Die VenNendun~transgener Tiere in der biomedizInischen
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-~----------------- Die VenNendun~ transgener Tiere in der biomedizInischen Forschung •In Deutschland* Teil 1: Sachstandsbericht 2001-2003 Ursula G. Sauer, Roman Kolar und Brigitte Rusche Akademie für Tierschutz. D-Neubiberg Zusammenfassung Teil 1 Während es sich die Bundesregierung zum Ziel gesetzt hat, einen aktiven Beitrag zur Reduktion von Tierversuchen zu leisten, nimmt gleichzeitig die Verwendung gentechnisch veränderter Tiere in der biomedizinischen Forschung Jahr für Jahr kontinuierlich zu. Vor diesem Hintergrund sollte mit der vorliegenden Studie ein Überblick über die Ziele und Inhalte von Forschungsvorhaben in Deutschland gewonnen werden,jür welche transgene Tiere hergestellt wurden oder in experimentellen Verfahren zum Einsatz kamen. Dabei sollten insbesondere diejenigen spezifischen Forschungsgebiete und Versuchsdurchführungen benannt werden, in denen gentechnologisch veränderte Tiere vermehrt verwendet werden. Anschließend sollte überprüft werden, ob die aufgedeckten Forschungsziele auch mit tierversuchsfreien Verfahren verfolgt werden könnten. In einer Literaturrecherche wurden 577 in Fachzeitschriften veröffentlichte relevante Publikationen gesammelt. Dieses Material ermöglicht eine Aussage über Forschungsgebiete aus der Grundlagenforschung, in denen transgene Tiere zum Einsatz kommen, nicht aber über deren routinemäßige Verwendung in der angewandten Forschung oder zur Aufrechterhaltung transgener Zuchtlinien, da derartige Verwendungszwecke in der Regel nicht Gegenstand von Fachpublikationen sind. Schwerpunkte der biomedizinischen Forschung mit transgenen Tieren sind gemäss den ausgewerteten Publikationen insbesondere in den Fachgebieten Neurobiologie, Immunologie, Kardiologie, Embryologie und Onkologie zu finden. Ihre Verwendung lässt sich jedoch auch in allen anderen Bereichen der biomedizinischen Grundlagenforschung nachweisen. Übereinstimmend mit der offiziellen Versuchstierstatistik waren die meisten verwendeten transgenen Tiere Mäuse, gefolgt von Ratten und Schweinen. Zudem wurden einzelne Forschungsvorhaben mit Fischen, Kaninchen und Hühnern erfasst'. Ratten gelangten zu einem hohen Prozentsatz in der Herz-Kreislauf-Forschung zum Einsatz, transgene Schweine hingegen werden als Organspendetiere im Rahmen der Xenotransplaruationsforschung her- gestellt und gezüchtet. Der überwiegende Teil der Forschungsvorhaben behandelte den experimentellen Einsatz bereits etablierter transgener Tiere, oder es wurde dargelegt, dass transgene Tiere gezielt für das betreffende Forschungsvorhaben hergestellt wurden. Zumeist wurden Veränderungen des Erbgutes ausgelöst, indem das Fremdgen in das Keimzellgenom integriert wurde. In einigen Forschungsvorhaben wurde berichtet, dass Wildtyp- Tieren nach der Geburt transgenes Material eingebracht wurde. Zusammenfassung Teil 2: Perspektiven zur Umstellung der biomedizinischen Forschung mit transgenen Tieren auf tierversuchsfreie Verfahren (erscheint in ALTEX 23,1,2006) Transgene Tiere werden in der Regel in Tierversuchen eingesetzt, um Genfunktionen und deren Regulierungen oder den Beitrag, den genetische Veränderungen zur Entstehung von Krankheiten leisten können, zu untersuchen. Ein großer Teil der transgenen Tiere ist allein schon aufgrund der gentechnischen Veränderung stark in seinem Allgemeinbefinden beeinträchtigt. Zusätzlich lässt sich hinterfragen, ob der experimentelle Einsatz transgener Tiere zu Erkenntnissen führte, die von solch hervorragender wissenschaftlicher Bedeutung sind, dass sie das Leiden der Versuchstiere rechtfertigen. Um daher Ansätze aufzuzeigen, mit denen die Verwendung transgener Tiere vermieden werden könnte, wurden anschließend in weiteren Recherchen tierversuchsfreie Verfahren erfasst, die zur Verfolgung der genannten Fragestellungen geeignet erschienen. Dies waren insbesondere tierversuchs freie Verfahren, die sich gentechnischer Techniken bedienen. Hierzu gehören in vitro Zellkulturverfahren mit gentechnisch veränderten Zellen, wie beispielsweise der so genannte Transfeeted Cell Array, sowie in vitro Untersuchungen, bei denen mittels RNA-Interferenz oder durch Einsatz von so genannten Antisense-Oligonucleotiden Gene gezielt an- und ausgeschaltet werden können. Derartige Verfahren lassen sich auch in Zellkulturen mit menschlichen Zellen einsetzen, so dass sich damit unmittelbar Erkenntnisse • Diese Studie wurde als Förderprojekt WK 1 - 1328 - 173 mit freundlicher finanzieller Unterstützung der Zentralstelle für die Erfassung und Bewertung von Ersatz- und Ergänzungsmethoden zum Tierversuch (ZEBET) des Bundesinstituts für Risikobewertung, Berlin, durchgeführt. 1 Nach der offiziellen deutschen Versuchstierstatistik Hamster, Schafe und Amphibien für experimentelle ALTEX 22,4/05 werden zudem in einzelnen Fällen transgene Zwecke hergestellt und verwendet. 233 m..... SAUER ET AL. -------------~- über die Funktion des menschlichen Körpers gewinnen lassen. Zwar wird ein Eins-zu-Eins Ersatz von Tierversuchen mit transgenen Tieren durch tierversuchsfreie Verfahren als unwahrscheinlich erachtet. Dennoch belegt aus Sicht des Tierschutzes das breite Spektrum von bereits heute verfügbaren tierversuchsfreien Verfahren zur Erforschung von Genfunktionen und genetisch Jedingten Wechselwirkungen, dass ein Verzicht auf derartige Tierversuche möglich ist, ohne die biomedizinische Forschung zu behindern. Selbst wenn möglicherweise die eine oder andere - auf die Methode Tierversuch bezogene - Frage vorübergehend nicht beantwortet werden könnte, würde eine Forschung, die sich auf moderne ethisch vertretbare in vitro Verfahren beschränkt, eigene Fragen zur Lösung der anstehenden biomedizinischen Probleme stellen. Vor diesem Hintergrund ist es zu begrüßen, dass die Bundesregierung die weitere Entwicklung tierversuchsfreier gentechnologischer Verfahren zur Reduktion von Tierversuchen derzeit aktiv fördert. Damit jedoch diese Fördermaßnahmen einen wirkungsvollen Beitrag leisten können, sollte die Umstellung der gentechnologischen Forschung - auch der biomedizinischen Forschung insgesamt - auf tierversuchsfreie Verfahren durch konkrete politische Maßnahmen unterstützt werden. Aus Sicht des Deutschen Tierschutzbundes ist zu fordern: • Um eine schnelle und umfassende Weiterentwicklung aussichtsreicher tierversuchsfreier gentechnologischer Verfahren zu ermöglichen, sollte sichergestellt sein, dass öffentliche Zuwendungen in ausreichender Höhe und über einen ausreichend langen Zeitraum zur Verfügung gestellt werden. • Der Gesetzgeber sollte eine breite Diskussion darüber anstoßen, ob die Gesellschaft bereit wäre, auf bestimmte Erkenntnisse zu verzichten, wenn diese mit einem bestimmten Summary - The use of transgenic animals in biomedica1 research in Germany Part 1: Status Report 2001-2003 While the German Federal Government has set itself the goal to make an active contribution to reducing animal experiments, the use of transgenic animals in biomedical research continuously increases every year. It is against this background that the study at hand aimed at providing an overview over the goals and the contents of research projects performed in Germany, in the course of whicn transgenic animals were produced or used in experimental procedures. Specifically, it was envisaged to spell out those specific areas of research, for wli ich transgenic animals mainly were being used. Subsequently it was evaluated whether the research goals revealed might also be pursued with non animal test methods. In a literature survey, a total of 577 scientific publications relevant for the purposes of the study were collected. This material enables conclusions on those scientific areas, in whiclt transgenic animals are used, applying to fundamental research, but not on their use in routine procedures in applied research or for the maintenance of transgenic breeds, since such purposes do not tend to be the subject of publications in scientific journals. 234 Maß an Tierleid erkauft werden müssen. Gegebenenfalls sollte im Tierschutzgesetz verankert werden, dass bestimmte Versuchsvorhaben von vorn herein nicht als ethisch vertretbar eingestuft werden. • Solange Tierversuche mit transgenen Tieren durchgeführt werden, sollte im Tierschutzgesetz mit konkreten rechtlichen Rahmenbedingungen sichergestellt werden, dass zur Einschätzung der ethischen vertretbarkeit die Belastung der Versuchstiere (unter Berücksichtigung aller für transgene Tiere relevanten Faktoren) und der erwartete Nutzen der Versuchsergebnisse objektiv und nachvollziehbar ermittelt werden. • Die für die Bewertung von Versuchsanträgen zuständigen Genehmigungsbehörden sollten vom Gesetzgeber mit konkreten Handlungsanweisungen dazu angeleitet werden, tierschutzrelevante Sachverhalte stärker als bisher in die inhaltliche Prüfung der ethischen Vertretbarkeit und wissenschaftlichen Unerlässlichkeit von Versuchsanträgen einzubeziehen und dabei besonderes Augenmerk auf versuchsantrdge mit transgenen Tieren zu richten. • Die Versuchstiermeldeverordnung sollte so angepasst werden, dass alle transgenen Tiere statistisch erfasst werden, unabhängig davon, ob sie in wissenschaftlichen Verfahren zum Einsatz gelangen oder nicht . Aus Sicht des Tierschutzes ist Forschung so umzugestalten, verzichten kann, ohne dadurch chen Fortschritt zu behindern. ein Beitrag geleistet werden, sachlich fundierten Argumenten es möglich, die biomedizinische dass sie auf trans gene Tiere den notwendigen wissenschaftliMit der vorliegenden Studie soll die Diskussion hierüber mit anzuregen. According to the topics covered by the publications, main areas of biomedical research with. transgenic animals can be found in the fields of neurobiology, immunology, cardiology, embryology and oncology. However their use can be discerned in all other areas of fundamental biomedical research as well. In accordance witli the official German laboratory animal statistics, the vast majority of transgenic animals used were mice.followed by rats and pigs, Additionally. singular research projects with fish, rabbits and chicken were recorded. (In the official German laboratory animals statistics, very small numbers of transgenic hamsters, sheep and amphibians were also recorded in the past years.) A high percentage of the rats were used in cardiovascular research, whereas transgenic pigs as a rule were produced and bred as organ donors in xenotransplantation research. The majority of research projects either dealt witli the experimental use of already established transgenic animal lines, or they described that transgenic animals specijically were produced for the purpose ofthe respective research project. Mostly, transgenesis was initiated by inserting the foreign gene into the germ cell genome. In some research projects, it was reported that the transgenic material was inserted into normally bred animals some time after parturition. ALTEX 22, 4/05 ~ -~----------------- SAUER ET AL. Part 2: Perspectives to change biomedical research to non-animal test methods (to be published in ALTEX 23,1,2006) As a rule, transgenic animals are being used in in vivo experiments to examine gene functions, their regulation or the contribution of genetic alterations to the development of diseases. Many transgenic animals already are affected in their wellbeing due to the genetic modification alone regardless of the procedures ~ performed with them. Moreover, it is to be questioned wither the experimental use of transgenic animals led to results that were of such outstanding scientific relevance that they legitimated the suffering of the animals. In order to point to possible approaches to avoiding the use of transgenic animals in the areas of research identified, subsequent investigations aimed at collecting information on non-animal test methods that might be applied in pursuing the aforesaid questions. In particular, these were non-animal test methods that make use of genetic techniques. Amongst these are in vitro cell culture methods with genetically modified cells, such as the so called Transfeeted Cell Array, as weil as in vitro test methods, in whicli specifically targeted genes can be turned on or off selectively for example by the socalled RNA interference technique or by antisense oligonucleotide genes. Since such technologies can also be applied to cell cultures with human cells, investigations with these methods enable direct information on the junction of human genes. Even thougb a one to one replacement of anima I experiments witli transgenic animals by non-anima I test methods is considered unlikely.from the point of view of animal weljare the broad spectrum of already available non animal test methods with whicb to study the junction of genes and genetically caused pathophysiological reactions proves that waiving of animal tests with transgenic animals is possible without impeding biomedical research, Even if it cannot be totally excluded that some very specijic questions linked to the respective animal experiment might not be pursued for the time being, nevertheless researcli that would be restricted to modern and ethically acceptable in vitro test methods would certainly conceive its very own questions to pursue and solve the problems currently faced by biomedical research. It is against this background that it is to be welcomed that the German Federal Government currently actively promotes the further development of genetechnological non-animal test methods, In order to ensure that these junding measures will make an effective contribution to reducing anima I experiments, as spelled out by the government itself, the conversion of genetechnological research, just like biomedical research as a whole, to non-animal testing methods should be supported by concrete political actions. From the point of view of the German Animal Weljare Federation the following issues are to be requested: • In order to enable a fast and comprehensive advancement of promising genetechnological non-animal test