Nachweis der Ubiquitinierung von TRPM4 Wildtyp und seiner
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Nachweis der Ubiquitinierung von TRPM4 Wildtyp und seiner Variante A432T Eine Pulldown Methode mit einem GST-S5A Konstrukt 1. Zusammenfassung 4. Methodik, Material und Vorgehen Bei Patienten mit einem atrioventrikulären Block (AVB) kann der „transient receptor potential channel“ Melastatin 4 (TRPM4) verändert sein. Unter anderem wurde die TRPM4 Variante A432T beschrieben, welche im Vergleich zum Wildtyp (WT) eine verminderte Proteinexpression aufweist. Die Ubiquitinierung ist ein Prozess, der in die Proteinexpression von Ionenkanälen involviert ist. Das Ziel dieser Arbeit ist es zu zeigen, ob TRPM4 WT und seine Variante A432T ubiquitiniert sind. Um diese Annahme zu überprüfen, wurde eine Pulldown Methode mit einem GST-S5A Konstrukt durchgeführt. Dabei hat sich herausgestellt, dass sowohl TRPM4 WT und TRPM4 A432T ubiquitiniert sind, jedoch nicht gleich stark. Dies könnte ein Indiz für den Proteinabbau vermittelt durch das endoplasmatische Retikulum (ERAD pathway) sein. 1. Schritt: Herstellung der Beads für den Pulldown - Mittels Überexpression von GST-S5A resp. GST durch IPTG Induktion in Bakterien - Lyse der Bakterien - Bindung an Sepharose Beads (GSH) GST-S5A Konstrukt Negativkontrolle GST GST GSH 2. Einleitung Bei einem atrioventrikulären Block (AVB) handelt es sich um eine Reizleitungsstörung des Herzens. Dabei kann der Impuls zur Kontraktion nicht mehr von den Vorhöfen zu den Ventrikeln weitergeleitet werden. Bei Untersuchungen von betroffenen Patienten, konnte festgestellt werden, dass der Ionenkanal TRPM4 verändert ist. Neben vielen anderen TRPM4 Varianten wurde auch die Variante TRPM4 A432T identifiziert. Bei dieser Variante handelt es sich um einen Austausch der Purinbasen am N-Terminus von TRPM4. Diese Mutation führt zu einer Substitution von Alanin zu Threonin an der Stelle 432 (TRPM4 A432T) (Liu et al., 2013: p. 3). Vorausgehende Experimente zeigten, dass TRPM4 A432T eine verminderte Proteinexpression aufweist im Vergleich zum Wildtyp (Syam N., 2013: Wurde noch nicht publiziert, mit der Erlaubnis der Autorin). Eine Erklärung für diesen Umstand könnte die Ubiquitinierung sein. Ubiquitin ist ein regulatorisches Protein, welches hauptsächlich dafür bekannt ist, Proteine für den Abbau durch das Proteasom zu markieren. Ein Grund für die Ubiquitinierung sind falsch gefaltete Proteine, welche durch Veränderungen in der Abfolge der Aminosäuren entstehen können. Das endoplasmatische Retikulum (ER) ist die posttranslationelle Qualitätskontrolle der Proteine. Wenn das ER falsch gefaltete Proteine erkennt, werden diese mittels Ubiquitin markiert. Durch die Modifikation werden diese Proteine ins Zytoplasma transportiert, wo sie durch das Proteasom abgebaut werden. Dieser Vorgang wird als ER-assoziierter Proteinabbau bezeichnet (ERAD pathway) (Rougier et al., 2010: p. 22 – 23). Die Effizienz dieses Vorgangs ist bei einer tieferen Temperatur vermindert. Bei einem vorgängigen Experiment wurden die transfizierten Zellen bei 28°C anstatt bei 37°C inkubiert. Die darauffolgende Auswertung der Proteinexpression ergab für TRPM4 und TRPM4 A432T ein vergleichbares Ergebnis. Im Vergleich zum TRPM4 WT war keine verminderte Expression bei der Variante A432T sichtbar (Syam N., 2013: Wurde noch nicht publiziert, mit der Erlaubnis der Autorin). Das Ziel dieser Arbeit ist es zu zeigen, ob TRPM4 WT und seine Variante A432T ubiquitiniert sind. Um diese Annahme zu überprüfen, wurde eine Pulldown Methode mit