ZIP - FreiDok - Albert-Ludwigs

Aus dem Department für Pathologie
Institut für Klinische Pathologie
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.
Die Rolle von Rap1a in Dendritischen Zellen und
GvHD nach Stammzelltransplantation
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
Vorgelegt 2016
von Juliane Katharina Steinmann
geboren in Rüsselsheim
2
Dekanin:
Prof. Dr. Kerstin Krieglstein
1. Gutachter:
Prof. Dr. Dr. J. Scheele
2. Gutachter:
PD Dr. H. Kropshofer
Jahr der Promotion:
2016
3
1
Inhaltsverzeichnis
Einleitung..................................................................................................................................................6
1.1
DendritischeZellen.................................................................................................................................................6
1.1.1
Antigenaufnahme,ReifungundMigrationindenLymphknoten.........................................7
1.1.2
Antigenprä sentation,T-Zell-AktivierungundSelbsttoleranz................................................8
1.1.3
SignalwegeinDC.......................................................................................................................................9
1.2
AllogeneKnochenmark-undStammzelltransplantation...................................................................10
1.3
Graft-versus-Host-Disease(GvHD)................................................................................................................11
1.3.1
PathophysiologiederakutenGvHD................................................................................................12
1.3.1.1 Phase1:KonditionierungundAktivierungvonAPC...........................................................................13
1.3.1.2 Phase2:T-Zellaktivierung..............................................................................................................................13
1.3.1.3 Phase3:EffektorphasemitGewebeschä digung....................................................................................14
1.3.2
ChronischeGvHD....................................................................................................................................14
1.3.3
ProphylaxeundTherapiederGvHD..............................................................................................15
1.4
Kleine,monomereG-Proteine.........................................................................................................................16
1.5
Rap1...........................................................................................................................................................................18
1.5.1
RegulationvonRap1.............................................................................................................................18
1.5.1.1 Rap1GEFsundGAPs.........................................................................................................................................19
1.5.2
FunktionenvonRap1...........................................................................................................................20
1.5.2.1 Regulationdesmitogen-activatedproteinkinaseSignalweges.....................................................20
1.5.2.2 RegulationderZelladhä sion..........................................................................................................................22
1.5.2.3 ZellmigrationundHomingvonhä matopoetischenStammzellen.................................................23
2
1.5.3
Rap1aKnockoutMaus..........................................................................................................................26
1.5.4
ZielsetzungderArbeit..........................................................................................................................27
MaterialundMethoden.....................................................................................................................28
2.1
Mausstämme..........................................................................................................................................................28
2.2
Genotypisierung....................................................................................................................................................28
2.2.1
DNA-Isolation...........................................................................................................................................28
2.2.2
DNA-MessungamNanoDropND8000Spektralphotometer...............................................29
2.2.3
Polymerase-Kettenreaktion(PCR).................................................................................................30
2.2.4
Primer.........................................................................................................................................................31
2.2.5
Gelelektrophorese..................................................................................................................................32
2.3
Zellkultur..................................................................................................................................................................33
2.3.1
GewinnungvonKnochenmarkzellen.............................................................................................33
2.3.2
Zellzahl-Bestimmung............................................................................................................................34
2.3.3
KultivierungvonDCausKnochenmark........................................................................................34
4
Inhaltsverzeichnis
2.3.4
ReinheitskontrollederDC..................................................................................................................34
2.4
Migrationsassay(Boyden-Kammer-Assay)...............................................................................................34
2.5
PhänotypisierungvonDC..................................................................................................................................36
2.6
Durchflusszytometrie..........................................................................................................................................37
2.7
DC-vermittelteSensibilisierungimKontaktallergiemodell...............................................................39
2.8
DCMigrationinvivo............................................................................................................................................40
2.9
AllogeneStammzelltransplantationundInduktioneinerGvHDimMausmodell....................41
2.9.1
IsolierungvonKnochenmarkzellen...............................................................................................42
2.9.2
GewinnungvonT-ZellendurchMACS-Positivselektion........................................................42
2.9.3
Bestrahlung...............................................................................................................................................43
2.9.4
Transplantation.......................................................................................................................................43
2.9.5
EngraftmentundChimä rismusvonRap1a-/-Knochenmarkzellenim
Transplantations-Mausmodell...........................................................................................................................43
2.10
3
4
invivoBiolumineszenz-Imaging(BLI)...................................................................................................44
Ergebnisse..............................................................................................................................................45
3.1
EinflussvonRap1aaufdieMigrationvonDC..........................................................................................45
3.2
EinflussvonRap1aaufdenPhänotypvonDC.........................................................................................47
3.3
DC-vermittelteSensibilisierungimKontaktallergie-Modell..............................................................50
3.4
DCMigrationinvivo............................................................................................................................................51
3.5
AllogeneStammzelltransplantationundGvHDMausmodell............................................................53
3.5.1
RollevonRap1abeiderGvHD..........................................................................................................53
3.5.2
RollevonRap1abeiHomingundEngraftment.........................................................................54
Diskussion..............................................................................................................................................57
4.1
DieRollevonRap1ainDC................................................................................................................................57
4.1.1
KompensationdurchRap1b..............................................................................................................57
4.1.2
Migration....................................................................................................................................................57
4.1.3
ImmunologischeSynapseundT-Zellaktivierung.....................................................................60
4.1.4
Phä notyp....................................................................................................................................................61
4.2
DieRollevonRap1inGvHDundEngraftment........................................................................................63
4.2.1
GvHD............................................................................................................................................................63
4.2.2
Engraftment..............................................................................................................................................66
4.3
Ausblick.....................................................................................................................................................................67
5
Zusammenfassung...............................................................................................................................69
6
Literaturverzeichnis...........................................................................................................................70
5
Inhaltsverzeichnis
7
Abkürzungsverzeichnis.....................................................................................................................86
8
Abbildungsverzeichnis......................................................................................................................89
9
Lebenslauf..............................................................................................................................................91
10
Publikationen....................................................................................................................................92
11
Danksagung.......................................................................................................................................93
6
Einleitung
1
Einleitung
1.1
Dendritische Zellen
Dendritische Zellen (DC), die wegen ihrer langen, baumartig verzweigten Zellfortsätze so
benannt wurden (Steinman and Cohn, 1973), bilden ein System von spezialisierten Antigenpräsentierenden Zellen (APC) und haben zentrale Bedeutung für die Erkennung einer enormen Vielzahl von Antigenen und der Initiierung und Kontrolle der Immunantwort. Sie sind
die wichtigsten APCs um naive T-Zellen zu aktivieren und stellen die entscheidende Nahtstelle zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem dar.
Konventionelle DC gehen aus hämatopoetischen Vorläuferzellen, unter der Kontrolle mehrerer löslicher Wachstumsfaktoren, z.B. GM-CSF (granulocyte/macrophage colony-stimulating
factor), Interleukin 3 (IL-3) und FLT3L (fms-related tyrosine kinase 3 ligand), hervor (Abbildung 1-1, (Shortman and Naik, 2007)). Weitere Untergruppen bilden plasmazytoide DC sowie
aus Monozyten hervorgehende DC (monocyte-derived DC) (Satpathy et al., 2012). Auf diese
Untergruppen wird in diesem Rahmen nicht genauer eingegangen. DC werden vor allem in
lymphatischen Geweben, Schleimhaut-Epithelien, Organparenchym (Kupffer-Zellen der Leber) und der Haut (Langerhans-Zellen, dermale DC) gefunden (Abbas et al., 2012). Auf ihre
Funktion und Besonderheiten soll in den folgenden Kapiteln näher eingegangen werden.
Abbildung 1-1: Die dendritische Zelle in der Hämatopoese. Vereinfachte Darstellung. Aus einer multipotenten Stammzelle entwickeln sich myeloische und lymphatische Vorläuferzellen, aus denen die verschiedenen Immunzellen der myeloischen
bzw. lymphatischen Zellreihe hervorgehen. Dendritische Zellen entwickeln sich unter
dem Einfluss verschiedener Wachstumsfaktoren, z.B. FLT3L. Es werden konventionelle DC und plasmazytoide DC unterschieden, wobei diese in weitere Untergruppen
unterteilt werden können (modifiziert nach Shortman und Naik 2007).
7
Einleitung
1.1.1 Antigenaufnahme, Reifung und Migration in den Lymphknoten
In den meisten Geweben liegen DC in einem unreifen Stadium vor, in dem sie nicht zur TZell-Aktivierung in der Lage sind. Sie sind optimal ausgestattet, um Antigene aus ihrer Umgebung aufzunehmen (Banchereau and Steinman, 1998). So können sie Partikel und Mikroorganismen phagozytieren (Inaba et al., 1993; Sousa et al., 1993), extrazelluläre Flüssigkeiten
und gelöste Partikel durch Mikro- und Makropinozytose aufnehmen (Sallusto et al., 1995)
und sie exprimieren verschiedene Endozytoserezeptoren, z.B. C-Typ Lektin Rezeptoren, wie
den Makrophagen-Mannose-Rezeptor (MMR, CD206) und DEC-205 (dendritic and epithelial
cells 205 kDa, CD205), ebenso wie Fcγ- und Fcε-Rezeptoren (Jiang et al., 1995; Sallusto and
Lanzavecchia, 1994; Sallusto et al., 1995). Antigene werden aufgenommen und zu MHC (major histocompatibility complex)-II-reichen Lysosomen und späten Endosomen transportiert,
um dort später bei entsprechender Stimulation immunogene MHC-II-Peptid-Komplexe zu
bilden (Inaba et al., 2000).
Die alleinige Antigenaufnahme führt nicht zur Reifung der DC, es sind weitere Stimuli notwendig. Dies sind z.B. mikrobielle Substanzen (pathogen-associated molecular patterns,
PAMPs) wie Lipopolysaccharid (LPS), oder Zytokine wie Tumornekrosefaktor-α (TNF-α)
und Interleukin-1 (IL-1), die an entsprechende Rezeptoren, z.B. toll-like Rezeptoren (TLR)
und zytoplasmatische pattern-recognition Rezeptoren (PRR) binden. Auch die Interaktion der
kostimulatorischen Moleküle CD40 und CD40L (CD40 Ligand) auf T-Zell-Seite führt zur
DC-Reifung (Abbas et al., 2012). Aktivierung von TLR, IL-1 Rezeptoren und TNF Rezeptoren führen u.a. zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB (nuclear factor κB) und verschiedener MAPK (mitogen activated protein kinase) Signalwege. Es kommt zu einem starken Anstieg der Expression von Peptid-beladenen MHC-Molekülen sowie kostimulatorischen
Molekülen (CD40, CD58, CD80, CD86) auf der Zelloberfläche, während die Endozytoserezeptoren internalisiert werden (Mellman and Steinman, 2001; Nakahara et al., 2006). Die
Synthese von Zytokinen, z.b. IL-12 und Typ-I Interferon, wird induziert, und trägt zur Verstärkung der angeborenen und adaptiven Immunantwort bei (Steinman, 2007). Zudem kommt
es zu einem Wechsel der exprimierten Chemokin-Rezeptoren und erhöhten Expression von
CCR7 (CC-Motiv Chemokinrezeptor 7) (Allavena et al., 2000). Morphologische Veränderungen beinhalten ein Verminderung von Adhäsionsmolekülen und Reorganisation des Zytoskeletts, wodurch eine hohe Zellmotilität erreicht wird (Winzler et al., 1997). Die reifenden DC
lösen ihre Adhäsion in Epithelien oder Geweben und migrieren durch die Lymphgefäße zu
8
Einleitung
lokalen Lymphknoten, um dort die T-Zell-Immunantwort zu induzieren. Diese Migration wird
hauptsächlich durch CCR7, den Rezeptor für die Chemokine CCL19 und CCL21, die von TZellen in den Lymphknoten sezerniert werden, kontrolliert. Naive T-Zellen exprimieren ebenfalls CCR7, wodurch das Zusammentreffen der DC und T-Zellen im Lymphknoten erreicht
wird (Abbas et al., 2012). Weiter ist ein Synergismus der CCR7 Liganden mit CXCL12, dem
Liganden für den Chemokinrezeptor CXCR4, für die Migration von reifen DC beschrieben
(Gouwy et al., 2014; Kabashima et al., 2007).
1.1.2 Antigenpräsentation, T-Zell-Aktivierung und Selbsttoleranz
Naive T-Zellen, die noch keinen Antigenkontakt hatten, befinden sich in einem Ruhezustand
und zirkulieren durch den Körper. Erkennen sie ein durch APC präsentiertes Antigen, kommt
es zur Aktivierung und zur Reifung in potente Effektor-T-Zellen, die eine spezifische Immunantwort generieren (Abbas et al., 2012).
Zytosolische Peptidantigene werden in DC auf MHC-I Moleküle geladen und von CD8+ zytotoxischen T-Zellen (CTL) erkannt, während durch Endozytose aufgenommene extrazelluläre
Antigene oder auch endosomale Selbst-Antigene auf MHC-II Moleküle geladen und von
CD4+ T-Helfer-Zellen (TH-Zelle) erkannt werden. Bei der sogenannten Kreuzpräsentation
können DC durch Endozytose von z.B. Tumor- oder Virus-infizierten Zellen deren Antigene
über Transport in das Zytosol auf MHC-I Molekülen präsentieren und so CTL aktivieren
(Abbas et al., 2012).
Eine Vielzahl von Molekülen sind an der DC-T-Zell Interaktion beteiligt. Die Region des
Kontakts zwischen DC und T-Zelle wird immunologische Synapse genannt (Dustin and
Shaw, 1999). Zusätzlich zur Erkennung des MHC-Peptid Komplexes durch den T-ZellRezeptor (TCR) und den CD4- oder CD8-Korezeptor ist die Interaktion zwischen kostimulatorischen Molekülen und deren Liganden für die Aktivierung obligat (2-Signal Hypothese,
(Baxter and Hodgkin, 2002)). Die größte Rolle spielen hierbei die beiden kostimulatorischen
Moleküle B7-1 (CD80) und B7-2 (CD86) auf aktivierten DC und deren Rezeptor CD28 auf
T-Zellen (Caux et al., 1994; Inaba et al., 1994). Die Zusammenlagerung der DC und T-Zellen
wird durch Interaktion verschiedener Adhäsionsmoleküle, v.a. lymphocyte function-associated
antigen 1 (LFA-1) auf der T-Zelle mit intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) auf der
APC, vermittelt und stabilisiert (Banchereau et al., 2000; Wülfing et al., 1998). Die Aktivierung der T-Zellen über den TCR und CD28 induziert verschiedene MAPK Signalwege (Dong
9
Einleitung
et al., 2002; Rincón et al., 2001; Tybulewicz, 2005), Phospholipase C (PLC) und Calciumund Diacylglycerol (DAG)-abhängige Signalwege (Tybulewicz, 2005), die wiederum zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren wie NFAT (nuclear factor of activated T-cells), AP-1
(activator protein 1) und NF-κB führen (Rincón et al., 2001). Schließlich kommt es zur klonalen Expansion, Zytokinproduktion (IL-2) und Differenzierung in Effektor- und GedächtnisT-Zellen (Abbas et al., 2012). Effektor-CD4+-TH-Zellen differenzieren abhängig von ihrer
Zytokin-Umgebung und DC-Kostimulation in funktionelle Untergruppen. Dieser Vorgang
wird auch Polarisation genannt (Zhu et al., 2010). Die Untergruppen werden nach ihrer Zytokin-Produktion und Funktion eingeteilt (Abbas et al., 2012). Fehlende Kostimulation durch
z.B. CD28 oder eingeschränkte Adhäsion in der immunologischen Synapse führt zu verminderter IL-2 Ausschüttung und nachfolgend zu verminderter Aktivierung von T-Zellen oder zu
funktionaler Unempfänglichkeit, auch Anergie genannt (Jenkins and Schwartz, 1987; Powell
et al., 1998). Wahrscheinlich werden Autoantigene ohne Kostimulation für spezifische TZellen auf naiven DC präsentiert und so Toleranz induziert (Steinman et al., 2003).
1.1.3 Signalwege in DC
Die Funktionen von DC und T-Zellen werden durch ein komplexes Netzwerk von intrazellulären Signalwegen gesteuert, welches in diesem Rahmen nicht hinreichend erläutert werden
kann. Es sollen einige distinkte, bekannte Signalwege aufgezeigt werden. DC erhalten wichtige Signale durch PRR, z.B. TLR, die PAMPs erkennen. Es sind eine Vielzahl von TLR bekannt, die jeweils unterschiedliche PAMPs detektieren (Akira et al., 2006). Über TLR induzierte Signalkaskaden kommt es zur Induktion verschiedener Gene, die für die DC Reifung
und Entwicklung der Abwehrfunktion verantwortlich sind. Nach Aktivierung dimerisieren die
TLR und rekrutieren Adaptermoleküle, u.a. MyD88 (myeloid differentiation primary response
gene 88) und TRIF (TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β), die nachfolgend
über mehrere Schritte zur Aktivierung von NF-κB und MAP Kinasen und so zur Produktion
von proinflammatorischen Zytokinen und Typ I Interferon führen (Akira et al., 2006; Takeda
and Akira, 2005). Weitere wichtige Signale bekommen DC über G-Protein-gekoppelte Chemokinrezeptoren. Wichtige Rezeptoren auf reifen DC sind CCR7 und CXCR4, die über Gαi,
Gαq und Gα12 verschiedene Signalwege induzieren und so das Zellüberleben, Chemotaxis,
Endozytose, das Aktinzytoskelett und die Migrationsgeschwindigkeit regulieren (Liu and Shi,
2014; Sánchez-Sánchez et al., 2006; Shi et al., 2007).
10
Einleitung
1.2
Allogene Knochenmark- und Stammzelltransplantation
Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (alloHSZT) ist eine etablierte Therapie für viele erworbene und angeborene Erkankungen des hämatopoetischen Systems, inklusive des Immunsystems und von Stoffwechselerkrankungen. Die Hauptindikationen in
Deutschland 2013 waren akute Leukämien (48,8 %), das myelodysplastisches Syndrom
(MDS, 14,3%), Non-Hodgkin-Lymphome (10,9%), das Multiple Myelom (6,8%) und gutartige Erkrankungen (5,8%) (Hilgendorf et al., 2015).
Man unterscheidet grundsätzlich die autologe von der allogenen HSZT. Bei der autologen
HSZT werden eigene Stammzellen des Patienten während der Remissionsphase mobilisiert,
durch Leukapherese gewonnen und nach Durchführung einer hochdosierten, myeloablativen
Chemotherapie zurückinfundiert, um so das hämatopoetische System des Patienten zu rekonstituieren. Indikationen für die autologe HSZT sind vor allem das Multiple Myelom, NonHodgkin- und Hodgkin-Lymphome (Passweg et al., 2015).
Bei der alloHSZT werden Stammzellen eines fremden Spenders in den Patienten transfundiert. Zusätzlich zur Konditionierungstherapie kommt hierbei der Transplantat-gegenMalignom/Leukämie-Reaktion (Graft-versus-Tumor/Leukemia-Effect, GvT/GvL), bei der
alloreaktive Spender-T-Zellen verbliebene Krebszellen angreifen und zerstören, große therapeutische Bedeutung zu.
Voraussetzung für das Gelingen der alloHSZT ist die HLA-(human leukocyte antigen)Kompatibilität des Spenders mit dem Empfänger, sowie die Konditionierung des Empfängers,
also die Eliminierung des eigenen hämatopoetischen Systems und der malignen Zellen. Für
die myeloablative Therapie stehen prinzipiell die hochdosierte Chemotherapie und die Bestrahlung in verschiedenen Konditionierungsprotokollen zur Verfügung. Quelle für Stammzellen können HLA-idente Geschwisterspender oder Fremdspender sein, außerdem werden heutzutage auch zunehmend Nabelschnurblut und haploidente Spender verwendet ((Beelen and
Mytilineos), Deutsches Register für Stammzelltransplantationen). Die Stammzellen werden
meist durch Leukapherese nach Mobilisierung mit G-CSF aus dem peripheren Blut gewonnen, alternativ durch klassische Knochenmarkspunktion.
Die allogene Stammzelltransplantation beinhaltet eine Reihe schwerwiegender Risiken und
Komplikationen. Durch die toxischen Effekte der myeloablativen Therapie leiden die Patienten unter Entzündungen der Schleimhäute/Stomatitis, Durchfall, Übelkeit, Erbrechen, hämorrhagische Zystitis, Haarausfall sowie organspezifische Nebenwirkungen der Zytostatika. In
11
Einleitung
den ersten Wochen nach der Transplantation, bevor es zum Anwachsen der hämatopoetischen
Spenderzellen in der Knochenmarknische (Engraftment) und Rekonstitution der Hämatopoese
kommt, besteht durch das fehlende Immunsystem ein erhebliches Infektionsrisiko. Vor allem
Infektionen durch Bakterien, Pilze und opportunistische Erreger wie CMV und EBV sind häufig. Mögliche Spätfolgen sind Zweitmalignome, Gonadeninsuffizienz und Wachstumsstörungen bei Kindern. Eine weitere erhebliche Gefahr ist das Auftreten einer Transplantat-gegenWirt-Reaktion (Graft-versus-Host-Disease, GvHD) (siehe Kapitel 1.3) (Buchholz and Ganser,
2009).
