Kopplung von IL-2 an Tumorzellen - Ruhr

Aus dem Lehrstuhl für Medizinische Mikrobiologie und Immunologie
der Ruhr-Universität Bochum
Lehrstuhlinhaber: Prof. Dr. W. Opferkuch
Kopplung von IL-2 an Tumorzellen
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Ingvild Birschmann
aus Itzehoe/Holstein
1999
Abstract
Birschmann
Ingvild
Kopplung von IL-2 an Tumorzellen
Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, zu untersuchen, ob rekombinantes humanes
Interleukin-2 mittels heterobifunktioneller Linker an Tumorzellen gebunden werden
kann. Dazu sollte rekombinantes Interleukin-2 sowohl kovalent über Thioether- bzw.
Disulfidbindung als auch durch Adhäsion über das Lektin ConcanavalinA an Zellen
gekoppelt werden. In Vorversuchen diente FITC als Modellsubstanz für IL-2.
Die verschiedenen Kopplungsansätze wurden durch Gelfiltration fraktioniert und zu
Zellkulturen der Myelomzellinie X63Ag8.653 gegeben. Die so modifizierten Zellen
wurden fluoreszenzmikroskopisch und im FACscan auf die Kopplungsrate untersucht.
Außerdem wurde überprüft, wie lange die auf verschiedene Weise eingeführten FITCMoleküle auf der Zelloberfläche nachweisbar waren. Die Menge des biologisch aktiven
IL-2, das mittels MHS an die SAMBA modifizierten Zellen gekoppelt worden war, wurde
im CTLL-2 - Proliferationstest nachgewiesen. Einer der Kopplungsansätze (IL-2 /
SPDP) wurde durch SDS-PAGE auf das Vorliegen von Polymeren untersucht.
Die fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen zeigten, daß sowohl die kovalente
Kopplung als auch die Kopplung über Adhäsion in den Ansätzen mit SAMBA als eine
der beiden Linkersubstanzen möglich war. Mit Hilfe des FACScans konnten bei kovalenter Kopplung zehnfach höhere mittlere Fluoreszenzintensitäten gemessenen
werden. In der SDS-PAGE zeigte sich, daß bei Verwendung von SPDP als Linkersubstanz IL-2 - Trimere und Tetramere entstehen. Im CTLL - Test konnte für das über
MHS und SAMBA an die Zellen gekopplten IL-2 eine kontinuierliche Abnahme nachgewiesen werden.
Die Ergebnisse zeigen, daß eine Kopplung von IL-2 mit verschiedenen Linkern an
Myelomzellen möglich ist. Außerdem sprechen die Ergebnisse der Untersuchungen
mittels FACScan für eine höhere Kopplungsrate bei Verwendung von kovalenten
Linkern. Die stetige Abnahme von IL-2 im CTLL-Test deutet auf eine kontinuierliche
Abgabe von IL-2 durch die gekoppelten Zellen hin.
Die nachgewiesenen Trimere und Tetramere des IL-2 und die kontinuierliche Abgabe
von IL-2 könnnen einen möglichen neuen Therapieansatz von Tumorerkrankungen im
Rahmen der ASI-Therapie darstellen.
1
Dekan: Prof. Dr. Gert Muhr
Referent: Prof. Dr. F.W. Falkenberg
Koreferent: Prof. Dr. W.-H. Kunau
Tag der mündlichen Prüfung: 5.12.2000
2
Inhaltsverzeichnis
_______________________________________________________________
Inhaltsverzeichnis
3
Abkürzungsverzeichnis
6
1. EINLEITUNG
8
1.1 Tumorimmunologische Grundlagen
8
1.2 IL-2
12
1.3 Immuntherapeutische Ansätze
14
1.3.1 Monoklonale Antikörper und antigenbindende Fragmente
14
1.3.2 Zytokine
15
1.3.3 Adoptive Immuntherapie
15
1.3.4 Aktive spezifische Immuntherapie
18
1.3.5 Problematik der immuntherapeutischen Ansätze
22
1.4. Zielsetzung
27
2. METHODIK
28
2.1 Material
28
2.1.1 Chemikalien
28
2.1.2 Verbrauchsmaterial
29
2.1.3 Geräte
29
2.1.4 Materialien für die Säulenchromatographie
29
2.1.5 Zellkulturmedien und Zellstämme
30
2.1.6 Lösungen und Puffer
31
2.2 Methoden
33
2.2.1 Arbeiten mit Zellkulturen
33
2.2.1.1 Kultivierung von Tumorzellen
33
2.2.1.2 Bestimmung von Zellzahlen
33
2.2.1.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen
33
2.2.2 Fluoreszein-Markierung von OVA mit Hilfe von
Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) und Tetramethylrhodamine B
Isothiocyanat (TRITC)
34
2.2.3 Bestimmung der Proteinkonzentration von Lösungen
fluoreszein modifizierter Proteine
2.2.4 Konzentrierung proteinhaltiger Lösungen
34
35
3
Inhaltsverzeichnis
_______________________________________________________________
2.2.5 Herstellung von Proteinkonjugaten
36
2.2.5.1 Einführung und Aktivierung von SH-Grupen in Proteine
unter Verwendung von SAMBA
37
2.2.5.2 Einführung und Aktivierung von 2-Pyridyldisulfidgruppen
in Proteine unter Verwendung von SPDP
38
2.2.5.3 Einführung und Aktivierung von Maleimid-Gruppen in
Proteine mit Hilfe von MHS
39
2.2.5.4 Gerichtete Synthese von Heterokonjugaten
41
2.2.5.4.1 Einführung von Heterokonjugaten direkt an Zellen
42
2.2.5.4.2 Einführung von Heterokonjugaten an Zellen mittels ConA
43
2.2.6 Gelfiltrations-Säulenchromatographie
43
2.2.7 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese zur Auftrennung von
Proteinen
44
2.2.8 Färben von Polyacrylamid-Gelen
45
2.2.9 CTLL-2-Proliferationstest
46
2.2.10 Arbeiten am FACScan
47
3. ERGEBNISSE
48
3.1 Einführung reaktiver Gruppen in Proteine
49
3.1.1 Modifizierung von OVA mit FITC bzw. TRITC
49
3.1.2 Modifizierung von OVA-FITC (bzw.IL-2) mit MHS
49
3.1.3 Modifizierung von OVA-FITC mit SPDP
51
3.1.4 Modifizierung von ConA mit SAMBA
51
3.2 Untersuchungen zur Kopplung von Protein an Tumorzelllen
52
3.2.1 Kovalente Kopplung von modifiziertem OVA-FITC an
reaktive Zellen
52
3.2.1.1 Kopplung von MHS-modifiziertem OVA-FITC an mittels
SAMBA aktivierte Zellen
53
3.2.1.1.1 Auswirkung der MHS-Konzentration auf die Kopplung von
MHS behandeltem OVA-FITC an SH-Gruppen-tragende Zellen
54
3.2.1.1.2 Auswirkung der SAMBA-Konzentration auf die Kopplung von
MHS-behandeltem OVA-FITC an SH-Gruppen-tragende Zellen
54
4
Inhaltsverzeichnis
_______________________________________________________________
3.2.1.1.3 Kopplung von Maleimid-Gruppen-tragendem
OVA-TRITC an SH-Gruppen-tragende Zellen
56
3.2.1.2 Kopplung von SPDP-modifiziertem OVA-FITC
an mittels SAMBA aktivierte Zellen
56
3.2.2 Kopplung von ConA an OVA-FITC über verschiedene
heterobifunktionelle Linker und Adhäsion an Zellen
57
3.2.2.1 SAMBA-ConA / OVA-FITC - MHS an Zellen
58
3.2.2.2 SAMBA-ConA / OVA-FITC - SPDP an Zellen
60
3.2.3 Untersuchung verschiedener Kopplungsprodukte von
OVA-FITC an Zellen mit Hilfe des FACScans
3.3. Untersuchungen zu Kopplung von IL-2 an Tumorzelllen
61
62
3.3.1 Reaktion von MHS mit IL-2 und Kopplung an
SAMBA-behandelte Zellen
62
3.3.1.1 Bestimmung der IL-2 - Konzentration
63
3.3.2 Reaktion von SPDP mit IL-2
64
3.3.2.1 Untersuchung der IL-2 - SPDP-Kopplungsprodukte
mittels SDS-PAGE
65
4. DISKUSSION
67
5. LITERATUR
79
Danksagung
92
Lebenslauf
93
5
Abkürzungsverzeichnis
_______________________________________________________________
ABKÜRZUNGVERZEICHNIS
APC
Antigen-präsentierende Zelle
APS
Ammoniumpersulfat
BSA
Rinder-Serumalbumin
ConA
Concanavalin A
CTL
zytotoxische T-Lymphozyten (Tc-Zellen)
DMEM
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium
DMF
Dimethylformamid
DMSO
Dimethylsulfoxid
EDTA
Ethylendiamin-tetraessigsäure
FCS
fötales Kälberserum
FITC
Fluoresceinisothioxyanat
HEPES
2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazino]ethansulfonsäure
IL-1
Interleukin-1
IL-2
Interleukin-2
kDa
Kilodalton
LAK
Lymphokin-aktivierte Killerzelle
MHC
Haupthisokompatibilitätskomplex
MHS
Maleimido-hexanoyl-N-hydroxysuccinimidester
MTT
3-(4,5-Dimethylthiazo-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid
NHS
N-Hydrosysuccinimid
NK-Zelle
Natürliche Killer-Zelle
OVA
Ovalbumin
PBS
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
rhIL-2
rekombinantes humanes Interleukin-2
RPMI 1640
Rosewell Park Memorial Institute Medium 1640
SAMBA
S-Acetylmerkaptobernsteinsäureanhydrid
SDS
Natriumdodecylsulfat
SPDP
Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat
TC-Zelle
Zytotoxische T-Zelle
TH-Zelle
T-Helferzelle
TIL
Tumor-infiltrierender Lymphozyt
6
Abkürzungsverzeichnis
_______________________________________________________________
Tris
Tris(hydroxymethyl)aminomethan
TRITC
Tetramethylrhodamine B Isothiocyanat
7
1.Einleitung
_______________________________________________________________
1 EINLEITUNG
1.1 Tumorimmunologische Grundlagen
Zu den bedeutendsten Fortschritten der modernen Medizin gehören die in der
Vorbeugung und Behandlung übertragbarer Krankheiten. Die Pocken sind
heute vollständig ausgerottet, und Ende dieses Jahrhunderts dürften - konsequente Impfungen vorausgesetzt - auch Kinderlähmung und Masern kein Problem mehr sein.
So erfolgreich verlief die Bekämpfung von Infektionskrankheiten in den industrialisierten Ländern, daß sie dort - bis zur gegenwärtigen AIDS-Pandemie nicht mehr unter den vordringlichsten nationalen Aufgaben rangierte.
Solche geradezu triumphalen Verbesserungen der Volksgesundheit würden
allein schon gewaltige Forschungsbemühungen zum Verständnis des menschlichen Immunsystems rechtfertigen. Doch in der Immunologie geht es um mehr
als nur um Art und Prävention von Infektionen. Sie weist auch neue Wege in
der Bekämpfung von malignen Tumoren.
Die ersten wissenschaftlich-theoretischen Ansätze zur Tumorimmunologie wurden um die Jahrhundertwende entwickelt. Schon Paul Ehrlich nahm an, daß es
- ähnlich wie bei Infektionskrankheiten - möglich sei, eine Impfung zur Verhütung der Entstehung von Geschwülsten durchzuführen. Er postulierte die
Existenz von immunologischen Mechanismen, sogenannten „Zauberkugeln“,
die in einer Art Schlüssel-Schloß-Prinzip mit Oberflächenstrukturen der Tumorzellen reagieren und so zur Abtötung von Tumorzellen führen könnten. Die
später entdeckten Antikörper bestätigten das Postulat Ehrlichs (Ehrlich, 1957).
Zur gleichen Zeit begann Cooley, Krebspatienten mit bakteriellen Toxinen zu
behandeln. Obwohl die Erfolge dieser Therapie gering waren, konnte dennoch
gezeigt werden, daß sich die körpereigene Abwehr gegen Krebs dadurch steigern ließ (Hellström et al., 1992).
Hinweise für das Vorliegen einer natürlichen Immunabwehr bieten Spontanremissionen von Primärtumoren oder von Metastasen nach Entfernung eines Pri8
1.Einleitung
_______________________________________________________________
märtumors, die - im Vergleich zur Tumorzellabschwemmung in Blut und
Lymphe - seltenen Metastasierungen sowie verhältnismäßig lang lokal begrenzte Tumorerkrankungen ohne regionale oder systemische Aussaat.
Um die Mechanismen dieser Immunabwehr gegen Tumore zu verstehen, wurden schon frühzeitig an Tieren Transplantationen von Tumoren durchgeführt.
Diese führten zu einer Immunantwort, die nach Entfernung des Primärtumors in
der Abstoßung retransplantierter Zellen des orginären Tumors resultierte
(Gross 1943; Prehn et al., 1957; Klein et al., 1960). Ebenso konnte gezeigt werden, daß syngen transplantierte Tumorzellen in Empfängertieren, die zuvor mit
devitalisierten Tumorzellen des gleichen Typs immunisiert worden waren, nicht
zu einem Tumor auswuchsen (Boon et al., 1992). Aufgrund dieser Ergebnisse
nahm man an, daß die verwendeten Tumorzellen spezifische Antigene auf ihrer
Zelloberfläche tragen. Somit erkennt das Immunsystem diese als fremd und
eliminiert sie.
In der Arbeitsgruppe von Basombrio konnte im Experiment nachgewiesen werden, daß die Antigene von Tumorzellen eines durch Kanzerogene induzierten
Tumors einzigartig sind (Basombrio 1970). Eine tumorinduzierte Immunität
schützt die Versuchstiere immer nur vor dem Wachstum der zur Immunisierung
eingesetzten Tumorzelle, eine immunologische Kreuzreaktivität zwischen den
Zellen der unterschiedlichen durch Kanzerogene induzierten Tumoren bestand
nicht.
Burnet (Burnet et al., 1970) stellte in den siebziger Jahren die „Immunüberwachungs-Hypothese“ auf, die besagt, daß es die Aufgabe von im Organismus
zirkulierenden T-Lymphozyten ist, neoplastische Zellen zu erkennen und abzutöten. Er impliziert damit das Vorhandensein von tumorspezifischen Antigenen
auf der Oberfläche von „spontan“ entarteten Zellen.
In den Folgejahren konnte die zentrale Bedeutung der T-Lymphozyten bei der
Bekämpfung neoplastischer Zellen in in vitro - Experimenten bestätigt werden
(Hewitt et al., 1976; Kedar et al., 1977). Daß die T-Lymphozyten auch in vivo für
die Entstehung tumorspezifischer Immunreaktionen verantwortlich sind, ist eine
heute allgemein akzeptierte Hypothese.
9
1.Einleitung
_______________________________________________________________
Voraussetzung jeder Immuntherapie oder Prophylaxe gegen Krebs ist das Vorhandensein von Tumorantigenen auf der Oberfläche entarteter Zellen sowie der
Fähigkeit des Organismus, gegen diese Antigene immunologisch reagieren
zu können. Die Erkennung und anschließende Zerstörung von Tumorzellen
durch das Immunsystem ist ein komplexer Vorgang. Bei diesem Vorgang sind
zwei Typen von Lymphozyten - T-Helferzellen und zytotoxische T-Zellen - beteiligt. Nur die Aktivierung beider Zelltypen und das Wechselspiel zwischen
ihnen gewährt eine optimale Immunabwehr:
Abb. 1: Schematische Darstellung der Vorgänge, die zur Generierung einer T-Zell-vermittelten
Anti-Tumor-Antwort führen (verändert nach Benjamini und Leskowitz, 1991)
Abkürzungen: APC: Antigen-präsentierende Zelle; CD3, CD4, CD8: akzessorische Moleküle; IL1 Interleukin-1; IL-2: Interleukin-2; IL-2-R: Interleukin-2-Rezeptor; TC: zytotoxische T-Zelle(=
CTL); TCR: T-Zell-Rezeptor-Komplex; TH: T-Helferzelle
Tumorzellen, aber auch somatische Zellen präsentieren auf ihrer Zelloberfläche
Fragmente cytosolischer Proteine. Diese Fragmente sind assoziiert mit einem
Komplex aus transmembranen Proteinkomponenten des Haupthistokompatibili-
10
1.Einleitung
_______________________________________________________________
tätskomlexes der Klasse I (MHCI). Wird von einer Tumorzelle ein Fragment
präsentiert, das sich von den normalen Komponenten der Zelle unterscheidet
und folglich antigene Eigenschaften besitzt, können für das präsentierte Antigen
spezifische zytotoxische T-Lymphozyten (CTL-Zellen) diese Zelle erkennen und
sie eliminieren. Die Erkennung erfolgt über den T-Zell-Rezeptorkomplex auf der
Oberfläche des Lymphozyten (Zinkernagel et al., 1975). In einem nächsten
Schritt kommt es zur Expression von Interleukin-2-Rezeptoren (IL-2-R) auf der
CTL-Zelle durch die Bindung zwischen der antigenpräsentierenden Zelle und
dem T-Lymphozyten. Die Internalisierung von rezeptorgebundenem IL-2 löst die
Proliferation der CTL-Zelle und ihre Differenzierung zu einer Effektorzelle aus.
Ziel dieser Kaskade ist die massive Vermehrung von tumorantigenspezifischen
CTL-Lymphozyten, die in der Lage sind, die Tumorzellen gezielt abzutöten.
Eine besondere Bedeutung innerhalb dieser Abfolge kommt dem Zytokin Interleukin-2 (IL-2) zu. Es wird von T-Helferlymphozyten (TH-Zellen) freigesetzt, die
durch das Erkennen von Fremdantigenen,also auch von Tumorantigen aktiviert
wurden (s.1.2). Der Aktivierungsprozess von TH-Zellen unterscheidet sich von
dem der CTL-Zellen. Ein wichtiger Partner dieser TH-Zellen sind die sogenannten Antigen-präsentierenden Zellen (APC). Diese sind darauf spezialisiert,
anderen Zellen des Immunsystems Fremdantigene zu präsentieren. So nehmen
sie auch Proteine auf, die von den Tumorzellen freigesetzt wurden,
prozessieren sie und exponieren Fragmente dieser Tumorantigene in Verbindung mit Proteinkomponenten der Klasse II des MHC auf ihrer Zelloberfläche.
Das so präsentierte Tumorantigen wird von den entsprechenden TH-Zellen über
deren T-Zell-Rezeptorkomplex erkannt. Die APC sezernieren Interleukin-1 (IL1), das neben der Antigenerkennung das zweite, für die tumorantigenspezifische TH-Zelle notwendige Aktivierungssignal ist (Cohen et al., 1987). Die Aktivierung führt zur temporär limitierten Sekretion von IL-2 durch die TH-Zelle.
Die Kenntnis dieser Abfolge führte zu ersten therapeutischen Ansätzen: Durch
die Gabe von IL-2 kann im Patienten unter Umgehung der Kaskade vom Antigen über das APC die Proliferation von CTL-Zellen ausgelöst werden (Fearon
et al., 1990).
11
1.Einleitung
_______________________________________________________________
1.2 Interleukin-2
Dem Zytokin Interleukin-2 (IL-2) kommt bei der Entwicklung einer durch T-Lymphozyten vermittelten Immunantwort eine wichtige Bedeutung zu. Seine Freisetzung führt zur Proliferation und zur Differenzierung der betroffenen T-Lymphozyten (s.1.1). IL-2 konnte zuerst aus dem Überstand von T-LymphozytenKulturen gewonnen werden, deren Zellen zuvor unspezifisch mit einem Mitogen
stimuliert worden waren (Morgan et al., 1976). Bei diesem nativen IL-2 handelt
es sich um ein Glykoprotein mit einem apparenten Molekulargewicht von 15 18 kDa (Gillis et al., 1982). Die Varianz im Molekulargewicht ist eine Folge des
unterschiedlichen Glykosilierungsgrades des Proteins (Robb et al., 1983).
Rekombinantes humanes Interleukin-2 (rhIL-2) ist nicht glykosiliert und besteht
aus 153 Aminosäureresten.
Die Arbeitsgruppe um Rosenberg untersuchte die Funktion der Zuckerreste
bezüglich der Entfaltung der biologischen Aktivität des IL-2. Es konnte experimentell nachgewiesen werden, daß das rekombinante IL-2 die gleiche biologische Aktivität besitzt wie das native Zytokin (Rosenberg et al., 1984). Seit einiger Zeit wird die Frage nach der Wirkung der Glykosilierung erneut kontrovers
diskutiert; fundierte Versuchsergebnisse, die die Befunde von Rosenberg
widerlegen oder einschränken, liegen jedoch zur Zeit noch nicht vor.
IL-2 wirkt als vielseitiger Mediator innerhalb des Immunsystems. Zu den verschiedenen Zielzellen zählen, wie bereits zuvor beschrieben, alle T-Lymphozyten-Unterklassen, aber auch B-Lymphozyten, Lymphokin-aktivierte Killerzellen, natürliche Killerzellen, Monozyten, Makrophagen und Oligodendrozyten
(Smith, 1988; Thompson, 1994). Außerdem wirkt es als Neuromodulator und
Wachstumsregulator von Gliazellen (Nistico et al., 1993; 1991; Arzt et al., 1993;
Benveniste et al., 1986). Darüber hinaus induziert IL-2 eine Zytokinkaskade, in
der verschiedene andere Interleukine (u.a. IL-1α und β), Interferone (IFN) und
die Tumornekrosefaktoren α und β (TNFα und β), involviert sind (Kovacs et al.,
1989).
12
1.Einleitung
_______________________________________________________________
Durch seine stimulierende Wirkung auf eine Vielzahl von Zellen des Immunsystems und die gute Verfügbarkeit des rekombinanten humanen IL-2 fand und
findet das Zytokin breite Anwendung in modernen Tumortherapieformen und in
Experimenten, mit denen Alternativen oder unterstützende Therapien zur
klassischen Behandlung von malignen Erkrankungen untersucht werden. Die
Anwendung umfaßt sowohl die alleinige systemische Verabreichung von IL-2 in
Tumortherapie-Ansätzen als auch in adoptiven Immuntherapien. Hierbei werden unterschiedliche Zellen des Immunsystems auf ihre Aktivierbarkeit gegen
Tumorzellen und die damit verbundene Antitumorwirkung untersucht (s. 1.4.3).