methods, it should be ensured that public junding is provided with an adequate budget and over a sufficiently lang period of time. • The legislator should initiate broad discussions on the question if society would be willing to dispense with. certain pieces of knowledge if they would necessarily have to be gained at the expense of a certain degree of animal suffering . As the case may be, in the German Animal Weljare Act it should be laid down that certain procedures should not be considered acceptable as such. • As long as animal experiments with transgenic animals continue to be performed, concrete legal measures should be laid down in the German Animal Weljare Act to ensure that the distress ofthe animals (taking into account allfactors relevant for transgenic animals) and the expected benejit of the researcli project are determined objectively so that the outcome of the ethical evaluation process becomes comprehensible. • The legislator should provide the authorities responsible for the licensing of research projects with concrete instructions in order to ensure that all aspects relevant for the weljare of the animals are jully taken into account when evaluating the ethical acceptability and scientific indispensability of projects and that special attention is given to research projects with transgenic animals. • The German Decree on the Reporting of Laboratory Animals should be amended to ensure that all individual transgenic animals are included in the official statistical reports regardless of whether they end up being used in scientific procedures or not. From the point of view of anima I weljare it is possible to redesign biomedical research to do without transgenic animals without impeding necessary scientific progress. The survey in hand sought to make a contribution to providing a scientifically sound background for initiating these discussions . Keywords: transgenic animals, literature survey, goals and the contents of research, non animal test methods, xenotransplantation 1 Einführung 1.1 Hintergrund Die deutsche Bundesregierung hat es sich zum Ziel gesetzt, einen dauerhaften aktiven Beitrag zur Reduktion von Tierversuchen zu leisten (siehe Seite 42 des Koalitionsvertrages vom 16. Oktober 2002, Anon. (2002)): "Die Aufnahme des ALTEX 22,4/05 Tierschutzes als Staatsziel in das Grundgesetz war ein wesentlicher Schritt hin zu einem würdigen Umgang mit unseren Mitgeschöpfen, den Tieren. In dieser Legislaturperiode wollen wir in weiteren Schritten ... die weitere Entwicklung von Alternativen zu Tierversuchen (Forschung, Dialog mit der Wirtschaft) fördern und umsetzen." Dieses Ziel wird im Tierschutzbericht 2003 bekräftigt (BMVEL, 2003; Seite 9, Abschnitt "Tierschutzpolitische Schwerpunkte in der Rückschau und Ziele für die Zukunft"): "Die Bundesregierung ist weiterhin bestrebt, die Notwendigkeit von Tierversuchen weiter abzubauen." Im Gegensatz zu diesen Zielsetzungen lässt sich der offiziellen Versuchstiersta235 SAUER ET AL. -------------~- tistik zufolge seit Mitte der 90er Jahre in der Entwicklung der Versuchstierzahlen kein eindeutig rückläufiger Trend ausmachen. Im Gegenteil nimmt insbesondere in der Grundlagenforschung die Anzahl verwendeter Versuchstiere Jahr für Jahr kontinuierlich zu. Als Ursache hierfür wird unter anderem die Herstellung und der zunehmende Einsatz transgener, also gentechnisch veränderter Tiere in der biomedizinischen Forschung und der hohe Tierverbrauch, der mit dieser Art der Forschung einhergeht, angeführt". So kommentiert die Bundesregierung die offiziellen nationalen Versuchstierzahlen im dritten EU- VersuchstierstatistikBericht (Kommission der Europäischen Gemeinschaften, 2003, Seite 59) mit den Worten: "Obwohl es schwierig ist, anhand der Statistik umfassende Schlussfolgerungen abzuleiten, ist davon auszugehen, dass die Entwicklung neuer Methoden zur Diagnostik und gentechnischer Verfahren eine Ursache für die Zunahme darstellt. Der Anstieg in der Zahl der verwendeten Tiere könnte auch der zunehmenden Bedeutung der Grundlagenforschung zugeschrieben werden." Der offiziellen deutschen Versuchstierstatistik zufolge stieg seit dem Jahr 2000 die Zahl verwendeter transgener Versuchstiere von Jahr zu Jahr um rund 20.000 bis 50.000 Tiere an (s. Tab. 1)3. Dies waren überwiegend trans gene Mäuse, aber auch transgene Ratten und Fische sowie in geringer Zahl transgene Hamster, Kaninchen, Schweine, Schafe und Amphibien. Doch diese Entwicklung lässt sich nicht nur für Deutschland ausmachen. Auch in anderen Mitgliedsstaaten der Europäischen Union wurde in den vergangenen Jahren eine Zunahme der Versuchstierzahlen beobachtet, die wiederum regelmäßig mit einer Zunahme der Herstellung und Verwendung transgener Tiere in Verbindung gebracht wurde (Sauer et al., 2004). 1.2 Ziel der Studie Vor diesem Hintergrund war es die Absicht der vorliegenden Studie, einen Überblick über die Ziele und Inhalte von Fachbegriffe aus den Gebieten der Genetik und Gentechnologie Fachbegriffe siehe Glossar ab Seite 255. 2 sowie weitere naturwissenschaftliche Den rechtlichen Definitionen zufolge ist die Herstellung transgener Tiere und deren Weiterzucht bis zur dritten Generation als genehmigungspflichtiger Tierversuch zu werten (BMVEL, 1996). Die Versuchstiere, die im Zuge der Herstellung transgener Tiere zum Einsatz gelangen, wie Eizellenspendertiere und Ammentiere, werden demzufolge in der Versuchstierstatistik eriasst, dabei aber nicht als transgene Tiere gezählt. Die Zucht transgener Tiere aus etablierten Linien hingegen wird nicht als Tierversuch gewertet (BMVEL, 1996). Nachgeborene transgene Tiere werden daher nur dann von der Statistik eriasst, wenn sie in einem Tierversuch eingesetzt werden. Nachgeborene transgene Tiere aber, die beispielsweise aufgrund starker Missbildungen sterben, bevor sie in einen Versuch gelangen, oder die als überzählige Tiere aussortiert werden, werden dort nicht aufgeführt. 3 Nach § 3 GenTG ist gentechnisches Arbeiten definiert als "die Erzeugung gentechnisch veränderter Organismen, die Vermehrung, Lagerung, Zerstörung oder Entsorgung sowie der innerbetriebliche Transport gentechnisch veränderter Organismen sowie deren Verwendung in anderer Weise, soweit noch keine Genehmigung für die Freisetzung oder das Inverkehrbringen zum Zweck des späteren Ausbringens in die Umwelt erteilt wurde". Der gesetzlichen Definition zufolge ist ein gentechnisch veränderter Organismus "ein Organismus, dessen genetisches Material in einer Weise verändert worden ist, wie sie unter natürlichen Bedingungen durch Kreuzen oder natürliche Rekombination nicht vorkommt". Veriahren der Veränderung genetischen Materials sind nach § 3 GenTG insbesondere: • "a) Nukleinsäure-Rekombinationstechniken, bei denen durch die Einbringung von Nukleinsäuremolekülen, die außerhalb eines Organismus erzeugt wurden, in Viren, Viroide, bakterielle Plasmide oder andere Vektorsysteme neue Kombinationen von genetischem Material gebildet werden und diese in einen Wirtsorganismus eingebracht werden, in dem sie unter natürlichen Bedingungen nicht vorkommen, • b) Veriahren, bei denen in einen Organismus direkt Erbgut eingebracht wird, welches außerhalb des Organismus hergestellt wurde, und natürlicherweise nicht darin vorkommt, einschließlich Mikroinjektion, Makroinjektion und Mikroverkapselung, • c) Zellfusionen oder Hybridisierungsveriahren, bei denen lebende Zellen mit neuen Kombinationen von genetischem Material, das unter natürlichen Bedingungen nicht darin vorkommt, durch die Verschmelzung zweier oder mehrerer Zellen mit Hilfe von Methoden gebildet werden, die unter natürlichen Bedingungen nicht vorkommen." 4 5 Einige Techniken zur Veränderung vorgestellt. des Keimzellgenoms von Wirbeltieren werden auf Seite 257 kurz § 7)1) Tierschutzgesetz: "Eingriffe oder Behandlungen zu Versuchszwecken an Tieren, wenn sie mit Schmerzen, Leiden oder Schäden für diese Tiere oder am Erbgut von Tieren, wenn sie mit Schmerzen, Leiden oder Schäden für die Erbgut veränderten Tiere oder deren Trägertiere verbunden sein können." 6 236 m...... Forschungsvorhaben in Deutschland auf dem Gebiet der biomedizinischen Grundlagenforschung zu erhalten, für welche trans gene Tiere vermehrt zum Einsatz kamen. Anschließend sollte untersucht werden, ob die entsprechenden Forschungsziele auch ohne trans gene Tiere weiterverfolgt werden könnten. Der gesetzlichen Definition im deutschen Gentechnikgesetz (GenTG, 1993) zufolge wurde transgenen Tieren das Erbgut durch technologische Verfahren in einer Weise verändert, wie sie unter natürlichen Bedingungen durch Kreuzen oder natürliche Rekombination nicht vorkommt", Um einen umfassenden Überblick zu erhalten, wurden nicht nur Vorhaben mit transgenen Tieren berücksichtigt, denen experimentell Erbgut in das Keimzellgenom eingebracht worden war, sondern auch solche Tiere, denen nach der Geburt transgenes Material eingebracht wurde. Nicht erfasst wurden hingegen Forschungsvorhaben mit Versuchstieren, bei denen durch so genannte ENU-Mutagenese Veränderungen des Erbgutes herbeigeführt wurden, indem den Vatertieren die mutagene und karzinogene Substanz Ethylnitrosoharnstoff (ENU) verabreicht wurde". Wie von BMVEL (1996), Mepham et al. (1998), Boyd Group (1999), Salomon et al. (2001) und Ammann (2004) ausgeführt, ist nicht nur die Herstellung und experimentelle Verwendung transgener Tiere, sondern auch die Zucht etablierter transgener Tierlinien mit tierschutzrelevanten Aspekten verbunden. Hierzu zählt nicht nur der hohe Tierverbrauch, der auch nach der Erzeugung transgener Tierlinien mit deren Weiterzucht einhergeht. Besonders berücksichtigt werden müssen zusätzliche Belastungen: Diesen können transgene Tiere - unabhängig von Versuchsdurchführung oder Haltung, allein schon aufgrund der Konsequenzen der gentechnischen Veränderung ihres Erbgutes - über die gesamte Lebensdauer hinweg ausgesetzt sein (Buehr et al., 2003). Daher wurden in der vorliegenden Studie nicht nur Verfahren berücksichtigt, die der Definition des deutschen Tierschutzgesetzes (TSchG) zufolge als Tierversuche zu werten sind 6, sondern auch die Forschungsvorhaben, in denen transgenen Tieren Zellen, Gewebe oder Organe entnommen und diese ALTEX 22,4/05 m...... SAUER ET AL. ---~--------------------------------------- Tab. 1: Anzahl der in den Jahren 2000-2003 verwendeten transgenen Gesamtzahl verwendeter Versuchstiere (Quelle: Versuchstierstatistik Tiere, aufgeschlüsselt BMVEL 1) nach Tierart, im Vergleich zur 2000 2001 2002 2003 149.859 von 975.885 200.776 von 1.024.413 218.072 von 1.151.053 244.588 von 1.180.355 2.937 von 486.432 2.785 von 512.393 3.276 von 519.575 7.471 von 501.228 0 von 7.523 12 von 8.562 0 von 12.052 0 von 10.142 Kaninchen 63 von112.249 69 von 117.890 0 von 133.446 2 von 104.418 Schweine 15 von 12.245 38 von 11.661 96 von 15.761 42 von 12.250 0 von 3.032 5 von 2.308 0 von 2.470 0 von 2.968 0 von 14.331 664 von 15.102 4 von 25.507 6 von 19.342 4.002 von 108.243 37 von 303.590 764 von 201.604 2.046 von 137.680 Mäuse Ratten .. Hamster Schafe Amphibien Fische Gesamtzahl transgener Tiere 156.876 von 1.825.215 204.386 von 2.126.561 222.212 von 2.212.376 254.155 von 2.112.341 Transgene Tiere -Differenz zum Vorjahr 47.510 transgene Tiere mehr als 2000 17.826 transgene Tiere mehr als 2001 31.943 transgene Tiere mehr als 2002 Gesamttierzahl - Differenz zum Vorjahr 301 .346 Tiere insgesamt mehr als 2000 85.815 Tiere insgesamt mehr als 2001 100.035 Tiere insgesamt mehr als 2002 1 http://www.verbraucherministerium.de/index-000557031A4E116584026521COA8D816.html in vitro für experimentelle Zwecke weiterverwendet wurden 7. 1.3 Durchführung der Studie Mittels umfassender Literaturdatenbankund freier Internetrecherchen wurden relevante Publikationen aus Fachzeitschriften der Jahrgänge 2001, 2002 und 2003 gesammelt, in denen in Deutschland durchgeführte Forschungsvorhaben mit trans genen Tieren dargelegt wurden. Eine ausführliche Beschreibung des Ablaufs der Literaturrecherche sowie der Auswahl der geeigneten Publikationen findet sich in Anhang 1. Alle Publikationen wurden in der Auswertung (Anhang 2) einem oder mehreren spezifischen Forschungsbereichen zugeordnet, es wurde nach Herstellung und Verwendung transgener Tiere unterschieden, und die verwendeten Tiergruppen bzw. Tierarten wurden erfasst. Zudem wurde überprüft, ob die transgenen Tiere für in vivo oder für in vitro Verfahren verwendet wurden bzw. ob Tieren aus Wildtyp-Zuchtstämmen 8 nach der Geburt transgenes Material eingebracht worden war. In der Diskussion der Ergebnisse der Studie wurden Schwerpunkte der Verwendung transgener Tiere in der biomedizinischen Forschung benannt (Ziffer 2). Anschließend wurden die Inhalte von Forschungsvorhaben mit transgenen Tieren beispielhaft vorgestellt, um so anhand konkreter Beispiele Anhaltspunkte zur Einschätzung der Belastung der Versuchstiere und des Nutzens der Versuche, Tiere, denen für wissenschaftliche Zwecke Organe oder Gewebe entnommen werden, werden nach der überarbeiteten Versuchstiermeldeverordnung in der Versuchstierstatistik erfasst (VersuchstiemneldeVO, 7 1999). Anmerkung: Für nicht gentechnisch veränderte Versuchstiere wird in der Studie in Einklang mit dem in der Literatur vorherrschenden Sprachgebrauch der Begriff "Wildtyp-Tiere" verwendet. Dabei ist jedoch zu beachten, dass dieser Begriff irreführend ist, da konventionelle Versuchstiere in der Regel in stark ingezüchteten Stämmen vermehrt werden. Nachkommen derartiger Linien weisen demzufolge ein weitgehend einheitliches Erbgut auf, so wie es unter natürlichen Bedingungen nicht vorkommen würde. 