Versuch 5 - Isocitrat

Versuch 5
„Isocitrat-Dehydrogenase“
Protokollant:
E-mail:
Studiengang:
Gruppen-Nr:
Semester:
Betreuer:
Max Mustermann
[email protected]
X
X
X
PD Dr. Gimpl
Einleitung
Ziel des Versuches ist es, die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit einer
enzymatischen Reaktion von der zugegebenen Enzymmenge zu beschreiben. Es soll
auch die Spezifität des Enzyms Isocitrat-Dehydrogenase (ICD) für die an ihrer
Reaktion beteiligten Cofaktoren gezeigt werden. Weiterhin wird das
Reaktionsverhalten des Enzyms bei Aktivierung durch bestimmte Metallionen
untersucht.
Der Fortschritt der Reaktionen wird mit einem Photometer verfolgt. Als Chromophor
dient NADPH, reduziertes NADP+, welches bei der Reaktion entsteht. Die
Konzentration von NADPH, und somit auch die Extinktion, ist direkt proportional zum
Isocitrat-Umsatz.
Theorie
Isocitrat-Dehydrogenase
Die Isocitrat-Dehydrogenase ist aus zwei identischen α- und β-Untereinheiten
zusammengesetzt. Jedes der beiden aktiven Zentren des Enzyms besteht aus den
Aminosäuren Asp311, Asp283 und Asp307. Jeweils zwei Aminosäuren (Asp311,
Asp307) stammen aus der einen Kette, die dritte (Asp283) aus der jeweils anderen.
In eukaryotischen Zellen gibt es zwei Isoenzyme der Isocitrat-Dehydrogenase, wobei
beide dieselbe Reaktion katalysieren, nämlich die Decarboxylierung von Isocitrat zu
α-Ketoglutarat. Das eine Isoenzym benötigt NAD+ als Cofaktor und katalysiert im
Citratzyklus (in den Mitochondrien) einen geschwindigkeitsbestimmenden Schritt, der
unter anderem durch Feedback-Hemmung vom Produkt, durch einen hohen
NADH/NAD+ Spiegel und durch ADP gehemmt wird.
Teilsequenzen des Citratzyklus sind auch extramitochondrial gelegen, so dass sie an
anabolen Vorgängen teilhaben können.
z.B. Citrat  α-Ketoglutarat
Fumarat Oxalacetat
Die zweite Isoform der Isocitrat-Dehydrogenase hat als Cofaktor NADP+. Sie kommt
sowohl im Mitochondrienplasma wie auch im Cytosol vor. Sie katalysiert die
α-Ketoglutarat Bildung im Cytosol. Diese ist wichtig für den Aminosäurestoffwechsel.
Ein weiteres Produkt der Reaktion ist NADPH2 welches als Reduktionsäquivalent für
anabole Stoffwechselwege im Cytosol wie zB. die Fettsäurebiosynthese dient.
Reaktionsfolge (NAD+ spezifische Isoform)
Im ersten Schritt wird am C(2)-Atom des Isocitrats oxidiert, wobei NAD+ reduziert
wird. Als Zwischenprodukt entsteht Oxalosuccinat.
Isocitrat
Oxalosuccinat
Im weiteren Verlauf ist ein Manganion beteiligt. Das Ion polarisiert die
Carbonylgruppe und erleichtert dadurch die Abspaltung des Kohlendioxids.
Schließlich wird das C(3)-Atom protoniert, was einer Keto-Enol-Tautomerie ähnelt.
α-Ketoglutarat
OPTISCHER TEST FEEEHHHLLTTT
Material und Methode
Der Versuch wurde exakt nach Versuchsanleitung durchgeführt. Die Anleitung und
die verwendeten Reagenzien sind im Skript auf den Seiten 20 und 21 zu finden.