Als problematisch erweist sich gerade in diesem Zusammenhang die systematische Gabe von IL-2 in hohen Dosen. RhIL-2 führt zu schweren Nebenwirkungen, z.B. Vasodilatation, Fieber, Herzrhythmusstörungen, Koma, usw.
Interessante Ansätze ergeben sich für die Tumorimmunologie aus den neueren
Forschungsergebnissen über den IL-2 - Rezeptor (IL-2R) (Lord et al., 1998).
Die Bedeutung des Rezeptors stellt sich bei Untersuchungen an Knockout Mäusen heraus. Während der Ausfall des IL-2 nicht essentiell für die T-ZellEntwicklung ist (Schorle et al., 1991), konnte gezeigt werden, daß der Verlust
des IL-2Rγ zu schweren Ausfällen bei der Entwicklung führt.
Das IL-2R - System gehört zur Klasse IA der Zytokinrezeptoren und besteht aus
drei Polypeptidketten (α, β, γ), von denen die Bildung eines Heterodimers aus
den Untereinheiten β und γ verantwortlich für die IL-2 Signaltransduktion zu
sein scheint (Takeshita et al., 1992, Taniguchi and Minami 1993). Von der αUntereinheit wird vermutet, daß sie zur Verstärkung der Bindung zwischen dem
Liganden und dem Rezeptor führt. Durch Induktion der Synthese des IL-2R
(u.a. durch IL-2, IL-4 oder IL-7) kommt es zur Stimulation von Jak1 und Jak2
(Janus kinase), die auf verschiedenen -teilweise nicht bekannten - Wegen
Einfluß auf die Gentranskription haben. Zwei Hauptwege stellen der Jak-Stat
(signaltransducers and aktivators of transcription) -Weg bzw. der Jak-Ras -Weg
dar. Letzter läuft über die Initiierung der Ras-abhängigen MAPK (mitogenaktivierende Phosphokinase) - Kaskade ab (Ihle et al., 1995; Taniguchi, 1995;
Kishimoto et al., 1994).
13
1.Einleitung
_______________________________________________________________
Wegen der zentralen Rolle des IL-2/IL-2R - Systems als Bindeglied zwischen
den innerhalb und außerhalb der Zelle während der Induktion einer Immunantwort ablaufenden Aktivierungsvorgängen, bietet es sich an, gerade mit
diesem Zytokine in der Tumorimmunologie zu arbeiten. Besonders beim
metastasierendem Nierenzellkarzinom und beim Melanom ist frühzeitig IL-2 in
Kombination (bes. mit IFN) oder als alleinige systemische Gabe eingesetzt
worden (Richards et al., 1992; Demchak et al., Lotze et al., 1991; Redman et
al., 1991; Valone et al., 1991).
1.3 Immuntherapeutische Ansätze
Eine erfolgreiche Immuntherapie ist abhängig von Tumoreigenschaften
(Histologie, Immunogenität, Metastasierunsfähigkeit), Tumorlokalisation, Tumorlast, Erkrankungsstadium, Grad der Heterogenität der Tumorzellpopulation
und der Fähigkeit des betroffenen Organismus, eine zellvermittelte Immunantwort gegen den Tumor zu entwickeln. Mit verschiedenen Ansätzen aktiver,
passiver oder adoptiver klinischer Strategien in der Tumorimmunologie wird
diesen Möglichkeiten in unterschiedlicher Weise Rechnung getragen.
1.3.1 Monoklonale Antikörper und antigenbindende Fragmente
Nach der Beschreibung der Hybridom-Tecknik durch Köhler und Milstein 1975
glaubte man in der Lage zu sein, monoklonale Antikörper mit hoher Spezifität
für Tumorantigene herstellen zu können. Mit solchen monoklonalen Antikörpern
hätte man dann hochwirksame Tumortherapeutika in Händen (Köhler et al.,
1975). Bei der Gewinnung und Applikation der Antikörper (meist aus der Maus)
ergab sich jedoch eine Reihe von Problemen. Dazu gehören z.B. die Bildung
von Antikörpern gegen und anaphylaktische Reaktionen auf die
„therapeutischen Antikörper“, fehlender Antigene und die unspezifische Bindung
der „therapeutischen Antikörper“ an andere Gewebe des menschlichen
Organismus. Die Herstellung humaner monoklonaler Antikörper, die aufgrund
14
1.Einleitung
_______________________________________________________________
ihrer geringeren Antigenität im menschlichen Organismus besser zur therapeutischen Anwendung geeignet sind als murine Antikörper, hat sich als
schwierig erwiesen (Morrison et al., 1990). In wieweit dieser Weg der Therapie
erfolgreich in der Breite der Tumorerkrankungen angewendet werden kann, ist
Bestandteil intensiver Forschung.
1.3.2 Zytokine
Wenn der Organismus sich mit fremden Antigenen, sei es bakterieller, viraler,
parasitärer, allogener oder autologer tumorzellulärer Herkunft, auseinandersetzt, läuft eine Kaskade von humoralen und zellulären Vorgängen ab, deren
Vorgänge darauf ausgerichtet sind , das Fremdmaterial zu eliminieren oder eine
Toleranz zu induzieren. Makrophagen/Monozyten und Lymphozyten sind oder
werden bei diesen Vorgängen aktiviert und greifen durch Sekretion von
Zytokinen regulierend in diese Vorgänge ein. So kann es nicht verwundern, daß
die Verwendung von Zytokinen auch in der Tumortherapie von stetig wachsender Bedeutung ist. Besondere Relevanz in der Onkologie haben bestimmte
Interleukine (z.B. IL-2 s.1.3), Interferone (IFN) (Heaton et al., 1993) und
Tumornekrosefaktoren (TNF) (Ruddle N.H., 1992; Tracey et al., 1992) erlangt.
Besonders die Kombination von verschiedene Zytokinen zeigt bei vielen
Therapieansätzen eine Steigerung der Effektivität. Nachteile ergeben sich aus
den zum Teil sehr starken Nebenwirkungen bei systemischer Applikation bzw.
der geringen Wirkung bei niedriger, aber gut verträglicher Dosis.
1.3.3 Adoptive Immuntherapie
1980 machten Yron und Spiess bei der Kultivierung von Tumorgewebe folgende Entdeckung: Sie hatten unter der Annahme, daß im Tumor selbst die
meisten tumorsensibilisierten Lymphozyten vorhanden sein müßten, Aufschlüsse von Tumorgeweben mit IL-2 kultiviert, um die Population jener sensibilisierten Lymphozyten zu expandieren. Noch bevor es jedoch zur Prolifera15
1.Einleitung
_______________________________________________________________
tion von Lymphozyten kam, wurden die umliegenden Tumorzellen lysiert. IL-2
konnte offensichtlich Lymphozyten dazu bringen, Tumorzellen zu erkennen und
abzutöten (Yron et al., 1980).
Es schien also möglich, „schlafende“ tumorsensibilisierte Lymphozyten in aktive
tumorlysierende Zellen zu verwandeln. Aus dem venösen Blut von Gesunden
konnten Lotze und Rosenberg Lymphozyten gewinnen, die nach Stimulation
mit IL-2 Tumorzellen unterschiedlicher Herkunft in vitro abtöten konnten. Sie
nannten diese Zellen später lymphokin-aktivierte Killerzellen (LAK) (Rosenberg
et al., 1987). In weiteren Experimenten wurde gezeigt, daß die Zellen auch in
vivo Anti-Tumor-Aktivität besitzen. In tumortragenden Mäusen konnten durch
die gleichzeitige Gabe von kultivierten syngenen LAK und IL-2 die Größe und
die Anzahl von Metastasen reduziert werden (Mule et al., 1984; Lafraniere
1985; Rosenberg et al., 1985a). Durch alleinige systemische Verabreichung
von IL-2 konnte in dem Tiermodell auch eine Anti-Tumor-Aktivität generiert
werden. Diese war jedoch wesentlich schwächer als die durch die kombinierte
Gabe von LAK und IL-2 hervorgerufene (Rosenberg et al., 1985a). Die Charakterisierung der LAK ergab, daß ihre lytische Aktivität nicht MHC-restringtiert war
(Grimm, 1993). Die LAK-Population ist sehr heterogen und umfaßt Lymphozyten mit und ohne T-Zellmarker (Damle et al., 1986).
Ein großes Potential an Anti-Tumor-Aktivität vermutete man auch bei den Lymphozyten, die solide Tumoren infiltrieren (Tumor-infiltrierende Lymphozyten;
TIL) und dadurch ständig mit Tumorantigenen in Kontakt stehen. Die aus
Mikrometastasen gewonnen TIL zeigten, verglichen mit den LAK, im Tierversuch nach in vitro-Stimulation mit IL-2 eine um den Faktor 50 bis 100 gesteigerte antitumorale Wirkung (Rosenberg et al., 1986). Bei den TIL handelt es
sich um MHC-restringierte Effektorzellen, die durch Kontakt mit Tumorantigenen bereits sensibilisiert sind, so daß, verglichen mit den LAK, die Spezifität
ihrer zytotoxischen Wirkung gesteigert ist. Während die Ergebnisse der Tierversuche mit TIL diesen Ansatz als eine effiziente Behandlungsmethode von
Krebserkrankungen erscheinen lassen, ergeben sich Probleme bei der routinemäßigen Durchführung solcher Therapien. Die Gewinnung ausreichender
16
1.Einleitung
_______________________________________________________________
Mengen autologer TIL, die sich dann in vitro stimulieren und expandieren lassen, stellt ein großes Problem dar (Whiteside et al., 1990).
Trotz dieser Schwierigkeiten fand die adoptive Immuntherapie mit LAK- und
TIL-Populationen Anwendung in klinischen Studien zur Behandlung von Karzinom-Patienen. Die Therapie erfolgte nahezu ausschließlich in Kombination mit
der systemischen Gabe von rhIL-2. Die Ergebnisse der Studien waren sehr
unterschiedlich. Deutliche Anti-Tumor-Wirkungen konnten mit der adoptiven
Immuntherapie unter Einsatz von LAK und TIL in Kombination mit IL-2 nur bei
Patienten mit malignen Melanomen oder Nierenzellkarzinomen beobachtet
werden. Die gleiche Methode zeigte bei anderen Tumoren keine oder nur eine
schwache therapeutische Wirkung, z.B. bei Lungen- oder Brusttumoren
(Rosenberg et al., 1985b; 1987; 1988; 1993; McCabe, 1991).
Eine Ursache für die unterschiedliche Wirksamkeit der Therapien bei Patienten
mit verschiedenen Tumortypen könnte die sein, daß als Folge dieser Therapien
die Tumorzellen immunresistent werden. Es konnte in einigen Fällen bewiesen
werden, daß Krebstherapien zum Verlust der β2-Mikroglobuline auf den
Tumorzelloberflächen führten. Diese Proteine sind Bestandteil des MHC-ΙKomplexes. Tumorzellen, denen diese Proteine fehlen, können nicht mehr von
tumorspezifischen CTL-Zellen angegriffen werden und entgehen der
Immunabwehr (Restifo et al., 1996).
Die notwendige, da effizienzerhöhende, begleitende systemische Gabe hoher
Dosen von IL-2 bei der adoptiven Immuntherapie stellt einen weiteren
Schwachpunkt innerhalb dieses Therapie-Konzeptes dar. Die systemische
Applikation hoher Dosen von rhIL-2 führt zu schweren Nebenwirkungen bei den
Patienten (s. 1.2) und in klinischen Versuchen auch zu therapiebedingten
Todesfällen (Kragel et al., 1990; Rosenberg et al., 1993).
17
1.Einleitung
_______________________________________________________________
1.3.4 Aktive spezifische Immuntherapie
Schon Anfang des Jahrhunderts wurde die Schutzimpfung gegen Krebs als
mögliche Therapie in der Behandlung und Prävention von Krebserkrankungen
angesehen (Ehrlich, 1957). Schutzimpfungen führen durch Immunisierung mit
abgeschwächten oder abgetöteten Erregern oder mit Bestandteilen davon zur
Immunität, die den Organismus bei Kontakt mit dem entsprechenden pathogenen Erreger vor dem Vollbild der Erkrankung schützen. Entsprechende vorbeugende Schutzimpfungen gegen Krebs gibt es bisher nicht. Sie sind auch nicht
sinnvoll, da die Wahrscheinlichkeit, daß ein bestimmtes Individuum an einer
bestimmten Krebserkrankung erkranken wird, äußerst gering ist. Anders ist es
in den Fällen, in denen die Infektion mit einem Virus nach einer gewissen
Latenzzeit zur malignen Entartung von körpereigenem Gewebe führen kann.
Der Grund dafür das die Entwicklung von Schutzimpfungen gegen Krebs bisher
nicht möglich gewesen ist, liegt aber gerade in der Herkunft der maligne entarteten Zellen. Sie sind nicht wie Viren, Bakterien oder andere Krankheitserreger körperfremd, sondern stammen von körpereigenen Zellen ab. Daher
sind sie vom Immunsystem nur schwer als „fremd“ zu erkennen (Schirmacher,
1990).
Die dichte zelluläre Infiltration von Tumoren, die lange Latenzzeit bis zur klinischen Symptomatik von Metastasen sowie die spontane Regression mancher
Tumoren und Metastasen legen jedoch nahe, daß auch körpereigene Tumoren
sehr wohl immunogen sein und eine Immunantwort in vivo auslösen können.
Diese Immunantwort ist in der Regel nicht effektiv genug, die Tumorerkrankung
zu beherrschen oder gar zum Verschwinden zu bringen. In fortgeschrittenen
Tumorstadien ist der Gesamtorganismus und damit auch das Immunsystem
durch den Tumor selber sowie durch Nebenwirkungen der bisherigen Therapie
geschwächt (Roitt et al., 1987; Schirrmacher, 1990).
Die aktive spezifische Immuntherapie soll das Immunsystem des Patienten gezielt gegenüber Tumorantigenen sensibilisieren und zur Tumorabstoßung stimulieren. Die im allgemeinen nur schwach ausgeprägte Immunogenität von
18
1.Einleitung
_______________________________________________________________
Tumorzellen kann mit Hilfe von Adjuvantien in Form von abetöteten Bakterien,
von Viren oder Teilen davon, oder chemischen Hilfsstoffen gesteigert werden.
Schon Mitte dieses Jahrhunderts gab es Berichte, daß Tumoren nach Virusinfekten verschwanden oder zumindest kleiner wurden. Die Arbeitsgruppe um
Koprowski konnte in den 50er-Jahren viruszerstörte Tumorzellen als stark
immunogen identifizieren. Nach der Immunisierung mit solchen Onkolysaten
waren Versuchstiere gegenüber dem entsprechenden Tumor immunogen
(Schirrmacher, 1990).
Lindemann setzte 1967 als erster systematisch Influenza-Onkolysate im Tierversuch als Vakzine gegen Zellen einer Tumorzellinie der Maus ein. Er konnte
zeigen, daß Zellfragmente mit Viruspartikeln gemischt nicht annähernd so
immunogen waren wie Onkolyste. Offenbar war das „Aussprossen“ von Virusantigenen in der Membran einer intakten Zelle mit dem Erscheinen von Virusantigenen an der Zelloberfläche der entscheidende, die Immunogenität steigernde Effekt (Schirrmacher, 1990).
Kobayashi zeigte, daß auch Viren, die die Tumor-Wirtszelle nicht lysieren, sondern deren Antigene lediglich in die Zellmembran eingebaut werden, bei der
Transplantation transfizierter Tumoren zur Abstoßung führten (Kobayashi,
1986).
Sinkovics führte in den 70er Jahren das Newcastle Disease Virus (NDV) in die
Onkolysat-Therapie ein. Er konnte bei Melanompatienten im Stadium II und III
eine 5-Jahres-Überlebensrate (5-JÜR) von 70% erreiche, während von nicht
vakzinierten Patienten nach 5 Jahren allenfalls noch 20% leben (Cassel et al.,
1965; Cassel et al., 1983; Murray et al., 1977).
Wallach et al. und Hersey et al. behandelten Melanompatienten erfolgreich mit
Vaccinia-Onkolysaten (Hersey et al., 1986; Schirrmacher 1990).
Die Erprobung verschiedener Viren in der Onkolysat-Therapie zielte darauf ab,
Viren zu finden, die sich als potente Antigene zur Steigerung der Immunogenität
von Tumorzellen eignen, jedoch für den Organismus möglichst nicht schädi19
1.Einleitung
_______________________________________________________________
gend wirken. Dabei ergab sich, daß das Newcastle Disease Virus (NDV) den
Ansprüchen sehr gut entspricht. Viele Stämme sind humanapathogen, in der
Lage Zellen zu infizieren, ihr Genom zu exprimieren und neue, jedoch nicht
mehr infektiöse Viruspartikel zu bilden. Außerdem wird die Produktion bestimmter Zytokine, u.a. Interferone, TNF und heat shock-Proteine durch das NDV angeregt (Lorence et al., 1988; Schirrmacher et al., 1989; 1986; Haas et al.,
1998).
Weitere Möglichkeiten der Modifizierung von Tumorzellen zur Steigerung der
Immunogenität besteht in der chemischen, enzymatischen oder gentechnischen Manipulation.
Mittlerweile sind mit der Methode der ASI Patienten mit unterschiedlichen
Tumoren erfolgreich behandelt worden. Hoover et al., berichteten über Ergebnisse einer randomisierten prospektiven Untersuchung mit einer aktiv-spezifischen Immuntherapie (mit Bacille-Calmette-Guérin -Impfstoff (BCG) gemischte
Vakzin) bei Patienten mit Dukes-B- und -C- Koloncarcinom (Hoover et al.
1985). Patienten nach autologer Tumorvaccinierung hatten signifikant längere
krankheitsfreie Intervalle und eine bessere Gesamtüberlebensrate als ausschließlich operativ therapierte. Auch war im Vergleich zur Kontrollgruppe das
Muster des Tumorrückfalls in der Immuntherapiegruppe diskreter und insbesondere im Hinblick auf eine erneute Resektabilität günstiger (Hoover et al. 1993).
Tumorrückfall oder Tod traten ein bei 56% der Kolonkarcinompatienten in der
Kontrollgruppe. Im Vergleich dazu waren es 33% in der Immuntherapiegruppe.
Aufbau und Durchführung dieser Studie wurden allerdings nicht unerheblich
kritisiert (Moertel C.G. 1994).
Mittlerweile liegen Daten einer Phase-II Studie an Patienten mit fortgeschrittenem Kolonkarzinom mit Lebermetastasen vor. Bei dieser Studie wurde eine
Vakzine aus autologen intakten Tumorzellen (ATV), verwendet, die mit NDV
modifiziert worden war (ATV-NDV). Während bei 48 Patienten eine ATV-NDV Therapie durchgeführt wurde, wurden 9 Patienten mit einem Gemisch aus ATV
und BCG behandelt. Während bei den ATV-NDV Patienten eine 2-Jahresüber-
20
1.Einleitung
_______________________________________________________________
lebensrate von 97,9% erzielt werden konnte, lag die 2-JÜR der ATV-BCG - Patienten bei 66,7% (Ockert et al., 1995).
Hersey et al. beobachteten eine 2-JÜR von 75% bei Melanom-Patienten, die
mit einem Vaccinia-Melanom-Onkolysat behandelt worden waren, in der historischen Kontrollgruppe betrug die 2-JÜR nur 57% (Hersey et al., 1986).
Freedman et al. wandten bei Vulvakarzinom-Patientinnen eine Vakzine aus
Membranfragmenten autologer Tumorzellen an. Die durchschnittliche Überlebenszeit der immuntherapierten Patientinnen war länger als 26 Monaten, während in einer Kontrollgruppe nach Resektion und Radiotherapie 16 Monate
durchschnittliche Überlebenszeit erreicht wurden (Freedman et al., 1983).
Besondere Erfolge sind in letzter Zeit beim Nierenzellkarzinom (NZK) erreicht
worden. Gerade bei diesem Tumor, der aufgrund seiner erst spät auftretenden
Symptome zum Zeitpunkt der Diagnosestellung meist weit fortgeschritten ist,
kommt jedem Therapieansatz eine besondere Bedeutung zu, da zu diesem
späten Zeitpunkt die Prognose der Patienten ohnehin sehr schlecht ist.
Seit den ersten Veröffentlichungen von Tallberg und Tykkä, die NZK- und später auch andere Patienten - mit einem Gemisch aus Tumorzellhomogenisat und
Tuberkulin- oder Candida albicans-Antigen vakzinierten und dabei 10-JÜR von
etwa 20%, verglichen mit 5% in einer nicht therapierten Kontrollgruppe, erreichten (Tallberg et al., 1987; 1986; 1985; Tykkä 1978; 1974), haben verschiedene
Arbeitsgruppen mit z.T. unterschiedlichen Methoden versucht, Patienten gegen
ihr NZK zu immunisieren (Schapira et al., 1979; Schärfe et al., 1986).
Seit einigen Jahren wird in der Arbeitsgruppe Falkenberg an dieser Therapieform mit ATV-NDV gearbeitet. So zeigte erst kürzlich eine Studie, daß besonders bei Patienten mit nicht-metastasiertem NZK bei einer mittleren Beobachtungsdauer von 22 Monaten ein Trend zu einer geringeren Rezidivrate in der
Studiengruppe (30 Patienten ohne ASI-Behandlung nach Nephrektomie) verglichen mit der Kontrollgruppe. 80% der Patienten der Studiengruppe waren
nach 2 Jahren rezidivfrei gegenüber 69% bei der Kontrollgruppe (Hinkel, 1995).
21
1.Einleitung
_______________________________________________________________
Neulich berichtete die Arbeitsgruppe um Repmann von einer signifikant höheren Überlebensrate von NZK-Patienten (Einteilung nach Robson) der Gruppen
Robson II und Robson III nach ASI-Behandlung (Repmann et al., 1997).
