Neurotrophe Mechanismen während der Entwicklung des retino

Neurotrophe Mechanismen während der Entwicklung des
retino-tectalen Systems der Taube (Columba livia)
Inaugural – Dissertation
zur
Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
in der
Fakultät für Psychologie
der
RUHR-UNIVERSITÄT BOCHUM
vorgelegt von:
Carsten Theiß
Gedruckt mit Genehmigung der Fakultät für Psychologie der
RUHR-UNIVERSITÄT BOCHUM
Referent:
Prof. Dr. Onur Güntürkün
Korreferent:
Prof. Dr. Irene Daum
Tag der mündlichen Prüfung: 21.02.2000
Danksagung
Herrn Prof. Dr. O. Güntürkün möchte ich meinen Dank ausdrücken für die Bereitstellung des
Dissertationsthemas sowie für die hervorragende Betreuung und konstruktive Kritik während
der gesamten Phase der Anfertigung der vorliegenden Doktorarbeit.
Ebenso möchte ich meinen Dank an Frau Prof. Dr. I. Daum aussprechen, die als Korreferentin
das Fortkommen dieser Arbeit aufmerksam verfolgt und unterstützt hat.
Herrn Prof. Dr. K. Meller gilt mein tiefster Dank für die Bereitstellung eines umfangreichen
histologischen Arbeitsplatzes und der intensive Unterweisung in die Elektronenmikroskopie.
Die mit Prof. Meller geführten Diskussionen zur Interpretation der Ergebnisse haben in
anregender Weise zur Anfertigung dieser Dissertation beigetragen.
Prof. Dr. K.P. Hoffmann und PD Dr. C. Distler danke ich für die Einweisung und die
Möglichkeit der Nutzung des konfokalen Mikroskops am Lehrstuhl für allgemeine Zoologie
und Neurobiologie in Bochum.
Ein besonderer Dank gilt der Arbeitsgruppe der Cytologie.
Die vielfältigen Unterstützungen von Claudia Grzelak, Anke Lodwig und Medah Özcan im
Labor, die Hilfe von Herrn Donberg bei der Fertigstellung der fotografischen Abzüge, und die
sekretärische Hilfe von Frau Bloch, haben Probleme in einzelnen Teilabschnitten der Arbeit
schnell vergessen lassen.
Sehr herzlich Danken möchte ich Frau Dr. Kerstin Krah und Frau Dr. Martina Manns für die
vielfältig anregenden Diskussionen und das Korrekturlesen des Manuskripts.
Ein besonderer Dank gilt meiner Frau Marion.
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung __________________________________________________________ 4
1.1 Fragestellung___________________________________________________________ 10
1.2 Das Modellsystem _______________________________________________________ 12
1.2.1
Das visuelle System der Taube ________________________________________________12
1.2.2
Die Retina ________________________________________________________________14
1.2.2.1 Retinale Verschaltungen___________________________________________________14
1.2.2.2 Morphologische Besonderheiten der Taubenretina ______________________________15
1.2.2.3 Verarbeitung visueller Informationen_________________________________________16
1.2.3
Das Tectum opticum ________________________________________________________16
1.2.3.1 Morphologie des Tectum opticum ___________________________________________17
1.2.3.2 Afferente und efferente Projektionen des Tectum opticum ________________________19
1.2.3.3 Verschaltung retinaler Informationen im Tectum opticum ________________________20
1.2.3.4 Funktionelle Studien zum Tectum opticum ____________________________________20
1.2.4
Entwicklung des visuellen Systems ____________________________________________21
1.3 Die Entwicklung des Nervensystems _______________________________________ 22
1.3.1
Neuronale Migration ________________________________________________________23
1.3.2
Genetische Determination ____________________________________________________24
1.4 Neurotrophine__________________________________________________________ 24
1.4.1
Die Struktur der Neurotrophine________________________________________________26
1.4.2
Die Neurotrophin-Rezeptoren _________________________________________________26
1.4.3
Die Signalkaskade nach Neurotrophin-Bindung ___________________________________28
1.4.4
Retrograde oder anterograde Signalleitung? ______________________________________28
1.4.5
Funktionen der Neurotrophine ________________________________________________29
1.5 Zielsetzung der Arbeit ___________________________________________________ 30
2
Material und Methoden ______________________________________________ 32
2.1 Material _______________________________________________________________ 32
2.2 Die Immunhistochemie __________________________________________________ 32
2.3 Retinale und Tectale Gewebeaufbereitung __________________________________ 32
2.3.1
Perfusion juveniler und adulter Tauben _________________________________________32
2.3.2
Immersionsfixierung juveniler und adulter Tauben ________________________________33
2.3.3
Immersionsfixierung embryonalen Gewebes _____________________________________34
2.4 Schneiden des Gewebes __________________________________________________ 34
2.4.1
Herstellung von Gefrierschnitten ______________________________________________34
2.4.2
Herstellung von Vibratomschnitten_____________________________________________35
1
Inhaltsverzeichnis
2.5 Die Antikörperherstellung________________________________________________ 36
2.5.1
Antikörper gegen BDNF _____________________________________________________36
2.5.2
Antikörper gegen NT-3 ______________________________________________________37
2.5.3
Antikörper gegen trk B ______________________________________________________37
2.5.4
Antikörper gegen trk C ______________________________________________________37
2.5.5
Antikörper gegen Vimentin___________________________________________________38
2.5.6
Sekundäre Antikörper _______________________________________________________38
2.6 Immunhistochemie für die Lichtmikroskopie ________________________________ 39
2.6.1
Avidin-Biotin Reaktion ______________________________________________________41
2.6.2
Diaminobenzidin-Reaktion ___________________________________________________42
2.6.2.1 DAB-Reaktion der Retina _________________________________________________42
2.6.2.2 DAB-Reaktion der Hirnschnitte _____________________________________________42
2.6.3
Fluoreszenz-Immunhistochemie _______________________________________________43
2.7 Prozessierung für die Transmissionselektronenmikroskopie____________________ 44
2.7.1
Immunhistochemie _________________________________________________________44
2.7.2
Einbettung in Epoxidharz ____________________________________________________44
2.7.3
Herstellung von Ultradünnschnitten ____________________________________________45
2.8 Kolokalisationsuntersuchungen im Tectum opticum __________________________ 45
2.9 Kresylviolett-Färbung ___________________________________________________ 45
3
2.10
Eindeckeln der Präparate ______________________________________________ 46
2.11
Lichtmikroskopie _____________________________________________________ 46
2.12
Transmissionselektronenmikroskopie ____________________________________ 46
2.13
Fluoreszenzmikroskopie _______________________________________________ 47
2.14
Konfokale Mikroskopie ________________________________________________ 47
2.15
Spezifitätskontrollen der Antikörper _____________________________________ 48
Ergebnisse_________________________________________________________ 49
3.1 Kontrollexperimente ____________________________________________________ 50
3.2 Retinale Expression von BDNF, NT-3, trk B und trk C ________________________ 50
3.2.1
Retinale BDNF Expression ___________________________________________________51
3.2.2
Retinale NT-3 Expression ____________________________________________________57
3.2.3
Retinale trk B-Expression ____________________________________________________62
3.2.4
Retinale trk C-Expression ____________________________________________________67
2
Inhaltsverzeichnis
3.3 Tectale Expression von BDNF, NT-3, trk B und trk C _________________________ 76
3.3.1
Tectale BDNF Expression____________________________________________________77
3.3.2
Tectale NT-3 Expression_____________________________________________________84
3.3.3
Tectale trk B Expression _____________________________________________________90
3.3.4
Tectale trk C Expression _____________________________________________________97
3.4 Ultrastrukturelle Untersuchungen im Tectum opticum adulter Tauben _________ 106
3.4.1
Rekonstruktion der tectalen Schichtung im Semidünnschnitt ________________________106
3.4.2
Ultrastrukturelle Lokalisation von BDNF _______________________________________110
3.5 Kolokalisationsuntersuchungen im Tectum opticum _________________________ 118
4
3.5.1
BDNF – Vimentin _________________________________________________________119
3.5.2
NT-3 – Vimentin __________________________________________________________121
3.5.3
Trk B – Vimentin _________________________________________________________124
3.5.4
Trk C – Vimentin _________________________________________________________126
Diskussion________________________________________________________ 129
4.1 Trophische Mechanismen in der Retina ___________________________________ 130
4.2 Trophische Mechnismen im Tectum opticum _______________________________ 134
4.3 Neuronale Migration tectaler Neuronen ___________________________________ 137
4.4 BDNF und NT-3 als retrograde Signalstoffe ________________________________ 143
4.5 BDNF und NT-3 als anterograde trophische Signalstoffe _____________________ 146
4.6 Ultrastrukturelle Untersuchungen des Tectum opticum ______________________ 149
4.7 Aktivitätsabhängige Ausschüttung der Neurotrophine _______________________ 151
4.8 Aktivitätsabhängige Expression von BDNF, NT-3, trk B und trk C _____________ 153
4.9 Neurotrophin-induzierte intrazelluläre Signale _____________________________ 155
4.10
Wird visuelle Lateralisation durch Neurotrophine gesteuert? _______________ 156
4.11
Ausblick ___________________________________________________________ 161
4.12
Therapeutische Einsatzmöglichkeiten von Neurotrophinen _________________ 162
5
Zusammenfassung _________________________________________________ 165
6
Literatur _________________________________________________________ 168
3
Einleitung
4
1 Einleitung
Für die Entwicklung sich aktiv bewegender komplexer Organismen war die Bildung eines
effizienten neuronalen Kontrollsystems wichtig, über welches Informationen aus der Umwelt
aufgenommen werden, um in einer für das jeweilige Individuum sinnvollen Weise auf einzelne
Reize zu reagieren. Die ersten, einfach organisierten Nervennetze zeigen die Coelenteraten. Im
Laufe der Evolution entwickelten sich solche Nervennetze zu Nervensystemen weiter, wobei
insbesondere das als übergeordnete Steuereinheit fungierende Gehirn schließlich bei den
phylogenetisch jungen Klassen der Vögel und Säuger eine hohe nervale Komplexität erreicht.
Grundlage der Komplexität ist die morphologische Vielfalt von Neuronen und Gliazellen, den
Bausteinen des Nervensystems, und deren vielfältige Verschaltungen, begründet in den
spezifischen
Anforderungen
der
Informationsaufnahme,
Informationsverarbeitung
und
Informationsweiterleitung.
Ein Teil dieser neuralen Leistungen sind asymmetrisch organisiert (Broca, 1865). So werden
kognitive Teilleistungen bei der Verarbeitung von sensorischen Informationen, Gedächtnis,
Emotionen, motorischer Kontrolle, Sprache und vielen anderen Sinnesqualitäten im Gehirn häufig
von einer Hemisphäre dominant ausgeführt (Hellige, 1993; Davidson & Hugdahl, 1995).
Gleichwohl aber zum Beispiel die linksseitige Dominanz bestimmter Komponenten der Sprache
im menschlichen Gehirn seit nunmehr 150 Jahren bekannt ist, so ist die neuronale Basis für die
Asymmetrie von Sprachverarbeitung nicht klar verstanden, ebenso wie die Mechanismen, welche
zur Ausbildung von Asymmetrien im menschlichen Gehirn führen.
Um weitere Informationen über die asymmetrische Organisation des menschlichen Gehirns zu
erhalten, muß zunächst die Frage gestellt werden, wodurch Asymmetrien in diesem System
ausgezeichnet sind und welche meßbaren Parameter für diese Asymmetrien vorliegen. Ein
morphologisches Kriterium für Asymmetrien im Gehirn sind Größenunterschiede bestimmter
Areale zwischen linker und rechter Hemisphäre, die Ausdruck unterschiedlicher Neuronengrößen,
Dichteunterschiede der Neuronen sowie deren Verschaltungen sein können. Die Schwierigkeiten
bei der Beschreibung solcher Asymmetrien liegen darin, daß die Unterschiede zwischen den
beiden Hemisphären häufig sehr fein sind. Bei dem menschlichen Gehirn ergibt sich das weitere
Problem, daß morphologische Studien nur begrenzt möglich sind, zumeist an postmortalem
Gewebe älterer Personen, bei denen häufig zusätzliche Begleiterscheinungen wie altersabhängige
Demenzen die Erhebung von gesicherten Daten erschweren. Gänzlich unmöglich sind darüber
Einleitung
5
hinaus Studien zur Ontogenese von Hirnasymmetrien, die beim Menschen schon im Embryo
etabliert sind, nach der Geburt in einer kritischen Phase aber modifizierbar bleiben.
Da das Phänomen von links-rechts Asymmetrien des Gehirns auch im Tierreich weit verbreitet ist,
können gerade Untersuchungen an einem einfachen, klar zu beschreibenden Objekt weitere
Erkenntnisse
über
asymmetrische
Organisationsprinzipien
des
Gehirns
liefern.
Als
Untersuchungsobjekt zum Studium von Asymmetrien bietet sich hierbei das visuelle System der
Vögel an, bei denen in der linken und rechten Hemisphäre verschiedene Aspekte visueller
Informationen verarbeitet werden. Die Daten zur Lateralisation des Gehirns bei verschiedenen
Vögeln konnten zumeist in Versuchen mit einseitigen Augenkappen gewonnen werden, die
aufgrund der vollständigen Kreuzung des optischen Nervs zur kontralateralen Hirnhälfte (Weidner
et al., 1985) das gezielte Studium einer Hirnhälfte ermöglichen. Insbesondere bei der Taube
Columba livia wurde die lateralisierte Informationsverarbeitung verschiedener visueller Stimuli
demonstriert. Hierbei zeigen Untersuchungen, daß das rechte Auge dominant ist bei der
Unterscheidung zwei-dimensionaler unnatürlicher Objekte (Güntürkün, 1985) und dreidimensionaler natürlicher Objekte (Güntürkün & Kesch, 1987), ebenso wie bei dem Erkennen
geometrischer optischer Illusionen (Güntürkün, 1997b). Asymmetrien wurden außerdem auch im
visuellen Gedächtnis mit deutlicher Dominanz des rechten Auges, beziehungsweise der linken
Hemisphäre gezeigt (v. Fersen & Güntürkün, 1990). In einem Freilandversuch zeigten Tauben
nach dem Aussetzen an einem entfernten Ort Vorteile bei dem Zurückfinden zu ihrem Heim über
ein ihnen bekanntes Gebiet bei der Betrachtung mit dem rechten Auge (Ulrich et al., 1999).
Desweiteren entwickeln sich kognitiven Prozesse wie „learning to learn“ Effekte schneller beim
Gebrauch des rechten Auges im Vergleich zum Gebrauch des linken Auges (Diekamp et al.,
1999). In unilateralen Läsionsstudien in der Taube bestätigte sich die Dominanz der linken
Hemisphäre bei der visuellen Informationsverarbeitung durch deutliche Einbußen nach
linksseitigen versus rechtsseitigen Läsionen (Güntürkün & Hoferichter, 1985; Güntürkün &
Hahmann, 1999). Zusammen zeigen diese Daten eine Dominanz des rechten Auges und der
linken Hemisphäre bei der Analyse visueller Objekte. Die Dominanz der linken Hemisphäre bei
visuellen Aufgaben wurden auch bei anderen Vögeln wie Hühnchen (Mench & Andrew, 1986;
Rogers, 1996; Vallortigera et al., 1996), Zebrafinken (Alonso, 1998), und Meisen (Clayton &
Krebs, 1994) bestätigt.
Grundlage der beobachteten Lateralisation bei der Verarbeitung visueller Stimuli sind nicht
periphere Faktoren, wie zum Beispiel Unterschiede in der Sehschärfe, Detektion bestimmter
Einleitung
6
Wellenlängen oder Tiefenauflösungen der beiden Augen (Martinoya et al., 1988; Remy &
Emmerton, 1991; Güntürkün & Hahmann, 1994), sondern vermutlich strukturelle Asymmetrien in
den beiden großen aufsteigenden visuellen Sehbahnen bei Vögeln, dem thalamofugalen System
(Retina >> Nucleus geniculatus lateralis pars dorsalis >> Wulst) und tectofugalen System (Retina
>> Tectum opticum >> Nucleus rotundus >> Ectostriatum), die vermutlich mit lateralisiertem
Verhalten im Hühnchen (Rogers, 1996) und Tauben korreliert (Skiba et al., im Druck). Während
im thalamofugalen System vermutlich visuelle Prozesse der Mustererkennung und dem Erkennen
von Bewegungen verarbeitet werden (Hodos, 1976; Wilson, 1980; Macko & Hodos, 1984;
Güntürkün et al. 1989), so werden im tectofugalen System visuelle Informationen über Farbe,
Muster und Bewegungen von Objekten verarbeitet (Hodos, 1969; Hodos & Karten, 1970;
Wang et al., 1993).
Anatomisch unterscheiden sich das tectofugale und thalamofugale System voneinander durch die
differierende Repräsentation des visuellen Gesichtsfeldes. Im roten Feld der Retina, welches im
dorso-temporalen Quadranten der Netzhaut liegt, wird das binokulare frontale Gesichtsfeld
abgebildet. Dieser Teil der Retina projiziert nahezu ausschließlich in das tectofugale System,
während die Projektionen vom gelben Feld der Retina, welches sich über die gesamte Netzhaut
mit Ausnahme des roten Feldes erstreckt, zumeist in das thalamofugale System ziehen (Remy &
Güntürkün, 1991). Im thalamofugalen System werden somit Informationen des monokularen
lateralen
Gesichtsfeldes
verarbeitet
(Güntürkün
&
Hahmann,
1999).
Die
in
Verhaltensexperimenten gewonnen Daten über die lateralisierte Verarbeitung visueller
Informationen wurden zumeist in Skinner-Boxen erhoben, wobei die visuellen Stimuli im
binokularen frontalen Gesichtsfeld lagen. In einer solchen Lernbox ist die Datenaufnahme zur
Verarbeitung visueller Informationen im thalamofugalen System sehr schwierig, und wird in der
Aussagekraft gegenwärtig diskutiert.
Begleitend zu den Ergebnissen aus Verhaltensversuchen und elektrophysiologischen Experimenten
wird seit einigen Jahren auch nach morphologischen und biochemischen Asymmetrien im visuellen
System von Vögeln gesucht. In Lateralisationsuntersuchungen des thalamofugalen Systems bis zu
zwei Wochen alter Hühnchen wurden hierbei morphologische und biochemische Asymmetrien
erkannt. So sind die Projektionen vom linken Nucleus geniculatus lateralis pars dorsalis auf den
visuellen Wulst der rechten Hemisphäre signifikant größer als von der rechten auf die linke
Hemisphäre (Rogers & Sink,1988; Rogers & Bolden, 1991; Rejendra & Rogers, 1993). Für die
Basalganglien konnten Stewart und Mitarbeiter (1992b) desweiteren zeigen, daß bei zwei Tage
Einleitung
7
alten Hühnchen die synaptische Dichte rechts um 22% größer ist als links. Bei diesen wurden
weitere neuroanatomische subzelluläre Asymmetrien darüber hinaus auch in einer rechtshemisphärisch höheren Dichte und Größe dendritischer Spines (Stewart et al., 1984; Stewart,
1991) sowie im Spinekopfdurchmesser in den Basalganglien gefunden (Patel & Stewart, 1988).
Auch biochemisch konnten Asymmetrien zwischen den beiden Hemisphären in jungen Hühnchen
gezeigt werden, die sich in einer rechtsseitig gesteigerten NMDA-Sensitivität (Stewart et al,
1992a) und [14C]2-desoxyglucose Aufnahme bei visueller neuronaler Aktivität (Rose & Csillag,
1985), und einer einseitig um 50% höheren Anzahl von Vesikeln pro Synapse (Stewart et al.,
1984) ausdrückt. Gleichwohl muß an dieser Stelle erwähnt werden, daß in adulten Hühnchen die
beschriebenen morphologischen links-rechts Unterschiede nicht mehr nachweisbar sind, und auch
adulte Tauben keine morphologischen Asymmetrien im thalamofugalen System zeigen (Burkhard
Hellmann, persönliche Korrespondenz).
Messungen der Perikariengröße in den superficialen Schichten des Tectum opticum von Tauben
ergaben links-hemisphärisch signifikant größere Somata als rechts-hemisphärisch (Güntürkün,
1997a), ebenso wie im Nucleus rotundus (Manns & Güntürkün, 1999b). Die Projektionen von
Neuronen des Tectum opticums auf den Nucleus rotundus sind bilateral organisiert (Hellmann &
Güntürkün, 1999), wodurch im tectofugalen System jeder Hemisphäre das ipsi- und
kontralaterale Auge repräsentiert ist. In Tauben ist der Anteil ipsi- und kontrolateraler
tectorotundaler Projektionen asymmetrisch, mit zweimal mehr Neuronen vom rechten Tectum
opticum zum linken Nucleus rotundus als umgekehrt (Güntürkün et al. 1999). Daher erhält der
Nucleus rotundus der dominanten linken Hemisphäre neben den Efferenzen des ipsilateralen TO
auch massiven Eingang von der kontralateralen Seite mit der Konsequenz einer deutlichen
anatomischen Asymmetrie des visuellen Eingangs links-hemisphärisch. Die funktionelle Relevanz
dieser Asymmetrie liegt vermutlich in der Integration visueller Informationen des binokularen
Gesichtsfeldes im linken Nucleus rotundus (Güntürkün & Hahmann, 1999; Skiba et al., im
Druck).
Die Verarbeitung visueller Informationen in den beiden großen aufsteigenden Systemen korreliert
möglicherweise mit einer Aufteilung der Hemisphären bei der Verarbeitung verschiedener visueller
Informationsqualitäten (Farbe, Bewegung, Muster, usw.) da zumindest das tectofugale System
deutlicher in der linken Hemisphäre repräsentiert ist. Inwieweit bei adulten Vögeln die
Verarbeitung visueller Informationen im thalamofugalen System dominant in der rechten
Hemisphäre erfolgt, bleibt gegenwärtig noch unbeantwortet. Möglicherweise wird über eine
Einleitung
8
Aufteilung der Verarbeitung visueller Stimuli in den beiden großen aufsteigenden Sehbahnen eine
Konfliktvermeidung bei der Informationsverarbeitung gewährleistet, gleichwohl visuelle
Informationen auch in beiden Systemen parallel verarbeitet werden (Rogers, 1996).
Die Ergebnisse verschiedener biochemischer, anatomischer und verhaltensphysiologischer
Untersuchungen deuten darauf hin, daß bei der Determination von Körperasymmetrien genetische
und epigenetische Faktoren eine Rolle spielen. Hierbei werden die ersten bei Vertebraten zu
beobachtenden Körperasymmetrien, wie die Anlage der visceralen Organe Milz, Leber und Herz
durch eine Reihe von Signalmolekülen bestimmt, die während bestimmter Entwicklungsvorgänge
einseitig exprimiert werden (Levin et al., 1995; Yost, 1995). Im Hühnerembryo konnte gezeigt
werden, daß ein Signalmolekül namens Activin während der Gastrulation asymmetrisch exprimiert
wird und an entsprechenden symmetrisch exprimierten Rezeptoren (cAct RIIb) bindet. Dies
wiederum induziert die Expression eines weiteren Rezeptors (cAct RIIa) auf der rechten Seite,
wodurch die Expression eines weiteren Signalmoleküls (Shh) auf die linke Seite begrenzt bleibt.
Anschließend wird das Gen „cNR-1“, welches ein sekretorisches Signalmolekül der TGFßFamilie („transforming growth factor-ß“) codiert, asymmetrisch linksseitig exprimiert. Dieses
sekretorische Signalmolekül nimmt im folgenden Einfluß auf das Wachstum der umliegenden
Zellen (Levin et al., 1995), und bedingt eine Rotation des Embryos im Ei (Robertson, 1997).
