenfalls auch für perakut verendete Tiere beschrieben
(TRAUTWEIN, 1988). Im Gegensatz zum Clinical Score kann beim Pathological
Score der Zeitpunkt der ausgeprägtesten Veränderungen nicht ermittelt werden. Eine
Möglichkeit wäre, alle Tiere zu einem festgesetzten Tag p.i. zu euthanasieren, um
vergleichbare Ergebnisse zu erhalten. Dies ist jedoch nicht sinnvoll, da so der Verlauf
der Erkrankung (Genesung oder letaler Verlauf) nicht mehr beurteilt werden kann.
Aufgrund der oben genannten Punkte ist der Pathological Score für die
Charakterisierung der Virulenz nicht geeignet, er gibt jedoch einen Hinweis darauf,
welche Organveränderungen bei den einzelnen Virusisolaten besonders auffällig
sind.
5.4.2 Inkubationszeit, Virämie und Virustiter im Serum
Die Dauer der Inkubationszeit, die Höhe des Virustiters im Blut und der Beginn der
Virämie werden auch als Hinweise auf die Virulenz eines KSPV-Isolates gewertet. So
zeigten hoch virulente Isolate im Allgemeinen eine kürzerer Inkubationszeit, einen
höheren Virustiter im Blut und einen früheren Beginn der Virämie als moderat oder
schwach virulente Isolate (VAN OIRSCHOT, 1988, KAMOLSIRIPRICHAIPORN et
al., 1992). In der vorliegenden Arbeit konnte dieser Zusammenhang für die hier
eingesetzten
Virusisolate
nicht
bestätigt
werden.
Das
als
hoch
virulent
Diskussion
109
charakterisierte Isolat CSF 0634 zeigte im ersten Tierversuch sogar eine um 2-3
Tage längere Inkubationszeit als die drei als moderat virulent eingestuften Isolate.
Auch die Virusisolierung aus den Leukozyten und die Höhe des Virustiters im Serum
an Tag 7 p.i. erlaubten keine Differenzierung der Virulenz. Im ersten Tierversuch war
bei dem Isolat CSF 0634 die Virusisolierung aus den Leukozyten bei allen Tieren erst
7 dpi möglich, während bei einigen Tieren, die mit den Isolaten CSF 0277, CSF 0650
und CSF 0695 infiziert worden waren, bereits 4 dpi eine Virusanzucht aus den
Leukozyten gelang. Auch in der Höhe des Virustiters im Serum zeigten sich keine
Unterschiede zwischen dem als hoch virulent klassifizierten Isolat CSF 0634 und den
moderat virulenten Isolaten CSF 0650, 0695 und 0277. Für die Bestimmung des
Virustiters im Serum wurde der Tag 7 p.i. gewählt, da zu diesem Zeitpunkt alle
Schweine viruspositiv waren, jedoch noch kein Tier verendet war. Aufgrund der oben
genannten Ergebnisse wurden die Inkubationszeit, die Virämie und der Virustiter im
Serum nicht in das Schema zur Beurteilung der Virulenz der KSPV-Isolate
einbezogen.
5.4.3 Bestimmung der Leukozytenzahl
Die Infektion mit dem KSPV verursacht eine schwere Leukopenie, die schon vor dem
Auftreten von Fieber beobachtet werden kann (TRAUTWEIN, 1988).
Alle infizierten Schweine der beiden Tierversuche entwickelten eine deutliche
Leukopenie. Die Leukozytenzahl wurde in das Schema zur Beurteilung der Virulenz
der KSPV-Isolate einbezogen (vgl. S. 70).
Im ersten Tierversuch erkrankten elf von 20 Schweinen an der akut-letalen
Verlaufsform der KSP. Der Clinical Score dieser Schweine war > 14 (hoch virulent).
Bei allen elf Tieren sanken die Leukozyten unter 6,5 G/l. Deshalb wurde eine
Leukozytenzahl < 6,5 mit drei Punkten bewertet. Im Gegensatz dazu lagen bei
sieben der neun rekonvaleszenten Tiere, die niedrigsten Leukozytenwerte über 6,5
G/l. Nur zwei der genesenen Schweine zeigten ein vorübergehendes Absinken der
Leukozyten unter 6,5 G/l. Der Clinical Score dieser Tiere lag zwischen 5 und 14
Diskussion
110
(moderat virulent). Der Referenzbereich der Leukozyten beim Schwein liegt zwischen
10 und 22 G/l (BICKHARDT, 1992). Aus diesem Grund wurde eine Leukozytenzahl
von ≥ 10 G/l mit 0 Punkten bewertet, um nicht Tiere mit einer niedrigen
physiologischen Leukozytenzahl schon vor der Infektion zu erfassen. Diese aufgrund
der Ergebnisse des ersten Tierversuches getroffene Einteilung wurde im zweiten
Tierversuch überprüft. Da es keine signifikanten Unterschiede zwischen der
Leukozytenzahl der Hybridschweine und der der DL-Schweine gab, wurden die
Werte
der
beiden
Gruppen
für
die
Isolate
CSF
0277
und
CSF
0634
zusammengefasst. Bei Tieren, die mit dem hoch virulenten Isolat CSF 0634 infiziert
worden waren, sanken die Leukozyten auf durchschnittlich 5,7 G/l, während es bei
Infektion mit dem moderat virulenten Isolat zu einem Abfall der Leukozyten auf
durchschnittlich 8,9 G/l kam.
5.4.4 Bildung neutralisierender Antikörper
Die Bildung neutralisierender Antikörper (nAk) wurde ebenfalls in die Bewertung der
Virulenz einbezogen (vgl. S 77), denn die Fähigkeit eines Schweins, nAk gegen das
KSPV zu entwickeln, bestimmt in hohem Maße den weiteren Krankheitsverlauf. Im
ersten Tierversuch zeigten acht von neun rekonvaleszenten Schweinen 14 dpi eine
Antikörperbildung (nAk > 5), während nur bei einem Schwein, das an der akut-letalen
Form der KSP erkrankte, zu diesem Zeitpunkt neutralisierende Antikörper
nachgewiesen werden konnten.