1.3
Graft-versus-Host-Disease (GvHD)
Die Graft-versus-Host-Disease ist die hauptsächlich auftretende, lebensbedrohliche Komplikation nach alloHSZT. Dabei greifen aktivierte Spender-T-Zellen das Gewebe des immuninkompetenten Empfängers an und zerstören es. Bei der akuten GvHD (aGvHD), die nach
alter Definition bis 100 Tage nach der HSZT auftritt, sind vor allem die Haut, der Gastrointestinaltrakt und die Leber betroffen. Bei der chronischen GvHD (cGvHD), die frühestens 100
Tage nach alloHSZT auftritt und Hauptgrund für die späte non-relapse Mortalität (NRM) ist,
kommt es zu einer Vielzahl von Symptomen, die an Autoimmunerkrankungen erinnern
(Ferrara et al., 2009). Die Frequenz der aGvHD korreliert direkt mit dem Grad der HLA Unterschiede (mismatch) zwischen Spender und Empfänger. HLAs sind hoch polymorphe Proteine und werden durch die MHC Gene codiert. Bei der sogenannten Typisierung werden durch
DNA-Sequenzierung die Klasse-I-Merkmale HLA-A, -B und -C und die Klasse-II-Merkmale
HLA-DRB1 und DQB1 analysiert (Deutsche Knochenmarkspenderdatei). Angestrebt wird
eine 100-prozentige Übereinstimmung von Spender und Empfänger. Trotz identischer HLAMerkmale kommt es allerdings bei ca. 40% dieser Patienten zur Entwicklung einer aGvHD,
was auf genetische Unterschiede in sogenannten minor histocompatibility antigens (miHA)
zurückzuführen ist. Liegt ein mismatch in einem HLA-Antigen vor, entwickeln ca. 60-80%
eine aGvHD. Bei Nabelschnurtransplantaten ist das Risiko trotz mismatch geringer (Ferrara et
al., 2009). Weitere Risikofaktoren sind höheres Spender- und Empfängeralter, weiblicher
Spender mit männlichem Empfänger und die Intensität der Konditionierungstherapie durch
den dadurch entstehenden Gewebeschaden (Jacobsohn and Vogelsang, 2007).
Die GvHD wird in vier Schweregrade, I (mild), II (moderat), III (schwer) und IV (sehr
schwer) eingeteilt. Die schwere aGvHD hat eine schlechte Prognose mit einer 5-Jahres-
12
Einleitung
Überlebensrate von etwa 25% für Grad III und 5% für Grad IV GvHD (Ferrara et al., 2009).
1.3.1 Pathophysiologie der akuten GvHD
1966 formulierte Billingham drei Voraussetzungen für die Entwicklung einer GvHD: (1) Vorhandensein von immunkompetenten Zellen im Transplantat; (2) Expression von Gewebemerkmalen im Empfänger, die die Spenderzellen als fremd erkennen; (3) Unfähigkeit des
Empfänger-Immunsystems, die transplantierten Zellen zu eliminieren (Billingham, 1966).
Ferrara et al. haben ein Modell mit drei Phasen entwickelt (Abbildung 1-2):
Abbildung 1-2: Pathophysiologie der aktuten GvHD. Drei-Phasen-Modell der Entstehung
der GvHD: 1) Aktivierung der Empfänger APCs durch Konditionierung und Gewebeschädigung;
(2) Akivierung, Expansion, Differenzierung und Migration der Spender-(donor) T-Zellen; (3)
Schädigung der Zielorgane wie Haut, Darm und Leber (modifiziert nach Ferrara et al., 2009)
13
Einleitung
1.3.1.1 Phase 1: Konditionierung und Aktivierung von APC
Durch Erkrankung und Konditionierungstherapie kommt es zu Gewebeschäden mit Ausschüttung von sogenannten danger signals, z.B. proinflammatorischen Zytokinen (TNFα, IL-1 und
-6), Chemokinen, oder PAMPs wie LPS aus dem Darm, die zur Aktivierung von APC führen.
Diese exprimieren verstärkt Adhäsions-, MHC- und kostimulatorische Moleküle, die von
Spender-T-Zellen als histoinkompatibel erkannt werden (Ferrara et al., 2009).
1.3.1.2 Phase 2: T-Zellaktivierung
Alloreaktive Spender-T-Zellen proliferieren und differenzieren zu Effektor-T-Zellen, was
durch die in Phase I ausgeschütteten Zytokine noch verstärkt wird. Sowohl CD4+als auch
CD8+ T-Zellen sind in Mausmodellen in der Lage eine aGvHD auszulösen (Korngold and
Sprent, 1985). Empfänger APC sind ausreichend und notwendig für die Initiierung der GvHD
(Shlomchik et al., 1999), jedoch scheinen Spender APC einen intensivierenden Effekt auf die
GvHD zu haben (Matte et al., 2004). Welche Rolle DC als potenteste APC und T-ZellAktivatoren, aber auch Toleranzinduktoren spielen, ist Gegenstand aktueller Forschung
(Duffner et al., 2004; Li et al., 2012; Markey et al., 2009; Weber et al., 2014).
Kostimulatorische Signalwege scheinen eine entscheidende Rolle in der GvHD in Tiermodellen zu spielen, z.B. positive CD28/B7 und CD40/CD40L und inhibitorische CTLA-4/B7 und
PD-1/PD-1L Interaktion. Hier ergeben sich mögliche Angriffspunkte für Prävention und Therapie (Blazar et al., 1994, 2001, 2003; Briones et al., 2011; Yu et al., 2000). Durch Aktivierung verschiedener Signalwege in den T-Zellen kommt es zur Transkription von Genen für
Zytokine wie IL-2, IFNγ (Interferon-γ) und TNFα entsprechend eines TH1 Phänotyps. IL-2
kontrolliert und verstärkt wiederum die alloreaktive Immunantwort durch autokrine Wirkung
auf die T-Zelle, was zu klonaler Expansion und Differenzierung führt, und zur Aktivierung
weiterer T-Zellen, natürlicher Killerzellen (NK), und TNFα produzierender Makrophagen
(Ball and Egeler, 2008). Die TH1/TH2 Polarisation scheint die Stärke der GvHD zu beeinflussen (Tanaka et al., 1997). Frühe Polarisation der Spender-T-Zellen in Richtung TH2 Phänotyp
mit IL-4 Ausschüttung und Unterdrückung der TH1 Antwort führte zu einer abgeschwächten
GvHD in einem Mausmodell (Krenger et al., 1995).
14
Einleitung
1.3.1.3
Phase 3: Effektorphase mit Gewebeschädigung
Die Effektorphase ist durch ein komplexes Zusammenspiel von zellulären Faktoren, v.a. CTL
und NK-Zellen, und inflammatorischen Molekülen wie TNFα, IFNγ, IL-1 und Stickstoffmonoxid (NO) gekennzeichnet, die gemeinsam zu einer massiven Gewebedestruktion führen.
CTL benutzen abhängig vom Zielorgan hauptsächlich den Fas- und Perforin/GranzymSignalweg um die Apoptose der Zielzellen zu induzieren (van den Brink and Burakoff, 2002).
In GvHD Modellen kann eine Überexpression verschiedener Chemokine festgestellt werden,
welche die Migration der alloreaktiven T-Zellen in die Zielorgane und –gewebe vermitteln
(Wysocki et al., 2005). Dem Darm kommt eine entscheidende Rolle bei der Verstärkung der
GvHD zu, da eine Vielzahl mikrobieller Substanzen durch die geschädigte Darmwand eindringen können, die wiederum über TLR zur Aktivierung und Reifung der DC und Ausschüttung inflammatorischer Zytokine führen. Der Gastrointestinaltrakt trägt somit zur Entwicklung des sogenannten Zytokinsturms und der daraus folgenden Entzündung bei (Hill and
Ferrara, 2000).
1.3.2 Chronische GvHD
Die chronische GvHD (cGvHD) ist noch immer die häufigste Ursache für die langfristige
Morbidität und Mortalität nach alloHSZT (Socié and Ritz, 2014). Sie tritt bei bis zu 70% aller
Patienten nach alloHSZT auf, wobei Kinder seltener betroffen sind (20-30%) (Hilgendorf et
al., 2015; Wolff et al., 2011). Höheres Patientenalter und aGvHD in der Anamnese stellen die
größten Risikofaktoren dar (Ferrara et al., 2009). In den letzten Jahren hat die Inzidenz der
cGvHD weiter zugenommen, Ursache hierfür sind die Verwendung von Fremdspendern, Verwendung von peripheren Blutstammzellen als Transplantatquelle, der zunehmende Einsatz
dosisreduzierter Konditionierungen und Donor-Lymphozyten-Infusionen (DLI) als Rezidiv
Therapie (Lee et al., 2003; Wolff et al., 2011).
Die klinische Präsentation der cGvHD ist charakteristisch und gleicht einer autoimmunen
vaskulären Erkrankung. Sowohl Klinik als auch Pathogenese unterscheiden sich deutlich von
der aGvHD (Blazar et al., 2012). Pathogenetisch liegen der cGvHD hauptsächlich autoimmune und fibrotische Vorgänge zu Grunde. Gestörte Toleranzmechanismen wie eine reduzierte
Thymusfunktion, vor allem konditionierungsbedingt oder durch eine vorbestehende aGvHD,
und Dysfunktion regulatorischer T-Zellen scheinen eine Rolle zu spielen. Sowohl allo- als
auch autoreaktive B- und T-Zellen haben einen Einfluss (Wolff et al., 2011). Die Rolle von
15
Einleitung
alloreaktiven T-Zellen wird deutlich durch die Beobachtung, dass eine T-Zell-Depletion des
Transplantats mit deutlich weniger cGvHD einhergeht, während die Transplantation von peripheren Blutstammzellen und DLI zu höheren cGvHD Raten führen (Lee et al., 2003). Die
Dysregulation von Zytokinen scheint ebenso eine Rolle zu spielen. Erhöhte Konzentrationen
von IL-1β, IL-6, IFNγ und TNF-α sind mit einem höheren Schweregrad der cGvHD assoziiert
und Patienten mit cGvHD scheinen erniedrigte Konzentrationen von IL-10, einem antiinflammatorischen Zytokin, zu haben (Barak et al., 1995; Körholz et al., 1997; Korngold and
Sprent, 1985).
Patienten mit cGvHD erleiden seltener ein Rezidiv ihrer Grunderkrankung im Vergleich zu
Patienten ohne GvHD, sodass das Gesamtüberleben von Patienten mit milder cGvHD besser
ist. Die schwere cGvHD geht jedoch immer noch mit einer hohen Letalität von ca. 50% einher
(Wolff et al., 2011), sodass dringend Fortschritte in Prävention und Therapie benötigt werden.
1.3.3 Prophylaxe und Therapie der GvHD
Zur Prävention der akuten GvHD werden Immunsuppressiva wie die Calcineurin-Inhibitoren
Cyclosporin A und Tacrolimus, der mTOR-Inhibitor Sirolimus, sowie Mycophenolat Mofetil
(MMF) und Methotrexat eingesetzt. Calcineurin-Inhibitoren wirken über Inhibition der IL-2
Produktion hemmend auf die Aktivierung der T-Zellen. Sirolimus hemmt durch Komplexbildung mit mTOR (mammalian Target of Rapamycin) verschiedene Zytokin-vermittelte Signalwege und somit die Aktivierung und den Zellzyklus der T-Zellen.
Weiter kann das Risiko für die cGvHD durch Gabe von Kaninchen-anti-ThymozytenGlobulin oder dem anti-CD52 Antikörper Alemtuzumab während der Konditionierungstherapie sowie durch Gabe von hochdosiertem Cyclophosphamid an Tag 3 und 4 nach alloHSZT
reduziert werden (Flowers and Martin, 2015).
Therapeutisch kommen in erster Linie topische und systemische Steroide, weitere Immunsuppressiva, die extrakorporale Photopherese (ECP), Tyrosinkinaseinhibitoren, IL-2, mesenchymale Stammzellen und Antikörper gegen T-Zellen und Zytokine zum Einsatz. Dabei
nimmt allerdings das Risiko für lebensbedrohliche Infektionen und eines Tumorrezidivs zu
(Ferrara et al., 2009; Flowers and Martin, 2015; Jacobsohn and Vogelsang, 2007).
In zahlreichen klinischen Studien werden weitere Möglichkeiten der GvHD-Prävention und
Therapie untersucht. Ansätze sind u.a. die Inhibition der Protein Kinase C (PKC) (Valenzuela
et al., 2009), des IL-6-Rezeptors (Paczesny et al., 2009), die direkte Injektion von ex vivo her-
16
Einleitung
gestellten regulatorischen T-Zellen (Taylor et al., 2002) und die Gabe von Statinen (Rotta et
al., 2010), deren Effekt auf eine reduzierte Farnesylierung kleiner GTPasen zurückzuführen
ist (Hechinger et al., 2013; Rotta et al., 2010).
1.4
Kleine, monomere G-Proteine
Kleine Guaninnukleotid-bindende Proteine, auch kleine G-Proteine oder kleine GTPasen genannt, sind monomere Guanosintriphosphat- (GTP)-bindende Proteine mit einer Molekülmasse von 20-40 kDa. Sie haben als molekulare Schalter eine Schlüsselposition in der zellulären
Signaltransduktion zwischen Rezeptoren und second-messenger-Systemen. Sie bilden eine
Superfamilie, auch ras-Superfamilie genannt, zu der über 150 verschiedene kleine GTPasen
gehören. Diese werden nach ihrer Struktur und funktionellen Gemeinsamkeit in die 5 Familien Ras, Rho, Rab, Ran und Arf unterteilt (Wennerberg et al., 2005). Proteine der ras-Familie
kontrollieren Genexpression, Zellproliferation und –überleben, Rho-Proteine regulieren die
Organisation des Aktin-Zytoskeletts, den Ablauf des Zellzyklus und ebenso die Genexpression. Rab- und Arf-Proteine regulieren den intrazellulären Transport von Vesikeln und Proteinen und Proteine der Ran-Familie sind für den nukleozytoplasmatischen Transport von RNA
und Proteinen zuständig (Wennerberg et al., 2005). Hoch konservierte, orthologe Proteine
finden sich z.B. in Drosophila melanogaster, C. elegans, S. cerevisiae, S. pombe sowie in
Pflanzen (Colicelli, 2004).
Die kleinen GTPasen agieren als GDP/GTP-regulierte molekulare Schalter (Vetter and
Wittinghofer, 2001). Sie haben eine hohe Affinität zu GDP und GTP und eine niedrige intrinsische GTPase-Aktivität. Der GDP/GTP-Zyklus wird durch zwei Klassen von Proteinen reguliert (Abbildung 1-3). Guanine nucleotide exchange factors (GEFs) tauschen GDP gegen GTP
aus und generieren so die aktive, GTP-gebundene Form des G-Proteins. GTPase activating
proteins (GAPs) verstärken die intrinsische, niedrige GTPase-Aktivität des G-Proteins bis zu
100.000-fach und induzieren so die schnelle Umwandlung in die GDP-gebundene, inaktive
Form. Die verschiedenen GTPasen besitzen jeweils distinkte GAPs und GEFs (Weinberg,
2013; Wennerberg et al., 2005).
Das Ras (rat sarcoma) Protein (p21) wurde als Erstes der kleinen GTPasen Anfang der 80iger
Jahre beschrieben und stellt den Prototyp dieser Proteinfamilie dar. Ras kontrolliert verschiedene intrazelluläre Signalwege, über die Vorgänge wie z.B. Zellproliferation, -differenzierung,
-adhäsion und Apoptose reguliert werden (Campbell et al., 2003). RAS Gene wurden zuerst
17
Einleitung
als retroviral transduzierte Onkogene in Harvey und Kirsten Sarkomzelllinien identifiziert, zu
denen vier homologe Gene im menschlichen Genom gefunden wurden (Chang et al., 1982;
Harvey, 1964; Kirsten and Mayer, 1969). Durch Mutationen aktivierte Formen von H-RAS, KRAS und N-RAS wurden nachfolgend in verschiedenen humanen Tumorzellen isoliert (Shih et
al., 1981). Die Mutationen beeinträchtigen z.B. die GTPase-Aktivität oder verhindern die
Bindung der GAPs, was zu einem konstitutiv aktivierten Ras-Protein und somit ständig aktivierten Signalwegen führt (Campbell et al., 2003).
Viele der GTPasen der Ras-Superfamilie werden durch Lipide modifiziert und sind dadurch
mit der Zellmembran assoziiert. Bei den meisten Proteinen der Ras, Rho und Rab Familie
beobachtet man eine kovalente, posttranslationale Modifikation des C-terminalen Cysteinrests
durch Isoprenylierung. Es werden z.B. Farnesyl- oder Geranylgeranylgruppen angehängt. Die
Lokalisierung in der Membran kann die Bindung und Aktivierung der Effektoren und die Interaktion mit den regulierenden Proteinen beeinflussen (Colicelli, 2004). Hier bieten sich Angriffspunkte
für
mögliche
Krebstherapeutika,
z.B.
Farnesyltransferase-Inhibitoren
(Malumbres and Barbacid, 2003).
Abbildung 1-3: Ras-Regulierungszyklus. Ras-Proteine
agieren als molekulare Schalter und werden mit Hilfe von
GEFs aktiviert (Ras-GTP) und durch GAPs inaktiviert
(Ras-GDP) (nach Weinberg 2014).
18
Einleitung
1.5
Rap1
Ras-verwandte GTPasen sind hochkonservierte Proteine, die große Gemeinsamkeiten in ihren
Effektordomänen besitzen und extrazelluläre Signale an verschiedene zelluläre Signalwege
koppeln. 1989 publizierten Noda und Kollegen Ergebnisse ihrer Suche nach Proteinen, welche den durch das mutierte K-ras Onkogen maligne transfomierten Phänotyp von Fibroblasten
unterdrücken könnten. Krev-1, welches identisch mit Rap1 ist, konnte die maligne Transformation rückgängig machen. Sie formulierten die Idee, dass Rap1 entweder ein Ras-Antagonist
sei, oder unabhängig vom Ras-Signalweg Zellwachstumssignale inhibieren könnte (Kitayama
et al., 1989). In den nachfolgenden Jahren zeigte sich jedoch, dass Rap1, abhängig vom jeweiligen zellulären Kontext, eine große Vielfalt an zellulären Aktivitäten vermittelt.
Rap1 (Ras-proximate 1), ein 21 kD schweres kleines G-Protein, ist zu ca. 50% homolog zu
Ras und damit sein nächster Verwandter. Die beiden Proteine besitzen eine identische Effektordomäne (Nagata et al., 1989; Pizon et al., 1988). Die Rap-Unterfamilie besteht aus den
Isoformen Rap1a, Rap1b sowie Rap2a, Rap2b und Rap2c, die untereinander zu 95 bzw. 90%
identisch sind. Rap1 und Rap2 sind zu 60% homolog, regulieren jedoch jeweils eigene Signalwege (Bokoch, 1993; Gloerich and Bos, 2011). Rap1a und Rap1b werden beide posttranslational durch Geranylgeranylierung modifiziert. Rap1a wird ubiquitär in den meisten
Geweben exprimiert und ist vor allem in verschiedenen Membrankompartimenten, wie z.B
der Plasmamembran, dem perinukleären Golgiapparat, dem Endoplasmatischen Retikulum,
endozytotischen und sekretorischen Vesikeln und der Zellkernhülle, in einer Vielzahl verschiedener Zelltypen lokalisiert (Gloerich and Bos, 2011). Rap1b kommt vor allem in Blutplättchen vor und ist dort mit dem Zytoskelett assoziiert (Bokoch, 1993). Für beide Isoformen
gibt es knockout-Mausmodelle, wobei der Doppel-knockout letal ist (Wittchen et al., 2011). In
unserer Gruppe wurde mit der Rap1a-knockout-Maus gearbeitet, die in Kapitel 1.5.3 beschrieben wird, um die Funktionen von Rap1a genauer zu untersuchen. In den folgenden Kapiteln werden die Regulation von Rap1 und die verschiedenen bekannten Funktionen in unterschiedlichen Kontexten beschrieben.