Die Existenz einer molekularen Signalkaskade von asymmetrisch exprimierten Signalmolekülen
während der Gastrulation zeigt, daß im Hühnerembryo links-rechts Asymmetrien determiniert
sind, bevor erste morphologische Asymmetrien zu beobachten sind. Neben den genetischen
Faktoren konnte in den letzten Jahren auch der Einfluß von epigenetischen Faktoren auf die
Ausbildung von Asymmetrien, insbesondere bei der Verarbeitung visueller Informationen, näher
beschrieben werden. Als Modellsystem für die Untersuchung solcher Phänomene bietet sich das
zunächst einfach aufgebaut erscheinende visuelle System von Vögeln an, bei denen die
vollständige Kreuzung des optischen Nervs differenzierte Studien eines Auges / einer Hemisphäre
ermöglichen. Nach einer einseitigen oder beidseitigen Manipulation, zum Beispiel durch
Augenkappen, können im visuellen System gezielt Effekte in der jeweils kontralateralen
Hemisphäre beziehungsweise in beiden Hemisphären gleichermaßen untersucht werden.
In ontogenetischen Studien wurde gezeigt, daß eine Dunkelinkubation der Eier die Ausbildung
von visuellen Asymmetrien in Hühnchen (Rogers, 1982) und Tauben verhindert (Güntürkün,
Einleitung
9
1993). Außerdem führt bei Tauben, nicht aber bei Hühnchen, eine zehntägige monokulare
Deprivation des rechten Auges beginnend nach dem Schlupf zu einer Umkehr der links-rechts
Asymmetrien, während die monokulare Deprivation des linken Auges eine Verstärkung der
normalen Dominanz der linken Hemisphäre im tectofugalen System bewirkt (Manns &
Güntürkün, 1999a). Augenkappenversuche zwanzig Tage nach dem Schlupf zeigten hingegen
keine Effekte auf Asymmetrien im visuellen System der Taube (Manns, 1998).
Aus diesen Experimenten wird ersichtlich, daß Manipulationen der visuellen Erfahrungen
funktionelle Asymmetrien in einem kritischen Zeitfenster beeinflussen, bei Hühnchen nur im
Embryo, bei Tauben auch während einer gewissen Phase nach dem Schlupf. Darüber hinaus
zeigen die Ergebnisse, daß die Asymmetrien im visuellen System bei Hühnchen und Tauben durch
den epigenetischen Faktor Licht vor dem Schlupf gesteuert werden (Rogers, 1996).
Bis zur Etablierung dieser Hirnasymmetrien im visuellen System der Vögel kommt es vermutlich zu
einer Kaskade von Ereignissen, an deren Anfang vermutlich genetisch determinierte
Signalkaskaden stehen (siehe oben), die zu einer asymmetrischen Lage des Vogelembryos im Ei
führen (Kuo, 1932). Diese Position des Embryos im Ei bedingt eine Abschattung des linken
Auges durch den Körper, während das rechte Auge der Eischale zugewandt ist. Durch die
Eischale eindringendes Licht, welches vermutlich primär vom rechten Auge perzipiert werden
kann, ist bei der Taube der epigenetische Faktor, welcher die Ontogenese der visuellen
Lateralisation des Taubengehirns steuert.
Einleitung
1.1
10
Fragestellung
In der Ontogenese des Nervensystems ist das Grundgerüst, daß heißt seine Kompartimentierung
in verschiedene Hirnanteile mit einem jeweils charakteristischen Aufbau, genetisch determiniert.
Die hohe, zum Teil asymmetrische Organisation des Gehirns, mit der Fähigkeit zu Lernen, dem
Erinnerungsvermögen sowie der überlegten Handlung, erfordert jedoch viele Feinabstimmungen,
zum Beispiel bezüglich der Morphologie von Neuronen und deren synaptischer Verbindungen.
Hierbei beeinflussen epigenetische Faktoren Musterbildungsprozesse (Purves & Lichtman, 1985),
wobei ein Anstieg an Komplexität durch die Interaktion zwischen einem induzierenden und einem
antwortenden Gewebe erreicht wird (Nieuwkoop et al., 1985).
Im visuellen System von Vögeln ist die linke Hemisphäre dominant bei der detaillierten Analyse
von visuellen Merkmalen, während die rechte Hemisphäre dominant räumliche Prozesse und die
Erinnerung bekannter Objekte in einem sozialen Kontext verarbeitet (Güntürkün, 1997c). Diese
Lateralisation im visuellen System ist vergleichbar mit Hirnasymmetrien beim Menschen, was
daraufhin deutet, daß zumindest ein Teil der Lateralisationen im Gehirn einen gemeinsamen
Ursprung zwischen Mammaliern und Vögeln hat (Güntürkün, 1997c).
Bei den Vögel ist der epigenetische Faktor Licht ein wichtiger Parameter für die Etablierung
visueller Lateralisationen. In einer Kaskade von Signalen sind Mechanismen wahrscheinlich, bei
denen eine genetisch determinierte Lage des Vogelembryos im Ei eine asymmetrische
Lichtstimulation des visuellen Systems bedingt. Die Konsequenzen sind vermutlich
unterschiedliche Aktivitätsmuster der beiden Augen zu bestimmten Phasen der embryonalen
Entwicklung, die nach einer Umwandlung in entsprechende molekulare Signale die beschriebenen
morphologischen
Asymmetrien
im
Vogelhirn
bewirken.
Solche
morphologischen
Organisationsprinzipien korrelieren wiederum mit lateralisierter Informationsverarbeitung sowie
lateralisiertem Verhalten.
Um das Phänomen der Asymmetrie des Gehirns weiter zu verstehen, sind verschiedene
experimentelle Ansätze denkbar, die unterschiedliche Teilaspekte in dem Gesamtkomplex
Lateralisation behandeln. In Verhaltensversuchen können immer feinere Unterschiede der
Informationsverarbeitung im Gehirn erfaßt werden. Verhaltensversuche kombiniert mit gezielten
Läsionsstudien lassen zumeist eine genaue Überprüfung der gewonnen Ergebnisse über
asymmetrische Informationsverarbeitung zu.
Einleitung
11
Neben diesen Ergebnisse zur asymmetrischen Informationsverarbeitung im Gehirn können
histologische Untersuchungen weitere grundlegende Daten für morphologische Korrelate von
lateralisiertem Verhalten liefern. Insbesondere ein histologisches Studium der Ontogenese des
visuellen Systems sollte dazu beitragen, neue Erkenntnisse über die Etablierung von Lateralisation
zu gewinnen.
Zum Verständnis der Konsequenzen molekularer Signalwege müssen hierbei nicht nur die
Mechanismen erforscht werden, welche zu einer asymmetrischen Verteilung der Signalmoleküle
führen, sondern auch die Mechanismen, über welche Zellen die asymmetrisch exprimierten
Signale interpretieren. Möglicherweise erfüllen trophische Faktoren, zu denen die Gruppe der
Neurotrophine zählen, wichtige Funktionen bei der Etablierung von Organisationsstrukturen im
Gehirn. Wie in den weiteren Ausführungen eingehend beschrieben wird, sind Neurotrophine
endogene, lösliche Proteine, die das Überleben, das Wachstum, die morphologische Plastizität
und die Synthese von Proteinen in Neuronen regulieren (Hefti et al., 1993).
In der vorliegenden Arbeit wird die Expression der beiden Neurotrophine “brain-derived
neurotrophic factor” und “neurotrophin-3” sowie der zugehörigen “high-affinity”-Rezeptoren
trk B und trk C während der Entwicklung der retino-tectalen Konnektivitäten in der Taube
Columba livia untersucht. In dieser ontogenetischen Expressionsstudie dieser aktivitätsabhängig
exprimierten und freigesetzten Neurotrophine soll die Frage untersucht werden, welche Rolle
Neurotrophine möglicherweise als Vermittler zwischen dem epigenetischer Faktor Licht und dem
Auftreten von morphologischen Asymmetrien in diesem System erfüllen.
Die Taube als Tiermodell zur Untersuchung des Einflusses neurotropher Faktoren während der
Etablierung und Stabilisierung des visuellen System eignet sich für diese Untersuchungen in
vielfältiger Weise. Es handelt sich um eine Tierart, deren Nervensystem eine hohe Komplexität mit
deutlichen morphologisch und verhaltensphysiologisch charakterisierten Asymmetrien zeigt.
Außerdem ist die morphologische Entwicklung des retino-tectalen Systems dieser beim Schlupf
noch unreifen Vögel gut charakterisiert. Die Innervation retinaler Axone in das Tectum opticum
beginnt vier Tage vor dem Schlupf und dauert etwa zwanzig Tage an, wobei sich parallel die
tectale Schichtung etabliert (Manns & Güntürkün, 1997). In diesem Zeitraum von etwa drei
Wochen werden darüber hinaus die morphologischen und funktionellen Asymmetrien des
visuellen Systems determiniert (Manns & Güntürkün, 1999a), ein Prozeß, der zum Beispiel bei
den nesthockenden Hühnchen bereits beim Schlupf abgeschlossen ist (Rogers, 1996).
Einleitung
12
In den folgenden Abschnitten wird das in der vorliegenden Arbeit untersuchte Modellsystem, das
retino-tectale System der Taube Columba livia, eingehend beschrieben, bevor einige Grundlagen
der Etablierung des Nervensystems bei Vertebraten allgemein dargestellt werden. Anschließend
werden die untersuchten Neurotrophine und Neurotrophin-Rezeptoren vorgestellt, und die
bekannten Wirkungsmechnismen dieser Signalmoleküle während der Etablierung verschiedener
Systeme als auch in Adulten kurz skizziert.
1.2
Das Modellsystem
Als Modell für die Untersuchungen neurotropher Mechanismen wurde das retino-tectale Systems
der Taube Columba livia, welche zur Klasse der Vögel (Aves) gehört, ausgewählt. Die
Entwicklung des bei dieser Spezies gut ausgeprägten und komplexen visuellen Systems ist mit
dem Schlupf der Tiere nicht abgeschlossen, sondern dauert bis nach dem Schlupf an (Manns &
Güntürkün, 1997). In den folgenden Abschnitten wird die Komplexität der retino-tectalen
Informationsfortleitung dargestellt deren Etablierung vermutlich eine Vielzahl an Feinanpassungen
erfordert.
1.2.1 Das visuelle System der Taube
Die tagaktive Taube Columba livia ist eine visuell hochentwickelte Spezies (Emmerton, 1983).
Bereits ihre seitlich am Kopf plazierten Augen deuten durch die Größe im Vergleich zum Kopf auf
die Dominanz dieser Sinnesorgane hin. Visuelle Informationen, welche in Form von Lichtreizen
die Linse und den Glaskörper passieren, werden am Augenhintergrund auf der Retina abgebildet.
Von dieser nehmen die Projektionen des visuellen Systems als Nervus opticus ihren Ursprung.
Der Nervus opticus, mit ca. 2.4 Millionen Axonen (Binggelli & Paule, 1969) etwa 2.5mal
faserreicher als der Nervus opticus des Menschen (Curcio & Allen, 1990), kreuzt nahezu
vollständig im Chiasma opticum (Cowan et al., 1961), um in der kontralateralen Hirnhälfte im
Nucleus geniculatus lateralis, pars ventralis (GLv) et pars dorsalis (GLd), Nucleus
suprachiasmaticus, Area praetectalis, Nucleus lentiformis mesencephali, Nucleus of the
Basal Optic Root (nBor), und im Tectum opticum zu terminieren (Hirschberger, 1967; Karten
& Nauta, 1968; Meier & Cuénod, 1973).
Einleitung
13
Ein geringer Anteil an ipsilateralen Projektionen zieht zum nBor (Güntürkün & Karten, 1991,
Shimizu et al., 1994), zum GLv (Shimizu et al., 1994), zu den Nuclei praetectalis
parvocellularis et magnocellularis (Shimizu et al., 1994), und zum Nucleus lateralis anterior
(Remy & Güntürkün, 1991; Shimizu et al., 1994).
Die beiden großen aufsteigen Sehbahnen bilden das thalamofugale und das tectofugale System.
Im thalamofugalen System findet die Informationsfortleitung von der Retina über den GLd zum im
Vorderhirn gelegenen visuellen Wulst statt. Im tectofugalen System wird visuelle Information von
der Retina zum mesencephalen Tectum opticum, und von dort über den diencephalen Nucleus
rotundus zum telencephalen Ectostriatum weitergeleitet. Das thalamofugale System entspricht dem
geniculocorticalen System, das tectofugale System dem extrageniculocorticalen System der
Säuger (Karten & Shimizu, 1989).
Da retinale Axone zu 75-95% im Tectum opticum terminieren (Remy & Güntürkün, 1991), und
es sich hierbei um ein durch epigenetische Faktoren beeinflußtes System handelt (Güntürkün,
1997a), waren in der vorliegenden Arbeit neurotrophe Mechanismen in der Retina und dem
Tectum opticum sowie bei der Etablierung retino-tectaler Konnektivitäten von besonderem
Interesse.
1.2.2 Die Retina
Bei der Taube zeigt die Retina den für Vertebraten typischen Aufbau aus zellkörperreichen
(nukleären) und zellkörperarmen (plexiformen) Schichten (Abbildung 2). In der adulten Retina
finden sich zwei plexiforme Schichten,
eine äußere plexiforme Schicht (ÄpS)
und eine innere plexiforme Schicht
(IpS) sowie drei nukleäre Schichten,
eine äußere nukleäre Schicht (Äns),
eine innere nukleäre Schicht (InS),
und eine Ganglion-Zellschicht (GzS).
Den einzelnen nukleären Schichten
der Retina läßt sich eine begrenzte
Anzahl an Zelltypen zuordnen. In der
Abbildung 2: Skizze nach Wässle & Boycott (1991)
Licht wird von den Photorezeptoren in elektrische
Signale umgewandelt, welche über die Bipolarzellen zu
den retinalen Ganglienzellen weitergeleitet werden, deren
Axone als einzige die Retina verlassen. Horizontal- und
ÄnS
sind
sogenannte
Einleitung
14
Photorezeptoren lokalisiert, in der InS Horizontal-zellen, Amakrinzellen, inter-plexiforme Zellen
und Bipolar-zellen; und die Ganglienzellen sind Namensgeber der entsprechenden GzS (Wässle
& Boycott, 1991).
1.2.2.1
Retinale Verschaltungen
Zwei Typen an Photorezeptoren können unterschieden werden, die äußerst lichtempfindlichen
Stäbchen, denen besondere Bedeutung beim Dämmerungssehen zukommen und die für das
Farbsehen verantwortlichen Zapfen und Doppelzapfen (Morris, 1970; Mariani & Leure-DuPree,
1978). Grundsätzlich bestehen Photorezeptoren aus einem inneren und einem äußeren Segment,
wobei das innere Segment in der ÄnS, das äußere Segment in der ÄpS lokalisiert ist (Nalbach et
al., 1993). Das innere Segment dient der Energieversorgung und der Proteinsynthese, wohingegen
im äußeren Segment Lichtreize mit Hilfe von Sehfarbstoffen in elektrische Signale umgewandelt
werden. Diese elektrischen Signale werden über nachgeschaltete Bipolarzellen zu den retinalen
Ganglienzellen weitergeleitet, die auch als zweite und dritte Neuronen der visuellen
Projektionsbahn bezeichnet werden.
Jede Bipolarzelle erhält ihre Eingänge von Stäbchen oder Zapfen. Zumeist versorgen 15-45
Stäbchen oder alternativ 5-20 Zapfen eine Bipolarzelle. In den Foveae, retinalen Bereichen mit
besonders hoher Sehschärfe, ist hingegen eine 1:1 Verschaltung von Zapfen auf Bipolarzellen zu
verzeichnen (Sterling et al., 1988). Die Bipolarzellen, welche keine eigenen Impulse erzeugen,
sondern auf Lichtaktivierung der Photorezeptoren mit anhaltenden De- oder Hyperpolarisationen
reagieren, stehen im synaptischen Kontakt mit den retinalen Ganglienzellen. Deren Axone
verlassen als einzige die Retina, um als Nervus opticus den Ursprungsort der retinalen
Projektionen zu bilden. Eine Subpopulation an Ganglienzellen ist außerdem in der InS lokalisiert
und wird als “displaced ganglion cells” (DGCs) bezeichnet (Brecha & Karten, 1981). Solche
mittelgroßen und großen DGCs haben bis in die IpS reichende Dendriten (Britto et al., 1988) und
projizieren zum Nucleus accessorius bei Vögeln (Fite et al., 1981). Sie sind vornehmlich in der
peripheren Retina lokalisiert (Prada et al., 1989; Prada et al., 1992). Ein geringer Anteil an
kleinen DGCs liegt hingegen in der zentralen Retina, wobei die Projektionen dieser Neuronen
noch unbekannt sind (Hayes & Holden, 1983).
Die in der InS lokalisierten Horizontalzellen und Amakrinzellen fungieren in der Retina als
Interneuronen. Horizontalzellen stellen den Kontakt zwischen verschiedenen Photorezeptoren her.
Einleitung
15
Sie sind untereinander über elektrische Synapsen, sogenannte Gap-junction Proteine, verbunden.
Die Funktion der Horizontalzellen liegt vermutlich in der Integration der Erregung verschiedener
Photorezeptoren. Die Amakrinzellen stehen im synaptischen Kontakt sowohl mit Bipolarzellen als
auch Ganglienzellen, wodurch eine abgestimmte Erregung retinaler Ganglienzellen möglich wird.
1.2.2.2
Morphologische Besonderheiten der Taubenretina
In der Taubenretina lassen sich zwei verschieden gefärbte Bereiche gegeneinander abgrenzen: das
“rote Feld” im dorso-temporalen Quadranten von dem sich über die restliche Retina
erstreckenden “gelben Feld”. Für das Farberscheinen dieser Felder verantwortlich sind
verschiedenfarbige Öltropfen (Galifret, 1968), welche im inneren Segment der Zapfen vorliegen
(Bloch & Marturana, 1971; Mariani & Leure-DuPree, 1978). Bestandteile dieser Öltropfen sind
gelöste Karotinoide (Varela et al., 1993). Die Funktion der Öltropfen liegt in der Absorption von
Licht unterhalb einer spezifischen Wellenlänge, wobei die sogenannten “cut-off” Filter die für
einen Photorezeptor sensitivsten Lichtwellenlängen passieren lassen (Bowmaker, 1977;
Emmerton, 1983; Young & Martin, 1984; Kawamuro et al., 1997, Hart et al., 1998).
Desweiteren sind in der Taubenretina zwei Bereiche erhöhter Ganglienzelldichte abzugrenzen, die
“Area dorsalis” im roten Feld und die “Area centralis” im gelben Feld (Binggeli & Paule, 1969;
Hayes & Holden, 1983).
1.2.2.3
Verarbeitung visueller Informationen
In der Vogelretina werden große, mittelgroße und kleine Ganglienzellen unterschieden, die durch
morphologische und elektrophysiologische Kennzeichen, ähnlich denen der Y-, X, und W-Zellen
der Katzenretina (Illing & Wässle, 1981), gegeneinander abzugrenzen sind (Hayes & Holden,
1980; Remy & Güntürkün, 1991).
Die beschriebene morphologische Unterteilung der Taubenretina in ein rotes und ein gelbes Feld
korreliert mit der differenzierten Verarbeitung visueller Information. Im roten Feld, welches das
ventro-frontale, binokulare Gesichtfeld der Taube repräsentiert, werden Informationen über nahe,
am Boden liegende Objekte, wie zum Beispiel Futter, aufgenommen (Bloch & Martinoya, 1982;
Uhlrich et al., 1982). Hingegen werden mit der im gelben Feld gelegenen Area centralis, in der
das monokulare, laterale Gesichtsfeld abgebildet wird, weit entfernte Objekte fixiert (Blough,
Einleitung
16
1971). Die Area centralis ist die Region der maximalen visuellen Auflösung der Taubenretina
(Hahmann & Güntürkün, 1993).
Charakteristisch für die Vogelretina ist die Verarbeitung komplexer Reizmuster auf retinaler
Ebene. So wurde in den sechziger Jahren in elektrophysiologischen Untersuchungen eine direkte
Einzellaktivierung auf individuelle Reizparameter wie Bewegung und Orientierung in der Netzhaut
gemessen (Marturana, 1962; Marturana & Fenk, 1963).
1.2.3 Das Tectum opticum
Das mesencephale Tectum opticum (TO) ist Bestandteil der tectofugalen Sehbahn. Nach nahezu
vollständiger Kreuzung im Chiasma opticum terminieren ca. 75-95% der Axone retinaler
Ganglienzellen im kontralateralen TO (Remy & Güntürkün, 1991), um von dort über den
thalamischen Nucleus rotundus ipsilateral zum telencephalen Ectostriatum zu projizieren. Diese
aufsteigende Sehbahn vergleichen Karten & Shimizu (1989) mit dem extragenikulostriatären
System der Säuger, bei welchen die Projektion von der Retina über den mesencephalen
Colliculus superior zum thalamischen Pulvinar und anschließend weiter zum extrastriatärem Cortex
verläuft.
1.2.3.1
Morphologie des Tectum opticum
Mit einer ca. 6mm großen Ausdehnung in der rostro-caudal Achse ist das TO im Vergleich zur
Gesamtlänge des Taubengehirns (20mm) proportional gut ausgeprägt. Im Nissl-Präparat zeigt
sich eine deutliche laminäre Struktur, wobei nukleäre und plexiforme Schichten unterschieden
werden. Nach Ramon y Cajal (1911)
werden im TO adulter Tauben von außen
nach innen, daß heißt von der Oberfläche
zum
Seitenventrikel,
15
Schichten
unterschieden, die mit den arabischen
Nummern 1 bis 15 belegt sind (Abbildung
3). Kennzeichnend für die einzelnen
Schichten sind das Vorkommen diverser
Zelltypen (Hayes & Webster, 1975),
Abbildung 3: Die einzelnen Schichten des TO
adulter Tauben, nach Ramon y Cajal (1911) mit
den arabischen Nummer 1-15 belegt, sind im
Nissl-Präparat gut abgrenzbar.
Einleitung
17
dorso-ventrale Unterschiede in der Schichtdicke (Hayes & Webster, 1985) sowie Unterschiede
in der Zelldichte (Theiss et al., 1998).
Die Schicht 1 des TO ist eine reine Faserschicht, über welche retinale Axone in einer retinotopen
Ordnung in das TO einziehen (McGill et al., 1966; Crossland et al., 1974; Clark & Whitteridge,
1976; Remy & Güntürkün, 1991), um dann die superficialen Schichten 2-7, insbesondere die
Schichten 3, 5, und 7 zu innervieren (Hayes & Webster, 1975, Angaut & Repérant, 1976;
Acheson et al., 1980). Die höchste synaptische Dichte wird in der Schicht 5 im TO erreicht
(Hayes & Webster, 1985). In den superficialen Schichten finden sich vornehmlich horizontale
Zellen, mit in den Schichten 4 und 5 gelegenen Perikaria und parallel zur tectalen Oberfläche
verlaufenden Dendriten. Die Mehrzahl dieser Zellen ist anaxonal, daß heißt sie projizieren nicht
aus dem TO heraus (Van Gehuchten, 1892). Vielmehr stehen sie in prä- und postsynaptischen
Kontakt mit den Dendriten weiterer Zellen des TO oder erhalten, wie im Falle der horizontalen
Zellen der Schicht 5, direkten Input retinaler Axone. Neben den horizontalen Zellen finden sich
radiale Zellen in der Schicht 4.
Die Schichten 8 bis 12 können im Nissl-Präparat deutlich gegeneinander abgegrenzt werden,
wobei das Vorkommen bestimmter Zelltypen für die einzelnen Schichten kennzeichnend ist. In der
Schicht 8 wird ein deutliches Band dicht gepackter Radialzellen sichtbar. Weniger dicht liegen
Radialzellen in den Schichten 9 bis 12. Neben den Radialzellen sind in den tectalen Schichten 10
und 11 auch sogenannte multipolare Neuronen lokalisiert (Van Gehuchten, 1892), deren
Efferenzen vermutlich die praetectalen Kerne erreichen. Die Dendriten der in den mittleren
Zellschichten lokalisierten Neuronen steigen bis in die superficialen Schichten auf, um dort
synaptische Kontakte mit retinalen Ganglienzell-Axonen oder Horizontalzellen einzugehen. Die
Radialzellen projizieren mit ihren Efferenzen zum ventralen Thalamus und zum GLd (Hunt &
Künzle, 1976; Wild, 1989).