Die Höhe des Antikörpertiters ließ sich nicht bewerten, da Tiere, die mit dem gleichen
Isolat infiziert wurden, eine zu große Variationsbreite in der Höhe des Antikörpertiters
zeigten. Für die Bestimmung des Antikörpertiters wurde Tag 14 p.i. gewählt, da auch
moribunde Tiere in der Terminalphase der Erkrankung neutralisierende Antikörper
entwickeln können. Bei einer Bewertung der Antikörperbildung zu einem späteren
Zeitpunkt würden auch diese Tiere mit null Punkten bewertet. Die getroffene
Einteilung wurde im zweiten Tierversuch überprüft. Alle Schweine, die mit dem
moderat virulenten Isolat CSF 0277 infiziert worden waren, zeigten 14 dpi eine
Diskussion
111
Antikörperbildung. Nur bei einem Schwein, das mit dem Isolat CSF 0634 infiziert
worden war, konnten zu diesem Zeitpunkt neutralisierende Antikörper nachgewiesen
werden.
5.4.5 Mortalitätsrate
Für die Beurteilung der Virulenz des KSPV stellt die Mortalität ein wichtiges Kriterium
dar (VAN OIRSCHOT, 1988). In dem von MITTELHOLZER et al. (2000)
vorgeschlagenen Bewertungsschema wurde sie jedoch nicht berücksichtigt, deshalb
wurde sie in das modifizierte Untersuchungsschema neu aufgenommen (vgl. S. 61).
Die Mortalitätsrate kann nicht wie die anderen Parameter für das Einzeltier bestimmt
werden, sondern nur für eine Tiergruppe. Auch aus diesem Grund ist es wichtig, eine
ausreichend große Tierzahl für die Bestimmung der Virulenz eines Virusisolates zu
infizieren.
In
der
vorliegenden
Arbeit
wurden
moribunde
Schweine
aus
Tierschutzgründen beim Vorliegen eines Clinical Score von mindestens 15
euthanasiert.
5.4.6 Einbeziehung geeigneter Parameter in das Untersuchungsschema von
MITTELHOLZER et al. (2000)
Die Mortalitätsrate, die Leukozytenzahl und die Bildung neutralisierender Antikörper
sind geeignete Parameter zur Bestimmung der Virulenz, während die anderen oben
genannten Parameter keine Zuordnung der vier getesteten KSPV-Isolate in eine
Virulenzkategorie erlaubten.
Der Clinical Score wurde unter Einbeziehung der oben genannten 3 Parameter neu
bestimmt. Da nun zwölf Parameter mit je 0-3 Punkten beurteilt wurden, konnte ein
modifizierter Clinical Score von maximal 36 erreicht werden. Virusisolate, die einen
Clinical Score von > 18 erreichten, wurden als hoch virulent eingestuft. Virusisolate,
bei denen der maximale Clinical Score zwischen 6 und 18 lag, wurden als moderat
112
Diskussion
virulent bewertet und schwach virulente Isolate wurde durch eine Punkzahl < 6
definiert. Damit die einzelnen Parameter des Untersuchungsschemas nicht
unterschiedlich stark gewertet werden, wurde auch hier die Unterteilung in 0 bis 3
Punkte beibehalten. Aufgrund der individuell sehr verschieden ausgeprägten
Symptome der KSP, wäre eine unterschiedlich starke Wertung der einzelnen
Parameter nicht gerechtfertigt.
Bezüglich der Einordnung der Virulenz der vier Virusisolate hat die Einbeziehung der
drei Parameter zu keiner Veränderung geführt. Das Isolat CSF 0634 wurde auch
nach dem modifizierten Bewertungsschema als hoch virulent eingestuft während die
Isolate CSF 0650, 0695 und 0277 als moderat virulent beurteilt wurden.
Die drei Parameter stellen somit eine gute Ergänzung zu dem Clinical Score von
MITTELHOZER et al. (2000) dar, vor allem unterliegen sie nicht der subjektiven
Beurteilung durch den Untersucher. Ihre Gültigkeit sollte aber noch durch die
Testung weiterer Virusisolate überprüft werden.
6. Zusammenfassung
Claudia Bunzenthal
Bestimmung der Virulenz von Virusisolaten der Klassischen Schweinepest
Die Klassische Schweinepest wird durch ein Pestivirus (KSPV) aus der Familie der
Flaviviridae verursacht. Seit ihrer Erstbeschreibung 1833 in Ohio (USA) wurden
perakute bis chronische Verlaufsformen beschrieben. Für die unterschiedlichen
klinischen Bilder der KSP werden neben der Virulenz des Erregers auch
Wirtsfaktoren, wie Alter, Rasse und Immunstatus der Tiere postuliert.
Bei den Seuchenausbrüchen der letzten Jahrzehnte entstand der Eindruck, dass
vermehrt protrahierte und klinisch inapparente oder „atypische“ Krankheitsverläufe
auftraten, die durch Infektion mit Virusisolaten von moderater bis schwacher Virulenz
erklärt wurden. Es wurden mehrfach Studien durchgeführt, um die Virulenz
bestimmter KSPV-Stämme zu quantifizieren, wobei jedoch keine einheitliche
Definition gefunden wurde.
In einem dieser Ansätze wurde ein Schema erstellt, dass die Virulenz von KSPVIsolaten über die Bestimmung einer klinischen Punktzahl (Clinical Score, CS)
ermittelt (Mittelholzer et al., Vet. Microbiol., 2000; 74: 293-308). Ziel der vorliegenden
Arbeit war, die Gültigkeit und Anwendbarkeit dieses Schemas zu überprüfen.
Vier KSPV-Feldisolate wurden im Tierversuch daraufhin untersucht, ob sie sich
anhand des Bewertungsschemas als hoch, moderat oder schwach virulent einordnen
lassen. Dabei wurden je fünf Schweine mit einem Isolat infiziert. Eine eindeutige
Zuordnung zu einer Virulenzkategorie war nur bei dem als hoch virulent eingestuften
Isolat CSF 0634 möglich. Bei den Isolaten CSF 0650, 0695 und 0277 waren die
Krankheitsverläufe bei den einzelnen Tieren einer Gruppe sehr verschieden. Sie
reichten von schweren akuten Erkrankungen mit letalem Ausgang bis hin zu milderen
transienten Verläufen mit vollständiger Genesung der Tiere und Entwicklung einer
effektiven Immunantwort. Diese Virusisolate wurden aufgrund des durchschnittlichen
Clinical Score als moderat virulent klassifiziert.