1.5.1 Regulation von Rap1
Rap1 wird durch eine große Vielzahl von externen Stimuli, wie z.B. Wachstumsfaktoren, Peptidhormone, Neurotransmitter, Zytokinen, Chemokinen, Zelladhäsionsmolekülen, Antigenen
und physikalischen Reizen, wie Zelldehnung oder –kontraktion, aktiviert (Minato et al.,
19
Einleitung
2007). Rap1 wiederum interagiert mit einer Reihe von nachgeschalteten Effektor-Molekülen,
die
typischerweise
eine
Ras/Rap-Bindungs-Domäne
(RBD),
eine
Ras/Rap-
Assoziationsdomäne (RA) oder andere RapGTP-bindende Domänen besitzen (Gloerich and
Bos, 2011). Wie in Kapitel 1.4 beschrieben, wird die Aktivierung zu Rap1GTP durch GEFs
vermittelt, die Inaktivierung zu Rap1GDP durch GAPs. Für Rap1 sind verschiedene distinkte
GEFs und GAPs beschrieben.
1.5.1.1 Rap1 GEFs und GAPs
Rap1 GEFs zeichnen sich durch eine gemeinsame katalytische GEF Domäne aus und sind mit
verschiedenen Rezeptoren oder intrazellulären second messengern verbunden (Hattori and
Minato, 2003). Der erste erkannte Rap1-GEF war C3G (Crk SH3-domain-binding guaninenucleotide releasing factor), welches ubiquitär exprimiert wird und an die SH3 (Src homology) Domäne von Crk (CT10 (chicken tumor virus number 10) regulator of kinase) Adapterproteinen bindet. Bei Aktivierung von Rezeptortyrosinkinasen wird C3G an die Plasmamembran verlagert und dort phosphoryliert, wodurch es wiederum Rap1 aktivieren kann (Gotoh et
al., 1995; Ichiba et al., 1999).
CalDAG-GEFs (Ca2+ Diacylglycerol GEF) besitzen eine Ca2+-Ionen und DAG Bindungsstelle
und sind daher wahrscheinlich der Phospholipase C (PLC) nachgeschaltet. Die CalDAGGEFs aktivieren spezifische GTPasen: CalDAG-GEF I aktiviert Rap1 und R-Ras und wird
hauptsächlich durch Ca2+ aktiviert, CalDAG-GEF III aktiviert Ras, Rap1, Rap2 und R-Ras
und transloziert an die Membran wenn DAG bindet (Kawasaki et al., 1998; Yamashita et al.,
2000).
Epac 1 und 2 (exchange protein directly activated by cAMP) haben Bindungstellen für cAMP
(cyclic adenosinmonophosphate), welches über eine Konformationsänderung die Interaktion
mit Rap1 ermöglicht (Bos, 2003; de Rooij et al., 1998).
PDZ (postsynaptic density-95 discs-large and zona occludens protein)-GEFs besitzen eine
PDZ-Domäne und interagieren mit verschiedenen Proteinen wie z.B. dem neuronenspezifischen S-SCAM (synaptic scaffolding molecule) bzw. MAGI (membrane-associated guanylate
kinase (MAGUK) with inverted orientation), Adapterproteinen und β-Catenin und spielen eine
Rolle bei Zell-Zell Kontakten wie z.B. tight junctions (Mino et al., 2000; Ohtsuka et al., 1999;
Pannekoek et al., 2011).
DOCK4, ein Mitglied der CDM-Familie (C. elegans ced-5, vertebrate DOCK180, Drosophila
20
Einleitung
Myoblast City), hat GEF-Aktivität für Rap und Rac und scheint ebenfalls bei der Vermittlung
von Zell-Zell-Kontakten mitzuwirken, es wird u.a. durch die kleine GTPase RhoG aktiviert
(Hiramoto et al., 2006; Yajnik et al., 2003).
Rap1 zeigt nur eine sehr niedrige intrinsische GTPase-Aktivität, weshalb für die Beendigung
des Rap1-Signals GAPs unabdingbar sind. Rap1GAP inserieren einen katalytisch aktiven Asparaginrest, wodurch die Rap1 GTPase Aktivität um ein Vielfaches verstärkt wird (Daumke et
al. 2004). Die Rap1GAPs sind konstitutiv aktiv, sodass ihr Expressionslevel die Aktivität und
die Aktivitätsschwelle von Rap1 zu bestimmen scheint (Minato et al., 2007). Sie spielen eine
wichtige Rolle für die spatiotemporale Kontrolle der Rap1 Aktivierung in Zellen (Mochizuki
et al., 2001). Es sind zwei Gruppen von RapGAPs beschrieben, die RapGAs und die SPA-1
(signal-induced proliferation-associated protein 1) Familie, welche eine katalytische Domäne, die GAP-related domain (GRD), gemeinsam haben. RapGA1 kommt ubiquitär mit Häufung im Gehirn vor, während RapGA2 in Blutplättchen beschrieben wurde (Kurachi et al.,
1997; Rubinfeld et al., 1991; Schultess et al., 2005). Zur SPA-1 Familie gehören SPA-1, SPA1-like (SPA-L) 1, auch E6TP1 (E6-targeted protein-1) bzw. SPAR genannt, und SPA-L-2 und
-3 (Hattori and Minato, 2003). E6TP1 bzw. SPA-L1 ist ein Zielmolekül für das E6 Onkoprotein der high-risk Humanen-Papilloma-Viren (HPV), welche mit dem Zervixkarzinom und
anderen genitalen Tumoren assoziiert sind, und wird durch dieses für den UbiquitinProteasom-vermittelten Proteinabbau markiert (Gao et al., 1999).
1.5.2 Funktionen von Rap1
1.5.2.1 Regulation des mitogen-activated protein kinase Signalweges
Nachdem Rap1 entdeckt worden und als möglicher Antagonist von Ras beschrieben worden
war (Kitayama et al., 1989), wurde zunächst sein Einfluss auf den Ras-MAPK Signalweg
genauer untersucht. Der Ras-MAPK Signalweg wird durch Wachstumsfaktoren aktiviert und
induziert die Expression verschiedener Gene und dadurch Zellproliferation und differenzierung. Ras-GTP bindet Raf, eine MAP Kinase Kinase Kinase (MAPKKK) und aktiviert es, wodurch es in der Lage ist, die nachgeschaltete mitogen/extracellular Kinase MEK
(MAPKK) zu phosphorylieren. MEK wiederum physophoryliert und aktiviert die extracellular signal-regulated kinases (ERK) 1 und 2 (MAPK). Ein konstitutiv angeschalteter Ras-Erk
Signalweg spielt eine zentrale Rolle in der ras-induzierten Onkogenese (Weinberg, 2013).
21
Einleitung
Rap1 scheint die Aktivierung von ERK abhängig vom Zellkontext unterschiedlich zu regulieren (Minato et al., 2007). Initial fand man, dass eine dominant aktive Rap1-Mutante (Rap
V12) die Ras-vermittelte ERK-Aktivierung abschwächen konnte, wahrscheinlich durch kompetitive Interferenz mit c-Raf1 (Cook et al., 1993; Hu et al., 1997). Rap1GTP bindet mit höherer Affinität an c-Raf1 als RasGTP, ist aber nicht in der Lage es zu phosphorylieren (Carey et
al., 2000). Dadurch wird die Aktivierung von c-Raf1 durch RasGTP verhindert und der RasERK Signalweg wird gehemmt (Bos et al., 2001; Schmitt and Stork, 2001). Ebenso konnte
gezeigt werden, dass konstitutiv aktiviertes Rap1 die Ras-ERK-vermittelte Induktion der IL-2
Expression in anergen T-Zellen über c-Raf1 hemmt und für diesen spezifischen Defekt verantwortlich ist (Boussiotis et al., 1997), während Überexpression eines Rap1GAP in normalen
T-Zellen die ERK Aktivierung über den TCR steigert (Carey et al., 2000).
Andererseits konnte in mehreren Studien gezeigt werden, dass Rap1 den MEK-ERK Signalweg selektiv über die MAPKKK B-Raf, unabhängig von Ras, aktivieren und z.B. das Zellwachstum in einer bestimmten Fibroblasten-Zelllinie stimulieren kann (Vossler et al., 1997;
Yoshida et al., 1992). Ebenfalls widersprüchlich wurde gezeigt, dass die cAMP-induzierte
Regulation von ERK und Aktivierung von Rap1 voneinander unabhängige Prozesse sind
(Enserink et al., 2002). Im Gegensatz zu c-Raf1, welches ubiquitär vorkommt, wird B-Raf nur
in bestimmten Gewebezellen, besonders in Neuronen und hämatopoetischen Zellen, exprimiert (Barnier et al., 1995), was eine Erklärung für die kontroversen Beobachtungen sein
kann.
B-Raf liegt in einer konstitutiv phosphorylierten, also aktiven Form vor, c-raf1 dagegen muss
phosphoryliert werden bevor es ERK aktivieren kann, wozu Rap1 nicht imstande ist (Carey et
al., 2000; Mason et al., 1999). In einer Studie konnte in Drosophila melanogaster, die nur eine
Raf-Isoform (DRaf) entsprechend B-Raf besitzt, konnte gezeigt werden, dass DRap1 ERK
über DRaf, unabhängig von Ras, aktiviert. Das wiederum zeigt, dass der Rap1-Raf-ERK Signalweg phylogenetisch konserviert ist (Mishra et al., 2005).
In neuronalen und hämatopoetischen Zellen konnte eine unterschiedliche Kinetik von Rasund Rap1-vermittelter ERK-Aktivierung gezeigt werden. So scheint der Ras-c-Raf1 Signalweg für die schnelle, Wachstumsfaktor-abhängige ERK-Aktivierung verantwortlich zu sein,
während Rap1-B-Raf eine nachhaltige ERK-Aktivierung bewirkt (Brummer et al., 2002;
Garcia et al., 2001; York et al., 2000). Die ERK Aktivierung über Ras scheint eher durch die
Geschwindigkeitsrate, die Aktivierung über Rap1 eher durch Dauer und Stärke des Stimulus
bestimmt zu sein (Sasagawa et al., 2005).
22
Einleitung
Weiter wird der Einfluss von Rap1 auf die p38 MAPK Signalkaskade diskutiert (Stork and
Dillon, 2005). Es konnte eine antagonistische Wirkung von Rap1 auf die IL-1 induzierte Rasabhängige Aktivierung von p38 beobachtet werden, wobei der genaue Mechanismus nicht
bekannt ist (McDermott and O’Neill, 2002; Palsson et al., 2000). Andererseits wurde die Aktivierung des Rap1/p38 MAPK Signalweges, nicht jedoch des MEK-ERK Signalweges, durch
Zell-Dehnungskräfte beschrieben, während Ras inaktiviert wird. Zellkontraktion dagegen
führt zur Aktivierung des Ras-MEK-ERK Signalweges und reduzierter Rap1 Aktivierung
(Sawada et al., 2001; Tamada et al., 2004).
1.5.2.2 Regulation der Zelladhäsion
Eine Vielzahl an Studien belegt die Rolle von Rap1 in der Zelladhäsion, darunter die Integrinvermittelte sowie die Cadherin-vermittelte Zelladhäsion (Bos, 2005). Initial konnte in HeLaZellen (humane Zerixkarzinomzelllinie, (Scherer et al., 1953)) gezeigt werden, dass Überexpression des Rap1-GAPs SPA-1 zu Abrundung und Ablösung der Zellen von der extrazellulären Matrix (EZM) führt, während Überexpression des Rap1-GEFs C3G die Ausbreitung der
Zellen auf der EZM bewirkte (Tsukamoto et al., 1999).
Mehrere Studien haben den Einfluss von Rap1 auf Integrin-regulierende zelluläre Signale
untersucht (Caron et al., 2000; Katagiri et al., 2000; Reedquist et al., 2000). Integrine sind
heterodimere Transmembranmoleküle, die an verschiedene Liganden der EZM, z.B. Fibronektin, Kollagen, Laminin oder Fibrinogen, und an Rezeptoren ihres Gegenübers, z.B.
ICAM-1 oder vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) binden (Carman and Springer,
2003; Evans and Calderwood, 2007). Integrine stellen also die Verbindung zwischen der EZM
und dem Zytoskelett her, und vermitteln Signale der EZM, die zu Reorganisation des Zytoskelett und der Aktivierung intrazellulärer Signalkaskaden führen im Sinne des „outside-in“ Signalweges (Shattil et al., 1998). Integrine können auch durch intrazelluläre Signale des sogenannten „inside-out“ Signalweges aktiviert werden (Kinbara et al., 2003).
Die Aktivität von Integrinen wird über Konformationsänderungen zwischen einer geschlossenen Form mit niedriger Affinität und einer offenen Form mit hoher Affinität reguliert. Diese
Konformationsänderungen werden durch Bindung von bestimmten Proteinen wie Talin und
RAPL (regulator of adhesion and polarization enriched in lymphocytes, s.u.) an die zytoplasmatische Integrindomäne gesteuert (Carman and Springer, 2003). Rap1 reguliert alle Integrine, die mit dem Zytoskelett assoziiert sind, also Integrine der β1-, β2- und β-3 Familie
23
Einleitung
(Carman and Springer, 2003). Rap1 scheint abhängig vom Zelltyp sowohl die Integrinaktivität bzw. Affinität als auch das Integrin-Clustering bzw. Avidität zu kontrollieren (Bos, 2005;
Crittenden et al., 2004).
Es sind verschiedene Rap1-Effektoren, die mit Integrinen interagieren, beschrieben. RAPL
bindet in Lymphozyten an Rap1GTP und assoziiert mit dem zytoplasmatischen Teil der αKette des αLβ2-Integrins (LFA-1, β2-Integrin), wodurch die offene Formation von LFA-1
induziert wird. Dadurch kommt es zur verstärkten Bindung an ICAM-1, was z.B. für die Bildung und Erhaltung der immunologischen Synapse und für Lymphozyten-Adhäsion und –
migration notwendig ist (Katagiri et al., 2003). In RAPL-defizienten Lymphozyten scheint das
homing in die sekundären lymphatischen Organe vermindert, wodurch diese hypoplastisch
sind, außerdem scheint die Reifung der B-Zellen beeinträchtigt zu sein. RAPL scheint somit
eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Wanderung von Immunzellen zu spielen
(Katagiri et al., 2004).
Ein anderer Rap1 Effektor ist das Rap1-interacting adaptor molecule (RIAM), dessen Überexpression zu Zellausbreitung, Formation von Lamellipodien und Integrin-vermittelter Zelladhäsion führt. RIAM interagiert direkt mit Profillin und Proteinen der Ena/VASP-Familie
(enabled/vasodilatator-stimulated phosphoprotein), welche wichtige Regulatoren für das Aktin-Zytoskelett sind (Lafuente et al., 2004). Somit scheint Rap1 auch einen direkten Einfluss
auf die zelluläre Aktin-Dynamik zu haben, die für die Ausbreitung und Migration von Zellen
notwendig ist, z.B. durch Bildung von Lamellipodien (Bailly, 2004).
1.5.2.3 Zellmigration und Homing von hämatopoetischen Stammzellen
Die Migration von Zellen stellt einen komplexen Prozess dar, dem die Polarisation der Verteilung und Funktion von Integrinen in der Zelle zugrunde liegt (Carman und Springer, 2003). In
Lymphozyten ist die Aktivität von Rap1 für diese Polarisation essentiell. Es induziert die CoLokalisation seines Effektors RAPL mit dem Integrin LFA-1 im führenden Zellteil (leading
edge) und in der immunologischen Synapse, was für die Adhäsion und Migration entlang von
ICAM-1 notwendig ist (Abbildung 1-4). Ebenso induziert Rap1 die Umverteilung des Chemokinrezeptors CXCR4 (CXC-Motiv-Chemokinrezeptor 4, stromal cell-derived factor 1
(SDF-1)-Rezeptor) in den führenden Zellteil (Katagiri et al., 2003; Shimonaka et al., 2003;
Tohyama et al., 2003). Außer der Polarisation scheint die Internalisierung und der Transport
von Integrinen vom hinteren, sich ablösenden Teil des migrierenden Lymphozyten, dem soge-
24
Einleitung
nannten Uropod, in den führenden Zellteil für die Rap1-induzierte Migration notwendig zu
sein (Lawson and Maxfield, 1995). Blockiert man die Internalisierung der Integrine, kommt
es zur erschwerten Ablösung der Zellen und verminderten Migration (Tohyama et al., 2003).
Es konnte gezeigt werden, dass die Chemokine secondary lymphoid tissue chemokine (SLC;
CCL21) und SDF-1 (CXCL12) zur raschen Aktivierung von Rap1 in Lymphozyten führen,
wodurch deren Scherkraft-resistente Adhäsion, kräftige Migration entlang von ICAM-1 und
transendotheliale Migration stimuliert wird. Es wird vermutet, dass Rap1 eine Rolle bei der
Extravasation von Lymphozyten spielt (Shimonaka et al., 2003, Abbildung 1-4). In DC konnte
eine Aktivierung der cAMP-Epac-Rap1-Achse durch Adenosinausschüttung von regulatorischen T-Zellen (Tregs) gezeigt werden. Aktiviertes Rap1 wurde nachfolgend an das subkortikale Aktinzytoskelett der DC lokalisiert, wodurch die gezielte Migration und Clusterbildung
mit Tregs gefördert wurde, nicht jedoch mit CD4+ T-Zellen (Ring et al., 2015). RAPLdefiziente DC aus Haut und Milz zeigten eine stark beeinträchtige Migration in drainierende
Lymphknoten und in die weiße Milzpulpa nach Stimulation mit LPS (Katagiri et al., 2004).
Dagegen zeigten Mäuse mit dem knockout der Isoform Rap1a zwar eine eingeschränkte Polarisation der T-Zellen nach TCR/CD3 Stimulation, jedoch keine Störungen der Hämatopoese
und des Zell-homing in Lymphknoten und in die Milz (Duchniewicz et al., 2006). In Epithelzellen widerum konnte ein negativer Einfluss von Rap1 auf die durch die rhoGTPase Rac1vermittelte Zellmotilität gezeigt werden (Vallés et al., 2004).
SDF-1 wird von Stromazellen im Knochenmark produziert und ist verantwortlich für die Migration und das Homing von hämatopoetischen Stammzellen (HSC) in die Knochenmarkniche
(Takashi Nagasawa, 1996). Dieser Vorgang ist Voraussetzung für die erfolgreiche Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen. Es konnte ein Einfluss von Rap1 auf die cAMPinduzierte Zunahme der CXCR4 Expression in CD34+ hämatopoetischen Progenitorzellen
nachgewiesen werden (Goichberg et al., 2006). Über SDF-1/CXCR4 Interaktion kommt es
wie oben beschrieben zu Rap1-vermittelte Aktivierung von LFA-1, welches essentiell für die
Migration und das Homing von HSC in die Stammzellnische ist (Potocnik et al., 2000). HSC
mit Überexpression von SPA-1 oder Rap1 knockout scheinen ein vermindertes Homing nach
Transplantation in letal bestrahlte Mäuse aufzuweisen (Minato et al., 2007).
25
Einleitung
Abbildung 1-4: Schematische Darstellung der durch Adhäsion von Leukozyten induzierten Signalwege in Leukozyten und Endothelzellen. In Leukozyten
wird Rap1 durch Chemokine aktiviert und induziert die VLA-4 u. LFA-1 vermittelte
Adhäsion. (-) Verlust der endothelialen Zell-Zell-Adhäsion führt zu verstärkter transendotheliale Migration (TEM), (+) verstärkte Zell-Zell-Adhäsion führt zu reduzierter
TEM. Gepunktete Pfeile zeigen mögliche Signalwege. Modifiziert nach Wittchen et.
al 2004.
26
Einleitung
1.5.3 Rap1a Knockout Maus
Um direkt die Funktion von Rap1a, einer Isoform von Rap1, zu untersuchen, wurde eine
Rap1a knockout Maus auf dem Hintergrund von C57BL/6 Mäusen in der Arbeitsgruppe
Scheele generiert. Dazu wurde eine internal ribosome entry site (IRES)/LacZ/Neomycin Kassette durch homologe Rekombination in Exon1 des Rap1a Gens inseriert und somit eine 420bp (Basenpaare) lange Region ersetzt, die für die N-terminalen 19 Aminosäuren von Rap1a
codieren. Diese Region enthält einen Teil des GTP-Bindungsmotiv (Abbildung 1-5). Die homozygoten Rap1a-/- Mäuse sind lebensfähig und fertil ohne offensichtliche Defekte in der
Differenzierung und Reifung von Lymphozyten (Duchniewicz et al., 2006). Veränderungen
konnten bisher unter anderem in der Integrin-vermittelten Zelladhäsion in Zellen des Immunsystems, in der Zytokin-Ausschüttung und dem MAPK-Signalweg in T-Zellen und bei der
Entzündungsreaktion in vivo ausgemacht werden (Dorn et al., 2012; Duchniewicz et al.,
2006).
Abbildung 1-5: Generation der Rap1a knockout Maus. Schematische Darstellung des Rap1a Genlokus, des targeting construct und des rekombinanten Allels.