8 ALTEX 22,4/05 die für die Abwägung der ethischen Vertretbarkeit von Forschungsvorhaben mit transgenen Tieren erforderlich sind, darzulegen (Teil 2, ALTEX 23 ,1,2006). (Das Verzeichnis aller erfassten Publikationen sowie die Originalzusammenfassungen der beispielhaft aufgeführten Publikationen können bei den Autoren oder der Redaktion ALTEX angefordert oder von www.altex.ch heruntergeladen werden.) Um darüber hinaus Ansätze aufzuzeigen, mit denen sich in den identifizierten Forschungsfeldern eine Reduktion der Versuchstierzahlen erreichen liesse, wurde in einer weiteren Recherche nach tierversuchsfreien Methoden gesucht, die anstelle der erfassten tierexperimentellen Verfahren eingesetzt werden könnten (Teil 2, ALTEX 23,1,2006). Dabei konnte es sich um "klassische" tierversuchsfreie Verfahren wie Zellkultur- Techniken oder Computermodelle handeln, vor allem aber auch um tierversuchsfreie Verfahren, die sich gentechnischer Methoden bedienen. Gerade letztere schienen offensichtlich in besonderem Maße das Potenzial zu besitzen, zur 237 SAUER ET AL. ~~~--------------------------~--- Beantwortung von Fragestellungen eingesetzt zu werden, für die ansonsten gentechnische Veränderungen in vivo durchgeführt wurden. Abschließend wurden die Erfolgsaussichten derartiger Methoden im Sinne der so genannten 3R ("replacementy reduction, rejinement 01 animal experiments ") nach Russell und Burch (1959) bewertet. Zudem wurden weiterführende Maßnahmen benannt, die erforderlich schienen, um eine Trendwende in Bezug auf die kontinuierlich steigende Verwendung transgener Tiere in der biomedizinischen Forschung herbeizuführen. 2 Die Verwendung transgener Tiere in der biomedizinischen Forschung in Deutschland Sachstand 2001-2003 2.1 Allgemeine Anmerkungen Die für die Erfassung der Publikationen ausgewiesene Zeitspanne von 2001 bis 2003 erschien ausreichend lang, Schwerpunkte der Verwendung transgener Tiere in der biomedizinischen Forschung aufzudecken. Für einen weiterführenden Überblick über grundsätzliche Trends beim Einsatz transgener Tiere, wie die Zu- oder Abnahme ihrer Verwendung in einem bestimmten Forschungsgebiet oder der spezielle Einsatz bestimmter transgener Tiere, müssten vergleichbare Literaturrecherchen in regelmäßigen Abständen wiederholt werden. Dann würde anhand eines Vergleichs des Zahlenmaterials erkennbar, ob sich beispielsweise die Anzahl der Publikationen, die Verhältnismäßigkeiten der verwendeten Tiere oder die Forschungsgebiete, in denen transgene Tiere vermehrt zum Einsatz kamen, signifikant verändern. 2.2 Durchführung der Recherche In einer ersten Phase der Informationsbeschaffung wurden durch eine vergleichende Literaturrecherche mit 38 wissenschaftlichen Datenbanken sowie durch eine freie Internetrecherche auf kostenfrei öffentlich verfügbaren Webseiten insgesamt 164 Publikationen erfasst. Daraus ergab sich, dass die Datenbank "Medline" der National Library 238 01 Medicine, Bethesda, USA, die für die Belange der Studie am besten geeignete wissenschaftliche Informationsquelle darstellte. Sie zeigte, dass - in Einklang mit den offiziellen Versuchstierzahlen die in den Publikationen dargelegten Forschungsvorhaben zumeist an transgenen Mäusen, aber auch an Ratten sowie in geringer Anzahl an Schweinen und Fischen durchgeführt wurden. Zudem konnte gezeigt werden, dass neben der Jahreszahl sowie dem Begriff "transgen" die Suchbegriffe .rnousetmice" "rat/ rats", "pig/pigs" und .fish" anstelle des übergeordneten Suchbegriffs .animal" zu den umfassendsten Rechercheergebnissen führte. Daher wurden in der zweiten Phase der Literaturrecherche mit geeigneten Kombinationen dieser Suchbegriffe ausschließlich Medline-Recherchen durchgeführt. Damit wurden 820 weitere Publikationen erfasst (siehe Anhang 1 für eine detaillierte Beschreibung der durchgeführten Literaturrecherchen). 2.3 Auswahl der geeigneten Publikationen Die erste inhaltliche Auswertung der 164 in der ersten und 820 in der zweiten Phase erfassten Fachartikel ergab insgesamt 577 relevante Publikationen. Publikationen wurden als für die Belange der Studie ungeeignet aussortiert, wenn sich in der Auswertung zeigte, dass sie offensichtlich nicht in Deutschland abgefasst wurden, oder wenn anhand der Adressen der Autoren und Co-Autoren nicht sicher festgestellt werden konnte, dass die Forschungsvorhaben in Deutschland durchgeführt worden waren. Publikationen wurden weiter aussortiert, wenn es sich um Review-Artikel handelte, in denen keine neuen wissenschaftlichen Erkenntnisse dargelegt wurden, oder wenn sie irrtümlich in der Recherche erfasst worden waren, weil Fütterungsversuche mit trans genen Pflanzen beschrieben wurden oder weil ungeeignete Begriffe erfasst wurden, wie z.B. Flourescence In Situ Hybridization über den Suchbegriff "FISH". Publikationen über in vitro Forschungsvorhaben wurden aussortiert, wenn trans gene Zellen in vitro hergestellt wurden und diese ausschließlich in vitro weiterverwendet wurden. Wenn aber zur Gewinnung von Zellen oder zur Herstel- m..... lung von Zelllinien trans gene Tiere benützt wurden oder wenn transgene Zellen in Wildtyp-Zuchtstämme eingebracht worden waren, wurden diese Publikationen wegen der damit verbundenen Tierschutzrelevanz als wesentlich erachtet und in die Auswertung aufgenommen. Schließlich waren einzelne Publikationen im Suchergebnis bei zwei verschiedenen Tierarten aufgeführt, wenn in den zugrunde liegenden Arbeiten beispielsweise gleichzeitig Mäuse und Ratten verwendet wurden oder wenn etwa ein Vorhaben mit transgenen Ratten, denen ein Gen der Maus eingefügt worden war, beschrieben wurde. 2.4 Aussagekraft des gesammelten Materials hinsichtlich der Erfassung von Gebieten, in denen transgene Tiere verwendet werden Da für die Studie ausschließlich Publikationen aus wissenschaftlichen Fachzeitschriften gesammelt wurden, wurden nur solche Verwendungszwecke transgener Tiere erfasst, die der Wissensvermehrung dienen, also Forschungsvorhaben aus der Grundlagenforschung. Das gesammelte Material war jedoch nicht geeignet, einen Überblick über die routinemäßige Verwendung transgener Tiere aus bereits etablierten Zuchtlinien zu erhalten. Eine derartige Verwendung kommt von vorn herein nicht als Thema für eine wissenschaftliche Veröffentlichung in Frage. In diesem Zusammenhang ist insbesondere der Einsatz transgener Tiere als so genannte Bioreaktoren zu nennen, also von Tieren, die aufgrund ihrer gentechnologischen Veränderung pharmazeutische Stoffe in Blut oder Milch ausscheiden (siehe Salomon et al., 2001). Wie viele Tiere welcher transgener Tierlinien im Zuge von Zuchtmaßnahmen geboren wurden, ohne jedoch für wissenschaftliche Zwecke zum Einsatz zu kommen, konnte aufgrund des gesammelten Materials nicht erfasst werden. Diese Tiere werden zudem in der Regel nicht in der offiziellen deutschen Versuchstierstatistik gezählt. Für das Vereinigte Königreich hingegen führt Boyd Group (1999) aus, dass aufgrund der Tierschutzprobleme, die mit Veränderungen des Erbgutes verbunden sein können, ALTEX 22,4/05 ~ SAUER ET AL. ---~---------------------------------------- alle Tiere, die als Nachkommen transgener Elterntiere gezüchtet wurden, in der Versuchstierstatistik erfasst werden müssen, selbst wenn sie nie in wissenschaftlichen Verfahren zum Einsatz gekommen waren. Gemäss der offiziellen britischen Versuchstierstatistik (zitiert in Boyd Group, 1999) ~aren im Jahre 1997 40% der erfassten trans genen Tiere in wissenschaftlichen Versuchen eingesetzt worden, während die übrigen 60% als .Zuchtbestand" zur Erhaltung gentechnisch veränderter Tierlinien erzeugt wurden. Da die Verfahren zur Herstellung transgener Tiere und die hierfür eingesetzten Tierarten sich zwischen Deutschland und dem Vereinigten Königreich nicht unterscheiden, müssen entsprechende Zahlenverhältnisse auch für die Anzahl der insgesamt in Deutschland hergestellten transgenen Tiere angenommen werden. 2.5 Schwerpunkte der biomedizinischen Forschung mit transgenen Tieren 2.5.1 Jahr der Veröffentlichung der Publikationen sowie verwendete Tierarten Die insgesamt 577 relevanten Publikationen verteilten sich mit 195 im Jahre 2001, 185 im Jahre 2002 und 197 im Jahre 2003 veröffentlichten Artikeln annähernd gleichmäßig über die erfasste Zeitspanne (Diagramm 1 und Tabelle 11 in Anhang 2). Fast 90% der Fachpublikationen betrafen Forschungsvorhaben, bei denen transgene Mäuse hergestellt oder zum Einsatz kamen, in rund 10% Forschungsvorhaben wurden transgene Ratten verwendet.. Einzelne Forschungen waren mit transgenen Schweinen, Fischen oder Kaninchen durchgeführt worden, während in zwei Publikationen von der gleichzeitigen Verwendung transgener Mäuse und Ratten sowie in einer Publikation von der gleichzeitigen Verwendung transgener Mäuse und Hühner berichtet wurde (Diagramm 2 und Tabelle 12 in Anhang 2). Auch der offiziellen deutschen Versuchstierstatistik zufolge handelt es sich beim Großteil der verwendeten trans genen Tiere um Mäuse (im Jahre 2002 98,1 %), gefolgt von Ratten (1,5%), Schweinen und Fischen (jeweils unter eiALTEX 22,4/05 nem Prozent). Zusätzlich wurden in der offiziellen Versuchstierstatistik für die Jahre 2000, 2001 und 2003 einzelne transgene Hamster, Kaninchen, Amphibien und Schafe aufgeführt. In der für diese Studie durchgeführten Literaturrecherche wurde nicht speziell nach Forschungsvorhaben mit trans genen Hamstern, Amphibien und Schafen gesucht, so dass über solche Forschungsgebiete keine Aussage möglich ist. 197 2.5.2 Verwendungszweck der Versuchstiere In fast allen erfassten Publikationen wurde der Einsatz transgener Tiere in einem experimentellen Verfahren beschrieben, wobei in rund 70% der Publikationen trans gene Tiere unmittelbar zum Einsatz kamen, während sie in knapp einem Viertel der Publikationen zunächst hergestellt und anschließend experimentell verwendet wurden. Nur in rund 6% der Publika- 195 • 2001 (195) .2002 (185) 2003 (197) 185 Abb. 1: Gesamtzahl der erfassten Veröffentlichung (2001-2003) Publikationen, aufgeschlüsselt nach dem Jahr der • Maus (87,4%) Ratte (10,3%) • Schwein (1,2%) • Maus und anderes Tier (0,5%) 87,4% • Fisch (0,3%) • Kaninchen (0,3%) Abb. 2: Anteilige Zuordnung der Publikationen vorhaben verwendeten Tierart / Tiergruppe zur im beschriebenen Versuchs- 6,4% • Herstellung (6,4%) Herstellung und Versuch (23,2%) 70,4% • Versuch (70,4%) Abb. 3: Anteilmäßige Zuordnung der Publikationen zum darin dargelegten Verwendungszweck der Tiere (Versuch M mit transgenen Tieren bzw. Herstellung (H) transgener Tiere) 239 m...... SAUER ET AL. -----------------~- tionen wurden Tierversuche zur Weiterentwicklung von Methoden zur Herstellung transgener Tiere beschrieben oder wurde über die Herstellung einer neuen transgenen Tierlinie berichtet (Diagramm 3 und Tabelle 13 in Anhang 2). Bedauerlicherweise sind die Angaben in der offiziellen deutschen Versuchstierstatistik nicht ausreichend detailliert, um ähnliche Verhältnismäßigkeiten feststellen zu können. 2.5.3 Forschungsgebiete der publizierten Versuche Die Forschungsgebiete, denen die erfassten Publikationen zugeordnet werden konnten, deckten den gesamten Bereich der Grundlagenforschung ab. Sie erstreckten sich über die Themen Dermatologie, Embryologie und Reproduktionsbiologie, Endokrinologie, Gastroenterologie, Genetik, Hämatologie, Kardiologie, Immunologie, Nephrologie, Neurobiologie, Onkologie, Ophthalmologie, Orthopädie Transplantationsmedizin und Xenotransplantationsforschung, Zellbiologie. Mit über einem Viertel (26,7%) der Publikationen war das Fachgebiet eurobiologie der Forschungsschwerpunkt, zu denen die meisten Fachartikel erfasst wurden, gefolgt von Immunologie (19,9%), Kardiologie (13,9%), Embryologie/Reproduktionsmedizi n (10,8 %) und Onkologie (7,1 %) (Diagramm 4 und Tabelle 14 in Anhang 2). Ähnliche Verhältnismäßigkeiten ergaben sich wenig überraschend bei der tierartspezifischen Zuordnung der Publikationen über transgene Mäuse zu den entsprechenden Fachgebietskategorien , da diese ohnehin mit fast 90% der Publikationen den überwiegenden Anteil an Artikeln ausmachten (Tabelle 15 in Anhang 2). Knapp die Hälfte der Publikationen über transgene Ratten hingegen wurde der Kardiologie zugeordnet, etwas über 20% der Neurobiologie und etwas über 6% der Endokrinologie (Tabelle 16 in Anhang 2). Fast alle Schweine (sechs von sieben) wurden der Transplantationsmedizin zugeordnet und waren alle als Organspendetiere im Zuge von Forschungsvorhaben für die Xenotransplantation verwendet worden (Tabelle 17 in Anhang 2). Diese Befunde stehen in Einklang mit den Ausführungen von van der Meer und 240 • Embryologie / Reprod. Medizin (10,8%) Endokrinologie (2,1%) Genetik (1,9%) 11 Hepatologie (1,9%) • Immunologie 19,9% 26,7% • Kardiologie • Methodik (19,9%) (13,9%) (6,4%) • Nephrologie (1,9%) • Neurobiologie • Onkologie o Sonstige (26,7%) (7,1 %) (7,4%) Abb. 4: Anteilige Zuordnung aller 577 Publikationen zu Forschungsgebietskategorien (alle Tierarten) Anmerkung: Unter "Sonstige" wurden alle Kategorien zusammengefasst, in denen weniger als 10 Publikationen erfasst wurden, d. h.: Dermatologie, Diabetologie, Gastroenterologie, Hämatologie, Ophthalmologie, Orthopädie, Transplantationsmedizin, Zellbiologie. 1,3% 1,3% Nur Kardiologie (58,6%) • K + Embryologie (1,3%) • K + Endokrinologie (30,0%) • K + Endokr + Nephrologie o K + Immunologie 30,0% (6,2%) (1,3%) • K + Neurobiologie • K + Zellbiologie (1,3%) (1,3%) Abb. 5: Anteilige Zuordnung der in der Fachgebietskategorie Kardiologie einsortierten Publikationen zu weiteren Fachgebietskategorien (Gesamtzahl: 80 Publikationen) 6,4% Nur Embryologie / Reproduktionsmedizin (59,7%) • E + Genetik (3,2%) E + Immunologie • E + Kardiologie (3,2%) (4,9%) • E + Neurobiologie 59,7% (14,5%) • E + Ophthalmologie OE + Orthopädie • E + Sonstiges (4,9%) (3,2%) (6.4%) Abb. 6: Anteilige Zuordnung der in der Fachgebietskategorie Embryologie/Reproduktionsmedizin einsortierten Publikationen zu weiteren Fachgebietskategorien (Gesamtzahl: 62 Publikationen) Anmerkung: Unter "E + Sonstige" wurden Publikationen zusammengefasst, die zusätzlich zur Fachgebietskategorie Embryologie den Fachgebietskategorien Endokrinologie, Gastroenterologie, Orthopädie + Endokrinologie sowie Transplantationsmedizin zugeordnet wurden. Diesen Unterkategorien wurde jeweils nur eine Publikation (4 x 1,6% = 6,4%) zugeordnet. ALTEX 22,4/05 ~ SAUER ET AL. -~-------------- van Zutphen (1997), denen zufolge Mäuse überwiegend in den Bereichen Gen-Expression, Immunologie, Embryologie, Onkologie, Neurologie, humane Erkrankungen, Gen-Austestung für GenFraming bei Nutztieren eingesetzt werden, während Ratten in erster Linie zur I Untersuchung des Bluthochdrucks und anderer Erkrankungen des Herzkreislaufsystems zum Einsatz gelangen. 