Zusammenfassung
114
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Krankheitsverlauf der Klassischen
Schweinepest von Hybridschweinen (DL x Pietrain) und Schweinen der Deutschen
Landrasse verglichen. Die Tiere wurden mit den Isolaten CSF 0277 bzw. CSF 0634
infiziert. Im Gegensatz zu früheren Beobachtungen konnten keine Unterschiede im
Krankheitsverlauf zwischen Kreuzungs- und Reinzuchttieren für die hier verwendeten
Isolate festgestellt werden. Möglicherweise spielen Alter und Immunstatus der Tiere
eine größere Rolle als die Rasse.
Die Versuche zeigten, dass das Untersuchungsschema zur Ermittlung der Virulenz
einzelner KSPV-Isolate zumindest im Tierversuch geeignet ist, jedoch mit der
Einschränkung, dass eine ausreichende Zahl von Probanden infiziert werden muss,
um die stark variierenden Krankheitsverläufe bei Infektion mit moderat virulenten
Virusisolaten zu berücksichtigen. Zur Feststellung der Virulenz des KSPV in einem
Bestand ist es nicht zu empfehlen, da hier Infektionszeitpunkt und Krankheitsverlauf
nicht bekannt sind.
Weitere Parameter wurden auf ihre Eignung für die Charakterisierung der Virulenz
des KSPV untersucht. Der Pathological Score, die Inkubationszeit, Beginn und Dauer
der Virämie und die Höhe des Virustiters im Serum waren nicht geeignet für die
Einteilung der Virulenz. Die Bestimmung der Leukozytenzahl, die Bildung
neutralisierender
ergänzende
Antikörper
Parameter
und
dar.
die
Sie
Untersuchungsschema einbezogen.
Mortalität
wurden
in
stellen
das
dagegen
oben
geeignete
beschriebene
Summary
Claudia Bunzenthal
Determination of the virulence of Classical Swine Fever Virus isolates
Classical Swine Fever (CSF) is caused by a Pestivirus (CSFV) within the family
Flaviviridae. Since the disease was first recognized 1833 in Ohio, USA, peracute to
chronic forms have been described. It has been postulated that the changing clinical
picture of CSF may be determined by the virulence of the virus itself, or due to host
factors, as are age, breed and immune status of the animals.
During the outbreaks of CSF in the last decades it was observed that more and more
inapparent or “atypical” courses of the disease occured. This was attributed to the
appearance of CSF viruses of moderate to low virulence. Several studies have been
performed to categorize the virulence of CSFV strains, but up to date no feasible
parameters have been defined. In one of these studies virulence of CSFV strains
was determined by using a clinical score system (Mittelholzer et al., Vet. Microbiol.,
2000; 74: 293-308).
The aim of this work was to test this approach for its applicability. For this, four recent
CSFV isolates were selected and each virus was used for infection of five pigs of the
same age and breed.
Only one isolate (CSF 0634) could be clearly assigned as highly virulent. Pigs
infected with the other three isolates (CSF 0650, CSF 0695 and CSF 0277)
developed differing clinical courses ranging from mild transient forms to the acute
lethal form of CSF. These three CSFV isolates could be classified as moderately
virulent by using the average clinical score.
In the second part of this work an attempt was made to analyse the influence of the
pig breed on the course of CSF. Pigs of the German landrace and crossbred
weaners (DL x Pietrain) were infected with two of the isolates used in the first
experiment (CSF 0277 and CSF 0634). In contrast to previously published findings,
116
Summary
no differences in the course of the disease were observed, thus indicating that age
and immune status of the pigs seem to be more relevant than the breed.
In summary, it was found that the determination of the clinical score is suitable for
classifying the virulence of CSFV isolates under experimental conditions only. In the
field, this is not possible as the time of infection is unknown. In addition, due to the
different clinical signs within one group of pigs, a sufficiently high number of animals
has to be included.
To find whether further parameters are adequate to supplement the clinical score
determination scheme, the leucocyte count, the development of neutralising
