DISS. ETH NO. 23519 Analysis of factors - ETH E

DISS. ETH NO. 23519
Analysis of factors determining LDH activity in murine tumor
models using hyperpolarized 13C MRS
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
GEORGIOS BATSIOS
MSc ETH Biomedical Engineering
born on 09.03.1986
citizen of Greece
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Markus Rudin, examiner
Prof. Dr. Sebastian Kozerke co-examiner
Prof. Dr. Stefanie Krämer co-examiner
2016
Abstract
Cancer evolves through multiple random mutations and clonal selection of cells that can survive
under potentially harmful conditions. The interaction between tumor microenvironment and tumor
cell adaptive responses provides the mutant cells with a selective advantage. Among others,
mutations in the metabolic enzymes have been identified for various cancer types, suggesting a link
between cell metabolism and cancer formation. Such mutations were shown to affect expression
levels and/or the activity of metabolic enzymes, as well as drive metabolic changes. Reprogramming
of energy metabolism is an emerging hallmark of neoplastic tissue. Most cancer cells metabolize
glucose by glycolysis in contrast to normal cells, which completely catabolize glucose by oxidative
phosphorylation. This shift to aerobic glycolysis (Warburg effect) with lactate production and
increased glucose consumption is important for the rapid proliferation of cancer cells.
Tissue metabolism can be studied noninvasively without ionizing radiation using magnetic resonance
spectroscopy (MRS) and MRS imaging (MRSI), which are characterized by high chemical specificity.
This specificity allows monitoring of several metabolites simultaneously. Yet MR methods suffer from
low sensitivity due to low quantum energy involved in the resonance process, which limits temporal
and spatial resolution. Dynamic nuclear polarization (DNP) allows to transiently overcome this
limitation by generating a hyperpolarized state yielding a 10,000 times increase in sensitivity. It
allows 13C-MRS and 13C-MRSI to identify metabolic products and provide a window for studying the
dynamics of the metabolic conversions in vivo including key steps of glycolysis and citric acid cycle.
The method is limited by the short half-life of the hyperpolarized state, which implies that the
hyperpolarized signal can be monitored for only a few minutes.
Given the increased aerobic glycolysis in tumors, hyperpolarized [1-13C]pyruvate has become an
attractive target for diagnostic purposes and assessment of therapy effects. Pyruvate has a
gatekeeper role in glucose metabolism; among others it is converted to lactate via the lactate
dehydrogenase (LDH), an enzyme that is frequently up regulated in tumors. Preclinical studies using
13
C-labelled pyruvate as a substrate have demonstrated that tumors display a higher degree of
lactate labelling compared to normal tissue, providing a non-invasive quantification method for the
Warburg effect and demonstrating that hyperpolarized pyruvate can be a valuable probe for
oncological imaging.
The aim of this work was to evaluate the influence of the microenvironment on tumor metabolism by
probing the LDH reaction as marker of tumor glycolytic activity. This involved the establishment of a
reliable experimental protocol for hyperpolarization by DNP of 13C labelled compounds, the
optimization of acquisition procedures for in vivo MR spectroscopy of tumors implanted in mice, and
the implementation and development of suitable analysis tools.
The tumor microenvironment has a major effect on tumor development and therapy response. We
therefore investigated to what extent the glycolytic activity in the murine mammary tumor 4T1, as
reflected by the conversion of pyruvate to lactate through LDH enzyme, was affected by the
implantation site. We concluded that orthotopically implanted tumors LDH kinetics displayed only a
weak dependence on tumor size independent of immune status of the mice (immunocompetent
versus immunocompromised mice). For subcutaneous tumors, there appears to be a more
v
Abstract
pronounced volume dependence of kLDH in BALB/c but not BALB/c Nude mice, though the values
observed were in the range observed for the other groups. Overall, we concluded that there are
minimal effects of tumor implantation site and immunocompetence of mice on growth rates and
metabolic activity as reflected by LDH forward reaction rate constant, indicating that these
parameters are largely governed by the intrinsic properties of the 4T1 cells. This conclusion is
confirmed by the fact that genetically engineered 4T1 cells expressing green fluorescent protein
(GFP) reporter gene show significantly reduced growth rate and kLDH values. Finally, we could not
detect any difference in LDH activity between 4T1 and the related 67NR tumor cells, which display
different propensity to form distant metastases.
An interesting and so far not reported observation was the occurrence of a second maximum in the
intensity-time profile for the [1-13C]pyruvate and [1-13C]lactate signals. We investigated whether this
biphasic behaviour could be associated to the implantation site of the tumors or the immune status
of the mice: Yet, no clear-cut dependence could be established though the incidence of double
maxima tended to be higher in immunocompetent animals. The effect of the pyruvate dosage and
intensity profiles as well as studies in animals carrying mock tumors for differentiating potential
contribution from normal tissue were investigated. In both cases signal profiles with two maxima
have been observed. In the second part of the study, magnetization and concentration time profiles
of pyruvate and lactate were simulated using compartment models. A three-compartment model
with a feedback loop from lactate concentration to pyruvate uptake and/or LDH conversion rate
constant was capable of reproducing the pyruvate intensity-time profile, but there were
discrepancies to lactate experimental data. Including the results obtained in animal carrying mock
tumors indicate that this model should be extended by including a second tissue compartment.
