DISS. ETH NO. 23519 Analysis of factors - ETH E
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DISS. ETH NO. 23519 Analysis of factors determining LDH activity in murine tumor models using hyperpolarized 13C MRS A thesis submitted to attain the degree of DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH (Dr. sc. ETH Zurich) presented by GEORGIOS BATSIOS MSc ETH Biomedical Engineering born on 09.03.1986 citizen of Greece accepted on the recommendation of Prof. Dr. Markus Rudin, examiner Prof. Dr. Sebastian Kozerke co-examiner Prof. Dr. Stefanie Krämer co-examiner 2016 Abstract Cancer evolves through multiple random mutations and clonal selection of cells that can survive under potentially harmful conditions. The interaction between tumor microenvironment and tumor cell adaptive responses provides the mutant cells with a selective advantage. Among others, mutations in the metabolic enzymes have been identified for various cancer types, suggesting a link between cell metabolism and cancer formation. Such mutations were shown to affect expression levels and/or the activity of metabolic enzymes, as well as drive metabolic changes. Reprogramming of energy metabolism is an emerging hallmark of neoplastic tissue. Most cancer cells metabolize glucose by glycolysis in contrast to normal cells, which completely catabolize glucose by oxidative phosphorylation. This shift to aerobic glycolysis (Warburg effect) with lactate production and increased glucose consumption is important for the rapid proliferation of cancer cells. Tissue metabolism can be studied noninvasively without ionizing radiation using magnetic resonance spectroscopy (MRS) and MRS imaging (MRSI), which are characterized by high chemical specificity. This specificity allows monitoring of several metabolites simultaneously. Yet MR methods suffer from low sensitivity due to low quantum energy involved in the resonance process, which limits temporal and spatial resolution. Dynamic nuclear polarization (DNP) allows to transiently overcome this limitation by generating a hyperpolarized state yielding a 10,000 times increase in sensitivity. It allows 13C-MRS and 13C-MRSI to identify metabolic products and provide a window for studying the dynamics of the metabolic conversions in vivo including key steps of glycolysis and citric acid cycle. The method is limited by the short half-life of the hyperpolarized state, which implies that the hyperpolarized signal can be monitored for only a few minutes. Given the increased aerobic glycolysis in tumors, hyperpolarized [1-13C]pyruvate has become an attractive target for diagnostic purposes and assessment of therapy effects. Pyruvate has a gatekeeper role in glucose metabolism; among others it is converted to lactate via the lactate dehydrogenase (LDH), an enzyme that is frequently up regulated in tumors. Preclinical studies using 13 C-labelled pyruvate as a substrate have demonstrated that tumors display a higher degree of lactate labelling compared to normal tissue, providing a non-invasive quantification method for the Warburg effect and demonstrating that hyperpolarized pyruvate can be a valuable probe for oncological imaging. The aim of this work was to evaluate the influence of the microenvironment on tumor metabolism by probing the LDH reaction as marker of tumor glycolytic activity. This involved the establishment of a reliable experimental protocol for hyperpolarization by DNP of 13C labelled compounds, the optimization of acquisition procedures for in vivo MR spectroscopy of tumors implanted in mice, and the implementation and development of suitable analysis tools. The tumor microenvironment has a major effect on tumor development and therapy response. We therefore investigated to what extent the glycolytic activity in the murine mammary tumor 4T1, as reflected by the conversion of pyruvate to lactate through LDH enzyme, was affected by the implantation site. We concluded that orthotopically implanted tumors LDH kinetics displayed only a weak dependence on tumor size independent of immune status of the mice (immunocompetent versus immunocompromised mice). For subcutaneous tumors, there appears to be a more v Abstract pronounced volume dependence of kLDH in BALB/c but not BALB/c Nude mice, though the values observed were in the range observed for the other groups. Overall, we concluded that there are minimal effects of tumor implantation site and immunocompetence of mice on growth rates and metabolic activity as reflected by LDH forward reaction rate constant, indicating that these parameters are largely governed by the intrinsic properties of the 4T1 cells. This conclusion is confirmed by the fact that