antibodies and the mortality rate were determined and found to be suitable. On the
contrary incubation period, viraemia and the pathological score and the level of virus
in the serum were not suitable.
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8. Anhang
8.1 Tabellen
Tab. 29: Körpertemperatur in °C bei Infektion mit CSF 0650
DPI
TIER 80
TIER 81
TIER 82
TIER 83
TIER 102
0
39,4
39,3
39,5
39,3
38,8
1
39,6
39,3
39,7
38,9
39,1
2
39,7
39,1
39,3
39,5
38,9
3
39,6
39,5
39,5
39,2
39,3
4
41,6
41,5
40,3
39,9
39,9
5
41,7
41,8
40,6
40,3
41
6
40,9
41,3
40,7
40,2
40,7
7
41,2
41,7
39,8
40,6
40,7
8
40,2
42,0
40,0
40,0
40,7
9
41,1
41,5
39,9
39,3
39,8
10
40,8
41,4
39,9
39,5
39,2
11
40,5
41,4
39,8
39,5
39,2
12
39,6
40,7 †
39,6
39,3
39,3
13
39,7
39,7
38,7
39,3
14
39,5
39,5
38,7
38,7
15
39,4
39,8
39,1
38,9
16
39,5
39,2
38,8
38,6
17
39,3
39,2
38,6
38,7
18
38,9
39,7
39,0
39,0
19
38,8
39,6
39,1
38,6
20
39,2
39,5
38,8
38,5
Anhang
139
Tab. 30: Körpertemperatur in °C bei Infektion mit CSF 0695
DPI
TIER 84
TIER 85
TIER 86
TIER 87
TIER 88
0
39,4
39,3
39,1
39,2
39,4
1
39,0
39,2
39,6
39,1
39,2
2
39,3
38,9
39,1
39,2
39,0
3
39,9
40,3
39,7
40,3
40
4
41,0
41,8
40,7
41,4
41,5
5
41,5
40,9
40,7
40,8
40,5
6
40,7
41,2
40,2
40,9
41,0
7
39,6
41,4
39,9
40,8
39,8
8
39,5
40,8
39,4
39,9
39,6
9
39,7
40,5
39,5
40,9
39,2
10
39,4
40,8
39,6
40,6
39,7
11
39,2
40,3 †
39,4
41,5
39,5
12
39,1
39,3
42,2
39,6
13
38,7
39,0
38,5 †
39,1
14
38,7
39,3
39,5
15
39,2
39,5
39,7
16
38,8
39,2
39,4
17
38,6
39,1
39,2
18
38,7
38,8
38,9
19
38,6
39,0
39,0
20
38,7
38,6
38,8
Anhang
140
Tab. 31: Körpertemperatur in °C bei Infektion mit CSF 0634
DPI
TIER 89
TIER 90
TIER 91
TIER 92
TIER 93
0
39,5
39,7
39,3
39,5
39,5
1
39,4
39,6
39,5
39,4
39,6
2
39,7
39,5
39,4
39,6
39,4
3
39,2
39,1
39,9
39,4
39,3
4
38,7
39,3
39,5
39,1
38,8
5
39,6
41,4
40,8
40,1
39,5
6
41,0
41,0
41,5
40,8
39,8
7
41,7
41,6
41,4
40,4
39,9
8
41,9
41,4
41,5
40,2
40,6
9
40,5
41,7
41,1
40,3
40,7
10
40,3
41,0
41,4
41,0
40,6
11
42,2
42,4
41,8
40,1
41,4
12
41,0
41,0
41,0
40,5
40,9
13
41,6
40,3
38,0 †
41,2
41,0
14
41,0
40,0 †
40,3
41,0
15
41,0 †
41,0
40,9
16
41,4
40,3
17
40,8
40,1 †
18
40,2
19
40,6
20
41,5 †
Anhang
141
Tab. 32: Körpertemperatur in °C bei Infektion mit CSF 0277
DPI
TIER 94
TIER 95
TIER 96
TIER 97
TIER 98
0
39,0
39,5
39,4
39,4
39,3
1
39,7
39,5
39,5
39,4
39,6
2
39,7
39,6
39,7
39,5
39,5
3
39,3
39,7
39,5
39,6
39,5
4
39,5
39,9
39,4
39,5
39,7
5
39,6
39,7
39,8
39,6
39,7
6
40,2
41,2
40,0
40,5
40,0
7
40,6
40,7
41,0
40,0
40,2
8
40,8
41,0
41,7
40,2
40,4
9
40,2
40,8
41,5
40,5
40,9
10
40,3
40,8
41,1
40,1
40,6
11
40,3
41,8 †
41,0
40,1
41,0
12
42,0
40,7
40,5
41,7
13
40,2
40,7
39,7
41,2
14
40,0
40,5
39,6
41,0
15
39,7
39,2
39,0
40,8
16
40,3
39,4
39,5
40,3 †
17
40,6
38,5
39,7
18
40,8 †
39,0
39,1
19
39,1
38,4
20
39,5
38,9
Anhang
142
Tab. 33: Leukozytenzahlen in G/l bei Infektion mit CSF 0650
DPI
TIER 80
TIER 81
TIER 82
TIER 83
TIER 102
0
23,9
15,2
16,8
16,4
16,3
4
12,7
9,4
9,1
10,6
14,2
7
7,3
6,2
12,8
6,5
9
11
4,9
9
15,2
10
14,2
14
7,7
15,4
15,2
17,7
18
11
18,3
18,8
14,4
21
14,3
18,5
17,7
24
18,3
17,8
18,8
Tab. 34: Leukozytenzahlen in G/l bei Infektion mit CSF 0695
DPI
TIER 84
TIER 85
TIER 86
TIER 87
TIER 88
0
20,2
17,3
22,8
21,1
18,9
4
4,4
4,6
8,5
11,7
11,4
7
4,4
4,9
10,2
6,2
9,7
11
6,3
2,0
18,8
2,3
13,4
14
9,7
17,4
2,6
15,0
18
9,9
19,3
15,4
21
14,2
14
14,0
24
16,2
14,4
Anhang
143
Tab. 35: Leukozytenzahlen in G/l bei Infektion mit CSF 0634
DPI
TIER 89
TIER 90
TIER 91
TIER 92
TIER 93
0
14,5
16,8
18,6
18,9
28,5
4
11,3
14,7
9,4
22,1
11,6
7
6,0
10,2
10,0
9,1
7,4
11
5,1
6,4
6,2
6,0
5,2
14
9,2
6,7
8,8
12,3
10,0
4,2
18
Tab. 36: Leukozytenzahlen in G/l bei Infektion mit CSF 0277
DPI
TIER 95
TIER 96
TIER 97
TIER 98
0
19,9
22,6
16,1
18,3
4
4,7
12,2
9,7
16,9
7
9,1
9,2
8,8
8,4
11
5,7
17,6
8,3
5,9
14
16,2
12,4
7,2
18
15,7
14,7
21
19,5
13,8
25
18,7
15,1
Anhang
144
Tab. 37: Körpertemperatur in °C bei Infektion mit CSF 0277 (Deutsche Landrasse)
DPI
TIER 129
TIER 130
TIER 131
TIER 132
TIER 133
0
38,8
38,9
38,7
38,6
38,8
1
38,7
38,7
38,8
38,9
38,9
2
38,7
39,1
39,0
38,9
39,2
3
38,6
39,1
38,8
38,8
39,0
4
38,9
39,2
39,4
39,2
39,8
5
39,0
39,3
39,6
39,6
40,3
6
39,8
39,9
39,8
40,0
40,0
7
40,4
39,6
39,7
39,6
39,8
8
39,7
39,7
39,2
39,7