einem GST-S5A Konstrukt durchgeführt. Dabei hat sich herausgestellt, dass sowohl TRPM4 WT und TRPM4 A432T ubiquitiniert sind, jedoch nicht gleich stark. Dies könnte ein Indiz für den Proteinabbau vermittelt durch das endoplasmatische Retikulum (ERAD pathway) sein. 3. Ziele und Fragestellungen Das Ziel dieser Arbeit ist es die molekulare Grundlage der verminderten Proteinexpression von TRPM4 A432T zu untersuchen. Basierend darauf, sind folgende Fragestellungen formuliert worden: S5A = Erkennt ubiquitinierte Proteine Glutathion-STransferase (GST) 2. Schritt: Proteinsynthese in HEK 293 Zellen - Transfektion der Zellen mit TRPM4 WT und TRPM4 A432T - Zellyse - Weiterfahren mit dem Zelllysat, welches TRPM4 WT resp. TRPM4 A432T enthält Ub Ub Ub Ub Ub Ub Ubiquitin 3. Schritt: Inkubation der Beads zusammen mit dem Zelllysat Bindung nur von ubiquitinierten Proteinen an das GST- S5A Konstrukt GSH GST Negativkontrolle Ergebnis analog zum GST S5A Konstrukt, wenn Proteine nicht ubiquitiniert sind Ub Keine Bindung an das GST S5A Konstrukt möglich, da Proteine nicht ubiquitiniert sind Ub GSH GST Waschen Waschen Wa schen GSH GST Ub GSH GST GSH Wa schen GST GST GSH 4. Western Blot - Probenmaterial wird auf eine SDS-PAGE geladen - Detektion mittels Antikörper gegen TRPM4 sowie gegen Ubiquitin - Statistische Evaluation mit einem t-Test 1.) Sind TRPM4 Wildtyp und seine Variante A432T ubiquitiniert? 2.) Ist die A432T Variante unterschiedlich ubiquitiniert im Vergleich zum Wildtyp? 5. Ergebnisse und Resultate Um diese Fragen zu beantworten, wird eine Pulldown Methode angewandt, welche ein GST-S5A Konstrukt verwendet. Das S5A Motiv ist eine Untereinheit des Proteasoms, welches ubiquitinierte Proteine erkennen kann. In den Western Blots wurde festgestellt, dass TRPM4 WT sowie dessen Variante A432T im Zelllysat (= Input) und auch in der GST-S5A Fraktion des Pulldowns erschienen sind. Ausserdem wurden die Banden vom Wildtyp wie auch von der Variante A432T quantifiziert. Pulld ow n PULLDOWN INPUT INPUT Die Existenz von TRPM4 WT und TRPM4 A43T sowohl im Zelllysat wie auch in der Pulldownfraktion von GST-S5A, erweist sich als starkes Indiz dafür, dass der Wildtyp und die Variante von TRPM4 ubiquitiniert sind. Zudem ist ersichtlich, dass die Diagramme von Input und Pulldown unterschiedlich aussehen. Im Input ist die verminderte Proteinexpression von TRPM4 A432T im Vergleich zum Wildtypen graphisch ersichtlich. Im Pulldown hat die Variante von TRPM4 jedoch eine erhöhte Expression. Dies bedeutet, dass ein grösserer Anteil von TRPM4 A432T ist ubiquitiniert im Vergleich zum Wildtyp. Daraus lässt sich schliessen, dass TRPM4 WT und TRPM4 A432T unterschiedlich ubiquitiniert sind. Eine Erklärung, wieso TRPM4 A432T stärker ubiquitiniert ist als der Wildtyp, könnte der ERAD pathway sein. Normalerweise ist ein t-Test mit einer Anzahl von drei Experimenten wenig aussagekräftig, trotzdem ist eine Tendenz der beiden Diagramme von Input und Pulldown erkennbar. Um dies zu bestätigen sind weitere Experimente erforderlich. 140 n.s. 120 100 80 60 40 100 80 60 40 20 20 0 * 120 fractio down lized Norma Normali zedpull pull ow d n fr actionn % tylated ofubiq uitylate dTRPM TRPM 44(%) of ubiqui 6. Diskussion Normali zedratio rati o input in putTRPM 4/inputactinactin (%) % Normalized TRPM4/input 140 n=3 n=3 TRPM4 WT TRP M4 WT TRPM4 A432T TRP M4 A432T 0 n=3 n=3 TRPM4 WT TRP M4 WT TRPM4 A432T TRP M4 A432T Abb.: Vergleich der Proteinexpression zwischen Input und Pulldown Sabine Naomi Nafzger BMA 10 - 13 Departement für Klinische Forschung, Universität Bern