1.3.5 Problematik der immuntherapeutischen Ansätze
Sowohl bei der adoptiven Immuntherapie als auch bei der Aktiven spezifischen
Immuntherapie kann die Effizienz der Therapie verstärkt werden, indem der
Vakzine IL-2 als Adjuvans zugesetzt wird. Hier hatte sich in den klinischen
Studien ein Schwachpunkt der Therapiekonzepte gezeigt. Die systemisch notwendigen hohen Dosen an rhIL-2 führen zu schweren Nebenwirkungen (s. 1.2),
die verständlich sind, betrachtet man die physiologische Funktion des Zytokins
und die Höhe der narürlicherweise vorkommenden Konzentration in vivo. Zytokine sind „short-range substances“ und dienen der Zell-Zell-Kommunikation
zwischen benachbarten Zellen des Immunsystems(s. Abb. 1). In der direkten
Umgebung solcher Zellen können diese Stoffe sehr hohe Konzentrationen erreichen, bezogen auf das Gesamtvolumen des Organismus werden sie jedoch
in kaum meßbaren Mengen freigesetzt (Sitkovsky et al., 1988). Um einen
Therapieerfolg im Rahmen eines ASI-Ansatzes zu ermöglichen, müßte die
systemisch applizierte Menge der hohen Konzentration entsprechen, was aber
aufgrund der Nebenwirkungen nicht durchführbar ist. Ein weiteres Problem liegt
in der niedrigen Plasmahalbwertzeit von ca. sieben Minuten für das rekombinante IL-2 (Lotze et al., 1987). Die erfolgversprechenste Applikationsart
scheint die direkte Injektion in den Tumorherd zu sein. Der Zytokinspiegel wird
dort erhöht, wo die Zellen des Immunsysems den Antigenreiz erfahren und ihre
antitumorale Wirkung entfalten sollen. Mit dieser Methode sind jedoch nur solide, gut zugängliche Tumore zu behandeln, z.B. in Form eines Sprays zur Therapie von Lungenmetastasen eines Nierenzellkarzinoms. Ferner diffundieren
die relativ kleinen Zytokinmoleküle schnell vom Applikationsort weg in das
umliegende Gewebe und werden innerhalb kürzester Zeit inaktiviert.
22
1.Einleitung
_______________________________________________________________
Um eine Anti-Tumorantwort gegen autologe Tumoren generieren zu können, ist
es daher notwendig, um die Tumorzellen herum eine stabile Mikroumgebung zu
schaffen, in der über einen langen Zeitraum hohe Konzentrationen von Zytokinmolekülen vorliegen, durch die die durch diese Region passierenden Zellen
des Immunsystems aktiviert werden können. Sowohl die systemische als auch
die lokale Verabreichung von Zytokinlösungen scheinen keine geeigneten
Methoden zum Erreichen des Zieles zu sein.
Ein alternatives Konzept wurde mittels gentechnischer Methoden entwickelt und
in vivo im Tierversuch getestet. Autologe Tumorzellen werden mit Zytokingenen
transfiziert und als Vakzine verabreicht. Die transfizierten Tumorzellen
produzieren dann im Empfänger kontinuierlich das von dem eingeführten Gen
kodierte Zytokin. Um die Zellen herum baut sich die gewünschte Mikroumgebung mit einer hohen Zytokinkonzentration auf, und ein Zytokingradient kann
die Zellen des Immunsystems chemotaktisch zu den Zielzellen führen, die die
Tumorantigene tragen.
Im Jahr 1990 testete die Arbeitsgruppe um Fearon im Tiermodell die Wirkung
von schwach immunogenen Tumorzellen der murinen Kolonkarzinomlinie
CT26, die zuvor mit dem Gen für IL-2 transfiziert worden waren. Die Verabreichung der gentransfizierten Zellen an syngene Mäuse führte bei diesen zu
einem kurzzeitigen weinige Tage andauernden Tumorwachstum. Anschließend
kam es zur vollständigen Remission. Demgegenüber gingen in den Kontrollgruppen die nicht-transfizierte Zellen der gleichen Tumorzellinie (CT26) an
und führten zum Tod der Tiere (Fearon et al., 1990). Die Vakzinierung aus mit
dem IL-2 - Gen transfizierten Zellen hinterläßt bei den behandelten Tieren
gleichzeitig eine Immunität gegen die nativen Tumorzellen. Die Tumorimmunität
wird durch MHC-restringierte CTL-Lymphozyten vermittlet.
In der Folgezeit wurden verschiedene murine Tumorzellen mit den Genen für
verschiedene Zytokine transfiziert und ihre Wirkung im Tiermodell überprüft.
Zellen anderer Zellinien als CT26 wurden mit den Genen für IL-2 transfiziert
(Ley et al., 1991; Gansbacher et al., 1990). IL-4 , IFN-alpha- und G-CSF
(granulocyte-macrophage - colony - stimulating factor) - Gene wurden in Zellen
23
1.Einleitung
_______________________________________________________________
muriner Tumor-Zellinien eingebracht (Golumbek et al., 1991; Ferrantini et al.,
1994; Dranoff et al., 1990). Alle diese Gruppen erhielten Ergebnisse, die sich
mit denen von Fearon vergleichen ließen.
Offensichtlich ist bei diesem Therapieansatz der entscheidende Vorteil, daß
beide Reize, der von den Tumorzellen ausgehende Antigenreiz und der von
den Zytokinen ausgehende und auf die Zellen des Immunsystems wirkende
Stimulationsreiz, von derselben Lokalisation innerhalb des Organismus kommt.
Dies ergab sich aus Versuche der Arbeitsgruppe um Pardoll, die nicht-zytokinGen-transfizierte Tumorzellen eines anderen Typs gemischt mit den zytokinGen-transfizierten Tumorzellen applizierte. Auf diese Weise konnte auch gegen
andere nicht Zytokin-Gen-transfizierte Tumorzellen Immunität induziert werden
(Pardoll, 1992). Bei einem ähnlichen Konzept bestand die Vakzine aus den autologen Tumorzellen und Fibroblasten, die mit einem Zytokingen transfiziert
worden waren. Vorteilhaft wirkt sich bei diesem Versuchsansatz aus, daß es
sich bei den Fibroblasten nicht um transformierte Zellen, sondern um somatische Zellen handelt. Diese können sich nicht so häufig teilen wie Tumorzellen,
aber der Effekt der lokalen hohen Zytokinkonzentration in unmittelbarer Nähe
des Tumorantigens bleibt erhalten (Weymayr, 1994; Sobol et al., 1992).
Die Umsetzung dieses in vielerlei Hinsicht optimalen Therapiekonzeptes auf
Tumorpatienten ist jedoch äußerst problematisch und ethisch nicht akzeptabel,
da dem Patient nicht nur gentechnisch veränderte sondern vor allem vitale Tumorzellen appliziert werden müssen. Eine Therapie mit vitalen Tumorzellen
birgt ein nicht-kalkulierbares Risiko der Metastasenbildung in sich. Auch die
Risiken, die sich aus der Manipulation des Genoms der Zelle ergeben, sind
nicht absehbar. In Tierversuchen konnte das Anwachsen von gentransfizierten
Tumorzellen im Empfänger nachgewiesen werden. Die Applikation muriner
Tumorzellen, die mit dem IL-2 - Gen transfiziert worden waren, führte zur Bildung von Metastasen, die eindeutig vom Transplantat abstammten (Tsai et al.,
1993). Der Verlust des Zytokingens oder die Selektion von neuen Tumorzellvarianten, die dem Immunsystem ausweichen können, wurden als Ursache für
diesen Befund diskutiert. Außerdem kann nicht ausgeschlossen werden, daß
die Produktion von Zytokinen durch gentransfizierte Tumorzellen oder gen24
1.Einleitung
_______________________________________________________________
transfizierte Begleitzellen das Tumorwachstum anregt, die Angiogenese fördert
oder die Tumorzellen mobiler werden läßt, was mit einer erhöhten Metastasierung einhergeht.
Entsprechende Beobachtungen konnten im Tierversuch mit Fibroblasten beschrieben werden, die mit einem Zytokingen transfiziert worden waren (Sobol et
al.,1992). Fibroblasten sind Zellen des Bindegewebes und tragen zur Bildung
und zum Erhalt der Bindegewebe-Fasermatrix bei. Sie spielen auch eine Rolle
bei der Ausbildung der bindegewebigen Matrix von Tumoren, ein Prozeß, der
auch von Zytokinen beeinflußt werden kann und das Tumorwachstum unterstützt. Zellen der Zellinie CHO, die mit dem TNF-Gen transfiziert wurden, zeigten im Tierversuch eine stärkere Neigung zur Metastasierung, als native Zellen
der gleichen Zellinie (Malik et al., 1990).
Das Risiko der Impfmetastasenbildung bei der Therapie mit autologen gentransfizierten Tumorzellen kann durch die Behandlung der Tumorzellen mit einer letalen Dosis ionisierender Strahlen (200 Gy) umgangen werden. Durch die
Bestrahlung verlieren die Tumorzellen die Fähigkeit sich zu teilen, während die
Fähigkeit zur Proteinsynthese und damit zur Synthese des Zytokins für eine
begrenzte Zeit erhalten bleibt. Dabei sinkt die Synthesekapazität, verglichen mit
der vitaler Zellen, stark ab. In jedem Fall fällt der dynamische Effekt der infolge
der Zellteilung stetig zunehmenden Zytokin-Produktion weg.
Zu den ethischen Bedenken, die einem Einsatz der zuvor genannten Therapien
entgegenstehen, kommen praktische Probleme. Es müssen für jeden Patienten
individuell autologe Tumorzellen oder somatische Zellen in ausreichenden
Mengen gewonnen werden. Die Zellen müssen dann an die Bedingungen in
der Gewebekultur adaptiert und im Anschluß daran mit dem Zytokingen transfiziert werden. Geeignete Transfektanten müssen dann ausgewählt und expandiert werden. Diese Arbeiten sind mit hohen Kosten und erheblichem Personalaufwand verbunden, die einer routinemäßigen Anwendung entgegenstehen.
25
1.Einleitung
_______________________________________________________________
Außerdem muß berücksichtigt werden, daß es sich bei den Studien mit tierischen Tumormodellen, um Tumorzellinien von „monoklonalen“ Zellen handelt,
während bei dem aus Patienten gewonnenen Tumormaterial komplexe
Mischungen von Tumorzellen vorliegen. Es ist daher möglich, daß bei den beschriebenen Aufarbeitungsverfahren Zellen mit bestimmten genotypischen
Eigenschaften selektiert werden. Die Adaptation der menschlichen Tumorzellen
an die Gewebekulturbedingungen kann bereits zur unkontrollierbaren Selektion
von Tumorzellvarianten führen. Diese Gefahr besteht erneut bei der Transfektion der kultivierten Zellen und der anschließenden Selektion der Transfektanten.
Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse und Erfahrungen ist eine Therapie von
Krebserkrankungen des Menschen mittels autologer, mit einem Zytokingen
transfizierten Tumorzellen oder Somazellen, nicht oder nur mit unkalkulierbaren
Risiken durchführbar.
Aufgrund der Ergebnisse der Arbeitsgruppe um Hock stellt sich die Frage, wie
sinnvoll der ethisch fragwürdige Einsatz von genetisch verändertem Tumormaterial ist. Von der Arbeitsgruppe wurden durch Bestrahlung devitalisierte
Tumorzellen mit einem klassischen Adjuvans vermischt und Mäusen injiziert.
Tieren einer anderen Versuchstiergruppe wurden mit einem Zytokingen transfizierte Tumorzellen appliziert. Beide Versuchstiergruppen zeigten hinsichtlich
der Induktion einer Tumorimmunität keine Effizienzunterschiede: (Hock et al.,
1993)
26
1.Einleitung
_______________________________________________________________
1.4. Zielsetzung
Seit einigen Jahren wird in der Arbeitsgrupe Falkenberg an der Anwendung
eines neuartigen Tumortherapie-Verfahrens zur Bekämpfung postoperativ auftretender Metastasen von humanen Nierenzellkarzinomen gearbeitet, das als
„Aktive Spezifisch Immunisierung“ (ASI) bezeichnet wird. Die Patienten erhalten
bei dieser Therapie eine Vakzine, die aus bestrahlten autologen Tumorzellen
besteht, die mit Hilfe des human-apathogenen Newcastle Disease Virus (NDV)
xenogenisiert wurden (Schirrmacher et al., 1989). Der Vakzine wird freies rekombinantes humanes Interleukin-2 als immunstimulierende Substanz beigemischt.
Im Rahmen dieser Arbeit sollen Möglichkeiten gefunden werden, rhIL-2 in
direkter Nähe von Tumorzellen zu fixieren. Im Gegensatz zum freien IL-2, das
eine Plasma-Halbwertzeit von wenigen Minuten besitzt, würde die Freisetzung
von fixiertem Zytokin ein länger anhaltender lokaler Stimulus sein. Durch die
direkte Nähe von Zytokinen und Tumorantigenen würde eine der natürlichen
Situation entsprechende Induktion zellvermittelter Immunität entstehen. Solche
rhIl-2-beladenen Tumorzellen, bei der ASI als Vakzine eingesetzt, könnten die
Wirksamkeit der Therapie verbessern und wären eine praktikable Alternative zu
Vakzinen aus gentransfizierten Tumorzellen.
Mit Hilfe verschiedener heterobifunktioneller Linkerreagenzien sollen reaktive
Gruppen an rhIL-2 und an Oberflächenproteinen von Tumorzellen gebunden
werden. Die Kopplung des IL-2 an die Tumorzellen soll über die Linkersubstanzen MHS oder SPDP und SAMBA erfolgen. Als Modellsubstanz soll zunächst OVA-FITC anstelle von rhIL-2 verwendet werden, um die verschiedenen
Kopplungsmechanismen wie kovalente oder adhäsive Bindungen sowohl auf
ihre Stabilität als auch auf die Kopplungsrate zu untersuchen.
Für die Kopplungsmechanismen mit den erfolgversprechendsten Ergebnissen
solle nachgewiesen werden, wie lange biologisch aktives rhIL-2 von diesen
veränderten Tumorzellen an die Umgebung abgegeben wird.
27
2.Methodik
_______________________________________________________________
2. Methodik
2.1 Materialien
2.1.1 Chemikalien
S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrd
Sigma
Agarose
Gibco BRL
Ammoniumpersulfat
Biorad
Bromphenolblau
Serva
Concanavalin A
Sigma
Coomassie Brillant Blue
Serva
Dithiothreitol
Sigma
Fluoresceinisothiocyanat (FITC)
Nordic Immunoloy
Glycerin
Riedel-de Haen
IL-2 (human, rekombinant)
Eurocetus
Molekulargewichtsmarker
Sigma
Ovalbumin
Serva
Streptaviden, FITC-konjugiert
Sigma, Vector
Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat
Molecular Probes
Trypanblau
Chroma
Trypsin-EDTA-Lösung (Trypsin-Versene-Lösung)
Bio Whittaker
Die hier nicht aufgeführten Chemikalien wurden in Analysenqualität von den
üblichen Herstellern bezogen.
28
2.Methodik
_______________________________________________________________
2.1.2 Verbrauchsmaterial
Filter für NOVACELLTM - Rührzelle: PM10
amicon
Filtrationsmembranen (0,22 µm und 0,45 µm)
Sartorius
Gewebekulturflaschen
Corning, Greiner
Gewebekulturplatten
Corning
Mikrotiterplatten
Falcon
Sterilfilter
Gelman Sciences,
Millipore
2.1.3 Geräte
Fluoreszenzmikroskop BH 2
Olympus
Fotokamera C-35 AD
Olympus
FPLC-Einrichtung
Pharmacia LKB
NOVACELLTM - Rührzelle
amicon
pH-Meter Modell 601 A
Orion Research
Semi Dry Blot
BioRad
Netzgerät Modell 3000/300
BioRad
UV-VIS Spectrometer
Spectrophotometer 555
Zentrifuge 5402
Eppendorf
Zentrifuge Varifuge RF (Rotor 5310)
Heraeus
2.1.4 Materialien für die Säulenchromatographie
Die verwendeten Materialien Sephadex G-25 (und Sephacryl 300 HR) und
Superose 12 prep grade wurden von der Firma Pharmacia bezogen.
29
2.Methodik
_______________________________________________________________
2.1.5 Zellkulturmedien und Zellstämme
Zellinien:
X63Ag8.653
Myelomzellinie (Kearney et
al., 1979) CTLL-2 murine,
zytotoxische T-Zellinie
Grundmedium:
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium (DMEM)
High Glucose (4,5 mg/ml)
Gibco
oder:
Rosewell Park Memorial
Institute Medium 1640 (RPMI 1640)
Bio Whittaker
Basismedium:
Pro Liter RPMI/DMEM werden je 10 ml der folgenden Substanzen hinzugefügt:
L-Glutamin (200mM)
Sigma
Na-Pyruvat (100mM)
Gibco
HEPES-Puffer (1M)
Gibco
Antibiotikamixtur (PSF):
Penicillin (10000 U/ml)
Streptomycin (10000 µg/ml)
Funghizone (25 µg/ml)
Bio Whittaker
Zellkulturmedium:
Basismedium mit:
10% (v/v) fötalem Kälberserum (FCS)
Biochrom
Medium für CTLL-2-Zellen:
Zellkulturmedium mit 20 U/ml rhIL-2
Biochrom
30
2.Methodik
_______________________________________________________________
Einfriermedium:
Grundmedium mit
15 % (v/v) Fötalem Kälberserum
Biochrom
12 % (v/v) Dimethylsulfoxid (DMSO)
Riedel-de Haën
2.1.6 Lösungen und Puffer
Acrylamid-Stammlösung
30 % (w/v)
Acrylamid
(für SDS-PAGE)
0,8 % (w/v)
N,N’-Bisacrylamid
Ammoniumpersulfat (APS)
Coomassie-Färbelösung
in
H2O
10 %(w/v)
APS
0,1 % (w/v)
Coomassie Brilliant Blue
R250
40%
10% (v/v)
Elektrophoresepuffer für SDS-Gele
Laemmli-Probenpuffer (2x)
Essigsäure
0,025 M
Tris-HCl
0,192 M
Glycin
0,1%
Entfärbelösung
Methanol
SDS
25 % (v/v)
Methanol
10 % (v/v)
Eisessig
0,125 M
Tris-HCl, pH6,8
4 %(w/v)
SDS
20 %(v/v)
Glycerin
10 %(v/v)
2-Mercaptoethanol
0,02% (w/v)
Pyronin
31
2.Methodik
_______________________________________________________________
MTT-Lösung
5 mg/ml
3-(4,5-dimethyl-thiazol2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium-bromid (MTT)
in
PBS
2,7 mM
KCl
1,5 mM
KH2PO4
137 mM
NaCl
8 mM
Puffer für Fluorochrom-Kopplung
PBS
0,1 mM
Na2HPO4
Na2CO3
pH 4,8
4x Sammelgelpuffer
SDS-Lösung für CTLL-2 - Test
0,5 M
10% (w/v)
in
4x Trenngelpuffer
1,5 M
Tris-HCl, pH 6,8
SDS
0,01N HCl
Tris-HCl, pH 8,8
32
2.Methodik
_______________________________________________________________
2.2 Methoden
2.2.1 Arbeiten mit Zellkulturen
2.2.1.1 Kultivierung von Tumorzellen
Die Kultivierung von Tumorzellen der Linie X63Ag8.653 erfolgte in Gebrauchsmedium. Die Tumorzellen wurden in einem Brutschrank bei 37°C, 5% CO2 und
98% relativer Luftfeuchtigkeit kultiviert; das Medium in den Flaschen wurde in
regelmäßigen Abständen ausgetauscht.
2.2.1.2 Bestimmung der Zellzahlen
Die Zellzahl wurde mit Hilfe der Neubauer-Zählkammer bestimmt, indem die
Anzahl der Zellen in vier der großen Quadrate der Kammer gezählt und der
Mittelwert der Zählungen ermittelt wurde. Dieser Wert mit 10000
(Kammerfaktor) multipliziert, entspricht der Zellzahl pro Milliliter. Unter Verwendung des Farbstoffes Trypanblau konnte eine Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen erfolgen.
2.2.1.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen
Bei den durchgeführten Arbeiten wurde ein Einfriermedium verwendet, daß das
Gefrierschutzmittel Dimethylsulfoxid (DMSO) enthält. Die Zellsuspension wurde
aus Gewebekulturflaschen in sterile Zentrifugenröhrchen überführt und 10
Minuten bei 100 x g zentrifugiert. Das Sediment wurde in 1 ml eiskaltem Einfriermedium aufgenommen, in ein 2 ml Einfrierröhrchen überführt und auf Eis
gestellt. Das Röhrchen wurde zunächst bei -80°C und zur Dauerkonservierung
bei -196°C in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
Zum Auftauen wurde das Einfrierröhrchen in 37°C warmen Wasser geschwenkt, bis die Suspension gerade auftaut, einem 12 ml - Röhrchen mit
33
2.Methodik
_______________________________________________________________
9 ml Gebrauchsmedium aufgenommen und in geeignete Kulturgefäße überführt. Um verbliebenes DMSO zu entfernen, wurde das Medium nach ca. 24
Stunden gewechselt.
2.2.2 Fluoreszein-Markierung von Ovalbumin (OVA) mit Hilfe von
Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) und Tetramethylrhodamine B
Isothiocyanat (TRITC)
Für die Markierung von OVA an FITC bzw. TRITC wurde eine Modifikation der
Technik von Rinderknecht (Rinderknecht, 1962) verwendet. Die Bindung von
FITC mit OVA erfolgte unter Bildung einer Thiocarbamidbindung nach
folgender Reaktionsgleichung:
OVA-NH2
+
S=C=N-Fluorochrom
→
S
║
OVA-NH-C -NH-Fluorochrom
Die NH2-tragenden Gruppen, die für diese Reaktion entscheidend sind,
stammen aus den ε-Aminogruppen der Lysinreste des Proteins.
Zu 1 ml einer Ovalbumin-Lösung (20 mg/ml in 0,1M NaHCO3 - Kopplungspuffer) wurden 100 µl einer Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) - Lösung (5 mg / ml
DMSO) gegeben. Die Inkubation des Gemisches erfolgte - in Aluminiumfolie
lichtdicht umwickelt - auf einer Rollvorrichtung 2 h bei Raumtemperatur.
Überschüssige FITC-Moleküle wurden vom Fluoreszein-markierten OVA durch
Gelfiltration über eine Sephadex G 25 - Säule abgetrennt.
Nach einer entsprechenden Vorschrift erfolgte die TRITC-Markierung von OVA.
2.2.3 Bestimmung der Proteinkonzentration von Lösungen fluoreszein-modifizierter Proteine
In Lösungen fluoreszein-markierter Proteine absorbieren beide Komponenten,
das Protein und das Fluoreszein, das Licht der Wellenlänge von 280 nm.