Die größten Zellen des TO sind die multipolaren Neuronen der Schicht 13. Ihre Perikaria
erreichen Durchmesser von 30 bis 50µm (Hardy et al., 1985), und ihre massiven und
weitreichenden Dendriten ziehen radial in die superficialen Schichten (Van Gehuchten, 1892;
Ramon y Cajal, 1911). Diese Neuronen bilden mit ihren zum Nucleus rotundus projizierenden
Axonen den Hauptteil des efferenten Ausgangs aus dem TO.
Die beiden periventrikulären Schichten 14 und 15 liegen zwischen dem Ependym des tectalen
Ventrikels und der Schicht 13. Es handelt sich um Faserschichten mit nur sehr wenigen Neuronen.
Einleitung
18
In der vorliegenden Untersuchung wurden die tectalen Laminae 1 bis 7 als superficiale Schichten,
die Laminae 8 bis 12 als mittlere Schichten, und die Laminae 13 bis 15 als tiefe tectale Schichten
zusammengefaßt. Dieser Zusammenschluß diverser Zellschichten reflektiert morphologische und
funktionelle Aspekte der Informationsfortleitung im TO, da insbesondere die superficialen
Schichten retino-rezipient sind, Neuronen der mittleren Schichten zumeist als Interneuronen
fungieren, während die tiefen tectalen Schichten den Hauptteil der tectalen Efferenzen ausmachen.
1.2.3.2
Afferente und efferente Projektionen des Tectum opticum
Die Afferenzen des TO der Taube sind in visuelle und nicht-visuelle Projektionen einzuteilen
(Brecha, 1978). Der Großteil der visuellen Projektionen stammt von der Retina, und zu
geringeren Anteilen von weiteren zum Sehsystem gehörenden Strukturen, wie dem visuellen Wulst
und dem multimodal arrangiertem Archistriatum. Die Projektionen der Retina sind im TO
topographisch organisiert, wobei die superio-temporale Retina (beinhaltet das rote Feld) mit
Efferenzen auf das rostro-ventrale TO, die inferio-temporale Retina mit Efferenzen auf das rostrodorsale TO, die superio-nasale Retina mit Efferenzen auf das caudo-ventrale TO, und schließlich
die inferio-nasale Retina mit Efferenzen auf das caudo-dorsale TO projiziert (Remy & Güntürkün,
1991). Sowohl die Area dorsalis im roten Feld als auch die Area centralis im gelben Feld der
Retina werden disproportional vergrößert im TO abgebildet (Clarke & Whitteridge, 1976).
Die Efferenzen des TO gelangen zu verschiedenen visuellen, motorischen und multimodal
arrangierten Strukturen des Gehirns, wie zum Beispiel dem Thalamus, dem Praetectum, den
pontinen Kernen, der Formatio reticularis, und den isthmischen Kernen (Hunt & Künzle, 1976).
1.2.3.3
Verschaltung retinaler Informationen im Tectum opticum
Die Axone retinaler Ganglienzellen terminieren vornehmlich auf radial orientierten Dendriten in den
superficialen Schichten sowie zu geringen Anteilen auf tief in der Schicht 4 gelegenen
Horizontalzellen (Hayes & Webster, 1975; Angaut & Repérant, 1976; Repérant & Angaut,
1977; Hardy et al., 1985). In elektrophysiologischen Experimenten untersuchten Hardy und
Mitarbeiter (1985) die intratectale Verarbeitung visueller Informationen im tectofugalen System.
Demnach erhalten multipolare Neuronen der Schicht 13 über ihre Dendriten Informationen aus
direkt innervierenden retinalen Zellen und leiten diese ohne weitere synaptische Verschaltungen
Einleitung
19
weiter. Daneben haben aber auch Radialzellen der Schichten 10 und 11 direkte Verschaltungen
mit retinalen Zellen, um als Interneuronen die elektrische Erregung zu den Neuronen der Schicht
13 weiterzuleiten, wo sie axo-somatische Synapsen bilden. Auf Grund autoradiographischer
Untersuchungen wird Glutamat als exzitatorischer Neurotransmitter für diese Signalleitung
vermutet (Beart, 1976; Henke et al., 1976a/b). In einer immunhistochemischen Arbeit konnte
gezeigt werden, daß verschiedene Glutamatrezeptoren vom AMPA-Typ im TO der Taube
exprimiert werden (Theiss et al., 1998). Insbesondere die superficialen Schichten als auch die
Schichten 9, 10 und sehr stark 13 des TO zeigten deutliche Immunreaktivität gegen diese
Rezeptoren. Die in den superficialen Schichten gelegenen Horizontalzellen bilden trisynaptische
Schaltkreise mit postsynaptischem retinalen Input und präsynaptischen Kontakten auf radial
orientierten Dendriten. Sie fungieren als Interneuronen und modulieren vermutlich retinale
Informationen. Als inhibitorischen Neurotransmitter exprimieren diese Neuronen GABA (Hunt &
Künzle, 1976a, Streit et al., 1978) und Glycin (Hunt et al., 1977).
1.2.3.4
Funktionelle Studien zum Tectum opticum
In TO der Taube dominieren die visuellen Afferenzen, mit dem Hauptteil der Axone von retinalen
Ganglienzellen (Remy & Güntürkün, 1991). Elektrophysiologische Untersuchungen zeigten, daß
70% der tectalen Neuronen auf bewegte Reize, davon 30% mit einer bestimmten
Vorzugsrichtung dieser Bewegung, reagieren (Jassik-Gerschenfeld & Guichard, 1972). Die
Größe der rezeptiven Felder ist in den superficialen Schichten mit 0.5° bis 4.0° sehr gering, nimmt
in den tiefen tectalen Schichten 12 bis 14 aber auf bis zu 180° zu (Jassik-Gerschenfeld et al.,
1975; Frost et al., 1981). Die Verarbeitung von Informationen über die Bewegung von Objekten
wurde in weiteren elektrophysiologischen Untersuchungen näher charakterisiert, wobei eine
Bewegung eines Objektes vor einem ruhigen Hintergrund zu einer gesteigerten Antwort von
Neuronen im TO führte, während die gleichgerichtete Bewegung von Objekt und Hintergrund
eine Inhibition der Neuronenantwort im TO bewirkte (Frost & Nakayama, 1983). Es ist
wahrscheinlich, daß Neuronen des TO die Diskrimination von Objekten und Hintergrund durch
die Analyse von Bewegungsdifferenzen der Beiden leisten (Frost et al., 1990). Neben dieser
Bewegungsanalyse antworten etwa 30% der tectalen Neuronen auf farbige Stimuli (Letelier,
1983). Auf Grund der anatomischen Organisation der retino-tectalen Projektionen, mit der
exklusiven Projektion des roten Feldes der Retina auf das tectofugale System, werden hier
Einleitung
20
visuelle Informationen des frontalen, binokularen Gesichtsfeldes verarbeitet (Remy & Güntürkün,
1991).
Einleitung
21
1.2.4 Entwicklung des visuellen Systems
Die Taube gehört zu den nesthockenden Vögeln. Jungtiere lösen sich erst nach der dritten bis
vierten Lebenswoche von den Elterntieren. Beim Schlupf haben sie noch geschlossene Augen.
Kennzeichnend für das visuelle System zu diesem Stadium sind die erst unvollständig entwickelten
Projektionen (Bagnoli et al., 1985, 1987). Die von nun an ablaufende Entwicklung des visuellen
Systems ist grundsätzlich vergleichbar zu der in Hühnerembryonen (Hamburger & Hamilton,
1951), jedoch ist die Ausreifung der Projektionen sowie der entsprechenden Zielgebiete
gegenüber den nestflüchtenden Hühnchen deutlich verzögert (Manns & Güntürkün, 1997).
Die Entwicklung der embryonalen beziehungsweise juvenilen Taube wurden von Manns &
Güntürkün (1997) klassifiziert. Da Tauben zwei Eier innerhalb von drei Tagen legen, mit dem
Brüten aber erst nach Ablage des zweiten Ei beginnen, wurde der Tag der zweiten Eiablage als
E 0 (Embryonal-Tag 0) definiert. Es folgen 17 Bruttage (E 1-E 17). Der Schlupftag der Tiere
wurde als „Posthatching-Tag 0“ (PH 0) eingeordnet.
Die Ergebnisse der Entwicklung der laminären Struktur des TO sowie der retino-tectalen
Projektion stützen sich auf die Untersuchungen von Manns und Güntürkün (1997). Demnach
erfolgt die Entwicklung der tectalen Schichten sowie die retinale Innervation entlang eines rostrocaudalen und latero-medialen Gradienten. Die Laminierung des TO hat ab E 8 im gesamten TO
begonnen und endet um PH 14 im caudo-ventralen Bereich des TO. Während dieser Zeit
entstehen die Neuronen in der Ventrikularschicht, der Schicht 0, um anschließend zur tectalen
Oberfläche zu migrieren, wobei ein “inside-outside layering” (siehe Punkt 1.3.1) zu beobachten
ist. In der vorliegenden Arbeit werden Schichten des TO aufgrund ihrer Morphologie und
Funktion zusammengefaßt und als tiefe, mittlere und superficiale Schichten bezeichnet, deren
Entstehung skizziert wird.
Die als tiefe Schichten bezeichneten Laminae 13, 14 und 15, werden im embryonalen TO in einer
alphabetischen Nomenklatur als Schichten A, B und C bezeichnet. Bis ca. E 9 sind sie angelegt
und gegeneinander abzugrenzen. Die mittleren Zellschichten des TO, die Laminae 8 bis 12,
während der Embryonalstadien als Schichten D, E, F, G und H klassifiziert, entstehen bis E 13. In
den verbleibenden 18 Tagen, bis PH 14 wird die Entwicklung des TO mit der Reifung der
superficialen Schichten 1-7 abgeschlossen. Die Reifung der Schichten ist hierbei zuerst im
Einleitung
22
lateralen Bereich abgeschlossen, mit einer zeitlichen Verzögerung von 1-2 Tagen folgt das
dorsale, und wiederum 1-2 Tage später das ventrale TO.
Die Entwicklung der retino-tectalen Projektion zeigt eine Innervation des TO bereits zum
Zeitpunkt E 14, wobei ab E 15-E 16 einziehende Fasern die retino-rezipienten Schichten
erreichen, ein Prozeß, der bis PH 3-PH 4 anhält. Insgesamt ist eine deutliche Verzögerung der
Entwicklung des retino-tectalen Systems gegenüber dem Hühnchen, welches bereits vor dem
Schlupf ausgereift und innerviert ist (LaVail & Cowan, 1971a, McLoon, 1985; Thanos &
Bonhoeffer, 1983, 1987), wie auch der Wachtel (Senut & Alvarado-Mallar, 1986) festzuhalten.
In den nächsten Abschnitten werden verschiedene Mechanismen der Entwicklung des
Nervensystems bei Vertebraten beschrieben, bevor mögliche Funktionen von trophischen
Signalen bei diesen Entwicklungsprozessen dargestellt sind.
1.3
Die Entwicklung des Nervensystems
Die hier beschriebenen grundlegenden Prozesse der Entwicklung des Nervensystems werden
ausführlich von M. Jacobson in „Developmental Neurobiology“ (2rd, Plenum Press, New York,
London, 1978), und von W.A. Himwich (Editor) in „Developmental Neurobiology“ (C.C.
Thomas, Springfield, Illinois, USA, 1970) beschrieben.
Bei Vertebraten wird im Verlauf der Embryogenese die Bildung des Nervensystems aus dem
Ektoderm vom darunterliegenden Mesoderm der Gastrula induziert. Es entsteht zunächst die
einschichtige Neuralplatte, aus welcher das gesamte Zentralnervensystem (ZNS) hervorgeht. Die
Ränder dieser Neuralplatte proliferieren, es bilden sich Neuralwülste, die schließlich in der Mitte
verschmelzen, um das Neuralrohr zu entwickeln. Der Neuralrohrschluß, welcher im anterioren
Bereich des Embryos beginnt, wird als Neurulation bezeichnet. In der weiteren Entwicklung
nimmt der anteriore Teil des Neuralrohres an Dicke zu und bildet die Hirnanlage, wohingegen der
übrige Teil zum Rückenmark ausdifferenziert. In der Hirnanlage kommt es zu vielfältigen
morphogenetischen Entwicklungsprozessen, welche Zellvermehrungen, Einschnürungen und
Krümmungen beinhalten und deren Resultat die Entstehung der verschiedenen Hirnanteile wie
Prosencephalon, Mesencephalon und Rhombencephalon ist.
Zu Beginn der Histogenese finden sich im Neuralrohr nur eine Schicht sich schnell teilender
Neuroepithelzellen. Ihre Ausläufer reichen von der inneren ventrikulären Seite, bis zur äußeren,
Einleitung
23
der Pia mater anliegenden Seite. Nach der Zellteilung dieser Neuroepithelzellen verliert zumeist
eine der beiden Tochterzellen den Kontakt zur Ventrikeloberfläche und wandert aus. Sie
migrieren nach außen, zur pialen Oberfläche, wodurch eine dreischichtige Struktur aus einer
Ventrikelzone (Proliferationszone), einer mittleren Intermediärzone, und einer äußeren
Marginalzone entsteht. In der Intermediärzone finden sich auswandernde Neuronen, die mit ihren
Axonen die äußere Marginalzone bilden.
Die Entstehung der typischen Schichtungen, wie zum Beispiel im Cortex, beginnt mit dem
Auswandern von Neuroblasten in die Marginalzone. Es entstehen die sogenannten kortikalen
Platten, die zur Vielschichtigkeit heranreifen. Ist diese Entwicklung abgeschlossen, verschwindet
die Ventrikelzone, übrig bleibt ein einschichtiges Ependym der Ventrikelwand. Nach Beendigung
der Zellmigration finden sich in der Intermediärzone keine Neuronen mehr, wohl aber zahlreiche
eingewachsene Nervenfasern, welche bei Adulten die weiße Substanz bilden.
Grundsätzlich lassen sich zwei Typen an Neuroepithelzellen unterscheiden, die Neuroblasten und
die Glioblasten. Die Neuroblasten sind die teilungsfähigen Vorläufer der Nervenzellen, die
Glioblasten hingegen die der Gliazellen. Nach ihrer Auswanderung aus der Ventrikelzone sind die
Nervenzellen postmitotisch, sie können sich nicht mehr teilen, wogegen die Gliazellen auch nach
Erreichen ihrer Endposition noch teilungsfähig sind.
1.3.1 Neuronale Migration
Leitstrukturen für migrierende Neuronen sind in vielen Bereichen des ZNS Radialgliazellen. Dies
sind Gliazellen, welche mit ihren langen Ausläufern sowohl Kontakt zur Ventrikeloberfläche, als
auch zur pialen Oberfläche während der Entwicklung halten. Migrierende Neuronen im Cortex
nutzen dieses Gerüst aus radialen Gliazellen, um in Bewegungen entlang dieser glialen Fortsätze
ihre endgültige Position zu erreichen (Rakic et al., 1971, 1972; Goldowitz & Mullen, 1982).
Kennzeichnend für die Entstehung des vielschichtigen Cortex ist das sogenannte “inside-outside
layering”. Zunächst wird die innerste, kortikale Schicht gebildet, welche dann die sich später
entwickelnden Neuronen durchwandern müssen, um die folgende Schicht zu bilden.
Im adulten Tier, nach Abschluß der Zellmigration, erfahren Radialgliazellen eine Umwandlung in
Astrocyten (Schmelchel & Rakic, 1979). Histologisch unterscheidbar sind die beiden Zelltypen
anhand ihrer Morphologie sowie ihres cytoskelettalen Aufbaus. Während die Radialzellen das
Intermediärfilament Vimentin exprimieren (Dahl et al., 1981), synthetisieren die reifen Astrocyten
Einleitung
24
im adulten Tier das für sie spezifische „glial fibrillary acidic protein“ (GFAP), ein
Intermediärfilament Protein (Bignami et al., 1980).
1.3.2 Genetische Determination
Das präzise Auswandern der Neuronen sowie das Etablieren von Zellkontakten mit
entsprechenden Zielorganen und anderen Nervenzellen ist die Grundlage für den Aufbau eines
funktionsfähigen Nervensystems. Dieses System, mit etwa 1010 bis 1012 Nervenzellen, wird bei
Vertebraten durch eine Anzahl von etwa 106 Genen bestimmt. Die genetische Information reicht
nicht allein zur Schaffung eines solch komplexen Systems aus, sondern sie steht vielmehr mit
epigenetische Faktoren in einer Interaktion.
Zum Beispiel ist das Wachstum der Dendriten genetisch determiniert (Privat & Drian, 1976), die
Geometrie der dendritischen Verzweigung hingegen wird durch das Zusammenspiel verschiedener
epigenetischer endogener Faktoren wie das afferente System (Calvet et al., 1983; Mason et al.,
1990; Cohen-Cory et al., 1991; Lindholm et al., 1993) sowie mechanische Einflüsse der
Migration bestimmt (Jäger et al., 1988). Neben den endogenen nehmen auch exogene
epigenetische Faktoren, zum Beispiel der Umweltfaktor Licht, Einfluß auf die Ausbildung
morphologischer Charakteristika von Nervengeweben (Güntürkün, 1997a). Auf molekularer
Ebene werden insbesondere endogenen trophischen Substanzen, von denen die Familie der
Neurotrophine im folgenden näher beschrieben wird, bedeutende Funktionen für die Ontogenese
des Nervensystems zugeschrieben (Levi-Montalcini, 1987).
1.4
Neurotrophine
Ein “ernährender” nervaler Einfluß auf Gewebe wurde bereits im Jahr 1824 von Magendie
untersucht. Zu einem Zeitpunkt als Anästhetika noch nicht bekannt waren, durchtrennte Magendie
einseitig den fünften Hirnnerv, den Nervus trigeminus, bei Kaninchen und beobachtete bei diesen
Tieren bereits wenige Tage später die Trübung der Cornea, diverse Eiterherde sowie deutliche
Veränderungen der Zunge auf der lädierten Seite. Er führte seine Beobachtungen auf veränderte
ernährende, neurale Einflüsse zurück. Aus heutiger Sicht ist diese Beobachtung jedoch nur bedingt
richtig, da ein steriles Arbeiten zur Vermeidung von Infektionsgefahren nicht üblich war. Einige
Jahre danach wurden die Ergebnisse von Samuel (1860) aufgegriffen, der den Begriff der
Einleitung
25
“trophischen Nerven” postulierte, Nerven, deren Funktion in der Bereitstellung ernährender Stoffe
für die Gewebe läge. Heidenhain (1878) dachte diese Funktion den sympathischen Nerven zu.
Sherington korrigierte diese Auffassung in Schäfers “Text book of physiology” (1900) insoweit,
als daß alle Nerven einen trophischen Einfluß auf das Gewebe ausüben könnten. Die Richtung
trophischer Einflüsse folge dabei der Signalleitung innerhalb des Nerven, bei motorischen Nerven
zum Beispiel hin zum Muskel. Der von der Richtung der Sinnesfortleitung unabhängige Weg
tropischen Signalflusses wurde 1934 durch Torrey postuliert. In seinen Experimenten fand er die
Degeneration
von
Geschmacksknospen
nach
Durchtrennen
der
entsprechenden
Geschmacksnerven. Ein Ausbleiben des trophischen Signals, einer sogenannten “Neurosubstanz”,
die von den im Hirnstamm gelegenen Somata produziert und bis in die Zunge transportiert würde,
sei die Ursache des Absterbens der Geschmacksknopsen. Diese Arbeit bot die Grundlage zweier
Erkenntnisse, dem Konzept der neurotrophen Faktoren und dem des axonalen Transports.
In den folgenden Jahren zeigte die experimentelle Entfernung nervalen Zielgewebes in
Hühnerembryonen, zum Beispiel der Extremitätenknospe, daß sowohl die spinalen Motoneuronen
als auch die sensorischen Neuronen in den Spinalganglien zugrunde gingen (Hamburger, 1934;
Hamburger & Levi-Montalcini, 1949). Nun begann die Suche nach den peripher vorhandenen
neurotrophen Faktoren, die ein Überleben der Neuronen gewährleisteten. Anstelle der entfernten
Gewebe (z.B. einer Extremitätenknospe) wurden von Levi-Montalcini & Hamburger (1951)
verschiedene Gewebe wie Muskel, Hirngewebe, Leber oder auch Haut implantiert, ohne jedoch
direkte Hinweise auf die gesuchten Substanzen zu finden. Erst drei Jahre später, 1954, gelangen
es Levi-Montalcini und Mitarbeiter erstmals, einen neurotrophen Faktor, den sogenannten “nerve
growth-promoting factor”, zu isolieren. Später wurde diese Substanz in “nerve growth factor”
(NGF) umbenannt (Cohen et al., 1954).
Bis in die achtziger Jahre war NGF der einzige bekannte neurotrophe Faktor. Erst 1982 wurde
aus dem Schweinegehirn der “brain-derived neurotrophic factor” (BDNF) isoliert (Barde et al.,
1982). Acht Jahre später fand man schließlich einen weiteren Vertreter dieser neurotrophen
Faktoren, das sogenannte “Neurotrophin-3” (NT-3) (Hohn et al., 1990; Maisonpierre et al.,
1990; Rosenthal et al., 1990). In den letzten Jahren konnten weitere neurotrophe Faktoren
identifiziert werden (NT-4/5: Berkmeier et al., 1991; Hallböök et al., 1991; NT-6: Götz et al.,
1994; NT-7: Lai et al., 1998), welche alle zur selben Genfamilie gehören und gemeinschaftlich als
Neurotrophine bezeichnet werden.
Einleitung
26
Im folgenden werden die in Vögeln und Mammaliern exprimierten Neutrophine NGF, BDNF,
NT-3 und NT-5 sowie ihre zugehörigen Rezeptoren mit den bekannten Eigenschaften und
Funktionen beschrieben.
1.4.1 Die Struktur der Neurotrophine
Das Protein NGF ist ein 26-kDa Homodimer zweier 13-kDa Polypeptide, mit jeweils 118
Aminosäuren (Scott et al., 1983; Ullrich et al., 1983). Sechs Cystein-Reste innerhalb dieser
Sequenz bilden untereinander Disulfidbrücken, wodurch die dreidimensionale Struktur des
Moleküls entsteht. Das Motiv der sechs Cystein-Reste innerhalb eines Monomers findet sich bei
BDNF, NT-3 und NT-5 wieder, wobei die Monomere bei letzteren aus 120 Aminosäuren
bestehen. Die Sequenzhomologie der Aminosäuren zwischen den Neutorophinen beträgt
zwischen 50-60% (Zhou & Rush, 1996a,b).
1.4.2 Die Neurotrophin-Rezeptoren
Grundsätzlich werden zwei Typen an Neurotrophin-Rezeptoren unterschieden: der “low-affinity
Rezeptor” und die “high-affinity Rezeptoren” (Sutter et al., 1979). Die etwa 400 Aminosäuren
des low-affinity Rezeptors bilden eine Transmembrandomäne sowie vier sich wiederholende
Cystein-reiche Domänen am extrazellulär gelegenen N-terminalen Ende. Die Cystein-Domänen
dienen der Bindung der Neurotrophine (Welcher et al., 1991).
Die Molekularmasse des low-affinity Rezeptors beträgt 75kDa, woraus sich der Name “p75Rezeptor” (p75) ableitet. Kennzeichnender Weise bindet p75 sowohl NGF (Sutter et al., 1979),
als auch BDNF (Rodriguez-Tebar et al., 1990) und NT-3 (Squinto, 1991) mit gleicher Affinität.
Die spezifische Wirkung der einzelnen Neurotrophine wird über entsprechende high-affinity
Rezeptoren vermittelt. Erstmals isoliert wurde ein solches 140-kDa großes Glykoprotein als
Produkt des “trk proto-Oncogens” aus dem menschlichen Darm (Martin-Zanca et al., 1986,
1989). Der Terminus “trk” steht hierbei für “Tropomyosin-Rezeptor-Kinase”, dem als protoOncogen umarrangierten Gen (Martin-Zanca et al., 1986). Man nutzte im folgenden die bekannte
Gensequenz, um weitere verwandte trk-Gene, “trk B” (Klein et al., 1989) und “trk C” (Lamballe
et al., 1991) zu identifizieren. Die physiologische Wirkung der exprimierten Proteine als
Rezeptoren für Neurotrophine wurde jedoch erst fünf Jahre später entdeckt. So erkannte man
Einleitung
27
den als trk A bezeichneten Rezeptor als spezifischen high-affinity Rezeptor für NGF (Kaplan et
al., 1991; Klein et al., 1991a), wohingegen der trk B Rezeptor mit hoher Affinität BDNF (Klein
et al., 1991; Soppet et al., 1991; Squinto et al., 1991) und NT-4/5 (Berkemeier et al., 1991,
Klein et al., 1992; Ip et al., 1992),
und der trk C Rezeptor NT-3
bindet (Lamballe et al., 1991).