genetically engineered 4T1 cells expressing green fluorescent protein (GFP) reporter gene show significantly reduced growth rate and kLDH values. Finally, we could not detect any difference in LDH activity between 4T1 and the related 67NR tumor cells, which display different propensity to form distant metastases. An interesting and so far not reported observation was the occurrence of a second maximum in the intensity-time profile for the [1-13C]pyruvate and [1-13C]lactate signals. We investigated whether this biphasic behaviour could be associated to the implantation site of the tumors or the immune status of the mice: Yet, no clear-cut dependence could be established though the incidence of double maxima tended to be higher in immunocompetent animals. The effect of the pyruvate dosage and intensity profiles as well as studies in animals carrying mock tumors for differentiating potential contribution from normal tissue were investigated. In both cases signal profiles with two maxima have been observed. In the second part of the study, magnetization and concentration time profiles of pyruvate and lactate were simulated using compartment models. A three-compartment model with a feedback loop from lactate concentration to pyruvate uptake and/or LDH conversion rate constant was capable of reproducing the pyruvate intensity-time profile, but there were discrepancies to lactate experimental data. Including the results obtained in animal carrying mock tumors indicate that this model should be extended by including a second tissue compartment. In conclusion, 13C-MRS combined with hyperpolarized 13C-labelled substrates has the potential to become a powerful tool in characterizing neoplasms. It can differentiate neoplastic from normal tissue and potentially detect diffuse metastatic lesions. As numerous preclinical studies have demonstrated, the method can be used to assess therapy response at the level of individuals. Methodological improvements should aim at addressing tumor heterogeneity and improving interpretation of metabolic data at a quantitative level. Development of novel hyperpolarized substrates, which give insights into complementary metabolic events, will further make dissolution DNP an attractive tool in metabolism related disease studies. vi Zusammenfassung Krebs entwickelt sich durch mehrere zufällige Mutationen und klonale Selektion von Zellen, die unter potentiell ungünstigen Bedingungen überleben können. Die Anpassungsfähigkeit von Tumorzellen an die spezifische Mikroumgebung liefert den mutierten Zellen einen selektiven Vorteil. Für verschiedene Krebsarten wurden Mutationen in den Stoffwechselenzymen identifiziert, welche auf einen Zusammenhang zwischen Zellstoffwechsel und der Entstehung von Krebs hinweisen. Solche Mutationen haben gezeigt, dass sie die Exprimierung und/oder Aktivität der Stoffwechselenzyme beeinflussen und zu metabolischen Veränderungen führen. Die Neuprogrammierung des Energiestoffwechsels ist ein neu erkanntes Merkmal der Tumorgewebe. Die meisten Krebszellen metabolisieren Glucose durch Glykolyse, im Gegensatz zu normalen Zellen, die Glucose vollständig durch oxidative Phosphorylierung abbauen. Diese Umstellung auf aeroben Glykolyse (WarburgEffekt) mit Laktatproduktion und erhöhtem Glukoseverbrauch ist wichtig für die schnelle Vermehrung von Krebszellen. Metabolische Vorgänge können mit grosser chemischer Spezifität mittels Magnetresonanzspektroskopie (MRS) und MRS-Bildgebung (MRSI) nichtinvasiv und ohne ionisierende Strahlung untersucht werden. Diese ermöglichen zudem, gleichzeitig mehrere Metaboliten zu beobachten. Allerdings leiden MR Methoden aufgrund der niedrigen Quantenenergie der Resonanzprozesse unter geringer Empfindlichkeit; die zeitliche und räumliche Auflösung ist somit begrenzt. Dynamische Kernpolarisation (DNP) ermöglicht es, diese Einschränkung vorübergehend zu überwinden, indem man mit einem hyperpolarisierten Zustand eine 10,000-fach erhöhte Empfindlichkeit generiert. Dies ermöglicht es, die 13C-MRS und die 13C-MRSI Stoffwechselprodukte zu identifizieren und öffnet ein Fenster, durch das die Dynamik metabolischer Umwandlungen, einschließlich der wichtigsten Schritte der Glykolyse und des Zitronensäurezyklus, in vivo studiert werden kann. Die Methode wird jedoch durch die kurze Halbwertszeit des hyperpolarisierten Zustandes begrenzt, das hyperpolarisierte Signal kann nur für ein paar Minuten gemessen werden. Aufgrund der erhöhten aeroben Glykolyse in Tumoren, einem wichtigen Merkmal von Krebs, stellt hyperpolarisiertes [1-13C]Pyruvat ein attraktives Ziel für diagnostische Zwecke und zur Beurteilung von Therapiewirkungen dar. Pyruvat hat eine Torwächterrolle im