34
2.Methodik
_______________________________________________________________
Zwischen der Absorption des Fluoreszeins bei 495 nm und bei 280 nm besteht
folgende Beziehung:
E280 = 0,35 x E495
Die Proteinkonzentration von Lösungen Fluoreszein-markierter Proteine
berechnet sich daher wie folgt:
cProtein =
(E280 - 0,35 × E 495)
— — — — — — — — — —
ε(Protein) × d
Zur Angabe der Kopplungseffizienz eines Fluorochromes an ein Protein wird
der F/P-Quotient eines Konjugates angegeben. Dieser Quotient gibt das molare
Verhältnis von Fluorochrom (F) zu Protein (P) an und somit die Anzahl der
Fluorochrommoleküle je Proteinmolekül (Peters, 1989). Für an Ovalbumin gekoppeltes FITC ergibt sich folgende Gleichung:
F/Pmolar
=
E 495 × 1,2 × 160000
— — — — — — — — — —
200 × 390 × (E280 - 0,35 × E 495)
2.2.4 Konzentrierung proteinhaltiger Lösungen
Für bestimmte Anwendungen, zum Beispiel für die Kopplung von Proteinen
nach Gelfiltrations-Säulenchromatographie (s 2.6), war es notwendig, Proteinlösungen zu konzentrieren. Hierzu wurden die Druckluftapparatur der Firma
amicon benutzt. Bei den hier durchgeführten Versuchen wurden die Filter PM10
eingesetzt, die für alle Proteine bis zu einem Molekulargewicht von etwa 10 kD
durchlässig sind.
35
2.Methodik
_______________________________________________________________
2.2.5 Herstellung von Proteinkonjugaten
In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, folgende Kopplungprodukte zur Bindung von OVA-FITC (bzw. IL-2) an Tumorzellen (hier der Linie X63Ag8.653) zu
erstellen.
Dabei wurden mit Hilfe von S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid (SAMBA)
SH-Gruppen (s.2.5.1) in Proteine eingeführt. Der entsprechende Kopplungspartner wurde durch Einführung von Maleimidgruppen mittels Maleimidohexanoyl-N-hydroxysuccinimidester (MHS) (s.2.5.2), bzw. Pyridyldisulfidgruppen unter Verwendung von Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (SPDP)
(s.2.5.2), erstellt:
I) Kopplung über eine Thioetherbindung:
- Zellen + SAMBA mit OVA-FITC (bzw. IL-2) + MHS
- Zellen mit Kopplungsprodukt aus
ConA + SAMBA und OVA-FITC (bzw. IL-2) + MHS
II) Kopplung über eine Disulfidbindung:
- Zellen + SAMBA mit OVA-FITC (bzw. IL-2) + SPDP
- Zellen mit Kopplungsprodukt aus
ConA + SAMBA und OVA-FITC (bzw. IL-2) + SPDP
Durch die Einführung der genannten funktionellen Gruppen entstanden bei
Reaktion gerichtete Konjugate über Thioether- bzw. Disulfidbindungen
zwischen den modifizierten Proteinen. Das Gleichgewicht der Reaktionen liegt
weit auf der Seite der Produkte. Die Entstehung unerwünschter Kopplungsprodukte aus intramolekularen Reaktionen oder Reaktionen zwischen zwei gleichen Proteinen (Homokonjugaten) wird so verhindert.
36
2.Methodik
_______________________________________________________________
2.2.5.1 Einführung und Aktivierung von SH-Grupen in Proteine unter
Verwendung von SAMBA (Ishikawa et al., 1983; Hermanson, 1996)
Bei der heterobifunktionellen Linkersubsanz SAMBA ist die reaktive SH-Gruppe
durch Acetylierung maskiert. Das zyklische Anhydrid im SAMBA-Molekül
reagiert mit primären Aminen. Der Anhydrid-Ring öffnet sich, und eine Amidbindung wird ausgebildet. Die Öffnung des zyklischen Anhydrids führt zur
Rekonstitution einer Carboxylgruppe im SAMBA-Molekül. Die in das Protein
eingeführte maskierte Thiolgruppe ist unempfindlich gegen Oxidation und
Reaktion mit anderen reaktiven Gruppen. Direkt vor ihrem Gebrauch können
die mit Hilfe von SAMBA in Proteine eingeführten acetylierten Thiolgruppen
durch Hydroxylamin aktiviert werden. Hydroxylamin „übernimmt“ die Acetylgruppen von den maskierten SH-Gruppen, so daß reaktive Thiolgruppen entstehen (s. Abb. 2).
O
O
S
S
O
O
NH-Protein
+ H2N-Protein
HO
O
O
O
SAMBA
O
HS
S
HO
NH-Protein
O
O
NH-Protein
NH2OH
HO
O
O
Abb. 2: Einführung von maskierten SH-Gruppen in Proteine mit Hilfe von SAMBA und die anschließende Aktivierung der Thiolgruppen durch Hydroxylamin
37
2.Methodik
_______________________________________________________________
Zur Optimierung der Konzentration an SAMBA wurden Lösungen mit 2,4 mg/ml
bis 2,4 x 10-3 mg/ml dieser Substanz in Dimethylformamid (DMF) hergestellt.
Zu 1x106 Zellen bzw. 0,25 mg/ml ConA wurden jeweils 50µl SAMBA gegeben.
Bei allen weiteren Versuche betrug die Stammkonzentration an SAMBA
2,4 mg/ml.
Zur direkten Reaktion an Zellen wurde der Ansatz 60 min bei Raumtemperatur
inkubiert, 3 x zentrifugiert (Eppendorf Zentrifuge 5402, 5 min, 700 Upm, 4°C)
und in jeweils 1 ml phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert.
250 µl einer 1M Hydroxylamin-Lösung und 315 µl einer 0,1M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) wurden dem Ansatz hinzugefügt und dieser 5 Minuten
lang bei Raumtemperatur inkubiert. Überschüssige Reagenzien wurden durch
Zentrifugation abgetrennt. Mit dem Zellpellet wurde dann die entsprechende
Kopplung durchgeführt (s. 2.2.5).
Bei der Reaktion von SAMBA an ConA entfielen die Zentrifugationsschritte.
Hier erfolgte die Abtrennung überschüssiger Reagenzien vom aktiviertem
Protein durch Gelfiltration über eine Sephadex G25-Säule (V=32ml) (s 2.2.6).
Vor der Reaktion mit der Zellsuspension wurden alle Lösungen sterilfiltriert und
sämtliche Arbeiten steril durchgeführt.
2.2.5.2 Einführung und Aktivierung von 2-Pyridyldisulfidgruppen in
Proteine unter Verwendung von SPDP (Carlsson et al., 1978)
Mit Hilfe des heterobifunktionellen Reagenz Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) werden „geschützte“ Sulfhydrylgruppen in Form von
Pyridyldisulfid-Gruppen in die Proteine eingeführt. Als funktionelle Gruppen
dienen jeweils eine durch N-Hydroxysuccinimid aktivierte Carboxylgruppe und
eine Pyridyldisulfid-Gruppe. Beide Gruppen sind über Propionyl-Reste miteinander verbunden. Die Bindung an das Protein erfolgt in Form einer Acylierungsreaktion zwischen der durch N-Hydroxysuccinimid aktivierten Carboxylgruppe
von SPDP und einer primären Aminogruppe des Proteins (s. Abb. 3).
38
2.Methodik
_______________________________________________________________
O
S
S CH2
CH2
C O N
N
+ H2N-Protein
O
S
S
CH2
CH2
C NH Protein
N
Abb. 3: Einführung von Pyridyldisulfid-Gruppen in Proteine mit Hilfe von SPDP
Zur Modifikation von OVA-FITC wurde SPDP in Ethanol (c = 15g/l) gelöst.
Dabei wurden die beiden Substanzen in einem molaren Verhältnis von 1 : 50
eingesetzt. Der Reaktionsansatz wurde unter Lichtausschluß auf einer Rollvorrichtung 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Abtrennung des überschüssigen SPDP vom Reaktionsprodukt erfolgte durch Gelfiltration über eine
Sephadex G-25 Säule (120 ml). Die das aktivierte Protein enthaltenden Gipfelfraktionen wurden vereinigt, ggf. konzentriert (s 2.2.4) und nach Sterilfiltration
zu den SH-Gruppen tragenden Zellen gegeben (s. 2.2.5.4).
Die Modifikation des rhIL-2 erfolgte wie oben beschrieben, wobei dieses in
einer Konzentration von 1 g/l in sterilem Wasser gelöst und mit SPDP versetzt
wurde.
2.2.5.3 Einführung und Aktivierung von Maleimid-Gruppen in Proteine mit
Hilfe von MHS
Die Modifikation von Proteinen mit Maleimid-Gruppen erfolgte unter Verwendung von Maleimido-hexanoyl-N-hydrosysuccinimidester (MHS). Es besitzt als
funktionelle Gruppe jeweils eine durch N-Hydroxysuccinimid aktivierte
Carboxylgruppe und eine Maleimid-Gruppe. Als Verbindung zwischen den
39
2.Methodik
_______________________________________________________________
beiden funktionellen Gruppen - dem Spacer - dient ein 6-Imido-hexanoyl-Rest.
Die Bindung an das Protein erfolgt in einer Acylierungsreaktion. Hierbei kommt
es zwischen der durch N-Hydrosysuccinimid (NHS) aktivierten Carboxylgruppe
der Maleimid-Derivate und einer primären Aminogruppe des Proteins unter
Freisetzung von NHS zur Ausbildung einer Amidbindung (s. Abb. 4).
O
O
N
O
O
O
N
O
+ H2N Protein
O
N
O
NH Protein
O
Abb. 4: Einführung von Maleimid-Gruppen in Proteine mit Hilfe von MHS
Zur Modifikation von OVA- FITC wurde MHS (c= 17 mg / ml DMF) in einem 50fachen molaren Überschuß zugegeben. Zur Ermittlung der optimalen Konzentration an MHS wurde eine Verdünnungsreihe von 100- bis 25-fachen Überschuß eingesetzt. Der Reaktionsansatz wurde unter Lichtausschluß auf einer
Rollvorrichtung 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Abtrennung des
überschüssigen MHS vom aktivierten Protein erfolgte durch Gelfiltration über
eine Sephadex G-25 Säule (32 ml). Die das aktivierte Protein enthaltenden
Gipfelfraktionen wurden vereinigt, ggf. konzentriert (s 2.2.4) und nach
Sterilfiltration zu den SH-Gruppen tragenden Zellen bzw. dem ConA gegeben
(s. 2.2.5.4).
40
2.Methodik
_______________________________________________________________
Die Veränderung des rhIL-2 erfolgte wie oben beschrieben, wobei dieses in
einer Konzentration von 1 g/l in sterilem Wasser gelöst und mit 100-fachen
Überschuß an MHS versetzt wurde.
2.2.5.4 Gerichtete Synthese von Heterokonjugaten
Mittels heterobifunktioneller Kopplungsreagenzien lassen sich de novo reaktive
Gruppen, wie Thiolgruppen oder Maleimidgruppen, in Proteine einführen. Die
Bindung der Proteine an die Tumorzellen erfolgt über zwei unterschiedliche
kovalente Bindungen. Die mit Maleimid-Gruppen modifizierten Proteine reagieren mit den Sulfhydrylgruppen der Zellen bzw. des ConA unter Ausbildung
einer Thioetherbindung (s. Abb. 5), wohingegen die mit Pyridyldisulfid-Gruppen
aktivierten Proteine mit den SH-Gruppen der Zellen bzw. des ConA eine Disulfidbindung ausbilden (s. Abb. 6)
O
Protein
O
NH C R N
+
HS
S
Zelle
Zelle
O
O
Protein
NH
O
C R N
O
Abb. 5: Reaktion der mittels MHS eingeführten Maleimid-Gruppen der Proteine mit den
Sulfhydrylgruppen der Tumorzellen unter Ausbildung von Thioetherbindungen
41
2.Methodik
_______________________________________________________________
O
Protein
NH C CH2 CH2 S S
+ HS
Zelle
N
O
Protein
NH C CH2 CH2 S S
Zelle
Abb. 6: Reaktion der mittels SPDP eingeführten Pyridyldisulfid-Gruppen der Proteine mit den
Sulfhydrylgruppen der Zellen unter Ausbildung von Disulfidbindungen
2.2.5.4.1 Einführung von Heterokonjugaten direkt an Zellen
Zur Reaktion der eingeführten Gruppen wurden 106 sedimentierte, SH-Gruppen
tragenden Zellen (s. 2.2.5.1) in 1 ml PBS resuspendiert und mit dem jeweiligen
aktivierten Protein versetzt (s. 2.2.5.2 bzw. 2.2.5.3). Der Ansatz wurde über
Nacht bei Raumtemperatur oder bei 4°C inkubiert. Bei OVA-FITC - enthaltenden Ansätzen wurde diese Inkubation unter Lichtausschluß durchgeführt.
Um nicht gekoppeltes Protein zu entfernen, wurden die Zellen viermal 10 Minuten lang bei 100 x g zentrifugiert und die sedimentierten Zellen jeweils in 1 ml
PBS resuspendiert.
Danach wurde ein Aliquot zur Bestimmung der Zellzahl und der fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung entnommen.
Der überwiegende Teil der Zellsuspension wurde in sterilen 24-Depot-Gewebekulturplatten in Kultur gehalten und zu verschiedenen Zeitpunkten bezüglich
ihrer Fluoreszenz oder ihrer freigesetzten rhIL-2 - Menge (hier Ansätze von 0,5
x 106 Zellen in entsprechenden 500µl Medium) untersucht.
Dazu wurden die Zellsuspension aus den Depots in sterile 12 ml Röhrchen
überführt und die Zellen bei 100 x g zentrifugiert. Bei Kopplung von rhIL-2 an
42
2.Methodik
_______________________________________________________________
Zellen wurden aus den Überstände das von den Konjugaten freigesetzten rhIL2 quantitative bestimmt. Bei FITC-OVA markierten Zellen wurde ein Aliquot der
resuspendierten Zellen fluoreszenzmikroskopischen untersucht.
Die Zellen wurden erneut in 1 ml DMEM-Gebrauchsmedium in die Depots der
Gewebekulturplatten zurückgegeben.
2.2.5.4.2 Einführung von Heterokonjugaten an Zellen mittels ConA
ConA-Moleküle wurden über kovalente Bindungen mit Fluoreszein-markiertem
Protein bzw. IL-2 konjugiert. Bei der Inkubation von Zellen mit diesen Lösungen
von Heterokonjagaten bindet die ConA - Komponente an Zuckerkomponenten
der Glykokalyx der Zellen.
Zur Kopplung von Protein an ConA wurden die Probenpools aus den Gelfiltrationen (s. 2.2.6) gemischt und sofort mit 25 µl einer 0,1M EDTA-Lösung pro
Milliliter Gesamtansatz versetzt. Nach Konzentrierung mittels einer amicon Zelle (s. 2.2.4) auf weniger als 1/10 des Volumens der anschließend
verwendeten Gelfiltrationssäule, wurde dieser Ansatz für 20 h bei 4°C inkubiert.
Die Abtrennung des fertigen Konjugates von den unkonjugierten Edukten erfolgte durch Gelfiltration über eine Superose 12 prep - Säule (V = 98 ml).
Die das Heterokonjugat enthaltenden Gipfelfraktionen wurden vereinigt und
nach Sterilfiltration zu den Zellen gegeben. Nach 30 Minuten Inkubation bei 4°C
wurden die Zellen von dem ungebundenen Konjugat durch Zentrifugation getrennt.
Die weitere Aufarbeitung der Zellen erfolgte wie unter 2.2.5.4.1 beschrieben.
2.2.6 Gelfiltrations-Säulenchromatographie
Im Rahmen der Arbeit wurden die Säulenchromatographien mit einem „Fast
Protein Liquid Chromatography“ (FPLC) -Säule durchgeführt. Als Pufferlösung
diente PBS (S. 2.6), das vor der Benutzung entgast und durch Membranfilter
(Porengröße 0,22 µm) sterilfiltriert wurde.
43
2.Methodik
_______________________________________________________________
Tabelle 1: Übersicht der verwendeten Säulenmaterialien und ihrer Anwendung
Material
Partikelgröße
in µm
Sephadex G-25 20 - 80
1-5
Sephadex G-25 20 - 80
1-5
8,5 bzw
120
Superose 12
prep grade
1 - 300
98
30
Fraktionierungsbereich in kD
Gelbettvolumen
in ml
28
Verwendung
Trennung des
fluoreszinmarkierten Proteins
von FITC
Trennung des
aktivierten Proteins
von Kopplungsprotein
Trennung der
Proteinkonjugate
von unkonjugiertem Protein
Die nach Vereinigung zum Probenpool vorliegenden Ansätze wurden gegebenenfalls konzentriert. Dazu wurden Produkte der Firma amicon verwendet (s.
2.2.3 und 2.2.4).
2.2.7 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese zur Auftrennung von
Proteinen
Die Auftrennung der Proteine erfolgte unter denaturierenden Bedingungen in
einer diskontinuierlichn SDS-Polyacrylamidelektrophorese nach der Methode
von Laemmli (Laemmli, 1970). Die Elektrophoresen wurden in der Mini-Protean-Slab Cell-Apparatur der Firma BioRad durchgeführt. Die Trenngele hatten
Dimensionen von 84 x 50 x 1,5 mm und besaßen eine Endkonzentration von
0,375 M Tris-HCl (pH 8,8) und 0,1% SDS.
Das Sammelgel enthielt einen Anteil von 3 oder 5 Prozent an Polyacrylamid, mit
einer Endkonzentration von 0,125 M Tris-HCl (pH 6,8) und 0,1% SDS. Die
Wanderungsstrecke für die Proben durch das Sammelgel betrug 1 cm.
Zum Gießen der x%igen Trenn- bzw. y%igen Sammelgele wurden folgende Ansätze (ausreichend für zwei 1,5 mm dicke Minigele) pipettiert:
44
2.Methodik
_______________________________________________________________
Tabelle 2: Berechnung der einzusetzenden Mengen bei Bildung von Trenngel
und Sammelgel
x%iges Trenngel (15 ml)
(11,25 - 0,5 x) ml
3,75 ml
0,5 x ml
150 µl
100 µl
10 µl
y%iges Sammelgel (6 ml)
H2O
(4,37 - 0,2 y) ml
4xTrenngelpuffer
1,5 ml
Acrylamidstammlsg.
0,2 y ml
10% SDS
60 µl
10% APS
60 µl
TEMED
10 µl
H2O
4xSammelgelpuffer
Acrylamidstammlsg.
10% SDS
10% APS
TEMED
APS und TEMED wurden unmittelbar vor dem Gießen des Gels zugesetzt.
Nach dem Gießen wurde das Trenngel vorsichtig mit Wasser überschichtet.
Das überschichtete Wasser wurde abgegossen und verbliebenes Wasser
durch dickes Filterpapier vollständig entfernt. Nun wurde das Sammelgel gegossen. Die Polymerisation war nach 15 min abgeschlossen. Der Kamm wurde
unter Elektrophoresepuffer vorsichtig entfernt.
Die Proteinproben wurden mit Laemmli-Probenpuffer versetzt, zum Denaturieren 5 min auf 95°C erhitzt und anschließend im Eisbad gekühlt. Die
Elektrophorese erfolgte zunächst bei 100 V, während die Proben das
Sammelgel durchwanderten, danach wurde die Elektrophorese bei 200 V bis
zum Herauslaufen des Pyronin Y fortgesetzt.
Der benutzte SDS-6H Marker (Sigma) lieferte 205, 116, 97, 66, 45, 29 kDaBanden entsprechend den Proteinen Myosin (Kaninchen), β-Galaktosidase
(E.coli), Phosphorylase b (Kaninchen), BSA, Ovalbumin, Carboanhydrase.
2.2.8 Färben von Polyacrylamid-Gelen
Das zu färbende Gel wurde 2-3 Minuten in Fixierungslösung und dann 5-10
Minuten in Coomassie Brilliant Blue - Färbelösung geschwenkt. Nach Überführen in Entfärbelösung wurde das Gel bis zum Erreichen des gewünschten Kontrastes (über Nacht oder länger) in dieser Lösung geschwenkt.
45
2.Methodik
_______________________________________________________________
2.2.9 CTLL-2-Proliferationstest
Bei den CTLL-2-Zellen handelt es sich um eine Linie in vitro-proliferierender
muriner zytotoxischer T-Lymphozyten, die durch IL-2 zur Proliferation angeregt
werden können (s. Abb. 1). Maus-Lymphozyten lassen sich von humanem IL-2
stimulieren, obwohl nur etwa 60% strukturelle Homologie zwischen murinem IL2 und humanem IL-2 besteht (Thomas, 1994). Die Proliferationsaktivität und
das Überleben der CTLL-2-Zellen ist abhängig von der IL-2 - Konzentration in
dem die Zellen umgebendem Medium. Wird jeweils eine bestimmte Anzahl von
CTLL-2-Zellen in Medien mit unterschiedlichem rhIL-2-Konzentrationen eine
bestimmt Zeit lang kultiviert, ist die Anzahl vitaler Zellen nach Ablauf der Zeit
direkt proportional zur jeweiligen rhIL-2 - Konzentration in den Kulturgefäßen.