Kennzeichen dieser Rezeptoren ist
der Aufbau aus einem extrazellulären
Signalpeptid (1), gefolgt von einer
Anbindungs-region
Abbildung 1 (modifiziert nach Barbacid, 1994):
Skizze der Neurotrophin/Rezeptor-Wechsel-wirkungen
von NGF, BDNF, NT-3 und NT-5 bei Vögeln und
Säugern. Die Pfeile zeigen die primären NeurotrophinBindungen an. NT-3 kann mit geringer Affinität auch an
den trk A und trk B Rezeptoren binden (gestrichelte
Linien).
(2)
für
Neurotrophine,
die
einem
Transmembransegment (3), sowie
einer katalytisch aktiven TyrosinKinase
Domäne
(4)
auf
cytoplasmatischen Seite (Barbacid,
1994; Abbildung 1). Zwischen trk A, trk B und trk C Rezeptoren besteht eine AminosäureSequenzhomologie von 66-68% (Lamballe et al., 1991). Desweiteren werden durch alternatives
Splicing trk BTK- und trk CTK- Rezeptoren exprimiert, die als “truncated”, das heißt verkürzte
Rezeptoren, bezeichnet werden. Ihnen fehlt die cytoplasmatische Tyrosin-Kinase Domäne,
welche durch eine 21 oder auch 23 Aminosäuren lange, vermutlich katalytisch inaktive, Sequenz
ersetzt wird (Klein et al., 1990; Middlemas et al., 1991). Die Funktion der trkTK- Rezeptoren liegt
möglicherweise in einer negativen Regulation des trophischen Signals, zum Beispiel durch Bindung
von Neurotrophinen, ohne daß eine cytoplasmatische Reaktion ausgelöst wird oder auch durch
die Bildung eines trk/trkTK- Heterodimers, welches katalytisch inaktiv ist (Bothwell, 1995).
1.4.3 Die Signalkaskade nach Neurotrophin-Bindung
Die Aktivierung der trk-Rezeptoren nach Anbindung der entsprechenden Neurotrophine initiiert
eine Signalkaskade, die bei allen Tyrosin-Kinase Rezeptoren gleichermaßen abläuft (Schlessinger
& Ullrich, 1992). Zunächst kommt es nach Neurotrophin-Bindung zu einer Homodimerisation des
Rezeptor-Moleküls auf der Zelloberfläche, gefolgt von einer Autophosphorylierung der TyrosinReste (Jing et al., 1992). Inwieweit auch der p75-Rezeptor in die Aktivierung der trk-Rezeptoren
Einleitung
28
einbezogen ist, wird gegenwärtig noch diskutiert. Die phosphorylierten Tyrosin-Reste bilden
Ankerstellen für “downstream-Signalelemente”, zum Beispiel die Phospholipase C (PLC)
(Ohmichi et al., 1991; Vetter et al., 1991; Widmer et al., 1993), die Steuereinheit p85 der
Phosphatidyl-Inositol-3´Kinase (PI-3K) (Soltoff et al., 1992; Ohmichi et al., 1992; Obermeier et
al., 1993) sowie MAP-Kinasen (Schanen-King et al., 1991; Loeb et al., 1992), welche über
SH2 Domänen vermittelt werden (Schlessinger & Ullrich, 1992). Diese Signalelemente sind
Bestandteil verschiedenen Proliferationsabläufe.
1.4.4 Retrograde oder anterograde Signalleitung?
Gemäß der klassische Interpretation des Einflusses neurotropher Signale wird ein Neurotrophin
von einem innervierten Neuron, der sogenannten Zielzelle, an einer Synapse ausgeschüttet und
diffundiert über den synaptischen Spalt zur präsynaptischen Membran des Axonterminus, um dort
an entsprechenden trk-Rezeptoren zu binden. Anschließend wird das trophische Signal retrograd,
zum Soma des innervierenden Neurons weitergeleitet oder transportiert. DiStefano und
Mitarbeiter (1992) demonstrierten, daß nach Bindung an den Rezeptor das Neurotrophin selbst
zum Soma der Zelle retrograd transportiert wird. Ebenfalls retrograd transportiert wird der
phosphorylierte, also aktivierte, trk-Rezeptor (Ehlers et al., 1993). Beide Untersuchungen
gemeinsam lassen den Schluß zu, daß es nach Anbindung des Neurotrophins an den trk-Rezeptor
zu einer endocytotischen Internalisierung dieses Neurotrophin-Rezeptor Komplexes kommt,
welcher anschließend retrograd zum Soma der Zelle transportiert wird. Während des Transportes
bleibt der Rezeptor aktiviert und kann die unter Punkt 1.4.3 beschriebenen Kaskaden auslösen
(Bhattacharyya et al., 1997). Lange Zeit war dieser Wirkungsmechanismus der einzige bekannte
Weg trophischen Signalflusses. In jüngerer Zeit wurde aber auch der anterograde trophische
Signalfluß entdeckt. Im visuellen System bei Hühnchen konnten von Bartheld und Mitarbeiter
(1996) zeigen, daß Neurotrophine vom Zellkörper entlang des Axons hin zum Axonterminus
transportiert werden. Präsynaptisch werden sie in intakter Form ausgeschüttet, diffundieren über
den synaptischen Spalt und binden postsynaptisch an den entsprechenden trk-Rezeptoren. Zhou
und Rush (1996a,b) bestätigten den anterograden Transport von BDNF in Spinalganglien.
Einleitung
29
1.4.5 Funktionen der Neurotrophine
Die beiden Wege der trophischen Signalleitung, der retrograde und der anterograde Signalfluß
sowie das Vorkommen verschiedener Neurotrophine ermöglicht eine Vielzahl von Wirkungen an
den entsprechenden Zielzellen, mit dem Ergebnis einer ständigen Anpassung an die jeweiligen
Bedürfnisse, im juvenilen wie auch im adulten Nervensystem.
In den letzten Jahren wurden zahlreiche Wirkungen der Neurotrophine NGF, BDNF und NT-3
beschrieben (reviewed durch Ebadi et al., 1997). Mögliche Wirkungen von NGF in Nervenzellen
sind demnach die positive Beeinflussung des axonalen Wachstums, der synaptischen
Umorganisation, der dendritischen Verzweigung sowie der Peptid-Synthese. Außerdem stimuliert
NGF Transmitter-synthetisierende Enzyme wie zum Beispiel die Acetylcholinesterase. Ebenso
vielfältig sind die Wirkungen von BDNF, welches fördernd auf die Zelldifferenzierung, auf
Transmitter-synthetisierende Enzyme sowie auf die Peptidsynthese und die Expression Calciumbindender Proteine wirkt. Desweiteren erhöht BDNF die synaptische Effizienz zwischen
verschiedenen Nervenzellen. NT-3 hingegen fördert das Überleben und die Proliferation von
Precursor-Zellen sowie die axonale Verzweigung im Zielgebiet sich entwickelnder neuronaler
Systeme. Ähnlich dem BDNF wirkt NT-3 auch stimulierend auf die Expression Calciumbindender Proteine sowie steigernd auf die synaptische Effizienz.
Den Neurotrophinen gemeinsam ist eine über elektrische und synaptische Aktivität gesteuerte
Synthese und Freisetzung (Castren et al., 1992; Lindholm et al., 1994; Schoups et al., 1995;
Blochl & Thoenen, 1995). Hierbei beeinflußt der epigenetische Faktor Licht die Expression von
Neurotrophinen und der entsprechenden Rezeptoren (Castren et al., 1992; Okazawa et al.,
1994).
Einleitung
1.5
30
Zielsetzung der Arbeit
Das Gehirn der Vertebraten wird in seiner Komplexität von keinem anderen Organ übertroffen.
Als höchstes Koordinationszentrum kennzeichnet es eine hohe Vielschichtigkeit bei der
Verarbeitung
von
Informationen
der
Umwelt.
Die
Grundlage
einer
differenzierten
Informationsverarbeitung liegt in der ungeheuer großen Vielfalt der Morphologie und
Verschaltungen der Bausteine dieses Organs, den Nervenzellen und Gliazellen.
Wenngleich das Wissen über einzelne Bauelemente des Gehirns recht gut ist, so sind komplexe
Prozesse, wie zum Beispiel die lateralisierte Verarbeitung von Informationen aus der Umwelt in
der linken oder rechten Hemisphäre, bislang nicht umfassend verstanden. Insbesondere die
Wirkungsketten, welche zur Ausbildung solcher Hirnasymmetrien führen, sind unbekannt. In der
vorliegenden Arbeit wird ein möglicher Teilaspekt bei der Etablierung von Hirnasymmetrien an
Hand der Entwicklung des retino-tectalen Systems der Taube untersucht.
Grundsätzlich sind alle nervalen Systeme, einschließlich ihrer Musterbildung während der
ontogenetischen Entwicklung genetisch determiniert. Die genetische Information allein reicht aber
nicht aus, um sinnvolle Zellkontakte zwischen einzelnen Neuronen zu etablieren, unsinnige
hingegen wieder zu verwerfen. Vielmehr sind weitere Faktoren für das Überleben einzelner
Nervenzellen, die korrekte Verschaltung zwischen den Neuronen sowie der Etablierung von
Asymmetrien im Gehirn erforderlich. Insbesondere den Neurotrophinen kommen zahlreiche
Funktionen zu, welche sich zum einen auf die Etablierung nervaler Systeme, zum anderen aber
auch auf die ständigen Feinanpassungen des Systems im adulten Tier beziehen.
In der vorliegenden Arbeit wurden mögliche Funktionen der beiden Neurotrophine BDNF und
NT-3 während der Entwicklung der Retina, des Tectum opticums sowie der Bildung des retinotectalen Systems in der Taube Columba livia untersucht:
Einleitung
31
1. In immunhistochemischen Untersuchungen wurde die Expression der beiden Neurotrophine
BDNF und NT-3 sowie der zugehörigen high-affinity Rezeptoren trk B und trk C in der
Retina und im Tectum opticum in den Altersstadien E 14 bis zum adulten Tier kartiert. Mit
Hilfe dieser Expressionsdaten werden intrinsische neurotrophe Mechnismen in der Retina und
im Tectum opticum diskutiert. Außerdem erlaubt die genaue zeitliche Rasterung der
Neurotrophin-Expression eine Interpretation neurotropher Mechanismen während der
Etablierung des retino-tectalen System unter Berücksichtigung des epigenetischen Faktors
Licht vor und nach dem Schlupf.
2. Basierend auf den Ergebnissen einer differentiellen Expression der Neurotrophine, sollten mit
Hilfe ultrastruktureller Untersuchungen zur Lokalisation von BDNF im adulten Tectum
opticum mögliche trophische Signalwege erfaßt werden, die Hinweise auf die Wirkungen von
BDNF in der adulten Taube liefern könnten.
3. Im Verlaufe der Untersuchungen ergaben sich Fragen, bezüglich eines Zusammenhangs von
Zellmigration und neurotrophen Mechanismen während der Etablierung der Zellschichten im
Tectum opticum. In weiteren Untersuchungen wurden Fluoreszenz-Doppelmarkierungen von
Neurotrophinen und Neurotrophin-Rezeptoren mit Vimentin, einem in Radialglia
vorkommenden Intermediärfilament, durchgeführt, die mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops
und eines konfokalen Lasermikroskops ausgewertet wurden.
Material und Methoden
32
2 Material und Methoden
2.1
Material
Für die Untersuchung neurotropher Mechanismen während der Entwicklung des retino-tectalen
Systems standen 73 Tauben beiden Geschlechts der Spezies Columba livia zur Verfügung, die
aus eigener Zucht sowie von einem lokalen Züchter bezogen wurden. Untersucht wurden die
„embryonalen Altersstadien“ E 14 und E 16, daß heißt Eier nach vierzehn beziehungsweise
sechzehn Tagen Inkubationszeit durch die Elterntiere, wobei der Tag E 1 mit der Ablage des
zweiten Ei im Nest definiert ist. Der Schlupftag der Jungtiere nach 18-tägiger Inkubationszeit wird
als „Posthatching Tag“ 0 (PH 0) definiert. Die sich anschließenden Altersstadien der
gegenwärtigen Untersuchungen waren PH 1, PH 2, PH 4, PH 7, PH 14 sowie adulte Tiere. Die
Entnahme der Retinae und Gehirne erfolgte stets vormittags zwischen 9.00-10.00 Uhr.
2.2
Die Immunhistochemie
Die Immunhistochemie ist eine Methode der Detektion biologischer Stoffe und zellulärer
Strukturen, wie zum Beispiel Transmitter, Rezeptoren oder Enzyme im Gewebe mit Hilfe speziell
gegen diese gerichteten Antikörpern. Die immunologische Detektion beinhaltet zunächst das
Herstellen mikroskopischer Schnittpräparate sowie an diesen Präparaten ablaufende
biochemische Reaktionen, welche in den nachfolgenden Gliederungspunkten erläutert werden. In
allen Fällen muß die Vorbehandlung des Gewebes möglich schonend sein, um eine Denaturierung,
Maskierung oder Verlagerung der nachzuweisenden Substanz zu vermeiden.
2.3
Retinale und Tectale Gewebeaufbereitung
2.3.1 Perfusion juveniler und adulter Tauben
Bei den Tieren ab PH 0 war der erste Schritt der Gewebeaufbereitung die Perfusion, bei welcher
das Kreislaufsystem der Tiere zum Durchspülen mit einer Kochsalzlösung (NaCl) und
anschließend mit einem Fixativ genutzt wurde. Im einzelnen wurde eine halbe Stunde vor Beginn
der Perfusion eine Dosis von 0,1-0,2ml Heparin (1000 Units) intramuskulär in den Musculus
pectoralis major gespritzt, um die Blutgerinnung während der Perfusion zu minimieren. Fünfzehn
Material und Methoden
33
bis dreißig Minuten später wurde den Tauben eine Überdosis Equithesin (0,40ml/100g
Körpergewicht) ebenfalls in den Musculus pectoralis major injiziert. Die Tiere fielen nach 15 bis
20 Minuten in eine tiefe Anästhesie. Anschließend wurden die Federn ventral am Thorax gerupft,
und der Brustkorb der Tiere eröffnet. Das Perikard wurde gespalten und eröffnet, um einen
Katheder in den linken Herzventrikel einzuführen. Durch einen Schnitt über dem Fettring des
rechten Atriums wurde eine Austrittspforte für das venöse Blut, ebenso wie die
Perfusionslösungen nach Durchlaufen des Kreislaufsystems geschaffen.
Über den angelegten Katheder wurde zunächst für zwei Minuten mit einer 40°C warmen 0,9%
NaCl-Lösung perfundiert, um das Blut aus dem Kreislaufsystem zu treiben. Der Perfusionsdruck
wurde in Abhängigkeit zum Alter der Tiere variabel eingestellt, um ein Platzen der Gefäße zu
vermeiden. Anschließend wurde mit der 37°C warmen Fixierlösung perfundiert, in der Dauer und
Menge jeweils abhängig von der Größe der Tiere. Bei den bis zu vier Tage alten Tieren reichten
150ml Fixativ, in den Altersstadien PH 7 und PH 14 wurde 250ml Fixativ benötigt, und bei
Adulten wurde mit 500ml Fixativ perfundiert. Eine gelungene Perfusion wurde zumeist schon
während der Prozedur durch ein Versteifen des Körpers, insbesondere durch ein Überstrecken
des Kopfes nach hinten, deutlich.
Das Fixativ für die lichtmikroskopischen Untersuchungen bestand aus 4% Paraformaldehyd
(PFA) und 0.2% Glutaraldehyd (GA) in PBS (Phosphat-Buffered Saline). Für die
ultrastrukturellen Untersuchungen mittels der Transmissionselektronenmikroskopie wurde ein
Fixativ bestehend aus 2.5% GA und 1.5% PFA in PBS benutzt.
2.3.2 Immersionsfixierung juveniler und adulter Tauben
Eine deutlich verbesserte Gewebekonservierung erreichte man über eine der Perfusion
anschließende 1.5-2 -stündige Immersionsfixierung. Hierzu wurden die Tiere direkt nach der
Perfusion dekapitiert und die Augen und das Gehirn präpariert. Zum besseren Eindringen des
Fixativs in die Retinae wurde von anterior ein etwa 6mm großes Loch in die Augen geschnitten,
um Cornea, Linse, und Glaskörper zu entfernen. Zur Immersionsfixierung der Gehirne wurden die
Hirnhäute weitestgehend entfernt. Nach dem Postfixierung wurden Retinae und Gehirne in einer
30%-igen Succrose (w/v) in PBS bei 4°C über Nacht aufbewahrt. In dieser Lösung wurde dem
Gewebe osmotisch Wasser entzogen, wodurch die Bildung von Gefrierartefakten in Form einer
Kristallbildung im Gewebe beim Auffrieren auf dem Kryostaten verringert wurde.
Material und Methoden
34
2.3.3 Immersionsfixierung embryonalen Gewebes
Die Tiere der Altersstadien E 14 und E 16 wurden nicht perfundiert sondern ausschließlich
immersionsfixiert. Hierzu wurden die Embryonen aus dem Ei herausgelöst und dekapitiert.
Anschließend wurde der Schädel sagittal eröffnet und unter einem Binokular die Augen und das
Gehirn vorsichtig entnommen. Die weitere Präparation der Augen und Gehirne ist mit der oben
beschriebenen Vorgehensweise identisch.
Anschließend wurde das Material für 24 Stunden in 4% PFA und 0.2% GA in PBS
immersionsfixiert, bevor es in eine 30% Succrose (w/v) und 0.3% Natriumazid (w/v) in PBSLösung bei 4°C für einen weiteren Tag überführt wurde.
Tabelle 1: Fixative der lichtmikroskopischen Untersuchungen
Juvenil – Adult
Perfusion
Immersionsfixierung
4% PFA + 0.2% GA
4% PFA + 0.2% GA
Menge: 150-500ml
Dauer: 1.5 – 2 Stunden
---
4% PFA + 0.2% GA
Embryonen
Dauer: 24 Stunden
2.4
Schneiden des Gewebes
Für die immunhistochemischen Darstellungen der Expression von BDNF, NT-3, trk B und trk C
auf retinaler und tectaler Ebene wurden Gefrierschnitte angefertigt. Hingegen wurde das Tectum
opticum für die ultrastrukturellen Untersuchungen, ebenso wie für die immunhistochemischen
Kolokalisationsuntersuchungen oben genannter Proteine mit Vimentin auf einem Vibratom
geschnitten.
2.4.1 Herstellung von Gefrierschnitten
Für die immunhistochemischen Untersuchungen der Expression der Neurotrophine und
Neurotrophin-Rezeptoren in der Taubenretina wurden 15µm Sagittalschnitte auf dem Kryostaten
angefertigt. Hierzu wurde beidseitig des Pecten des Taubenauges ein Schnitt gesetzt, bevor die
Retina vorsichtig stumpf von der Sclera abgesetzt werden konnte. Die entnommene Retina wurde
in einer Petrischale ausgebreitet, zentral wurde ein Tropfen Gefriermedium (Tissue Embedding
Material und Methoden
35
Medium, Slee Technik, Mainz, Deutschland) aufgetragen, bevor die Retina eng eingerollt wurde.
Diese Rolle wurde anschließend mit einem Ende im Winkel von 90° auf den Kryostaten
aufgesetzt und bei zirka –20°C unter ständiger Zugabe weiteren Gefriermediums aufgefroren.
Nach einer viertel Stunde war das Gewebe komplett durchgefroren, und die ersten sagittalen
Retinaeschnitte wurden direkt auf gelatinisierte Objektträger aufgenommen.
Die für die Expressionsuntersuchungen der Neurotrophine und Neurotrophin-Rezeptoren
verwendeten Gehirne wurden zunächst schnell auf –40°C gekühlt. Hierzu wurde eine Menge von
zirka 50ml iso-Pentan in flüssigem Stickstoff auf die gewünschte Temperatur abgekühlt, bevor die
Gehirne für etwa 30 Sekunden in die Lösung gegeben wurden. Durch das rapide Einfrieren wurde
die Kristallbildung im Gewebe reduziert. Anschließend wurden die Gehirne rostral auf den
Gewebehalter des Kryostaten mit Gefriermedium (s.o.) bei zirka -30°C aufgefroren. Etwa
fünfzehn Minuten später wurden von caudal beginnend 25µm starke Frontalschnitte angefertigt,
die zum einen in PBS mit 0.3% Natriumazid gesammelt, zum anderen direkt auf gelatinisierte
Objektträger aufgezogen wurden. Natriumazid empfiehlt sich als Zusatz zur PBS-Lösung bei
einem längeren Aufbewahren der Schnitte, weil es die Pilz- und Bakterienbildung unterdrückt, in
dieser Konzentration aber keinen schädigenden Einfluß auf das Gewebe hat. Das genutzte
Gefriermikrotom war ein „Leitz 1720 digital Kryostat“, Ernst Leitz Wetzlar GmBH, Deutschland.
2.4.2 Herstellung von Vibratomschnitten
Für die elektronenmikroskopischen Untersuchungen und die Kolokalisations-untersuchungen
wurden Vibratomschnitte angefertigt. Hierzu wurde der zu schneidende Bereich weitestgehend auf
das Tectum opticum getrimmt, daß heißt die Gehirne wurden entlang der Sutura sagittalis in zwei
Hälften gespalten, und anschließend das gesamte Vorderhirn und Kleinhirn entfernt. Der
verbleibende Quader wurde in einer 4%-igen Agar-Agar Lösung (w/v) eingebettet. Insbesondere
für das embryonale und juvenile Gewebe, welches trotz Fixierung sehr fragil war, diente der
Agar-Mantel zur Stabilisierung beim Schneiden. Mit Hilfe eines Gewebeklebers wurde das
Material auf Halteblöcke fixiert, und 100µm Sagittalschnitte angefertigt, die bis zur
histochemischen Behandlung in PBS-Natriumazid Lösung verblieben.
Das genutzte Gerät war ein „Vibratome 1000“ der Firma „tpi“, St. Lois, Amerika.
Material und Methoden
2.5
36
Die Antikörperherstellung
Antikörper sind Glykoproteine, die als Antwort auf den Kontakt mit einer Fremdsubstanz, einem
sogenannten Antigen im Organismus, produziert werden. Sie gehen mit dem Antigen einen
spezifischen Komplex mit hoher Bindungsaffinität (Ka = 107 bis 1010 M-1) ein, der anschließend
aus dem Körper entfernt wird. Antikörper bilden die Grundlage der humoralen Antwort des
Immunsystems; sie gehören zu den Immunglobulinen (Ig), zumeist zur Klasse der IgG. Die
Antikörperherstellung erfolgt durch eine Immunisierung von Tieren wie Maus, Kaninchen oder
Ziege, wobei dem Tier die im folgenden nachzuweisende Substanz subcutan injiziert wird. Für das
immunisierte Tier stellt dieses Protein eine Fremdsubstanz, ein sogenanntes Antigen, dar. Es
reagiert gegen dieses Antigen mit einer spezifischen Antikörperreaktion. Zum Zeitpunkt der
maximalen Immunantwort, daß heißt, der maximalen Antikörperproduktion, wird dem Tier Blut
entnommen. Durch Zentrifugation entfernt man die roten Blutkörperchen, wonach ein
antikörperhaltiges Serum übrig bleibt (Antiserum). Da ein Antigen zumeist mehrere Epitope
aufweist, an welche wiederum verschiedene Antikörper binden können, werden in der Regel
Antikörper unterschiedlicher Spezifität gegen das Antigen produziert, sogenannte polyklonale
Antikörper. Sehr spezifisch gegen nur ein Epitop gerichtet sind sogenannte monoklonale
Antikörper. Bei der Herstellung monoklonaler Antikörper werden B-Lymphocyten, aus der Milz
immunisierter Tiere, zum Beispiel der Maus, mit Myelomzellen hybridisiert, und anschließend
nahezu unbegrenzt kultiviert. Kennzeichen dieser Hybridome ist die Produktion nur eines, für die
B-Zelle typischen Antikörpers, welches in der Folgezeit entsprechend abgeschöpft und genutzt
werden kann.