Die schwarzen Balken markieren codierende Exons. Die 5-kb lange targeting Kassette enthält eine IRES Sequenz, das β-Galaktosidase Gen (LacZ) und das Neomycin Gen (NEO). Restrikitionsenzym-Bindungsstellen: B, BamHI; H, HindIII; P,
PstI. (Duchniewicz et al. 2006)
27
Einleitung
1.5.4 Zielsetzung der Arbeit
Die kleine GTPase Rap1 ist abhängig vom zellulären Kontext an einer Vielzahl von basalen
Zellvorgängen beteiligt, u.a. beeinflusst sie Zellproliferation, -differenzierung und Zytokinsynthese und ist ein Hauptregulator der Integrin-vermittelten Zelladhäsion. Bisher wurde
Rap1 in verschiedenen Zelltypen charakterisiert, u.a. in Endothelzellen und T-und B-Zellen,
jedoch gibt es nur wenig Daten in DC. Im ersten Teil dieser Arbeit sollten Rap1a-defiziente
DC isoliert und in vitro bezüglich ihrer Oberflächenrezeptoren und ihres Migrationsverhaltens
analysiert werden.
In unserer Gruppe konnte bereits gezeigt werden, dass Rap1a-defiziente Mäuse eine verminderte T-Zell-vermittelte Entzündungsreaktion im Kontaktallergie-Mausmodell aufweisen
(Dorn et al., 2012). Da Rap1 eine wichtige Rolle bei der Ausbildung der immunologischen
Synapse und der T-Zellaktivierung spielt, sollte in dieser Arbeit die Rolle von Rap1a in DC
im Kontaktallergiemodell untersucht werden.
Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte die Rolle von Rap1a in der GvHD und im Engraftment
mittels eines etablierten Luziferase-transgenen GvHD-Mausmodells untersucht werden. Eine
der Hauptursachen für die Mortalität und Morbidität nach alloHSZT ist die Entwicklung einer
Graft-versus-Host-Erkrankung (GvHD). Grundlegend für die Pathogenese der GvHD ist die
Interaktion und Aktivierung von Spender-T-Zellen mit Empfänger-APC. Rap1a-defiziente
murine T-Zellen weisen eine deutlich verminderte Integrin-vermittelte Adhäsion auf endothelialem VCAM-1 auf, sodass eine verminderte Interaktion von Rap1-defizienten T-Zellen mit
APC angenommen werden kann. Da Rap1 außerdem an der Regulation der T-Zellaktivierung,
-proliferation und Zytokinproduktion beteiligt ist, stellt es ein interessantes Molekül im Zusammenhang mit der GvHD dar und bietet einen möglichen therapeutischen Angriffspunkt.
Für alle Versuche wurden im eigenen Labor generierte Rap1a-knockout-Mäuse verwendet.
28
Material und Methoden
2
Material und Methoden
2.1
Mausstämme
Mäuse:
Stamm
Beschreibung
Bezug
C57Bl/6
H-2Kb, Thy-1.2
Charles River Laboratories Ger-
C57Bl/6 rap1a-/-
H-2Kb, Thy-1.2
C57Bl/6 luc
+
b
H-2K , Thy-1.2
C57Bl/6 luc+ rap1a-/-
H-2Kb, Thy-1.2
BALB/c
H-2Kd, Thy-1.2
many (Sulzburg, Germany) oder
lokale Züchtung in der Tierhaltung
der Universität Freiburg
Die Mausstämme wurden in der Tierhaltung des ZKF (Zentrum für Klinische Forschung) der
Universitätsklinik Freiburg unter spezifisch pathogenfreien Bedingungen (SPF) gezüchtet und
gehalten oder einzelne Tiere von Charles River Laboratories Germany bezogen, welche bei
Verwendung zwischen 6 und 12 Wochen alt waren. Die Luziferase-transgenen C57Bl/6 Mäuse wurden im ZKF gezüchtet und als Spender für Luziferase-transgene T-Zellen und dendritische Zellen verwendet. Für die Transplantationsversuche wurden ausschließlich gleichgeschlechtliche Mauspaare verwendet. Alle Tierversuche waren vom Regierungspräsidium
Freiburg genehmigt (Tierantrag G-10/75) .
2.2
Genotypisierung
2.2.1 DNA-Isolation
Materialien:
DNeasy Blood & Tissue Kit
Qiagen, Hilden
1,5 ml Reaktionsgefäß
Eppendorf, Hamburg
50 µl aqua ad injectabilia
Braun, Melsungen
Ethanol absolut zur Analyse
Merck, Darmstadt
Zur Bestimmung des Rap1a Genotyps der Versuchstiere wurden regelmäßig Genotypisierungen durchgeführt. Dazu wurden ca. 5 mm lange Stücke der Schwanzspitze der vier Wochen
29
Material und Methoden
alten Tiere gewonnen. Aus diesen Gewebeproben wurde mit Hilfe des Dneasy Blood & Tissue
Kit, dem Herstellerprotokoll entsprechend, die DNA zur Analyse isoliert. Die Gewebeproben
wurden jeweils in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß gegeben und mit 180 µl ATL Puffer und 20 µl
Proteinase K für mindestens 4,5 Stunden bis zur vollständigen Gewebelyse bei 56°C im Heizblock inkubiert. Nach Durchmischung erfolgte die Zugabe von je 200µl AL Puffer und Ethanol zur Homogenisierung und zur DNA-Fällung, danach wurde die Suspension in eine spin
column, eine Säule, die eine DNA-bindende Membran enthält, gegeben und in ein 2 ml Reaktionsgefäß gesetzt. Nach Zentrifugation bei 8000 rpm (rounds per minute) für 1 min wurde
der Durchfluss und das Reaktionsgefäß verworfen und die Säule in ein neues 2 ml Reaktionsgefäß gesetzt. Nach Zugabe von 500 µl AW1 Puffer wurde wieder bei 8000 rpm für 1 min
zentrifugiert, der Durchfluss verworfen und die Säule in ein neues 2 ml Reaktionsgefäß gesetzt. Nun wurden 500 ml AW2 Puffer hinzugefügt und für 3 min bei 14.000 rpm zentrifugiert, um die Membran, die nun die gereinigte DNA gebunden hat, zu trocknen und das restliche Ethanol zu entfernen. Die Säule wurde auf ein neues 2 ml Reaktionsgefäß gesetzt und
zum Eluieren der DNA zwei mal mit je 50µl AE-Puffer für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und bei 8000 rpm für 1 min zentrifugiert. Die so gewonnene DNA wurde direkt weiterverarbeitet oder bei -20°C gelagert.
2.2.2 DNA-Messung am NanoDrop ND8000 Spektralphotometer
Materialien:
Nano Drop ND8000 Spektralphotometer
PEQLAB Biotechnologie GMBH, Erlangen
Puffer AE aus DNeasy Blood & Tissue Kit
Qiagen, Hilden
Der DNA-Gehalt und die Reinheit der gewonnenen Proben wurde mit dem NanoDrop
ND8000 Spektralphotometer nach Herstellerangaben bestimmt. Hierzu wurde die Absorption
der Nukleinsäuren bei der einer Wellenlänge von 260 nm (A260) im UV-Spektrometer gemessen und die Konzentration nach dem Lambert-Beerschen Gesetz berechnet.
Zur Bestimmung der Reinheit wurde außerdem die Absorption bei 280 nm (A280), welche
den aromatischen Ringsystemen der Aminosäuren entspricht, gemessen und der Quotient
A260/A280 berechnet, der für bei hohem Reinheitsgrad zwischen 1,8 und 2,0 liegen sollte.
Nach Kalibrierung des Gerätes mit dem AE-Puffer wurde je 1µl der Probe direkt auf die
Messoberfläche aufgetragen und gemessen.
30
Material und Methoden
2.2.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Materialien:
Puffer 10x
Qiagen, Hilden
Q-Solution 5x
Qiagen, Hilden
MgCl2 25 mM
Qiagen, Hilden
dNTP 10 mM
Fermentas, St. Leon-Rot
Taq-Polymerase
Qiagen, Hilden
aqua ad injectabilia
Braun, Melsungen
primer 1 (BamH)
Institut für Biologie III, Freiburg
primer 2 (INPR)
Institut für Biologie III, Freiburg
primer 3 (rap1a)
Institut für Biologie III, Freiburg
TPersonal Thermocycler
Biometra, Göttingen
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) dient der exponentiellen Vervielfältigung der zu untersuchenden DNA-Sequenzen. Dabei werden die Reaktionsschritte in mehreren Zyklen immer
wieder wiederholt und die dabei entstehenden Produkte jeweils wieder als Ausgangsprodukt
für den nächsten Reaktionszyklus genutzt.
Im ersten Schritt erfolgt die Denaturierung der doppelsträngigen DNA bei 94 - 96°, danach
die Anlagerung der Primer an die entsprechenden DNA-Abschnitte (annealing). Schließlich
erfolgt die Verlängerung der Primer (Elongation) mit Desoxyribonukleosidtriphosphaten
(dNTPs) durch die hitzestabile Taq-Polymerase in 5’ – 3’ Richtung. Diese drei Schritte, Denaturierung – Annealing – Elongation, werden vielfach wiederholt, um eine möglichst große
Menge des Reaktionsprodukts zu erhalten.
Um den Wildtyp, den heterozygoten und den homozygoten Phänotyp eindeutig nachweisen zu
können, wurden zwei Reaktionsansätze parallel hergestellt. Zum ersten Ansatz wurden zum
Nachweis des Wildtyp-Allels die Primer 1 und 3 gegeben, zum zweiten Ansatz (zum Nachweis des Knockout-Allels) die Primer 1 und 2.
31
Material und Methoden
2.2.4 Primer
1. BamHI-HindIII
5‘ CCT TTG TTA CTC CAT ATC AAC CAT TG 3‘
2. 3‘INPR-1
5‘ CAA CGT TAT CGA TAC CGT CG 3‘
3. 3‘Rap1a
5‘CCA AGG ACT AGC TTG TAC TCA CG 3‘
Der PCR-Mastermix wurde in zwei Ansätzen für mehrere Proben auf Eis hergestellt. Für eine
DNA-Probe von 5 µl (ca. 100 ng DNA) setzte er sich wie folgt zusammen:
Puffer 10x
dNTP 10mM
Mg2+ 25 mM
Q Sol 5x
H2 O
taq Polymerase
primer 1
primer 2/3
µL
2,5
2,5
3
5
8,9
0,5
1,3
1,3
Je 25 µl Mastermix wurde in PCR-Tubes vorgelegt und 5 µl der entsprechenden DNA-Probe
hinzupipettiert. Zusätzlich wurden Wasser-, Primer- und DNA-Kontrollen pipettiert.
Die Proben wurden in den Thermocycler gesetzt und das PCR-Programm mit folgendem
Temperaturprofil durchgeführt:
Anfangsdenaturierung:
30 Zyklen:
96°C für 5 Minuten.
Denaturierung:
96°C für 30 Sekunden
Primerbindung: 53°C für 30 Sekunden
Verlängerung:
Abschließende Verlängerung:
72°C für 1,5 Minuten
72° C für 7 Minuten
Danach wurden die Proben direkt mittels Gelelektrophorese analysiert oder bei 4° C im Kühlschrank gelagert.
32
Material und Methoden
2.2.5 Gelelektrophorese
Materialien:
Agarose
Serva, Heidelberg
TBE-Puffer (10x):
55 g Borsäure
Merck, Nottingham, UK
108 g Trizma Base
Sigma-Aldrich, München
7,5 g EDTA (Titriplex III)
Merck, Nottingham, UK
ad 1 L mit VE-Wasser
DNA Loading Dye 6x
Fermentas, St. Leon-Rot
DNA Ladder 100 bp Gene Ruler
Fermentas, St. Leon-Rot
Gel RedTM
Biotium, Hayward, USA
Je 15 µl des PCR-Produkts wurden mit 2µl Gel RedTM und 2 µl Loading Dye gemischt und
davon 15 µl auf ein 1% TBE-Agarose Gel pipettiert. Es wurde eine Spannung von 200 V für
ca. 1 h angelegt, danach konnte das Gel direkt unter dem UV-Transluminator betrachtet und
abgelesen werden.
Abbildung 2-1: Rap1a Gelelektrophorese einer Genotypisierung von Rap1 knockout Mäusen. Maus 1 zeigt je eine
Bande der (+) und (-) Sequenz entsprechend einem heterozygoten Genotyp (+/-). Maus 2 zeigt nur eine (+) Bande, entsprechend dem Rap1a Wildtyp (+/+), Maus 3 zeigt nur eine (-)
Bande, entsprechend dem homozygoten Rap1a knockout (-/-)
(eigene Abbildung).
33
Material und Methoden
2.3
Zellkultur
Material:
PBS (phosphate buffered saline)
Gibco, Karlsruhe
DC-Medium
RPMI 1640 + L-Glutamin
PAA, Pasching Österreich
+ 10 % FCS (fetales Kälberserum)
PAN Biotech, Aidenbach
+ 1% Penicillin/Streptomycin
Gibco, Karlsruhe
GM-CSF
R&D Systems, Minneapolis, USA
Spritzen, verschiedene Größen
Braun, Melsungen
Einmal-Skalpelle
Feather, Osaka, Japan
Kanülen, steril
Braun, Melsungen
Zellkulturschalen 100 mm
Greiner, Frickenhausen
Red Blood Lyse Buffer
BD Pharm, Heidelberg
2 % Trypanblau-Llösung
Merck, Darmstadt
Flatbottom 96 Well Platten
BD Falcon, Heidelberg
Megafuge 2.0R Heraeus
Thermo scientific, Bonn
Neubauer Zählkammer
Laboroptik, Friedrichsdorf
Lichtmikroskop
Zeiss, Jena
Brutschrank Hereaus function line
Thermo Scientific, Bonn
PE anti-mouse CDC11c
BioLegend, San Diego, USA
2.3.1 Gewinnung von Knochenmarkzellen
Zur sterilen Gewinnung des Knochenmarks wurden die ausgewählten Versuchsmäuse durch
zervikale Dislokation geopfert und Femur und Tibia mit einem sterilen Skalpell und Pinzette/Schere freipräpariert und aus den Gelenkpfannen gelöst. Danach wurden die Knochen vollständig von Haut und Muskeln befreit und in eine Zellkulturschale mit sterilem PBS überführt. Unter der Sterilbank wurde das Kniegelenk durchtrennt und Femur und Tibia an beiden
Enden mit einem sterilen Skalpell eröffnet. Mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle wurden die
Knochen mehrmals mit sterilem PBS durchgespült, sodass sich das Knochenmark herauslöste.
Anschließend wurden die gewonnenen Zellen zentrifugiert, in Medium aufgenommen und für
34
Material und Methoden
2 min mit 2 ml Erythrozyten-Lysepuffer versetzt, mit PBS gewaschen, erneut in 5 ml Medium
aufgenommen und in der Neubauer Zählkammer nach Färbung der toten Zellen mit 2%
Trypanblau gezählt.
2.3.2 Zellzahl-Bestimmung
Zur Bestimmung der Zellzahl wurden die Zellen mit Trypanblau (1:10; 10 µl Zellsuspension
+ 90 µl Trypanblau) gefärbt und in der Neubauer Zählkammer gezählt. Es wurden nur lebende, ungefärbte Zellen gezählt.
2.3.3 Kultivierung von DC aus Knochenmark
Pro Kulturschale wurden 6x106 Zellen in 10 ml DC-Medium ausgesät und mit 55µl GM-CSF
(= 40 ng/ml) versetzt. Die Zellen wurden im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 inkubiert, an
Tag 3 wurden 10 ml Medium und 55 µl GM-CSF zugegeben, an Tag 5 erfolgte ein Teilmediumwechsel von 10 ml Medium und erneute Zugabe von 55 µl GM-CSF. An Tag 7 bis 10
konnte mit den so gewonnenen DC gearbeitet werden.
2.3.4 Reinheitskontrolle der DC
Die Reinheitskontrolle wurde mit 1x105 Zellen durch Zugabe von 0,5 µl anti-CD11cPhycoerythrin (PE) gekoppelten Antikörper am FACScalibur Flowcytometer durchgeführt
(Abbildung 2-3). Für die Beschreibung der Methode siehe Kapitel 2.6 Durchflusszytometrie.
Der Anteil an DC dendritischen Zellen lag jeweils zwischen 60 und 90 %.
2.4
Migrationsassay (Boyden-Kammer-Assay)
Material:
Zellschaber
Sarstedt, Nümbrecht
Migrations-Medium:
RPMI 1640 + L-Glutamin
PAA, Pasching, Österreich
+ 2 % FCS (fetales Kälberserum)
PAN Biotech, Aidenbach
Transwell Boyden-Kammer (3 µm)
Corning Inc., Lowell, USA
Lipopolysaccharid (LPS) von Salmonella abortus equi
Enzo Life Sicences, Lörrach
35
Material und Methoden
murines CXCL12/SDF-1
R&D Systems, Minneapolis, USA
PE anti-mouse CD11c
BioLegend, San Diego, USA
Zur Untersuchung des Migrationsverhaltens der murinen rap1a-wildtyp (wt), rap1a-knockout
(ko) oder rap1a-heterozygoten DC wurde ein Boydenkammer Migrationsassay durchgeführt.
Die Boydenkammer besteht aus zwei Kammern, die durch eine Membran mit Mikroporen
getrennt sind, durch welche die Zellen migrieren können. In die untere Kammer können z.B.
Chemokine gegeben werden, wodurch die aktive Migration der Zellen entlang des Chemokin-Gradienten von der oberen in die untere Kammer induziert wird. Das Migrationsverhalten
kann dann mittels Durchflusszytometrie oder Zählung der Zellen in der oberen und unteren
Kammer quantitativ bestimmt werden.
Als Chemokin wurde in diesem Versuch CXCL12 bzw. SDF-1 (stromal cell-derived factor 1)
verwendet, welches z.B. von kutanen Lymphgefäßen exprimiert wird und zusammen mit seinem Liganden CXCR4 eine wichtige Rolle bei der Migration von DC spielt (Kabashima et
al., 2007; Sozzani et al., 1997). Lipopolysaccharide (LPS) aus den Zellwänden gramnegativer Bakterien beinhaltet potente
PAMPs
(pathogen-associated
molecular patterns), die zur Aktivierung und Reifung der DC führen
(Abbas et al., 2012).
Die kultivierten DC wurden an Tag 7
der Zellkultur mit dem Zellschaber
von den Kulturplatten abgeerntet,
Abbildung 2-2: Boydenkammer (Transwell Permeable Supports, Corning) Darstellung des Aufbaus der
Boydenkammer mit oberem Well (Insert) und unterem
Well, getrennt durch eine Mikroporenmembran
(Abbildung Corning Inc.,
http://www.corning.com/uploadedImages/Lifesciences/
US-Canada/Assets/Images/Permeable_insert.jpg)
abzentrifugiert und gezählt. Je die
Hälfte der Zellen der verschiedenen
Proben wurden mit LPS für 20 h im
Brutschrank aktiviert. In einer vereinfachten Variante des Versuchs wurde
auf die Aktivierung mit LPS verzichtet. In die Kammern der Transwellplatten wurden je 600
µl Migrationsmedium, zur Hälfte mit CXCL12 (50 ng/ml) versetzt, vorgelegt. Dann wurden
die Einsätze (Inserts) mit der Pinzette eingesetzt und die Zellsuspension (5x105 Zellen in 100
µl Medium) pipettiert. Es wurde für 4,5 h im Brutschrank bei 37°C inkubiert.
36
Material und Methoden
Nach Ablauf der Zeit wurden zuerst die Zellen im oberen Einsatz sorgfältig mittels Eppendorf-Pipette resuspendiert und in FACS-Proberöhrchen überführt. Die Unterseite des Einsatzes wurde zur Ablösung festhängender Zellen mittels Pipette gut abgespült und zusammen mit
den Zellen in der unteren Kammer resuspendiert und ebenfalls in FACS- Proberöhrchen überführt. Es wurde einmal bei 1200 rpm zentrifugiert, die Zellpellets in je 100 µl PBS resuspendiert und mit je 0,5 µl anti-CD11c (PE-gekoppelt) versetzt, 15 min bei 4 °C inkubiert und
dann 500 µl PBS zugegeben.
Die Auswertung erfolgte mittels Durchflusszytometrie, wie in Kapitel 2.6 beschrieben, die
Angabe der migrierten Zellen erfolgte als % der Gesamtzellzahl (obere und untere Kammer).