Die Anzahl lebender Zellen wird indirekt über die Bestimmung der Stoffwechselaktivität des Ansatzes ermittelt, indem der Zellsuspension eine Lösung
des gelben Tetrazoliumsalzes di-Methyl-thiazolyl-diphenyltetrazolium-bromid
(MTT) zugesetzt. Das MTT gelangt passiv über die Zellmembran in die Zellen
und wird in den Mitochondrien lebender Zellen umgesetzt. Dehydrogenasen in
den Organellen reduzieren das Tertrazoliumsalz. Es entsteht ein blaues
wasserunlösliches Formazan, das sich in den lebenden Zellen anreichert. Die
Menge an Formazan, die in einer CTLL-2-Suspension innerhalb eines bestimmten Zeitraumes gebildet wird, ist proportional zur absoluten Zahl der lebenden
Zellen. Durch Zugabe einer Lösung aus SDS in HCl werden die Zellen lysiert
und das freigesetzte Formazan löst sich. Die Extinktion der blauen Lösung wird
bei einer Wellenlänge von 550 nm bestimmt. Sie ist proportional zur Anzahl der
lebenden Zellen im Ansatz, die wiederum proportional ist zur Konzentration an
biologisch wirksamen IL-2 im Medium, in dem die Zellen zuvor inkubiert worden
sind. Durch Einsetzen von Proben einer Verdünnungsreihe aus einer rhIL-2Standardlösung in den Test kann durch die Messung der Extinktion des
Formazans die rhIL-2-Konzentration unbekannter Lösungen ermittelt werden. In
diesem Testverfahren ist die selektive Bestimmung von biologisch aktiven rhIL2-Molekülen möglich
Bei der Durchführung wurden die zu untersuchenden Proben und die als
Standard dienende rhIL-2 Lösung mit einem rhIL-2-Gehalt von 100U/ml in
46
2.Methodik
_______________________________________________________________
RPMI-Gebrauchsmedium verdünnt (Proben: 1:3, 1:10, 1:30 etc.; Standard: 090 U/ml). Jede Verdünnung wurde dreifach in den Depots einer sterilen 96Depot-Gewebekultur angesetzt, wobei das Gesamtvolumen eines Verdünnungsansatzes jeweils 90 µl betrug. Mit Ausnahme von 3 - 6 Depots, die 100 µl
Gebrauchsmedium enthielten (Kontrolle für unspezifischen MTT-Umsatz),
wurden in jedes Depot 20000 Zellen in 10 µl RPMI-Gebrauchsmedium gegeben. Nach 48 h Inkubation der Ansätze im Brutschrank bei 37°C, 5% CO2 und
98% relativer Luftfeuchtigkeit wurden pro Depot 10 µl der MTT-Lösung
zugegeben. Nach weiteren vier Stunden Inkubation, wurden die Ansätzen mit
jeweils 100 µl einer 10%igen SDS -Lösung versetzt und diese noch einmal über
Nacht bei Raumtemperatur oder 37°C inkubiert.
Dann wurde die Extinktion der Formazanlösungen in den Depots bei 550 nm im
Acht-Kanal-Photometer gemessen.
2.2.10 Arbeiten am FACScan
In dieser Arbeit konnten verschiedene mit FITC-markierte Zellen unter zu Hilfenahme der Durchflußzytometrie charakterisiert werden. Dabei werden mit Hilfe
eines optischen Meßsystems die Streulicht- und Fluoreszenzsignale einzelner
in einem Flüssigkeitsstrom fokussierter Partikel analysiert. Der Schwerpunkt der
Messung liegt dabei nicht bei der Zählung von Zellen, sondern bei der analytischen Charakterisierung heterogener Zellsysteme.
Zur Untersuchung mittels FACScan wurde OVA-FITC an Zellen gekoppelt.
Dazu wurden Zellsuspensionen mit einer Konzentration von 1 x 106 Zellen / ml
hergestellt.
Untersucht wurden jeweils Proben von Zellen mit Kopplungprodukt aus ConA /
SAMBA und OVA-FITC / MHS und Zellen / SAMBA mit OVA-FITC / MHS (s.
2.2.5).
47
3.Ergebnisse
_______________________________________________________________
3. ERGEBNISSE
Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, zu untersuchen, ob rekombinantes
humanes Interleukin-2 (rhIL-2) mittels heterobifunktioneller Linker an Tumorzellen gebunden werden kann.
Zum Erreichen dieses Ziels sollte rhIL-2 über Thioether- bzw. Disulfidbindung
kovalent an Zellen gebunden werden. Zusätzlich sollten Konjugate aus rhIL-2
und Tumorzellen hergestellt werden, ohne - wie bei der direkten kovalenten
Kopplung - die Membranproteine zu modifizieren. Mittels dieser Versuchsansätze wird verhindert, daß durch die Manipulation der Membranproteine ihre
potentiellen tumorassoziierten Transplantatantigene zerstört werden. Dazu
sollten aus dem Lektin ConcanavalinA (ConA) und aus rhIL-2 wiederum mittels
heterobifuntioneller Linker Heterokonjugate erstellt werden, die in der Lage sein
sollten, über den Lektinanteil direkt an Strukturen der Glykokalix von Zellen zu
binden und rhIL-2 freizusetzen. Schließlich sollte die Freisetzung von biologisch
aktivem IL-2 über einen Zeitraum von mehrern Wochen nach Kopplung an
einem der verschiedenen Ansätze gezeigt werden.
In den zunächst durchgeführten Vorversuchen diente mit Fluoresceinisothiocyanat markiertes Ovalbumin als Modellsubstanz für das rhIL-2.
- Im ersten Abschnitt ist die Einführung reaktiver Gruppen in Proteine beschrieben (3.1).
- Der zweite Abschnitt enthält die bei der Herstellung der Konjugate von OVAFITC an Tumorzellen erzielten Ergebnisse (3.2), einschließlich der
Charakterisierung mittels Durchflußzytometrie (3.2.3).
- Die Ergebnisse, die bei der Kopplung von IL-2 an Tumorzellen erzielt wurden,
werden im dritten Abschnitt beschrieben (3.3).
48
3.Ergebnisse
_______________________________________________________________
3.1 Einführung reaktiver Gruppen in Proteine
3.1.1 Modifizierung von OVA mit FITC bzw. TRITC
In Vorversuchen wurde Ovalbumin-FITC bzw. -TRITC als Modellsubstanz für
das später einzusetzende rhIL-2 verwendet. Durch den fluoreszierenden Anteil
konnten zellgebundene Heterokonjugate mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie
nachgewiesen werden. Nach Fluoreszein-Markierung von OVA mit Hilfe von
Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) und Tetramethylrhodamine B Isothiocyanat
(TRITC) (s. 2.2.2) wurde durch fotometrische Messungen der Protein- und
Fluoreszeinkonzentrationen der molare Fluoreszein/Protein-Quotient (F/P-Quotient) und die Proteinkonzentration bestimmt (s. 2.2.3). Die ermittelten molaren
F/P-Quotienten lagen im Bereich von 1,9 : 1 bis 3,0 :1 für FITC-markiertes OVA.
Für TRITC-markiertes OVA wurde ein Quotient von 1,4 :1 bestimmt.
3.1.2 Modifizierung von OVA-FITC (bzw. IL-2) mit MHS
Mit Hilfe des heterobifunktionellen Linkerreagenzes MHS wurden MaleimidGruppen in Fluoreszein-OVA- Moleküle eingeführt (s. 2.2.5.3). Die Elutionsprofile (s. Abb. 7), die bei der Abtrennung des aktivierten Proteins vom Überschuß
an Linkerreagenz durch Gelfiltration über eine Sephadex G 25-Säule (32 ml)
aufgezeichnet wurden, zeigten bei einer Wellenlänge von 280 nm zwei Maxima.
Das erste entsprach dem mit MHS aktivierten OVA-FITC, das zweite dem bei
der Acylierungsreaktion freiwerdenden NHS. Da MHS bei einer Wellenlänge
von 280 nm keine Absorption zeigte, konnten die Elution des unverbrauchten
Reagenzes bei dieser Wellenlänge nicht verfolgt werden.
Bei Reaktion von IL-2 und MHS, ergab sich ein ähnliches Elutionsprofil (s. Abb.
8). Das höhere zweite Maximum kam durch den Überschuß an MHS und dadurch gebildeten NHS zustande. Die Fraktionen, die nach der OD-Messung nur
das Kopplungsprodukt enthielten, wurden vereinigt. Es handelte sich dabei um
ein Poolvolumen von 2 - 17 ml.
49
3.Ergebnisse
_______________________________________________________________
OD280
2
1,5
1
0,5
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Durchflußvolumen [ml]
Abb. 7: Repräsentatives Elutionsprofil, das bei der Abtrennung des MHS bzw. des
entstandenen NHS vom modifizierten OVA-FITC aufgezeichnet wurde
OD280
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14
Durchflußvolumen [ml]
Abb. 8: Repräsentatives Elutionsprofil, das bei der Abtrennung des MHS bzw. des
entstandenen NHS vom modifizierten IL-2 aufgezeichnet wurde
50
3.Ergebnisse
_______________________________________________________________
3.1.3 Modifizierung von OVA-FITC mit SPDP
Mit Hilfe des heterobifunktionellen Linkerreagenzes SPDP wurden Pyridyldisulfid -Gruppen in OVA- Fluoreszein Moleküle eingeführt. Das Elutionsprofil (s.
Abb. 9), das bei der Abtrennung des aktivierten Proteins vom Überschuß an
Linkerreagenzien durch Gelfiltration über eine Sephadex G 25-Säule (V = 120
ml) aufgezeichnet wurde, zeigte bei einer Wellenlänge von 280 nm mehrere
Maxima. Das erste entsprach dem Kopplungsprodukt, das im Ausschußvolumen der Säule aufgrund seiner Größe zu finden war. Weitere Maxima wurden
verursacht durch überschüssiges SPDP.
OD280
1
0 ,8
0 ,6
0 ,4
0 ,2
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
10 0 110 12 0 13 0 14 0 15 0 16 0 17 0 18 0 19 0 2 0 0
Durchflußvolumen [ml]
Abb. 9: Repräsentatives Elutionsprofil, das bei der Abtrennung des überschüssigen SPDP vom
modifizierten OVA-FITC aufgezeichnet wurde.
3.1.4 Modifizierung von ConA mit SAMBA
Mit Hilfe des heterobifunktionellen Linkerreagenzes SAMBA wurden in ConAMoleküle SH-Gruppen eingeführt (s. 2.2.5.1). Nach Inkubation und Aktivierung
51
3.Ergebnisse
_______________________________________________________________
mittels Hydroxylamin und EDTA erfolgte die Fraktionierung des Kopplungsansatzes mittels FPLC über eine Sephadex G25 - Säule (32ml).
Das Elutionsprofil zeigte bei einer Wellenlänge von 280 nm zwei Maxima (s.
Abb. 10). Das erste, hohe Maximum (19 ml) lag im Ausschlußvolumen der
Säule, das zweite, niedrigere Maximum lag bei etwa 35 ml. Das modifizierte
ConA war in den Fraktionen des ersten Maximums enthalten.
0,8
OD280
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Durchflußvolumen [ml]
Abb. 10: Repräsentatives Elutionsprofil das bei der Abtrennung des überschüssigen SAMBA
vom modifizierten ConA aufgezeichnet wurde.
3.2 Untersuchungen zur Kopplung von Proteinenen an Tumorzelllen
3.2.1 Kovalente Kopplung von modifiziertem OVA-FITC an reaktive
Zellen
An die mit SH-Guppen versehenen Zellen (s. 2.2.5.1) wurde entweder über
eine Thioetherbindung oder über eine Disulfidbrücke, das entsprechend modifizierte Protein gebunden (s. 2.2.5.4).
52
3.Ergebnisse
_______________________________________________________________
3.2.1.1 Kopplung von MHS-modifiziertem OVA-FITC an mittels SAMBA
aktivierte Zellen
Bei der Kopplung über Thioetherbindung, wurden verschiedene Ansätze getestet.
Tabelle 3:
Probennummer
1
2
3
4
5
6
7
8
9
FITC-OVA
+
+
+
+
-
+
+
+
+
-
-
-
-
+
+
+
+
+
-
+
-
+
+
-
+
-
2 mg (in 1ml H2O)
Iodacetat
7,6 mg (in 1ml H2O)
PBS (2 ml)
(3ml)
+
(3ml)
+
-
+
-
-
+
-
+
-
1h Inkubation,
Fraktionierung über
FPLC
+
-
+
-
-
+
-
+
-
Tumorzellen
+
+
+
+
+
+
+
+
+
SAMBA
+
+
-
-
-
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+++
(+)
-
-
-
+++
(+)
-
-
MHS
(0,5 mg in 30 µl DMF)
1x106 in 1ml PBS
(12 mg in 50µl DMF)
1h Inkubation, Zentrifugation,
Zugabe von EDTA
und Hydroxylamin
Auswertung am
Fluoreszenzmikroskop
Bei der Auswertung zeigte sich bei den Proben 1 und 6 eine deutliche und
gleichmäßige Markierung der Zellen. Auch bei den Proben 2 und 7 wurden
Zellen mit FITC markiert. Im Gegensatz zu den Proben 1 und 6 wurde hier allerdings keine gleichmäßige Markierung beobachtet. Auch war insgesamt die
Fluoreszenzintensität um ein Vielfaches geringer. Des weiteren zeigte sich bei
der mikroskopischen Auswertung kein Unterschied zwischen den Ansätzen mit
bzw. ohne Iodacetat, deshalb wurde in den weitern Versuchen auf die Zugabe
von Iodacetat verzichtet.
53
3.Ergebnisse
_______________________________________________________________
In verschiedenen Versuchsansätzen wurde die optimale Konzentration an MHS
(s. 2.2.5.3) und SAMBA (s. 2.2.5.1) untersucht. Zudem wurde das alternative
Kopplungsprodukt OVA-TRITC im Vergleich zum OVA-FITC getestet (s. 2.2.2).
3.2.1.1.1 Auswirkung der MHS-Konzentration auf die Kopplung von MHS
behandeltem OVA-FITC an SH-Gruppen-tragende Zellen
Zur Bestimmung einer optimalen Konzentration des eingesetzten MHS wurde
eine Verdünnungsreihe erstellt. Die Ausgangskonzentration an MHS entsprach
(nach der Arbeit von Ishikawa et al.,1983) einem 25-fachen molaren Überschuß
zum OVA-FITC (s. 2.2.5.3). Untersucht wurden ein 50 -, 75 - und 100-facher
Überschuß an MHS.
Bei allen Versuchsansätzen zeigte sich in der fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung eine gleichmäßige und intensive Fluoreszenz der präparierten
Zellen mit deutlicher Randsaumbetonung. Bei der Negativkontrolle (keine Zugabe von MHS) zeigte sich nur eine schwache Fluoreszenz der Zellen bei
relativ hohem Hintergrund. Auffallend war zudem die mangelnde Einheitlichkeit
der Färbung bei diesem Versuchsansatz (s. Tabelle 3).
3.2.1.1.2 Auswirkung der SAMBA-Konzentration auf die Kopplung von MHSbehandeltem OVA-FITC an SH-Gruppen-tragende Zellen
Für die Reaktion wurde die optimale Konzentration an SAMBA ermittelt. Dazu
wurden zu 1x106 Zellen 50 µl SAMBA mit einer Konzentration von 2,4 mg/ml
bis 2,4 x 10-3 mg/ml gegeben. Die in der Literatur vorgeschlagene Menge betrug 0,24 mg SAMBA in 100µl Dimethylformamid (DMF) zu 1 x 106 Zellen
(Ishikawa et al., 1983). Die von Reimer (1994) genutzte Konzentration betrug
24 mg SAMBA in 100µl DMF zu 1 x 106 Zellen. Bei der fluoreszenzmikroskopischen Auswertung zeigte sich, daß mit abnehmender SAMBA-Konzentration,
die Zellen unregelmäßiger markiert wurden und der Anteil an Zellfragmenten
erheblich zunahm.
54
3.Ergebnisse
_______________________________________________________________
3, 14 und 28 Tage nach der Kopplung wurde ein Aliquot der Zellen entnommen
und nach Zentrifugation und Waschen mit PBS erneut mikroskopisch untersucht. Bei diesen Untersuchungen zeigte sich, daß mit abnehmender SAMBA Konzentration der Anteil an Zelltrümmern im Vergleich zur Gesamtzellzahl
zunahm, je weiter die Kopplung zurücklag. Im Gegensatz zu den geringen
Konzentrationen, nahm bei dem Ansatz mit 24 mg SAMBA pro 1 x 106 Zellen
der Anteil der markierten Zellen weniger schnell ab. Außerdem erschienen
diese Zellen weiterhin intakt.
Bei weiteren Versuchen zeigte die fluoreszenzmikroskopische Auswertung
eines entsprechenden Ansatzes nach 8 Wochen einige Zellen mit nur noch geringer Rate an Fluoreszenz und einen hohen Anteil an weiterhin gut fluoreszierenden Zellen.
Abb. 11: Repräsentative mikrofotografische Wiedergabe der mit dem Fluoreszenzmikroskop bei
40 x 10-facher Vergrößerung betrachteten Zellpräparation bei 50-fachem molaren Überschuß
an MHS und 24 mg SAMBA pro 1x106 Zellen
55
3.Ergebnisse
_______________________________________________________________
3.2.1.1.3 Kopplung von Maleimid-Gruppen-tragendem OVA-TRITC an SHGruppen-tragende Zellen
Die Bindung von TRITC an Ovalbumin erfolgte entsprechend der Kopplung von
FITC an Ovalbumin (s. 2.2.2). Die Kopplung des OVA-TRITC an Zellen über
eine Thioetherbindung wurden nach der o.g. Vorschrift durchgeführt (s.
2.2.5.3). Anstelle des genannten OVA-FITC wurde OVA-TRITC als Kopplungsedukt eingesetzt. Die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung zeigte, daß die
Kopplung auch hier erfolgreich war. Allerdings war die Floureszenz so
schwach, daß eine mikrofotografische Dokumentation nicht möglich war.
3.2.1.2 Kopplung von SPDP-modifiziertem OVA-FITC an mittels SAMBA
aktivierte Zellen
Für diese Kopplung wurden nach Herstellung des mit SH-Gruppen modifizierten OVA-FITC (s. 2.2.5.2) und nachfolgender Gelfiltration (s. 2.2.6), die vereinigten Fraktionen sterilfiltriert und zu den mit SH-Gruppen modifizierten Zellen
gegeben (s. 2.2.5.1). Dabei wurden zwei verschiedene Konzentrationen an
SAMBA (24 mg bzw. 0,24 mg SAMBA zu jeweils 1 x 106 Zellen) getestet.
Bei der fluoreszenzmikroskopischen Auswertung konnten bei beiden Konzentrationen viele fädige Strukturen, die stark fluoreszierten beobachtet werden.
Bei der hohen SAMBA-Konzentration waren diese Strukturen besonders zahlreich und die Zellen waren einheitlich stark markiert. Bei der niedrigen Konzentration konnten weniger der oben beschriebenen Strukturen beobachtet werden. Zudem war eine weniger einheitliche Markierung der Zellen zu sehen.
Nach vier Tagen waren bei hoher Konzentration viele fluoreszierende Zelltrümmer zu sehen und der Anteil an intakten Zellen war geringer. Auch bei der
niedrigeren Konzentration konnte eine Vielzahl an Trümmern und fluoreszierenden fädigen Strukturen beobachtet werden, aber der Anteil an intakten
markierten Zellen war höher.
56
3.Ergebnisse
_______________________________________________________________
Abb. 12: Mikrofotografische Wiedergabe der mit dem Fluoreszenzmikroskop bei 40 x 10-facher
Vergrößerung betrachteten Zellpräparation nach Reaktion von OVA-FITC und SPDP und
Kopplung an mit SH-Gruppen (SAMBA, 24 mg/100 µl) versehenen Zellen.
3.2.2 Kopplung von ConA an OVA-FITC über verschiedene heterobifunktionelle Linker und Adhäsion an Zellen
Am Anfang dieser Versuchsreihe standen Versuche, in denen ConA-FITC ohne
Einführung von heterobifunktionellen Linkern zu den Zellen gegeben (zu 1 x 106
Zellen 0,2 mg bzw. 0,4 mg ConA-FITC) wurde, um eine Kopplung von ConA an
Zellen nachzuweisen.
Nach Inkubation und dreimaligem Waschen wurden die Zellen lichtmikroskopisch untersucht. Dabei zeigten sich im Durchlicht viele Zellhaufen. Die fluoreszenzmikroskopische Aufnahme war nur bedingt auswertbar. Es konnten neben
markierten Zellen, viele unmarkierte Zellen und eine große Anzahl teilweise
57
3.Ergebnisse
_______________________________________________________________
markierter Zelltrümmer beobachtet werden. Die Fluoreszenzrate pro Zelle war
geringer als bei den unter 3.2.1 beschriebenen Ansätzen.
Am 3. und 7. Tage nach der Kopplung wurde ein Aliquot der Zellen entnommen
und nach Zentrifugation und Waschen mit PBS erneut mikroskopisch untersucht. Dabei konnte ein weiteres Abnehmen der Fluoreszenz beobachtet werden.
Da die Kopplung prinzipiell erfolgreich war, sollte in den nächsten Schritten dieser Versuchsansatz optimiert werden. Dazu sollten OVA-FITC-Moleküle, die mit
MHS oder SPDP, und ConA-Moleküle, die mit SAMBA modifiziert worden
waren, miteinander reagieren. Das heißt, es sollten Heterokonjugate entstehen,
in denen die beiden Proteine über Thioetherbindungen (3.2.2.1) bzw. über
Disulfidbindungen (3.2.2.2) kovalent verknüpft waren. Anschließend erfolgte die
Kopplung dieser Produkte an Zellen, wobei die starken adhäsiven Kräfte
zwischen ConA und Zellwänden ausgenutzt wurden.
3.2.2.1 SAMBA-ConA / OVA-FITC - MHS an Zellen
Nach Abtrennung des aktivierten Proteins vom Überschuß an Linkerreagenz
durch Gelfiltration (s. 3.1.2 und 3.1.4) wurden die Ansätze vermischt, mit EDTA
versetzt und nach Konzentration inkubiert. Die Abtrennung der ungekoppelten
Edukte erfolgte über eine Superose 12 prep - Säule (98 ml). Das bei der Fraktionierung des Kopplungsgemisches aufgezeichnete Elutionsprofil (s. Abb. 13),
zeigte drei Maxima. Das erste Maximum war deutlich ausgebildet und lag bei
einem Elutionsvolumen von 34 ml. Die Proteine in diesen Fraktionen besaßen
apparente relative Molekülmassen von über 300 kDa, entsprechend dem Ausschlußvolumen der verwendeten Superose 12 prep -Säule. Das Kopplungsprodukt wurde dementsprechend in diesen Fraktionen erwartet. Ungekoppeltes
OVA-FITC - MHS bzw. ConA-SAMBA war in dem unten gezeigten Elutionsprofil
mit der gewählten Auflösung nicht mehr nachweisbar.