Die in dieser Arbeit verwendeten primären Antikörper detektieren spezifisch die Neutrophine
BDNF und NT-3, die Neurotrophin-Rezeptoren trk B und trk C sowie das cytoskelettale
Intermediärfilament Vimentin. Die eingesetzten sekundären Antikörper gehen spezifische
Bindungen mit den entsprechenden primären Antikörpern ein.
2.5.1 Antikörper gegen BDNF
Der BDNF-Antikörper (N-20) von Santa Cruz Biotechnology, Inc. USA, ist ein
affinitätsgereinigter polyklonaler Antikörper aus Kaninchen gegen menschliches BDNF-Antigen.
Der Antikörper ist gegen die Aminosäure 128-147 des carboxyterminalen Endes des BDNF
Material und Methoden
37
gerichtet, welche identisch zwischen Mensch und Maus ist. Gemäß den Herstellerangaben zeigt
der Antikörper keine Kreuzreaktivität gegen NGF, NT-3 und NT-4. Bezogen wurde das
Produkt über IC Chemikalien, Deutschland.
2.5.2 Antikörper gegen NT-3
Der Antikörper gegen NT-3 (N 20) von Santa Cruz Biotechnology, Inc. USA, ist ein
affinitätsgereinigter polyklonaler Antikörper aus Kaninchen gegen die Aminosäuren 139-158 des
carboxy-terminalen Endes menschlichen NT-3. Diese Sequenz verhält sich konservativ zwischen
Mensch und Maus. Der Antikörper zeigt keinerlei Kreuzreaktivität zwischen NGF, BDNF und
NT-4. Das Produkt wird von IC Chemikalien, Deutschland, vertrieben.
2.5.3 Antikörper gegen trk B
Der von Santa Cruz Biotechnology, Inc. USA, hergestellte polyklonale, affinitätsgereinigte
Antikörper gegen trk B (794) aus Kaninchen ist gegen die carboxy-terminalen Aminosäuren des
Maus trk B Proteins gerichtet. Der Antikörper erkennt das trk B Protein in Maus und Mensch, ist
aber nicht kreuzreaktiv mit trk A und trk C. Zu beziehen ist das Produkt über IC Chemikalien,
Deutschland.
2.5.4 Antikörper gegen trk C
Der trk C (C-14) Antikörper aus Kaninchen von Santa Cruz Biotechnology, Inc. USA, ist gegen
die carboxy-terminale Aminosäuresequenz des Schweine trk C Proteins gerichtet. Es handelt sich
um einen polyklonalen, affinitätsgereinigten primären Antikörper, der zum Teil Kreuzreaktivität
gegen trk A und trk B Proteine zeigt. Der Antikörper wird von IC Chemikalien, Deutschland,
vertrieben.
Ein ebenfalls getesteter trk C (798) Antikörper aus Kaninchen von Santa Cruz Biotechnology,
Inc. USA, der gegen eine Aminosäuresequenz der Precursor Form des Schweine trk C Peptids
gerichtet ist, ohne dabei Kreuzreaktivitäten gegen trk A und trk B zu zeigen, war bei der Taube
stets negativ.
Material und Methoden
38
2.5.5 Antikörper gegen Vimentin
In der kommerziellen Herstellung des monoklonalen Antikörpers anti-Vimentin (Klon Vim 3B4)
wurden Mäuse mit gereinigtem Vimentin aus Rinder Augenlinsen immunisiert. Die Milzzellen des
Tiere wurden anschließend mit Myelomzellen fusioniert, und die gewonnenen Antikörper
affinitätsgereinigt. Der Antikörper reagiert mit dem Intermediärfilament Vimentin aus einer Vielzahl
von Spezies, darunter auch dem aus Vögeln. Vertrieben wird anti-Vimentin (Klon Vim 3B4) von
Boehringer Mannheim, Deutschland.
2.5.6 Sekundäre Antikörper
Zur Visualisierung der immunologischen Detektion und zur dauerhaften Färbung mittels der
Diaminobenzidin-Reaktion (DAB-Reaktion) wurden ein affinitätsgereinigter, polyklonale
sekundärer Antikörper eingesetzt. Die Spezifität dieses Antikörpers, an welchen das Vitamin
Biotin gekoppelt wurde, ist Ziege gegen Immunglobuline des Kaninchens. Der Antikörper ist
Bestandteil des „ABC-Elite Kit“ der Firma „Vector Laboratories“, und kann über „Camon“ in
Wiesbaden bezogen werden.
Für die ultrastrukturellen Untersuchungen zur Lokalisation von BDNF wurde ein Gold-markierter
sekundärer Antikörper eingesetzt (Ziege anti-Kaninchen, 10nm Gold, Sigma, Produktnummer
G 7402, Deutschland).
In der Fluoreszenz-Immunhistochemie wurden FITC oder TRITC gekoppelt sekundäre
Antikörper verwendet:
1. Zur Darstellung der Neutrophine, beziehungsweise der Neurotrophin-Rezeptoren wurden
FITC-gekoppelte und affinitätsgereinigte anti-Kaninchen Antikörper aus der Ziege eingesetzt.
Der Antikörper mit der Produktnummer F-6005 wird von Sigma, Deutschland vertrieben.
2. Die Detektion des Maus Antikörpers gegen Vimentin erfolgte mittels eines TRITCgekoppelten, affinitätsgereinigten anti-Maus Antikörpers aus Schaf, welche unter der
Produktnummer T-5268 bei Sigma, Deutschland zu beziehen ist.
Material und Methoden
39
Tabelle 2: Antikörper für DAB-Präparate
Primärer
Antikörper
BDNF
NT-3
Trk B
Trk C
Wirt
Kaninchen
Konzentration
sekundärer
Antikörper
Konzentration
Ziege
gegen
Kaninchen
1/100
1 / 100
Tabelle 3: Antikörper für die Elektronenmikrsokopie
Primärer
Antikörper
Wirt
BDNF
Kaninchen
Konzentration sekundärer Konzentration
Antikörper
1/100
Ziege
gegen
1/100
Markierung
10nm Gold
Kaninchen
Tabelle 4: Antikörper für Fluoreszenz-Präparate
Primärer
Antikörper
BDNF
NT-3
Trk B
Trk C
Vimentin
2.6
Wirt
Konzentration sekundärer Konzentration
Antikörper
FluoreszenzFarbstoff
Ziege
gegen
Kaninchen
1/100
FITC
1/100
TRITC
Kaninchen
1/100
Maus
1/100
Ziege gegen
Maus
Immunhistochemie für die Lichtmikroskopie
Die gesamte Immunhistochemie der auf Objektträger aufgezogenen Retinae wurde in einer
feuchten Kammer bei 4°C durchgeführt, die der Hirnschnitte hingegen frei flotierend bei
Raumtemperatur. Im ersten Schritt wurden die Retinae und Hirnschnitte für dreißig Minuten in
Wasserstoffperoxid inkubiert. Dies diente der Inaktivierung endogener Peroxidasen im Gewebe,
welche den unspezifischen Hintergrund einer DAB-Reaktion (Punkt 2.6.2) erhöhen. Drei
Waschgänge zu je 2 Minuten und zwei Waschgänge zu 10 Minuten in PBS schlossen sich an.
Material und Methoden
40
Eine anschließende Inkubation für dreißig Minuten in 10%-igem Normalserum vom Spender des
zweiten Antikörpers (Schaf) in einer Standardlösung, bestehend aus 0.3%-igen Triton X-100
Lösung in PBS, diente dazu, unspezifische Anbindungsstellen für die Antikörper, zum Beispiel
zellständige Fc-Fragmente oder sehr saure oder basische Komponenten zu blocken. Das
Detergenz Triton X-100 diente der Permeabilisierung des Gewebes für die Antikörper durch
Herauslösen von Lipiden aus der Zellmembran. Nach dem Blockierungsschritt wurde kurz in PBS
gewaschen, bevor das Material mit dem primären Antikörper für zwölf Stunden (zumeist über
Nacht) bei 4°C auf einem Schüttler inkubierte. Die primären Antikörper wurden in der
Standardlösung verdünnt. Die Konzentrationen sind den Tabellen 2 und 4 zu entnehmen.
Anschließend wurde wiederum dreimal 2 Minuten und zweimal 10 Minuten mit PBS gewaschen,
um nicht gebundene primäre Antikörper zu entfernen. Die Immunhistochmie wurde mit dem
sekundären Antikörper für zirka eine Stunde auf dem Schüttler bei Raumtemperatur fortgesetzt
(Konzentrationen siehe Tabellen 2 und 4). Die Visualisierung dieser Antikörperkaskade erfolgte
entweder über die ABC-DAB Methode für die Dauerpräparate, oder direkt mittels eines
Fluoreszenzmikroskops für die Immunfluoreszenzpräparate:
1. ABC-Reaktion: die verwendeten sekundären Antikörper sind am C-terminalen Ende mit
dem
Vitamin
Biotin
konjugiert,
welches
als
Anbindungsstelle
für
weitere
Reaktionskomponenten dient. Mittels der anschließenden DAB-Reaktion (siehe Punkt 2.6.2)
wird die Kaskade sichtbar gemacht.
2. Fluoreszenz-Immunhistochemie: die sekundären Antikörper sind direkt mit einem
Fluoreszenz-Farbstoff,
FITC
oder
TRITC,
konjugiert
und
Auflichtfluoreszenzmikroskop nachgewiesen werden (Gliederungspunkt 2.6.3).
können
im
Material und Methoden
41
2.6.1 Avidin-Biotin Reaktion
Die Avidin-Biotin Reaktion, allgemein als ABC-Methode beschrieben, dient der Färbung der
Antikörperkaskade,
mit
dem
Vorteil
einer
hohen
Sensitivität
durch
eine
weitere
Signalverstärkung. Die Abkürzung ABC beschreibt den Meerettichperoxidase konjugierten
Avidin-Biotin-Komplex. Im Versuchsprotokoll schlossen sich nach der Inkubation im sekundären
Antikörper drei Waschgänge zu 2 Minuten und zwei Waschgänge zu 10 Minuten in PBS an, um
nicht gebundene sekundäre Antikörper aus dem Gewebe zu entfernen. Die einzelnen
Reaktionskomponenten des ABC-Kit sind das Eiweißglykoprotein Avidin (A) und das mit dem
Vitamin Biotin (B) konjugierte Enzym Meerettichperoxidase (P). Dreißig Minuten vor Beginn der
ABC-Reaktion wurden die bei 4°C aufbewahrten Stammlösungen der Komponenten A und B
des „ABC-Elite-Kit“ (Vector Laboratories) laut Herstellerangaben zusammengefügt, wobei sich
drei Moleküle des Meeretichperoxidase konjugierten Biotins mit einem Avidin verbanden.
Das Verhältnis der Komponenten
war so bestimmt, daß nicht alle
Bindungsstellen am Avidin durch
Biotin besetzt sind. Während der
an-schließenden
Inkubation
der
Hirnschnitte in der ABC-Lösung,
für
eine
Stunde
bei
Raum-
temperatur auf dem Schüttler,
wurden freie Anbindungsstellen des
Avidins durch die am sekundären
Antikörper
Biotinmoleküle
gebundenen
besetzt
(siehe
Abbildung 4).
Drei Spülgänge in PBS dienten
dem Entfernen nicht gebundener
Abbildung 4:
Die Antikörper-ABC-Bindungskaskade
Der primäre Antikörper (pAK) bindet spezifisch am
Antigen, der biotinylierte sekundäre Antikörper (sAK)
erkennt wiederum spezifisch das Fc-Fragment des
pAK. Der Meerettichperoxidase konjugierte AvidinBiotin-Komplex bindet im letzten Schritt über das
Biotin am sekundären Antikörper.
ABC-Komponenten aus dem Gewebe, bevor mit der Diaminobenzidin-Reaktion (DABReaktion) fortgefahren wurde.
Material und Methoden
42
2.6.2 Diaminobenzidin-Reaktion
Zur Lokalisation des Antigens im Gewebe wurde eine DAB-Reaktionen durchgeführt.
Grundsätzlich wird bei der DAB-Reaktion durch eine Peroxidase das zunächst farblose
Chromogen 3,3´-Diaminobenzidin durch einen Oxidationsprozess in ein bräunliches Produkt
umgewandelt (Abbildung 5). Die Reaktionen an den immunologisch präparierten Retinae
beziehungsweise Hirnschnitten wurden methodisch unterschiedlich angegangen.
Abbildung 5: Die DAB-Reaktion
Freigesetzte Sauerstoff-Radikale sind die
Starter der Reaktion, bei der mittels der
Peroxidase das farblose Chromogen 3,3´DAB durch eine Oxidation in einen bräunlichen
Farbstoff umgewandelt wird.
2.6.2.1
DAB-Reaktion der Retina
Die DAB-Reaktion der Retinae erfolgte nach dem Protokoll von Graham und Karnovsky (1966),
wobei das Gewebe in einer 0.06% 3,3´-DAB-Lösung unter Zugabe von 0.3%
Wasserstoffperoxid für zirka 3 Minuten inkubiert wurde. Nachfolgend schlossen sich fünf kurze
Spülgänge in PBS zum Stoppen der Reaktion an.
2.6.2.2
DAB-Reaktion der Hirnschnitte
Bei der im folgenden beschriebenen DAB-Reaktion handelte es sich um eine Nickel-Kobaltintensivierte 3,3´-Diaminobenzidin-Reaktion (Adams, 1981; Shu et al., 1988). AmmoniumNickelsulfat, Ammonium-Chlorid und Kobalt-Chlorid dienen der Signalverstärkung, die Glucose
fungiert als Substrat für die Glucoseoxidase.
Zum Protokoll: zur Ansäuerung des Gewebes wurde zweimal für 10 Minuten mit NatriumAcetatpuffer (pH 6.0) gespült. Anschließend wurden die Hirnschnitte für fünfzehn Minuten in
Material und Methoden
43
DAB präinkubiert, um eine Sättigung mit DAB zu erreichen. Im zweiten Schritt erfolgte die
eigentliche Farbreaktion in einem frischen Gefäß mit neuen Lösungen unter Zusatz von
Glucoseoxidase. Das aus dem Schimmelpilz gewonnene Enzym Glucoseoxidase katalysierte die
folgende Reaktion, als deren Endprodukt H2O2 entstand:
ß-D-Glucose + O2 ⇒ D-Gluconsäure-δ-lacton + H2O2
Der Vorteil der Reaktion ist eine langsame und kontinuierliche Freisetzung des
Wasserstoffperoxid, welches mittels der mit dem Biotin konjugierten Peroxidase das Chromogen
DAB oxidiert. Das DAB polymerisierte dabei unter Diazotierung, am Ort der Oxidierung ergab
sich eine bräunliche Färbung. Gestoppt wurde die Reaktion durch mehrere kurze Spülgänge,
zunächst in Natrium-Acetatpuffer, anschließend in PBS.
2.6.3 Fluoreszenz-Immunhistochemie
In der Fluoreszenz-Immunhistochemie werden Fluoreszenzfarbstoff gekoppelte sekundären
Antikörper eingesetzt, welche durch Licht einer charakteristischen Wellenlänge im
Auflichtfluoreszenzmikroskop
sichtbar
fluoreszierende
mit
Farbstoffe
gemacht
werden.
Kommerziell
erhältlich
sind
unter-
schiedlichen Emissionsspektren.
Der an das Antigen bindende primäre
Antikörper wurde mit Hilfe eines spezifisch
gegen
diesen
gerichteten
sekundären
Antikörper nachgewiesen. Der sekundäre
Antikörper
wiederum
war
mit
den
Fluoreszenzfarbstoff FITC oder TRITC
konjugiert, welche im AuflichtfluoreszenzMikroskop selektiv angeregt werden können
(Abbildung 6).
Die für FITC und TRITC charakteristischen
Eigenschaften sowie die zur Anregung
zugehörigen Filter sind den Tabellen 5 / 6 zu
Abbildung 6:
Fluoreszenz-Immunhistochemie
Der spezifisch gegen ein zu untersuchendes
Antigen gerichtet primäre Antikörper (pAK)
wird mit Hilfe eines Fluoreszenzfarbstoff
gekoppelten (F) sekundären Antikörper (sAK)
detektiert.
Material und Methoden
entnehmen.
44
Material und Methoden
45
Tabelle 5: Anregungs- und Emissionsspektrum der Fluoreszenzfarbstoffe
Fluroeszenz-Farbstoff
Anregungsspektrum [nm]
Emissionsspektrum [nm]
FITC
494
518
TRITC
555
580
Tabelle 6: Filter der Fluoreszenz-Imunhistochemie
2.7
2.7.1
Filter
Anregungsfilter [nm]
Emissionsfilter [nm]
Farbteiler [nm]
FITC
450-490
520
510
TRITC
546
590
580
Prozessierung für die Transmissionselektronenmikroskopie
Immunhistochemie
Im ersten Schritt der immunhistochemischen Untersuchungen zur Expression von BDNF im
adulten TO wurden die Vibratomschnitte frei flotierend für 2 Stunden in 10%-igem Normalserum
aus dem Schaf in einer Standardlösung, bestehend aus 0.03% Triton X-100 in PBS (PBS-T), bei
Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde dreimal 10 Minuten in PBS gespült, bevor das
Material im Antikörper gegen BDNF (1/100 in PBS-T) für 36 Stunden bei 4°C inkubiert wurde.
Es folgten Spülgänge in PBS, bevor sich die Inkubation in dem mit 10nm Gold-markierten
sekundären Antikörper (1/100) gegen BDNF für 12 Stunden bei 4°C anschloß.
2.7.2
Einbettung in Epoxidharz
Die immunhistochemisch aufbereiteten Vibratomschnitte des Tectum opticum wurden mittels einer
Rasierklinge in etwa 2mm lange, vom Ventrikelpithel bis zur pialen Oberfläche reichende
Quadrate zerlegt, welche für 2 Stunden in 1% Osmiumtetroxid (OsO 4) kontrastiert wurden.
Anschließend wurde in einer aufsteigenden Ethanolreihe in 30 minütlichen Schritten von 30%
EtOH bis schließlich 100% EtOH entwässert, wobei die Gewebestücke im 70% EtOH, dem 1%
Uranylacetat und 1% Phosphorwolframsäure zugesetzt war, für 16 Stunden verblieben. Nach
vollständiger Entwässerung wurden die Präparate über das Intermedium Propylenoxid in das
Epon (Serva, Deutschland) überführt, wobei das Propylenoxid schrittweise durch Epon ersetzt
Material und Methoden
46
wurden. Nach abschließender Durchtränkung der Gewebestücke mit Epon wurden die
Kunstharzpräparate unter Zugabe von Härter bei 60°C auspolymerisiert.
2.7.3 Herstellung von Ultradünnschnitten
Die auspolymerisierten Gewebestücke wurden mit Hilfe eines Diamantmessers (Leitz,
Deutschland) auf einem Ultramikrotom (Ultratome III LKB, Reichert, Deutschland) geschnitten.
Es wurden Semidünnschnitte (2µm Dicke) zur lichtmikroskopischen Kontrolle angefertigt. Die
Anfärbung erfolgte in einer Lösung bestehend aus je 1% Methylenblau, Azur II und Borsäure in
Aqua dest. Ultradünnschnitte (70nm Dicke) der Präparate wurden auf Formvar beschichtete
(0.33% Formvar in Chloroform) 75-mesh-Kupfernetze aufgefangen und getrocknet. Eine weitere
Kontrastierung erfolge mit Hilfe des Leika EM-Stain über eine Stunde. Die Kontrastierlösungen
waren Ultrastain I (Dauer 10 Minuten) und Ultrastain II (Dauer 20 Minuten).
2.8
Kolokalisationsuntersuchungen im Tectum opticum
In immunhistochemischen Kolokalisationsuntersuchungen nutzt man die unterschiedlichen
Emissionsspektren diverser Fluoreszenzfarbstoffe, um durch gezielten Einsatz verschieden
markierter sekundärer Antikörper mehrere Antigene in einem Präparat zu detektieren. Im TO der
Taube wurden dazu Doppelmarkierungen in einem Präparat von BDNF, NT-3, trk B und trk C
jeweils mit Vimentin in verschiedenen Altersstadien durchgeführt.
Im Versuchsablauf wurde zunächst eine Fluoreszenz-Immunhistochmie gegen Vimentin
durchgeführt, gefolgt von der Imunhistochemie gegen das entsprechende Neurotrophin
beziehungsweise gegen den trk-Rezeptor. Durch die entsprechende Filterwahl am Mikroskop
konnten so in einem Präparat jeweils zwei Antigene vergleichend untersucht werden.
2.9
Kresylviolett-Färbung
Zur lichtmikroskopischen Darstellung nahezu aller Neuronen in einem jeweiligen Nervengewebe
eignete sich die Kresylviolett-Färbung, bei welcher der Farbstoff Kresylviolett charakteristisch
das endoplasmatischen Retikulum der Zellen anfärbt. Während der Färbeprozedur wurde das
Material zunächst kurz in Aqua dest. und anschließend in 70%-igem Alkohol gespült, bevor es
durch eine Inkubation für ein bis zwei Minuten in Aqua dest., versetzt mit 5 Tropfen 99%-igem
Material und Methoden
47
Eissessig auf 100ml, leicht angesäuert wurde. Die Färbung erfolgte durch eine Inkubation der
Präparate für zehn Minuten in 1%-igem Kresylviolett auf dem Schüttler. Es schlossen sich zwei
kurze Spülgänge in Aqua dest. an, bevor unter steter optischer Kontrolle in Spülgängen in
Alkohol plus Eisessig (70% und 96% EtOH) differenziert wurde.
2.10 Eindeckeln der Präparate
Das Eindeckeln der Retinae erfolgte direkt mittels erwärmter Glycerine-Gelatine. Die auf
gelatinisierten Objekträgern aufgezogenen Hirnschnitte wurden hingegen in einer aufsteigenden
Alkoholreihe (70%, 96%, und 2 x 100%) entwässert. Nach zweimaligem Klären in dem
Lösungsmittel Xylol, welches den Alkohol im Gewebe verdrängt, wurden sie mit DEPEX (Serva,
Feinbiochemic GmbH & Co, Deutschland) eingedeckelt.
Für die Fluoreszenz-Mikroskopie behandeltes Gewebe wurde ohne Vorbehandlung mit
erwärmtem Moviol (Höchst, Deutschland), welches keine Eigenfluoreszenz aufweist,
eingedeckelt.
2.11 Lichtmikroskopie
Die DAB-Präparate wurde auf einem Zeiss-Durchlichtmikroskop mit integrierter Kamera,
ausgewertet. Es standen variable Objektivvergrößerungen (6.3-; 16-: 25-; 40-fach) zur
Verfügung. Die Gesamtvergrößerung des Mikroskops errechnet sich aus:
Objektiv x Optovar (= 1.2) x 3.2
Die Fotodokumentation erfolgte auf dem Film AGFA APX-25, 25 ASA.
2.12 Transmissionselektronenmikroskopie
Die ultrastrukturellen Untersuchungen wurden auf einem Philips 420 Transmissionsektronenmikroskop durchgeführt. Die fotografische Dokumentation erfolgte auf Guilleminot
Filmen.
Material und Methoden
48
2.13 Fluoreszenzmikroskopie
Die Fluoreszensmikroskopie wurde an einem Zeiss Mikroskop mit entsprechenden Filtern und
Neofluar-Objektiven (25-; 40-fach) durchgeführt. Die Fotodokumentation erfolgte auf Ilford
HP5, 400 ASA, mittels einer angeschlossenen Spiegelreflexkamera.
