Möglichkeiten und Grenzen der IgG
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Möglichkeiten und Grenzen der IgG- Aviditätsbestimmungen am Beispiel der Diagnostik von Infektionen mit Cytomegalievirus, Toxoplasma gondii und Parvovirus B19 Was verbirgt sich hinter dem Begriff Avidität? Wozu kann man die Avidität in der Diagnostik nutzen? Testsysteme zur Bestimmung von Avidität Was können sie leisten? © MIKROGEN Avidität … …was genau ist das eigentlich ? Avidität (lat. avidus = begierig, gierig) Avidität definiert die Gesamt-Bindungsstärke, mit der eine Mischung von polyklonalen IgG-Molekülen an multiple antigene Epitope von Proteinen bindet. Zu unterscheiden ist die Avidität von der Affinität eines Antikörpers: Affinität ist die Stärke einer einzelnen Antigen-Antikörper-Bindung (ausgedrückt durch die Dissoziationskonstante) und die Avidität ist die Gesamtheit der Affinitäten. Die Avidität reift über mehrere Monate und spiegelt die Antigen-gesteuerte Selektion von B-Zellen wider, die IgG zunehmender Affinität produzieren. (Quellen: Prince 2014 und Wikipedia ) 3 . 28.04.2016 © MIKROGEN Avidität im Infektionsverlauf (Quelle: Prince 2014) 4 28.04.2016 © MIKROGEN Avidität … …was bringt sie uns für die Diagnostik? Wer kennt sie nicht, die diagnostischen Stolpersteine? - IgM-Negativität alleine schließt eine Infektion nicht mit Sicherheit aus (z.B. Komplexierung von Viruspartikeln mit spez. Antikörpern, z.B. IgMNonresponder) - IgM kann persistieren - IgM ggf. aufgrund von Kreuzreaktivitäten mit anderen Erregern falsch positiv - Kreuzreaktivität durch atypische Aktivität des Immunsystems im IgM (RF, Autoimmunerkrankung, Schwangerschaft) > d.h. niedriger Vorhersagewert von IgM - eine negative PCR schließt eine niedrige Viruslast nicht aus - der direkte Antigennachweis kann nicht zwischen primärer und rezidivierender Infektion unterscheiden > auch die PCR ist nicht immer aussagekräftig 5 28.04.2016 © MIKROGEN Avidität … …was bringt sie uns für die Diagnostik? Die Aviditätsbestimmung schließt die Lücken… IgG-Antikörper, die zu einem frühen Zeitpunkt nach einer Primärinfektion gebildet werden, zeigen niedrige Avidität, während Antikörper zu einem späteren Zeitpunkt nach der Infektion gebildet werden, zeigen hohe Avidität. Durch die Bestimmung der Avidität, kann der Infektionszeitpunkt einer Infektion eingegrenzt werden. Die Kenntnis des Infektionszeitpunktes ermöglicht eine Differenzierung in frische bzw. abgelaufene Infektion. Durch die Aviditätsbestimmung können unklare Screening-Ergebnisse geklärt werden. 6 28.04.2016 © MIKROGEN Parvovirus B19, CMV und Toxoplasma Avditätsbestimmung als wichtiges Tool in der Schwangerschaft Vertikale Übertragung viraler Infektionen und Krankheitsbild Insbesondere in der Schwangerschaftsdiagnostik kann die Eingrenzung des Infektionszeitpunktes von extrem wichtiger Bedeutung für die Therapieentscheidung und damit für das Ausmaß der gesundheitlichen Beeinträchtigung des Neugeborenen sein. Transmissionsrate 1. Trimenon schwere Sypmtomatik 2. Trimenon milde Symptomatik 3. Trimenon asymptomatisch Die Transmissionsrate ist am höchsten, wenn die Infektion in der Spätschwangerschaft erworben wird. 7 28.04.2016 Klinische Symptomatik © MIKROGEN Die Schwere der Erkrankung beim Kind ist am größten, wenn die mütterliche Infektion in der Frühschwangerschaft erworben wird. Avidität … wie können wir sie nachweisen? niedrig avides IgG, nicht jedoch hoch avides IgG, dissoziiert in Gegenwart von Stoffen mit leicht denaturierender Wirkung auf Proteine (wie z.B. Harnstoff, Kaliumthiocyanat, Guanidinchlorid) vom Antigen Quelle: HE Prince 2014 i.d.R. ELISA und Line-Immunoassay, auch IFT (CMIA, ELFA, CLIA, ECLIA) Mikrogen hält das Patent auf Aviditäts-Bestimmung mit dem Line-Immunoassay. 