58
3.Ergebnisse
_______________________________________________________________
OD280
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Durchflußvolumen [ml]
Abb. 13: Repräsentatives Elutionsprofil, das bei der Abtrennung des OVA-FITC - MHS bzw. des
ConA-SAMBA vom Kopplungsprodukt aufgezeichnet wurde
Abb. 14: Mikrofotografische Wiedergabe der mit dem Fluoreszenzmikroskop bei 40 x 10-facher
Vergrößerung betrachteten Zellpräparation nach Kopplung von SAMBA-ConA / OVA-FITC MHS und Adhäsion an Zellen
59
3.Ergebnisse
_______________________________________________________________
Die fluoreszenzmikroskopischen Bilder zeigten eine deutlich schwächere
Floureszenz als bei direkter kovalenter Kopplung von OVA-FITC über Thioetherbindung an die Tumorzellen. Deutlich wurde auch der stärker ausgeprägte
Randsaum und die verminderte Internalisierung. Weiterhin fiel auf, daß der
Anteil von Zellhaufen bei den Versuchsansätzen mit ConA zugenommen hatte.
3.2.2.2 SAMBA-ConA + OVA-FITC - SPDP an Zellen
Entsprechend der Kopplung von MHS-aktiviertem OVA-FITC an SAMBA-ConA,
wurden auch bei diesen Ansätzen nach Abtrennung des aktivierten Proteins
vom Überschuß an Linkerreagenz durch Gelfiltration (s. 3.1.3 und 3.1.4), die
Ansätze gemischt, mit EDTA versetzt und konzentriert. Dabei konnte schon
beim Mischen der beiden Ansätze eine Ausfällung von gelben fädigen Strukturen und eine gelbe Anfärbung des Filters bei Konzentrierung beobachtet werden. Das nach Konzentrierung und Inkubation erhaltene Produkt, wurde vor
dem Auftragen auf die Säule filtriert und zur Abtrennung von den ungekoppelten Edukte über eine Superose 12 prep - Säule (98ml) gegeben. Bei der Fraktionierung des Kopplungsgemisches ergab sich das u.g. Elutionsprofil (s. Abb.
15).
OD 280
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Durchflußvolumen [ml]
Abb. 15: Elutionsprofil, das bei der Abtrennung des OVA-FITC - SPDP bzw. des ConA-SAMBA
vom Kopplungsprodukt aufgezeichnet wurde.
60
3.Ergebnisse
_______________________________________________________________
Bei den Fraktionen, in denen das Kopplungsprodukt erwartet wurde (Teil des
Ausschlußvolumens bei 40 ml), zeigte sich nur ein Elutions-Maximum von geringer Intensität. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und mit
Zellen inkubiert (s. 2.2.5.4.2).
Die fluoreszenmikroskopische Auswertung zeigte am Tag der Kopplung Zellen,
die zum überwiegenden Teil nicht markiert waren. Nach 8 Tagen war auch
diese schwache Markierung nicht mehr zu beobachten.
3.2.3 Untersuchung verschiedener Kopplungsprodukte von OVAFITC an Zellen mit Hilfe des FACScans
Die Untersuchung von Zellsuspensionen mittels FACScan ermöglicht eine Aussage bezüglich der Fluoreszenzintensität der mit OVA-FITC gekoppelten
Zellen.
Untersucht wurden jeweils Proben von ungekoppelten Zellen, von Zellen, an
die mittels Adäsionskräfte OVA-FITC gekoppelt worden war (s. 3.2.2.1) und von
Zellen, bei denen die Bindung von OVA-FITC kovalent erzeugt worden war (s.
3.2.1.1).
Das Histogramm (s. Abb. 16) zeigte drei Peaks, die den ungekoppelten und den
wie oben beschrieben gekoppelten Zellen entsprachen. Die Histogrammstatistik der einzelnen Peaks ergab eine mittlere Fluoreszenz-intensität von
3,74 bei den ungekoppelten Zellen, 722,32 bei den über Adhäsionskräfte gekoppelten Zellen und von 7336,53 bei den kovalent veränderten Zellen.
61
3.Ergebnisse
_______________________________________________________________
Abb. 16: Histogramm der FACScan-Untersuchung von ungekoppelten Zellen
(X63AG8.653.001), OVA-FITC - Kopplung an Zellen mittels Adhäsion über ConA
(X63AG8.653.002) und OVA-FITC - Kopplung an Zellen über kovalente Bindung
(X63AG8.653.003)
3.3 Untersuchungen zur Kopplung von IL-2 an Tumorzellen
3.3.1 Reaktion von MHS mit IL-2 und Kopplung an SAMBA-behandelte Zellen
Für die Verwendung der rhIL-2-Tumorzell-Konjugate als Tumorvakzine ist es
wesentlich, daß die biologische Aktivität des rhIL-2 nach Modifizierung mit MHS
und nach Kopplung an die Tumorzellen zumindest teilweise erhalten bleibt. Im
Rahmen dieser Doktorarbeit wurde mit Hilfe des CTLL-2-Proliferationstests
untersucht, inwieweit die IL-2 gekoppelten Zellen während der nachfolgenden
mehrwöchigen Inkubation biologisch aktives IL-2 abgaben.
62
3.Ergebnisse
_______________________________________________________________
Aufgrund der vorigen Ergebnisse wurde entschieden, daß dieser Test im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit nur an einem Kopplungsprodukt durchgeführt werden sollte. Dazu wurde der Ansatz ausgewählt, bei dem das Produkt
aus der Reaktion von IL-2 mit MHS an mit SAMBA modifizierte Zellen gekop-pelt wurden.
3.3.1.1 Bestimmung der IL-2 - Konzentration
Mittels CTLL-2-Proliferationstest (s. 2.2.9) wurde zu verschiedenen Zeitpunkten
nach der o.g. Kopplung von IL-2 an Tumorzellen die Menge an freigesetztem
biologisch aktivem IL-2 bestimmt.
Es wurden zwei Ansätze mit unterschiedlicher SAMBA-Konzentrationen (6 mg
bzw 0,06 mg zu jeweils 0,5 x 106 Zellen) präpariert. Die Zellen wurden nach der
Kopplung und den nachfolgenden Waschschritten (s. 2.2.5.4.1), in jeweils
500µl Medium aufgenommen. Zur Bestimmung der IL-2 - Konzentration wurden
die Zellen zentrifugiert, in Puffer gewaschen und in 500 µl DMEM-Medium resuspendiert. Für den CTLL-2-Proliferationstest wurde vom Überstand eine Verdünnungsreihe erstellt. In Abbildung 17 sind die mit Hilfe des CTLL-2-Proliferationstests ermittelten prozentualen biologischen Aktivitäten des in den Überständen befindlichen rhIL-2, bezogen auf die biologische Aktivität von nicht
modifiziertem rhIL-2 (100%) zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Kopplung
dargestellt.
63
3.Ergebnisse
_______________________________________________________________
IL-2 [%]
100
80
60
1:10
1:1000
40
20
Ausgangswert
22
.2
.
8.
2.
18
.1
.
11
.1
.
23
.1
2.
16
.1
2.
12
.1
2.
0
Datum
Abb. 17: Prozentuale biologische Aktivitäten des in den Überständen befindlichen rhIL-2 bezogen auf die biologische Aktivität von nicht modifiziertem rhIL-2 (100%) zu unterschiedlichen
Zeitpunkten nach Kopplung
Wie aus dem Diagramm zu entnehmen ist, kam es in einem Zeitrahmen von 6
Wochen zu einer sukzessiven Abnahme der Konzentration an aktivem Interleukin im Überstand der Zellkultur. Die Werte gingen von 140 IE/ml auf mit der
verwendeten Methode nicht mehr meßbare Werte zurück.
3.3.2 Reaktion von SPDP mit IL-2
Entsprechend der o.g. (s. 3.2.1.2) Kopplung von SPDP-modifiziertem OVAFITC an mittels SAMBA aktivierte Zellen, sollte ein Kopplungsprodukt mit IL-2
erstellt werden.
Dazu wurde IL-2 und SPDP unter Schütteln inkubiert (s. 2.2.5.2). Zur Abtrennung ungekoppelter Moleküle vom Kopplungsprodukt sollte die sterilfiltrierte Lösung mittels Gelfiltration fraktioniert werden. Dabei wurde beobachtet, daß bei
der Inkubation von IL-2 und SPDP fädige, weiße Strukturen entstanden. Bei
64
3.Ergebnisse
_______________________________________________________________
Gelfiltration der sterilfiltrierten Lösung konnte kein eindeutiger Peak im Ausschußvolumen ermittelt werden. Es stand damit kein SH-Gruppen - tragendes
IL-2 zur Verfügung, das zur Kopplung an die vorbereiteten Zellen genutzt
werden konnte. Ein Aliqout des nicht-filtrierten Kopplungsproduktes wurde
mittels SDS-PAGE fraktioniert und untersucht.
3.3.2.1 Untersuchung der IL-2 - SPDP-Kopplungsprodukte mittels SDSPAGE
Zur Untersuchung der IL-2 - SPDP-Kopplungsprodukte wurden Aliquots des
Produktes für die SDS-PAGE vorbereitet. Es wurden Proben
(Ausgangskonzentration 0,9 µg IL-2/µl Lösung) mit 8 µl und 12 µl des gekoppelten Ansatzes und mit 4 µl (= 4 µg) des ungekoppelten IL-2 ohne Zusatz von
DTT vorbereitet. Zusätzlich wurden 10µl des gekoppelten Ansatzes mit DTThaltigem Probenpuffer versehen, aufgekocht und aufgetragen.
Abb. 18: Analyse der IL-2 - SPDP-Kopplungsprodukte durch SDS-PAGE und anschließende
Färbung des Gels mit Coomassie Brilliant Blue. Der Pfeil in der Spur 4 markiert das
Interleukin-2 - Dimer. Spur 1 und 2: nicht denaturierte Ansätze, Spur 3 unverändertes
Interleukin-2 als Kontrolle, Spur 5 Molekulargewichtsmarker.
65
3.Ergebnisse
_______________________________________________________________
Das Coomassie-blue - gefärbte Gel zeigte in den nicht-denaturierten Ansätzen
(Spuren 1 und 2) Banden, die dem Interleukin-Monomer, -Trimer und -Tetramer
entsprechen könnten. Im denaturierten Ansatz (Spur 4) war neben dem Interleukin-Monomer nur noch eine schwächer ausgeprägte Bande, die dem Interleukin-Dimer entsprechen könnte, zu sehen. In allen Spuren war etwa auf der
Höhe von 25 kD eine scharf begrenzte Bande zu sehen, die als ein Artefakt
betrachtet werden muß.
66
4.Diskussion
_______________________________________________________________
4. DISKUSSION
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine Tumorvakzine herzustellen, die aus
Tumorzellen besteht, an die rekombinantes humanes IL-2 gekoppelt worden ist.
Diese Versuche sind im Rahmen von Therapieansätzen zu sehen, bei denen
Patienten mit Nierenzellkarzinom mit/gegen autologe Tumorzellen vakziniert
werden. Die hier angewendete Methode (Aktive Spezifische Immunisierung)
beruht auf Arbeiten von Cassel et al. (1983) und Schirrmacher et al. (1989). Bei
diesem Ansatz werden die intakten, lebenden Tumorzellen, die durch enzymatische Desintegration des Primärtumorgewebes eines Patienten gewonnen
werden, mit einem human-apathogenen Virus, dem Hühner-pathogenen Newcastle-Disease-Virus, inkubiert. Die derart behandelten Tumorzellen werden
dann durch ionisierende Strahlung (100 Gy) abgetötet und dem Patienten zur
Vakzinierung intradermal appliziert.
Das Virus bindet über Hämagglutinin-Neurominidase und ein Fusionsprotein an
Rezeptoren der Tumorzell-Oberfläche und verfremdet (xenogenisiert) sie dadurch. Zusätzlich hat das Virus eine stark immunmodulatorische Wirkung. Das
hat zur Folge, daß Zellen des Immunsystems zunächst Antigene des Virus als
fremd erkennen und eine Immunantwort gegen diese einleiten (second signal
theory). Es wird davon ausgegangen, daß im so stimulierten Immunsystem
dann auch eine Immunantwort gegen die Tumorzelle selbst ausgelöst wird. Die
Wirksamkeit dieses Konzeptes der aktiven spezifischen Immunisierung beim
Menschen konnte u.a. von der Arbeitsgruppe Falkenberg nachgewiesen
werden (Hinkel, 1995; Repmann et al., 1997).
Zur weiteren Stimulation der Immunantwort wird rhIL-2 eingesetzt (Rosenberg
et al., 1987), indem das Zytokin lokal, zusammen mit den abgetöteten autologen, NDV-beladenen Tumorzellen injiziert wird. Von Pomer konnte gezeigt
werden, daß Patienten mit Nierenzellkarzinom auf eine Tumorvakzine, die mit
IL-2 zusammen verabreicht wird, mit einer verstärkten Hautreaktion antworten
67
4.Diskussion
_______________________________________________________________
(Pomer et al.,1995). Diese Hautreaktion wird als delayed type hypersensitivityReaktion (DTH) bezeichnet. Sie entsteht dadurch, daß bei der intradermalen
Applikation der Vakzine, an der Einstichstelle in wenigen Stunden eine Entzündungsreaktion zu beobachten ist. Diese Hautreaktion wird von T-Lymphozyten
ausgelöst, die gegen den Tumor sensibilisiert sind und bei erneutem Kontakt
mit ihrem Antigen Zytokine ausschütten, damit andere Zellen, insbesondere
zytotoxische T-Zellen, rekrutieren und aktivieren. Die DTH gilt daher als Maß für
die zelluläre Immunreaktion auf die autologe Tumorzellvakzine. (ZangemeisterWittke et al., 1989)
Die Beseitigung vitaler Tumorzellen ist ein Prozeß, der durch tumorspezifische
CTL-Lymphozyten vermittelt wird. IL-2, in der Regel von aktivierten TH-Lymphozyten sezerniert (s. Abb. 1), ist ein Proliferations-Signal für tumorspezifische TCLymphozyten. Vakzinen, die rhIL-2 und bestrahlte Tumorzellen enthalten, sollten demnach besonders geeignet sein, eine protektive Tumor-Immunität bei
den Empfängern zu erzeugen.
Freies rhIL-2 besitzt nach der Injektion nur eine sehr geringe Halbwertzeit. Die
kleinen Zytokinmoleküle diffundieren von der Injektionsstelle weg in das umliegende Gewebe, werden in den Körperflüssigkeiten verdünnt, von anderen
Proteinen (z.B. Albumin) und Rezeptoren anderer Zellen gebunden und durch
Gewebsproteinasen abgebaut. Ihre Konzentration im Körper nimmt daher
schnell ab (Lotze et al., 1985). Werden die Zytokine in unphysiologischer Weise
systemisch verabreicht, müssen deshalb hohe Dosen eingesetzt werden, um
therapeutische Wirksamkeit zu zeigen. Im Rahmen solcher Therapiekonzepte
werden erheblichen Nebenwirkungen bis hin zum Tod des Patienten
beobachtet (Kragel et al., 1990; Miles, 1992; Rosenberg et al., 1993).
Mit Tumorvakzinen aus Tumorzellen, die mit Zytokingenen transfiziert wurden
und das jeweilige Zytokin synthetisierten und sezernierten, konnten in Tierversuchen Therapieerfolge erzielt werden, ohne die schweren Nebenwirkungen
der systemischen Applikation von Zytokinen hervorzurufen (Ley et al., 1991).
Die Verfügbarkeit von IL-2 in unmittelbarer Nähe der Tumorantigene scheint bei
68
4.Diskussion
_______________________________________________________________
der Generierung eines schützenden Effektes im Empfänger einer solchen Vakzine eine wichtige Rolle zu spielen.
Therapien mit vitalen, gentechnisch veränderten Krebszellen können beim
Menschen jedoch nur bedingt angewendet werden, da die Verabreichung
solcher Zellen hohe gesundheitliche Risiken in sich birgt und ethisch nicht
akzeptierbar ist. Bei Verlust des transfizierten Gens kann es zum Tumorwachstum an der Applikationsstelle kommen (Tsai et al., 1993). Außerdem besteht die
Gefahr, daß der Phänotyp dieser Tumorzellen durch die Transfektion so
verändert wird, daß schnell metastasierende oder hochmaligne Tumoren entstehen (Malik et al., 1990). Durch eine Inaktivierung der transfizierten Tumorzellen vor der Applikation durch Bestrahlung oder andere Maßnahmen, kann
das Risiko einer unkontrollierten Tumorentwicklung ausgeschlossen werden. Es
ist bislang allerdings umstritten, ob die transfizierten Zellen das Zytokin nach
der Bestrahlung über einen ausreichend langen Zeitraum und in ausreichender
Menge produzieren. Hinzu kommt, daß die Herstellung individueller Vakzinen
aus Zytokingen-transfizierten Tumorzellen, für jeden Patienten mit hohem Personal- und Kostenaufwand verbunden ist.
Eine Möglichkeit rhIL-2 länger im Organismus zu halten und die Immunantwort
direkt in Nähe der abgetöteten Tumorzellen zu stimulieren, besteht in der chemischen Kopplung des Zytokins an Zellen. Tumorzell - rhIL-2 - Konjugate, in
denen das rhIL-2 kovalent an inaktivierte Tumorzellen gebunden ist, könnten
eine Alternative zu IL-2- Gen-transfizierten Tumorzellen darstellen. Vorraussetzungen dafür wäre die Erhaltung der biologische Wirksamkeit des rhIL-2 auch
nach der Bindung an die Tumorzelle und die Spaltbarkeit der Bindung zwischen
Tumorzelle und rhIL-2 unter physiologischen Bedingungen. Außerdem dürfte
die sterische Konfiguration solcher Komplexe die TZell - Antigen - Interaktion
nicht behindern. Die Konjugate würden ähnlich den gentransfizierten Zellen als
Depot für IL-2 fungieren und das Zytokin in unmittelbarer Nähe der Tumorantigene freisetzten.
69
4.Diskussion
_______________________________________________________________
In der vorliegenden Arbeit sollten folgende Fragen beantwortet werden:
1. Welche Möglichkeiten gibt es, Proteine an Zellen zu koppeln?
OVA-FITC, das mit Hilfe von Fluoreszenz einfach nachgewiesen werden kann,
wurde zu Vorversuchen als Testsubstanz bei der Kopplung eingesetzt.
2. In wie weit lassen sich die mit OVA-FITC erzielten Ergebnisse auf IL-2 übertragen?
3. Ist das gekoppelte IL-2 biologisch aktiv?
4. Wie lange nach der Kopplung kann IL-2 in biologisch aktiver Form nachgewiesen werden?
70
4.Diskussion
_______________________________________________________________
Folgende Kopplungsansätze wurden mit OVA-FITC durchgeführt:
1. Kovalente Bindung von OVA-FITC mit Hilfe von heterobifunktionellen Linkerreagenzien an Tumorzellen
1a: über eine Thioetherbindung
O
O
MHS +
NH2
Protein
Protein NH C R N
OVA-FITC
OVA-FITC
O
O
Protein NH C R N
+
HS
O
OVA-FITC
O
S Zelle
HN Protein
Zelle
SAMBA +
NH2
Protein
Zelle
O
HO
O
1b: über eine Disulfidbindung
O
SPDP +
NH2 Protein
OVA-FITC
Protein HN C
S S
OVA-FITC
N
O
+
HS
S S Zelle
Protein NH C
OVA-FITC
HN Protein
Zelle
SAMBA +
NH2 Protein
Zelle
HO
O
O
71
4.Diskussion
_______________________________________________________________
2. Adhäsion von mittels heterobifunktionellen Linkerreagenzien mit OVA-FITC
modifiziertem ConA an Tumorzellen
2a: über eine Thioetherbindung
O
O
MHS +
NH2
Protein
Protein NH C R N
OVA-FITC
OVA-FITC
O
O
Protein NH C R N
+
HS
O
OVA-FITC
O
S ConA
HN Protein
ConA
SAMBA +
NH2
Protein
ConA
O
HO
O
2b: über eine Disulfidbindung
O
SPDP +
NH2 Protein
OVA-FITC
Protein HN C
S S
OVA-FITC
N
O
+
HS
S S ConA
Protein NH C
OVA-FITC
HN Protein
ConA
SAMBA +
NH2 Protein
ConA
HO
O
O
72
4.Diskussion
_______________________________________________________________
Um ein Verfahren zur Herstellung von Heterokonjugaten aus OVA-FITC und
Zellen über eine Thioetherbindung zu etablieren, mußten die optimalen Konzentrationen der dazu notwendigen Linker-Substanzen MHS und SAMBA ermittelt werden(s. 3.2.1.1). Die parallel durchgeführte Negativkontrolle (Reaktion
des OVA-FITC mit Tumorzellen ohne vorige Einführung des MHS (s. Tabelle 3,
Probe 2)) zeigte in der floureszenzmikroskopischen Auswertung unerwarteterweise ebenfalls eine Markierung der Zellen, diese war aber weniger einheitlich und wies eine geringere Fluoreszenzintensität auf als die Ansätze mit
Einführung von MHS. Diese erfolgte Kopplung läßt sich mit den vorhandenen
reaktiven Aminosäuren (z.B. Cystein) des OVA-FITC erklären, die mit den SHGruppen von Proteinen auf der Tumorzell-oberfläche eine kovalente Bindung
eingehen können.
Die in der Literatur (Ishikawa et al., 1983) empfohlene Konzentration eines 25
molaren Überschusses an MHS im Vergleich zu OVA -FITC, erwies sich als
ausreichend für die Kopplung.
Bei der Ermittlung der optimalen SAMBA - Konzentration wurden die besten
Ergebnisse mit einer 100-fach höheren Konzentration, als die in der Literatur
vorgeschlagene (0,24 mg SAMBA in 100µl Dimethylformamid pro 106 Zellen)
(Ishikawa et al., 1983), erzielt. Bei den mit dieser Konzentration (24 mg SAMBA
in 100µl Dimethylformamid pro 106 Zellen) durchgeführten Kopplungen, blieb
die Fluoreszenz länger erhalten und die Fluoreszenzintensität war höher (s.
3.2.1.1.2).
Insgesamt war die durchgeführte Kopplung erfolgreich. Die Zellen zeigten eine
hohe Fluoreszenzintensität und eine starke Internalisierung des OVA-FITC, bei
schwach ausgeprägtem Randsaum.