2.14 Konfokale Mikroskopie
Zur Visualisierung der für die Kolokalisationsuntersuchungen einzelner Proteine eingesetzten
Fluoreszenz-gekoppelten Antikörper im Tectum opticum der Taube wurde das konfokale
Mikroskop „MRC-500“ von Bio-Rad Microscience (England) genutzt. Das konfokale
Mikroskop fokussiert den zur Anregung der Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzten Argon-IonenLaser auf eine Lochblende, der dann über einen Spiegel in das Mikroskopobjektiv gelenkt wird.
Das Objektiv wiederum bündelt das Licht in der gewünschten Tiefe des Präparates. Das von
dieser Ebene im Präparat emittierte Licht wird wieder vom Objektiv erfaßt, und auf die Öffnung
einer weiteren Lochblende fokussiert, hinter welcher sich ein Detektor befindet. Vom Gewebe
außerhalb der Fokusebene emittiertes Licht, welches die Abbildung unscharf erscheinen läßt, wird
von dieser Lochblende abgeschirmt. Unter Verwendung einer computergestützten Steuereinheit
wird der Laser in der Fokusebene über das Präparat gefahren, und die gewonnenen Daten auf
einem Bildschirm visualisiert. Die konfokale Mikroskopie eignet sich insbesondere zur Darstellung
von Strukturen, welche eine Tiefenausdehnung im Präparat zeigen. Eine so entstandene scharfe
Abbildung der gesamten Ausdehnung wäre im normalen Fluoreszenzmikroskop nicht möglich. Im
konfokalen Mikroskop wurden nacheinander verschiedene Fokusebenen im Präparat
aufgezeichnet, und die gewonnen Schichtbilder anschließend über die Software MRC-500 zu
einem Bild zusammengefügt.
Zur detaillierten Darstellung möglicher Kolokalisationen bestimmter Proteine in einer Zelle wurde
diese Prozedur zunächst für jeden Fluoreszenzfarbstoff (FITC und TRITC) einzeln durchgeführt,
bevor die Rekonstruktionen mit Hilfe der Bio-Rad Softwear farblich abgesetzt übereinander
gelegt wurden. So entstand ein exaktes Muster zur Expression der untersuchten Proteine im
Tectum opticum in einer Tiefenausdehnung von 50-70µm.
Material und Methoden
49
2.15 Spezifitätskontrollen der Antikörper
Die Aussagekraft der Ergebnisse einer immunhistochemischen Untersuchung hängt von der
Spezifität der eingesetzten Antikörper ab. Vorangegangene Arbeiten zeigten, daß die eingesetzten
Antikörper die gleichen Antigene bei Ratten und Tauben erkennen (Vázquez et al., 1994;
Hannestad et al., 1998).
In der vorliegenden Arbeit wurden außerdem Kontrollen durchgeführt, bei denen der primären
Antikörper durch ein affinitätsgereinigten Antiserum (Vector SP 1000) vom Spender der
primären Antikörper, jedoch ohne den spezifischen primären Antikörper, ersetzt wurde, ohne die
weitere Vorgehensweise der Immunhistochemie zu ändern. Aufschluß über die Spezifität des
sekundären Antikörpers konnte durch eine immunhistochemische Reaktion ohne die Inkubation
der Präparate mit dem primären Antikörper gewonnen werden.
Ergebnisse (Retinale Expression...)
3
49
Ergebnisse
Die im folgenden dargestellten Ergebnisse zeigen die Expression der beiden Neurotrophine
BDNF und NT-3 sowie der high-affinity Neurotrophin-Rezeptoren trk B und trk C in der Retina
und im Tectum opticum der Taube Columba livia während der Entwicklung des retino-tectalen
System. Mit Hilfe dieser Untersuchungen werden intra-retinale und intra-tectale trophische
Regelkreise erfaßt, ebenso wie mögliche retrograde und anterograde Signalwege im retinotectalen System. Insbesondere mögliche neurotrophe Mechanismen während der Entwicklung
einer lateralisierten Informationsverarbeitung in diesem System werden basierend auf diesen
Ergebnissen diskutiert.
Die Untersuchungen der Expression dieser Proteine wurden im embryonalen Gewebe der
Altersstadien E 14 und E 16, als auch in diversen Altersstadien nach dem Schlupf durchgeführt,
beginnend mit dem Schlupftag (PH 0) und fortlaufend mit 1 Tag, 2 Tage, 4 Tage, 7 Tage, 14
Tage alten Tieren (PH 1, PH 2, PH 4, PH 7, PH 14) und adulten Tauben. Diese Altersstadien
reflektieren den Zeitraum, in welchem retino-tectale Verbindungen und damit einhergehend auch
die Lateralisation dieses System entstehen. Die Datenaufnahme in den Untersuchungen bezieht
sich auf drei bis acht Tiere pro Altersstadium. Insgesamt wurden mit den eingesetzten Antikörper
spezifische Markierungen der Zellsomata und Fortsätze neuronaler Zellen in der Retina und im
Tectum opticum gleichermaßen beobachtet.
Die ultrastrukturellen Untersuchungen im Tectum opticum adulter Tauben dienten einer
morphologischen Charakterisierungen einzelner tectaler Schichten, wobei immunhistochemisch die
ultrastrukturelle Lokalisation des Neurotrophins BDNF untersucht wurde. Die gewonnen
Ergebnisse lassen detaillierte Schlußfolgerungen über den BDNF vermittelten trophischen
Signalfluß im retino-tectalen System adulter Tauben zu.
Die Kolokalisationsuntersuchungen von Neurotrophinen und Neurotrophin-Rezeptoren mit dem
für Radialglia spezifischen Intermediärfilament Vimentin wurden zur näheren Charakterisierung
faserartiger, Neurotrophin / Neurotrophin-Rezeptor positiver Strukturen im Tectum opticum
(siehe Punkt 3.3) während einzelner juveniler Altersstadien durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen
eine deutliche Koexpression dieser Proteine im Tectum opticum, wodurch bislang nicht bekannte
neurotrophe Mechnismen bei der Zellmigration erfaßt wurden.
Ergebnisse (Retinale Expression...)
3.1
50
Kontrollexperimente
In den Untersuchungen zur Spezifität der eingesetzten Neurotrophin- und Neurotrophin-Rezeptor
Antikörper wurde ersichtlich, daß die verwendeten Kaninchen gegen Ratte Antikörper auch die
entsprechenden Antigene im Taubenhirn erkannten. In immunhistochemischen Kontrollen wurde
der primäre Antikörper gegen ein immunologisch nicht reaktives Serum ersetzt. Nach einer
ansonsten unveränderten immunhistochemischen Prozedur blieben somatischer Signale oder
diffuse Markierungen im Taubenhirn und den Retinae aus. Auch die sekundären Antikörper
zeigten keinerlei unspezifische Markierungen in den Präparaten.
3.2
Retinale Expression von BDNF, NT-3, trk B und trk C
Zur Charakterisierung des retinalen Expressionsmuster von BDNF, NT-3, trk B und trk C
während der Entwicklung des retino-tectalen Systems wurden Netzhäute der Altersstadien E 16,
PH 0, PH 1, PH 2, PH 4, PH 7, PH 14 sowie adulter Tauben untersucht. Im ersten
untersuchten Altersstadium E 16 waren alle retinalen Schichten etabliert, wenngleich die
Neuronen in den einzelnen Schichten vermutlich noch nicht voll differenziert waren. Diese
Aussage basiert auf ausschließlich lichtmikroskopischen morphologischen Betrachtungen, wobei
die Schichtdicke der inneren plexiformen Schicht im Verlaufe der untersuchten Altersstadien
zunahm, während die Schichtdicken der inneren und äußeren nukleären Schichten leicht
abnahmen. Vermutlich korrelierte die Straffung der nukleären Schichten mit der etablierten
Konfiguration der Neuronen in einzelnen Schichten, während die Ausdehnung der plexiformen
Schichten zunehmende synaptische Kontakte der Neuronen wahrscheinlich machte.
Insgesamt waren die Perikarien der retinale Ganglienzellen und der Photorezeptorzellen anhand
ihrer Lage unterhalb der inneren plexiformen, bzw. oberhalb der äußeren plexiformen Schicht
eindeutig zu erkennen, wohingegen die Zuordnung der immunhistochemisch-positiven Neuronen
zu einem bestimmten retinalen Zelltyp in der inneren nukleären Schicht basierend auf der Lage der
Zellkörper innerhalb dieser Schicht, der Perikariengröße sowie der Art ihrer Fortsätze
durchgeführt wurde.
Retinale Neuronen zeigten in den durchgeführten Experimenten eine deutliche Immunreaktivität
gegen die eingesetzten Antikörper, wobei das Signal von BDNF und trk C zumeist auf das
Perikarion der Neuronen begrenzt war, hingegen die Antikörpern gegen NT-3 und trk B sowohl
Ergebnisse (Retinale Expression...)
51
die Somata als auch die proximalen Fortsätze einzelner Neuronen markierten. Darüber hinaus
zeigten die eingesetzten Antikörper diffuse, aber deutliche Markierungen des Neuropils.
3.2.1 Retinale BDNF Expression
In den Untersuchungen zur Expression von BDNF in der Taubenretina wurde das Neurotrophin
in diversen Zelltypen nachgewiesen (Abbildungen 7-10). Nach immunhistochemischer
Behandlung zeigten sich deutliche Markierungen retinaler Ganglienzellen sowie moderate Signale
in der inneren nukleären Schicht. Anhand der Lage der markierten Neuronen direkt oberhalb der
inneren plexiformen Schicht ist es wahrscheinlich, daß diese Nervenzellen zu den Amakrinzellen
sowie zu den displaced Ganglienzellen der Retina zählen (Abbildung 9). Desweiteren zeigten die
Somata der Photorezeptorzellen in der Taubenretina eine BDNF-Immunreaktivität (Abbildung
10). Außer den somatischen Markierungen spezifischer Neuronen war eine Neuropil-Färbung
der inneren und äußeren plexiformen Schichten sichtbar (Abbildung 9).
Im einzelnen folgten die BDNF-Expressionen in den einzelnen Schichten der Taubenretina vom
Embryonalstadium bis zu den adulten Tieren einem zeitlichen Gradienten, wobei die embryonale
Retina keinerlei BDNF-Expression, weder somatisch noch des Neuropils zeigte (Abbildung 7).
Die BDNF-Synthese begann am Schlupftag (PH 0) mit vereinzelten BDNF-positiven retinalen
Ganglienzellen (Abbildung 7). Eine Markierung der inneren plexiformen Schicht war zum
Zeitpunkt PH 0 ebenfalls zu erkennen, wenn auch sehr schwach.
Ergebnisse (Retinale Expression...)
52
Abbildung 7: E 16 - PH 0
a) In der embryonalen Retina wurden keine BDNF-positiven Neuronen
detektiert.
b) Ab dem Schlupftag zeigten retinale Ganglienzellen (G) und diffus die innere
plexiforme Schicht BDNF Immunreaktivität (Pfeile).
Balken = 50µm.
Einen Tag nach dem Schlupf (PH 1) war die Expression des Neurotrophins noch immer auf
vereinzelte retinale Ganglienzellen begrenzt, wobei die Markierung der inneren plexiformen
Schicht an Signalintensität zunahm (Abbildung 8).
Ergebnisse (Retinale Expression...)
53
Abbildung 8: PH 1-PH 2
a) Einen Tag nach dem Schlupf waren retinale Ganglienzellen (G) und die innere
plexiforme Schicht (Pfeile) BDNF markiert.
b) Am zweiten Tag nach dem Schlupf dehnte sich die somatische BDNF
Markierung auf Neuronen der inneren nukleären Schicht (weiße Pfeile) und
diffus auf die äußere und innere plexiforme Schicht aus (schwarze Pfeile).
Balken = 50µm.
Zwei Tage nach dem Schlupf (PH 2) wurde BDNF von retinalen Ganglienzellen und erstmals
auch von Neuronen der inneren nukleären Schicht exprimiert (Abbildung 8). Das Signal dieser
retinalen Zellen war schwach, aber eindeutig. Ob es sich hierbei um Bipolarzellen, Amakrinzellen
oder displaced Ganglienzellen handelte, konnte nicht abschließend geklärt werden. Desweiteren
war ab PH 2 eine diffuse Markierung der äußeren plexiformen Schicht zu erkennen (Abbildung
8). Vom Tag vier (PH 4) bis hin zum Tag 14 nach dem Schlupf (PH 14) war ein sehr starkes
Ergebnisse (Retinale Expression...)
54
BDNF-Signal in retinalen Ganglienzellen als auch in Neuronen der inneren nukleären Schicht zu
verzeichnen (Abbildung 9).
Abbildung 9: PH 4-PH 7
Eine intensive somatische BDNF Markierung retinaler Ganglienzellen (G) und
Neuronen der inneren nukleären Schicht (weiße Pfeile) wurde vier (a) und sieben
Tage (b) nach dem Schlupf erkannt, begleitet von einer diffusen Markierung der
äußeren und inneren plexiformen Schicht (schwarze Pfeile). Balken = 50µm.
Ergebnisse (Retinale Expression...)
55
Die BDNF-positiven Ganglienzellen ergaben das Bild einer perlschnurartigen Aufreihung,
wohingegen die markierten Neuronen in der inneren nukleären Schicht in verschiedenen Tiefen,
zumeist aber direkt oberhalb der inneren plexiformen Schicht, lagen. Möglicherweise handelte es
sich hierbei um BDNF-positive Amakrinzellen oder displaced Ganglienzellen, nicht aber um die
zur äußeren plexiformen Schicht orientierten Bipolarzellen. Auch in den juvenilen Altersstadien
PH 4 bis PH 14 war eine diffuse Markierung der äußeren plexiformen Schicht zu erkennen
(Abbildungen 9-10). In der adulten Taubenretina ähnelte die Expression von BDNF dem Muster
im Altersstadium PH 14 (Abbildung 10). Es ergab sich ein sehr klares BDNF-positives Signal
retinaler Ganglienzellen, welche dicht gepackt nebeneinander lagen. Die sich anschließende innere
plexiforme Schicht zeigte ein moderates BDNF-Signal. In der inneren nukleären Schicht
synthetisierten insbesondere die direkt an der inneren plexiformen Schicht gelegenen Neuronen
BDNF, wobei es sich vermutlich um Amakrinzellen und/oder displaced Ganglienzellen handelte.
Außerdem kennzeichnete die adulte Taubenretina eine deutliche somatische BDNF-Expression
der Photorezeptorzellen (Abbildung 10).
Ergebnisse (Retinale Expression...)
Abbildung 10: PH 14 – Adult
In der Retina vierzehn Tage alter (a) und adulter Tauben (b) wurden deutliche
somatische BDNF Markierungen in retinalen Ganglienzellen (G) und
Amakrinzellen (A), als auch, bei den Adulten (b), in der äußeren nukleären
Schicht (weiße Pfeile) erkannt. Desweiteren zeigten sich diffuse Markierungen der
inneren plexiformen Zellschicht (schwarze Pfeile).
Balken = 50µm.
56
Ergebnisse (Retinale Expression...)
57
3.2.2 Retinale NT-3 Expression
Die immunhistochemischen Untersuchungen zur Expression von Neutrotrophin-3 (NT-3) in der
Taubenretina zeigten die Synthese des Proteins in verschiedenen Zelltypen (Abbildungen 11-14).
NT-3-positiv waren retinale Ganglienzellen, Neuronen der inneren nukleären Schicht,
wahrscheinlich Bipolarzellen, Amakrinzellen und displaced Ganglienzellen sowie die Somata von
Photorezeptorzellen in der äußeren nukleären Schicht. Neben der somatischen Markierungen
waren noch Neuropilmarkierung der inneren plexiformen Schicht mit dem Antikörper gegen
NT-3 zu beobachten. Die Expression des Proteins erfolgte in aufeinanderfolgenden Stadien vom
Embryonalstadium bis zum adulten Tier, wobei einzelne Neuronentypen unterschiedliche
Expressionsmuster während der Entwicklung aufwiesen.
In der embryonalen Retina (E16) konnte NT-3 immunhistochemisch nicht nachgewiesen werden
(Abbildung 11). Hingegen war bereits am Schlupftag (PH 0), also zwei Tage später, eine massive
Expression von NT-3 in einer Vielzahl retinaler Ganglienzellen, aufgereiht wie auf einer
Perlenkette, zu beobachten (Abbildung 11). Außerdem war ab PH 0 eine Neuropilfärbung der
inneren plexiformen Schicht zu verzeichnen.
Einen Tag nach dem Schlupf (PH 1) war das Expressionsmuster mit dem von PH 0 nahezu
identisch, wobei zusätzlich erste Neuronen der inneren nukleären Schicht sehr schwach NT-3positiv waren (Abbildung 12). Es handelte sich hierbei um direkt über der inneren plexiformen
Schicht gelegene Neuronen, wodurch eine Zuordnung dieser zu den Amakrinzellen und/oder
displaced Ganglienzellen wahrscheinlich ist. Wiederum einen Tag später (PH 2) exprimierten
retinale Ganglienzellen und vermutlich Bipolarzellen der inneren nukleären Schicht das
Neurotrophin NT-3 (Abbildung 12). Die Klassifizierung der NT-3-positiven Zellen als
2. Neuronen der Sehbahn beruhte zum einen auf ihrer Lokalisation im zentralen Bereich der
inneren nukleären Schicht sowie zum anderen auf ihren charakteristischen und deutlich markierten
distalen Fortsätze, welche zu den Ganglienzellen projizierten. In einer subjektiven Bewertung des
immunhistochemischen Signals zeigte sich die höchste Signalintensität am PH 2, wobei neben dem
somatischen Signal auch die distalen Fortsätze der retinalen Ganglienzellen und der Bipolarzellen
markiert waren (Abbildung 12). Zu beobachten war außerdem eine moderate Markierung der
inneren plexiformen Schicht als auch eine schwache und diffuse Markierung der
Photorezeptorschicht (Abbildung 12).
Ergebnisse (Retinale Expression...)
Abbildung 11: E 16 – PH 0
a) In der embryonalen Retina (E 16) wurden keine NT-3 Markierungen
beobachtet.
b) Zwei Tage später (PH 0) hingegen waren eine Vielzahl retinaler
Ganglienzellen (G) NT-3-positiv. Darüber hinaus zeigte sich eine schwache
diffuse Markierung der inneren plexiformen Schicht (Pfeil). Balken = 50µm.
58
Ergebnisse (Retinale Expression...)
Abbildung 12: PH 1 – PH 2
a) Einen Tag nach dem Schlupf (PH 1) waren retinale Ganglienzellen (G) mit
dem Antikörper gegen NT-3 markiert. Erste schwach NT-3-positive
Neuronen zeigten sich in der inneren nukleären Schicht (Pfeile).
b) Am zweiten Tag nach dem Schlupf (PH 2) waren retinale Ganglienzellen (G)
und Bipolarzellen (B) der inneren nukleären Zellschicht NT-3-positiv, wobei
die Somata und die proximalen Dendriten deutlich zu erkennen waren.
Balken = 50µm.
59
Ergebnisse (Retinale Expression...)
60
Ab dem vierten Tag nach dem Schlupf (PH 4) bis zum letzten untersuchten juvenilen Stadium
PH 14 war eine moderate NT-3 Synthese in den retinalen Ganglienzellen erkennbar, wobei die
Dichte der NT-3 exprimierenden Ganglienzellen in den älteren Entwicklungsstadien abnahm
(Abbildungen 13-14). Ebenso waren Neuronen der inneren nukleären Schicht schwach NT-3positiv, vermutlich Bipolarzellen und Amakrinzellen wie gleichermaßen displaced Ganglienzellen.
Diffus markiert waren in den Altersstadien PH 4 bis zu den Adulten die innere plexiforme Schicht
(Abbildungen 13-14).
Abbildung 13: PH 4 – PH 7
In den Altersstadien PH 4 (a) und PH 7 (b) zeigten retinale Ganglienzellen (G)
und Neuronen der inneren nukleären Zellschicht (schwarze Pfeile) NT-3
Immunreaktivität. Diffus markiert mit dem Antikörper gegen NT-3 war die innere
plexiforme Schicht (weiße Pfeile). Balken = 50µm.
Ergebnisse (Retinale Expression...)
61
Zum Zeitpunkt PH 14 waren zusätzlich vereinzelte Photorezeptorzellen diskret somatisch NT-3positiv (Abbildung 14). In der adulten Retina war das NT-3 Signal schwach (Abbildung 14).
Vermutlich synthetisierten in Adulten etwa die Hälfte der retinalen Ganglienzellen das
Neurotrophin sowie vereinzelt Neuronen der inneren nukleären Zellschicht (Amakrinzellen
und/oder displaced Ganglienzellen).
Abbildung 14: PH 14 – Adult
Bei vierzehn Tage alten (PH 14) (a) und adulten Tauben (b) waren retinale
Ganglienzellen (G) NT-3-positiv. Während im Altersstadium PH 14 Bipolarzellen
(B) und die Somata der Photorezeptoren NT-3 markiert waren (schwarze
Pfeile), so zeigten bei Adulten insbesondere Amakrinzellen (A) Immunreaktivität
gegen NT-3. Außerdem diffus markiert war die innere plexiforme Schicht (weiße
Pfeile). Balken = 50µm.
Ergebnisse (Retinale Expression...)
62
3.2.3 Retinale trk B-Expression
Der high affinity Rezeptor trk B wurde in der Taubenretina von verschiedenen Zelltypen
exprimiert. Mit Hilfe immunhistochemischer Methoden wurde das Protein in den Somata retinaler
Ganglienzellen, in Neuronen der inneren nukleären Schicht (vermutlich in displaced Ganglienzellen,
Amakrinzellen und Bipolarzellen) sowie diffus in der inneren und äußeren plexiformen Schicht
nachgewiesen (Abbildung 15–18).
Insgesamt war eine deutliche Korrelation zwischen der trk B Expression und einzelnen
Altersstadien zu erkennen. Beginnend mit der embryonalen Retina E 16 war keine trk B
Immunreaktivität zu verzeichnen (Abbildung 15). Am Schlupftag (PH 0) waren die ersten
Ganglienzellen vereinzelt, aber sehr deutlich trk B-positiv (Abbildung 15). Außerdem waren in der
inneren nukleären Schicht der Retina vereinzelt Zellen mit dem Antikörper gegen trk B markiert,
wobei es sich vermutlich um Amakrinzellen handelte. Moderat und diffus war am PH 0 die innere
plexiforme Schicht markiert (Abbildung 15).
Einen Tag nach dem Schlupf (PH 1) zeigte die Retina das gleiche Expressionsmuster wie am
PH 0; Ganglienzellen synthetisierten den trk B Rezeptor ebenso wie vereinzelte Neuronen in der
inneren nukleären Schicht (Abbildung 16). Hinzu kam eine diffuse Markierung der äußeren und
inneren plexiformen Schicht. Im Zeitraum von zwei Tagen (PH 2) (Abbildung 16) bis vier Tagen
nach dem Schlupf (PH 4) (Abbildung 17) waren es vermutlich Amakrinzellen und auch displaced
Ganglienzellen, welche ein deutliches trk B-positives Signal zeigten. Hierbei kennzeichneten sich
die displaced Ganglienzellen durch ihre Somagröße aus ebenso wie die trk B-positiven Neuronen
in der retinalen Ganglienzellschicht. In der äußeren plexiformen Schicht war weiterhin eine diffuse
Markierung zu erkennen (Abbildung 16).
Ergebnisse (Retinale Expression...)
Abbildung 15: E 16 – PH 0
a) Im Altersstadium E 16 wurde keine trk B Immunreaktivität in der Retina der
Taube erkannt.
b) Ab dem Schlupftag (PH 0) waren vereinzelt Neuronen der inneren
plexiformen Schicht (vermutlich Amakrinzellen: A) und retinale Ganglienzellen
(G) trk B-positiv. Mit dem Antikörper gegen trk B diffus markiert war die
innere plexiforme Schicht (Pfeile).
Balken = 50µm.
63
Ergebnisse (Retinale Expression...)
Abbildung 16: PH 1 – PH 2
a) Am Tag eins nach dem Schlupf waren retinale Ganglienzellen somatisch trk B
markiert (G) ebenso wie vereinzelte Neuronen der inneren nukleären Schicht
(schwarze Pfeile). Diffus trk B-positiv waren die äußere und innere plexiforme
Schicht (weiße Pfeile).
b) Am zweiten Tag nach dem Schlupf wurden trk B-positive retinale
Ganglienzellen (G), Amakrinzellen (A), displaced Ganglienzellen (DG) sowie
schwach markierte Bipolarzellen (B) erkannt. Insbesondere die proximalen
Fortsätze der Amakrinzellen waren trk B-positiv.