2.5.4 Weitere Forschungsgebietskategorien Um die zahlenmäßig bedeutsamsten Forschungsgebiete - Neurobiologie, Immunologie, Kardiologie, Embryologie/Reproduktionsmedizin und Onkologie weiter zu differenzieren, wurde versucht, die Inhalte der Publikationen weiteren Fachgebieten zuzuordnen. Dabei konnten jedoch fast 80% der Publikationen, die in die Kategorien Neurobiologie oder Immunologie eingeteilt wurden, aufgrund der dargelegten Themengebiete keiner weiteren Fachgebietskategorie zugeordnet werden. Rund 40% der Publikationen, die zur Kardiologie eingeteilt wurden, konnten jedoch einer weiteren Kategorie zugeordnet werden: 30,0% zusätzlich zur Endokrinologie sowie 6,2% zusätzlich zu Endokrinologie und Nephrologie. Fast alle Forschungsvorhaben der Kategorie Kardiologie, die der Unterkategorie Endokrinologie zugeordnet wurden, sowie alle Forschungsvorhaben, die zu den Unterkategorien Endokrinologie und Nephrologie kamen, wurden mit transgenen Ratten durchgeführt (Diagramm 5 und Tabelle 22 in Anhang 2). Fast 60% der Publikationen über Embryologie/Reproduktionsmedizin wurden keiner weiteren Fachgebietskategorie zugeordnet, 14,5% zusätzlich der Fachgebietskategorie Neurobiologie (Diagramm 6 und Tabelle 20 in Anhang 2). Knapp die Hälfte der Publikationen der Fachgebietskategorie Onkologie wurde keiner weiteren Fachgebietskategorie zugeordnet. 22% wurden zusätzlich Kategorie Immunologie eingeteilt, knapp 15% zur Dermatologie und etwas über 7% zusätzlich zur Gastroenterologie (Diagramm 7 und Tabelle 24 in Anhang 2). ALTEX 22,4/05 I 2.5.5 Art der Versuchsdurchführung 2.5.5.1 Weiterverwendung von Material transgener Tiere in in vitro Verfahren In 72 der insgesamt 577 Publikationen wurden Forschungen, bei denen Material transgener Tiere in vitro weiterverwendet wurde, beschrieben. Dabei wurde in elf Publikationen dargelegt, dass in vitro Gewebekulturen transgener Tiere, wie beispielsweise Hirnschnitte oder Herzvorhöfe, verwendet wurden; in neun Publikationen handelte es sich um in vitro Organkulturen, überwiegend um isolierte Herzen transgener Tiere. In 45 Publikationen wurde die in vitro Verwen- dung von Zellen transgener Tiere beschrieben, in drei Publikationen die in vitro Verwendung von Zellen und Geweben. Vier Publikationen beschrieben sowohl einen in vivo Versuch auch die in vitro Verwendung von Zellen transgener Tiere. In vier Publikationen blieb unklar, ob das Forschungsvorhaben in vivo oder in vitro unter Verwendung von Zellen transgener Tiere durchgeführt worden war (Tabelle 25 in Anhang 2). Die meisten dieser Publikationen wurden den Fachgebietskategorien Neurobiologie (24), Immunologie (22), Kardiologie (14) und Embryologie/ Reproduktionsmedizin (6) zugeordnet (Diagramm 8 und Tabelle 25 in Anhang 2). Da diese jedoch ohnehin die Katego- 2,4% ~ Nur Onkologie (48,8%) 11 0 + Dermatologie (14,6%) 110 + Endokrinologie 48,8% (2,4%) 110 + Gastroenterologie 11 0 + Hepatologie o + Immunologie (22,0%) 11 0 + Neurobiologie Abb. 7: Anteilige Zuordnung der in der Fachgebietskategorie sortierten Publikationen zu weiteren Fachgebietskategorien Publikationen) 4 (7,3%) (2,4%) (2,4%) Onkologie ein(Gesamtzahl: 41 6 11 Embryologie / Reprod.medizin Immunologie 22 24 11 Kardiologie (14) 11 Neurobiologie 11 Onkologie (6) (22) (24) (2) Sonstige (4) 14 Abb. 8: Anteilige Zuordnung der Publikationen, in denen Gewebe transgener Tiere in vttro weiterverwendet wurden, zu den Fachgebietskategarien (Gesamtzahl: 72 Publikationen) Anmerkung: Unter "Sonstige" wurden die Fachgebietskategorien zusammengefasst, denen nur eine Publikation über Forschungsvorhaben, in denen Gewebe transgener Tiere in vitro weiterverwendet wurden, zuzuordnen war. Dies waren die Fachgebietskategorien: Dermatologie, Endokrinologie, Gastroenterologie, Genetik. 241 SAUER ET AL. ~ ----------------------------------------~--- rien mit den insgesamt meisten Publikationen darstellten, ist es nicht möglich in diesem Zusammenhang spezielle Forschungsgebiete auszumachen, in denen in vitro Verfahren mit Geweben transgener Tiere vermehrt zum Einsatz gelangen würden. , 2.5.5.2 Forschungsvorhaben, in denen Tieren nach der Geburt transgenes Material eingebracht wurde In 22 der 577 Publikationen wurden Forschungen beschrieben, in denen Tieren von Wildtyp-Zuchtstämmen nach der Geburt trans genes Material eingebracht wurde, also keine gentechnischen Eingriffe in das Keimzellgenom erfolgt waren (Diagramm 9 und Tabelle 26 in Anhang 2). In den meisten derartigen Forschungsvorhaben wurden trans gene Zellen in bestimmte Gewebe der Tiere injiziert. Diese Publikationen wurden mit je sechs überwiegend den Kategorien Immunologie und Neurobiologie zugeordnet, in einzelnen Fällen den Bereichen Hepatologie, Kardiologie, Onkologie, Orthopädie (je zwei), Dermatologie und Ophtalmologie (je eine). Auch hier können aufgrund des ohnehin hohen Anteils der Publikationen der Fachgebietskategorien Immunologie und Neurobiologie an der Gesamtpublikationszahl keine Forschungsgebietsschwerpunkte ausgemacht werden, in denen besonders häufig Tieren erst nach der Geburt transgenes Material eingebracht wurde. Es fällt jedoch auf, dass alle solchen neurobiologischen Versuche mit Ratten durchgeführt wurden. Ob dies daran liegt, dass das Gehirn dieser Tiere aufgrund seiner Größe für das zielgerichtete Einbringen von Lösungen geeigneter erscheint als das der Maus, kann mit den vorliegenden Rechercheergebnissen nicht ermittelt werden. von Fachartikeln wiedergegeben werden. Damit soll zusätzlich ein Eindruck vermittelt werden, welche Bandbreite unterschiedlicher Forschungsziele in den ausgewerteten Publikationen verfolgt wurde, sowie aus welchem Grunde transgene Tiere anstelle konventioneller Versuchstiere für die Forschungsvorhaben ausgewählt wurden und für welche Verfahren sie zum Einsatz gelangten. Die Originalzusammenfassungen der hier zitierten Publikationen sind auf www.altex.ch als Anhang 4 zu finden. Beispiel 1: Forschungsgebiet - Neurobiologie, Tierart - Maus, Verwendungszweck Versuch liehen Verlust an Nervenzellen gekennzeichnet ist. Neuere Erkenntnisse lassen vermuten, dass dieser Nervenzelltod unter anderem auf den fehlgeschlagenen Versuch der Zellen, wieder in den Zellzyklus zurückzukehren, zurückzuführen ist. Um tierexperimentell die Auswirkungen der Amyloid-Ablagerungen auf Ereignisse, die mit dem Zellzyklus zusammenhängen, zu untersuchen, wurde in APP23-Mäusen mit einer transgenen Veränderung des Amyloid- VorläuferProteins untersucht, wie Zellzyklusspezifische Gene exprimiert wurden. Amyloid-beta-Ablagerungen in APP23Mäusen führen zu einer ausgeprägten Entzündungsreaktion der NervenscheidenzeIlen, die in den Sternzellen (bestimmten Nervenscheidenzellen) u. a. durch Expression der Gene mit den Informationen für die Botenstoffe Zyklin D I, E und BI gekennzeichnet ist. In den Nervenzellen selbst hingegen geht die Bildung der amyloiden Plaques nicht mit erheblichen Veränderungen in der Expression der Zykline oder der von ihnen abhängigen Enzyme einher. Daraus wird geschlossen, dass die Amyloid-Pathologie in APP23-Mäusen im Gegensatz zur Alzheimer-Krankheit in Menschen nicht von Veränderungen der Expression von Zellzyklus-Genen in Nervenzellen begleitet ist. Diese Befunde unterstützen die Annahme, dass die erneute Expression von Zellzyklus-Komponenten im Verlauf der Alzheimer-Krankheit nicht durch die Bildung und Ablagerung von Amyloid beta verursacht wird. - Gärtner, U., Brückner, M. K., Krug, S., Schmetsdorf, S., Staufenbiel, M. und Arendt, T. (2003) Die Ablagerung von Amyloiden in APP23-Mäusen (trans genen Mäusen zur Untersuchung der Alzheimer Krankheit) geht mit der Expression von Zyklinen in Sternzellen (Nervenscheidenzellen), nicht aber in Nervenzellen, einher Die Alzheirner-Krankheit (AK) ist eine nervenzellschädigende Störung, die durch Anreicherung bestimmter Eiweißstoffe in den Zellen, Bildung der so genannten amyloiden Plaques (Eiweißstoff-Ablagerungen, die für die Alzheirner-Krankheit charakteristisch sind) außerhalb der Zellen sowie einen erheb- • Dermatologie 242 (2) • Immunologie • Kardiologie 6 2.5.6 Beispiele für Forschungsvorhaben, in denen transgene Tiere hergestellt oder verwendet wurden Um beispielhaft zu veranschaulichen, wie Publikationen in der Auswertung den Fachgebietskategorien etc. zugeordnet wurden, sollen an dieser Stelle die inhaltlichen Zusammenfassungen einer Reihe (1) Hepatologie (6) (2) • Neurobiologie • Onkologie • Ophthalmologie • Orthopädie (6) (2) (1) (2) 2 Abb. 9: Anteilmäßige Zuordnung der 22 Publikationen, in denen dargelegt wurde, dass transgenes Material in Tiere von Wildtyp-Zuchtstämmen eingebracht wurde, zur Fachgebietskategorie, der die Publikation zugeordnet wurde. ALTEX 22,4/05 ~ -~------------- Beispiel 2: Forschungsgebiet - Neurobiologie, Tierart - Maus, Verwendungszweck Versuch,Versuchsdurchführung: in vitro Verwendung von Geweben transgener Tiere Gebhardt, C.~ Körner, R. und Heinemann, U. (2002) Durch Sauerstoffmangel bedingte verspätete Entladungen (elektrophysiologische Aktivitäten) von Nervenzellen des Hippocampus (Ammonshorn, bestimmter Teil des Gehirns, der u.a. am Affekt- und Triebverhalten beteiligt ist) von Mäusen, denen der erregende Aminosäure- Trägerstoff 1 fehlt Sauerstoffmangel führt zu einer schnellen Zunahme der Ausschüttung von Glutamat (einer erregenden Aminosäure, die als Botenstoff Nervenzellimpulse zwischen Nervenzellen verstärkend weiterleitet) aus den Zellbläschen der Nervenzellen. Zusätzlich kann die durch Sauerstoffmangel bedingte Freisetzung von Glutamat durch eine gestörte Funktion von Glutamat-Trägerstoffen in den Nervenzellen verursacht werden. Die Zunahme der Glutamat-Konzentration außerhalb der Zellen kann ein wichtiger Faktor bei der Auslösung von durch Sauerstoffmangel bedingten NervenzellEntladungen (SNE) und nachfolgenden Nervenzellschädigungen darstellen. Daher sollten derartige SNE sowie die Freisetzung von Glutamat aus den Bläschen der Nervenzellen untersucht werden. Hierfür wurden Himgewebeschnitte des Hippocampus von Wildtyp-Mäusen und von transgenen Mäusen, denen das Gen für den Nervenzell-Glutamat- Trägerstoff, der "erregende AminosäureTrägerstoff 1" (excitatory amino acid carrier 1, EAACl), ausgeschaltet worden war, hergestellt. An diesen Himschnitten wurden in vitro elektrophysiologische Ableitungen der Aktivitäten bestimmter Nervenzellen durchgeführt. Verzögerte Reaktionen nach SNE waren in Hirnschnitten der Mäuse, in denen EAACI reinerbig ausgeschaltet war, verstärkt, wohingegen die durch Sauerstoffmangel ausgelöste Zunahme des erregenden elektrischen "Miniaturstroms" hinter ALTEX 22,4105 den Nervenzellübergängen in den transgenen Tieren mit ähnlich kurzer Übergangsfrist und in ähnlicher Häufigkeit auftrat wie bei den Kontrolltieren. Wenn zusätzlich durch Gabe eines speziellen Hemmstoffes die Aufnahme von Glutamat in die Nervenscheidenzellen verhindert wurde, verringerte sich die Phase bis zum Einsetzen der SNE dramatisch und zwischen Kontrolltieren und gentechnisch veränderten Tieren wurden keine unterschiedlichen Reaktionen mehr beobachtet. Daraus wird der Schluss gezogen, dass der GlutamatTrägerstoff in Nervenzellen einen erheblichen Einfluss auf die Zeitdauer bis zur Ausbildung der SNE hat. Da SNE in Mäusen, denen EAACI fehlt, nicht verhindert werden kann, scheinen Mechanismen der Freisetzung des Glutamats aus den Nervenzellbläschen an deren Entstehung ebenfalls beteiligt zu sein. Diese Mechanismen werden bemerkbar, sobald die Glutamataufnahme in Nervenscheidenzellen verhindert wird. Beispiel 3: Forschungsgebiet - Immunologie, Unterkategorie - Dermatologie, Tierart - Maus, Verwendungszweck Versuch, Versuchsdurchführung: Einbringen transgener Zellen in Zuchtstämme Müller, G., Müller, A., Tüting, T., Steinbrink, K., Saloga, J., Szalma, C., Knop, J. und Enk, A. H. (2002) Mit dem Botenstoffinterleukin-lO vorbehandelte dendritische Zellen verändern im Tierversuch die Abwehrreaktionen von sensibilisierten und nicht sensibilisierten Abwehrzellen Interleukin-lO ist ein vielfältig wirkender Botenstoff, von dem bekannt ist, dass er hemmende Wirkungen auf die Funktionen dendritischer Zellen (bestimmter Abwehrzellen) ausübt. In vitro verwandelt Interleukin-lO unreife dendritische Zellen in tolerierende Antigen-präsentierende Zellen (d. h. in Zellen, die vermitteln, dass der Körper gegen bestimmte Fremdstoffe keine Abwehrreaktion in Gang setzt, während sie andere Fremdstoffe SAUER ET AL. zum Auftakt einer solchen Abwehrreaktion an spezielle Abwehrzellen, die so genannten CD4+- T-Zellen, weiterleiten). Zur Untersuchung, ob mit Interleukin-l0 vorbehandelte dendritische Zellen auch in vivo derartige tolerierende Wirkungen vermitteln, wurden CD4+-T-Zellen so genannter DOll.10-0valbumin-T-ZellRezeptor-transgener Mäuse (dies sind Mäuse, die gentechnisch so verändert wurden, dass sie auf der Oberfläche der genannten T-Zellen nur Rezeptoren für Hühnereiweiß ausbilden) in WildtypMäuse eingebracht. Im nächsten Schritt wurden diese Tiere mit dendritischen Zellen behandelt, die je nach Untersuchungsgruppe teilweise vorher Kontakt mit Interleukin-lO und / oder mit Hühnereiweiß hatten. Anschließend wurde in vitro durch Zugabe von Hühnereiweiß ermittelt, ob sich die Abwehrzellen als Reaktion auf den erneuten Hühnereiweiß-Reiz vermehrten oder nicht. In den Kontrollgruppen erhielten die Mäuse nicht vorbehandelte Abwehrzellen und anschließend nach Gabe der jeweils unterschiedlich vorbehandelten dendritischen Zellen aufgelöstes Hühnereiweiß. In den Tieren, die mit Hühnereiweiß vorbehandelte dendritische Zellen erhalten hatten, vermehrten sich die Abwehrzellen nach Verabreichung des Hühnereiweißes am stärksten. Die geringste Zunahme hingegen wurde in den Mäusen beobachtet, die mit Hühnereiweiß und Interleukin-lO behandelte dendritische Zellen erhielten. In weiteren Versuchen wurden den Tieren voraktivierte Abwehrzellen und anschließend dendritische Zellen übertragen. Die Hühnereiweißspezifische Vermehrung der Abwehrzellen war in den Tieren am stärksten ausgeprägt, die Hühnereiweiß-vorbehandelte dendritische Zellen erhielten, während sie in den Tieren, die dendritische Zellen erhielten, die sowohl mit Hühnereiweiß als auch mit Interleukin10 vorbehandelt worden waren, unterhalb des Schwellen wertes lag. Als versucht wurde, in den Fußballen der Tiere allergische Reaktionen des verzögerten Typs auszulösen, zeigten die Mäuse, die mit Hühnereiweiß und Interleukin-lO vorbehandelte dendritische Zellen erhalten hatten, im Vergleich zu den Kontrolltieren kein Anschwellen der Fußballen. 