In conclusion, 13C-MRS combined with hyperpolarized 13C-labelled substrates has the potential to
become a powerful tool in characterizing neoplasms. It can differentiate neoplastic from normal
tissue and potentially detect diffuse metastatic lesions. As numerous preclinical studies have
demonstrated, the method can be used to assess therapy response at the level of individuals.
Methodological improvements should aim at addressing tumor heterogeneity and improving
interpretation of metabolic data at a quantitative level. Development of novel hyperpolarized
substrates, which give insights into complementary metabolic events, will further make dissolution
DNP an attractive tool in metabolism related disease studies.
vi
Zusammenfassung
Krebs entwickelt sich durch mehrere zufällige Mutationen und klonale Selektion von Zellen, die unter
potentiell ungünstigen Bedingungen überleben können. Die Anpassungsfähigkeit von Tumorzellen an
die spezifische Mikroumgebung liefert den mutierten Zellen einen selektiven Vorteil. Für
verschiedene Krebsarten wurden Mutationen in den Stoffwechselenzymen identifiziert, welche auf
einen Zusammenhang zwischen Zellstoffwechsel und der Entstehung von Krebs hinweisen. Solche
Mutationen haben gezeigt, dass sie die Exprimierung und/oder Aktivität der Stoffwechselenzyme
beeinflussen und zu metabolischen Veränderungen führen. Die Neuprogrammierung des
Energiestoffwechsels ist ein neu erkanntes Merkmal der Tumorgewebe. Die meisten Krebszellen
metabolisieren Glucose durch Glykolyse, im Gegensatz zu normalen Zellen, die Glucose vollständig
durch oxidative Phosphorylierung abbauen. Diese Umstellung auf aeroben Glykolyse (WarburgEffekt) mit Laktatproduktion und erhöhtem Glukoseverbrauch ist wichtig für die schnelle
Vermehrung von Krebszellen.
Metabolische
Vorgänge
können
mit
grosser
chemischer
Spezifität
mittels
Magnetresonanzspektroskopie (MRS) und MRS-Bildgebung (MRSI) nichtinvasiv und ohne
ionisierende Strahlung untersucht werden. Diese ermöglichen zudem, gleichzeitig mehrere
Metaboliten zu beobachten. Allerdings leiden MR Methoden aufgrund der niedrigen Quantenenergie
der Resonanzprozesse unter geringer Empfindlichkeit; die zeitliche und räumliche Auflösung ist somit
begrenzt. Dynamische Kernpolarisation (DNP) ermöglicht es, diese Einschränkung vorübergehend zu
überwinden, indem man mit einem hyperpolarisierten Zustand eine 10,000-fach erhöhte
Empfindlichkeit generiert. Dies ermöglicht es, die 13C-MRS und die 13C-MRSI Stoffwechselprodukte zu
identifizieren und öffnet ein Fenster, durch das die Dynamik metabolischer Umwandlungen,
einschließlich der wichtigsten Schritte der Glykolyse und des Zitronensäurezyklus, in vivo studiert
werden kann. Die Methode wird jedoch durch die kurze Halbwertszeit des hyperpolarisierten
Zustandes begrenzt, das hyperpolarisierte Signal kann nur für ein paar Minuten gemessen werden.
Aufgrund der erhöhten aeroben Glykolyse in Tumoren, einem wichtigen Merkmal von Krebs, stellt
hyperpolarisiertes [1-13C]Pyruvat ein attraktives Ziel für diagnostische Zwecke und zur Beurteilung
von Therapiewirkungen dar. Pyruvat hat eine Torwächterrolle im Glukose-Stoffwechsel und wird
unter anderem über die Laktatdehydrogenase (LDH) zu Lactat umgewandelt. LDH ist ein häufig
hochreguliertes Enzym in Tumoren. Präklinische Studien, die 13C markiertes Pyruvat als Substrat
verwendet haben, haben gezeigt, dass Tumore ein höhere Laktat Markierung im Vergleich zu
normalen
Gewebe
aufgewiesen
haben.
Sie
stellen
somit
ein
nicht-invasives
Quantifizierungsverfahren für den Warburg Effekt dar und zeigen, dass hyperpolarisiertes Pyruvat
eine wertvolle Sonde für onkologische Bildgebung sein kann.