8 28.04.2016 © MIKROGEN Aviditätsteste bei Mikrogen (Mikrogen hält das Patent für Avidität auf Line- Immunoassays) Aviditäts-Antigene 9 28.04.2016 © MIKROGEN recomLine EBV IgG [Avidity] [IgA], IgM recomLine Toxoplasmose IgG [Avidity], IgM recomLine CMV IgG [Avidity], IgM recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidity], IgM recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidität] recomLine Toxoplasmosis IgG [Avidität]] recomLine CMV IgG [Avidität]] recomLine EBV IgG [Avidität]] Aviditätsbestimmung mit dem recomLine von Mikrogen Niedrig avide IgG AK = akute Infektion Hoch avide IgG AK = abgelaufene Infektion 10 28.04.2016 © MIKROGEN Parvovirus B19 – Klinik • Typisches Erythema infectiosum der Ringelröteln, in 20 % der Fälle asymptomatischer Verlauf oder Symptome eines grippalen Infektes; ggf. generalisierte Lymphknotenschwellung • Patienten, die bereits vor der Infektion mit Parvovirus B19 an einer Änamie leiden (z.B. Sichelzellanämie), haben ein erhöhtes Risiko für eine Aplastische Krise. • Infektionen in der Schwangerschaft - vor der 20. Schwangerschaftswoche - steigern das Risiko einer Fehlgeburt um ca. 5%. • Ca. 10 % der Hydrops fetalis-Fälle sind auf eine Parvovirus-Infektion in der Schwangerschaft zurückzuführen. • Seroprävalenz in Deutschland: Kinder 4-6 Jahre: 35%, Kinder 10-15 Jahre: 58%, Erwachsene 25-29 Jahre: 70% , Erwachsene 65-69 Jahre: 79% Rekombinante Parvovirus-Antigene – Grundlage unserer Mikrogen- Nachweissysteme Aviditätsantigene rekombinante VP2-Partikel • VP2-Partikel zeigen im Vergleich zum nativen Virus keine immunologischen Unterschiede • Die Detektion von Antikörper gegen Konformations-Epitope ist wichtiger Bestandteil einer verlässlichen Diagnostik in jeder Phase der Infektion 12 28.04.2016 © MIKROGEN Typischer Verlauf einer Parvovirus B19-Infektion 13 28.04.2016 © MIKROGEN recomLine Parvovirus B19 IgG, IgM [Avidität] Typischer Verlauf einer Parvovirus-Infektion 14 28.04.2016 © MIKROGEN Parvovirus-Diagnostik mit dem recomLine Parvovirus B19 VP-2p cutoff VP-1S VP-N VP-C NS-1 VP-2r IgG + Av. ++ ++ + n n ++ +/- + IgM + ++ VP-2p cutoff ++ + akute Infektion VP-2r VP-C NS-1 + IgG + +++ +++ +++ +++ ++ +/- high Av. + h h + IgM + + ++ + +/- recomWell Parvovirus IgG and IgM: positiv +/- VP-1S VP-N low + ++ Screening: + kurz zurückliegende Infektion Hohe Avidiät tritt frühestens 4 Wochen nach Infektion auf; eine Infektion innerhalb der letzten 4 Wochen kann ausgeschlossen werden. Screening: recomWell Parvovirus IgG and IgM: positiv 15 28.04.2016 © MIKROGEN Parvovirus-Diagnostik mit dem recomLine Parvovirus B19 VP-2p cutoff VP-1S VP-N VP-2r VP-C NS-1 + IgG + ++ +++ ++ high Av. + h h - IgM akute abgelaufene Infektion Infektion Screening recomWell IgG: positiv, IgM: negativ + VP-2p cutoff VP-N VP-1S VP-C VP-2r IgG + NS-1 + ++ - Av. + - IgM + abgelaufene Infektion Im recomLine, VP2p -AK können zur Diagnose einer abgelaufenen Infektion herangezogen werden. Screening recomWell IgG: positiv, IgM: negativ In ca. 10% der lang zurückliegenden Infektion mit Parvovirus B19 liegt isoliertes VP-2p vor. VP-2p ist daher unerlässlich für eine zuverlässige Diagnostik. 