39,8
9
40,4
39,5
39,0
39,0
39,7
10
39,6
39,3
39,3
39,3
39,8
11
39,3
39,3
39,2
39,2
39,0
12
39,3
39,0
38,7
38,6
39,3
13
39,0
39,2
39,0
39,2
39,8
14
39,2
39,0
39,2
39,1
38,9
15
38,9
39,0
38,8
38,8
39,3
16
38,6
39,0
38,7
38,9
39,0
17
39,6
39,3
39,0
38,9
39,3
18
39,3
39,5
39,1
39,3
39,0
19
38,8
39,2
39,0
39,2
39,0
20
38,6
39,1
38,8
38,9
39,2
Anhang
145
Tab. 38: Körpertemperatur in °C bei Infektion mit CSF 0277 (Hybridschweine)
DPI
TIER 134
TIER 135
TIER 136
TIER 137
TIER 138
0
38,9
39,3
39,0
39,0
38,8
1
38,8
38,7
39,3
38,9
38,8
2
38,7
38,9
39,2
39,3
39,3
3
39,0
39,3
39,2
39,3
39,3
4
38,9
39,6
39,6
39,6
39,8
5
39,2
39,3
39,6
39,8
39,7
6
39,6
39,7
39,8
40,5
40,1
7
39,8
39,8
39,8
40,3
40,5
8
40,4
40,2
40,3
40,3
40,6
9
40,2
40,2
40,0
40,0
39,8
10
39,7
40,3
40,8
39,8
39,7
11
40,5
40,0
39,8
39,5
39,5
12
39,5
39,0
39,3
39,7
39,2
13
39,6
39,3
39,8
39,2
39,3
14
39,5
39,5
39,8
39,5
39,7
15
39,5
39,2
39,3
39,3
39,1
16
38,6
39,1
39,2
39,5
39,2
17
38,7
39,1
39,3
39,4
39,2
18
38,7
39,4
39,5
39,4
39,0
19
39,3
39,0
39,4
39,0
38,9
20
39,2
39,0
39,5
38,8
39,0
Anhang
146
Tab. 39: Körpertemperatur in °C bei Infektion mit CSF 0634 (Deutsche Landrasse)
DPI
TIER 141
TIER 142
TIER 143
TIER 144
TIER 145
0
39,1
38,7
38,7
38,9
38,5
1
38,8
38,7
38,9
38,6
38,7
2
39,2
39,2
39,6
39,8
39,3
3
38,9
39,3
39,4
39,4
39,1
4
39,0
39,1
39,6
39,2
39,1
5
39,4
39,5
40,0
39,0
39,6
6
40,2
40,0
40,0
40,2
40,0
7
40,7
39,7
39,8
40,0
40,6
8
40,8
40,3
40,6
40,5
41,0
9
41,3
40,5
40,3
40,0
41,2
10
40,8
41,6
41,0
40,7
41,0
11
40,0
40,9
39,9
41,0
40,8
12
41,0
41,0
40,6
41,0
40,9
13
40,3
41,6
40,5
40,6
39,8 †
14
40,6
40,4
40,2
41,1
15
40,3
40,7
41,0
41,2
16
40,5
41,3
41,0
40,8
17
40,3
41,2
41,0
40,7
18
39,8
40,9
40,1
41,0
19
41,7
41,2
40,9
41,0
20
40,4
41,2
41,1
40,9
21
39,9
39,9
39,1
39,9
22
40,4
40,4
39,9
40,7
23
40,3
40,0
40,0
39,9
24
39,7
37,5 †
39,1
39,5
25
38,1 †
39,1 †
39,2 †
Anhang
147
Tab. 40: Körpertemperatur in °C bei Infektion mit CSF 0634 (Hybridschweine)
DPI
TIER 146
TIER 147
TIER 148
TIER 149
TIER 150
0
38,8
38,7
39,4
38,6
38,9
1
38,9
39,3
39,2
38,6
38,8
2
38,8
39,3
39,2
39,3
39,2
3
39,2
39,2
39,4
38,9
39,2
4
39,4
39,3
39,7
39,7
39,5
5
39,3
39,8
41,0
39,9
40,0
6
39,6
40,6
40,8
40,2
40,3
7
40,0
40,0
41,1
40,7
40,3
8
40,4
40,4
41,2
40,3
41,0
9
40,8
40,6
40,3
40,5
41,0
10
41,0
41,0
41,3
40,8
41,0
11
41,2
41,6
41,0
41,0
41,5
12
41,6
41,4
41,6
41,8
41,7
13
41,3
41,5
41,8
40,0
41,6
14
41,0
40,9
42,0
41,2
40,8
15
41,0
41,0
40,6 †
41,3
40,0
16
41,0
40,9
41,7
38,7 †
17
40,8
41,0
41,0
18
40,2
40,8
38,5 †
19
40,0
41,1
20
40,3 †
40,7 †
Anhang
148
Tab. 41: Leukozytenzahlen in G/l bei Infektion mit CSF 0277 (Deutsche Landrasse)
DPI
TIER 129
TIER 130
TIER 131
TIER 132
TIER 133
0
15,8
16,1
19,3
16,2
16,8
4
10,4
8,9
8,9
6,8
11,5
7
7,6
10,9
13,4
7,4
9,7
11
9,6
16,2
15,8
15,8
21,3
14
17,7
17,2
16,2
17,6
20,6
18
19,5
14,4
16,7
17,2
18,4
21
20,2
13,8
14,6
15,6
15,4
25
19,4
14,1
15,6
18,0
19,9
Tab. 42: Leukozytenzahlen in G/l bei Infektion mit CSF 0277 (Hybridschweine)
DPI
TIER 134
TIER 135
TIER 136
TIER 137
TIER 138
0
21,1
17,7
19,9
17,0
15,6
4
7,6
17,5
12,0
16,2
7,6
7
6,7
7,4
6,9
9,8
9,0
11
13,9
15,7
17,9
22,5
8,1
14
17,8
12,6
16,3
23,2
15,0
18
19,4
14,5
13,1
19,6
15,5
21
16,3
14,8
15,2
18,8
16,6
25
17,5
11,5
16,4
19,3
14,9
Anhang
149
Tab. 43: Leukozytenzahlen in G/l bei Infektion mit CSF 0634 (Deutsche Landrasse)
DPI
TIER 141
TIER 142
TIER 143
TIER 144
TIER 145
0
13,7
14,4
25,4
17,4
18,4
4
8,7
9,6
12,0
10,3
6,9
7
5,8
6,6
11,3
8,1
10,8
11
3,2
5,1
5,0
8,6
2,8
14
3,5
6,6
8,0
9,4
1,7
18
4,0
3,5
5,3
7,1
21
1,7
3,5
3,7
5,6
25
2,4
4,2
7,2
Tab. 44: Leukozytenzahlen in G/l bei Infektion mit CSF 0634 (Hybridschweine)
DPI
TIER 146
TIER 147
TIER 148
TIER 149
TIER 150
0
22,5
13,9
19,7
20,7
18,7
4
10,7
5,3
9,0
11,1
13,4
7
7,3
3,7
6,0
10,6
12,2
11
7,6
3,5
8,2
12,3
10,5
14
4,2
4,2
1,6
11,0
5,4
18
7,4
3,4
21
6,2
5,4
1,2
Anhang
150
8.2 Zusammensetzung der verwendeten Medien und Reagenzien
8.2.1 Zellkulturmedien
MEM (minimum essential medium)-Earle
(Medium für die Zelllinie Niere/PK(15)A)
MEM-Earle-Fertigpulver1
9,60 g
NaHCO3
2,20 g
Aqua bidest. ster.
ad 1000,00 ml
Fetales Kälberserum2
50 ml
Der pH-Wert wurde durch CO2-Begasung auf 7,0 eingestellt.