Das Ziel dieser Arbeit war, den Einfluss der Mikroumgebung auf den Tumormetabolismus zu
bewerten, indem die LDH Reaktion als Marker für glykolytische Aktivität herangezogen wurde. Dies
beinhaltete die Etablierung eines zuverlässigen Versuchsprotokolls für Hyperpolarisation durch
dynamische Kernpolarisation von 13C-markierten Verbindungen und die Optimierung der
Akquisitionsverfahren für in vivo MR-Spektroskopie von in Mäusen implantierten Tumoren, sowie die
Entwicklung und Umsetzung von geeigneten Analysetools.
vii
Zusammenfassung
Die Tumor-Mikroumgebung hat einen großen Einfluss auf Tumorentstehung und Therapiereaktion.
Deshalb untersuchten wir, inwieweit die glykolytische Aktivität im murinen Brusttumor, wie sie durch
die Umwandlung von Pyruvat zu Laktat durch das LDH Enzym widergegeben ist, vom
Implantationsort abhängt. Die LDH Kinetik in orthotopisch implantierten Tumoren zeigte nur eine
schwache Abhängigkeit von der Größe des Tumors und war unabhängig vom Immunstatus der
Mäuse (immunkompetenten versus immungeschwächte Mäuse). In subkutanen Tumoren zeigt sich
eine ausgeprägtere Volumenabhängigkeit der kLDH in BALB/c, aber nicht in BALB/c Nacktmäusen,
obwohl die beobachteten Werte im Bereich von anderen beobachtete Gruppe lagen. Insgesamt
haben wir festgestellt, dass Implanatationsort und Immunkompetenz nur einen geringen Einfluss auf
die Tumorwachstumsrate und metabolische Aktivität (kLDH) haben, was darauf hinweist, dass diese
Parameter weitgehend durch die intrinsischen Eigenschaften der 4T1 Zellen geregelt werden. Diese
Schlussfolgerung wird durch die Tatsache unterstützt, dass genetisch entwickelte 4T1 Zellen mit
einem grün fluoreszierende Protein (GFP)-Reporter-Gen eine deutlich reduzierte Wachstumsrate und
kLDH Werte aufweisen. Schliesslich konnten wir keinen Unterschied zwischen LDH-Aktivität in 4T1 und
verwandten 67NR Tumorzellen feststellen, die eine unterschiedliche Neigung aufweisen,
Fernmetstasen zu bilden.
Eine interessante und bisher noch nicht beschriebene Beobachtung war das Auftreten eines zweiten
Maximums im Intensitäts-Zeit-Profil der [1-13C]Pyruvat und [1-13C]Laktat-Signale. Wir untersuchten,
ob dieses biphasische Verhalten mit dem Implantationsort der Tumoren oder dem Immunstatus der
Mäuse in Verbindung gebracht werden konnte. Es konnte jedoch keine eindeutige Abhängigkeit
festgestellt werden, obwohl die Häufigkeit von Doppelmaxima in immunkompetenten Tieren leicht
erhöht war. Weiterhin wurde die Auswirkung der Pyruvat-Dosierung und der Intensitätsprofile
untersucht, sowie Studien an Tieren mit Tumoratrappen durchgeführt, um einen möglichen Beitrag
von normalem Gewebe zu untersuchen. In beiden Fällen sind Signalprofile mit zwei Maxima
beobachtet worden. Im zweiten Teil der Studie wurden die Magnetisierung und Konzentrations-ZeitProfile von Pyruvat und Laktat mit Kompartimentmodellen simuliert. Ein Drei-Kompartiment-Modell
mit einer Rückkopplungsschleife von Laktat-Konzentration zu Pyruvat Aufnahme und/oder LDH
Reaktionsgeschwindigkeit konnte das Pyruvat-Intensitäts-Zeit-Profil reproduzieren, jedoch gab es
Abweichungen zu den experimentellen Laktat-Daten. Die Resultate, die in den Tieren mit
Tumoratrappen erzielt wurden, deuten darauf hin, dass dieses Modell um ein zweites
Gewebekompartiment ergänzt werden sollte.
Abschließend lässt sich zusammenfassen, dass das Kombinieren von 13C-MRS mit hyperpolarisierten
13
C-markierten Substraten Potenzial hat, als leistungsfähiges Werkzeug bei der Charakterisierung von
Neoplasmen verwendet zu werden. So kann neoplastisches von normalem Gewebe unterscheiden
und diffuse metastatische Läsionen erkannt werden. Wie zahlreiche präklinische Studien gezeigt
haben, kann dieses Verfahren verwendet werden, um die Therapiereaktion auf der Ebene einzelner
Individuen zu beurteilen. Methodische Verbesserungen sollten künftig auf die Tumorheterogenität
abzielen und die quantitative Erfassung der metabolischen Daten verbessern. Die Entwicklung
neuartiger hyperpolarisierter Substrate, die Einblicke in komplementäre metabolische Ereignisse
geben, wird DNP weiter zum attraktiven Werkzeug für Studien Metabolismus-bezogener
Erkrankungen machen.
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