2.5
Phänotypisierung von DC
Material:
Lipopolysaccharid (LPS) von Salmonella abortus equi
Enzo Life Sicences, Lörrach
anti-mouse CD11c (PE, FITC, APC, Pacific blue)
BioLegend, San Diego, USA
anti-mouse CD16/32 (FITC)
BioLegend, San Diego, USA
anti-mouse CD36 (APC)
BioLegend, San Diego, USA
anti-mouse CD80 (PE, FITC)
BioLegend, San Diego, USA
anti-mouse CD86 (FITC, Pacific blue)
BioLegend, San Diego, USA
anti-mouse CD205 (PE)
BioLegend, San Diego, USA
anti-mouse DCIR2 (APC)
BioLegend, San Diego, USA
PBS (phosphate buffered saline)
Gibco, Karlsruhe
Zur Untersuchung der Auswirkung des Rap1a Knockouts auf den Phänotyp der dendritischen
Zellen wurden Zellen mit dem Rap1a Wildtyp und Rap1a Knockout an Tag 7 der Zellkultur
wie in Kapitel 2.3 beschrieben geerntet, gezählt und in PBS aufgenommen. In einer Versuchsvariante erfolgte zuerst die Aktivierung je der Hälfte der Zellen durch Inkubation mit 1µg/ml
LPS für 20 h. Dann wurden pro Ansatz 5x105 Zellen in 100 µl PBS in FACS- Proberöhrchen
gegeben und mit 0,5 µl der entsprechenden Antikörper versetzt. Zu jeder Probe wurde antimouse CD11c Antikörper zur Detektion der dendritischen Zellpopulation und entweder ein
oder zwei weitere Antikörper (anti-mouse CD16/32, CD36, CD80, CD86, CD205, DCIR2)
mit entsprechend unterschiedlichen Fluorochromen zugegeben. Die Proben wurden für 15
37
Material und Methoden
min bei 4°C inkubiert und nach Zugabe von 500 µl PBS mittels Durchflusszytometrie gemessen (s. Kapitel 1.6)
2.6
Durchflusszytometrie
Material:
FACScalibur Flowcytometer
BD Bioscience, Heidelberg
CyAN ADP Analyzer
Beckman Coulter, Krefeld
FACS Tubes
BD Bioscience, Heidelberg
Cell Quest pro
Becton Dickinson, Heidelberg
FlowJo Cytometrie Analysis
Tree Star Inc., Ashland, USA
Die Durchflusszytometrie ermöglicht die laserbasierte Analyse von Zellen hinsichtlich chemischer und physikalischer Eigenschaften wie z.B. Größe, Oberflächeneigenschaften und intrazellulären Bestandteilen. FACS-Geräte (fluorescence activated cell sorter), wie das verwendete FACScalibur, können zusätzlich Zellen nach bestimmten Eigenschaften sortieren. Der
besondere Vorteil der Durchflusszytometrie liegt darin, dass in wenigen Sekunden tausende
Zellen einzeln und gleichzeitig bezüglich verschiedener Parameter charakterisiert werden
können.
Im Durchflusszytometer senden Laser monochromatisches Licht aus, welches gebündelt wird
und auf die vorbeifließenden Zellen trifft, an denen es in bestimmter Weise gestreut wird. Das
Vorwärtsstreulicht (Forwardscatter, FSC) ist dabei ein Maß für die Größe der Zellen, das
rechtwinkelig an intrazellulären Strukturen abgestrahlte Seitwärtsstreulicht (Sidewardscatter,
SSC) ein Maß für die Zellgranularität. Zusätzlich können Zellen direkt mit Fluoreszenzfarbstoffen oder mit Fluoreszenz-gekoppelten Antikörpern markiert werden, z.B. Phycoerythrin
(PE), Fluoresceinisothiocyanat (FITC) oder Allophycocyanin (APC), die einen Teil der
Lichtenergie absorbieren und Fluoreszenzlicht mit höheren Wellenlängen emittieren. Ein System aus Filtern und Spiegeln trennt die abgegebene Strahlung nach ihren Wellenlängen, Detektoren registrieren die verschiedenen Anteile, die dann zum Ergebnis verrechnet werden. Es
ist möglich, mehrere Fluoreszenzen gleichzeitig zu messen, da sie Licht unterschiedlicher
Wellenlänge abgeben. Bei der Verwendung mehrerer Fluorochrome gleichzeitig ist allerdings
38
Material und Methoden
eine Kompensation vor der Messung notwendig, da es sonst durch überlappende Wellenlängenbereiche zu falsch positiven Signalen kommen kann.
Abbildung 2-3: Reinheitskontrolle der primären DC-Kultur aus Knochenmarkzellen mittels
FACS Analyse Beispiel einer Reinheitskontrolle nach 6-tägiger Kultivierung von dendritischen
Zellen aus primär gewonnenen Knochenmarkzellen (rap1a wt). Der Dot Plot zeigt die im Gate (R1)
ausgewählte Zellpopulation (a), 95 % ungefärbte Zellen (b) und 62 % anti-CD11c gefärbte Zellen
(c) in verschiedenen Proben einer Zellpopulation. (d) Darstellung der ungefärbten (dunkelblau) und
gefärbten (hellblau) Probe im Overlay (eigene Abbildung).
39
Material und Methoden
2.7
DC-vermittelte Sensibilisierung im Kontaktallergiemodell
Material:
2,4,6-Trinitrobenzol-1-Sulfonsäure (TNBS)
Sigma-Aldrich, München
2,4,6-Trinitro-1-Chlorbenzol (TNCB) in Aceton
VeZerf Laborsynthesen GmbH, Idar-Oberstein
Messschieber
Mitotoyo, Neuss
Das allergische Kontakthypersensitivitäts-Modell (CHS) ist ein etabliertes Mausmodell um
die T-Zell-vermittelte allergische Reaktion vom verzögerten Typ (Typ-VI Allergie) zu untersuchen (Martin et al., 2008). Beim ersten Kontakt mit einem Kontaktallergen (chemisches
Allergen, Metallionen) kommt es zu einer inflammatorischen Reaktion der Haut, bei der die
Allergene von APC, z.B. DC, aufgenommen und prozessiert werden. Es kommt zur Reifung
und Auswanderung der APC in lokale Lymphknoten, wo die prozessierten Antigene auf
MHC-I/II Molekülen präsentiert werden. Diese werden von naiven, antigenspezifischen CD4+
und CD8+ T-Zellen über deren T-Zell-Rezeptor (TCR) erkannt und es kommt zum Priming
und zur Differenzierung der naiven T-Zellen zu Effektor-T-Zellen und deren Eintritt in die
Blutbahn (Sensitisierungsphase). Bei nachfolgenden Allergenkontakten kommt es dann zur
Rekrutierung der antigenspezifischen T-Zellen in die entzündete Haut und zur Auslösung der
zellvermittelten, zytotoxischen Immunantwort in Form einer ekzematösen Hautreaktion (Auslösephase).
Im CHS Modell kann sowohl die Sensibilisierungsphase als auch die Auslösungsphase untersucht werden. Im Ohrschwellungstest (mouse ear swelling test, MEST) erfolgt die Sensibilisierung mittels lokaler Applikation eines Testallergens und die Auslösung der allergischen
Reaktion durch Applikation des Testallergens auf die Ohren der Versuchstiere einige Tage
später. Es wird die Zunahme der Ohrdicke über die Zeit als Maß für die CHS Reaktion gemessen. In einer Modifizierung des Versuchs, der hier durchgeführt wurde, erfolgt die Sensibilisierung durch intrakutane (i.c.) Injektion von mit dem Kontaktallergen modifizierten DC
(Martin, 2013). Dieser Versuch ist im Folgenden beschrieben:
DC von C57Bl/6 wt oder Rap1a-/- Mäusen wurden, wie in Kapitel 1.2.2 beschrieben, kultiviert
und an Tag 7 geerntet, gezählt und je die Hälfte der Zellen abzentrifugiert (1200 rpm, 5 min)
und das Pellet in 1 ml 3mM TNBS in PBS für 7 min bei 37° und Dunkelheit inkubiert. Danach wurde mit 10 ml Medium abgeblockt, zentrifugiert und erneut mit 10 ml Medium gewaschen. Es erfolgte die i.c. Injektion von je 3x105 DC in 100 µl an zwei Stellen des rasierten
40
Material und Methoden
Abdomens von 6-8 Wochen alten, gleichgeschlechtlichen C57Bl/6 Mäusen. Die korrekte Injektion zeigte sich durch Bildung einer Blase während der Injektion. Dabei gab es folgende
Versuchsgruppen mit jeweils 3 Tieren:
1 – DC unmodifiziert (Kontrolle)
2 – DC + TNBS
3 – DC rap1a-/- unmodifiziert (Kontrolle)
4 – DC rap1a-/- + TNBS
An Tag 5 des Versuchs erfolgte zunächst die Messung der Ohrdicke mit Hilfe eines Messschiebers. Dann wurden beide Ohren mit je 20µl 1% TNCB in Aceton bepinselt (challenge)
um die allergische Reaktion auszulösen. Nach 24 Stunden wurde die Ohrdicke erneut gemessen und die Differenz in µm angegeben.
2.8
DC Migration in vivo
Material:
0,2% FITC in 1:1 Ac/DBP (Aceton/Dibutylphthalat)
Sigma Aldrich, München
1:1 Ac/DBP
Sigma Aldrich, München
PE anti-mouse CD11c
BD Bioscience, San Jose, USA
Biotin anti-mouse I-Ab (anti-MHCII)
BD Pharmingen, Heidelberg
PE-Cy5 Streptavidin
BD Pharmingen, Heidelberg
FACS-Puffer:
PBS
Invitrogen, Karlsruhe
2% FCS
PAA, Pasching, Österreich
5mM EDTA
Invitrogen GmBH, Karlsruhe
0,02% NaN3
Sigma Aldrich, München
Beim Kontaktallergie-Modell (CHS) kommt es in der Sensibilisierungsphase nach Kontakt
mit dem Allergen zur Aufnahme und Prozessierung durch APC, die dann maturieren und in
lokale Lymphknoten wandern, wo sie das Antigen auf MHC-Molekülen präsentieren. Dieser
Vorgang kann genutzt werden, um die Migration von DC in vivo zu untersuchen. Hierbei wird
FITC in Aceton/Dibutylphthalat (Ac/DBP) als potentes Kontaktallergen und gleichzeitig Flu-
41
Material und Methoden
orochrom zur Analyse in der Durchflusszytometrie genutzt. FITC wird in der Haut von DC
aufgenommen und im Lymphknoten auf MHC-Molekülen präsentiert, wodurch die migrierten
DC quantifiziert bestimmt werden können.
Dazu wurden die Ohren von C57Bl/6 wt und Rap1a-/- Mäusen auf beiden Seiten mit je 50 µl
0,2% FITC in Ac/DBP (Aceton/Dibutylphthalat) oder mit 50 µl Ac/DBP als Kontrolle bepinselt. Nach 24 Stunden wurden die aurikulären Lymphknoten der Tiere präpariert und entnommen, zur Zellgewinnung mittels Spritzenstempel durch ein Zellsieb gedrückt, gewaschen
und in FACS-Puffer aufgenommen. Pro 100 µl Zellsuspension wurden je 0,5 µl PE antimouse CD11c, Biotin anti-mouse I-Ab und PE-Cy5 Streptavidin zugegeben und bei 4°C für
15 min inkubiert. Die Auswertung erfolgte mittels Durchflusszytometrie (siehe Kapitel 2.6)
auf FITC-positive DC im CD11c/MHC II I-Ab hoch-positiven Fluoreszenz-Kanal.
2.9
Allogene Stammzelltransplantation und Induktion einer
GvHD im Mausmodell
Material:
Zellsieb 100µm
BD, Heidelberg
MACS LS Zellseparationssäule
Milteny Biotec, Bergisch-Gladbach
MidiMACS Magnetzellseparator
Milteny Biotec, Bergisch-Gladbach
MACS Multistand
Milteny Biotec, Bergisch-Gladbach
CD4 MicroBeads, mouse
Milteny Biotec, Bergisch-Gladbach
CD8 MicroBeads, mouse
Milteny Biotec, Bergisch-Gladbach
Röntgenquelle RS2000
RadSource, Brentwood, USA
Isofluran
Abbott, Wiesbaden
Zur Untersuchung eines möglichen Einflusses von Rap1a auf die Ausprägung einer GvHD
nach Stammzelltransplantation wurde ein Mausmodell (C57Bl/6 à BALB/c) mit einem MHC
major-mismatch verwendet. Dabei handelt es sich um ein um ein aggressives Transplantationsmodell, bei dem die MHC-Moleküle von Spender und Empfänger nicht zusammenpassen,
so dass und es regelhaft zur Entwicklung einer akuten GvHD kommt.
Dazu erfolgt nach myeloablativer, letaler Bestrahlung der Empfängertiere die Transplantation
mit Knochenmarkzellen des Spenders, und zur Auslösung der GvHD zusätzlich die Trans-
42
Material und Methoden
plantation von Spender-T-Zellen. Der genaue Ablauf ist im folgenden beschrieben (Zeiser et
al., 2006, 2007).
2.9.1 Isolierung von Knochenmarkzellen
Für die Isolierung von Knochenmarkzellen aus C57Bl/6 Mäusen für die Transplantation wurde wie in Kapitel 2.3.1 beschrieben vorgegangen. Zur Entfernung möglicher Knochensplitter
wurden die Zellen außerdem durch ein Zellsieb gedrückt, die Erythrozyten wurden nicht lysiert.
2.9.2 Gewinnung von T-Zellen durch MACS-Positivselektion
Für die Gewinnung von T-Zellen wurde das MACS-System genutzt, bei dem die T-Zellen
mittels MicroBeads, magnetischen Kügelchen mit gekoppelten Antikörpern, markiert und
dann magnetisch isoliert werden können. Bei der Positiv-Selektion werden die gewünschten
Zellen, in diesem Fall CD4+ und CD8+ T-Zellen, durch Antikörper-gekoppelte Beads markiert
und mittels Magnet in der
Säule zurückgehalten und von
den restlichen Zellen befreit.
Durch Entfernen der Säule
aus dem Magneten und SpüAbbildung 2-4: Prinzip der Positivselektion mittels MACSSystem. (Abbildung Miltenyi Biotec
http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macscell-separation/macs-technology/microbeads_dp.aspx)
len erhält man dann die markierten Zellen.
Nach Opferung der Spendermäuse (C57Bl/6 luc+ und
C57Bl/6 luc+ rap1a-/-) wurden die Milzen präpariert, durch ein 100 µm großes Nylonsieb in
RPMI-Kulturmedium homogenisiert und die Suspension zentrifugiert (1200 rpm, 10 min,
4°C) und in ca. 200 µl kaltem PBS resuspendiert. Pro Milz wurden dann je 10 µl CD4- und
CD8-MicroBeads zugegeben, zentrifugiert und 20 min bei 4°C inkubiert. In der Zwischenzeit
wurden zwei MACS-Säulen an den MACS-Separator platziert und mit 3 ml PBS durchgespült. Die Zellen wurden anschließend mit 25 ml PBS gewaschen, zentrifugiert (1200 rpm, 10
min, 4°C), in 3 ml PBS resuspendiert und auf die Säulen gegeben. Nach zweimaligem Nachspülen mit jeweils 3 ml PBS wurden die Säulen aus dem Magneten genommen und die Zellen
43
Material und Methoden
mit Hilfe eines Stempels durch die Säule gedrückt und in einem 50 ml Falcon aufgefangen
und einmal mit PBS gewaschen, dann gezählt und entweder direkt zur Transplantation verwendet oder in Medium im Inkubator zwischengelagert. Direkt vor der Transplantation wurden die Zellen gezählt und auf 3x105 Zellen in 50 µl PBS eingestellt.
2.9.3 Bestrahlung
Um die Mäuse für die Knochenmarkstransplantation zu konditionieren, also das Empfängerknochenmark zu zerstören, wurden sie in einer RS2000 Röntgenquelle im Neurozentrum der
Universitätsklinik Freiburg mit 7 Gy (dies entsprach einer Bestrahlungsdauer von 5 min 56
sec bei 160 kV und 25mA) letal bestrahlt.
2.9.4 Transplantation
Nach der Bestrahlung erfolgte direkt die Transplantation der vorher isolierten Knochenmarkzellen zur Rekonstitution der Hämatopoese. Dazu wurden die bestrahlten Versuchstiere mittels Isofluran narkotisiert. Pro Maus wurden 5x106 Knochenmarkzellen in 50µl aus C57Bl/6
Mäusen, und zur Auslösung einer GvHD zusätzlich 3x105 T-Zellen in 50µl von entweder
C57Bl/6 luc+ oder C57Bl/6 luc+ Rap1a-/- Mäusen in den Augenvenen-Plexus injiziert, sodass
insgesamt ein Volumen von 100 µl injiziert wurde.
2.9.5 Engraftment und Chimärismus von Rap1a-/- Knochenmarkzellen
im Transplantations-Mausmodell
Zur Untersuchung des Engraftments Rap1a defizienter und heterozygoter Knochenmarkzellen
im Vergleich zu normalen Knochenmarkzellen wurde ein Transplantations-Modell wie oben
beschrieben genutzt. Hierbei stammten die transplantierten Knochenmarkzellen jeweils von
Luziferase-transgenen C57Bl/6 Rap1awt, Rap1a+/- und Rap1a-/- Mäusen. Es wurden keine TZellen transplantiert und somit keine GvHD ausgelöst. Nach 50 Tagen wurde die Expansion
mittels BLI wie in Kapitel 2.10 beschrieben gemessen. Der Chimärismus wurde an Tag 50
anhand der Durchflusszytometrie nach Gewinnung der Knochenmarkzellen aus jeweils 3 Versuchstieren pro Gruppe und Färbung mit anti-H-2Kb (FITC-gekoppelt) ermittelt.
44
Material und Methoden
2.10 in vivo Biolumineszenz-Imaging (BLI)
Biolumineszenzkamera IVIS Spectrum
Caliper Life Science
Living Image 4.1 Sofware
Caliper Life Science
Luziferin
BioSYNTHH
Das Biolumineszenz-Imaging ist ein nicht-invasives bildgebendes Verfahren zur Darstellung
einzelner Luziferase-exprimierender Zellpopulationen in vivo. Bei der BiolumineszenzReaktion katalysiert das Enzym Luziferase unter Sauerstoffverbrauch die Umsetzung seines
Substrates Luziferin zu elektronisch angeregten, instabilen Dioxetanen bzw. Dioxetanonen,
die beim Zerfall Lichtquanten emittieren. Diese können wiederum von charge-coupleddevice- (CCD)-Kameras detektiert werden. Somit lassen sich Aussagen über die Expansion
der Zellen in der Maus treffen.
Die Versuchstiere wurden mit jeweils 200 µl (150 mg/kg) Luziferin i.p. injiziert und dann in
einer Kammer mit 2% Isofluran narkotisiert. Nach 10 min Wartezeit wurden die Mäuse unter
Fortsetzung der Isofluran-Narkose unter der BLI-Kamera (IVIS200, Caliper Life Science)
positioniert und ca. 2,5 min belichtet (Einstellungen Binning= medium, F/stop: 1, subject
hight 1,5 cm). Die Expansion der luc+ Zellen wurde mittels Living Image 4.1 Software als
Photonen/sec/cm2 quantifiziert und dargestellt. Die Tiere wurden im Abstand von 2-3 Tagen
analysiert gemessen.
45
3
Ergebnisse
Ergebnisse
3.1
Einfluss von Rap1a auf die Migration von DC
Das Migrationsverhalten von Rap1a defizienten DC wurde mit Hilfe des Chemokins CXCL12
in speziellen Transwell-Kammern untersucht. In den ersten drei Versuchen wurden heterozygote und homozygote Rap1a-/- DC im Vergleich zu wildtyp DC untersucht und zum Teil vor
der Migration mit LPS aktiviert oder nicht. Dabei zeigte sich eine signifikant geringere Migration der Rap1a+/- und Rap1a-/- DC im Vergleich zum Wildtyp-Zellen in An- und Abwesenheit von CXCL12 (s. Abbildung 3-1). Zwischen homozygoten und heterozygoten Rap1a defizienten DC zeigte sich dagegen kein signifikanter Unterschied. Die Zellzahlen aus oberer und
unterer Kammer wurden addiert und als 100% definiert, migrierte Zellen wurden als % davon
angegeben. Da sich durch die Aktivierung mit LPS keine signifikante Steigerung der Migration erreichen ließ, wurde in den weiteren Versuchen darauf verzichtet.
Abbildung 3-1: Migration von wildtyp, Rap1a +/- und -/- DC im Transwell-Kammer-Assay.
Migration von Rap1a heterozygot und homozygot defizienten DC in % der durchflusszytometrisch
bestimmten Gesamtzellzahl im Vergleich zum wt unter Einfluss von CXCL12 und nach Stimulation
mit 1µg/ml LPS für 20 h. Daten eines repräsentativen Versuchs (n=3 pro Gruppe) *p<0.05
**p<0.005.
46
Ergebnisse
In den Folgeversuchen mit Rap1a-/- DC kam es entlang des CXCL12 Chemokin-Gradienten
sowohl bei wildtyp DC als auch Rap1a-/- DC zu einer signifikant vermehrten Migration von
8,14 % (Faktor 1,35, p=0,018) bzw. 5,32 % (Faktor 1,4, p=0,011) im Vergleich zur Migration
ohne Gradient. Dabei zeigte sich eine deutlich verringerte Migration der Rap1a defizienten
DC sowohl ohne (Faktor 1,76, p=0,00007) als auch entlang des CXCL12 – ChemokinGradienten (Faktor 1,69, p=0,0003) im Vergleich zu wildtyp DC (Abbildung 3-2).