EDulb (EMEM [Eagle’s minimum essential medium], modifiziert nach DULBECCO
und FREEMAN [1959])
(Medium für Virustitration, Virusneutralisationstest und Virusisolierung)
EDulb-Pulvermedium3
13,53 g
2,20 g
NaHCO3
Penicillin G4
Streptomycin Sulfat
0,06 g
5
Aqua bidest. ster.
0,05 g
ad 1000,00 ml
Der pH-Wert wurde durch CO2-Begasung auf 6,9 eingestellt.
1
Fa. Gibco, BRL, Eggenheim, Kat.-Nr. 61100-087
2
Fa. Biochrom, Berlin, Kat.-Nr. 0115
3
Fa. Serva, Heidelberg, Art.-Nr. 47303
4
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Prod.-Nr. P 3032
5
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Prod.-Nr. S 9137
Anhang
151
8.2.2 Reagenzien
8.2.2.1 Puffer
PBS (Phosphatpuffer pH 7,0-7,2; DULBECCO u. VOGT (1954))
NaCl
8,00 g
KCl
0,20 g
NaHPO4 x 12 H2O
2,37 g
KH2PO4
0,20 g
CaCl2 x 2 H2O
0,13 g
MgCl2 x 6 H2O
0,10 g
Aqua bidest. ster.
ad 1000,00 ml
PBS/Tween
PBS
Tween® 206
1000,00 ml
100,00 µl
PBSM (Phosphatpuffer ohne Kalzium und Magnesium mit Phenolrot und Dextrose,
pH 7,3)
NaCl
8,00 g
KCl
0,20 g
NaHPO4 x 12 H2O
2,37 g
KH2PO4
0,20 g
Dextrose
1,00 g
Phenolrot
0,016 g
Aqua bidest. ster.
6
Fa. Merck, Darmstadt, Art.-Nr. 109280
ad 1000,00 ml
Anhang
152
8.2.2.2 Lösungen
ATV (adjusted trypsin-versen)-Lösung
NaCl
8,00 g
KCl
0,40 g
NaHCO3
0,58 g
Dextrose
1,00 g
Trypsin (3U/mg)7
0,50 g
EDTA (Versen)
0,20 g
Aqua bidest. ster.
ad 1000,00 ml
Lagerung bei –20 °C, nach dem Auftauen nicht erneut einfrieren.
AEC-Lösung
3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC)8
Dimethylformamid
Natriumazetat-Puffer
H2O2 (3%)
20,00 mg
3,00 ml
ad 50,00 ml
0,40 ml
1000 mg 3-Amino-9-Ethylcarbazol und 150 ml Dimethylformamid wurden für 3
Monate bei 4 °C gelagert.
Dextranlösung 5%ig
Dextransulfat-Na-Salz
5g
EDTA-Lösung (1,5%)
ad 100 ml
Auflösen im Wasserbad bei 45 °C und anschließend autoklavieren.
7
Fa. Serva, Heidelberg, Art.-Nr. 37290
8
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Prod.-Nr. A5754
Anhang
153
8.3 Sonstige Chemikalien
Calciumchlorid
Merck, Darmstadt
102083
Dextrose
Riedel-de Haen, Seelze
16325
Dimethylformamid
Merck, Darmstadt
103053
EDTA
Merck, Darmstadt
108418
Glycin
Jürgens, Hannover
4201.1000
Kaliumchlorid
Merck, Darmstadt
104934
Kaliumdihydrogenphosphat
Merck, Darmstadt
112034
(Di)Kaliumhydrogenphosphat
Merck, Darmstadt
105109
Magnesiumchlorid
Merck, Darmstadt
814733
Natriumazetat
Merck, Darmstadt
101539
Natriumchlorid
Merck, Darmstadt
1.06404.5004
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Carl Roth, Karlsruhe
2326.2
Natriumhydrogencarbonat
Merck, Darmstadt
106329
Natriumhydrogenphosphat
Merck, Darmstadt
106352
Tris(hydroxmethyl)aminomethan p. A.
Merck, Darmstadt
1.08382
Wasserstoffperoxid 30%
Merck, Darmstadt
107209
Anhang
154
8.4 Geräte und Gebrauchsgegenstände
Autoklaven
Autoklav 17
Melag, Berlin
Inkubator
CO2-Inkubator Typ B 5060 EK/CO2
Heraeus, Hanau
Inkubator Typ BB 6220 CU
Heraeus, Hanau
Ständer für Einfrierröhrchen
Kryo Vials® Support Rack
Greiner, Nürtingen
Mikroskope
Inverses Mikroskop (715075)
Leitz, Wetzlar
pH-Meter
Calimatic 766
H. Jürgens, Hannover
Pipetten
Pipetman, P20, P100, P200, P1000
ABIMED Analysen Technik GmbH,
Langenfeld
Digitale 12-Kanal Pipette
Finland Labsystems for Flow
Laboratories
Pipettierhilfen
pipetus® -standard
Hirschmann Laborgeräte
Pipetboy plus®
Tecnomara AG, Wallisellen, Schweiz
Sicherheitswerkbänke
NUAIRE™ Klasse II Typ A/B3
NUAIRE, Plymouth, Minnesota, USA
Microflow ABS/200 A
Astec Microflow, North Somerset, UK
Anhang
155
Zählkammer
Neubauer improved
Landgraf Laborgeräte, Langenhagen
Thoma
H. Jürgens, Hannover
Trockenschrank (80 °C)
Ehret, Emmerdingen
Waagen
1213 MP
Satorius, GmbH, Göttingen
Wasserbäder
Type 1003
Gesellschaft
f.