243 m...... SAUER ET AL. -------------~- Wurden die Zellen dem Fremdstoff in viva oder in vitro erneut ausgesetzt, veränderte sich die hemmende Wirkung der Interleukin-lO-behandelten dendritischen Zellen ebenfalls nicht. Demzufolge hemmen Interleukin-lO-behandelte dendritische Zellen sowohl in nicht vorbehandelten als auch in vorbehandelten Mäusen die Hühnereiweiß-spezifischen Abwehrreaktionen. , Beispiel 4: Forschungsgebiet - Kardiologie, Unterkategorien - Endokrinologie, Nephrologie, Tierart - Ratte, Verwendungszweck - Versuch Lemmer, B., Witte, K., Enzminger, H., Schiffer, S. und Hauptfleisch, S. (2003) Transgene TGR(mREN2)27-Ratten als Modell für einen gestörten Biorhythmus auf Ebene des Gehirns, des Herzens und der Nieren In transgenen Bluthochdruck-Ratten (TGR(mREN2)27-Ratten), die das Maus-Gen Ren-2 beinhalten, wurde ein umgekehrter 24-Stunden- Verlauf der Blutdruckkurve bei normalem Muster der Herzrate und des Bewegungsmusters beschrieben. Diese transgenen Ratten wurden als Modell des sekundären Bluthochdrucks des Menschen eingehend untersucht; dabei wurden nicht-transgene Ratten des Sprague-Dawley-Zuchtstammes als Kontrolltiere mit normalem Blutdruck verwendet. Mit radiotelemetrischen Verfahren wurden schwerwiegende Störungen des Tagesrhythmus sowie Rhythmusstörungen der Herzkreislauffunktionen, der Bewegungsmuster und der Körpertemperatur nachgewiesen, und zwar sowohl unter normalen Licht-Dunkel- Verhältnissen, unter Dunkel-Dunkel-Verhältnissen und nach einem Lichtimpuls. Durch Bestimmung der ATl-Rezeptoren in den Nierenkörperchen sowie der Nierenfunktion wurde untersucht, wie angesichts des übermäßig exprimierten Renin-AngiotensinSystems der trans genen Ratten Signale übertragen werden. Dabei wurde ermit- 9 10 Extrazelluläre Basalmembran 244 Matrix = außerhalb = Grenzschicht der Zellen gelegene zwischen telt, wie Schlüsselvorgänge, die in den trans genen Ratten an der erhöhten sympathischen Regulierung beteiligt sind, exprimiert werden. Die Ergebnisse der Untersuchungen belegen eindeutig, dass das zusätzliche Maus-Renin-Gen in den trans genen Ratten nicht nur das ReninAngiotensin-System erheblich beeinflusste und somit erwartungsgemäß zu Bluthochdruck führte, sondern auch den Tagesrhythmus des Blutdruckmusters bis hinunter auf die Ebene seiner hormonellen Steuerung und der Expression weiterer relevanter Gene. Daraus wird der Schluss gezogen, dass die Expression eines einzigen zusätzlichen Gens in der Lage ist, den Tagesrhythmus eines Tieres auf höchst komplexe Weise zu stören. Beispiel 5: Forschungsgebiet - Embryologie, Tierart - Maus, Verwendungszweck Versuch Kostka, G., Giltay, R., Bloch, w., Addicks, K., Tirnpl, R., Fässler, R. und Chu, M. L. (2001) Tod zum Zeitpunkt der Geburt und Veränderungen in Gefäßinnenwandzellen verschiedener Gefäßabschnitte von Mäusen, denen Fibulin-l fehlt Das Protein Fibulin-l der extrazellulären Matrix" ist ein spezifischer Bestandteil von Gefäßwänden und kann mit anderen Bindegewebsstoffen der Basalmernbran'" verbunden sein. Zur Untersuchung seiner biologischen Funktion wurde das Fibulin-l-Gen in Mäusen gezielt inaktiviert. Dies führte in einer Reihe von Geweben zu massiven Blutungen, die nach Ablauf der halben Trächtigkeitsdauer einsetzten und letztendlich zum Tod von fast allen homozygoten (reinerbigen) Embryonen zum Zeitpunkt der Geburt führten. Durch histologische Untersuchung konnten Erweiterungen und Brüche in der inneren Schicht verschiedener kleiner Blutgefäße nachgewiesen werden. In größeren Blutgefäßen wurden diese Schäden nicht beobachtet. Die Nieren wiesen eine charakteristische Fehlbildung der Nie- Grundsubstanz Bindegewebe und nicht-bindegewebigen Bestandteilen renkörperchen und eine Desorganisation der Podozyten (bestimmter Nierenzellen) auf. Die beobachtete verzögerte Lungenentwicklung schien auf eine Störung in der Lungenaufblähung zurückzuführen zu sein. In immunhistologischen Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass Fibulin-l an den für dieses Protein charakteristischen Stellen fehlte, während für eine Reihe anderer Proteine der extrazellulären Matrix keine unüblichen Verteilungsmuster festgestellt werden konnten. Elektronenmikroskopische Untersuchungen ergaben intakte Basalmembranen, aber sehr unregelmäßige Vorgänge in den inneren Zellen der Kapillaren der am meisten betroffenen Organe. Das Fehlen von Fibulin-l verursachte einen erheblichen Blutverlust, ohne dass die Blutgerinnung beeinträchtigt war. Die Befunde weisen auf eine ausgeprägte Störung ganz bestimmter Funktionen der Gefäßinnenwandzellen hin, die zusammen mit einigen der Nieren- und Lungenschädigungen für den frühen Tod der Tiere verantwortlich sein könnten. Beispiel 6: Forschungsgebiet - Onkologie, Tierart - Maus, Verwendungszweck Herstellung und Versuch - Klein, A., Guhl, E., Tzeng, Y. J., Fuhrhop, J., Levrero, M., Graessmann, M. und Graessmann, A. (2003) Das HBx-Gen verursacht in transgenen Tieren, die für das p53-Gen heterozygot (gemischterbig) sind, eine überhöhte Ausprägung von Zyklin Dl und die Ausbildung von Brustkrebs Anmerkung: Mit dem HEx-Gen wird das Hepatitis B-Virus-X-Protein kodiert, ein Eiweißstoff, der an der Entstehung bestimmter Krebsarten beteiligt sein soll. Mit dem p53-Gen wird das p53-Protein kodiert, ein Eiweißstoff der Zelle, der den Zellzyklus anhalten und zum Tod der Zelle beitragen kann. Um die Bedeutung der Expression des HBx-Gens auf die Organdifferenzierung, das natürliche Absterben von Zellen und die Entwicklung von Tumoren zu untersuchen, wurden transgene Mäuse hergestellt, die die entsprechende genetische Veränderung ausschließlich in EpithelALTEX 22, 4/05 ~ --~-------------------------- zellen (Deckgewebezellen) der Brustdrüse ausbilden. Es konnte durch verschiedene Techniken nachgewiesen werden, dass das veränderte Gen während der Trächtigkeit, während des Säugens und nach dem Absetzen exprimiert war. Die Bildung des HBx-Proteins hatte in den Brustdrüsenzelfen weder Einfluss auf die Entwicklung der Brustdrüse noch auf das Absterben von Zellen. Obwohl Brustkrebs in weniger als einem Prozent dieser so genannten WAP-HBx-transgenen Tiere auftrat, entwickelten 12 von 85 der Nachkommen dieser Tiere, die mit p53+/- Tieren gekreuzt worden waren, innerhalb von 8 bis 18 Monaten Brustkrebs. Zusätzlich konnte erstmals gezeigt werden, dass das HBx-Protein in der Lage ist, Brustdrüsenepithelzellen unabhängig vom p53-Protein unsterblich zu machen. HBx verursacht während der frühen Phase der Trächtigkeit eine überhöhte Expression des Zyklin-DlGens. Diese Eigenschaft behalten Brustdrüsenepithelzellen, die aus der Brustdrüse oder aus Brusttumoren entnommen wurden, bei. Beispiel 7: Tierart - Maus, Verwendungszweck Herstellung - Forde, A., Constien, R., Gröne, H. J., Hämmerling, G. und Arnold, B. (2002) Vorübergehende Cre-vermittelte Neubildung ausschließlich in Gefäßinnenwandzellen durch Verwendung von Tie2-regelnden Elementen Die gentechnologische Vielseitigkeit des Cre/loxP-Systems setzt nach Angaben der Autoren voraus, dass ein breites Spektrum gewebe spezifischer transgener Mäuse verfügbar ist, mit denen eine Bandbreite biologischer Fragen abgeklärt werden kann. Daher wurde eine transgene Mauslinie erzeugt, bei der es möglich ist, das so genannte Tie2-Cre-Gen durch zielgerichtete Genmanipulation ausschließlich und zeitlich gesteuert in Gefäßinnenwandzellen auszulösen. Mit Hilfe einer EGFPReporter-Mauslinie (Mäuse, die einen speziellen fluoreszierenden Eiweißstoff ausbilden, EGFP = enhanced green fluorecent protein) konnte überprüft werden, dass die Veränderung des Erbgutes zuverALTEX 22,4/05 lässig bei einem Großteil der untersuchten Gefäßinnenwandzellpopulationen auftrat. In nicht-induzierten Mäusen wurde keine EGFP-Expression beobachtet. Diese induzierbare Cre-Linie wird den Autoren zufolge einen "sehr nützlichen Posten" (beneficial asset) darstellen, um in ausgewachsenen Mäusen die Rolle von Genen, die für die Gefäßinnenwandzellen spezifisch sind, sowie Veränderungen des Erbgutes in der Gefäßinnenwand sehr effizient zu untersuchen. Beispiel 8: Tierart - Schwein, Verwendungszweck - Versuch, Forschungsgebiet Xenotransplantation - Vangerow, B., Hecker, J. M., Lorenz, R., Loss, M., Przemeck, M., Appiah, R., Schmidtko, J., Jalali, A., Rueckoldt, H. und Winkler, M. (2001) Cl-Hemmstoff zur Behandlung der akuten (sofortigen) vaskulären (Blutgefäß-) Abstoßungsreaktion in Altweltaffen, denen hDAF transgene Nieren des Schweins eingepflanzt wurden Anmerkung: Damit - theoretisch - Patienten, denen artfremde Organe übertragen werden sollen, langfristig überleben können, müssen vier Phasen von Abstoßungsreaktionen überwunden werden: die hyperakute, die akute vaskuläre, die klassische Abwehrzell-vermittelte und die chronische Abwehrreaktion. Der hDAF-Faktor (human Decay Accelerating Factor = "humaner Verwesungsbeschleunigungsfaktor") verhindert die Aktivierung des Komplementsystems. (Das Komplementsystem besteht aus Bluteiweißstoffen. Es unterstützt das Abwehrsystem in seiner Funktion.) Daher kann der hDAF-Faktor dazu beitragen, die hyperakute Abstoßungsreaktion zu verhindern, die zum sofortigen Tod der Patienten nach Einpflanzung des artfremden Organs führen würde. Zurzeit stellt die akute vaskuläre Abstoßungsreaktion (AVR) nach Angaben der Autoren das Haupthindernis auf dem Weg zu einer erfolgreichen Übertragung von Organen konventioneller oder transgener Schweine (mit gentechnischen Veränderungen der für die Regulierung des Komplementsystems verantwortli- SAUER ET AL. ehen Gene) auf Affen dar. Im Zuge dieser Abstoßungsreaktion werden Abwehrstoffe des Empfängertieres, deren Bildung durch die Xenotransplantation ausgelöst wurde, in dem artfremden Organ abgelagert, woraufhin das Komplementsystem aktiviert wird. h-DAF-transgene Nieren des Schweins wurden Affen anstelle einer ihrer eigenen Nieren eingepflanzt. Nach der Operation wurde das Abwehrsystem medikamentös unterdrückt. Sobald dennoch eine AVR auftrat, wurde diese entweder durch medikamentöse Gabe von Cyclophospharniden und Steroiden oder mit denselben Mitteln und einer zusätzlichen dreitägigen Verabreichung eines C 1-Hemmstoffes, eines vielfältig wirkenden Komplementsystem- Regulierungsstoffes , behandelt. In 8 von 10 Tieren wurde in der Anfangsphase nach der Xenotransplantation eine stabile Funktion des übertragenen Organs erreicht, bei allen Tieren wurden eine oder mehrere AVR-Schübe beobachtet. Als 4 Tieren zur Behandlung der Abstoßungsreaktion der Cl-Hemmstoff der Standardmischung beigefügt wurde, wurde die AVR in 6 von 7 Schüben erfolgreich eingedämmt. Bei einer weiteren Gruppe mit 4 Tieren, denen nur die Standardmischung verabreicht wurde, konnte keiner der 4 AVRSchübe behandelt werden. Die Überlebenszeit der Empfängertiere verlängerte sich also signifikant, wenn diese auf die Behandlung der Abstoßungsreaktion ansprachen. Daraus wird gefolgert, dass die AVR in Affen, denen h-DAF-transgene Nieren des Schweins eingepflanzt wurden, erfolgreich durch zusätzliche Kurzzeithemmung bestimmter Anteile des Komplementsystems behandelt werden kann. Im zweiten Teil der Studie, der in ALTEX 23,1,2006 erscheinen wird, soll auf der Basis der hier erhobenen Daten eine ethische Bewertung der Verwendung transgener Tiere in der biomedizinischen Forschung vorgenommen werden. Nach einem Kapitel über mögliche tierversuchsfreie Verfahren soll anschließend die Unerlässlichkeit von Tierversuchen mit transgenen Tieren kritisch hinterfragt werden. 245 SAUER ET AL. -------------~- Referenzen * Ammann, D. (2004). Transgene Tiere als Krankheitsmodelle. ALTEX 21 (1),4245. Anon. (2002). Erneuerung - Gerechtigkeit - Nachhaltigkeit. Koalitionsvertrag zwischen SPD und Bündnis 90/Die Grünen vom 16. Oktober 2002. 