16 28.04.2016 © MIKROGEN Typischer Verlauf einer Parvovirus-Infektion 17 28.04.2016 © MIKROGEN Typische Parvovirus B19- Infektionsverläufe 18 28.04.2016 © MIKROGEN Phasen-spezifische Antigene in Kombination mit (der von Mikrogen auf dem Line-Assay patentierten) Aviditäts-Bestimmung erlauben eine Charakterisierung des Infektionsstatus einer Parvovirus B19 -Infektion und eine präzise Aussage über den Zeitpunkt der Infektion Unklare Screening-Ergebnisse können durch den recomLine Parvovirus B19 genauer charakterisiert und geklärt werden. einziger verfügbarer Aviditätstest für Parvovirus B19 Infektionen Parvovirus B19- Infektionen innerhalb der letzten 4 Wochen können mit der Aviditätstestung im recomLine Parvovirus B19 zuverlässig ausgeschlossen werden. 19 28.04.2016 © MIKROGEN recomLine Parvovirus B19 IgG [Avidity], IgM recomLine Parvovirus b19 IgG [Avidität], IgM [IgA] Toxoplasmose in der Schwangerschaft Durchseuchung im gebärfähigen Alter: 20 Jahre 30 Jahre 40Jahre ~ 32% ~ 48% ~ 32% Konnatale Toxoplasmose: Ø 18 Fälle pro Jahr (Germany 2001-2010; BfR) 5-14% mit schwerer systemischer Erkrankung 86-95% subklinisch infiziert, postenzephalitische Symptome, irreparable Spätschäden ↔ bislang kein obligatorisches Screening Retinochoroiditis vernarbt 20 28.04.2016 © MIKROGEN Kongenitale Toxoplasmose Toxo-Zyste in Muskelgewebe Hydrocephalus Stufendiagnostik Toxoplasma-Antikörper-Suchtest z.B. IgG-Screening EIA, IFT positiv negativ IgM-Antikörper Wiederholung des Suchtestes während der Schwangerschaft alle 8-12 Wo. z.B. EIA, ISAGA positiv negativ V.a. inaktive Infektion (latent) Bewertung der Antikörperkonzentrationen IgG niedrig IgG hoch IgG hoch IgG niedrig IgM niedrig IgM niedrig IgM hoch IgM hoch Inaktive Infektion Abklingende Infektion Aktive Infektion Akute Infektion Bestätigungsdiagnostik Aviditätsbestimmung z.B. EIA, Immunoblot z.B. EIA = Summenavidität z.B. Immunoblot = Antigenspezifische Avidität Bestimmung des Infektionszeitpunktes 21 28.04.2016 ? Titeranstieg ? IgM low responder ? persistierendes IgM © MIKROGEN recomLine Toxoplasma: der Streifen IgG [Avidität] und IgM [IgA] IgG Antigene Inkubation Kontrolle IgG IgM Antigene Konjugate- IgM kontrolle IgA IgG Aviditäts-Antigene Cut off Kontrolle Intensität der Banden in Relation zur Cut off-Bande Bande Intensität ROP1c MIC3 GRA7 GRA8 p30 MAG1 GRA1 rSAG1 22 28.04.2016 © MIKROGEN Keine Reaktion - Intensität schwächer als Cut off +/- Intensität entspricht Cut off 1+ Intensität stärker als Cut off 2+ Intensität sehr stark 3+ recomLine Toxo IgG und Avidität Für die Bestimmung der Avidität werden 2 Teststreifen benötigt. Die Testdurchführung IgG und Avidität MUSS im gleichen Ansatz erfolgen. IgG Aviditätsstreifen IgG Streifen Inkubationkontrolle Inkubationkontrolle Konjugatekontrolle IgG IgG IgM IgM kontrolle IgA IgA Cut offkontrolle Cut offKontrolle ROP1c MIC3 GRA7 GRA8 p30 24 28.04.2016 Konjugate- ROP1c Vergleich der Reaktionsintensität der korrespondierenden Bande MIC3 GRA7 GRA8 p30 MAG1 MAG1 GRA1 GRA1 rSAG1 rSAG1 © MIKROGEN recomline Toxoplasma: Infektionsverlauf 25 28.04.2016 © MIKROGEN Aviditätsstudie: BioMerieux versus MIKROGEN 26 28.04.2016 © MIKROGEN 27 28.04.2016 © MIKROGEN 28 28.04.2016 © MIKROGEN recomLine Toxoplasma IgG [Avidität], IgM [IgA] Unklare Screening-Ergebnisse können durch den recomLine Toxoplasma genauer charakterisiert und geklärt werden. Der recomLine Toxoplasma Aviditätstest kann dem Lysat-Aviditätstest in vielen Fällen überlegen sein. Phasen-spezifische Antigene in Kombination mit (der von Mikrogen auf dem Line-Assay patentierten) Aviditäts-Bestimmung erlauben eine Charakterisierung des Infektionsstatus einer Toxoplasmose-Infektion und eine präzise Aussage über den Zeitpunkt der Infektion Schwangerschafts-relevante Infektionen können zuverlässig identifiziert werden. 