MEMO Teil 1

MEMO
Teil 1
Grundlagen der lasergestützten Charakterisierung
von Metabolismus und Morphologie von Zellverbänden
Teilverbundprojekte
Erforschung eines optischen Messverfahrens zur dreidimensionalen berührungs- und zerstörungsfreien in vitroUntersuchung und qualitativen Evaluierung von komplexen biologischen Systemen (LaVision BioTec GmbH, FKZ: 13N8434)
Erprobung von nicht-linearen Laser-Raster-Mikroskopieverfahren (Universität Bielefeld, FKZ: 13N8432)
Neue Kultivierungsmethode für das Tissue Engineering durch 3D-ECM-Analyse mittels zeit- und ortsaufgelöster
Laserraster-Mikroskopie am Bioreaktor (iba Heiligenstadt, FKZ: 13N8435)
Einleitung
Knorpel
Ziel des Projektes
Knorpelbiopsie
Keratansulfat
Expansion autologer Chondrozyten
Chondrozyt
Abb. 1: Chondrozyten auf
einer
Kollagen
I/IIIMembran
(1-PhotonenAnregung bei 488 nm,
CLSM, grün: autofluoreszierende Kollagen I/IIIFaser und Keratansulfat
(Anti-KS-FITC-Konjugat,
monoklonal), rot: Zellgegenfärbung mit SYTO 83.
Kollagen I/III-Faser
Knorpel besteht überwiegend aus extrazellulärer Matrix (ECM), deren Komposition
eine entscheidende Rolle für die Funktionalität des Gewebes spielt. Das knorpeltypische Kollagen Typ II garantiert die strukturelle Integrität, während keratansulfattragende Proteglykane die mechanische Pufferleistung realisieren. Schädigungen
des Knorpels manifestieren sich kurz- oder langfristig in Arthrosen.
präimplantative in vitro-Kultivierung
auf Kollagen I/III-Scaffolds
Therapie von Knorpelschäden
Erhalt der Zelldifferenzierung
Konservative Therapieformen der Arthrose (Abrasion, Pridiebohrung, Mosaikplastik)
resultieren häufig in einem minderwertigen fibrösen Ersatzknorpel. Eine innovative
Weiterentwicklung der seit 1993 praktizierten Therapie mit körpereigenen Chondrozyten stellt die Matrix-gekoppelte Autologe Chondrozyten Implantation (MACI®) dar.
Diese 3D-Kultivierungsmethode maximiert die Syntheseraten knorpel-spezifischer
ECM-Moleküle bei gleichzeitiger Minimierung des chirurgischen Aufwandes. Als
Ergebnis der präimplantativen Kultivierung werden auf Kollagen I/III-Membranen
vorkultivierte Chondrozyten in das Defektareal implantiert.
geeignete Scaffoldmaterialien und
Scaffoldstrukturen
biochemische Stimulierung
mechanische/hydrodynamische
Stimulierung
Die während der Zellexpansion stattfindende zunehmende Zelldedifferenzierung soll durch die Wahl geeigneter Scaffoldmaterialien
sowie durch externe Zellstimulierungen während der präimplantativen
Kultivierung minimiert bzw. aufgehalten werden. Die Bewertung
differenzierungsfördernder Effekte kann über die Zellzahl,
Zellverteilung, Zellmorphologie und ECM-Synthese (z.B. Keratansulfat, Kollagen Typ II; siehe Abb. 1) während der präimplantativen
Kultivierung erfolgen.
Die Herausforderung für eine online-2-Photonen-Mikroskopie besteht
dabei in der komponentenspezifischen Visualisierung und quantitativen Analyse von Autofluoreszenzsignalen/SHG der drei wesentlichen Komponenten: Scaffold, Chondrozyten sowie ECM.
Z
X-Y
Deckglas
onlineKontrolle
durch
2-PhotonenMikroskopie
Variation der Scaffoldstruktur
zur Optimierung der
Zellperformance
Zellzahl
Zellmorphologie
Synthese von ECM
Bioreaktor
(Medienkonditionierung)
Fließkammer (Bypass)
verschiebbare Platte
Zellen auf Scaffold
Medienflow
Medien-Inflow
hydrodynamischer Scherstress
obere Kammer
mechanische Stimulation
untere Kammer
Vlies (ACI-MaixTM)
Schwamm
rotierende Welle
biokompatible Membran
Technik der Laserscannenden 2-Photonen-Mikroskopie
Vorteile der 2-Photonen-Anregung
Experimenteller Aufbau
nichtlineare optische Absorption limittiert die Anregung von
Fluorochromen auf die Fokusebene
echte räumliche Selektivität
quadratische Abhängigkeit
der Fluoreszenzintensität
von der Anregungsenergie
Analyse von Geweben und
Zellen unter nichtinvasiven
Bedingungen
Abb. 2: Grundlage der Multiphotonenmikroskopie – die simultane Absorption von zwei oder
mehr niedrig-energetischer Photonen zur
Anregung von Fluoreszenz.
schonende Gewebeanalyse
Reduzierung von Fotobleaching und Fotoschädigungen
keine Vorbehandlung der zu analysierenden Proben notwendig
(Autofluoreszenz)
Analyse bis in eine Tiefe von 1 mm in biologischen Geweben und
3D-Zellkulturen aufgrund der verwendeten hohen Wellenlänge mit
geringer Streuung von Photonen
LaVision BioTec GmbH
Meisenstr. 65
D-33607 Bielefeld
Dr. H. Spiecker
Tel.: +49 (0)521 2997710
[email protected]
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Ti:Sa-Laser
Pre-Chirp
Strahl-Multiplexer
Scanner-Spiegel
Universität Bielefeld
Biophysik & Angewandte Nanowisenschaften
Universitätsstrasse 25
D-33615 Bielefeld
Prof. Dr. D. Anselmetti
Tel.: +49 (0)521 1065391
[email protected]
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Mikroskop
Probe
Filterrad / Spektrometer
Kamera
9 Dichroitischer Spiegel
10 Objektiv
11 PMT
Institut für Bioprozess- und Analysenmesstechnik (iba) e.V.
Fachbereich Biowerkstoffe
Rosenhof
D-37308 Heilbad Heiligenstadt
Dr.-Ing. K. Liefeith
Tel.: +49 (0)3606 671170
[email protected]