Balken = 50µm.
64
Ergebnisse (Retinale Expression...)
65
Abbildung 17: PH 4 – PH 7
a) Im Altersstadium PH 4 waren retinale Ganglienzellen (G) sowie
Amakrinzellen (A) somatisch trk B markiert, begleitet von einer diffusen
Markierung der inneren plexiformen Schicht (Pfeile).
b) Sieben Tage nach dem Schlupf nahm die Immunreaktivität gegen trk B zu.
Retinale Ganglienzellen (G) und Amakrinzellen (A) exprimierten den highaffinity Rezeptor, ebenfalls begleitet von einer diffuses Markierungen der
inneren plexiformen Schicht (Pfeile). Balken = 50µm.
Ab dem siebten Juveniltag (PH 7) bis hin zum Tag 14 nach dem Schlupf (PH 14) wurde das
trk B Signal subjektiv stärker (Abbildungen 17-18), wobei retinale Ganglienzellen und Neuronen
der inneren nukleären Schicht massiv trk B-positiv waren. Insbesondere am PH 14 zeigten eine
Vielzahl von vermutlich Amakrinzellen eine starke Immunreaktivität gegen den trk B Rezeptor
Ergebnisse (Retinale Expression...)
66
(Abbildung 18). Außer diesen somatischen Markierungen war eine diffuse Färbung des Neuropils
der inneren plexiformen Schicht zu erkennen. In der adulten Taube reduzierte sich das retinale
trk B-positive Signal somatisch auf die Ganglienzellen und diffus auf die innere plexiforme Schicht
(Abbildung 18).
Ergebnisse (Retinale Expression...)
Abbildung 18: PH 14 – Adult
a) Vierzehn Tage nach dem Schlupf wurden intensive Immunreaktivitäten gegen
trk B in retinalen Ganglienzellen (G) und vermutlich Amakrinzellen (A)
beobachtet, wobei die proximalen Fortsätze der Amakrinzellen trk B-positiv
waren. Begleitet wurde die somatischen Markierungen von diffusen
Färbungen der inneren und schwach der äußeren plexiformen Schichten
(Pfeile).
b) In den adulten Tauben waren somatisch retinale Ganglienzellen (G) und diffus
die innere plexiforme Schicht (Pfeile) trk B-positiv.
Balken = 50µm.
67
Ergebnisse (Retinale Expression...)
68
3.2.4 Retinale trk C-Expression
In den folgenden immunhistochemischen Darstellungen wurde die Expression des high-affinity trk
C Rezeptor von diversen Zelltypen der Taubenretina nachgewiesen. Deutlich wurde die Synthese
dieses spezifischen Neurotrophin-Rezeptors in retinalen Ganglienzellen und in Neuronen der
inneren nukleären Schicht, wobei es sich vermutlich um displaced Ganglienzellen sowie
Amakrinzellen handelte (Abbildungen 19–22). Ein schwach somatisches und diffuses trk C Signal
war darüber hinaus in der äußeren nukleären und plexiformen Schicht und ausschließlich diffus in
der inneren plexiformen Schicht zu erkennen.
Auch die Expression des trk C Proteins in der Taubenretina kennzeichnete ein differentielles
Muster in den verschiedenen Entwicklungsstadien. In der embryonalen Retina wurde der trk C
Rezeptor immunhistochemisch nicht nachgewiesen (Abbildung 19). Erst ab dem Schlupftag
(PH 0) wurde ein moderates trk C Signal in vereinzelten Somata retinaler Ganglienzellen sichtbar
(Abbildung 19). Sehr vereinzelt zeigte sich ab PH 0 ein schwaches trk C-positives Signal in den
Somata von Photorezeptorzellen sowie eine diffuse Markierung der inneren plexiformen Schicht.
Ein und zwei Tage nach dem Schlupf (PH 1 / PH 2) exprimierten retinale Ganglienzellen den
trk C Rezeptor, wobei erstmals vereinzelte Neuronen der inneren nukleären Schicht ein
schwaches trk C-positives Signal zeigten (Abbildung 22). Desweiteren wurde eine
Intensitätszunahme der Neuropilfärbung der inneren plexiformen Schicht und eine trk C
Markierung der äußeren plexiformen Schicht in diesen Altersstadien beobachtet.
Ergebnisse (Retinale Expression...)
Abbildung 19: E 16 – PH 0
a) In der embryonalen Retina (E 16) wurde keine trk C Immunreaktivität
erkannt.
b) Ab dem Schlupftag (PH 0) exprimierten vereinzelte retinale Ganglienzellen
(G) und darüber hinaus schwach somatisch einzelne Photorezeptoren
(schwarzer Pfeil) den trk C Rezeptor. Diffus markiert war ab PH 0 die innere
plexiforme Schicht (weiße Pfeile).
Balken = 50µm.
69
Ergebnisse (Retinale Expression...)
70
Abbildung 20: PH 1 – PH 2
a) Einen Tag nach dem Schlupf waren retinale Ganglienzellen (G) trk C-positiv
ebenso wie die innere und äußere plexiforme Schicht (Pfeile).
b) Zwei Tage nach dem Schlupf zeigten auch Neuronen der inneren nukleären
Schicht trk C Immunreaktivität, wobei es sich vermutlich um Amakrinzellen
(A) und/oder displaced Ganglienzellen (DG) handelte. Die trk C Expression
in den retinalen Ganglienzellen (G) nahm in diesem Altersstadium an Quantität
und Signalstärke zu. Diffus markiert waren die innere und äußere plexiforme
Schicht. Balken = 50µm.
Zwischen dem vierten und siebten Tag nach dem Schlupf (PH 4 / PH 7) zeigte sich eine klare
Immunreaktivität in retinalen Ganglienzellen und in Neuronen der inneren nukleären Schicht
Ergebnisse (Retinale Expression...)
71
(Abbildung 21). Aufgrund der Lage dieser Neuronen direkt oberhalb der inneren plexiformen
Schicht waren es vermutlich Amakrinzellen und/oder displaced Ganglienzellen. In den
Altersstadien PH 4 und PH 7 waren intensive diffuse trk C Markierung der inneren und äußeren
plexiformen Schicht zu erkennen (Abbildung 21).
Abbildung 21:PH 4 – PH 7
Die trk C Expression im Altersstadium PH 4 (a) und PH 7 (b) war deutlich
sichtbar in retinalen Ganglienzellen (G) als auch Neuronen der inneren nukleären
Schicht (schwarze Pfeile). Vermutlich handelte es sich um Amakrinzellen und/oder
displaced Ganglienzellen. Diffus markiert waren die innere und äußere plexiforme
Schicht mit dem Antikörper gegen trk C (weiße Pfeile). Balken = 50µm.
Ergebnisse (Retinale Expression...)
72
Ergebnisse (Retinale Expression...)
73
Vierzehn Tage nach dem Schlupf (PH 14) nahm das trk C Immunsignal ni den Neuronen der
inneren nukleären Schicht an Intensität ab, blieb aber in den retinalen Ganglienzellen hoch.
Vermutlich handelte es sich hier bei den Neuronen der inneren nukleären Schicht um Amakrinund/oder displaced Ganglienzellen (Abbildung 22). In den vierzehn Tage alten Tauben waren
außerdem die äußere und innere plexiforme Schicht trk C markiert (Abbildung 22). Die adulte
Taubenretina zeigte eine deutliche trk C Expression in retinalen Ganglienzellen und eine
schwächere Expression des Rezeptors in der inneren plexiformen Schicht. Aufgrund der
Lokalisation dieser trk C-positiven Neuronen direkt an der innere plexiformen Schicht handelte es
sich wahrscheinlich um Amakrinzellen und displaced Ganglienzellen (Abbildung 22). Zusätzlich
trk C-positiv war die innere plexiforme Schicht (Abbildung 22). Die Signalintensität in den
retinalen Ganglienzellen schien in einer subjektiven Betrachtung, beginnend mit PH 0 bis zum
Adultstadium, kontinuierlich an Intensität zuzunehmen (Abbildungen 19-22). Hingegen schien eine
maximale Signalintensität der Neuronen der inneren nukleären Schicht zwischen PH 4 und PH 7
erreicht worden zu sein (Abbildung 21).
Ergebnisse (Retinale Expression...)
Abbildung 22:PH 14 –Adult
In den Retinae vierzehn Tage alter (a) und adulter Tauben (b) waren retinale
Ganglienzellen (G) intensiv trk C immunreaktiv. Etwas schwächer waren auch
Amakrin und/oder displaced Ganglienzellen (schwarze Pfeile) mit dem Antikörper
gegen trk C markiert. Begleitet wurden diese somatischen Markierungen von
einer diffusen Färbung der inneren plexiformen Schicht (weiße Pfeile). Balken =
50µm.
74
Ergebnisse (Retinale Expression...)
75
Die Tabelle 7 faßt die Ergebnisse der retinalen Expression der Neurotrophine BDNF und NT-3
sowie der high-affinity Rezeptoren trk B und trk C zusammen. Deutlich wird die mit dem
Schlupftag beginnende und in den juvenilen Altersstadien anhaltend intensive Expression von
BDNF und NT-3 und ebenso der trk B und trk C Rezeptoren in retinalen Ganglienzellen und
Neuronen der inneren nukleären Schicht. Während BDNF in der adulten Taube weiterhin intensiv
in Neuronen der inneren nukleären Schicht und den retinalen Ganglienzellen synthetisiert wurde,
so war ein Maximum der NT-3 Expression zwischen PH 2 und PH 14 zu erkennen. Die retinale
Expression von trk B und trk C hingegen verlief in der Taube relativ gleichförmig. Beginnend mit
dem Schlupftag waren vereinzelte retinale Ganglienzellen trk B und trk C positiv, wobei die
Signale der beiden high-affinity Rezeptoren in den folgenden Altersstadien an Intensität zunahmen
und auch in den adulten Tieren deutlich zu erkennen waren. Außerdem zeigten Neuronen der
inneren nukleären Schicht intensive Immunmarkierungen gegen die beiden trk Rezeptoren,
insbesondere in den juvenilen Altersstadien.
Tabelle7: Zeitlicher Verlauf der retinalen Expression von BDNF, NT-3, trk B und trk C
ÄNS = äußere nukleäre Schicht, INS = innere nukleäre Schicht, RGZ = retinale
Ganglienzellschicht. Markierungsintensität: + = moderat; ++ = intensiv; +++ = sehr intensiv; - =
nicht zu erkennen.
BDNF
NT-3
Trk B
Trk C
E 16
PH 0
PH 1
PH 2
PH 4
PH 7
PH 14
Adult
ÄNS
-
-
-
-
-
-
-
+
INS
-
-
-
+
++
+++
+++
+++
RGZ
-
+
+
++
+++
+++
+++
+++
ÄNS
-
-
-
+
-
-
+
-
INS
-
-
+
++
++
++
++
+
RGZ
-
+++
+++
+++
++
++
++
++
ÄNS
-
-
-
-
-
-
-
-
INS
-
+
+
++
++
+++
+++
-
RGZ
-
+
+
++
++
+++
+++
+++
ÄNS
-
+
-
-
-
-
-
-
INS
-
-
-
+
++
++
+
+
RGZ
-
+
++
++
++
+++
+++
+++
Ergebnisse (Retinale Expression...)
76
Die Expression von BDNF, NT-3, trk B und trk C ist ein Indiz für neurotrophe Signalflüße in der
juvenilen und adulten Taubenretina. Hierbei erfolgte die immunhistochemische Detektion der oben
genannten Antigene ab dem Schlupftag der Tauben, während in der embryonalen Retina keine
immunmarkierten Strukturen erkennbar waren. Obgleich auch die Retinae embryonaler Tauben
durch die Eischale dringendes Licht empfangen können, so sind die Tiere einer massiven
Lichtstimulation ab dem Schlupftag ausgesetzt. Die ebenfalls ab PH 0 beginnende Expression der
Neurotrophine / Neurotrophin-Rezeptoren deutet auf aktivitätsabhängige, über Licht gesteuerte
Prozesse bei der Synthese dieser Proteine hin. Möglicherweise fungieren die in der äußeren und
inneren nukleären Schicht, und ebenso in der retinalen Ganglienzellschicht exprimierten
Neurotrophine als intrinsische Signale während der Etablierung der Retina, zum Beispiel bei der
Entwicklung der dendritischen Verzweigung oder der Synapsenbildung der Neuronen.
Nach einer von Bovolenta und Mitarbeitern (1996) durchgeführten Neutralisation von NT-3
durch spezifische Antikörper wurden massive Entwicklungsstörungen der Retina beobachtet. Die
Ausdehnung der Zellschichten unterblieb, ebenso wie die dendritische Verzweigung der retinalen
Ganglienzellen. Auch die Anzahl der Axonen im Nervus opticus wurde durch die Blockierung von
NT-3 drastisch reduziert.
Neben NT-3 deuten diverse Untersuchungen (siehe Punkt 4.1) auch auf BDNF als wichtigen
trophischen Faktor der retinalen Entwicklung (Überblick: v. Bartheld, 1998). Möglicherweise
regulieren die beiden trophischen Substanzen im Zusammenspiel die Entwicklung der Retina.
Hierbei ist die mit dem Schlupftag beginnende massive Expression von NT-3 ein Hinweis auf eine
wichtige Funktion dieses Neurotrophins bei der retinalen Entwicklung direkt nach der massiven
Lichtstimulation. Im gleichen Zeitraum wird BDNF im Gegensatz zu NT-3 schwächer exprimiert,
mit steigender Tendenz im weiteren Verlauf der retinalen Differenzierung bis zur adulten Taube.
Möglicherweise ist BDNF ein wichtiger trophischer Faktor während der späten retinalen
Differenzierung.
Die beiden Neurotrophine BDNF und NT-3 und der Neurotrophin-Rezeptor trk C werden auch
in diversen Schichten der adulten Taubenretina exprimiert, wodurch auch hier trophische
intraretinale Signalflüsse denkbar sind. Die funktionellen Relevanzen solcher intraretinalen
Neurotrophin-Signalflüsse liegen möglicherweise in einer ständigen Feinanpassung des Systems,
zum Beispiel hinsichtlich der Dendritenmorphologie, der Transmittersynthese, und der
synaptischen Verschaltungen (Überblick: Ebadi et al., 1997). Die Synthese von BDNF, NT-3,
Ergebnisse (Retinale Expression...)
77
trk B und trk C in den retinalen Ganglienzellen juveniler wie auch adulter Tauben kann darüber
hinaus Ausdruck anterograder und/oder retrograder Signalflüsse zwischen der Retina und
diversen weiteren Hirnstrukturen sein. Die im folgenden beschriebenen Ergebnisse zur Expression
dieser Proteine im Tectum opticum lassen eine genauere Analyse retino-tectalen Signalflüsse zu.
Ergebnisse (Tectale Expression...)
3.3
76
Tectale Expression von BDNF, NT-3, trk B und trk C
Die Charakterisierung des tectalen Expressionsmusters der Neurotrophine BDNF, NT-3 sowie
der high-affinity Rezeptoren trk B und trk C wurde in den Altersstadien E 14, E 16, PH 0, PH 1,
PH 2, PH 4, PH 7, PH 14 und in der adulten Taube durchgeführt. Viele Neuronen dieser
mesencephalen Struktur kennzeichnete eine deutliche somatische Immunreaktivität mit zum Teil
proximal gefärbten Fortsätzen. Die Klassifizierung erfolgte zum einen auf Grund der Lage der
immunhistochemisch markierten Somata in den zu bestimmenden tectalen Schichten, zum anderen
anhand der zum Teil markierten Zellfortsätze. In den retino-rezipienten superficialen Schichten
wurde neben den klar abgrenzbaren Radialzellen auch weitere Neuronen erkannt, deren genaue
Zuordnung anhand dieser immunhistochemischen Daten nicht erfolgen konnte. Es handelte sich
um Nervenzellen, deren mit den Antikörpern markierte Fortsätze horizontal zur tectalen
Oberfläche verliefen. Vermutlich waren dies Horizontalzellen der superficialen Schichten, aber
insbesondere in den juvenilen Altersstadien auch tangential zur tectalen Oberfläche migrierende
Neuronen. In den mittleren Zellschichten waren Radialzellen und multipolare Neuronen, deren
Dendriten bis in die superficialen Schichten reichten, immun-positiv gegen die eingesetzten
Antikörper. In den immunhistochemischen Untersuchungen waren in den tiefen tectalen Schichten,
die mit den Neuronen der Schicht 13 den Hauptanteil der Efferenzen aus dem Tectum opticum
bilden, und wo außerdem während der Entwicklung der mesencephalen Struktur Neuronen im
Ventrikelepithel generiert werden, mutipolare Neuronen in der Schicht 13 und kleine Neuronen
der Schichten 14 und 15 dargestellt. Zusätzlich waren radial verlaufende, mehrere Zellschichten
überspannende faserartige Markierungen ohne somatisches Signal zu beobachten. Eine genaue
Zuordnung dieser im folgenden als radial orientierte Fasern bezeichneten Strukturen erfolgt im
Abschnitt 3.4 “Kolokalisationsuntersuchungen”. Der bei der Beschreibung der Immunmarkierung
tectaler Neuronen gebrauchte Begriff der Kolumnen bezieht sich auf die morphologische
Betrachtung eines mehrere Zellschichten überspannenden, somatischen und diffusen Signals, mit
klarer Abgrenzung zu direkt benachbarten Bereichen. Die Beschriftung der Schichten erfolgt in
den Embryonalstadien der in der Einleitung beschrieben alphabetischen Nomenklatur und ab
PH 0 der von Ramon y Cajal (1911) eingeführten numerischen Nomenklatur.
Ergebnisse (Tectale Expression...)
77
3.3.1 Tectale BDNF Expression
In den immunhistochemischen Untersuchungen zur Expression von BDNF wurde das
Neurotrophin in diversen Zellen unterschiedlicher tectaler Schichten in einem zeitlich differenten
Expressionsmuster nachgewiesen (Abbildungen 23-28). Außerdem waren in diversen
Altersstadien radial orientierte Fasern BDNF-positiv, welche zumeist mehrere tectale Schichten
überspannten.
Im ersten untersuchten Altersstadium (E 14) wurden vereinzelt BDNF-positive Neuronen in der
Schicht C (adulte Schicht 13) detektiert (Abbildung 23). Eine moderate auf vereinzelte Neuronen
beschränkte BDNF Immunmarkierung war darüber hinaus auch in Neuronen der Schichten A
und B (Adult: 15 und 14) sowie im Ventrikelepithel zu beobachten (Abbildung 23). Bei drei
Tieren zeigte sich das BDNF Signal im rostro-lateralen TO, bei einem weiteren Tier zum
Zeitpunkt E 14 in der gesamten ventro-dorsalen Ausdehnung des rostralen TO, wohingegen im
caudalen TO kein positives BDNF Signal beobachtet wurde. Zwei Tage später, zum Zeitpunkt
E 16, war eine intensive somatische Schicht C Markierung ventro-rostral sowie caudo-dorsal
(Abbildung 23) zu verzeichnen. Außerdem stellten sich in den Experimenten insbesondere im
caudalen TO Neuronenmarkierungen in den Schichten A und B dar, begleitet von BDNFpositiven, radial orientierten Fasern. Kennzeichnend für diese Fasern war ein Verlauf durch
nahezu alle tectalen Schichten, vom Ventrikelepithel bis zu den oberflächlichen Schichten. Sehr
vereinzelt synthetisierten Neuronen der mittleren Zellschichten BDNF (Abbildung 23).
Ergebnisse (Tectale Expression...)
78
Abbildung 23: E 14 - E 16
a) Im Altersstadium E 14 zeigten intensiv Schicht C Neuronen (C) sowie schwächer Neuronen
in den tiefen tectalen Schichten (Pfeile) BDNF Immunreaktivität.
b) Nach 16-tägiger Brutdauer (E 16) waren Neuronen der Schicht C (C) und der tiefen tectalen
Schichten (A-B) trk C markiert. Begleitet wurde die somatische Immunreaktivität von einer
Fasermarkierung, welche vom Ventrikelepithel bis zu den superficialen Schichten reichte
(Pfeile). Balken = 100µm.
Ergebnisse (Tectale Expression...)
79
Am Schlupftag (PH 0) dehnte sich die somatische Immunreaktivität gegen BDNF auf alle
vorhandenen tectalen Zellschichten aus (Abbildung 24). Dabei waren Neuronen der Schichten 15
bis 13 und der Schicht 10 in der gesamten ventro-dorsalen Ausdehnung BDNF markiert. Die
somatischen BDNF Signale der Schichten 9 und 8 waren hingegen nicht uniform in der ventrodorsal Ausdehnung, sondern vielmehr in breiten Kolumnen lokalisierbar. BDNF-positive radial
orientierte Fasern ohne zuzuordnendes Perikarion waren unabhängig von den beschriebenen
somatischen Markierungen im gesamten TO zu identifizieren (Abbildung 24).
Abbildung 24: PH 0
Die Immunreaktivität gegen BDNF war somatisch in nahezu allen tectalen Schichten im
Altersstadium PH 0 zu erkennen. Die Neuronen der Schichten 15 bis 10 waren in der gesamten
dorso-ventralen Ausdehnung gleichermaßen BDNF-positiv, hingegen zeigten sich in den höheren
Schichten kolumnäre Markierungen (Pfeile). Balken = 100µm.
In den folgenden Untersuchungsstadien PH 1, PH 2 und PH 4 (Abbildungen 25-26) glichen die
somatischen Immunmarkierungen denen von PH 0 (Abbildung 24). Über das gesamte TO zeigten
Neuronen aller entwickelten und sich entwickelnden tectalen Schichten somatische
Immunreaktivität. Während auch hier Neuronen der Schichten 15 bis 13 nahezu uniform in der
ventro-dorsal Ausdehnung BDNF-positiv waren, offenbarten sich in den mittleren und
superficialen
Schichten
breite
kolumnenartige
Lokalisationen
BDNF-synthetisierender
Ergebnisse (Tectale Expression...)
80
Nervenzellen. Radial orientierte und mit dem Antikörper markierte Fasern waren bei PH 1 im
gesamten TO (Abbildung 25), bei PH 2 und PH 4 hingegen deutlicher im caudo-ventralen TO zu
Abbildung 25: PH 1
Einen Tag nach dem Schlupf zeigten Neuronen aller tectalen Schichten BDNF Immunreaktivität.
Nervenzellen der Schichten 10-15 waren in der dorso-ventralen Ausdehnung gleichermaßen
BNDF positiv waren, während Neuronen in den höheren Zellschichten, in Kolumnen angeordnet,
BDNF markiert waren (massive Pfeile). Außerdem mit dem Antikörper gegen BDNF markiert
waren radiale Fasern ohne zuzuordnendes somatisches Signal (dünne Pfeile). Balken = 100µm.
erkennen (Abbildungen 26).
Ergebnisse (Tectale Expression...)
81
Abbildung 26: PH 2 – PH 4
In den Altersstadien PH 2 (a) und PH 4 (b) waren Neuronen in allen etablierten tectalen
Schichten BDNF-positiv. Balken = 100µm.
Ergebnisse (Tectale Expression...)
82
Sieben und vierzehn Tage nach dem Schlupf waren somatische BDNF Markierungen in den tiefen
und mittleren Schichten und verstreut in den superficialen Schichten zu beobachten (Abbildung
27). Radial orientierte, BDNF markierte Fasern waren in diesen Altersstadien nahezu
ausschließlich auf das ventrale TO begrenzt (Abbildung 27), wobei von vier PH 14 Tieren eines
Abbildung 27: PH 7 – PH 14
In den Altersstadien PH 7 (a) und PH 14 (b) waren Neuronen der Schicht 13 intensiv mit dem
Antikörper gegen BDNF markiert. Darüber hinaus zeigten Neuronen der tiefen und der mittleren
und höheren tectalen Schichten vereinzelt BDNF Immunreaktivität. Radial orientierte BDNFpositive Fasern wurden im ventralen Tectum opticum erkannt (Pfeile). Balken = 100µm.