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SAUER ET AL. -~-------------- Anhang 1 Durchführung der Literaturrecherche sowie Auswahl der geeigneten Publikationen Tab. 2: Verwendete Datenbanken (Gesamtanzahl Name der Datenbank 38; Quelle: www.dimdLde) Hersteller AMED (Allied and Alternative Medicine) The Britisch Library, Wetherby/Großbritannien AnimAlt-ZEBET BfR (ZEBET), Berlin/Deutschland BIOSIS Previews BIOSIS Thomson/ISI, CAB Abstracts CAB International, Philadelphia/USA Oxon/Großbritannien CancerLit National Cancer Institute (NCI), Bethesda/USA, CATFILEplus National Library of Medicine (NLM), Bethesda/USA Cochrane Library - Cochrane Central Register of Controlled Trials (Central) Cochrane Collaboration, Update Software Ud, Oxford/Großbritannien Cochrane Library - Cochrane Database of Systematic Reviews (CDSR) Cochrane Collaboration, Update Software Ud, Oxford/Großbritannien DAHTA-Datenbank DIMDI, Köln/Deutschland Derwent Drug File Thomson Elsevier BIOBASE Elsevier B.v., Amsterdam/Niederlande ( Bundesministerium für Gesundheit Elsevier B.V. , Amsterdam/Niederlande EMBASE Alert Elsevier B.V. , Amsterdam/Niederlande IDEM, Göttingen/Deutschland FSTA (Food Science and Technology Abstracts) International Food Information Service (IFIS), Shinfield/Großbritannien gms (German Medical Science) German Medical Science (gms), Düsseldorf/Deutschland gms Meetings (German Medical Science Meetings) German Medical Science (gms), Düsseldorf/Deutschland GeroLit (Gerontologische Literatur) DZA, Berlin/Deutschland GLOBAL Health CAB International, HECLINET (Health Care Literature Informations Technische IPA (International Pharmaceutical und Soziale Sicherung) Derwent, London/Großbritannien EMBASE (Excerpta Medica Database) ETHMED (Ethik in der Medizin) 1963-2002 Oxon/Großbritannien Universität Berlin, Berlin/Deutschland, 1969-5/2001 Network) Abstracts) Karger-Verlagsdatenbank American Society of Health-System Pharmacists (ASHP), Bethesda/USA S. Karger AG, Basel/Schweiz Kluwer-Verlagsdatenbank Kluwer Academic MEDIKAT Zentralbibliothek MEDLINE National Library of Medicine (NLM), Bethesda/USA MEDLINE Alert National Library of Medicine (NLM), Bethesda/USA Publishers , DordrechtiNiederlande, Norwell/USA für Medizin (ZB MED), Köln/Deutschland NHS-CRD-DARE (NHS=National Health Service, NHS (National Health Service) Centre for Reviews and Dissemination, CRD=Centre for Reviews and Dissemination, York/Großbritannien DARE=Database of Abstracts of Reviews of Effects) NHS-CRD-HTA (INAHTA) (NHS=National Health Service, CRD=Centre for Reviews and Dissemination, HTA=Health Technology Assessment, INHATA=lnternational Network of Agencies for Health Technology Assessment) NHS (National Health Service) Centre for Reviews and Dissemination, York/Großbritannien, INAHTA, Stockholm/Schweden OldMEDLINE National Library of Medicine (NLM), Bethesda/USA, SOMED (Sozialmedizin) lögd, Bielefeld/Deutschland, 1951-1965 1978-2000 Springer-Verlag GmbH & Co. KG, Heidelberg/Deutschland Springer-Verlagsdatenbank Springer-Verlag GmbH & Co. KG, Heidelberg/Deutschland Thieme-Verlagsdatenbank Georg Thieme-Verlag, Derwent Drug Backfile Thomson ISTPB, ISTP/ISSHP (ISTP=lndex to Scientific and Technical Proceedings, ISSHP=lndex to Social Sciences & Humanities Proceedings) ISI- Thomson Springer-Verlagsdatenbank PrePrint SciSearch (entspricht dem Science Citation Index) ISI- Thomson Derwent Biotechnology Thomson Resource XTOXLINE (T165) setzt sich aus den bei den Datenbanken TXC65 und TXS65 zusammen ALTEX 22, 4/05 Stuttgart/Deutschland Derwent, London/Großbritannien, Scientific, Scientific, Philadelphia/USA, Philadelphia/USA, 1964-1982 Uxbridge/Großbritannien Uxbridge/Großbritannien Derwent, London/Großbritannien National Library of Medicine (NLM), Bethesda/USA 247 m..... SAUER ET AL. -----------------~- Durchführung der Literaturrecherche - Phase 1 Zur ersten Erfassung von Informationen wurde in 38 wissenschaftlichen Datenbanken (Tab. 2), die vom Deutschen Institut für Medizinische Dokumentation und Information erfasst werden (www.dimdi.de). eine Literaturrecherche mit sechs Suchbegriffkombinationen durchgeführt. Dabei wurden die Suchbegriffe "transgen" , "animal" , "German" und Veröffentlichungsdaten von 200 I bis 2003 so kombiniert, dass Doppelnennungen möglichst eliminiert wurden (Tab. 3). Mit dieser Recherche wurden 136 Publikationen erfasst. Nach einer Detailauswertung der Inhalte wurden jedoch lediglich 28 als für die Ziele der Studie geeignet erfasst. Die Ablehnungsquote von 77% (l 05/136) ist vor allem auf die Ungenauigkeit des Suchbegriffs "German" zurückzuführen: Von den 136 Publikationen entfielen allein 84 dadurch, dass sie nicht in Deutschland abgefasst wurden. In den übrigen aussortierten Publikationen wurden in elf Fällen Fütterungsversuche mit trans genen Pflanzen beschrieben. Publikationen, die in vitro Forschungsvorhaben vorstellten, wurden aussortiert, wenn in vitro trans gene Zellen hergestellt wurden und diese ausschließlich in vitro weiterverwendet wurden. Diese Voraussetzung traf für drei Publikationen zu. Wenn aber zur Gewinnung von Zellen oder der Herstellung Zelllinien transgener Tiere verwendet wurden oder wenn trans gene Zellen Zuchtstämmen injiziert wurden, wurden diese Publikationen als relevant erachtet und in die Auswertung aufgenommen. Bei drei aussortierten Publikationen handelte es sich um Review-Artikel zu den jeweiligen Themengebieten, in denen keine neuen wissenschaftlichen Erkenntnisse dargelegt wurden. In vier weiteren Publikationen konnte nicht eindeutig identifiziert werden, ob die Forschungsarbeiten tatsächlich in Deutschland durchgeführt worden waren (Tab. 4). Relevante Publikationen wurden in den folgenden Datenbanken erfasst: Biosis Prev AB (eine Publikation), Derwent Drug Profile (fünf Publikationen), Elsevier Biobase (eine Publikation), Embase 248 Tab. 3: Verwendete Suchbegriffe und Suchbegriffskombinationen 1 .Transqen" 2 "Transgen" und "animal" und "German" 3 .Transqen" und .anlmar' (und "German" 4 2 oder 3 5 4 und Veröffentlichungsdatum 6 5 und "Transgen" und "animal" im Adressfeld) nach 2000 im Titel Tab. 4: Anzahl der Publikationen, die nicht den Zielen der Studie entsprachen, aufgeschlüsselt nach den Gründen für ihre Ablehnung Anzahl aussortierter Grund für Aussortierung Pflanzen 11 3 Ort der Forschung außerhalb Deutschlands 84 Ort der Forschung nicht eindeutig zuzuordnen Forschung mit transgenen (z.B. Fütterungsversuch) Review-Artikel 4 3 In viiro Forschung mit transgenen Zellen; in vitro Herstellung transgener Zeillinien 105 Gesamtzahl Tab. 5: Anzahl der Publikationen, Veröffentlichung (2001-2003) aufgeschlüsselt nach dem Jahr der Jahr Gesamt Anzahl Publikationen 28 Tab. 6: Tierarten/Tiergruppen, wurde Tierart Publikationen deren Verwendung in den Publikationen beschrieben /Tiergruppe Anzahl Publikationen Tab. 7: Anzahl Publikationen, der in der weiterführenden freien Internetrecherche aufgeschlüsselt nach dem Jahr der Veröffentlichung Jahr Gesamt Anzahl Publikationen 25 Tab. 8: Tierarten/Tiergruppen, deren Verwendung freien Internetrecherche erfassten Publikationen Tierart erfassten (2001-2003) in den in der weiterführenden beschrieben wurde /Tiergruppe Anzahl Publikationen (sieben Publikationen), ISTPB / ISSHP (zwei Publikationen), Medline (zwölf Publikationen). Von diesen 28 Publikationen wurden sechs im Jahre 2001, 17 im Jahre 2002 sowie fünf im Jahre 2003 veröffentlicht (Tab. 5). In 20 Forschungsvorhaben wurde die Verwendung von Mäusen dargestellt, in drei Veröffentlichungen Ratten, in vier Veröffentlichungen Schweine sowie in einer Fische (Tab. 6). Um das Ergebnis dieser ersten Datenbankrecherche zu erweitern, wurde im Internet auf Webseiten, die für die jeweiligen Hauptautoren der erfassten 28 Publikationen relevant erschienen, nach weiteren, dem Suchprofil entsprechenden Publikationen gesucht. Dazu wurden die dort veröffentlichten Publikationslisten der Hauptautoren und gegebenenfalls weiterführende Links ausgewertet, Zudem wurde im .Porschungsportal" des Bundesforschungsministeriums(http://bserv3. n·zn.uni-hannover.de/fp/ index.html) mit dem Suchbegriff "transgen" nach weiterer Literatur gesucht. Nach DetailausALTEX 22, 4/05 ~ SAUER ET AL. --~-------------------------- wertung der so erfassten Publikationen konnten insgesamt 25 weitere Publikationen identifiziert werden, die den Zielen der Studie entsprachen. Von den 25 mittels freier Internetrecherche erfassten Publikationen wurden 14 im Jahre 2001, fünf im Jahre 2002 sowie sechs im 1ahre 2003 veröffentlicht (Tab. 7). Dabei wurde in 18 Publikationen die Verwendung von Mäusen dargestellt, in fünf Veröffentlichungen von Ratten, sowie in je einer Veröffentlichung Schweine und Fische (Tab. 8). Durchführung der Literaturrecherche - Phase 2 Da die Gesamtzahl 53 der im ersten Abschnitt der Literaturrecherche erfassten Publikationen (28 durch Datenbankrecherche sowie 25 durch freie Internetrecherche ) für die Belange der Studie als nicht aussagekräftig erachtet wurde, wurde eine zweite Recherchephase angeschlossen, in der die Suchbegriffe ausgehend von den Ergebnissen der ersten Recherchephase spezifiziert wurden: Anstelle des Suchbegriffs "animal" wurde für die vier ermittelten TierartenJTiergruppen, mit denen die beschriebenen Forschungsarbeiten durchgeführt worden waren, für Maus, Ratte, Schwein und Fisch getrennt Datenbankrecherchen durchgeführt. Nachdem in der ersten Phase der Datenbankrecherche die meisten relevanten Publikationen über die Datenbank "Medline" erfasst worden waren, wurde in der zweiten Phase zunächst ausschließlich eine Medline-Recherche (ME66; www.dimdi.de) durchgeführt. Hierzu wurden insgesamt elf Suchbegriffkombinationen ausgewählt (Tab. 9). Diese Suchbegriffe wurden so kombiniert, dass die Anzahl jeweils erfasster Publikationen nach Möglichkeit unter 100, auf jeden Fall aber unter 150 Treffern blieb. Dazu wurden in den Suchbegriffkombinationen die Suchbegriffe für Mäuse, Ratten und Schweine jeweils getrennt in der Singular- und Plural-Form eingegeben (pig/pigs; mouse/mice; rat/rats). Für Mäuse und Ratten wurden zudem die Recherchen für die einzelnen Jahrgänge 200 I, 2002 und 2003 getrennt durchge- Tab. 9: In Literaturrecherche 11(Medline; www.dimdi.de) sowie Anzahl hierbei erfasster Publikationen verwendete Suchbegriffe führt. Eine Gegenprobe durch Verknüpfung der Suchbegriffe in der Singularund Plural-Form sowie Verknüpfung der Jahrgänge 2001 bis 2003 (siehe Tab. 9, Zeile G und Zeile K) belegte, dass beide Suchstrategien zur gleichen Trefferanzahl führten. Mit den in Tabelle 9 aufgeführten Suchbegriffskombinationen wurden insgesamt 820 Publikationen erfasst. Diese Anzahl erschien ausreichend, einen Überblick über die Forschungsbereiche zu erhalten, in denen trans gene Tiere in den vergangenen Jahren hergestellt oder verwendet wurden. Daher wurden keine weiteren Recherchen in anderen Datenbanken oder frei im Internet durchgeführt. Auswahl der geeignete Publikationen Die erste inhaltliche Auswertung der 820 in der zweiten Phase der Literaturrecherche erfassten Fachartikel nach den im vorangegangenen Kapitel aufgeführten Kriterien ergab 568 relevante Publikationen. Somit wurden insgesamt 258 Veröf- und Suchbegriffskombinationen Versuchstier Suchbegriffskombination Anzahl Maus A ((mouse AND transgen?) AND CS="German"?) AND PY= 2001 to 2001 90 Ratte B ((mouse AND transgen?) AND CS="German"?) AND PY= 2002 to 2002 102 C ((mouse AND transgen?) AND CS="German"?) AND PY= 2003 to 2003 90 D (((mice NOT mouse) AND transgen?) AND CS="German"?) AND PY= 2001 to 2001 128 E (((mice NOT mouse) AND transgen?) AND CS="German"?) AND PY= 2002 to 2002 120 F (((mice NOT mouse) AND transgen?) AND CS="German"?) AND PY= 2003 to 2003 135 SummeA- F 665 G (((mouse OR mice) AND transgen?) 665 I (((rat OR rats) AND transgen?) AND CS="German"?) AND PY= 2002 to 2002 43 J (((rat OR rats) AND transgen?) AND CS="German"?) AND PY= 2003 to 2003 38 Summe H-J 130 AND CS="German"?) AND PY= 2001 to 2003 (((pig OR pigs) AND transgen?) AND CS="German"?) AND PY= 2001 to 2003 Summe Fisch AND PY=2001 to 2003 49 K (((rat OR rats) AND transgen?) Schwein AND CS="German"?) H (((rat OR rats) AND transgen?) AND CS="German"?) AND PY= 2001 to 2001 Schwein 130 17 17 ((fish AND transgen?) AND CS="German"?) AND PY= 2001 to 2003 8 Summe 8 Fisch Gesamt 820 CS = Corporate Source, Institution; Anschrift des Autors PY = Publication Year; Jahr der Veröffentlichung OR = Gesuchte Publikationen enthalten entweder den einen oder den anderen Suchbegriff. AND = Gesuchte Publikationen enthalten sowohl den einen als auch den anderen Suchbegriff. ALTEX 22, 4/05 249 m...... SAUER ET AL. -------------~- fentlichungen (30,7%) aussortiert. Für die einzelnen Tierarten/Tiergruppen lag diese Rate jeweils zwischen 19,3 und 75,0% (Tab. 10). Da insgesamt neun Publikationen in Phase 1, nicht aber in Phase 2 der Literaturrecherche erfasst wurden, wurden diese zusätzlicf zu den 56~ Publikationen der Phase 2 der Literaturrecherche in die Auswertung aufgenommen, so dass insgesamt 577 relevante Publikationen ausgewertet wurden. Tab. 10: Anzahl Auswertung der erfassten Such begriff Publikationen vor und nach der inhaltlichen Anzahl Publikationen vor Auswertung Anzahl Publikationen nach Auswertung Ausfallquote Fisch Fish 8 2 75,0% Schwein Pig & Pigs 17 4 64,7% Ratte Rat & Rats 130 59 54,6% Maus Mouse '01 90 70 22,2% Mouse '02 102 74 27,5% Mouse '03 90 72 20,0% Mice '01 128 96 25,0% Mice '02 120 82 31,7% Mice '03 135 109 19,3% 820 568 30,7% Summe Anmerkung: Die Anzahl der mit den Suchbegriffen erfassten Publikationen stimmt nicht notwendigerweise mit der Anzahl der Publikationen, in denen bestimmte Tierarten verwendet wurden, überein, da beispielsweise die Publikationen, in denen transgene Kaninchen verwendet wurden, über den Suchbegriff "Rat & rats" (siehe Seite 53) erfasst wurden. Anhang 2 Auswertung der 577 erfassten Publikationen aus den Jahren 2001-2003 Forschungsvorhaben mit transgenen Tieren in Deutschland Die 577 erfassten Publikationen (siehe Anhang 1) wurden inhaltlich nach den Angaben Autor, Titel und Quelle der Publikation sowie Institution der Autoren aufbereitet (siehe Anhang 3 auf der Webseite www.altex.ch/archivdownload_d.htm). Zusätzlich wurde verzeichnet, mit welcher Tierart oder Tiergruppe das Forschungsvorhaben durchgeführt worden war, und der Verwendungszweck der Tiere (Herstellung transgener Tiere oder Einsatz transgener Tiere im Versuch) wurde ermittelt. Schließlich wurde jede Publikation inhaltlich einer oder mehreren Forschungsgebietskategorien zugeteilt. Diese Aufschlüsselung erfolgte übergreifend für alle Tierarten sowie für die verschiedenen Tierarten getrennt. Bei der Auswertung nach Art der Versuchsdurchführung der experimentellen Forschungsvorhaben wurde verzeichnet, ob in vitro Verfahren anstelle von oder zusätzlich zu den in vivo Verfahren verwendet wurden, oder ob Wildtyp-Zuchtstämmen nach der Geburt trans genes Material eingebracht worden war. Die Angaben zur Institution des Autors oder der Autoren wurden nicht weiter ausgewertet. Diese Informationen waren nur erfasst worden, um zu ermitteln, ob 250 die Forschungsvorhaben in Deutschland durchgeführt worden waren, während sich die Inhalte der Studie darauf richteten, Forschungsschwerpunkte mit transgenen Tieren zu identifizieren und nicht wissenschaftliche Institutionen, die mit transgenen Tieren arbeiten, namentlich zu benennen. Jahr der Veröffentlichung der Publikationen sowie Tierarten Von den 577 Publikationen waren 195 im Jahre 2001 publiziert, 185 im Jahre 2002 sowie 197 im Jahre 2003 (Tab. 11). In den meisten Publikationen (503; 87,2%) wurden Forschungsvorhaben mit Mäusen dargelegt, gefolgt von solchen mit Ratten (59; 10,3%). In sieben Fällen wurde die Verwendung von Schweinen beschrieben, zweimal die Verwendung von Fischen und zweimal von Kaninchen. Zusätzlich zu den 503 Publikationen über Forschungsvorhaben mit Mäusen wurde zweimal von der gleichzeitigen Verwendung von Mäusen und Ratten und einmal von der gleichzeitigen Verwendung von Mäusen und Hühnern berichtet (Tab.12). Bei den in den Versuchsvorhaben eingesetzten Fischen handelte es sich ein- über mal um Zebrafische (Danio rerio) und einmal um Reiskärpflinge (Medaka oryzias latipes). Die beiden Publikationen über Versuche mit trans genen Kaninchen wurden über den Suchbegriff "Ratte" erfasst, im einen Fall, da die transgenen Kaninchen Gene der Ratte erhalten hatten und im andern, da im selben Versuch Zellen der Ratte verwendet wurden, Verwendungszweck der Versuchstiere In der Auswertung wurde unterschieden, ob in der jeweiligen Publikation die Herstellung einer transgenen Tierlinie bzw. Methoden zur Herstellung transgener Tiere beschrieben wurden, ob dargelegt wurde, dass trans gene Tiere gezielt für den Versuch hergestellt und anschließend verwendet wurden, oder ob der Einsatz transgener Tiere in einem Versuchsvorhaben dargestellt wurde. Entsprechend wurden die Publikationen den Begriffen "Herstellung", "Herstellung und Versuch" sowie "Versuch" zugeordnet. In 37 der 577 Publikationen (6,4%) wurde die Herstellung transgener Tiere bzw, Methoden zur Herstellung transgener Tiere dargelegt. In 134 (23,2%) ALTEX 22, 4/05 ~ -~----------------- Publikationen wurden transgene Tiere für das Forschungsvorhaben hergestellt und verwendet. 