Glukose-Stoffwechsel und wird unter anderem über die Laktatdehydrogenase (LDH) zu Lactat umgewandelt. LDH ist ein häufig hochreguliertes Enzym in Tumoren. Präklinische Studien, die 13C markiertes Pyruvat als Substrat verwendet haben, haben gezeigt, dass Tumore ein höhere Laktat Markierung im Vergleich zu normalen Gewebe aufgewiesen haben. Sie stellen somit ein nicht-invasives Quantifizierungsverfahren für den Warburg Effekt dar und zeigen, dass hyperpolarisiertes Pyruvat eine wertvolle Sonde für onkologische Bildgebung sein kann. Das Ziel dieser Arbeit war, den Einfluss der Mikroumgebung auf den Tumormetabolismus zu bewerten, indem die LDH Reaktion als Marker für glykolytische Aktivität herangezogen wurde. Dies beinhaltete die Etablierung eines zuverlässigen Versuchsprotokolls für Hyperpolarisation durch dynamische Kernpolarisation von 13C-markierten Verbindungen und die Optimierung der Akquisitionsverfahren für in vivo MR-Spektroskopie von in Mäusen implantierten Tumoren, sowie die Entwicklung und Umsetzung von geeigneten Analysetools. vii Zusammenfassung Die Tumor-Mikroumgebung hat einen großen Einfluss auf Tumorentstehung und Therapiereaktion. Deshalb untersuchten wir, inwieweit die glykolytische Aktivität im murinen Brusttumor, wie sie durch die Umwandlung von Pyruvat zu Laktat durch das LDH Enzym widergegeben ist, vom Implantationsort abhängt. Die LDH Kinetik in orthotopisch implantierten Tumoren zeigte nur eine schwache Abhängigkeit von der Größe des Tumors und war unabhängig vom Immunstatus der Mäuse (immunkompetenten versus immungeschwächte Mäuse). In subkutanen Tumoren zeigt sich eine ausgeprägtere Volumenabhängigkeit der kLDH in BALB/c, aber nicht in BALB/c Nacktmäusen, obwohl die beobachteten Werte im Bereich von anderen beobachtete Gruppe lagen. Insgesamt haben wir festgestellt, dass Implanatationsort und Immunkompetenz nur einen geringen Einfluss auf die Tumorwachstumsrate und metabolische Aktivität (kLDH) haben, was darauf hinweist, dass diese Parameter weitgehend durch die intrinsischen Eigenschaften der 4T1 Zellen geregelt werden. Diese Schlussfolgerung wird durch die Tatsache unterstützt, dass genetisch entwickelte 4T1 Zellen mit einem grün fluoreszierende Protein (GFP)-Reporter-Gen eine deutlich reduzierte Wachstumsrate und kLDH Werte aufweisen. Schliesslich konnten wir keinen Unterschied zwischen LDH-Aktivität in 4T1 und verwandten 67NR Tumorzellen feststellen, die eine unterschiedliche Neigung aufweisen, Fernmetstasen zu bilden. Eine interessante und bisher noch nicht beschriebene Beobachtung war das Auftreten eines zweiten Maximums im Intensitäts-Zeit-Profil der [1-13C]Pyruvat und [1-13C]Laktat-Signale. Wir untersuchten, ob dieses biphasische Verhalten mit dem Implantationsort der Tumoren oder dem Immunstatus der Mäuse in Verbindung gebracht werden konnte. Es konnte jedoch keine eindeutige Abhängigkeit festgestellt werden, obwohl die Häufigkeit von Doppelmaxima in immunkompetenten Tieren leicht erhöht war. Weiterhin wurde die Auswirkung der Pyruvat-Dosierung und der Intensitätsprofile untersucht, sowie Studien an Tieren mit Tumoratrappen durchgeführt, um einen möglichen Beitrag von normalem Gewebe zu untersuchen. In beiden Fällen sind Signalprofile mit zwei Maxima beobachtet worden. Im zweiten Teil der Studie wurden die Magnetisierung und Konzentrations-ZeitProfile von Pyruvat und Laktat mit Kompartimentmodellen simuliert. Ein Drei-Kompartiment-Modell mit einer Rückkopplungsschleife von Laktat-Konzentration zu Pyruvat Aufnahme und/oder LDH Reaktionsgeschwindigkeit konnte das Pyruvat-Intensitäts-Zeit-Profil reproduzieren, jedoch gab es Abweichungen zu den experimentellen Laktat-Daten. Die Resultate, die in den Tieren mit Tumoratrappen erzielt wurden, deuten darauf hin, dass dieses Modell um ein zweites Gewebekompartiment ergänzt werden sollte. Abschließend lässt sich zusammenfassen, dass das Kombinieren von 13C-MRS mit hyperpolarisierten 13 C-markierten Substraten Potenzial hat, als leistungsfähiges Werkzeug bei der Charakterisierung von Neoplasmen verwendet zu werden. So kann neoplastisches von normalem Gewebe unterscheiden und diffuse metastatische Läsionen erkannt werden. Wie zahlreiche präklinische Studien gezeigt haben, kann dieses Verfahren verwendet werden, um die Therapiereaktion auf der Ebene einzelner Individuen zu beurteilen. Methodische Verbesserungen sollten künftig auf die Tumorheterogenität abzielen und die quantitative Erfassung der metabolischen Daten verbessern. Die Entwicklung neuartiger hyperpolarisierter Substrate, die Einblicke in komplementäre metabolische Ereignisse geben, wird DNP weiter zum attraktiven Werkzeug für Studien Metabolismus-bezogener Erkrankungen machen. viii