Ergebnisse
a) und b): Zeit-Umsatz-Kurve bei Zugabe von verschiedenen Enzymmengen
Extinktion
Zeit (s) a) (0,05mL b) (0,1mL
Enzymlsg.) Enzymlsg.)
0
0,045
0,050
30
0,135
0,230
60
0,220
0,400
80
/
0,490
90
0,310
/
100
/
0,550
120
0,390
0,580
140
/
0,585
150
0,455
/
160
/
0,588
180
0,515
0,588
210
0,555
/
240
0,575
/
270
0,580
/
300
0,585
/
Farbig unterlegte Werte sind direkt vergleichbar da
sie nach der gleichen Zeit aufgenommen wurden.
Zeit-Umsatz-Kurven zu Versuchen a) und b)
0,7
0,6
Extinktion
0,5
0,4
Versuch a): 0,05ml Enzymlsg
Versuch b): 0,1ml Enzymlsg
0,3
0,2
0,1
0
0
50
100
150
200
Zeit (s)
250
300
350
c) Nachweis der Coenzymspezifität des Enzyms
Zeit (min)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
7,5
8
8,5
9
9,5
10
Extinktion
0,005
0,005
0,005
0,005
0,005
0,005
0,005
0,005
0,005
+
Zugabe von NADP bei t = 4,5min
0,045
0,140
0,250
0,355
0,450
0,540
0,620
0,680
0,725
0,745
0,750
0,750
Zeit-Umsatz-Kurve zu Versuch c)
0,8
0,7
0,6
Extinktion
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
2
4
6
Zeit (min)
8
10
12
d) Aktivierung des Enzyms durch Metall-Ionen
a) mit Magnesium-Ionen
Zeit (min) Extinktion
0
0,025
0,5
0,075
1
0,130
1,5
0,185
2
0,235
2,5
0,275
3
0,333
3,5
0,370
4
0,415
4,5
0,450
5
0,480
5,5
0,510
6
0,530
6,5
0,540
b) mit Calcium-Ionen
Zeit (min)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
Extinktion
0,010
0,015
0,020
0,030
0,045
0,060
0,077
0,095
0,115
0,135
0,160
0,185
0,205
0,230
Zeit-Umsatz-Kurve zu Versuch d): Aktivierung des Enzyms mit
Metall-Ionen
0,7
Extinktion
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
1
2
3
4
5
6
Zeit (min)
Aktivierung mit Magnesium-Ionen
Aktivierung mit Calcium-Ionen
(Aktivierung mit Mangan-Ionen)
7
e) Alternierende Aktivierung und Hemmung des Enzyms
Zugabe
von..
t
E
EDTA
MnSO4
EDTA
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
0,043 0,146 0,183 0,183 0,183 0,183 0,248 0,3 0,31 0,31 0,31 0,31 0,31
Zugabe
von..
t
E
MnSO4
6,5
7
7,5
8
8,5
9
9,5
10
10,5
0,361 0,441 0,486 0,529 0,546 0,552 0,558 0,558 0,558
Zeit-Umsatz-Kurve bei alternierender Aktivierung und Hemmung
des Enzyms
0,6
0,5
Extinktion
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
2
4
6
Zeit (min)
8
10
12
Auswertung
Zu a) und b)
In den Ergebnissen von Versuch a) sieht man deutlich, dass bei einer größeren
Enzymmenge das chemische Gleichgewicht der Reaktion schneller erreicht wird. Die
Zeit bis zum erreichen des Eqilibriums ist sogar umgekehrt proportional zur
zugegebenen Enzymmenge. Somit ist die Reaktionsgeschwindigkeit direkt
proportional zur zugegebenen Enzymmenge und es gilt: Doppelte Enzymenge doppelte Reaktionsgeschwindigkeit.