Abbildung 3-2: Migration von Rap1a-/- DC in vitro. Relative DC-Migration in Abhängigkeit von CXCL12 von Rap1a wildtyp und Rap1a defizienten DC. Es zeigt sich eine signifi-/kant verminderte Migration von Rap1a DC im Vergleich zu wildtyp DC sowohl mit als
auch ohne Chemokin-Gradient. Kumulierte Daten von 8 unabhängigen Versuchen mit jeweils n=3 pro Gruppe.
47
Ergebnisse
3.2
Einfluss von Rap1a auf den Phänotyp von DC
Als nächstes wurde die Expression verschiedener Oberflächenmoleküle auf Rap1a wildtyp
versus Rap1a-/- DC untersucht: CD16/CD32 (Fc-Rezeptoren FcγII und FcγIII), CD36 (gp IIIb,
Scavenger Rezeptor), CD80 und CD86 (Kostimulatoren für die T-Zell-Aktivierung und Ligand für CD28 und CD152 (CTLA-4)), CD205 (DEC-205, Endozytoserezeptor auf dendritischen Zellen) und DCIR2 (Dendritic Cell Inhibitory Receptor 2). Bei Versuchen mit unreifen
DC (ohne vorherige Aktivierung der DC mit LPS) zeigten sich keine Unterschiede in der Expression von CD 16/CD32, CD80, CD86 und CD205 zwischen Rap1a-/- und wildtyp DC (s.
Abbildung 3-3).
Abbildung 3-3: Durchflusszytometrische Analyse der Expression verschiedener Oberflä-/5
chenmoleküle auf wildtyp sowie Rap1a DC. Je 10 Zellen pro Ansatz (2 Ansätze pro Gruppe)
wurden zur Bestimmung der DC-Population mit anti-CD11c und zusätzlich mit entweder antiCD86, -CD80, -CD205 oder –CD16/32 gefärbt und mit dem Durchflusszytometer analysiert. Doppelt positive Zellen wurden in % der DC-Gesamtpopulation angegeben. Es zeigten sich keine
signifikanten Unterschiede bei der Expression der bestimmten Oberflächenmarker zwischen wild-/typ und Rap1a DC.
Durch Kontakt der unreifen DC mit proinflammatorischen mikrobiellen Substanzen, sogenannten PAMPs, wie z.B. LPS, kommt es zur Veränderung der Genexpression und zur Reifung und Aktivierung der DC. Dabei kommt es u.a. auch zur Hochregulierung verschiedener
Oberflächenmoleküle, wie z.B. CD80 und CD86 (Abbas et al., 2012; Caux et al., 1994). Des-
48
Ergebnisse
halb wurde der Versuch nach Aktivierung der DC durch LPS wiederholt und die Expression
der oben genannten Oberflächenmoleküle auf unreifen und reifen DC von Rap1a-/- und wildtyp Mäusen gemessen. Es bestätigte sich die Beobachtung, dass es keinen Unterschied in der
Expression der untersuchten Oberflächenmoleküle zwischen unreifen Rap1a-/- und wildtyp
DC zu geben scheint. Nach LPS-induzierter Reifung der DC hingegen konnte für beide DCPopulationen eine verstärkte Expression der untersuchten Oberflächenmoleküle, mit Ausnahme von DCIR2, festgestellt werden. Für CD36, CD205 und DCIR2 zeigte sich eine verstärkte
Expression bei Rap1a-/- DC im Vergleich zu den wildtyp DC (s. Abbildung. 3-4). Dieser Effekt war besonders ausgeprägt bei DCIR2.
49
Ergebnisse
Abbildung 3-4: Durchflusszytometrische Analyse der Expression verschiedener Oberflä5
chenmoleküle mit und ohne Aktivierung mit LPS von wildtyp und Rap1a defizienten DC. Je 10
Zellen wurde mit anti-CD11c zur Bestimmung der DC-Population und mit entweder anti-CD16/32, CD36, -CD80, -CD86, -CD205 oder –DCIR2 gefärbt. Die Hälfte der Zellen war vorher mit 1µg/ml LPS
für 20 h aktiviert worden. Es zeigte sich eine erhöhte Expression von CD36, CD205 und DCIR2 auf
-/-/mit LPS aktivierten Rap1a DC im Vergleich zu aktivierten wildtyp DC (braun=Rap1a + LPS,
-/rot=Rap1a , schwarz=wt + LPS, grau=wt).
50
Ergebnisse
3.3
DC-vermittelte Sensibilisierung im Kontaktallergie-Modell
Im Kontaktallergie-Modell (CHS) kann die T-Zell-vermittelte allergische Reaktion (Typ-IV
Hypersensitivität) untersucht werden. Es ist bekannt, dass für diese Reaktion die Interaktion
von allergenbeladenen APC, wie z.B. DC, mit T-Zellen notwendig ist (Martin et al., 2008).
Unsere Gruppe konnte bereits zeigen, dass diese Reaktion in Rap1a defizienten Mäusen signifikant reduziert ist (Dorn et al., 2012). Um die Rolle von Rap1a in DC in diesem Zusammenhang genauer zu untersuchen, wurde eine Variante des CHS durchgeführt, bei dem Rap1a-/und wildtyp DC in vitro mit dem Kontaktallergen TNBS modifiziert und C57BL/6 Mäuse
durch intrakutane Injektion damit sensibilisiert werden. Dadurch konnte gezielt untersucht
werden, ob Rap1a defiziente DC für die von anderen beschriebene reduzierte allergische Reaktion in Rap1a defizienten Mäusen eine Rolle spielen.
Es zeigte sich, wie erwartet, eine signifikante Zunahme der Ohrdicke in den mit TNBSmodifizierten Rap1a-/- und wildtyp DC sensibilisierten Mäusen im Vergleich zu den Kontrollgruppen (p<0,05). Die Ohrschwellung bei den Kontrolltieren kommt durch die durch das potente Kontaktallergen TNCB hervorgerufene primäre Entzündungsreaktion zustande, welche
der Sensibilisierungsphase entspricht und deutlich geringer ausfällt als die Reaktion der Auslösungsphase in den mit TNBS-DC sensibilisierten Tieren. Die Ohrschwellung der mit
Rap1a-/- TNBS-DC sensibilisierten Mäuse unterschied sich jedoch nicht signifikant von der
durch wildtyp TNBS-DC hervorgerufenen Reaktion .
51
Ergebnisse
Abbildung 3-5: Ohrschwellungstest 5 Tage nach Sensibilisierung von C57BL/6
Mäusen mit allergen-modifizierten DC. C57BL/6 Mäuse wurden mit TNBS modifizier-/ten oder unmodifizierten (Kontrolle) Rap1a oder wildtyp DC intrakutan injiziert (n=3 pro
Gruppe). An Tag 5 erfolgte die Messung der Ohrdicke und Pinselung der Ohren mit 20 µl
1% TNCB pro Ohr (challenge), 24 h später die zweite Messung. Die Zunahme der Ohrdicke in µm zeigt das Ausmaß der Entzündungsreaktion an. Es zeigte sich eine signifikante Schwellung der Ohren bei sensibilisierten Versuchtieren i.Vgl. zur Kontrolle, je-/doch kein signifikanter Unterschied zwischen mit Rap1a und wildtyp TNBS-DC
sensibilisierten Mäusen. *** signifikant p<0.05
3.4
DC Migration in vivo
Das beim Migrationsassay in vitro festgestellte Migrationsdefizit der Rap1a-defizienten DC
wurde im Kontaktallergie-Modell in vivo untersucht. DC als potente APC nehmen Kontaktallergene auf und migrieren in lokale Lymphknoten um die Kontaktallergene dort zu präsentieren. Bepinselt man die Ohren von Rap1a-defizienten und wildtyp C57Bl/6 Mäusen mit FITC
kann man 24 h später die lokalen Lymphknoten entnehmen und die eingewanderten, FITC
beladenen DC durchflusszytometrisch analysieren. Hierzu wurden FITC-positive Zellen im
CD11c/MHC-II I-Ab hochpositiven Gate bestimmt und als % der gesamten CD11c/MHC-II IAb positiven Population angegeben (Abbildung 3-6).
52
Ergebnisse
Abbildung
3-6:
Durchflusszytometrische
Analyse der DC-Migration nach Allergenkontakt in aurikuläre Lymphknoten. 24 h nach
Pinselung der Ohren mit je 50 µl 0,2% FITC in
Ac/DBP oder mit 50 µl Ac/DBP als Kontrolle
erfolgte die Entnahme der aurikulären Lymphknoten. Die gewonnenen Zellen wurden im
b
CD11c/MHC-II I-A hochpositiven Gate auf FITC
Positivität analysiert. FITC positive, migrierte
b
Zellen wurden in % der CD11c/I-A positiven
Population angegeben (n=2 pro Gruppe): Kontrollen 14 % und 19,5 %, Wildtyp 73,9 % und
-/39,5 %, Rap1a 62,4 % und 28,2 %. Es konnten
keine signifikanten Unterschiede in der in vivo
-/Migration der Rap1a DC im Vergleich zum
Wildtyp festgestellt werden.
In diesem in vivo Versuch ließen sich keine Unterschiede im Migrationsverhalten der Rap1adefizienten DC im Vergleich zu wildtyp DC feststellen. Damit ergeben sich Hinweise, dass
das in vitro beobachtete signifikant vorhandene Migrationsdefizit der Rap1a-/- DC in vivo
kompensiert wird. Aufgrund der kleinen Gruppengröße (n=2 pro Gruppe) kann dies jedoch
nur als Trend betrachtet werden, der weiter evaluiert werden muss.
53
Ergebnisse
3.5
Allogene Stammzelltransplantation und GvHD Mausmodell
3.5.1 Rolle von Rap1a bei der GvHD
Die Rolle von Rap1a in der Entwicklung der GvHD nach Stammzelltransplantation wurde in
einem Mausmodell (C57BL/6 à BALB/c) mit einem MHC major mismatch untersucht. Als
Korrelat für das Ausmaß der GvHD wurde die T-Zellexpansion durch BiolumineszenzIimaging sichtbar und als Photonen/sec/Maus messbar gemacht. Dazu wurden Luziferasetransgene, Rap1a-/- sowie wildtyp T-Zellen bei der allogenen Stammzelltransplantation in die
Empfängertiere transfundiert. Eine Kontrollgruppe erhielt nur Knochenmarkzellen und keine
zusätzlichen T-Zellen. Somit konnten sowohl quantitative Aussagen über die Zellexpansion in
vivo als auch Beobachtungen hinsichtlich der Lokalität und des zeitlichen Ablaufs gemacht
werden. BALB/c-Empfängertiere, die Rap1a-/- T-Zellen infundiert bekommen hatten, zeigten
ein signifikant geringeres Biolumineszenz-Signal als wildtyp T-Zell-Empfänger, was als Maß
für die T-Zellexpansion angesehen werden kann und in Photonen/sec/Maus quantifizierbar
war (Abb. 3-7 und -8). Vor allem im Bereich des Darms, eines der wichtigsten GvHDZielorgane, zeigte sich ein deutlich schwächer ausgeprägtes Signal bei den Rap1a-/- T-ZellEmpfängern im Vergleich zur wt-Gruppe.
Abbildung 3-7: In vivo T-Zellproliferation von Rap1a-/- und wildtyp T-Zellen im C57BL/6 à
+
-/BALB/c alloKMT-Modell. Verteilung von luc , Rap1a
und wildtyp T-Zellen in BALB/cEmpfängertieren, repräsentativ an Tag 7, 9 und 17 nach alloKMT. *Tod durch GvHD; BM bone
luc wt
marrow, Kontrollgruppe, Transplantation von gesundem Knochenmark; BM/Tc
Transplantation
+
luc rap1a-/von Knochenmark und wildtyp, luc T-Zellen; BM/Tc
Transplantation von Knochenmark und
-/+
rap1a , luc T-Zellen
54
Ergebnisse
Abbildung 3-8: Quantifizierung der T-Zellexpansion in Pho-/+
tonen/sec/Maus Rap1a luc T-Zellen (hellgrau) zeigten ein
+
signifikant geringeres Photonensignal als Rap1a wildtyp luc TZellen (dunkelgrau) in BALB/c-Empfängertieren (p=0,006).
Exemplarische Darstellung des Signals in jeweils einer repräsentativen Maus.
Die GvHD zeigte sich klinisch durch Gewichtsabnahme, Diarrhoe, Anorexie, Lethargie und
struppiges Fell. Kontrollmäuse, die nur hämatopoetische Stammzellen und keine T-Zellen
transplantiert bekamen, entwickelten keine GvHD, da das Knochenmark von Mäusen nicht
ausreichend zytotoxische T-Zellen enthält (Zeiser et al., 2006). Das Überleben lag in der Kontrollgruppe bei 100%, was das Funktionieren der Knochenmarktransplantation anzeigt. Die
Erkrankung und das Versterben der Versuchstiere kann somit auch zuverlässig auf die TZellgabe und deren Effekt zurückgeführt werden. Die letale Bestrahlungsdosis war zuvor mit
einzelnen Tieren bestätigt worden. Wurde nach der Bestrahlung kein Knochenmark transplantiert, verstarben die Tiere innerhalb weniger Tage (Daten nicht gezeigt).
3.5.2 Rolle von Rap1a bei Homing und Engraftment
Rap1a spielt eine wichtige Rolle bei Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen sowie und z.B.
bei der Zelladhäsion und –migration (Duchniewicz et al., 2006; Kinashi and Katagiri, 2004;
Lorenowicz et al., 2006). Um einen möglichen Einfluss von Rap1a auf das Homing und Engraftment von hämatopoietischen Stammzellen bei der alloKMT zu untersuchen wurde ebenfalls ein C57BL/6 (H-2kb) à BALB/c (H-2kd) Transplantations-Modell verwendet, ohne
55
Ergebnisse
durch zusätzliche T-Zell-Gabe eine GvHD auszulösen. Die Knochenmarkzellen für die Transplantation wurden von Luziferase-transgenen C57BL/6 wildtyp und heterozygoten und homozygoten Rap1a-defizienten Mäusen gewonnen und die Expansion in BALB/c Mäusen mittels Biolumineszenz-Imaging sichtbar gemacht.
Weder homozygote noch heterozygote Rap1a-Defizienz führten zu einer Beeinträchtigung des
Engraftments, was sowohl durch das Imaging als auch klinisch und durchflusszytometrisch in
der Chimärismusanalyse bestätigt werden konnte. Es zeigte sich sogar eine verstärkte Expansion der Rap1a-/- und heterozygoten KM-Zellen im Vergleich zu wildtyp KM-Zellen (Abbildung 3-9).
Abbildung 3-9: Expansion von hämatopoietischen Stammzel+
len nach alloKMT. Verteilung von Rap1a wildtyp, +/- und -/-, luc
KM-Zellen nach alloKMT (C57BL/6àBALB/c) zu drei repräsentativen Zeitpunkten. Es zeigt sich eine verstärkte Expansion der
Rap1a-defizienten Zellen verglichen mit wildtyp KM-Zellen.
Um zum einen das Funktionieren des Transplantations-Modells zu kontrollieren und zum anderen das Engraftment der Donor-KM-Zellen in den Empfängertieren nachzuweisen, wurde
von je drei Tieren pro Gruppe Knochenmark gewonnen und durchflusszytometrisch analysiert. Dabei ergab sich ein > 90%iger Donorchimärismus für alle untersuchten Versuchstiere
an Tag 50 nach alloKMT, sodass von einem guten Engraftment der Spenderzellen in unserem
Transplantations-Modell ausgegangen werden konnte (Abbildung 3-10).
56
Ergebnisse
Abbildung 3-10: Durchflusszytometrische Chimärismusanalyse. KM-Zellen von 3 Mäusen je
b
Gruppe wurden aus Femur und Tibia gewonnen und mit anti-H-2k PE Antikörper gefärbt. Es zeigd
te sich ein >90 %iger Donorchimärismus der Balb/c Mäuse. Zur Kontrolle wurde gegen H-2k gefärbt (nicht gezeigt).
57
4
Diskussion
Diskussion
4.1
Die Rolle von Rap1a in DC
Die eng mit Ras verwandte kleine GTPase Rap1 spielt eine entscheidende Rolle in der Integrin- und Cadherin-vermittelten Zelladhäsion (Bos, 2005) und reguliert die Aktivität der
MAP Kinasen, wobei dieser Effekt vom jeweiligen Zelltyp abhängig ist (Minato et al., 2007).
Die Funktionen von Rap1 sind in einer Vielzahl von verschiedenen Zelltypen untersucht worden, vor allem in Zellen des Immunsystems, neuronalen Zellen, Epithel- und Endothelzellen.
Zur Funktion von Rap1 in DC, vor allem bezüglich Migration, Antigenaufnahme, prozessierung und –präsentation, liegen bisher nur wenige Daten vor. In dieser Arbeit wurde
mit Hilfe der in unserer Arbeitsgruppe generierten Rap1a-knockout Maus (Duchniewicz et al.,
2006) die Funktion der Isoform Rap1a in DC und in T-Zellen im GvHD –Modell genauer
untersucht.
4.1.1 Kompensation durch Rap1b
Rap1a-defiziente Mäuse haben einen milden Phänotyp ohne offensichtliche Defekte des Immunsystems (Duchniewicz et al., 2006). Möglicherweise kompensiert die Rap1b Isoform, die
zu 95% mit Rap1a identisch ist, teilweise das Fehlen von Rap1a, da die beiden Isoformen
sowohl redundante als auch spezifische Funktionen besitzen. So scheint z.B. Rap1b eine
wichtige Rolle in der Angiogenese zu spielen und ein wichtiger Faktor in der Migration von
Endothelzellen zu sein (Chrzanowska-Wodnicka et al., 2008; Li et al., 2007; Wittchen et al.,
2011). Trotzdem scheinen sowohl Rap1a als auch Rap1b essentiell für die Aktivierung von βIntegrin in Endothelzellen und dadurch für die Migration und Integrin-vermittelte Adhäsion
zu sein (Carmona et al., 2009). Insgesamt sind die Gemeinsamkeiten und Unterschiede der
beiden Isoformen noch nicht umfassend untersucht. Im Rap1 Pulldown Assay zeigte sich bei
heterozygoten Rap1a-ko DC ein vermindertes Rap1a-Signal, jedoch ein mit dem Wildtyp vergleichbares Gesamt-Rap1 Signal (Daten nicht gezeigt), was ebenfalls für eine Kompensation
durch Rap1b spricht.
4.1.2 Migration
Ein Einfluss von Rap1 auf die Zellmigration ist in verschiedenen Zelltypen beschrieben worden (Katagiri et al., 2004; McLeod et al., 2002; Shimonaka et al., 2003). Die Migration von
58
Diskussion
Zellen stellt einen komplexen Vorgang dar, der mit der dynamischen Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts einhergeht. Hierfür sind hauptsächlich die GTPasen der Rho-Familie, vor
allem RhoA, Cdc42 und Rac1, verantwortlich (Etienne-Manneville and Hall, 2002).
In der vorliegenden Arbeit konnte ein signifikanter Migrationsdefekt der Rap1a-defizienten
DC im Vergleich zu wildtyp DC in vitro festgestellt werden. Dabei war die Migration sowohl
ohne als auch entlang eines CXCL12-Chemokingradienten signifikant reduziert, jedoch nicht
aufgehoben, und durch CXCL12 verstärkbar (s. Abbildung 3-1 u. -2).
Diese Beobachtung steht in Einklang mit verschiedenen publizierten Studien. So konnten
Shimonaka et al. zeigen, dass Rap1 eine maßgebliche Rolle bei der Chemokin (CXCL12)induzierten Integrinaktivierung, Adhäsion und Migration entlang ICAM-1 und VCAM-1 und
der transendothelialen Migration von Lymphozyten spielt. Rap1 induziert dabei die Polarisierung der Lymphozyten, das RapGAP SPA-1 ist in der Lage sie zu unterdrücken (Shimonaka et
al., 2003). In diesem Zusammenhang scheint das Rap-Effektormolekül RAPL, welches hauptsächlich in Immunzellen exprimiert wird, eine entscheidende Rolle zu spielen, da Fehlen von
RAPL in Lymphozyten und DC zu einer defekten Adhäsion und Migration führt. Die Expression der Integrine LFA-1 und VLA-4 ist dabei nicht reduziert. RAPL induziert im Sinne des
inside-out Signals die Konformationsänderung von LFA-1 zur offenen Form (Katagiri et al.,
2003, 2004).