406 (70,4%) Publikationen beschrieben experimentelle Vorhaben, bei denen transgene Tiere zum Einsatz kamen (Tab. 13). Forschungsgebiete, in denen die in den Publikationen dargelegten Forschungsvorhaben durchgeführt wurden Zur Einteilung der Publikationen in Forschungsgebiete wurden alle Publikationen einem oder mehreren Kategorien zugeordnet. Experimentelle Forschungsvorhaben ("Herstellung und Versuch" oder "Versuch") wurden den folgenden Forschungsgebieten zugeordnet: Dermatologie, Diabetologie, Embryologie/Reproduktionsbiologie, Endokrinologie (ohne Diabetologie), Gastroenterologie (ohne Hepatologie), Genetik, Hämatologie, Hepatologie, Kardiologie, Immunologie, Nephrologie, Neurobiologie, Onkologie, Ophthalmologie, Orthopädie, Transplantationsmedizin (inkl. Xenotransplantationsforschung) , Zellbiologie . Die Forschungsvorhaben, in denen transgene Tierlinien hergestellt oder Tierversuche zur Weiterentwicklung von Methoden zur Herstellung transgener Tiere dargelegt wurden, wurden nicht weiter aufgeschlüsselt, sondern alle der Kategorie "Methodik" zugeordnet. Die Zuordnung der Publikationen zu Kategorien erfolgte in der Regel mit Hilfe der in den Datenbanken verfügbaren Schlagwörter (keywords) und Zusammenfassungen (abstracts). Um eine korrekte Zuordnung zu den Kategorien sicherzustellen, wurden die so verfügbaren Informationen bei Bedarf durch weitere kostenfrei im Internet verfügbare Informationen, wie Volltexte von Veröffentlichungen oder Präsentationen von Arbeitsgruppen, ergänzt. Die meisten Forschungsvorhaben waren den Forschungsgebieten Neurobiologie (154/26,7%) zuzuordnen, sowie Immunologie (115/19,9%), Kardiologie (80/13 ,9%), Embryologie/Reproduktionsmedizin (62110,8%) und Onkologie (41/7,1 %). Zwischen 10 und 40 Publikationen wurden den Forschungsgebieten Endokrinologie, Genetik, Hepatologie oder Nephrologie zugeordnet bzw. beschrieben die Herstellung transgener ALTEX 22, 4/05 SAUER ET AL. Tab. 11: Gesamtzahl der Publikationen, Veröffentlichung (2001-2003) aufgeschlüsselt nach dem Jahr der Jahr Gesamt Anzahl Publikationen 577 Tab. 12: Anzahl der Publikationen, aufgeschlüsselt nach TierartlTiergruppe TierartlTiergruppe Anzahl Maus 504 87,4% Maus & Ratte 2 0,3% Maus & Huhn 1 0,2% Ratte 59 10,3% Schwein 7 1,2% Fisch 2 0,3% Kaninchen 2 0,3% Gesamt 577 1000 % Publikationen Relative Anzahl Tab. 13: Zuordnung der Publikationen zum Verwendungszweck der Tiere (Versuch M mit transgenen Tieren bzw. Herstellung (H) transgener Tiere), aufgeschlüsselt nach dem Jahr Jahr Herstellung Herstellung Versuch Gesamt 2001 11 46 138 195 2002 11 39 135 185 2003 15 49 133 197 Gesamt 37 6,4% 134 406 577 23,2% 70,4% 100% Relativer Anteil & Versuch Tab.14: Anzahl der Publikationen, aufgeschlüsselt sowie der zugeteilten Forschungsgebietskategorie, nach dem Jahr der Publikation alle Tierarten Tabelle - Alle Tierarten Jahr der Publikation 2001 2002 2003 Gesamt Relative Anzahl Forschungsgebietskategorie Dermatologie 1 2 3 6 1,0% Diabetologie 3 1 3 7 1,2% Embryologie/ Reproduktionsmedizin 23 23 16 62 10,8% Endokrinologie 5 4 3 12 Gastroenterologie 3 4 1 8 2,1% 1,4% Genetik 5 5 1 11 1,9% Hämatologie 1 2 0 3 0,5% Hepatologie 1 3 7 11 1,9% Immunologie 42 31 42 115 19,9% Kardiologie 27 26 27 80 13,9% 6,4% Methodik 10 10 17 37 Nephrologie 4 5 2 11 1,9% Neurobiologie 45 47 62 154 26,7% Onkologie 15 15 11 41 7,1% Ophthalmologie 4 1 0 5 0,9% Orthopädie 2 2 0 4 0,7% Transplantationsmedizin* 4 3 0 7 1,2% Zellbiologie 0 1 2 3 0,5% Gesamt 195 185 197 577 100% * einschließlich Xenotransplantationsforschung 251 SAUER ET AL. ~ ----------------------------------------~--- Tierlinien oder Methoden zur Herstellung transgener Tiere (Methodik). Weniger als 10 Publikationen wurden den Forschungsgebieten Dermatologie, Diabetologie, Gastroenterologie, Hämatologie, Ophthalmologie, Orthopädie, Transplantationsmedizin und Zellbiologie zugeordnet (Tabs 14). Eine ähnliche Verteilung der Zuordnungen zu Forschungsgebietskategorien konnte ebenfalls bei der tierartspezifischen Zuordnung der Versuche an Mäusen festgestellt werden (Tab. 15). Rund die Hälfte der Versuche mit transgenen Ratten wurden dem Forschungsgebiet Kardiologie zugeordnet, 20,3% dem Forschungsgebiet Neurobiologie. Einzelne Publikationen betrafen die Forschungsgebiete Endokrinologie, Gastroenterologie, Hepatologie, Immunologie, Nephrologie, Onkologie, Ophthalmologie und Orthopädie, oder behandelten Arbeiten, in denen transgene Tiere hergestellt bzw. Methoden zur Herstellung transgener Tiere erforscht wurden (Tab. 16). In den beiden Versuchen mit Kaninchen waren hepatologische bzw. kardiologische Fragestellungen verfolgt worden. In den beiden Forschungsvorhaben mit Fischen wurden methodische Arbeiten dargelegt (Tab. 18 und 19). Sechs der sieben Versuche mit trans genen Schweinen waren dem Gebiet der Transplantationsmedizin zuzuordnen und behandelten alle Vorhaben aus der Xenotransplantationsforschung. In einer weiteren Publikation wurden methodische Arbeiten dargelegt (Tab. 17). Zuordnung der Publikationen zu weiteren Forschungsgebietskategorien Durch Zuordnung der Publikationen zu einer zweiten oder gegebenenfalls zu mehreren weiteren Kategorien konnten deren Forschungsinhalte teilweise detaillierter aufgeschlüsselt werden. Wenn beispielsweise eine Publikation der Kategorie Neurobiologie und der Unterkategorie Immunologie zugeteilt wurde, war mit dem Forschungsvorhaben primär ein neurobiologisches Forschungsziel verfolgt worden, das jedoch auch immunologische Inhalte hatte. Hingegen lag bei einem Forschungsvorhaben, das der Kategorie Immunologie und der Unter252 Tab. 15: Anzahl Publikationen über Versuche mit Mäusen, aufgeschlüsselt dem Jahr der Publikation sowie der zugeteilten Forschungsgebietskategorie nach Tabelle Maus Jahr der Publikation 2001 2002 2003 Gesamt Relative Dermatologie 1 2 3 6 Diabetologie 3 1 3 7 1,2% 1,4% Embryologie/ Reproduktionsmedizin 23 23* 16 62 12,2% Endokrinologie 3 2 3 8 1,6% Anzahl Forschungsgebietskategorie Gastroenterologie 2 3 1 6 1,2% Genetik 5** 5 1 11 2,1% Hämatologie 1 2 0 3 0,6% Hepatologie 1 2 5 8 1,6% Immunologie 42 30 42 114 22,5% Kardiologie 11 16 23 50 9,8% Methodik 9 8 13** 30 5,9% Nephrologie 4 3 2 9 1,8% Neurobiologie 41 44 57 142 28,0% Onkologie 15 14 11 40 7,9% Ophthalmologie 4 0 0 4 0,8% Orthopädie 2 1 0 3 0,6% Transplantationsmedizin 1 0 0 1 0,2% Zellbiologie 0 1 2 3 0,6% Gesamt 168 157 182 507## 100% • In einem Versuch mit gleichzeitiger Verwendung von Maus und Huhn ••In einem Versuch mit gleichzeitiger Verwendung von Maus und Ratte ## In zwei Versuchen gleichzeitige Verwendung von Maus und Ratte sowie in einem Versuch gleichzeitige Verwendung von Maus und Huhn Tab. 16: Anzahl der Publikationen über Versuche mit Ratten, aufgeschlüsselt dem Jahr der Publikation sowie der zugeteilten Forschungsgebietskategorie nach Tabelle Ratte Jahr der Publikation 2001 2002 2003 Gesamt Relative Anzahl Forschungsgebietskategorie Endokrinologie 2 2 0 4 Gastroenterologie 1 1 0 2 6,8% 3,4% Hepatologie 0 0 2 2 3,4% Immunologie 0 1 0 1 1,7% Kardiologie 15 10 4 29 49,1% Methodik 0 2 2 4 Nephrologie 0 2 0 2 6,8% 3,4% 20,3% Neurobiologie 4 3 5 12 Onkologie 0 1 0 1 1,7% Ophthalmologie 0 1 0 1 1,7% Orthopädie 0 1 0 1 1,7% Gesamt 22 24 13 59 100% Tab. 17: Anzahl der Publikationen über Versuche mit Schweinen, aufgeschlüsselt nach dem Jahr der Publikation sowie der zugeteilten Forschungsgebietskategorie Tabelle Schwein Jahr der Publikation 2001 2002 2003 Gesamt Forschungsgebietskategorie Methodik 0 0 1 1 Transplantationsmedizin* 3 3 0 6 Gesamt 3 3 1 7 •Alle Xenotransplantationsforschung ALTEX 22, 4/05 ~ SAUER ET AL. -~------------- kategorie Neurobiologie, zugeordnet worden war, das Forschungsziel primär auf immunologischen Inhalten. Publikationen wurden somit nicht doppelt erfasst. Nachfolgend werden alle Forschungsgebietskategorien, zu denen mindestens 40 Publikationen erfasst wurden (Embryologie/Repreduktionsmedizin, Immunologie, Kardiologie, Neurobiologie und Onkologie), aufgeschlüsselt nach zusätzlich zugeteilten Forschungsgebietskategorien dargestellt. Fast 60% der Publikationen der Fachgebietskategorie Embryologie/Reproduktionsmedizin wurden keiner weiteren Fachgebietskategorie zugeordnet. 14,5 % wurden zusätzlich der Neurobiologie zugeordnet und je knapp 5% den Kategorien Kardiologie und Ophthalmologie (Tab. 20). Fast 80% der Publikationen der Immunologie wurden keiner weiteren Fachgebietskategorie zugeordnet; 5,2% und 3,5% wurden zusätzlich den Kategorien Onkologie bzw. Gastroenterologie zugeordnet (Tab. 21). Rund 60% der Publikationen der Kardiologie wurden keiner weiteren Kategorie zugeordnet, 30,0% zusätzlich der Kategorie Endokrinologie sowie 6,2% zusätzlich den Kategorien Endokrinologie und Nephrologie. Fast alle Forschungsvorhaben der Kategorie Kardiologie, die der Unterkategorie Endokrinologie zugeordnet wurden, sowie alle Forschungsvorhaben, die den Unterkategorien Endokrinologie und Nephrologie zugeordnet wurden, wurden mit transgenen Ratten durchgeführt (Tab. 22). Fast 80% der Publikationen aus der Fachgebietskategorie Neurobiologie wurden keiner weiteren Kategorie zugeordnet, jeweils knapp 10% zusätzlich der Embryologie und Immunologie (Tab. 23). Knapp die Hälfte der Publikationen, die in die Fachgebietskategorie Onkologie eingeteilt wurden, wurde keiner weiteren Kategorie zugeordnet. 22% wurden zusätzlich in die Kategorie Immunologie eingeteilt und knapp 15% in die Dermatologie (Tab. 24). Tab. 18: Anzahl der Publikationen über Versuche mit Kaninchen, aufgeschlüsselt nach dem Jahr der Publikation sowie der zugeteilten Forschungsgebietskategorie Tabelle Kaninchen Jahr der Publikation 2002 2003 Gesamt 1 Hepatologie 0 1 0 Kardiologie 1 0 0 1 Gesamt 1 1 0 2 Tab. 19: Anzahl der Publikationen über Versuche mit Fischen, aufgeschlüsselt dem Jahr der Publikation sowie der zugeteilten Forschungsgebietskategorie nach Tabelle Fisch Jahr der Publikation 2001 2002 2003 Gesamt Methodik 1 0 1 2 Gesamt 1 0 1 2 Forschungsgebietskategorie Tab. 20: Publikationen der Kategorie "Embryologie/Reproduktionsmedizin" (E), aufgeteilt nach Zuordnung zu weiteren Unterkategorien sowie dem Jahr der Publikation Jahr der Publikation 2001 2002 2003 Gesamt Relative 59,7% Anzahl Forschungsgebietskategorie Nur Embryologie/ Reproduktionsmedizin 15 12 10 37 E + Endokrinologie 1 0 0 1 1,6% E + Gastroenterologie 0 0 1 1 1,6% E + Genetik 0 2 0 2 3,2% E + Immunologie 2 0 0 2 3,2% 4,9% E + Kardiologie 1 1 1 3 E + Neurobiologie 3 4 2 9 14,5% E + Ophthalmologie 0 2 1 3 4,9% E + Orthopädie 0 2 0 2 3,2% 1,6% E + Orthopädie Endokrinologie + 1 0 0 1 E + Transplant.-Medizin 0 0 1 1 1,6% Gesamt 23 23 16 62 100,0% Tab. 21: Publikationen der Kategorie Immunologie (I), aufgeteilt zu weiteren Unterkategorien sowie dem Jahr der Publikation nach Zuordnung 2001 2002 2003 Gesamt Relative Nur Immunologie 34 24 32 90 78,4% I + Dermatologie 1 1 0 2 1,7% Jahr der Publikation Anzahl Forschungsgebietskategorie I + Embryologie/ Reproduktionsmedizin 1 1 0 2 1,7% I + Endokrinologie 1 0 1 2 1,7% I + Gastroenterologie 2 1 1 4 3,5% I + Hepatologie 0 0 3 3 2,6% I + Kardiologie 0 0 2 2 1,7% I + Methodik 1 1 0 2 1,7% I + Neurobiologie 0 0 1 1 0,9% I + Onkologie 1 3 2 6 5,2% I + Onkologie Dermatologie Gesamt ALTEX 22, 4/05 2001 Forschungsgebietskategorie + 1 0 0 1 0,9% 42 31 42 115 100,0% 253 m.... SAUER ET AL. -------------~- Art der Versuchsdurchführung der experimentellen Forschungsvorhaben Tab. 22: Publikationen der Kategorie Kardiologie (K), aufgeteilt zu weiteren Unterkategorien sowie dem Jahr der Publikation Jahr der Publikation nach Zuordnung 2001 2002 2003 Gesamt Relative Nur Kardiologie K + Embryologie/ 12 15 20 47* 58,7% Reproduktionsmedizin 0 0 1 1 1,3% K + Endokrinologie 14 9 1 24** 30,0% Anzahl Forschungsgebietskategorie Weiterverwendung von Material transgener Tiere für in vitro Verfah~en Zur Einteilung der Publikationen in die Art der Versuchsdurchführung der experimentellen Forschungsvorhaben I wurde aufgeschlüsselt, ob transgene Tiere in Tierversuchen im Sinne des Tierschutzgesetzes eingesetzt, oder ob Zellen, Gewebe oder Organe transgener Tiere für in vitro Versuche weiterverwendet wurde. In 501 der 577 Publikationen ergaben die im Internet verfügbaren Informationen, dass in den Forschungsvorhaben transgene Tiere in Tierversuchen eingesetzt wurden. In vier Publikationen blieb nach Auswertung aller kostenfrei verfügbarer Informationen unklar, ob die Versuche in viva oder in vitro unter Verwendung von Zellen transgener Tiere durchgeführt worden waren. In 72 Publikationen wurden Forschungsvorhaben, bei denen Material transgener Tiere in vitro weiterverwendet wurde, beschrieben (Tab. 25). Dabei wurde in elf Publikationen dargelegt, dass in vitro