Da bei Kultivierung der MHS/SAMBA - behandelten Zellen keine Proliferation
beobachtet werden konnte, legt dies den Schluß nahe, daß die Zellen durch die
Modifikation devitalisiert worden waren. Außerdem muß davon ausgegangen
werden, daß die Zellen durch die Behandlung fixiert worden waren, da sie
offensichtlich über lange Zeit morphologisch intakt blieben und nicht zerfielen.
73
4.Diskussion
_______________________________________________________________
Da die Zellen für in vivo - Anwendungen sowieso abgetötet werden müssen, ist
ihre Devitalisierung von untergeordneter Bedeutung.
In diesem Zusammenhang muß darauf hingewiesen werden, daß der Einsatz
von abgestorbenen und von der Membran her nicht mehr intakten Tumorzellen
als Tumorvakzine umstritten ist. Es konnte gezeigt werden, daß ex vivo die
Stimulierung einer TC-Zell - abhängigen Anti-Tumor-Antwort nur mit vitalen
Tumorzellen, die eine intakte Membran besitzen, nicht aber mit abgestorbenen
Tumorzellen oder Zell-Lysaten erreicht werden kann (Schirrmacher und von
Hoegen, 1993). Demgegenüber steht die Beobachtung, daß die Applikation von
Liposomen, die ein Lysat aus B16-Tumorzellen und rhIL-2 enthalten, in syngenen Mäusen in vivo zur Entstehung einer protektiven Anti-Tumor-Antwort
führt (Gershman et al., 1994). Ebenso kann durch die Verabreichung einer
Vakzine aus bestrahlten B16-Tumorzellen, an die IL-2 enthaltende Liposomen
gekoppelt sind, in vivo eine bleibende Immunität gegen Tumorzellen induziert
werden (Reimer, 1994). In wie weit die in dieser Arbeit erstellten Ansätze, die
eine Weiterentwicklung der Arbeit von Reimer sind, bei den anstehenden Tierversuchen wirksam sind, bleibt abzuwarten.
Bei der Kopplung von ConA an OVA-FITC über verschiedene hetero-bifunktionelle Linker und die anschließende Adhäsion des Kopplungsproduktes an
Zellen kann verhindert werden, daß durch die Veränderung der Membranproteine ihre potentiellen tumorassoziierten Transplantatantigene zerstört
werden. In diesem Ansatz wurde OVA-FITC mit MHS und ConA mit SAMBA
modifiziert. Die nachfolgende Adhäsion dieses Reaktionsproduktes an Zellen
erfolgte aufgrund der starken Anziehungskräfte zwischen dem Lektinanteil des
Produktes und der Glykokalix von Zellen.
Bei der fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung der markierten Zellen zeigte
sich im Vergleich zur direkten kovalenten Bindung ein deutlicherer Randsaum
bei insgesamt mit geringerer Fluoreszenzintensität markierten Zellen. Die
Menge an internalisiertem OVA-FITC war geringer.
74
4.Diskussion
_______________________________________________________________
Dieses Ergebnis spiegelte sich auch bei der durchflusszytometrischen Untersuchung der beiden Ansätze wieder. Hier zeigte sich, daß die Fluoreszenzintensität bei der Bindung des OVA-FITC über eine kovalente Bindung quantitativ um
den Faktor 10 größer war, als die bei der Adhäsion des OVA-FITC an die Zellen (s. 3.2.3). Das heißt, es wurde die 10fache Menge an OVA-FITC gebunden.
ConA - OVA-FITC wird im Gegensatz zu direkt gebundenen OVA-FITC in nur
geringen Mengen internalisiert. Eine abschließende Erklärung dieses Phänomens konnte in dieser Arbeit nicht gegeben werden. Ein Erklärungsansatz liegt
darin, daß das für Zellen toxische SAMBA die Zellmembranen derart verändert,
daß sie durchlässiger wird und somit Moleküle mit SH-Gruppen nicht nur an die
äußere sondern auch an innere Membranen gebunden werden können. Im
Gegensatz zur direkten Kopplung, kommen die Zellen bei der Adhäsion des
modifizierten ConA nicht mit SAMBA in Kontakt. Die Membranen bleiben
weiterhin intakt und das Kopplungsreagenz wird vermehrt an der Außenseite
gebunden. Von zusätzlicher Bedeutung kann in diesem Zusammenhang die
Größe des Kopplungsreagenzes sein. Je größer das Kopplungsreagenz, desto
langsamer kann es durch die Zellmembran hinduchdiffundieren. Bei der Verwendung von ConA wird dieser Diffusionsvorgang durch seine zusätzliche
Größe verlangsamt.
Parallel zu den o. g. Ansätzen wurde SPDP als Alternativsubstanz für MHS
verwendet, um das OVA-FITC über Disulfidbrücken zu binden. McIntyre et al.
beschrieben, daß Disulfidbindungen in vitro leichter spaltbar sind als Thioetherbindungen (McIntyre et al., 1994). Somit lag hier eine weitere Methode für
die Kopplung von Zytokinen vor, die in dieser Arbeit auf die Kopplung von OVAFITC/bzw. IL-2 an Zellen angewendet werden sollte.
Bei der Reaktion des durch Kopplung mit SPDP veränderten OVA-FITC mit
SAMBA - modifizierten Zellen zeigten sich im Fluoreszenzmikroskop fädige
Strukturen. Anstelle der erwarteten heterologen Kopplung zwischen OVA-FITC
und der Zellmembran waren durch Reaktion der eingefügten SH-Gruppen der
OVA-FITC - Moleküle offensichtlich Polymere entstanden.
75
4.Diskussion
_______________________________________________________________
Besonders deutlich sichtbar wurde das Ausfallen der Polymere bei Konzentrierung des modifizierten OVA-FITC nach vorheriger säulenchromatographischer
Reinigung mit Hilfe einer NOVACELLTM - Rührzelle. Hier zeigte sich eine zunehmende Gelbfärbung des Filters während des Konzentriervorganges.
Das Auftreten von Polymeren wurde auch bei dem Versuch, IL-2 kovalent an
Zellen zu binden, beobachtet. Aufgrund des geringeren Volumens des Gesamtansatzes konnte auf eine Konzentrierung verzichtet werden. Nach Sterilfiltration wurde das Kopplungsgemisch aus IL-2 und SPDP säulenchromatographisch fraktioniert. Da im Eluat kein Kopplungsprodukt nachgewiesen werden konnte, mußte vermutet werden, daß das polymerisierte IL-2 größer war
als die Porengröße des Sterilfilters und in diesem zurückgehalten worden war.
Zur Bestätigung wurde das Produkt aus der Kopplung von IL-2 mit SPDP mittels SDS-PAGE untersucht. Ein Aliquot des Ansatzes wurde im nativen ein anderer im denaturierten Zustand analysiert. Als Kontrolle wurde ein Aliquot des
rekombinant erstellten IL-2 aufgetragen. Hier zeigte sich, daß zumindest
Tetramere in der nicht - denaturierten Probe vorhanden waren (s. 3.3.2.1).
Polymere konnten mit den zur Verfügung stehenden Methoden nicht nachgewiesen werden.
Die primär nicht beabsichtigte Polymerisation von IL-2 eröffnet weitere Untersuchungsmöglichkeiten. Derzeit wird in weiteren Versuchen geklärt, ob aus IL-2
- Polymeren in vivo biologisch aktives IL-2 freigesetzt wird und wie die Kinetik
der Freisetzung im Vergleich zur Freisetzung aus anderen IL-2 - Präparationen
verläuft.
Die stärkste Kopplung von OVA-FITC an Zellen konnte über die Bindung von
SAMBA und MHS erreicht werden. Dieser Ansatz wurde als Grundlage für die
kinetischen Untersuchungen zur Freisetzung von IL-2 gewählt.
Die IL-2 - Freisetzung aus dem Konjugat wurde in einem biologischen Assay
mittels CTLL-2-Proliferationstest bestimmt (s. Abb. 17). Über 6 Wochen konnte
eine sukzessive Abnahme der Konzentration an aktivem IL-2 im Überstand der
Zellkultur beobachtet werden. Nach 6 Wochen war die abgegebene IL-2 76
4.Diskussion
_______________________________________________________________
Menge mit den zur Verfügung stehenden Methoden nicht mehr detektierbar.
Diese Ergebnisse spiegeln sich auch bei der fluoreszenzmikroskopischen
Auswertung der entsprechend OVA-FITC - markierten Zellen wieder. Hier
konnte über 2 Monaten nur eine geringe Abnahme der Fluoreszenz beobachtet
werden (s. 3.2.1.1.2).
Es konnte in dieser Arbeit also gezeigt werden, daß es möglich ist, IL-2 unter
Beibehaltung seiner biologischen Aktivität an Tumorzellen zu koppeln und daß
die Bindung zwischen Tumorzelle und rhIL-2 spaltbar ist. Für die Eignung der
Tumorzell - rhIL-2 - Konjugate ist die Spaltbarkeit der Bindung zwischen
Tumorzellen und rhIL-2 von entscheidender Bedeutung, da von Horwitz et al.
(1993) beschrieben worden ist, daß immobilisiertes IL-2 zwar noch die Fähigkeit besitzt an IL-2 - Rezeptoren zytotoxischer T-Zellen zu binden und ihre
Lebensfähigkeit aufrecht zu erhalten, die Zellen jedoch nicht mehr zur Proliferation anregen konnte. Irreversibel an Tumorzellen gebundenes IL-2 wäre somit
nicht mehr in der Lage stimulierend auf zytotoxische T-Zellen und andere
Komponenten des Immunsystems zu wirken, die an der Ausbildung einer AntiTumor-Antwort beteiligt sind.
Versuche, in denen Mäusen G-CSF-Gen-transfizierte C26-Tumorzellen injiziert
wurden, zeigten, daß durch den um die transfizierten Zellen gebildeten G-CFSGradienten Lymphozyten angelockt werden, die selektiv das Wachstum der
Tumorzellen inhibieren (Colombo et al., 1992). Möglicherweise vermag ein IL-2
- Gradient, der von Tumorzell-IL-2-Konjugaten ausgeht, ebenfalls Lymphozyten
anzulocken, die nach der Aktivierung durch IL-2 Tumorzellen angreifen.
Inwieweit die Bindung von IL-2 an Tumorzellen über Adhäsion von ConA ähnlich erfolgreich durchzuführen ist, muß in weiteren Versuchsreihen geklärt werden. Da bei diesem Versuchsansatz die Zelloberfläche nicht zusätzlich verändert wird, könnte die immunstimulierende Wirkung der Vakzine größer sein.
Dagegen kann ein nicht-kovalent gebundenes Konjugat durch strömende Körperflüssigkeiten und durch Adsorption an andere Zellen oder Proteine schneller
freigesetzt werden. Im Hinblick auf die spätere Verwendung in Tumorvakzinen
77
4.Diskussion
_______________________________________________________________
muß noch geklärt werden, welcher Ansatz über die Dauer der Therapie erfolgreicher sein könnte.
An Hand der beschriebenen Ergebnisse konnte gezeigt werden, daß IL-2 nach
Kopplung an Tumorzellen in vitro über Monate stabil war und kontinuierlich aus
der jeweiligen Bindung von der Zellmembran freigesetzt wurde. Die entsprechenden Ansätze sind nun zu optimieren und die Ergebnisse in Tierversuchen
zu kontrollieren.
Der Vorteil dieser Methode liegt zum einen in dem vergleichsweise geringerem
Kostenaufwand und zum anderen in der im Vergleich mit Zytokingen - Transfektionen ethischen Unbedenklichkeit.
78
5.Literatur
_______________________________________________________________
5. Literatur
Arzt, E., Ruric, R., Stelzer, G., Stalla, J., Sauer, J., Renner, U., Stalla, G.K.
Interleukin involvement in anterior pituitary cell growth regulation: effects of IL-2
and IL-6.
Endocrinology 132, 459-467 (1993)
Basombrio, M.
Search for common antigenicity among twenty-five sarcomas induced by
methylchloranthrene.
Cancer Res. 30, 2458-2462 (1970)
Benveniste, E.N., Merrill, J.E.
Stimulation of oligodendroglial proliferation and maturation by interleukin-2.
Nature 321, 610-613 (1986)
Boon, T., Old, L.
Immun Response to Tumors, in: Encyclopedia of immunology. Roitt I.M.,
Delives P.J. (Hrsg.)
Academic Press, 15157-1589 (1992)
Burnet, F.M.
A certain symmetry: histocompatibility antigens compared with immunocyt
receptors.
Nature 226, 123-126 (1970)
Cassel, W.A., Garrett, R.E.
Newcastle Disease Virus as an antineoplastic agent.
Cancer 18, 863-868 (1965)
Cassel, W.A., Murray, D.R., Phillips, H.S.
A phase II study on the postsurgical management of stage II malignant
melanoma with a Newcastle Disease Virus oncolysate.
Cancer 52, 856-860 (1983)
Carlsson, J., Drevin, H., Axen, R.
Protein thiolation and reversible protein-protein conjugation. N-Succinimidyl 3(2-pyridyldithio)propionate, a new heterobifunctional reagent.
J. Biochem. 173, 723-737 (1978)
Cohen, P.J., Lotze, M. T., Roberst, J.R., Rosenberg, S.A., Jaffee, E.S.
The immunopathology of sequential tumor biopsis in patients treated with
interleukin-2. Correlation of response with T-cell infiltration and HLA-DR
expression.
Am. J. Path. 129, 208-216 (1987)
79
5.Literatur
_______________________________________________________________
Colombo, M.P., Ferrari, G., Stoppacciaro, A., Parenza, M., Rodolfo, M., Mavilio,
F., Parmiani, G.
Granulocyte colony-stimulating factor gene transfer suppresses tumorigenicity
of an murine adenocarcinoma in vivo.
J. Exp. Med. 17, 889-897 (1991)
Damle, N.K., Doyle, L.V., Bradley, E.C.
IL-2 actibated human killer cells are derived from phenotypically heterogenous
precursors.
J. Immunol. (1986)
Demchak, P.A., Mier, J.W., Robert, N.J., O’Brien, K., Gould, J.A., Atkins, M.B.
Interleukin-2 and high-dose cisplatin in patients with metastatic melanoma: a
pilot study.
J. Clin. Oncol. 9, 1821-1830 (1991)
Dranoff, G., Jaffee, E., Lazenby, A., Golumbek, P., Levitsky, H., Brose, K.,
Jackson, V., Hamada, H., Pardoll, D. Mulligan, R.C.
Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secret murine granulocytemacrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific and longlasting anti-tumor immunity.
Proc. Nat. Am. Sci. 90, 3539-3543 (1990)
Ehrlich, P.
The collected papers of Paul Ehrlich, in: Immunology and Cancer Research.
Himmelweit (Hrsg., 1957) 550
Pergamon,
London 1909
Fearon, E.R., Pardoll, D.M., Itaya, T., Golumbek, P., Levitsky, H.I., Simons,
J.W., Karasuyama, H., Vogelstein, B., Frost, P.
IL-2 pruduction by tumor cell bypasses T helper function in the generation of an
antitumor response.
Cell 60, 397-403 (1990)
Ferrantini, M., Giovarelli, M., Modesti, A., Musinai, A., Venditti, M., Peretti, E.,
Lollini, P.L., Nanni, P., Forni, G., Belardelli, F.
IFN-alpha 1 gene expression into a metastatic murine adenocarcinoma (TS/A)
results in CD8+ T cell-mediated tumor rejection and development of antitumor
immunity.
J. Immunol. 153, 4604-4615 (1994)
Freedman, R.S., Bowen, J.M., Herson, J.H., Wharton, J.T. Edwards, C.L.,
Rutledge, F.N.
Immunotherapy for vulvar carcinoma with virus-modified homologous extracts.
Obstet. Gynecol. 62, 707-714 (1983)
Gansbacher, B., Zier, K., Daniels, B., Cronin, K., Bannerji, R., Gilboa, E.
IL-2 gene transfer into tumor cells abrogates tumorinenicity and induces
protective immunity.
J. Exper. Med. 172, 1217-1224 (1990)
80
5.Literatur
_______________________________________________________________
Gershman, N., Johnston, D., Bystryn, J.-C.
Potentiation of melanoma vaccine immunogenicity by interleukin-2 liposomes.
Vaccine Research 3, 83-92 (1994)
Gillis, S., Mochizuki, D.Y., Conlon, P. J., Hefeneider, S.H., Tanthum, C.A.,
Gillis, A. E., Frank, M. B., Henney, C.S., Watson J.D.
Molecular charakterization of IL-2.
Immunol. Rev. 63, 167-209 (1982)
Golumbek, R.T., Lazenby, A.J., Levitsky, H.I., Jaffee, L.M., Karasuyama, H.,
Baker, M., Pardoll, D.M.
Treatment of established renal cancer by tumor cells engineered to secrete IL4.
Science 254, 713-716 (1991)
Grimm, E.A.
Properties of IL-2-activated lymphocytes. in: Therapeutic applications of
interleukin-2. Atkins, M.B., and Mier, J.W. (Hrsg.) S. 27-38
Marcel Dekker
New York 1993
Gross, L.
Intradermal immunisation of C3H mice against a sarcoma that originated in an
animal of the same line.
Cancer Res. 3, 326-333 (1943)
Haas, C., Ertel, C., Gerhards, R., Schirrmacher V.
Introduction of adhesive and costimulatory immune functions into tumor cells by
infection with Newcastle Disease Virus.
Int. J. Oncol. 13, 1105-1115 (1998)
Heaton, K.M., Grimm, E.A
Cytokine combinations in immunotherapy for solid tumors: a review.
Cancer Immunol. Immunther. 37, 213-219 (1993)
Hellström, K.E., Hellström, I.
Immun Response to Tumors, in: Encyclopedia of immunology. Roitt, I.M.,
Delives, P.J. (Hrsg.) S. 1527-1529
Academic Press 1992
Hermanson, G.T
Bioconjugate techniques.
Academic press
NewYork 1996
Hersey, P., Edwards, A.l., Coates, A., Shaw, H., McCarthy, W., Milton, G.
Evidence that treatment with vaccinia melanoma cell lysates (VMCL) as
adjuvant to surgical treatment of stage II melanoma: II. Effects on cell mediated
cytotoxicity and leucocyte dependent antibody activity: Immunological effects of
VMCL in melanoma patients.
Cancer Immunol. Immunother. 22, 221-231 (1986)
81
5.Literatur
_______________________________________________________________
Hewitt, H.B., Blake, E.R., Walder, A.S.
A critique of the evidence for active host defence against cancer, based on
personal studies of 27 murine tumors of spontaneous origin.
Br. J. Cancer 33, 637-643 (1976)
Hinkel, A., de Riese, W., Alefelder, J., Laumann, D., Falkenberg, F.W., Senge,
T., Hertle, L.
Active specific immunotherapy with an autologous virus-modified tumor cell
vaccine in human renal cell carcinoma.
Eur. J. Cancer 31, 1719-1920 (1995)
Hock, H., Dorsch, M., Kunzendorf, U., Überla, K., Qin, Z., Diamantstein, T.,
Blankenstein, T.
Vaccination with tumor cells genetically engineerede to produce different
cytokines: Effectivity not superior to a classical adjuvant.
Cancer Res. 53, 714-716 (1993)
Hoover, H.C., Surdyke, M.G., Dangel, R.B., Peters L.C., Hanna, M.G.
Prospectively randomized trial of adjuvant active-specific immunotherapy for
human colorectal cancer.
Cancer 55, 1236-1243 (1985)
Hoover, H.C., Brandhorst, J.S., Peters, L.C., Surdyke, M.G., Takeshita, Y.,
Madariaga, J., Muenz, L.R., Hanna, M.G
Adjuvant active specific immunotherapy for human colorectal cancer: 6.5-year
median follow-up of a phase III prospectively randomized trial.
J. Clin. Oncol 11, 390-399 (1993)
Horwitz, J.I., Toner, M., Tompkins, R.G., Yarmush, M.L.
Immobilized IL-2 preserves the viability of an IL-2 dependent cell line.
Mol. Immunol. 30, 1014-1048 (1993)
Ihle, J., Holzer,U., Krull, F., Dohlsten, M., Kalland, T., Niethammer, D.,
Dannecker, G.E.
Antibody-targeted superantigens induce lysis of major histocompatibility
complex class II-negative T-Cell leukemia lines.
Cancer Res. 55, 623-628 (1995)
Ishikawa, E., Imagawa, M., Hashida, S., Yoshitake, S., Hamaguchi, Y., Ueno,
T.
Enzym-Labeling of antibodies and their fragments for enzyme immunoassay
and immunohistochemical staining.
J. Immunoassay 4, 209-327 (1983;)
Kearney, J.F., Radbruch, A., Liesegang, B., Rajewsky K.
A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobin expression but
permits the construction of antibody-secreting hybrid cell lines.
J. Immunol. 123, 1548-1550 (1979)
82
5.Literatur
_______________________________________________________________
Kedar, E., Schwartzbach, M., Raanan, Z., Hefetz, S.
In vitro induction of cell-mediated immunity to murine leukemia cells. Cytotoxic
activity in vitro and tumor-neutralizing capacity in vivo of anti-leukemia cytotoxic
lymphocytes generated in macrocultures.
J. Immunol. Methods 16, 39-58 (1977)
Kishimoto, C., Kuroki, Y., Ochiai, H., Kurokawa, M., Sasayama, S.
Cytokine and murine coxsachievirus B3 myocarditis. Interleukin-2 suppressed
myocarditis in the acute stage but enhanced the condition in the subsequent
stage.
Circulation 89, 2836-2842 (1994)
Klein, G., Sjörgen, H.O., Klein E.
Demonstration of resistance against methylcholanthrene-induced sarcomas in
the primary autochthonous host.
Cancer Res. 20, 1561-1572 (1960)
Kobayashi, H.
The biological modification of tumor cells as a means of inducing their
regression: an overview.
J. Biol. Response Mod. 5, 1-11 (1986)
Köhler, G., Milstein, C.
Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specifity.
Nature 265, 394 (1975)
Kovacs, E.J., Beckner, S.K., Longo, D.L., Varesio L., Young, H.A.
Cytokine gene expression during the gereration of human lymphokine-activated
killer cells: early induction of interleukin1 beta by interleukin 2.
Cancer Res. 49, 940-944 (1989)
Kragel, A.H., Travis, W.D., Steis, R.G., Rosenberg, S.A., Roberts, W.C.
Myocarditis or acute myocardial infarction associated with interleukin-2 therapy
for cancer.