Weiter scheint Rap1 unterschiedlichen Einfluss auf Rho-GTPasen und somit auf das Zytoskelett und die Zellmorphologie zu haben. Im Schleimpilz Dictyostelium interagiert Rap1 mit
RacGEF1 und stimuliert wahrscheinlich über einen Rac Signalweg die Polimerisation von FActin nach Chemokinstimulation in vitro (Mun and Jeon, 2012). In menschlichen Zellen bindet Rap1 an verschiedene Rac-GEFs, z.B. VAV2 und Tiam1 (T-cell lymphoma and metastasis-inducing protein 1), und lokalisiert sie in aktiven Lamellipodien-Fortsätzen, wo sie
Rac1 aktivieren und zu Verstärkung der Zellausbreitung führen (Arthur et al., 2004; Gérard et
al., 2007). In Blutplättchen wird nach Stimulation durch den Kollagenrezeptor Gp-VI (Glykoprotein VI) Rac1 sequentiell nach Rap1 aktiviert (Stefanini et al., 2012). In NIH3T3 Fibroblasten konnte gezeigt werden, dass durch PDGF (platelet derived growth factor) aktiviertes
Rap1 an die Führungsstelle der Zelle rekrutiert wird und nachfolgend Rac1 dort lokalisiert
und aktiviert, was für die Zellmigration notwendig ist (Takahashi et al., 2008).
Weiter ist beschrieben, dass durch Reelin aktiviertes Rap1 unter Beteiligung von Ral, Rac und
Cdc42 die N-Cadherin-induzierte Polarisierung von migrierenden Neuronen fördert (Jossin,
2011).
59
Diskussion
Positive Effekte von Rap1, bzw. Rap1GEFs, auf die Migration von Zellen wurden unter anderem auch in B-Zell-Lymphomzellen (Lin et al., 2009), Melanomzellen (Freeman et al., 2010;
Gao et al., 2006; Hernández-Varas et al., 2011), Pankreaskarzinomzellen (Almahariq et al.,
2013), T-ALL-Zellen (Infante et al., 2011) und Kolonkarzinomzellen (Tsygankova et al.,
2013) beschrieben, sodass sich hier mögliche Therapieansätze ergeben.
Gegensätzlich wurde berichtet, dass konstitutiv aktiviertes Rap1 einen negativen Einfluss auf
Rac1 Signalwege und die Zellmigration in NBT-II Zellen hat (Vallés et al., 2004). Eine mögliche Erklärung ist, dass eine koordinierte Regulation der Aktivierung und Inaktivierung von
Rap1, nicht jedoch die andauernde Aktivierung von Rap1, für die Zellbewegung nötig ist
(Takahashi et al., 2008). Passend hierzu führt konstitutiv aktiviertes Rap1, andererseits aber
auch Blockierung der Rap1 Aktivierung, zu verminderter Extravasation und Metastasenbildung von Melanomzellen (Freeman et al., 2010).
In einem orientierenden in vivo Migrationsversuch von FITC-markierten Rap1a-defizienten
und wildtyp DC in aurikuläre Lympknoten konnte in dieser Arbeit kein Unterschied im Migrationsverhalten festgestellt werden (Abbildung 3-6). Hier ist allerdings die kleine Versuchsgruppengröße (n=2 pro Gruppe) hervorzuheben, die die Aussagekraft des Ergebnisses einschränkt, sodass dieses Ergebnis nur als Hinweis gesehen werden kann und es weiterer
Evaluation bedarf.
Es ergeben sich mehrere Erklärungen für ein mögliches unterschiedliches Migrationsverhalten
der Rap1a-defizienten DC in vitro und in vivo. Zum einen spielt wahrscheinlich die Kompensation durch Rap1b, wie oben beschrieben, eine wichtige Rolle, zum anderen könnte ebenfalls
Rap2 dazu beitragen. Rap1 und Rap2, die zu ca. 60 % identisch sind, scheinen distinkte Rollen in der Adhäsion und Migration von T-Zellen zu spielen und interagieren beide mit RAPL,
wobei RAPL-Rap2 stabilere Komplexe bildet (Miertzschke et al., 2007). Außerdem ist ein
Einfluss von Rap2 auf die Integrin-vermittelte Migration und Adhäsion in B-Zellen beschrieben (McLeod et al., 2002). Somit kann vermutet werden, dass auch Rap2 an der Migration
von DC beteiligt sein und ein defektes Rap1a Signal kompensieren könnte. Weiter ist denkbar,
dass RAPL auch durch andere Ras GTPasen, unabhängig von Rap1a, aktiviert wird. Abgesehen davon sind mehrere parallele und ineinandergreifende Signalwege, die die Chemotaxis
regulieren, beschrieben, sodass vor allem in vivo eine Kompensation der Rap1a-Defizienz
denkbar ist (Chen et al., 2007; Haastert et al., 2007; Kölsch et al., 2008).
60
Diskussion
4.1.3 Immunologische Synapse und T-Zellaktivierung
Unsere Gruppe konnte bereits zeigen, dass Rap1-/- Mäuse eine signifikant verminderte T-Zellvermittelte Entzündungsreaktion im CHS Mausmodell zeigen, was sich in einer verminderten
Ohrschwellungsreaktion und einer geringer ausgeprägten Zellinfiltration im histologischen
Schnitt äußert (Dorn et al., 2012). Wie in Kapitel 2.7 beschrieben, bedarf es der Aktivierung
von T-Zellen durch APC, um eine starke Entzündungsreaktion auszulösen, wobei DC als potenteste APC beschrieben sind (Abbas et al., 2012). Basierend auf dieser Rationale wurde in
dieser Arbeit gezielt die Rolle von Rap1a in DC im CHS Mausmodell untersucht, um die beobachtete verminderte Entzündungsreaktion in Rap1a-/- Mäusen weiter zu charakterisieren.
Hierbei zeigte sich kein signifikanter Unterschied in der Ohrschwellungsreaktion, wenn ausschließlich DC, nicht aber T-Zellen, Rap1a-defizient waren. Sowohl mit wildtyp DC als auch
Rap1a-/- DC sensibilisierte Tiere zeigten eine ausgeprägte und vergleichbare Ohrschwellung
als Ausdruck der Kontaktallergie (Abbildung 3-5). Dies spricht dafür, dass die zuvor beschriebene verminderte Entzündungsreaktion in Rap1-/- Mäusen nicht durch einen Defekt der
DC, sondern wahrscheinlich durch einen Defekt auf Seiten der T-Zellen verursacht wird. Dies
lässt sich durch den Einfluss von Rap1 auf die Ausbildung und Stabilisierung des Zell-ZellKontakts und der Ausbildung der immunologischen Synapse erklären.
Die dreidimensionale Anordnung der verschiedenen an der T-Zell-Aktivierung beteiligten
Moleküle an der Stelle des TCR-Antigen-MHC-Kontakts wird immunologische Synapse bzw.
SMAC (supramolecular activation cluster) genannt. Da der TCR relativ klein ist und nur eine
geringe Affinität zu Antigenen hat, die wiederum nur in geringer Zahl auf APC präsentiert
werden, bedarf es eines ausgeklügelten Adhäsionskomplexes, der die TCR-Antigen Bindung
stabilisiert und T-Zell-Aktivierung ermöglicht. Im Zentrum sind der TCR und die kostimulatorischen Moleküle lokalisiert (cSMAC), während LFA-1 und das zytoskelettale Adapterprotein Talin peripher um das Zentrum angeordnet sind (pSMAC) (Huppa and Davis, 2003).
LFA-1 umringt als Ring-Cluster das TCR-Cluster und bindet an ICAM-1 auf der APCOberfläche. Dieser Prozess wird durch den initialen Kontakt des TCR mit Antigen-beladenen
MHC-Molekülen initiiert (Huppa and Davis, 2003). Rap1 wird durch den TCR aktiviert, akkumuliert an der T-Zell-APC Kontaktstelle und führt zur Anhäufung, Reorganisation und Aktivierung von LFA-1 im Rahmen der Synapsenbildung (Katagiri et al., 2002). Wie bereits erwähnt, scheint dieser Vorgang über das Rap1/RAPL inside-out Signal, Assoziation von RAPL
mit LFA-1 und deren Akkumulation an der immunologischen Synapse abzulaufen (Katagiri et
61
Diskussion
al., 2003).
Unsere Gruppe konnte bereits zeigen, dass Rap1a-/- T-Zellen eine verminderte Adhäsion über
LFA-1/ICAM-1 sowie VLA-4/Fibronectin zeigen (Duchniewicz et al., 2006). Somit lässt sich
erklären, dass es durch das fehlende Rap1a-Signal zu einer verminderten Adhäsion und gestörten Synapsenbildung zwischen T-Zelle und DC kommt, wodurch eine deutlich geringer
ausgeprägte Entzündungsreaktion im CHS-Modell induziert wird. Rap1a-Defizienz in DC
scheint dagegen nicht zu einer sich phänotypisch auswirkenden beeinträchtigten Antigenaufnahme, -prozessierung, –präsentation oder T-Zellaktivierung zu führen, wobei genauer untersucht werden müsste, ob es sich hierbei um Kompensationsmechanismen handelt oder Rap1a
in diesen Vorgängen eine untergeordnete Rolle in DC spielt.
4.1.4 Phänotyp
Verschiedene Oberflächenmoleküle, die für die spezifischen Funktionen von DC wichtig sind,
wurden durchflusszytometrisch untersucht. Dabei ließen sich bei unstimulierten Rap1adefizienten und wildtyp DC keine Unterschiede hinsichtlich ihrer Expression von
CD16/CD32, CD36, CD80 und CD86, CD205 und DCIR2 feststellen. Somit kann festgestellt
werden, dass das Repertoire der untersuchten Oberflächenmoleküle auf DC durch das Fehlen
von Rap1a nicht beeinflusst wird. Nach Stimulation der DC mit LPS kommt es zur Reifung
der DC und Änderung ihres Oberflächenmarkerprofils, mit Anstieg der Expression kostimulatorischer Moleküle sowie Internalisierung von Endozytoserezeptoren (Mellman and Steinman,
2001; Nakahara et al., 2006). Entsprechend konnten in dieser Arbeit eine vergleichbare Hochregulation von CD80 und CD86 auf stimulierten DC festgestellt werden, sodass das Fehlen
von Rap1a hier keinen Einfluss zu haben scheint (Abbildung 3-3).
Die Expression von DCIR2, CD36 und CD205 war auf stimulierten Rap1a-/- DC im Vergleich
zu wildtyp DC signifikant erhöht (Abbildung 3-4).
DCIR2 gehört zu den Typ II C-Typ Lektin Rezeptoren und ist eines von vier murinen Homologen zum humanen DCIR (hDCIR). Er enthält ein ITIM (immunoreceptor tyrosine-based
inhibitory motif) und wirkt so als inhibitorischer Rezeptor. DCIR2 ist als spezifischer Marker
einer Untergruppe von CD8α- DC, die vor allem in der roten Pulpa und der Marginalzone der
Milz vorkommen, beschrieben. CD8α- DCIR2+ DC scheinen bevorzugt Antigene auf MHC-II
Molekülen zu präsentieren und eine CD4+ T-Zell-Antwort zu induzieren. Trotzdem ist die
62
Diskussion
genaue Funktion von DCIR in vivo noch nicht bekannt (Dudziak et al., 2007; Kanazawa,
2007). Es ist beschrieben, dass DCIR2 nach Stimulation der DC mit LPS, CD40L oder TNF-α
herabreguliert wird (Bates et al., 1999).
CD205 ist ein endozytotischer Typ II C-Typ Lektin Rezeptor und charakterisiert einen CD8α+
DC-Subtyp. Antigene, die über CD205 endozytiert werden, werden hocheffizient auf MHC-I
(Cross-Präsentation) und MHC-II Molekülen präsentiert. CD205 scheint eine wichtige Rolle
in der Toleranzinduktion durch Cross-Präsentation von Autoantigenen zu spielen (Bonifaz et
al., 2002; Shrimpton et al., 2009). Außerdem wurde beobachtet, dass Stimulation mit LPS zur
Erhöhung von CD205 auf DC und zur Toleranzinduktion führt (Zhou et al., 2014). Andererseits wird CD205 erfolgreich für die DC-vermittelte Vakzinierung gegen mikrobielle und Tumor-Antigene genutzt (Dhodapkar et al., 2014; Matos et al., 2013).
Der Multiligand-Scavenger-Rezeptor CD36 wird ebenfalls auf konventionellen CD8α+ DC
exprimiert und ist an der Phagozytose apoptotischer Zellen und der Belieferung des CrossPräsentations- und MHC-II Weges mit Antigenen beteiligt (Tagliani et al., 2008). Konventionelle CD8α+ DC scheinen generell eine Rolle bei der Aktivierung von CTL gegen Viren zu
spielen (Belz et al., 2004).
Die DCIR2 Expression änderte sich auf den wildtyp DC auch nach Stimulation mit LPS nicht,
lediglich die Rap1a-/- DC zeigten entgegen der Erwartung eine verstärkte Expression. CD36
und CD205 wurden auf beiden DC-Populationen nach LPS Stimulation wie in der Literatur
beschrieben verstärkt exprimiert, wobei das Signal der Rap1a-/- DC jeweils beträchtlich höher
war als das der wildtyp DC.
Dies könnte darauf hinweisen, dass Rap1a in wildtyp DC eine inhibitorische Funktion hat
hinsichtlich des Transports von DCIR2, CD205, CD36 auf die Zelloberfläche, während diese
Inhibition in Rap1a-/- DC fehlt. Da Rac1 die Fähigkeit von CD8+ DC zur Aufnahme apoptotischer Zellen und zur T-Zell-Aktivierung via Cross-Präsentation positiv reguliert (Kerksiek,
2005; Shurin et al., 2005; Tourkova et al., 2007) und eine antagonistische Wirkung von Rap1
auf Rac1 beschrieben ist (Vallés et al., 2004), könnte die Fähigkeit zur Antigenaufnahme und
Cross-Präsentation in Rap1a-/- DC erhöht sein. Diese Annahme korreliert mit der vermehrten
Expression von CD205 und CD36 auf Rap1a-/- DC. Die Analyse weiterer Subtyp-spezifischer
Oberflächenmarker, wie CD8α, CD103, CD4 und CD11b sind notwendig, um hier weiter
Klarheit zu erlangen. Ebenso sollten die speziellen Fähigkeiten der DC, vor allem Antigenaufnahme und –präsentation, insbesondere die Cross-Präsentation, und die Erzeugung der
spezifischen T-Zell-Antwort im Einzelnen genauer untersucht werden.
63
Diskussion
4.2
Die Rolle von Rap1 in GvHD und Engraftment
4.2.1 GvHD
Nach allogener Stammzelltransplanatation treten vor allem zwei schwerwiegende Komplikationen auf, GvHD und Transplantatversagen (engraftment failure). Bei der akuten GvHD erkennen Spender-T-Zellen empfängereigene Antigene auf Empfänger- und Spender-APC,
werden durch diese aktiviert und greifen Epithelgewebe des Empfängers an (Jacobsohn and
Vogelsang, 2007). Das sekundäre lymphatische Gewebe des Gastrointestinaltrakts scheint der
initiale Ort der T-Zell-APC Interaktion zu sein (Ferrara et al., 2009). Durch die Konditionierungstherapie werden proinflammatorische Zytokine wie TNFα und IL-1 vermehrt ausgeschüttet und Adhäsionsmoleküle, MHC-Moleküle und kostimulatorische Moleküle vermehrt
auf Empfänger-APC exprimiert (Wysocki et al., 2005). Aktivierte T-Zellen differenzieren
überwiegen in Richtung des TH1-Phänotyps, was mit massiver Zytokinausschüttung (INF-γ,
IL-2, TNFα) einhergeht und mit dem Auftreten und Schweregrad der aGvHD korreliert. Erhöhte IL-10 Spiegel sind dagegen mit einem geringeren GvHD Risiko assoziiert (Ferrara et
al., 2009). Die Expression von Integrinen, z.b. α4β7 Integrin, und Chemokinen wiederum sind
wichtig für das Einwandern der alloreaktiven T-Zellen in entzündete Gewebe bei der aGvHD
(Murai et al., 2003; Waldman et al., 2006; Wysocki et al., 2005).
Da Rap1, wie bereits beschrieben, an der Regulation von Zelladhäsion, -migration, TZellaktivierung, –proliferation und Zytokinproduktion beteiligt ist und sich auf die Interaktion
zwischen T-Zellen und APC bzw. DC auswirkt, stellt es ein interessantes Molekül in Zusammenhang mit der GvHD dar und wurde im Mausmodell in der vorliegenden Arbeit genauer
untersucht.
Im GvHD Modell in dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Rap1a-/- T-Zellen ein deutlich
geringeres Signal im BLI, entsprechend einer geringeren T-Zell-Expansion, nach alloKMT im
Vergleich zu wildtyp-T-Zellen aufwiesen (Abildung 3-7 u. -8). Klinisch zeigte die Rap1-/Gruppe eine geringere Ausprägung der GvHD-Symptome, jedoch zeigte sich keine signifikant
höhere Überlebensrate.
Die verminderte T-Zellexpansion kann zum einen durch die bereits beschriebene eingeschränkte Ausbildung der immunologischen Synapse und T-Zell-APC Interaktion von Rap1adefizienten T-Zellen erklärt werden (s. Kapitel 1.1.3 und Kapitel 4.1.2).
Außerdem ist ein Defekt der Migration und des Einwanderns von Rap1a-defizienten T-Zellen
64
Diskussion
denkbar. Damit zirkulierende, aktivierte T-Zellen in Zielgeweben der GvHD, z.B. Haut oder
Darmschleimhaut, Entzündung und Destruktion verursachen können, müssen sie zunächst die
Blutbahn durch postkapilläre Venolen verlassen. Dies geschieht durch Chemokin-induzierte
transendotheliale Migration in mehreren Schritten. Die aktivierten T-Zellen rollen Selektinvermittelt entlang des Endothels, dann kommt es durch Chemokine zur Aktivierung von Integrinen, v.a. VLA-4 und LFA-1, auf T-Zellen und zur festen Adhäsion, und schließlich zur
trans- und paraendothelialen Migration der Lymphozyten (Alon and Ley, 2008; Ley et al.,
2007).
Die genauen Signalwege, über die die Chemokin-induzierte Adhäsion und Migration der TZellen koordiniert werden, sind weitgehend unbekannt. Rap1 ist hier hauptsächlich für die
durch verschiedene inside-out Signale induzierte schnelle Aktivierung von Integrinen, die
Scherkraft-resistente Adhäsion am Endothel und die transendotheliale Migration der Lymphozyten verantwortlich (Shimonaka et al., 2003). Aktiviertes Rap1 und sein Effektormolekül
RIAM rekrutieren das Aktin-Adapterprotein Talin1 zum zytoplasmatischen Teil der Integrine,
wodurch diese in ihre hochaffine Konformation übergehen (Han et al., 2006; Tadokoro et al.,
2003). Zusätzlich erhöht Rap1 die Avidität und Affinität von LFA-1 durch Rekrutierung von
RAPL an die zytoplasmatische α-Kette von LFA-1 (Katagiri et al., 2003).
Verschiedene Studien zeigen die Bedeutung der Integrinexpression und -aktivierung auf TZellen für die GvHD-Entwicklung (Chen et al., 2013; Liang et al., 2008; Petrovic et al., 2004;
Waldman et al., 2006). Klinisch bedeutsam sind therapeutische Antagonisten von Integrinen,
z.B. monoklonale Antikörper oder Statine (Blazar et al., 1995; Harning et al., 1991; Wang et
al., 2009). Die Blockade von LFA-1 durch Lovastatin reduziert die GvHD-Morbidität und
Mortalität, und führt zu verminderter T-Zellproliferation in vivo (Wang et al., 2009).
CRK Proteine gehören zur Familie der Adapterproteine und sind ebenfalls Regulatoren von
Zelladhäsion und –migration. CRK Proteine binden mit einer SH3-Domäne an das Rap1GEF
C3G, welches Rap1 aktiviert (Birge et al., 2009). Kürzlich konnte gezeigt werden, dass dieser
Signalweg (CRK/C3G/Rap1) wichtig für die Chemokin-induzierte Adhäsion und Migration
von T-Zellen ist. In einem Mausmodell führte der konditionale knockout von CRK/CRL-like
(CRKL) in T-Zellen zu beeinträchtigter Aktivierung von Rap1 und defekter Chemokininduzierter Adhäsion, Chemotaxis und Diapedese. CRK/CRKL defiziente T-Zellen zeigten
effizientes Einwandern in lymphatische Organe, jedoch schwache Migration in entzündete
Gewebe, inkl. GvHD Zielorgane. Diese Beobachtung ist wichtig, da CRK/CRKL-defiziente
65
Diskussion
T-Zellen einen starken Graft-versus-Tumor-Effekt, der sich v.a. im lymphatischen Gewebe
abspielt, auslösen können, dabei aber nur eine minimale GvHD hervorrufen (Huang et al.,
2015).