Gewebekulturen transgener Tiere, wie beispielsweise Hirnschnitte oder Herzvorhöfe verwendet wurden, sowie in neun Publikationen in vitro Organkulturen transgener Tiere, bei denen es sich überwiegend um isolierte Herzen handelte. In 45 Publikationen wurde die in vitro Verwendung von Zellen transgener Tiere beschrieben sowie in drei Publikationen die in vitro Verwendung von Zellen und Geweben transgener Tiere. In vier Publikationen wurde sowohl ein in viva Versuch auch die in vitro Verwendung von Zellen transgener Tiere beschrieben. Forschungsvorhaben, in denen Tieren nach der Geburt transgenes Material eingebracht wurde In der Auswertung der Publikationen wurde gesondert verzeichnet, ob in den Forschungsvorhaben Wild typ- Tieren nach der Geburt transgenes Material eingebracht wurde, also keine gentechnischen Eingriffe in das Keimzellgenom 254 K + Endokrinologie + Nephrologie 1 2 2 5*** 6,2% K + Immunologie 0 0 1 1 1,3% K + Neurobiologie 0 0 1 1 1,3% K + Zellbiologie 0 0 1 1 1,3% Gesamt 27 26 27 80 100,0% * Drei Forschungsvorhaben mit Ratten 21 Forschungsvorhaben mit Ratten sowie ein Forschungsvorhaben *** Alle Forschungsvorhaben mit Ratten H mit Mäusen und Ratten Tab. 23: Publikationen der Kategorie Neurobiologie (N), aufgeteilt zu weiteren Unterkategorien sowie dem Jahr der Publikation Jahr der Publikation nach Zuordnung 2001 2002 2003 Gesamt Relative Nur Neurobiologie 32 37 49 118 77,1% N + Diabetologie 1 0 0 1 0,7% N + Embryologie/ Reproduktionsmedizin 5 4 6 15 9,8% N + Endokrinologie 0 3 1 4 2,6% N + Immunologie 7 2 5 14 9,1% Anzahl Forschungsgebietskategorie N + Nephrologie 0 0 1 1 0,7% Gesamt 45 46 62 153 100,0% Tab. 24: Publikationen der Kategorie Onkologie (0), aufgeteilt zu weiteren Unterkategorien sowie dem Jahr der Publikation Jahr der Publikation 2001 2002 2003 nach Zuordnung Gesamt Relative Anzahl Forschungsgebietskategorie Nur Onkologie 9 5 6 20 48,8% o + Dermatologie o + Endokrinologie o + Gastroenterologie o + Hepatologie o + Immunologie o + Neurobiologie 2 2 2 6 0 1 0 1 14,6% 2,4% Gesamt 15 0 2 1 3 0 1 0 1 4 4 1 9 0 0 1 1 22,0% 2,4% 41 100,0% erfolgt waren. In den meisten derartigen Versuchen wurden transgene Zellen in bestimmte Gewebe der Tiere injiziert. Bei den entsprechend verwendeten transgenen Zellen wurde nicht weiter differenziert, ob diese in vitro hergestellt oder transgenen Tieren entnommen worden waren. In 22 Publikationen wurde dargelegt, dass transgenes Material in Tiere von Wildtyp-Zuchtstämmen eingebracht wurde. In einer dieser Publikationen 15 11 7,3% 2,4% wurde beschrieben, dass Ratten transgene embryonale Stammzellen der Maus injiziert wurden sowie in einem Forschungsvorhaben Wildtyp-Mäusen Plasmide (Tab. 26). Da Publikationen, in denen in vitro gentechnologische Methoden entwickelt oder in vitro transgene Zelllinien hergestellt wurden, nicht als für die Belange der Studie relevant erachtet wurden, beinhalteten alle Publikationen, die dem Verwendungszweck "Herstellung" zugeordnet wurden, in vivo-Forschungsvorhaben. 1 ALTEX 22,4/05 ~ SAUER ET AL. ---~--------------------------------------- Tab. 25: Art der Versuchsdurchführung (mit oder ohne vorheriger Herstellung Art der Versuchs durchführung bei den Publikationen, dieser Tiere) eingesetzt Organkultur Gewebekultur in denen dargestellt worden waren ZelIkultur wurde, dass transgene Zell- und Gewebekultur In vivo und in vitro Tiere Gesamt In vitro / in vivo unklar 0 Fachgebietskategorie Dermatologie 0 0 1 0 0 1 Embryologie/Reprod.-Medizin 0 2 3 0 1 6 0 Endokrinoloqiee 0 0 1 0 0 1 0 Gastroenterologie 1 0 0 0 0 1 0 Genetik 0 0 1 0 0 1 0 Hämatologie 0 0 0 0 0 0 1 Immunologie 0 0 20 0 2 22 3 Kardiologie 2 7 5 0 0 14 0 Neurobiologie 8 0 12 3 1 24 0 Onkologie 0 0 2 0 0 2 0 Gesamt 11 9 45 3 4 72 4 Tab. 26: Zuordnung der 22 Publikationen, in denen dargelegt wurde, transgenes Material in Tiere von Wildtyp-Zuchtstämmen eingebracht Fachgebietskategorie Fachgebietskategorie Einbringen Dermatologie 1 Hepatologie 2* Immunologie 6** Kardiologie 2*** Neurobiologie 6* Onkologie 2 Ophthalmologie 1* Orthopädie 2** Gesamt 22 transgenen Materials dass wurde, zur in Wildtyp- Tiere * Alle Publikationen behandelten Versuche mit Ratten Eine Publikation behandelte Versuche mit Ratten •••Eine Publikation behandelte Versuche mit Kaninchen H Glossar FachbegriHe aus dem Gebiet der Genetik und Gentechnologie Blastozysten Frühembryonales Stadium, bei dem der Embryo aus einer kugelförmigen Inneren einen flüssigkeitsgefüllten DNA Desoxyribonu- Biochemischer kleinsäure den "Buchstaben" Cre-Iox Begriff für den Bestandteil Die Cre-Iox-Technik gentechnische Zeitpunkt des charakteristischen ist eine bestimmte Veränderung der Entwicklung Embryonale Embryonale differenzieren). von Zellen besteht, die im von Genen. Die DNA besteht aus einzelnen Nucleotiden (s.d.), "Gen-Alphabets". Technik zur Herstellung nur in einem bestimmten des Körpers auszulösen. Tiere erzeugt werden, die dann miteinander Stammzellen Ansammlung Hohlraum umschließen. transgener Tiere, bei der versucht wird, die Organ des Körpers oder erst ab einem bestimmten Hierzu müssen zunächst zwei verschiedene Zellen, die noch die Fähigkeit haben, sich in alle Arten von Körperzellen dessen Information Arten transgener gekreuzt werden. das bestimmte zu entwickeln (zu Expression, Damit der Eiweißstoff, exprimieren muss das Gen "abgelesen", d. h. exprimiert werden. Dieser Vorgang heißt Expression (siehe mRNA, messenger RNA). Gen enthält, von der Zelle gebildet werden kann, Gen Die kleinste funktionelle Einheit des Erbgutes. Jedes Gen hat eine charakteristische beinhaltet so die Information für die Bildung eines ganz bestimmten Eiweißstoffes Sequenz von Nucleotiden (siehe auch Expression und und mRNA, messen ger RNA). Genetik Die Lehre von den Genen Genom Die Gesamtheit ALTEX 22, 4/05 des Erbgutes, das sich in der Zelle in Form der DNA (s.d.) im Zellkern befindet. 255 SAUER ET AL. ~ -------------~- Heterozygot Gemischterbig. Jede Erbinformation gemischterbigen (z.B, blond / braunhaarig). bestimmten Homozygot genetischen farbe) zwei identische des Körpers liegt in der Zelle doppelt vor. In der (z.B. Haarfarbe) zwei unterschiedliche Welche dieser beiden Informationen dann tatsächlich ausgeprägt Informationen vor wird, hängt von Regeln ab. Reinerbig (siehe auch heterozygot). "blond" zu jeder Eigenschaft Form liegen somit zu einer Eigenschaft In der reinerbigen Informationen Form liegen zu einer bestimmten vor (z.B. blond / blond). Demzufolge Eigenschaft (z.B. Haar- wird auf jeden Fall die Eigenschaft ausgeprägt. Knock-out Ein Gen wird gentechnisch Kodieren Jedes Gen "kodiert" aufgebaut ausgeschaltet, einen bestimmten indem es beispielsweise Eiweißstoff, zerstört oder ausgeschnitten d. h. es beinhaltet die Information, wird. wie der Eiweißstoff werden muss. Mikroinjektion Einimpfen mit mikroskopisch mRNA messenger RNA Schlüsselmolekül, das während der Expression eines Gens die Bildung des zugehörigen Proteins veranlasst: Die so genannte messenger RNA (Boten-RNA) wird im Zuge der Transkription (s.d), als Spiegelbild der jeweiligen DNA-Nucleotid-Sequenz Zell bestandteilen, kleiner Kanüle an der DNA gebildet. Anschließend Translation durch Ablesen der mRNA Eiweißstoffe Nucleotide Die Bausteine der DNA, die als "Buchstaben" alle Eiweißstoffe Plasmide wandert die mRNA vom Erbgut zu den die für die Bildung der Eiweißstoffe verantwortlich Dort werden im Zuge der des "Gen-Alphabets" im Erbgut die Kodierung der Baupläne für des Körpers ermöglichen. Gene, die in Bakterien außerhalb des eigentlichen Erbgutes vorkommen. befallen, können die Plasmide in das Erbgut dieses Organismus Gentechnologie sind (Ribosomen). gebildet. genutzt, wenn Gene mittels Plasmiden Wenn die Bakterien einen Organismus eingebaut werden. Diese Eigenschaft übertragen Rekombination Die Um lagerung der Erbinformation Transgen Das fremde Gen, das übertragen Transfektion Einbringen fremder Gene in eine Zelle, ohne dass diese in das Genom der Zelle eingebaut werden. Transformation Umwandlung Transkription Der erste Schritt während der Expression von Genen die Bildung von mRNA, Transkriptionsfaktor Stoff, der die Transkription Translation - die Änderung wird in der werden sollen. in Rahmen der Zellteilungsvorgänge werden soll. genetischer Eigenschaften durch Aufnahme fremder Gene in das Genom der Zelle. .rnessenqer RNA" an der DNA. (s.o.) vermittelt. Der zweite Schritt während der Expression von Genen: das Ablesen der mRNA während der Bildung von Eiwei ßstoffen Sonstige Fachbegriffe Aminosäure Baustein für Eiweiße Amyloid Eiweißkörper, Dermatologie Die Lehre von der Funktion der Haut Diabetologie Die Lehre von der Zuckerkrankheit Embryologie Die Lehre von der Entwicklung die bei bestimmten Krankheiten entstehen und sich in den Geweben bestimmter Diabetes von Embryonen Endokrinologie Die Lehre von der Funktion von Hormonen Enzyme Spezifische Gastroenterologie Die Lehre von der Funktion des Magen-Darm-Traktes Fermentstoffe, die jeweils bestimmte Hämatologie Die Lehre von der Funktion des Blutes Hepatologie Die Lehre von der Funktion der Leber Immunologie Die Lehre von der Funktion des Abwehrsystems In vitro "Im Reagenzglas", In vivo "Im lebenden Organismus", Kardiologie Die Lehre von der Funktion des Herzens Nephrologie Die Lehre von der Funktion der Nieren biochemische Vorgänge in der Zelle vermitteln. d. h. in Zellkultur etc. d. h. im Tierversuch Neurobiologie Die Lehre von der Funktion des Nervensystems Onkologie Die Lehre von der Krebsentstehung Ophthalmologie Die Lehre von der Funktion des Auges Orthopädie Die Lehre von der Funktion des Bewegungsapparates Reproduktionsbiologie Die Lehre von der Funktion des Fortpflanzungssystems Rezeptor Oberflächenstruktur auf Zellen, an der sich jeweils im Schlüssel-Schloss-Prinzip Xenotransplantation Die Transplantation (Einpflanzung, Zellzyklus Der Rhythmus, Zykline Botenstoffe, 256 Organe ablagern. Übertragung) tierartfremder in dem sich die Zellen teilen, wobei sie verschiedene die von Zellen gebildet und ausgeschüttet bestimmte Stoffe anlagem können. Organe Stadien durchlaufen. werden und die Reaktionen anderer Zellen beeinflussen. ALTEX 22, 4/05 ~ --~-------------------------- Techniken zur Veränderung des Keimzellgenoms von Wirbeltieren SAUER ET AL. 1 Mikroinjektionsmethode Hierfür werden befruchtete Eizellen zuvor getöteter "Spendertiere" verwendet, in denen sich die Zellkerne des Spermiums noch nicht mit denen der Eizelle vereinigt haben. Die zu übertragende DNA wird in einen dieser so genannten Vorkerne übertragen. Zur Überprüfung, ob die Eizellen diese Manipulation überlebt haben, wird in Zellkultur abgewartet, ob sie sich weiter teilen, bevor anschließend diese so genannten Zweizell-Zygoten in Ammentiere übertragen werden. Nach BMVEL, 1996, überleben ca. 50% der Zygott'n die Mikroinjektion, ca. 10-30% der in die Ammentiere übertragenen Zygoten entwickeln sich bis zur Geburt weiter und die überlebenden Nachkommen sind mit einer Wahrscheinlichkeit zwischen 4 und 25% transgen. Bei 0-75% der transgenen Tiere wurde das fremde Gen nicht nur in das Keimzellgenom eingebaut, sondern es wird auch exprimiert. Bei dieser Technik kann nicht beeinflusst werden, an welcher Stelle im Erbgut der Eizelle die DNA eingebaut wird und ob somit beispielsweise Teile des Erbgutes der Eizelle durch Einbringen des trans genen Materials zerstört werden. Reinerbig sind transgene Tiere erst, wenn gemischterbige Tiere untereinander gekreuzt werden und diese Tiere für Zuchtlinien weiter verwendet werden. Der Nachweis, welche Tiere das fremde Gen in der gewünschten Weise in ihr Erbgut eingebaut haben, ist sehr zeitaufwändig und benötigt eine große Zahl an Tieren. DNA-Übertragung in embryonale Stammzellen sowie deren anschließende Injektion in Blastozysten Bei dieser bislang nur für die Maus etablierten Technik wird die DNA zunächst in embryonale Stammzellen eingebracht, das heißt in Embryozellen, die noch die Fähigkeit haben, sich in alle Arten von Körperzellen weiterzuentwickeln. Anschließend werden mit speziellen Techniken die Stammzellen ausgewählt, die das transgene Material an der gewünschten Stelle eingebaut haben, und in so genannte Blastozysten (sehr frühes Embryonalstadium, bei dem der Embryo lediglich aus einer .Zellkugel" besteht) eingebracht. Daraus können sich nach Übertragung in Ammentiere Tiere entwickeln, die das trans gene Material in Keim- und Körperzellen eingebaut haben. Bei einem Teil der transgenen Tiere können wiederum die gewünschten Gene exprirnieren. Kombinierte Verfahren (beispielsweise Cre-Iox-Technik) Das Ziel der kombinierten Verfahren, wie der Cre-lox-Technik, ist es, Veränderungen des Erbgutes entweder nur in einem bestimmten Körpergewebe herbeizuführen oder sicherzustellen, dass diese erst zu einem bestimmten Zeitpunkt in der Entwicklung des Tieres in Wirkung treten. Hierfür benötigt man zwei Linien transgener Tiere: Mittels Mikroinjektion (s.o.) werden transgene Tiere hergestellt, die das so genannte Enyzm "cre-Rekombinase" nur in einem bestimmten Körpergewebe oder zu einem bestimmten Entwicklungszeitpunkt bilden (da das diesbezügliche Gen nur dort oder nur zu dem bestimmten Zeitpunkt exprimiert). Mittels DNA-Übertragung in embryonale Stammzellen sowie anschließender Injektion in Blastozysten (s.o.) werden transgene Tiere hergestellt, die das Gen der Tiere, das untersucht werden soll, durch die so genannte Ioxl--Geneequenz einschließen. Anschließend werden diese beiden Tierlinien gekreuzt. Da das Enyzm "cre-Rekombinase" gezielt Genstücke, die zwischen loxlvSequenzen liegen, ausschneidet, kann so herbeigeführt werden, dass das Enzym das gewünschte Gen in dem gewünschten Gewebe oder zu dem gewünschten Zeitpunkt aus dem Erbgut der Nachkommen "herausschneidet", so dass das Protein, dessen Information in diesem Gen enthalten war, ab dem Zeitpunkt bzw. in dem Gewebe nicht mehr hergestellt werden kann. Ausführliche Beschreibungen gentechnologischer Methoden zur Veränderung des Keimzellgenoms von Wirbeltieren finden sich bei: BMVEL (1996), GV-SOLAS (1996), Mepham (1998) sowie Salomon et al. (2001). 1 ALTEX 22, 4/05 et al. 257