In der Tabelle zu Versuch a) sieht man das. Bei doppelter Enzymmenge (0,1mL), ist
das chemische Gleichgewicht nach der Hälfte der Zeit, die man bei einfacher
(0,05mL) Enzymenge benötigt, erreicht. Das ist logisch, denn bei Zugabe einer
größeren Menge Enzym zur einer konstanten Menge an Substrat, können in der
gleichen Zeit mehr Enzym-Substrat-Komplexe gebildet werden als bei einer kleineren
Menge Enzym, und somit auch mehr Substrat zu Produkt umgesetzt werden, denn
die einzelnen Enzyme arbeiten bei gleichen Bedingungen auch alle gleich schnell.
Die „Regel“, die besagt, dass die Reaktionsgeschwindigkeit direkt proportional mit
steigender Enzymkonzentration steigt, gilt allerdings nur für Reaktionen bei denen
Substrat im Überschuss, zumindest jedoch in einer um einiges größeren Menge als
das Enzym, vorliegt. Befindet sich in der Lösung weniger Substrat als Enzym, wird
das chemische Gleichgewicht nicht schneller erreicht, wenn man mehr Enzym
hinzugibt.
Zu c)
Der Reaktionsansatz unterscheidet sich von dem in den Versuchen a) und b) nur
durch das unterschiedliche Coenzym welches sich im Ansatz befindet. In den
Versuchen a) und b) wurde beides mal NADP+ in den Ansatz gegeben, in den Ansatz
von Versuch c) dagegen NAD+.
Nach der Zugabe von Enzym zum Ansatz c) kommt es zu keiner Änderung der
Extinktion. Das heißt es wurde kein NADH gebildet (NADH und NADPH haben ihr
gemeinsames Absorptionsmaximum bei etwa 350nm). Nach einer Zugabe von
NADP+ allerdings kommt es zu einer Änderung der Extinktion, was man auf eine
Bildung von NADPH zurückführen kann. Die ICD katalysiert also ihre Reaktion, wobei
sie den Elektronentransporter NADP+ reduziert. Die IDC kann also mit NAD+ als
Elektronenakzeptor die Reaktion nicht katalysieren. Dies ist der Nachweis für die
Coenzymspezifität von ICD.
Das Vorhandensein einer Coenzymspezifität ist nicht verwunderlich denn eine
Substrat (-stereo) Spezifität ist sehr typisch für Enzyme. Coenzyme sind ja auch eine
Art Substrat für Enzyme (deswegen auch manchmal Cosubstrat genannt) und
müssen auch an einer bestimmten Stelle mit dem Enzym in Wechselwirkung treten.
Passen sie sterisch nicht an diese Stelle des Enzyms so kommt es nicht zu den
gewünschten WW und somit auch nicht zur Reaktion.
Zu d)
Die Zeit-Umsatz-Kurven von Versuch d)a) und d)b) können direkt mit der von
Versuch a) verglichen werden, da bei allen drei Versuchen die Ansätze die gleiche
Zusammensetzung, abgesehen von den aktivierenden Metallionen, hatten und auch
in allen drei Fällen die gleiche Enzymmenge eingesetzt wurde.
Bei Aktivierung durch Mangan-Ionen läuft die Reaktion von Isocitrat zu α-Ketoglutarat im Vergleich zu den Reaktionsanssätzen mit anderen Metall-Ionen am
schnellsten ab. An zweiter Stelle im Vergleich der drei, kommt das Mg2+-Ion. Bei
einer Aktivierung mit diesem Ion wird das Eqilibrium zwar erst nach der doppelten
Zeit erreicht, die die ICD mit Mn2+-Ionen braucht, jedoch immer noch viel schneller
als bei Substitution der Magnesium-Ionen durch Ca2+-Ionen. In diesem Fall ist das
chemische Gleichgewicht nach Ende der Messzeit immer noch lange nicht erreicht.
Die Reaktion läuft in diesem Fall am langsamsten ab bzw. die ICD hat bei alleinigem
Vorhandensein von Ca2+-Ionen als aktivierendes Ion eine geringere Umsatzzahl.
