Antimikrobielle Peptide als funktionale Moleküle für die

Antimikrobielle Peptide als funktionale Moleküle
für die Oberflächenbeschichtung
K. Rapsch, F.F. Bier und M. von Nickisch-Rosenegk
Fraunhofer Institut für Biomedizinische Technik (IBMT)
© Fraunhofer IBMT
Inhaltsverzeichnis
 Antimikrobielle Peptide
 Theoretische Grundlagen
 Wirkspektrum und Aktivität
 Oberflächenbeschichtung
 Funktionalisierung
 Peptidimmobilisierung
 Antimikrobielle Eigenschaften
 Zusammenfassung
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Antimikrobielle Peptide – Theoretische Grundlagen
 Ursprung
 Natürlich vorkommende Komponenten
 Teil des angeborenen Immunsystems
 Wahrscheinlich einer der ältesten Defensivmechanismen
 Allgemeine Eigenschaften
 Gruppe vielfältiger Moleküle > 500
 15 – 50 Aminosäuren
 Überproportional viele hydrophobe Seitenketten
 Positive Nettoladung >3
 Charakteristische Sekundärstruktur
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Antimikrobielle Peptide – Theoretische Grundlagen
-Faltblatt
z.B. Tachystatin
α-Helix
z.B. Magainin-2
Gemischte Struktur
z.B. β-Defensin-2
Disulfidbrücken
z.B. Defensin-1
Schleifen
z.B. Tachyplesin
Längliche Struktur
z.B. Indolicidin
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Protein Data Bank www.pdb.org
Master thesis, Anne Thomas: Development of methods for generation and characterization of
biocidal surfaces by usage of antimicrobial peptides
Antimikrobielle Peptide – Theoretische Grundlagen
Barrel stave
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Toroidal
Brogden, K. A. (2005). "Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors
in bacteria?" Nat Rev Microbiol 3(3): 238-50
Carpet
Antimikrobielle Peptide – Theoretische Grundlagen
 Klassifizierung
Generally Recognized as Safe
(GRAS)
 Biologisch abbaubar
 Selektivität / Multiaktivität
 Reduzierte Resistenzausprägung
 z.B. Nisin Z:
Lebensmittelzusatzstoff E234
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Wang, G., Li, X. and Wang, Z. (2009) APD2: the updated antimicrobial peptide
database and its application in peptide design. Nucleic Acids Research 37, D933-D937
www.aps.unmc.edu/AP/main.php
Antimikrobielle Peptide – Wirkspektrum und Aktivität
 Aktivität gegen gram+ und gram- Bakterien
Bakterienkonzentration [Bakterien x 10 8 /m l]
S .x y los us / Protam in
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
0,6
1,5
3
4,5
6
15
Peptidkonzentration [µM]
lebend
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tot
unbekannt
Gesamtzahl nach der Inkubation
30
45
60
Antimikrobielle Peptide – Wirkspektrum und Aktivität
 Zeitabhängigkeit
 Bakteriozider Effekt
S .x y los us
gram +
E.coli
gram -
E.coli / Protam in
100
Getötete Bakterien [%]
1 x 10 8
Bakterien/m l
90% tote Zellen
80
Protamin [µM]
35,1
10,1
Peptid 1 [µM]
60<x<340
81,3
Peptid 2 [µM]
40,0
46,9
20
Cecropin P1 [µM]
Nicht aktiv
11,7
0
60
40
0
5
10
15
20
25
30
35
Zeit [m in]
BMAP – 27 [µM]
Nicht getestet
37,1
Peptidkonzentration 30µM
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Peptidkonzentration 6µM
40
Antimikrobielle Peptide – Wirkspektrum und Aktivität
 Bakterienaggregation
 Bakterienlyse
Bakterienkonzentration [Bakterien x 10 8 /m l]
E.coli / Protam in
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
1
3
6
9
12
30
60
Peptidkonzentration [µM]
lebend
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tot
unbekannt
Gesamtzahl nach der Inkubation
Oberflächenbeschichtung
 Funktionalität
 Konformation /
Orientierung
 Peptid / Bakterien
Interaktion
 Freiheitsgrade
 Immobilisierungspunkt
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Onaizi, S. A. and S. S. Leong (2010). "Tethering antimicrobial peptides: current status
and potential challenges." Biotechnol Adv 29(1): 67-74.