Somit kann geschlussfolgert werden, dass Rap1a-Defizienz in T-Zellen möglicherweise zu
einer reduzierten Migration in die von der GvHD betroffenen Gewebe führt, was sich durch
die verminderte T-Zellexpansion im BLI und eine abgeschwächte GvHD-Symptomatik äußert. Dies sollte z.B. durch histologische Untersuchungen von GvHD-Zielorganen weiter evaluiert werden. Als Mechanismus kann eine beeinträchtigte Chemokin-induzierte Integrinaktivierung über Rap1-Signalwege vermutet werden.
Eine weitere Überlegung gilt der T-Zelldifferenzierung in TH1 und TH2 Phänotypen und deren
Einfluss auf die GvHD-Entwicklung. An der Auslösung der aGvHD scheinen vor allem CD4+
TH1-Zellen, die die Zytokine IFN-γ, IL-2 und TNFα sezernieren, beteiligt zu sein (Reddy,
2003). TH2-Polarisierung durch IL-4 hingegen reduziert die Entwicklung der GvHD, bzw.
Fehlen von TH2 Zytokinen verschlechtert die GvHD (Fowler and Gress, 2000; Tawara et al.,
2008). Die Rolle der TH1/ TH2 Polarisation in der Pathogenese der GvHD ist jedoch noch
nicht gänzlich verstanden und wird kontrovers diskutiert (Blazar et al., 2012; Reddy, 2003).
In Rap1a-/- T-Zellen ist in vitro sowohl die TH1- als auch die TH2-Zytokinproduktion nach
Stimulation über den TCR dereguliert, wobei die TH2-Zytokine, besonders IL-5, IL-6 und IL10, stärker induziert werden und möglicherweise die TH1-Antwort unterdrücken (Dorn et al.,
2012). Falls diese Deregulierung auch in vivo auftritt, könnte dies einen weiteren Einfluss auf
die Entwicklung der GvHD durch Rap1a-/- T-Zellen haben. Hierzu sollten die Zytokinspiegel
nach alloKMT analysiert werden.
Beim GvHD Mausmodell, das in dieser Arbeit durchgeführt wurde, verstarben die erkrankten
Mäuse nur teilweise an der GvHD, Überleber entwickelten jedoch eine der cGvHD ähnelnden
Erkrankung. Hier zeigte sich eine geringere Ausprägung bei Empfängern von Rap1a-/- TZellen. Möglicherweise führte die zwar nachweislich letale, aber insgesamt im Vergleich zu
bereits beschriebenen GvHD-Modellen (Schroeder and DiPersio, 2011; Zeiser et al., 2006)
geringere und nicht fraktionierte Bestrahlung von 1x7 Gy zu einer verminderten Gewebeschädigung und entsprechend vermindertem Zytokinsturm, wodurch die GvHD Mortalität in
66
Diskussion
der Maus reduziert wird (Hill et al., 1997; Schwarte and Hoffmann, 2005; Schwarte et al.,
2007). Es ist zudem beschrieben, dass Unterschiede zwischen Umwelt-Pathogenen in verschiedenen Laboren und in Mäusen von verschiedenen Anbietern die Ausprägung der GvHD
beeinflussen (Nestel et al., 1992).
In dieser Arbeit wurde der GvT-Effekt der Rap1a-/- T-Zellen nicht untersucht. Aufgrund der
beschrieben Einflüsse von Rap1a auf T-Zellaktivierung, -migration und –interaktion wären
weiterführende Versuche hierzu äußerst interessant. Vor allem in Hinblick auf eine mögliche
klinische Bedeutung von Rap1 in der GvHD ist ein intakter GvT-Effekt unabdingbar, da sonst
eine Reduktion der GvHD mit einer erhöhten Krankheits-Rückfallrate einhergeht.
4.2.2 Engraftment
Das Einwandern und Anwachsen von hämatopoetischen Stammzellen in die Knochenmarknische sind Voraussetzung für die erfolgreiche Stammzelltransplantation nach myeloablativer
Konditionierung. Wie in der Einleitung beschrieben, spielt hier zum einen die SDF-1/CXCR4
Achse eine wichtige Rolle (Takashi Nagasawa, 1996), die über Rap1-Aktivierung die Interaktion von LFA-1 mit ICAM-1 induziert. Dies ist essentiell für Migration und Homing von HSC
in die Stammzellnische (Potocnik et al., 2000; Shimonaka et al., 2003). Andererseits ist eine
dominante Rolle der Interaktion von VLA-4 mit VCAM-1 für das Homing beschrieben, da
diese eine fehlende LFA-1/ICAM-1 Interaktion kompensieren kann (Bonig et al., 2006).
Aufgrund der bereits diskutierten Funktionen von Rap1 hinsichtlich der Chemokininduzierten Zellmigration und –adhäsion, könnte eine Einschränkung des Homing und Engraftment von Rap1-/- HSC erwartet werden. Hierzu liegen bisher kaum publizierte Daten vor.
Minato et al. berichten in ihrem Review von 2007 über vermindertes Homing von HSC mit
SPA-1-Überexpression oder dominant-negativer Rap1 Mutation nach Stammzelltransplantation (Minato et al., 2007).
Kürzlich konnte auch in Rap1a-/- HSC eine reduzierte CXCL12-induzierte Adhäsion an
VCAM-1 und ICAM-1 gezeigt werden. Konträr dazu wiesen Rap1a-/- HSC ein intaktes Engrafment im Mausmodell auf (direkte Kommunikation, Deak et al.).
Auch in dieser Arbeit konnte entgegen der Erwartung und in Einklang mit den Ergebnissen
von Deak et al. eine uneingeschränkte Repopulation des Knochenmarks mit Rap1a-/- HSC
67
Diskussion
nach myeloablativer Bestrahlung im C57Bl/6àBALB/c Transplantationsmodell nachgewiesen werden. Durchflusszytometrisch zeigte sich 50 Tage nach Transplantation ebenfalls ein
Donorchimärismus von mind. 90%. Im BLI zeigte sich in Empfängern von Rap1a+/- und
Rap1-/--Knochenmarkzellen eine verstärktes Signal entsprechend einer vermehrten Expansion
im Vergleich zu Wildtyp-Knochenmarksempfängern (Abbildung 3-9 u. -10).
Ursache für die nicht beobachtete negative Auswirkung der Rap1a-Defizienz auf das Einwandern ist einerseits möglicherweise die bereits in 4.1.1 diskutierte Redundanz der Rap1 Isoformen (Chrzanowska-Wodnicka et al., 2008; Li et al., 2007; Wittchen et al., 2011). Andererseits
spielt wie oben beschrieben die VLA-4/VCAM Interaktion eine primäre Rolle beim Einwandern von HSC, und es sind Rap1-unabhängige Mechanismen in der Regulation von VLA-4
beschrieben (Ghandour et al., 2007).
4.3
Ausblick
Die Untersuchung der Rolle von Rap1a in DC sollte mit weiteren in vitro sowie in vivo Versuchen fortgeführt werden. Besonders interessant wären Versuche zur Antigenaufnahme, prozessierung und –präsentation, der T-Zell-Aktivierung sowie Zytokinausschüttung von DC.
Untersuchungen der jeweiligen Signalwege wären ebenfalls wichtig, um den Einfluss von
Rap1a auf andere GTPasen, vor allem Ras, und bekannte Signalwege zu verstehen. Da DC
eine wichtige Rolle in der Immunabwehr sowie bei pathologischen Immunreaktionen wie der
GvHD spielen, könnten sich hier mögliche therapeutische Angriffspunkte ergeben.
Bei der Entwicklung der GvHD spielt die Interaktion von Spender-T-Zellen mit APC eine
grundlegende Rolle, wobei bisher nicht endgültig geklärt werden konnte, welche Rolle Empfänger- und Spender-APC spielen (Duffner et al. 2004, Li et al. 2012, Markey et al. 2009,
Matte et al. 2004, Shlomchik et al. 1999). In dieser Arbeit konnte ein Einfluss von Rap1a auf
die Entwicklung der GvHD im GvHD-Mausmodell mit Rap1a-defizienten T-Zellen gezeigt
werden. Dieser Einfluss sollte auch auf Seiten der DC untersucht werden. Hierfür sollten
mindestens zwei Modelle verwendet werden: (1) GvHD-Modell mit Rap1a-defizienten Spender-DC, (2) GvHD-Modell mit Rap1a-defizienten Empfänger-DC. Hierfür sollten zunächst
Chimären mit Rap1a-Defizienz im hämatopoetischen System, also auch den Empfänger-DC,
hergestellt werden.
Weiter ist bekannt, dass Statine einen positiven Effekt auf die Entwicklung der GvHD haben
68
Diskussion
können (Hechinger et al., 2013). Daher wäre es interessant, den Einfluss von rap1 im Zusammenhang mit Statinen oder z.B. Farnesyltransferase- oder Geranyltransferase-Inhibitoren zu
untersuchen. Dies könnte in dem in dieser Arbeit beschriebenen GvHD-Maus-Modell erfolgen.
69
5
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die GvHD stellt als eine der hauptsächlich auftretenden Komplikationen nach alloHSZT den
Hauptgrund für die sogenannte non-relapse Mortalität dar. Grundlegend bei der Pathogenese
ist die Interaktion von Donor-T-Zellen mit APC. Die Prävention und Therapie sowohl der
akuten als auch der chronischen GvHD ist bisher nicht befriedigend und daher Gegenstand
aktueller Forschung.
In dieser Arbeit wurde zunächst die Funktion von Rap1a in DC untersucht. Für alle Versuche
wurde die im eigenen Labor generierte Rap1a-ko Maus verwendet. Im Migrationsassay in der
Boyden-Kammer konnte ein signifikanter Migrationsdefekt Rap1a-defizienter DC in vitro
nachgewiesen werden. Dieser Effekt konnte in einem Vorversuch in vivo nicht bestätigt werden, weitere Versuche sind hier notwendig. Die Rap1a-defizienten DC wurden hinsichtlich
verschiedener Oberflächenmarker mittels FACS untersucht. Hier zeigten sich im Ruhezustand
keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zu wildtyp DC, nach Stimulierung mit LPS
zeigte sich jedoch eine verstärkte Expression von DCIR2, CD36 und CD205, was auf eine
mögliche erhöhte Fähigkeit zur Antigenaufnahme und Cross-Präsentation von Rap1adefizienten DCs hinweist. Im Kontaktallergiemodell konnte gezeigt werden, dass das Fehlen
von Rap1a in DC keinen signifikanten Einfluss auf die T-Zell-DC-Interaktion hat, und somit
die Entzündungsreaktion normal abläuft. Im Gegensatz dazu zeigen Rap1a-defiziente Mäuse
eine verminderte Entzündungsreaktion (Dorn et al., 2012), sodass von einem Defekt auf Seiten der T-Zelle ausgegangen werden kann.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde Rap1a in einem GvHD Maus-Modell untersucht. Es
konnte mittels Biolumineszenz-Imaging (BLI) gezeigt werden, dass Rap1a-Defizienz von
Spender-T-Zellen zu einer verminderten Expansion der T-Zellen sowie einer Abschwächung
der GvHD führt. Weiter wurde gezeigt, dass Rap1a-defiziente hämatopoetischen Stammzellen
keine Einschränkung in Homing und Engraftment im Vergleich zum Wildtyp aufweist. Dies
könnte darauf hinweisen, dass andere Rap1a-abhängige Funktionen, wie T-Zell-Aktivierung
oder –Differenzierung für den Effekt bei Rap1a-Defizienz von Spender-T-Zellen bei der
GvHD verantwortlich sind. Insgesamt stellt Rap1 einen möglichen therapeutischen Angriffspunkt für die GvHD dar und sollte diesbezüglich weiter untersucht werden.
70
6
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Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
A-cyclase
Adenylatcyclase
AP-1
activator protein-1
APC
Antigen-präsentierende Zelle
BMDC
bone marrow derived dendritic cells
cAMP
cyclisches Adenosinmonophosphat
CalDAG
Calcium Diacylglycerol
CCR
CC-Motiv Chemokinrezeptor
CD
cluster of differentiation
CK
Chemokin
C3G
Crk SH3-domain-binding guanine-nucleotide releasing factor
CHS
Contact hypersensitivity
Crk
CT10 (chicken tumor virus number 10) regulator of kinase
CTL
zytotoxische T-Zellen
CTLA-4
cytotoxic T-lymphocyte-associated protein-4
CXCR
CXC-Motiv-Chemokinrezeptor
DAG
Diacylglycerol
DC
Dendritische Zelle
DEC-205
dendritic and epithelial cells 205 kDa
DLI
Donor-Lymphozyten-Infusion
dNTP
Desoxyribonukleosidtriphosphat
E6TP
E6-targeted protein-1
EGF
epithelial growth factor
EGFR
epithelial growth factor receptor
Epac
exchange protein directly activated by cAMP
ERK
extracellular regulated kinase
FLT3L
fms-related tyrosine kinase 3 ligand
GDP
Guanosindiphosphat
GEF
guanine nucleotide exchange factor
GM-CSF
granulocyte/macrophage colony-stimulating factor
GP
Glykoprotein
GTP
Guanosintriphosphat
87
Abkürzungsverzeichnis
GvHD
Graft versus Host Disease
GvL
Graft versus Leukemia effect
HLA
human leukocyte antigen
HPV
Humanes Papilloma Virus
HSZT
hämatopoetische Stammzelltransplantation
i.c.
intra cutan
ICAM-1
intercellular adhesion molecule-1
IFN
Interferon
IL
Interleukin
i.p.
intra peritoneal
kDa
Kilodalton
KM
Knochenmark
KMT
Knochenmarktranksplantation
ko
knockout
LFA-1
lymphocyte function-associated antigen-1
LPS
Lipopolysaccharid
MAGI
membrane-associated guanylate kinase (MAGUK) with inverted
orientation
MAPK
mitogen activated protein kinase
MEK
mitogen/extracellular signal-regulated kinase
MHC
major histocompatibility complex
MKP3
MAPK Phosphatase 3
MMR
Makrophagen-Mannose-Rezeptor (CD206)
mTOR
mammalian target of Rapamycin
MyD88
myeloid differentiation primary response gene 88
NFAT
nuclear factor of activated T-cells
NFκB
nuclear factor κB
NGF
nerve growth factor
NK
Natürliche Killerzelle
NRM
non-relapse Mortalität
PAMP
pathogen-associated molecular pattern
PBS
phosphate buffered saline
PD-1
programmed death-1
88
Abkürzungsverzeichnis
PDGF
platelet derived growth factor
PDZ
postsynaptic density-95 discs-large and zona occludens protein
PI3K
Phosphatidylinositol-3 Kinase
PKA
Protein Kinase A
PLC
Phospholipase C
PP2A
Protein Phosphatase 2A
PRR
pattern-recognition Rezeptor
PtdIns(4,5)P2
Phosphatidylinositol-4,5-biphosphat
R
Rezeptor
RAP
Ras-proximate
RAPL
Regulator of cell polarization and adhesion enriched in
lymphoid tissues
RPMI
Roswell Park Memorial Institute
RTK
Rezeptor Tyrosin Kinase
SDF-1
stromal cell-derived factor 1
SCAM
synaptic scaffolding molecule
SH3
src homology 3
SMAC
supramolecular activation cluster
SPA-1
signal-induced proliferation-associated protein 1
Src
sarcoma
TCR
T-Zell-Rezeptor
TH-Zelle
T-Helfer Zelle
Tiam1
T-cell lymphoma and metastasis-inducing protein 1
TLR
toll-like Rezeptor
TNBS
2,4,6-Trinitrobenzol-1-Sulfonsäure
TNCB
2,4,6-Trinitro-1-Chlorbenzol
TNF
Tumornekrosefaktor
TRIF
TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β
wt
wildtyp
89
8
Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1-1: Die dendritische Zelle in der Hämatopoese. ....................................................6
Abbildung 1-2: Pathophysiologie der aktuten GvHD. ............................................................12
Abbildung 1-3: Ras-Regulierungszyklus. ................................................................................17
Abbildung 1-4: Schematische Darstellung der durch Adhäsion von Leukozyten induzierten
Signalwege in Leukozyten und Endothelzellen. .......................................................................25
Abbildung 1-5: Generation der Rap1a knockout Maus. ..........................................................26
Abbildung 2-1: Rap1a Gelelektrophorese einer Genotypisierung von Rap1 knockout Mäusen.
...................................................................................................................................................32
Abbildung 2-2: Boydenkammer (Transwell Permeable Supports, Corning)...........................35
Abbildung 2-3: Reinheitskontrolle der primären DC-Kultur aus Knochenmarkzellen mittels
FACS Analyse ...........................................................................................................................38
Abbildung 2-4: Prinzip der Positivselektion mittels MACS-System. .....................................42
Abbildung 3-1: Migration von wildtyp, Rap1a +/- und -/- DC im Transwell-Kammer-Assay.
...................................................................................................................................................45
Abbildung 3-2: Migration von Rap1a-/- DC in vitro...............................................................46
Abbildung 3-3: Durchflusszytometrische Analyse der Expression verschiedener
Oberflächenmoleküle auf wildtyp sowie Rap1a-/- DC. .............................................................47
Abbildung 3-4: Durchflusszytometrische Analyse der Expression verschiedener
Oberflächenmoleküle mit und ohne Aktivierung mit LPS von wildtyp und Rap1a defizienten
DC. ............................................................................................................................................49
Abbildung 3-5: Ohrschwellungstest 5 Tage nach Sensibilisierung von C57BL/6 Mäusen mit
allergen-modifizierten DC. .......................................................................................................51
Abbildung 3-6: Durchflusszytometrische Analyse der DC-Migration nach Allergenkontakt in
aurikuläre Lymphknoten. ..........................................................................................................52
Abbildung 3-7: In vivo T-Zellproliferation von Rap1a-/- und wildtyp T-Zellen im C57BL/6 à
BALB/c alloKMT-Modell. .......................................................................................................53
Abbildung 3-8: Quantifizierung der T-Zellexpansion in Photonen/sec/Maus.........................54
90
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 3-9: Expansion von hämatopoietischen Stammzellen nach alloKMT. ..................55
Abbildung 3-10: Durchflusszytometrische Chimärismusanalyse............................................56
91
9
Lebenslauf
Lebenslauf
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10
Publikationen
Publikationen
2016
Fleck, E., Göttig, S., Kropshofer, H., Steinmann, J., Dorn, A., et al.
(2016) Mice Deficient in Rap1A GTPase Display Reduced Adhesion of
Hematopoietic and Mesenchymal Stromal Cells but Intact Hematopoietic
Repopulation Potential. J Stem Cell Res Ther 6: 356.
2015
Steinmann, J., Fleck, E., Henschler, R., Fisch, P., Scheele, J., & Kropshofer, H. (2015, October). GTPase Rap1 regulates the shear stressresistant adhesion of Mesenchymal Stromal Cells (MSCs). In Oncology
Research
and
Treatment
(Vol.
38,
pp.
128-128).
ALLSCHWILERSTRASSE 10, CH-4009 BASEL, SWITZERLAND:
KARGER. (ausgezeichnet mit dem Posterpreis der DGHO)
Steinmann, J., Bertz, H., Wäsch, R., Marks, R., Zeiser, R., Bogatyreva,
L., Finke, J., and Lübbert, M. (2015). 5-Azacytidine and DLI can induce
long-term remissions in AML patients relapsed after allograft. Bone
Marrow Transplant. 50, 690–695.
2014
Platzbecker, U., Schnerch, D., Steinmann, J. Low-dose chemotherapy
and kinase inhibition as treatment options in AML and MDS In: Lübbert
M, Gore S, eds., MDS and Acute Myeloid Leukemias: A Biological and
Therapeutic Continuum. Chapter 3. UNI-MED Verlag AG, 28323 Bremen, International Medical Publishers (Boston MA, USA; London UK).
2014
Brown, R., Steinmann, J., Graham, J., Glasspool, R. Epigenetic Therapies in Solid Tumours: From Preclinical Models to Clinical Trial Results.
In: Lübbert, M., Jones, P.A., eds. Epigenetic Therapy of Cancer. Springer
Berlin Heidelberg; 2014
Navanda, S.C., Steinmann, J., Lübbert, M., Silverman, L.R. Clinical developement of demethylating agents in hematology. J Clin Invest. 2014;
124(1):40-6.
2013
ASH Annual Meeting, New Orleans, USA
Abstract Achievement Award
Steinmann, J., Bertz, H., Wäsch, R., Marks, R., Zeiser, R., Bogatyreva,
L., et al. Low Dose 5-Azacytidine combined with Donor Lymphocyte Infusions (DLI), an effective Outpatient Treatment of AML/MDS Relapse
after Allografting, can induce Long-Term Remissions: An Experience of
72 Patients. Blood. 2013; 122(21):3317-3.
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Danksagung
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