Die ICD ist somit ein Beispiel für Enzyme die mehr als einen Cofaktor benötigen
(nämlich NAD+ oder NADP+ und ein zweiwertiges Metallkation) um eine Reaktion zu
katalysieren. In der Eukaryotenzelle wird wahrscheinlich, aufgrund der hohen
Reaktionsgeschwindigkeit, Mn2+ als aktivierendes Ion gewählt.
Zu e)
In Versuch e) wurde abwechselnd Mn2+ und EDTA zugegeben. Man kann an der
Kurve sehen, dass nach Zugabe von EDTA die Reaktion stagnierte. Erst nach
erneuter Zugabe von Mn2+ startete die Reaktion wieder und lief solange bis wir
erneut EDTA zugaben.
Die Erklärung hierfür liegt auf der Hand: EDTA ist ein Chelator zweiwertiger MetallIonen. Er komplexiert diese im Verhältnis eins zu eins. Somit können die Ionen nicht
mehr an der Reaktion teilhaben, und diese stagniert. Gibt man wieder Mn2+-Ionen
hinzu übersteigt die Anzahl der Mn2+-Ionen die der EDTA-Moleküle. Da EDTA Mn2+
im Verhältnis 1:1 koordinativ bindet liegen wieder freie Ionen in der Lösung vor, die
sich nun wieder an der Reaktion beteiligen können. In diesem Versuch wurde
gezeigt, dass Mn2+-Ionen (oder zB. Mg2+ oder Ca2+) essentiell sind für den
Katalysemechanismus der ICD. Sie fungieren hier auch als Katalysator, da sie
unverändert aus der Reaktion hervorgehen.
Literatur
-Skript zum Biochemischen Grundpraktikum, Institut für Biochemie, J.-G.-Universität-Mainz
-Biochemisches Praktikum, Kleber, Schlee, Schöpp, Verlag: Gustav Fischer, 1997
-Biochemie, Stryer, Verlag: Spektrum, 1994 (2. durchgesehene Auflage)
Zusätzliche Rechenaufgabe fürs Protokoll: Alltagsrechnungen aus dem Labor
Molekulargewicht von NaCl: 58.4 g/ mol
1. Herstellung von 50 ml einer 3 M NaCl- Lösung (Stammlösung) aus
dem Salz. Wieviel wird eingewogen?
2. Herstellung von 5 ml einer 150 mM NaCl Lösung aus
a.) dem Salz
b.) der 3 M NaCl Stammlösung
___________________________________________________________________
Lösung:
1. -In 1L 3M NaCl-Lsg sind 3mol NaCl.
-Also sind in 50mL (= 0,05l) NaCl-Lsg 0,05 x 3mol = 0,15mol NaCl.
-0,15mol NaCl wiegen 0,15mol x 58,4g/mol = 8,76g
Um 50mL 3M NaCl-Stammlsg. aus reinem NaCl herzustellen muss man 8,76g
NaCl einwiegen.
2. a) -In 1L 150mM NaCl-Lsg sind 150mmol NaCl
-Dann sind in 5mL (=0,005L) 150mM NaCl-Lsg 0,005 x 0,15mol =
0,00075mol NaCl.
-0,00075mol NaCl wiegen 0,00075mol x 58,4g/mol = 0,0438g
Um 5mL 150mM NaCl-Lsg aus reinem NaCl herzustellen muss man 0,0438g
NaCl einwiegen
b) -In 5mL 150mM NaCl-Lsg sind 0,00075mol NaCl.
- 1000mL 3M NaCl-Lsg entsprechen 3mol NaCl
XXXmL
entsprechen 0,00075mol NaCl
-In 0,25mL 3M NaCl-Lsg sind 0,00075mol NaCl
Um 5mL 150mM NaCl-Lsg aus der 3M NaCl-Stammlsg. herzustellen muss
man 0,25mL der Stammlsg. mit 4,75mL H2O auffüllen.