Oberflächenbeschichtung - Funktionalisierung
R
R
R
R
R
H2O
O Si
H3C
Hydrolyse
O
CH3
O
HO Si OH
HO Si OH
OH
OH
R
R
R
HO Si O
OH
CH3
R
H
Wasserstoffbrücken
R
R
R
O
O
O
H
H
H
HO Si O Si O Si OH
HO Si O Si O SiH
O
O
© Fraunhofer IBMT
O
O
O
O
H H H H H H
O
O
O
H
OH
R
HO Si O Si O Si OH
R
O Si OH
H
H
H
O
O
O
Silanol
Kondensation
Oberflächenbeschichtung - Peptidimmobilisierung
 Epoxygruppe
 Autoreaktiv
 1-Schrittreaktion
SH
NH2
pH 7-8,5
pH >8,5
OH
pH 11-12
 Reaktion mit
S
Nukleophilen
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O
O
O
O
O
O
O
O
HO Si
O Si
O Si
O Si
O Si
O
O
O
O
O
O
OH
O
O
HN
OH
O
O
OH
OH
O
O
O
O
O
HO Si
O Si
O Si
O Si
O Si
O
O
O
O
O
OH
Oberflächenbeschichtung - Peptidimmobilisierung
O
O
O
O
O
 Aminogruppe
N
O
O
O
O
N
O
O
 APTS, unreaktiv
NHS-PEG-NHS
 2-Schrittreaktion
O
 Aktivierung durch bifunktionalen Linker
H2N
H2N
H2N
H2N
H2N
O
O
O
1,4-Butanediol Diglycidyl Ether
O
O
O
O
O
N
O
HO Si
O Si
O Si
O Si
O Si
O
O
O
O
O
© Fraunhofer IBMT
OH
O
O
O
NHS-PEG-Maleinimid
O
N
O
Oberflächenbeschichtung - Peptidimmobilisierung
 Physiologischer pH-Wert
 Spezifische Reaktion
 Stabiles Produkt
S
O
O
O
O
N
O
N
O
O
N
O
O
HN
O
O
O
 NHS Abgangsgruppe
O
SH
O
O
O
O
O
O
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O
O
O
HN
NH2
H2N
H2N
HN
O Si
O Si
O Si
O Si
O
O
O
O
O
OH
O
O
HN
HO Si
O
O
O
H2N
O
O
H2N
H2N
H2N
HN
HO Si
O Si
O Si
O Si
O Si
O
O
O
O
O
OH
Oberflächenbeschichtung - Peptidimmobilisierung
Vergleich Lös ung/Im m obilis iert
 N-Terminales Cystein
 Immobilisiert
S
O
O
OH
HS
O
O
O
HO Si
O Si
O
O
Bakterienkonzentration [Bakterienx 10 7 /m l]
 Lösung
2,5
2
1,5
1
0,5
0
O Si OH
NK
O
Immobilisiert
C-Peptid A
lebend
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Lösung
tot
unbekannt
Lösung
Immobilisiert
C-Peptid B
Gesamtzahl nach der Inkubation
Oberflächenbeschichtung - Peptidimmobilisierung
1 x 10 8 Bakterien/m l
90% tote Zellen
S .x y los us
E.coli
Peptid 2 [µM]
40,0
46,9
NH2
C
-
NH2
Peptid
-
N
NH2
N-Terminal
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C-Terminal
Zufällig
Oberflächenbeschichtung - Antimikrobielle Eigenschaften
 Stabile antimikrobielle Oberflächenbeschichtung
S .x y los us / im m obilis iertes Peptid
12
10
8
6
4
4x Waschzyklen
2
4x Inkubation
0
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Bakterienkonzentration [Bakterien x 10 6 /m l]
Bakterienkonzentration [Bakterien x 10 6 /m l]
S .x y los us / im m obilis iertes Peptid
12
10
8
6
4
2
0
lebende Bakterien
lebende Bakterien
Bakterien Startkonzentration
Bakterien Startkonzentration
Detektionsgrenze
Detektionsgrenze
Zusammenfassung
 Antimikrobielle Peptide
 Effektive Bakterizide mit charakteristischen Eigenschaften
 Selektives Wirkungsspektrum
 Bakterizide Wirkung innerhalb weniger Minuten
 Gerichtete Immobilisierung unter physiologischen Bedingungen
 Einfache Produktion und Modifikation
 Oberfläche mit stabilen antimikrobiellen Eigenschaften
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Danksagung
 Prof. Dr. F. F. Bier
 Prof. Dr. M. Tadros
 Dr. M. v. Nickisch-Rosenegk
 Abteilung Technische Molekularbiologie
 Anne Thomas
 Michaela Schellhase
 Fraunhofer IBMT
Diese Projekt wird gefördert von der EU und dem Land Brandenburg über die
Investitionsbank des Landes Brandenburg ILB (Förderkennzeichen: 80139359).
© Fraunhofer IBMT
Vielen Dank für ihre Aufmerksamkeit
© Fraunhofer IBMT
Melo, M. N., R. Ferre, et al. (2009). "Antimicrobial peptides: linking partition, activity and high
membrane-bound concentrations." Nat Rev Microbiol 7(3): 245-50.