29 28.04.2016 © MIKROGEN recomBlot CMV recomLine CMV IgG [Avidität], IgM [IgA] Bestätigung und Bestimmung des Infektionszeitpunktes AWMF- Labordiagnostik schwangerschaftsrelevanter Virusinfektionen (Prof. Modrow) - CMV-Diagnostik Screening (IgG) bei allen Schwangeren empfohlen; bei Frauen mit Exposition mit Kindern bis zum 3. Lebensjahr soll kompletter Serostatus erhoben werden (IgG und IgM); im Falle eines positiven IgM ist die Aviditätsbestimmung indiziert. Empfehlung zur Diagnose einer Primärinfektion: Nachweis einer CMV-IgG-Serokonversion; Nachweis niedriger Avidität in Kombination mit hoch positivem IgM; Fehlen von gB- IgG mittels Immunoblot in Kombination mit niedriger Avidität 30 28.04.2016 © MIKROGEN CMV in der Schwangerschaft Mütterliche CMV-Infektion in der Schwangerschaft (meist asymptomatisch) Primärinfektion Reaktivierung in ca. 1% aller Schwangeren I 30 - 40% geringes Risiko (ca. 1%) Infektion des Feten (0,5 - 1% aller Neugeborenen kommen mit einer intrauterin erworbenen CMV-Infektion auf die Welt) 10-15 % symptomatisch bei Geburt (intrauterine Wachstumsretardierung, Mikrozephalie, intrazerebrale Verkalkung, Hepatitis, Hepatosplenomegalie, Thrombpzytopenie) 5 -10 % zunächst asymptomatisch, später ggf. einseitiger Hörverlust, sensorineurale Schwerhörigkeit, Entwicklungsrückstand) (Quelle: Medizinische Virologie, Hans w. Doerr und Wolfram H. Gerlich , 2. Auflage 2010) 31 28.04.2016 © MIKROGEN alle übrigen gesund trotzdem oft langanhaltende Virusausscheidung CMV in der Schwangerschaft - Labordiagnostik Bestimmung des Immunstatus Analyse von IgG/IgM und IgG-Avidität IgG neg / IgM neg seronegativ Risiko der CMV-Inf. IgG pos /IgM neg CMV IgG-Avi. hoch abgelaufene Infektion (Latenz) IgG pos / IgM pos CMV IgG-Avi. hoch persist. IgM oder rekurrierende Infekt. IgG pos /IgM pos CMV IgG-Avi niedrig Primärinfektion Bestätigungstest Immunoblot anti-gB-IgG neg CMV-IgM pos niedrige Avidität Primärinfektion Folgeserum bei Fieber, auffälligem Altraschall etc. IgG neg / IgM neg or IgM pos CMV Serokonversion CMV Primärinfektion IgG neg / IgM pos Verdacht auf Primärinfektion Folgesereum Nach 10 Tagen IgG pos /IgM pos Primärinfektion Folgeserum nach 10 Tagen Bei Kontakt mit Kindern unter 3 Jahren Hiegiene-Anweisungen keine weiteren Schritte nötig In der 21 SS-Woche: Pränatale Diagnostik Analyse auf CMV DNA Im Fruchtwasser IgG neg / IgM pos (IgM falsch pos) keine Infektion Risiko der CMV-Inf. Labordiagnostik schwangerschaftsrelevanter Virusinfektionen , Sk2 Leitlinie 2014 32 28.04.2016 © MIKROGEN recomLine CMV - Auswertung anhand eines Punkteschemas 33 28.04.2016 Antigen IgG IgM IE1 1 1 CM2 5 3 p150 6 p65 Summe der TestPunkte ergebnis IgG IgM 4 1 2 negativ 1 2 2-5 3 fraglich gB1 1 1 gB2 1 1 6 4 positiv © MIKROGEN recomLine CMV Bewertung der Avidität p150 IE1 CM2 gB2 Interpretation (I) Verdacht auf Anitkörper mit hoher Avidität im p150 und Infektion zusätzlich Antikörper mit hoher Avidität gegenüber einem weiteren