Labortechnik
m.b.H.,
Burgwedel
Zentrifugen
Lobofuge 400R
Heraeus-Christ GmbH, Osterode/Harz
8.5 Verbrauchsmittel
Blutentnahmeröhrchen
Kabavette G (S 79 G 7,5)
KABE® Labortechnik,
Nürmbrecht-Elsenroth
Kabavette G (E 79 G 7,5)
102600
KABE® Labortechnik,
Nürmbrecht-Elsenroth
102200
Greiner, Nürtingen
126563
Einfrierröhrchen
Kryo-Vials® 2 ml
Anhang
156
Gewebekulturflaschen
Gewebekulturflaschen 50 ml
Greiner, Nürtingen
690160
Gewebekulturflaschen 250 ml
Greiner, Nürtingen
658170
Gewebekulturröhrchen
Greiner, Nürtingen
163160
Volumen bis 1000
MBT Brand, Gießen
1478025
Volumen bis 200
ratiolab, Dreilich
2100601
Mikrotiterplatten
Greiner, Nürtingen
653190
Makrotiterplatten
Greiner, Nürtingen
662160
Pipettenspitzen
Polysterolmikrotiterplatten
Anhang
157
8.6 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1:
Genomorganisation des KSPV
17
Abb. 2:
Clinical Score bei Infektion mit CSF 0650 (Genotyp 1.3)
56
Abb. 3:
Temperaturverlauf bei Infektion mit CSF 0650 (Genotyp 1.3)
56
Abb. 4:
Clinical Score bei Infektion mit CSF 0695 (Genotyp 1.1)
57
Abb. 5:
Temperaturverlauf bei Infektion mit CSF 0695 (Genotyp 1.1)
57
Abb. 6:
Clinical Score bei Infektion mit CSF 0634 (Genotyp 2.3)
58
Abb. 7:
Temperaturverlauf bei Infektion mit CSF 0634 (Genotyp 2.3)
58
Abb. 8:
Clinical Score bei Infektion mit CSF 0277 (Genotyp 2.1)
59
Abb. 9:
Temperaturverlauf bei Infektion mit CSF 0277 (Genotyp 2.1)
59
Abb. 10: Mortalitätrate (%) bei Infektion mit den vier KSPV-Isolaten
61
Abb. 11: Pathological Score bei Infektion mit CSF 0650 (Genotyp 1.3)
65
Abb. 12: Pathological Score bei Infektion mit CSF 0695 (Genotyp 1.1)
65
Abb. 13: Pathological Score bei Infektion mit CSF 0634 (Genotyp 2.3)
66
Abb. 14: Pathological Score bei Infektion mit CSF 0277 (Genotyp 2.1)
66
Abb. 15: Leukozytenzahlen bei Infektion mit den vier KSPV-Isolaten
67
Abb. 16: Leukozytenzahlen bei Infektion mit CSF 0650 (Genotyp 1.3)
68
Abb. 17: Leukozytenzahlen bei Infektion mit CSF 0695 (Genotyp 1.1)
68
Abb. 18: Leukozytenzahlen bei Infektion mit CSF 0634 (Genotyp 2.3)
69
Abb. 19: Leukozytenzahlen bei Infektion mit CSF 0277 (Genotyp 2.1)
69
Abb. 20: Clinical Score bei Infektion mit CSF 0277 (Dt. Landrasse)
81
Abb. 21: Temperaturverlauf bei Infektion mit CSF 0277 (Dt. Landrasse)
81
Abb. 22: Clinical Score bei Infektion mit CSF 0277 (Hybridschweine)
82
Abb. 23: Temperaturverlauf bei Infektion mit CSF 0277 (Hybridschweine)
82
Abb. 24: Clinical Score bei Infektion mit CSF 0634 (Dt. Landrasse)
83
Abb. 25: Temperaturverlauf bei Infektion mit CSF 0634 (Dt. Landrasse)
83
Abb. 26: Clinical Score bei Infektion mit CSF 0634 (Hybridschweine)
84
Abb. 27: Temperaturverlauf bei Infektion mit CSF 0634 (Hybridschweine)
84
Abb. 28: Pathological Score bei Infektion mit CSF 0277 (Dt. Landrasse)
89
Abb. 29: Pathological Score bei Infektion mit CSF 0277 (Hybridschweine)
89
Anhang
158
Abb. 30: Pathological Score bei Infektion mit CSF 0634 (Dt. Landrasse)
90
Abb. 31: Pathological Score bei Infektion mit CSF 0634 (Hybridschweine)
90
Abb. 32: Leukozytenzahlen bei Infektion mit CSF 0277 und CSF 0634
91
Abb. 33: Leukozytenzahlen der Dt. Landrasse (DL) und der Hybridschweine (H)
bei Infektion mit CSF 0277
92
Abb. 34: Leukozytenzahlen der Dt. Landrasse (DL) und der Hybridschweine (H)
bei Infektion mit CSF 0634
92
Anhang
159
8.7 Tabellenverzeichnis
Tab. 1:
Einteilung der Virulenz
40
Tab. 2:
Klinischer Schlüssel zur Bestimmung des Clinical Score
41
Tab. 3:
Pathologischer Schlüssel zur Bestimmung des Pathological Score
43
Tab. 4:
Vergleich des Clinical Score (CS) und der Inkubationszeit bei
Infektion mit den vier KSPV-Isolaten.
Tab. 5:
60
Vergleich des Clinical Score (CS) der vier KSPV-Isolate an Tag
10, 14 und 18 p.i. mit dem maximalen CS (CSmax)
61
Tab. 6:
Pathological Score bei Infektion mit den vier KSPV-Isolaten
64
Tab. 7:
Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion von Schweinen, die mit
CSF 0650 infiziert worden waren.
Tab. 8:
Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion von Schweinen, die mit
CSF 0695 infiziert worden waren.
Tab. 9:
71
72
Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion von Schweinen, die mit
CSF 0634 infiziert worden waren.