Cancer 66, 1513-1516 (1990)
Laemmli, U.K.
Cleavage of structural proteins during the assemly of the head of bacteriophage
T4.
Nature 227, 680-685
Lafraniere, R., Rosenberg, S., A. (1985)
Successfull immunotherapy of murine experimental hepatic metastasis with
lymphokine-activated killer cells and recombinant IL-2.
Cancer Res. 45, 3735-3741
Ley, V., Langlade-Demayen, P., Kourilsky, P., Larsson-Sciard, E.-L.
A novel approach to the induction of specific cytolytic T cells in vivo.
Res. Immunol. 141, 851-854 (1991)
83
5.Literatur
_______________________________________________________________
Lord, J.D., McIntosh, B.C., Greenberg, P.D., Nelson, B.H.
The IL-2 receptor promotes proliferation, bcl-2 and bcl-x induction, but not cell
viability through the adapter molecule Shc.
J. Immunol. 161, 4627-4633 (1998)
Lorence, R.M., Rood, P.A., Kelley, K.W.
Newcastle Disease Virus as an antineoplastic agent: induction of Tumor
Necrosis Factor-α and augmentation of its cytotoxicity.
J. Natl. Cancer Inst. 80, 1305-1312 (1988)
Lotze, M.T., Matory, Y.L., Ettinghausen, S.E., Rayner, A.A., Sharrow, S.O.,
Seipp, C.A.Y., Custer, M.C., Rosenberg, S.A.
In vivo administration of purified human IL-2. Half life, immunological effects and
expansion of peripheral lymphoid cells in vivo with recombinant IL-2.
J. Immunol. 135, 2865-2875 (1985)
Lotze, M.T., Custer, M.C., Sharrow, S.O., Rubin, L.A., Nelson, D.L., Rosenberg,
S.A.
In vivo administration of purified human interleukin-2 to patients with cancer:
development of interleukin-2 receptor positive cells and circulating soluble
interleukin-2 receptors following interleukin-2 administration.
Cancer Res. 15, 2188-2195 (1987)
Lotze, M.T.
Concerning repeat hepatic resections for colorectal metastases.
Surgery 109, 347-348 (1991)
Lotze, M.T.
Trials and tribulations: the cost of developing gene therapies.
FASEB J. 5, 3013-3014 (1991)
Lotzová, E.
Analysis of effector mechanisms in cancer.
Curr. Opin. Immunol. 1, 124-129 (1989)
Malik, S.T.A., Naylor, M.S., East, N., Oliff, A., Balkwill, F.R.
Cells secreting tumor necrosis factor show enhanced metastasis in nude mice.
Eur. J. Cancer 26, 1031-1034 (1990)
MacLean, G.D., Reddisch, M.A., Koganty, R.R., Wong, T., Gandi, S.,
Smolenski, M., Samual, J., Nabholz, J.M., Longenecker, B.M.
Immunisation of breast cancer patients using a synthetic sialyl-Tn
glycoconjugate plus Detox adjuvant.
Cancer Immunol. Immunother. 36, 215-222 (1993)
McCabe, M.S., Staglein, D., Hawkins, M.J.
The modified group-C experience - phase III randomized trials of IL-2 vs. IL2/LAK in advanced renal-cell carcinoma and advanced melanoma.
Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 31, 186 (1990)
84
5.Literatur
_______________________________________________________________
McIntyre, G.D., Scott, C.F., Ritz, J., Blattler, W.A., Lambert, J.M.
Preparation and characterization of interleukin-2-gelonin conjugates made using
different cross-linking reagents.
Bioconjug. Chem. 5, 88-97 (1994)
Miles, D.W., Aderka, D., Engelmann, H., Wallach, D., Balkwill, F.R.
Induction of soluble tumor necrosis factor receptors during treatment with
interleukin-2.
Br. J. Cancer 66, 1195-1199 (1992)
Moertel, C.G.
Chemotherapy for colorectal cancer.
N. Engl. J. Med. 21, 330, 1136-1142 (1994)
Morgan, D. A., Ruscetti, F.W., Gallo, R.C.
Selective in vitro growth of T-lymphocytes from normal human bone marrows.
Science 193, 1007-1009 (1976)
Morrison, S.L., Schlom, J.
Recombinant chimeric monoclonal antibodies.
Imp. Adv. Oncol. 1990, 3-18 (1990)
Mule, J.J., Shu, S., Schwarz, S.L., Rosenberg S.A.
Adoptive innumotherapy of established pulmonary metastases with LAK cells
and recombinant IL-2.
Science 225, 1487-1489 (1984)
Murray, D.R., Cassel, W.A., Torbin, A.H., Olkowski, Z.L., Moore, M.E.
Viral oncolysate in the management of malignant melanoma. II. Clinical studies.
Cancer 40, 680-686 (1977)
Nistico, G., De Sarro, G.
Is interleukin-2 a neuromodulator in the brain?
Trends Neurosci. 14, 146-150 (1991)
Nistico, G.
Communications among central nervous system, neuroendocrine and immune
systems: interleukin-2.
Prog. Neurobiol. 40, 463-475 (1993)
Ockert, D., Schirrmacher, V., Beck, N., Stoeben, E., Ahlert, T., Flechtenmacher,
J., Hagmuller, E., Buchcik, R., Nagel, M., Saeger, H.D.
Newcastle disease virus-infected intact autologous tumor cell vaccine for
adjuvant active specific immunotherapy of resected colorectal carcinoma.
Clin. Cancer Res. 2, 21-28 (1995)
de Riese W., Allhoff E., Kirchner H., Stief C.G., Atzpodien J., Maschek H.,
Jonas U.
Complete spontaneous regression in metastatec renal cell carcinoma - an
update and review.
World J. Orol. 9, 184-191 (1991)
85
5.Literatur
_______________________________________________________________
Pardoll, D.
Immunotherapy with cytokine gene-transduced tumor cells: the next wave in
gene therapy for cancer.
Curr. Opin. Oncol. 4, 1124-1129 (1992)
Peters, L.C., Hanna, M.G.
Active specific immunotherapy of established micrometastasis: effect of
cryopreservation procedures on tumor cell immunogenicity in guinea pigs.
J. Natl. Cancer Inst. 64, 1521-1525 (1980)
Pomer, S., Thiele, R., Staehler, G., Drehmer, I., Lohrke, H., Schirrmacher, V.
Tumor vaccination in renal cell carcinoma with and without interleukin-2 (IL-2)
as adjuvant. A clinical contribution to the development of effective active
specific immunization.
Urologe A. 34(3), 215-220 (1995)
Prehn, R.T., Main, J.M.
Immunity of methylcholanthrene-induced sarcomas.
J. Natl. Cancer Inst.18, 769-778 (1957)
Reimer, M.
Herstellung von IL-2 enthaltenden Liposomen und deren Kopplung an B16Tumorzellen.
Diplomarbeit, Ruhr-Universität Bochum (1994)
Redman, B.G., Flaherty, L., Chou, T.H., Nakeff, A., Pillote, K., Kaplan, J.
Sequential dacarbazine/cisplatin and interleukin-2 in metastatic melanoma:
immunological effects of therapy.
J. Immunother. 10, 147-151 (1991)
Repmann, R., Wagner, S., Richter, A.
Adjuvant therapy of renal cell carcinoma with active-specific-immunotherapy
(ASI) using autologous tumor vaccine.
Anticancer Res. 17, 2879-2882 (1997)
Restifo, N.P., Marincola, F.M., Dawakami, Y., Tauberberger, J., Yannelli, J.R.,
Rosenberg, S.A.
Loss of functional beta 2-microglobulin in metastatic melanomas from five
patients receiving immunotherapy.
J. Natl. Cancer Inst. 88, 100-108 (1996)
Richards, J.M., Mehta, N., Ramming, K., Skosey, P.
Sequential chemoimmunotherapy in the treatment of metastatic melanoma.
J. Clin. Oncol. 10, 1338-1343 (1992)
Rinderknecht, H.
Ultra-repid fluorescent labelling of proteins.
Nature 193, 167-168 (1962)
86
5.Literatur
_______________________________________________________________
Roitt I.M., Brostoff J. Male D.K.
Kurzes Lehrbuch der Immunologie
Thieme Verlag
Stuttgart-New York 1987
Robb, R.J., Kutny, R.M., Chowdhry, V.
Purification and partial sequenze analyses of human T cell growth factor.
Proc. Natl. Am. Sci. 80, 5990-5994 (1983)
Rosenberg, S.A., Grimm, E.A., McGrogan, M., Doyle, M., Kawasaki, E., Koths,
K., Mark, D.F.
Biological activity of recombinant human IL-2 produced by Escherichia coli.
Science 223, 1412-1415 (1984)
Rosenberg, S.A., Mule, J.J., Spiess, P.J., Reichert C.M., Schwartz, S.L.
Regression of established pulmonary metastasis and subcutaneous tumor
mediatet by the systemic administration of high-dose recombinant IL-2.
J. Exp. Med. 161, 1169-1188 (1985a)
Rosenberg, S.A., Lotze, M.T., Muul, L.N., Leitman, S., Chan, A.E.,
Ettinghausen, D.E., Matory, Y.I., Skibber, J.M., Shiloni, E., Vetto, J.T., Seipp,
C.A., Simpson, C., Reichert, C.M.
Observation on the systemic administration of autologous lymphokine-activated
killer cells and recombinant IL-2 to patients with metastatic cancer.
N. Engl. J. Med. 313, 1485-1492 (1985b)
Rosenberg, S.A. Lotze, M.T. Muul, L.M., Chon, A.E. Avis, F.P. Leitmann, S.,
Marston Linehan, W., Robertson, C.N., Lee, R.E., Rubin, J.T., Seipp, C.A.,
Simpson, C.G., White, D.E.
A progress report on the treatment of 157 patiets with advanced cancer using
lymphokine-activated killer cells and interleukin-2 or high dose interleukin-2
alone.
N. Engl. J. Med. 316, 889 (1987)
Rosenberg, S.A., Spiess, P., Lafraniere, R.
A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating
lymphocytes.
Science 233, 1318-1321 (1986)
Rosenberg, S.A., Packard, B.S., Aebersold, P.M., Solomon, D., Topalian, S.L.,
Toy, S.T., Simon, P., Lotze, M.T., Yang, J., Seipp, C.A., Simpson, C., Carter,
C., Bock, S., Schwartzentruber, C., Wie, J.
Immunotherapy of patients with metastatic melanoma using tumor-infiltrating
lymphozytes and IL-2: a preliminary report.
N. Engl. J. Med. 318, 1676-1680 (1988)
87
5.Literatur
_______________________________________________________________
Rosenberg, S.A., Lotze, M.T., Yang, J., Topalinam, S.L., Chang, A.E.,
Schwartzentruber, C., Aebersold, P.M., Leimann, S., Linehan, W.M., Seipp,
C.A., White, D.E., Steinberg, S.M.
Prospective randomized trial of high-dose IL-2 alone or in conjugated with
lymphokine-activated killer cells.
J. Natl. Cancer Inst. 85, 622-632 (1993)
Ruddle, N.H.
Tumor necrosis factor-ß. in: Encyclopedia of immunology. Roitt I.M., Delives
P.J. (Hrsg.) S. 1525-1527
Academic Press 1992
Schapira, D., McCune, C., Henshaw, E.
Treatment of advanced renal cell carcinoma with specific immunotherapy
consisting of autologous tumor cells and C. parvum.
Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 20, 348-353 (1979)
Schärfe, T., Becht, E., Klippel, K.F., Jacobi, G.H., Hohenfellner, R.
Active immunptjeraüy pf stage IV renal cell cancer using autologous tumor
cells.
World J. Urol. 3, 245-248 (1986)
Schirrmacher, V.
Krebsimpfung mit Tumorzellen,
Spektrum der Wissenschaft 1, 38-50 (1990)
Schirrmacher, V
Tumoren: Entstehung, Metastasierung und immunologische
Abwehrmechanismen. in: Immunologie. Gemsa, Kalden, Resch (Hrsg.) S. 185203
Thieme Verlag
Stuttgart, New York 1991
Schirrmacher, V.
Immunity and Metastasis: In situ actibation of protective T cells by virusmodified
cancer vaccines.
Cancer Surv. 13, 129-154 (1992)
Schirrmacher, V., Ahlert, T., Heicappel, R., Appelhans, B., von Hoegen, P.
Successful application of non-oncogenic viruses for antimetastatic cancer
immunotherapy.
Cancer Rev. 5, 19-49 (1986)
Schirrmacher, V., von Hoegen, P.
Importance of tumor cell membrane integrity and viability for cytotoxic T
lymphocyte activation by cancer vaccines.
Vaccine Res. 2, 183-196 (1993)
88
5.Literatur
_______________________________________________________________
Schirrmacher, V., von Hoegen P., Scjöag Ü., Liebrich W., Lehner B.,
Schumacher K., Ahlert T., Bastert G.
Active specific immunotherapy with New-castle-disease-virus-modified
autologous tumor cells following resection of liver metastases in colorectal
cancer. First evaluation of clinical response of a phase II-trial.
Cancer Immunol. Immunother. 35, 325-330 (1989)
Schorle, H., Holtschke, T., Hunig, T., Schimpl, A., Horak, I.
Development and function of T cells in mice rendered interleukin-2 deficient by
gene targeting.
Nature 352, 621-624 (1991)
Sitkovsky, M.V., Paul, W.E.
Global or directed exocytosis?
Nature 322, 306-307 (1988)
Smith, K.E.
IL-2: Inception, imcapt and implications.
Science 240, 1169-1176 (1988)
Sobol, R.E., Fakhrai, H., Gjerset, R.
Active immunotherapy with transduced fibroblasts.
Protocols of the American Association of Cancer Research 33, 495-502 (1992)
Takeshita, T., Ohtani, K., Asao, H., Kumaki, S., Nakamura, M., Sugamura, K.
An associated molecule, p64, with IL-2 receptor beta chain. Its possible
involvement in the formation of the functional intermediate-affinity IL-2 receptor
complex.
J. Immunol. 148, 2154-2158 (1992)
Tallberg, T., Kalima, T., Halttunen, P., Mahlberg, K., Tykkä, H., Seiro, J.,
Dabek, J.
Postoperative active specific immunotherapy with supportive biomodulating
measure in patients suffering from malignant gastric tumours.
Tumor Diagnostik & Therapie 8, 49-53 (1987)
Tallberg, T., Tykkä, H.
Specific active immunotherapy in advanced renal cell carcinoma: A clinical
longterm follow-up study.
World J. Urol. 3, 234-244 (1986)
Tallberg, T., Tykkä, H., Mahlberg, K., Halttunen, P., Lehtonen, T., Kalima, T.,
Sarna, S.
Active specific immunotherapy with supportive measures in the treatment of
palliatively nephrectomize, renal adenocarcinoma patients. A therteen-Year
Follow-Up study.
Eur. Urol. 11, 233-243 (1985)
Taniguchi, T., Minami, G.
The IL-2/IL-2 receptor system: a current overview.
Cell 73, 5-8 (1993)
89
5.Literatur
_______________________________________________________________
Taniguchi, T.
Cytokine signaling through nonreceptor protein tyrosine kinases.
Science 268, 251-255 (1995)
Thomas, E.ed.
The cytokine handbook
Academic Press
London 1994
Tracey, K.J., Cerami, A.
Tumor necrosis factor in the malnutrition (cachexia) of infection and cancer.
Am. J. Trop. Med. Hyg. 47, 2-7 (1992)
Tracey, K.J., Cerami, A.
Tumor necrosis factor-α. in: Encyclopedia of immunology Roitt, I.M., Delives,
P.J. (Hrsg.) S. 1522 - 1524
Academic Press 1992
Tsai, J., Gansbacher, B., Tait, L., Miller, F.R., Heppner, G.H.
Induction of antitumor immunity by IL-2-gene-transduced mouse mammary
tumor cells versus transduced mammary stromal fibroblasts
J. Natl. Cancer Inst. 85, 546-553 (1993)
Tykkä, H., Hjelt, L., Oravisto, K.J., Turunen, M., Tallberg, T.
Disappearance of lung metastases during immunotherapy in five patients
suffering from renal carcinoma.
Scand. J. Resp. Dis. [Suppl.] 89, 123-134 (1974)
Tykkä, H., Oravisto, K.J., Turunen, M., Tallberg, T.
Active specific immunotherapy of advanced renal cell carcinoma.
Eur. Urol. 6, 250-258 (1978)
Valone, F.H., Gandara, D.R., Deisseroth, A.B., Perez, E.A., Rayner, A.,
Aronson, F.R., Luce, Jl, Paradise, C.
Interleukin-2, cisplatin, and 5-fluorouracil for patients with non-small cell lung
and head/neck carcinomas.
J. Immunother. 10, 207-213 (1991)
Weymayr, C.
Invasion der Killerzeller
Die Zeit 11, 51 (1994)
Whiteside, T.L.
Human tumor-infiltrating lymphozytes and their characterzation. in: Interleukin-2
and killer cells in cancer. Lotzova,E., Herbermann, R.B. (Hrsg.)
CRC Press 1990
Yron, I., Wood T.A., Spiess P.J., Rosenberg S.A.
In vivo growth of murine T cells. V. The Isolation and growth of lymphoid cells
infiltrating sangeneic solid tumors
J. Immunol. 125, 238.245 (1980)
90
5.Literatur
_______________________________________________________________
Zangemeister-Wittke, U., Kyewski, B., Schirrmacher, V.
Recruitment and activation of tumor-specific immune T cells in situ. CD8+ cells
predominate the secondary response in sponge matrices and exert both
delayed-type hypersensitivity-like and cytotoxic T lymphocyte activity.
J. Immonol. 143, 379-385 (1989)
Zinkernagel, R.M., Doherty, P.C.
H-2 compatibility requirement for T-cell mediated lysis of target cells infected
with lymphocytic choriomeningites virus.
J. Exp. Med. 141, 1427-1436 (1975)
91
Persönliche Anmerkungen und Danksagung
Nicht nur, weil es guter Brauch - sondern auch weil es mir ein persönliches Anliegen ist, Dank zu sagen für die Anforderungen und auch Möglichkeiten im
Zusammenhang meiner Tätigkeit und dieser Arbeit - steht dieses Nachwort
hier.
Danke, sage ich...
- Herrn Prof. Dr. W. Opferkuch für die Bereitstellung eines Laborplatzes,
- Herrn Prof. Dr. W. Falkenberg, der mich für die vorliegende Thematik interessiert hat, für seine kontinuierliche gute Betreuung und stete Diskussionsbereitschaft, sowie, daß es ihm gelungen ist, mir den Blick für die Zusammenhänge
von chemischer Grundlagenforschung und medizinischer Anwendbarkeit zu
schärfen,
- der Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum für das Promotionsstipendium und der damit verbundenen finanziellen Unterstützung,
- den Mitarbeitern der Arbeitsgruppe Falkenberg, und hier besonders Maike
Rieks für die Einweisung und Hilfe bei den FACScan - Analysen, Ralf Limberg
für die begleitende Diskussion bei der Arbeit im Labor und Anke Albrecht für die
Einführung in spezielle Zellkulturarbeiten,
- Herrn Dr. Andreas Hinkel für die unterstützende Einführung in die Thematik
und das Korrekturlesen,
- Herrn Prof. Dr. W.-H. Kunau dafür, daß er mich bei der Abfassung der Arbeit
unterstützte, indem ich die technischen Möglichkeiten seiner Abteilung nutzen
konnte,
- meinem Mann, Dr. Thomas Eller, für das Korrekturlesen und den ermunternden Zuspruch bei der Durchführung meiner Arbeit,
- meinen Eltern, deren Unterstützung und emotionaler Ansporn mir es ermöglichte, die Studiengänge Chemie und Medizin, und beide Promotionen, durchzuführen.
Auch wenn es in unserer Welt und Zeit nicht opportun ist
- ich danke Gott, weil ich meine Arbeit als Chemikerin und Ärztin tun möchte,
„mit der göttlichen Neugierde eines Menschen, der das Neue und Unbekannte
nicht nur als ein Verborgenes, sondern zugleich als etwas Geborgenes entdeckt. Auch das Neue und Unbekannte ruht im Frieden jener Hände, die Orient
und Okzident, die das Einstige und das Zukünftige umfangen.“ (Prof. Dr. H.
Thielicke in „Zu Gast auf einem schönen Stern“)
92
Ingvild Birschmann
Pommergasse 3
32469 Petershagen-Lahde
05702/851112
Persönliche Angaben
Familienstand:
Staatsangehörigkeit:
Religionsbekenntnis:
Geburtsdatum:
Geburtsort:
Eltern:
verheiratet seit 3.11.1995
deutsch
evangelisch
1.05.1965
Itzehoe/Holstein
Sigurd Birschmann, Pfarrer
Meta Birschmann, geb. Seyda, Hausfrau
Schulbildung
Aug. 71 - Mitte 75 Grundschule
Mitte 75 - 23.05.84
Max-Planck-Gymnasium, Gelsenkirchen-Buer
Ausbildung
Mitte 1984 - Mitte 1986 Ausbildung zur Chemisch-Technischen-Assistentin an der
Metallberufsschule Gelsenkirchen
Studium
seit 7.10.1986
18.04.1996
8.09.1997
Studium an der Ruhr-Universität Bochum
Fächer: Chemie (Diplom) und Humanmedizin
Abschluß des Medizinstudiums (3. Staatsexamen)
Abschluß des Chemiestudiums (Diplomprüfung), Thema der
Diplomarbeit: Die Funktion des IL-1ß bei der Regeneration des
peripheren Nervensystems
Berufstätigkeit
seit 15.07.1997
wissenschaftliche Mitarbeiterin am Institut für Physiologische Chemie Abteilung
Zellbiochemie an der Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum
(Prof. Dr. W.-H. Kunau)
Sonstige Berufserfahrung
8.06.1982 - 30.11.1996 Berufspraktikum bei der Fa. REAL SB Warenhaus GmbH & Co Vertriebs KG
seit Juli 1996
nebenberufliche Dozententätigkeit an der Zentralen Krankenpflege-schule
der Krankenhausgemeinschaft des Kirchenkreises Herne
Fächer: Anatomie, Physiologie und Biologie; Dermatologie, Urologie,
Auszeichnungen
28.10.1994
Promotionsstipendium der Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität
Bochum
Mitgliedschaften
Tätiges Mitglied der Studenten Mission Deutschland
93