Aviditäts-Antigen > 12 Wochen (II) Nicht (I) Verdacht auf aber Antikörper mit niedriger Avidität Infektion gegenüber mindestens 2 Aviditäts-Antigenen < 14 Wochen (III) Nicht (I) und nicht (II). Intermediäre Avidität für einzelne AviditätsAntigene oder IgG-Titer für eine Bewertung zu niedrig keine weitere Aussage durch Aviditätstestung Aviditätsantigene 34 28.04.2016 © MIKROGEN Akute Infektion (< 6-8 Wochen) IgGIgMKontrolle Kontrolle Kontrolle CutoffReakt. Kontr. IE1 CM2 p150 p65 gB1 gB2 recomLine CMV Patient st2 IgG IgG : IgM 20 19 35 positiv, 7 Punkte Avidität: niedrig IgM: positiv, 8 Punkte Av 1 IgG IgG : Av Avidität: - IgM IgM: positiv, 8 Punkte IgG IgG : positiv, 7 Punkte Av Avidität: niedrig IgM IgM: 28.04.2016 © MIKROGEN IgM Avidität (Medac) (Vidas) niedrig + (< 0, 25) positiv, 6 Punkte positiv, 7 Punkte nd, IgG Titer zu niedrig + niedrig + (0,19) Abgelaufene Infektion (> 12 Wochen, > 24 Wochen) IgGIgMKontrolle Kontrolle Kontrolle CutoffReakt. Kontr. IE1 CM2 p150 p65 gB1 gB2 Avidität (Vidas) recomLine CMV st1/25 IgG IgG : Av Avidität hoch ( CM2, p150, gB2) > 12 Wochen st1/93 negativ IgG IgG : positiv, 9 Punkte > 6-8 Wochen Av Avidität: hoch (IE1, p150, gB2) > 12 Wochen IgM IgM: IgG : IgG st1/96 Av positiv, 15 Punkte > 6-8 Wochen IgM IgM: negativ IgG IgG : positiv, 7 Punkte > 24 Wochen Av Avidität: - IgM: IgM 28.04.2016 © MIKROGEN bordeline/hoch (0,65) borderline (0,57) negativ Avidität: hoch (p150, gB2) > 12 Wochen st1/27 36 positiv, 14 Punkte >6-8 Wochen IgM: IgM <0,4 low 0,4 -0,65 borderline >0,65 high negativ borderline (0,59) hoch (0,76) CMV - Infektionsverlauf IgGIgMKontrolle Kontrolle Kontrolle CutoffReakt. Kontr. IE1 CM2 p150 Patient 13 IgG p65 gB1 gB2 IgM IgG erste Abnahme, Verdacht auf akute Infektion Verdacht auf Infektion < 6-8 Wochen Av IgM IgG 8,4 Wochen nach der ersten Abnahme Verdacht auf Infektion < 14 Wochen Av IgM IgG 26,3 Wochen nach der ersten Abnahme Verdacht auf Infektion > 12 Wochen Av IgM 37 28.04.2016 © MIKROGEN Leistungsdaten recomLine CMV 38 28.04.2016 © MIKROGEN Leistungsdaten recomLine CMV 39 28.04.2016 © MIKROGEN Einzig verfügbarer auf rekombinanten Antigenen basierender Immunoblot zur zur Bestätigung unklarer CMV-ScreeningErgebnisse Phasen-spezifische Antigene in Kombination mit (der von Mikrogen auf dem Line-Assay patentierten) Aviditäts-Bestimmung erlauben eine präzise Charakterisierung des Infektionsstatus einer CMV-Infektion Schwangerschafts-relevante Infektionen können zuverlässig identifiziert werden. 40 28.04.2016 © MIKROGEN 41 28.04.2016 © MIKROGEN Möglichkeiten und Grenzen der IgG- Aviditätsbestimmung Nicht alle Antigene eignen sich für die Bestimmung der Avidität. Bei sehr lange abgelaufenen Infektionen kann die IgG-Antwort (durch fehlende Boosterung) sehr niedrig und für die Avidiätstestung nicht ausreichend sein. Bisher keine Standardisierung in den unterschiedlichen Aviditätstests unterschiedlicher Hersteller. Die Avditätsbestimmung unterstützt Sie bei der Optimierung Ihrer Diagnostik: Sichere Differenzierung zwischen akuter und abgelaufener Infektion Weiterführende Methode bei unklaren Screeningergebnissen im Zuge der Stufendiagnostik Für die Schwangerschaftsdiagnostik unerlässliche Nachweismethode zur Identifizierung akuter, maternaler Infektionen – wichtig für Therapieentscheidung und Verringerung neonataler Komplikationen und Spätschäden beim Kind 42 28.04.2016 © MIKROGEN 43 28.04.2016 © MIKROGEN