72
Tab. 10: Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion von Schweinen, die mit
CSF 0277 infiziert worden waren.
73
Tab. 11: Vergleich der Virustiter (log10 KID50/ml) der vier KSPV-Isolate,
die am Tag 7 p.i. im Serum erreicht wurden.
74
Tab. 12: Titer der neutralisierenden Antikörper bei Infektion mit CSF 0650
75
Tab. 13: Titer der neutralisierenden Antikörper bei Infektion mit CSF 0695
75
Tab. 14: Titer der neutralisierenden Antikörper bei Infektion mit CSF 0634
76
Tab. 15: Titer der neutralisierenden Antikörper bei Infektion mit CSF 0277
76
Tab. 16: Vergleich der Bildung neutralisierender Antikörper am Tag 14 p.i.
77
Tab. 17: Clinical Score (CS) nach MITTELHOLZER et al. (2000) und nach
dem modifizierten Bewertungsschema (CSmod)
78
Tab. 18: Vergleich des Clinical Score (CS) und der Inkubationszeit von Hybridschweinen (H) und Schweinen der Deutschen Landrasse (DL),
die mit CSF 0277 und CSF 0634 infiziert worden waren.
85
Anhang
160
Tab. 19: Vergleich des Pathological Score (PS) von Hybridschweinen (H)
und Schweinen der Deutschen Landrasse (DL) bei Infektion mit
CSF 0277 und CSF 0634.
88
Tab. 20: Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion von Schweinen der
Deutschen Landrasse, die mit CSF 0277 infiziert worden waren.
93
Tab. 21: Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion von Hybridschweinen,
die mit CSF 0277 infiziert worden waren.
94
Tab. 22: Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion von Schweinen der
Deutschen Landrasse, die mit CSF 0634 infiziert worden waren.
94
Tab. 23: Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion von Hybridschweinen,
die mit CSF 0634 infiziert worden waren.
95
Tab. 24: Vergleich der Virustiter (log10 KID50/ml) der Hybridschweine und
der Schweine der Deutschen Landrasse, die am Tag 7 p.i. erreicht
wurden.
96
Tab. 25: Titer der neutralisierenden Antikörper (ND50) bei Infektion mit
CSF 0634 (Deutsche Landrasse)
97
Tab. 26: Titer der neutralisierenden Antikörper (ND50) bei Infektion mit
CSF 0634 (Hybridschweine)
97
Tab. 27: Titer der neutralisierenden Antikörper (ND50) bei Infektion mit
CSF 0277 (Deutsche Landrasse)
98
Tab. 28: Titer der neutralisierenden Antikörper (ND50) bei Infektion mit
CSF 0277 (Hybridschweine)
98
Tab. 29: Körpertemperatur in °C bei Infektion mit CSF 0650
138
Tab. 30: Körpertemperatur in °C bei Infektion mit CSF 0695
139
Tab. 31: Körpertemperatur in °C bei Infektion mit CSF 0634
140
Tab. 32: Körpertemperatur in °C bei Infektion mit CSF 0277
141
Tab. 33: Leukozytenzahlen in G/l bei Infektion mit CSF 0650
142
Tab. 34: Leukozytenzahlen in G/l bei Infektion mit CSF 0695
142
Tab. 35: Leukozytenzahlen in G/l bei Infektion mit CSF 0634
143
Tab. 36: Leukozytenzahlen in G/l bei Infektion mit CSF 0277
143
Tab. 37: Körpertemperatur in °C bei Infektion mit CSF 0277 (Dt. Landrasse)
144
Anhang
161
Tab. 38: Körpertemperatur in °C bei Infektion mit CSF 0277 (Hybridschweine) 145
Tab. 39: Körpertemperatur in °C bei Infektion mit CSF 0634 (Dt. Landrasse)
146
Tab. 40: Körpertemperatur in °C bei Infektion mit CSF 0634 (Hybridschweine) 147
Tab. 41: Leukozytenzahlen in G/l bei Infektion mit CSF 0277 (Dt. Landrasse)
148
Tab. 42: Leukozytenzahlen in G/l bei Infektion mit CSF 0277 (Hybridschweine) 148
Tab. 43: Leukozytenzahlen in G/l bei Infektion mit CSF 0634 (Dt. Landrasse)
149
Tab. 44: Leukozytenzahlen in G/l bei Infektion mit CSF 0634 (Hybridschweine) 149
Veröffentlichungen
Teile der vorliegenden Arbeit wurden bereits vorab veröffentlicht:
FLOEGEL-NIESMANN, G., C. BUNZENTHAL, S. FISCHER and V. MOENNIG
(2003):
Virulence of Recent and Former Classical Swine Fever Virus Isolates Evaluated by
their Clinical and Pathological Signs.
J. Vet. Med. B 50, 214-220
5th Pestivirus Symposium, St. John’s College, Cambridge, UK, 26.-29.08.2002
Poster: Assessment of the virulence of recent Classical Swine Fever Virus isolates.
BUNZENTHAL, C., G. FLOEGEL-NIESMANN and I. GREISER-WILKE
Danksagung
Frau Prof. Dr. I. Greiser-Wilke danke ich für die Überlassung des interessanten
Themas
sowie
für
die
engagierte
wissenschaftliche
Betreuung
und
gute
Zusammenarbeit.
Herrn Prof. Dr. V. Moennig danke ich für die freundliche Aufnahme im Institut für
Virologie.
Frau Dr. G. Floegel-Niesmann und Frau Dr. A. Meindl-Böhmer möchte ich für die
fachlichen Diskussionen und vielfältigen Hilfestellungen danken.
Frau G. Müller möchte ich für ihre freundschaftliche Unterstützung und gute
Zusammenarbeit sowie für die vielen persönlichen Gespräche danken.
Für die zuverlässige Versorgung der Tiere danke ich Frau M. Berg, Frau D.
Lichterfeld und Herrn G. Thiem sowie Herrn H. Schulz.
Sehr herzlich danke ich allen Mitarbeitern des Instituts für Virologie, insbesondere
Frau I. Betsch, Frau R. Neth, Frau J. Pipereit, Frau S. Oetjens und Frau M. Giesecke
für ihre freundliche Aufnahme und Hilfsbereitschaft sowie allen „Mit-Doktoranden“.
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