Ergebnisse (Tectale Expression...)
83
keine Fasermarkierungen zeigte.
In der adulten Taube hingegen waren BDNF-positive Neuronen in allen tectalen Schichten zu
beobachten (Abbildung 28), wobei weder rostro-caudale noch ventro-dorsale Unterschiede
Abbildung 28: Adult
Im adulten Tectum opticum exprimierten Neuronen in allen tectalen
Schichten das Neurotrophin BDNF. Balken = 100µm.
offensichtlich wurden.
Ergebnisse (Tectale Expression...)
84
3.3.2 Tectale NT-3 Expression
Verschiedene tectale Laminae zeigten in den Untersuchungen eine deutliche NT-3
Immunreaktivität, bei welcher sowohl Neuronen der tiefen als auch der mittleren und superficialen
Schichten somatisch markiert waren (Abbildungen 29-31). Außerdem wurden in bestimmten
Altersstadien mehrere Schichten überspannende, radial orientierte Fasern dargestellt
(Abbildungen 30-34).
Kennzeichnend für die Expression von NT-3 war ein differentielles Muster, beginnend mit E14
bis zur adulten Taube, wobei NT-3-positive Neuronen vereinzelt bereits zum Zeitpunkt E 14 in
den tiefen und mittleren Schichten des TO zu erkennen waren (Abbildung 29).
Abbildung 29: E 14
Im Altersstadium E 14 waren schwach NT-3-positive Neuronen in den tiefen tectalen Schichten
(Pfeile) zu erkennen. Balken = 100µm.
Die Intensität und Häufigkeit der NT-3 Expression nahm ab E 16 deutlich zu (Abbildung 30). Es
waren Neuronen der tiefen Schichten, insbesondere der Schicht C (adulte Schicht 13) sowie
vereinzelte Zellen der mittleren Schichten NT-3 markiert, wobei die Neuronen der Schicht C
anhand ihrer proximal markierten Fortsätze gut zu erkennen waren (Abbildung 30). Außerdem
traten ab E 16 radial orientierte Fasern auf, die vom Ventrikelepithel bis zur tectalen Oberfläche
reichten (Abbildung 30).
Ergebnisse (Tectale Expression...)
85
Abbildung 30: E 16
Im Altersstadium E 16 waren Neuronen der tiefen tectalen Schichten (kleine Pfeile) und vereinzelt
auch in den mittleren Schichten (kleine Pfeile) NT-3 immunreaktiv, wobei die proximalen
Dendriten der multipolaren Neuronen der Schicht C markiert waren. Außerdem NT-3-positiv
waren radiale Fasern, die alle tectalen Schichten vom Ventrikelepithel bis zur pialen Oberfläche
des Tectum opticum überspannten (dünne Pfeile). Balken: 100µm.
Ab dem Schlupftag (PH 0) wurden neben der Markierung von Neuronen der tiefen tectalen
Schichten auch NT-3-positive Neuronen in den mittleren und superficialen Schichten beobachtet
(Abbildung 31). Außer diesen somatischen Markierung waren auch die proximalen Fortsätze der
Neuronen immunreaktiv, wodurch insbesondere die multipolaren Neuronen der Schicht 13
identifizierbar waren (Abbildung 31).
Ein und zwei Tage nach dem Schlupf (PH 1 und PH 2) war die Immunreaktivität gegen NT-3 auf
alle tectalen Schichten ausgedehnt, wobei die Schicht 13 im gesamten ventro-dorsalen Verlauf
NT-3-positiv war, das Immunsignal in den mittleren und höheren Zellschichten hingegen auf breite
Kolumnen begrenzt wurde (Abbildung31-32). Im Altersstadium PH 2 waren in den superficialen
Schichten deutliche NT-3-positive Radialzellen, Horizontalzellen und tangential migrierende
Neuronen und Radialzellen der mittleren Zellschichten zu erkennen (Abbildung 32). In einer
subjektiven Betrachtung der Signalintensität schien ein Maximum am PH 2 erreicht zu sein. NT-3
Ergebnisse (Tectale Expression...)
86
markierte radiale Fasern ohne zuzuordnendes Perikarion waren im Zeitraum PH 0 bis PH 4 im
gesamten TO erkennbar (Abbildungen 31-33).
Abbildung 31: PH0 – PH 1
In den Altersstadien PH 0 (a) und PH 1 (b) wurden NT-3-positive Neuronen in den tiefen (T),
mittleren (M) und superficialen Schichten (S) des Tectum opticums erkannt. Dabei waren die
somatischen Markierungen von Neuronen der mittleren und superficialen Schichten auf breite
Kolumnen begrenzt (Pfeile), während die tiefen tectalen Schichten in der dorso-ventralen
Ausdehnung keine Markierungsunterschiede aufwiesen. Begleitet war das somatische NT-3
Signal von radial verlaufenden Fasermarkierungen vom Ventrikelepithel bis zur pialen Oberfläche.
Balken: 100µm.
Ergebnisse (Tectale Expression...)
87
Ergebnisse (Tectale Expression...)
88
Abbildung 32: PH2
a) Zwei Tage nach dem Schlupf (PH 2) waren NT-3-positive Neuronen in den tiefen (T),
mittleren (M) und superficialen Schichten (S) des Tectum opticum zu erkennen. Die
somatischen Markierungen in den mittleren und superficialen Schichten waren auf Kolumnen
begrenzt (Pfeile). Radiale Fasern ohne somatisches Signal waren auch in diesem
Altersstadium NT-3-positiv (Pfeile). Balken: 100 µm.
b) In einer Ausschnittsvergrößerung der mittleren und superficialen Schichten sind NT-3-positive
Radialzellen (R) und Horizontalzellen (H) und/oder tangential migrierende Neuronen zu
identifizieren. Balken: 30µm.
Ergebnisse (Tectale Expression...)
89
Am vierten Tag nach dem Schlupf (PH 4) waren in der Schicht 13 viele, in den mittleren und
superficialen Schichten vereinzelte Neuronen NT-3-positiv, welche in Kolumnen angeordnet
Abbildung 33: PH 4
Vier Tage nach dem Schlupf (PH 4) waren Neuronen der tiefen tectalen Schichten in der
gesamten dorso-ventralen Ausdehnung NT-3-positiv (T). In den mittleren (M) und superficialen
Schichten (S) war das Immunsignal auf breite Kolumnen begrenzt, wobei Radialzellen und
Horizontalzellen und/oder tangential migrierende Neuronen deutliche Immunreaktivität zeigten
(Pfeile). Radiale NT-3-positive Fasern waren noch schwach zu erkennen. Balken: 100µm.
waren (Abbildung 33).
In den folgenden Altersstadien nahm die Immunreaktivität gegen das Neurotrophin NT-3 stetig
ab. Sieben Tage nach dem Schlupf waren NT-3-positive Neuronen in den tiefen tectalen
Schichten lokalisiert, wohingegen keine NT-3 markierten Neuronen in den mittleren und
superficialen Schichten detektiert werden konnten (Abbildung 34). Bei vierzehn Tage alten Tieren
reduzierte sich das Immunsignal weiter. Es waren nur sehr schwach NT-3 markierte Neuronen in
der Schicht 13 zu erkennen (Abbildung 34), bevor schließlich bei Adulten keine NT-3
exprimierenden tectalen Neuronen sichtbar waren (Abbildung 34).
Ergebnisse (Tectale Expression...)
90
Abbildung 34: PH 7 / PH 14 / Adult
In den Altersstadien PH 7 (a), PH 14 (b) und Adult (c) nahm die Immunreaktivität gegen NT-3
im Tectum opticum stetig ab. Bei sieben Tage alten Tauben (a) waren die multipolaren Neuronen
der Schicht 13 und vereinzelt Neuronen der Schichten 14 und 15 NT-3-positiv. Vierzehn Tage
alte Tiere (b) zeigten noch eine schwache NT-3 Markierung von Schicht 13 Neuronen, während
bei Adulten (c) keine NT-3-positiven Neuronen erkannt werden konnten. Balken: 100µm.
Ergebnisse (Tectale Expression...)
91
3.3.3 Tectale trk B Expression
Die Expression von trk B wurde in Neuronen unterschiedlicher tectaler Schichten mittels der
Immunhistochemie nachgewiesen (Abbildungen 35-39). Hierbei zeigten sich deutliche somatische
Markierungen von Neuronen der Schichten 13-15, der mittleren Zellschichten (8-12) und der
superficialen Schichten 2-7. Außer dem somatischen trk B Signal kennzeichnete insbesondere
Neuronen der superficialen Schichten eine intensive Markierung der proximalen Fortsätze, wobei
es sich vermutlich um Horizontalzellen und tangential migrierende Neuronen handelte (Abbildung
36). Ebenfalls trk B-positiv waren die proximalen Fortsätze der multipolaren Neuronen der
Schicht 13 und der Radialzellen der mittleren Schichten (Abbildung 37). Neben den eindeutig
einem Neuronentypen zuzuordnenden Signalen wurden im TO der Taube trk B-positive und
radial orientierte Fasern gefunden (Abbildungen 35-40). Insgesamt war die trk B Synthese auf die
Entwicklungsphase des TO begrenzt, wobei sich für die verschiedenen Altersstadien spezifische
Expressionsmuster des Rezeptors in den diversen Zellschichten ergaben.
Beginnend mit E 14 zeigte sich im rostralen TO eine schwache somatische Immunreaktivität in der
Schicht C (adulte Schicht 13), vereinzelt in den tiefen Schichten A und B, und darüber hinaus in
den mittleren Schichten D bis H (adulte Schichten 12-8) (Abbildung 35). Im caudalen TO war
das somatische Signal sehr schwach, aber grundsätzlich mit dem im rostralen TO identisch.
Zwei Tage später im Altersstadium E 16 zeigten sich insbesondere im rostralen TO intensive trk B
Immunmarkierungen der multipolaren Schicht C Neuronen und vereinzelt von Neuronen der tiefen
und mittleren Zellschichten. Im caudalen TO war das Signal vornehmlich auf die dorsalen
Schichten A, B und C begrenzt (Abbildung 35). In diesem Altersstadium wurde außerdem eine
intensive Markierung radial orientierter Fasern beobachtet (Abbildung 35).
Ergebnisse (Tectale Expression...)
92
Abbildung 35: E 14 – E16
a) Im Altersstadium E 14 wurden erste schwach trk B-positive Neuronen (Pfeile) in den tiefen
und mittleren Schichten des rostralen Tectum opticum detektiert.
b) Die Immunreaktivität gegen den trk B Rezeptor war im Altersstadium E 16 intensiv in den
multipolaren Neuronen der Schicht C (C). Vereinzelt waren auch Neuronen der Schichten A
und B und der mittleren Schichten trk B markiert (Pfeile). Außerdem zeigten sich radial
orientierte, vom Ventrikelepithel bis zur pialen Oberfläche verlaufende, trk B-positive Fasern
(Pfeile). Balken: 100µm.
Am Schlupftag (PH 0) war im TO der Taube eine intensive trk B Markierung zu erkennen,
welche sich über die tiefen und mittleren bis zu den superficialen Schichten erstreckte (Abbildung
Ergebnisse (Tectale Expression...)
93
36). Die Neuronen der Schichten 13, 14 und 15 synthetisierten den trk B Rezeptor nahezu
gleichmäßig über den gesamten ventro-dorsalen wie auch rostro-caudalen Bereich der
mesencephalen Struktur (Abbildung 36). Hingegen zeigte sich eine intensive auf Kolumnen
begrenzte Markierung von Neuronen der mittleren und superficialen Schichten, vornehmlich im
ventralen und lateralen TO (Abbildung 36). Zum Teil konnten in diesen Schichten Radialzellen
und Horizontalzellen und/oder tangential migrierende Neuronen identifiziert werden (Abbildung
36). Auch am PH 0 zeigten radial orientierte Fasern ohne zuzuordnendes somatisches Signal eine
deutliche trk B Immunreaktivität, welche sich zumeist im ventro-lateralen TO in Kolumnen
ausdrückte (Abbildung 36).
Ergebnisse (Tectale Expression...)
94
Ein bis vier Tage nach dem Schlupf (PH 1, PH 2, und PH 4) (Abbildungen 37-38) glich das Bild
der trk B Expression dem von PH 0 (Abbildung 36), wobei die Markierungen der Radialzellen
und Horizontalzellen der mittleren und superficialen Zellschichten über die gesamte ventro-dorsale
Achse des TO eine kolumnäre Verteilung zeigten. Radial orientierte Fasern wurden in diesem
Zeitraum ebenfalls über das gesamte TO mit dem Antikörper gegen trk B dargestellt
(Abbildungen 37-38).
Abbildung 37: PH 1
Einen Tag nach dem Schlupf wurde eine intensive trk B Immunreaktivität in allen tectalen
Schichten nachgewiesen. Die Neuronen der Schicht 13 waren in der dorso-ventralen Ausdehnung
uniform markiert, wogegen in den mittleren und superficialen Schichten kolumnäre Markierungen
sichtbar wurden (Pfeile). Desweiteren waren radiale Fasern im gesamten TO trk B-positiv.
Balken: 100µm.
Abbildung 36: PH 0
Am Schlupftag (PH 0) waren Neuronen der tiefen (T), mittleren (M) und superficialen Schichten
(S) trk B-positiv (a). Balken: 100µm. Auffallend waren die kolumnären Markierungen von
Radialzellen und Horizontalzellen und/oder tangential migrierende Neuronen (Pfeile) der mittleren
und superficialen Schichten (b). Radial verlaufende trk B-positive Fasern, welche vom
Ventrikelepithel bis zur pialen Oberfläche reichten, waren auch im Altersstadium PH 0 zu
erkennen. Balken: 30µm.
Ergebnisse (Tectale Expression...)
95
Abbildung 38: PH 2 – PH 4
In den Altersstadien PH 2 (a) und PH 4 (b) waren die Neuronen aller tectalen Schichten trk Bpositiv. Deutlich zu erkennen waren die in Kolumnen trk B markierten Radialzellen und
Horizontalzellen und/oder tangential migrierende Neuronen der mittleren und superficialen
Schichten. Auch radiale trk B-positive Fasern waren in diesen Altersstadien detektierbar (Pfeile).
Balken: 100µm.
Ergebnisse (Tectale Expression...)
96
Am Tag sieben nach dem Schlupf (PH 7) reduzierte sich das somatische trk B Signal vornehmlich
auf Neuronen der Schicht 13, vereinzelt waren aber auch Neuronen der mittleren und
superficialen Schichten trk B-positiv (Abbildung 39). In diesem Altersstadium waren trk B
markierte und radial orientierte Fasern nahezu ausschließlich im ventro-caudalen TO zu erkennen
Abbildung 39:PH 7
Im Tectum opticum sieben Tage alter Tauben waren Neuronen der Schicht 13 immunreaktiv
gegen den trk B Rezeptor. Vereinzelt waren darüber hinaus auch Nervenzellen der mittleren und
superficialen Schichten mit dem Antikörper markiert. Im ventro-caudalen Bereich dieser
mesencephalen Struktur waren zusätzlich radial orientierte trk B-positive Fasern lokalisierbar
(Pfeile). Balken: 100µm.
(Abbildung 39).
Vierzehn Tage nach dem Schlupf (PH 14) war die trk B Immunreaktivität im TO zumeist auf die
caudalen Bereiche dieser mesencephalen Struktur eingrenzbar. Neben tectalen Neuronen der
Schicht 13 waren auch vereinzelt Neuronen der mittleren und superficialen Schichten trk Bpositiv, welche als Radialzellen und Horizontalzellen und/oder tangential migrierende Neuronen
identifizieren wurden (Abbildung 40). Sehr wenige radial orientierte trk B-positive Fasern waren
im ventro-caudalen TO lokalisiert. In der adulten Taube waren keine trk B-positive Neuronen
oder Fasern zu beobachten (Abbildung 40).
Ergebnisse (Tectale Expression...)
97
Abbildung 40: PH 14 – Adult
a) In den immunhistochemischen Untersuchungen zur Expression des trk B Rezeptors wurden im
caudalen Tectum opticum somatische Markierungen von Neuronen der Schicht 13 erkannt,
zum Teil begleitet von kolumnären Markierungen von Nervenzellen in den mittleren und
superficialen Schichten (Pfeile). Sehr schwach trk B-positiv waren auch radial orientiert
Fasern im caudalen Tectum opticum.
b) In der adulten Taube wurde keine trk B Immunreaktivität im Tectum opticum erkannt.
Balken: 100µm.
Ergebnisse (Tectale Expression...)
98
3.3.4 Tectale trk C Expression
In den tiefen, mittleren und superficialen Schichten des TO der Taube wurden trk C
synthetisierende Neuronen beobachtet, wobei das Immunsignal zumeist auf das Perikarion der
Neuronen begrenzt war (Abbildungen 41-44). In einem Zeitfenster von E 16 bis PH 4 wurden
darüber hinaus radial orientierte Fasern beobachtet, welche zum Teil über mehrere Schichten vom
Ventrikelepithel bis zur tectalen Oberfläche verfolgt werden konnten (Abbildungen 41-43). Die
Häufigkeit und Intensität dieser Fasern war aber geringer als in den immunhistochemischen
Untersuchungen zu BDNF, NT-3 und trk B (Punkt 3.3.1-3.3.3).
Während der tectalen Entwicklung zeigten sich Unterschiede im Expressionsmuster von trk C. Im
Altersstadium E 14 wurde eine schwache Immunmarkierung der tiefen tectalen Schichten,
insbesondere der Schicht C (adulte Schicht 13), erfaßt (Abbildung 41). Sehr vereinzelt waren zu
diesem Zeitpunkt auch Neuronen der mittleren Schichten trk C-positiv. Zwei Tage später, im
Embryonalstadium E 16, waren deutlich trk C synthetisierende Nervenzellen in der Schicht C
auszumachen (Abbildung 41). Auffallend intensiv markiert waren die Somata und proximalen
Dendriten von Schicht C Neuronen im dorsalen TO. Zudem waren verstreut einzelne Neuronen
der mittleren Zellschichten trk C-positiv. Bezüglich der trk C Expression zwischen E 14 und E 16
war ein subjektiv stärkeres Signal im linken versus dem rechten TO bemerkenswert.
Ab dem Schlupftag PH 0 dehnte sich das trk C Immunsignal von den tiefen über die mittleren bis
zu den superficialen Schichten aus (Abbildung 42). Während trk C synthetisierende Neuronen der
Schicht C über die gesamte ventro-dorsale Ausdehnung gleichermaßen detektierbar waren,
zeigten trk C exprimierende Neuronen der mittleren und superficialen Schichten ein kolumnäres
Auftreten (Abbildung 42). Einen Tag nach dem Schlupf (PH 1) glich das Expressionsmuster des
high-affinity Neurotrophin Rezeptors in der tectalen Expression dem beschriebenen Muster von
PH 0 (Abbildung 42). Außer den somatischen Markierungen wurden radial orientierte, zumeist
schwach trk C-positive Fasern in den Altersstadien E 16 bis PH 1 in schmalen Kolumnen
detektiert (Abbildungen 41-42).
Ergebnisse (Tectale Expression...)
99
Abbildung 41: E 14 - E 16
In den embryonalen Untersuchungsstadien E 14 (a) und E 16 (b) wurde eine moderate
Immunreaktivität gegen den trk C Rezeptor in der Schicht C (C) und vereinzelt in den mittleren
Zellschichten erkannt (kleine Pfeile).
Begleitet waren diese somatischen trk C Signale von einer trk C-positiven Markierung radialer
Fasern (dünne Pfeile).
Balken: 100µm.
Ergebnisse (Tectale Expression...)
100
Ergebnisse (Tectale Expression...)
101
Abbildung 42: PH 0 – PH 1
Ab dem Schlupftag PH 0 (a) waren Neuronen in den tiefen (T), mittleren (M) und superficialen
Schichten (S) trk C-positiv. Auch einen Tag nach dem Schlupf (b) zeigten die Neuronen dasselbe
trk C Expressionsmuster wie am Schlupftag. In beiden Altersstadien waren Neuronen der Schicht
13 in der gesamten dorso-ventralen Ausdehnung uniform, in den mittleren und superficialen
Schichten hingegen kolumnär markiert. Schwach trk C-positive radiale Fasern wurden im
gesamten Tectum opticum erkannt (Pfeile).
Balken: 100µm.
Ergebnisse (Tectale Expression...)
102
Zwei und vier Tage nach dem Schlupf (PH 2; PH 4) waren Neuronen der superficialen Schichten
noch vereinzelt kolumnär trk C-positiv, während die multipolaren Neuronen der Schicht 13 wie
auch Neuronen in den Schichten 14 und 15 deutliche trk C Immunreaktivität zeigten (Abbildung
43). Vereinzelte radiale trk C-positive Fasern waren zumeist im caudalen Tectum opticum zur
erkennen (Abbildung 43).
Ergebnisse (Tectale Expression...)
103
In den folgenden Altersstadien PH 7 bis PH 14 waren vornehmlich Neuronen der tiefen tectalen
Schichten trk C markiert (Abbildungen 44-45). Auffallend waren die intensiv trk C-positiven
Neuronen der Schicht 13, begleitet von einer Vielzahl von kleinen Neuronen in den tiefen
Schichten 14 bis 15 (Abbildung 44). Vereinzelt waren auch in diesen Altersstadien im caudalen
Tectum opticum Neuronen der superficialen und mittleren Zellschichten mit dem Antikörper gegen
trk C markiert (Abbildung 45). In den adulten Tauben waren immunhistochemisch keine trk Cpositiven Neuronen im Tectum opticum zu beobachten, mit Ausnahme einer sehr schwachen
Hintergrundfärbung (Abbildung 45).
Abbildung 44: PH 7
Sieben Tage nach dem Schlupf waren multipolare Neuronen der Schicht 13 (13) und kleine
Neuronen in den tiefen Schichten 14 und 15 trk C-positiv. Vereinzelt waren im caudalen Tectum
opticum Neuronen der mittleren und superficialen Schichten trk C markiert (Pfeile). Balken:
100µm.
Abbildung 43: PH 2 - PH 4
In den Altersstadien PH 2 (a) und PH 4 (b) waren die Neuronen der Schicht 13 intensiv trk Cpositiv (13), während Immunmarkierungen mit dem Antikörper gegen den trk C Rezeptor in den
mittleren (M) und superficialen Schichten (S) kolumnär auf distinkte Bereiche begrenzt waren
(Pfeile). Im caudalen Tectum opticum wurden vereinzelte trk C-positive Fasern detektiert (Pfeile).
Balken: 100µm.
Ergebnisse (Tectale Expression...)
104
Ergebnisse (Tectale Expression...)
105
Abbildung 45 PH 14 – Adult
a) Im Tectum opticum vierzehn Tage alter Tauben wurden trk C-positive Neuronen in den
Schichten 13 bis 15 und caudal vereinzelt in den mittleren (M) und superficialen Schichten (S)
erkannt. Auch in diesem Altersstadium waren es in den tiefen tectalen Schichten multipolare
Neuronen der Schicht 13 und kleine Neuronen der Schichten 14 bis 15, welche den trk C
Rezeptor exprimierten (Pfeile).
b) Im adulten Tectum opticum wurde eine sehr schwache trk C Markierung erkannt, die als
Hintergrund gewertet wurde. Balken: 100µm.
Ergebnisse (Tectale Expression...)
106
In der Tabelle 8 werden die tectalen Expressionsmuster der Neurotrophine BDNF und NT-3
sowie der korrespondierenden high-affinity Rezeptoren trk B und trk C zusammengefaßt. In den
vorgestellten Untersuchungen zeigten sich erste immun-positive Signale der Proteine im
Altersstadium E 14, woraufhin in den weiteren untersuchten Altersstadien generell ein qualitativer
und quantitativer Anstieg der Expression dieser Proteine zu beobachten war. Unterschiedlich
zeigte sich aber das Expressionsmuster in adulten Tauben. Während das Neurotrophin BDNF
auch in adulten Tieren in allen tectalen Schichten prominent exprimiert wurde, so konnte eine
NT-3 Synthese nur bis PH 7, beziehungsweise sehr schwach bis PH 14 in den tiefen tectalen
Schichten erkannt werden. Die beiden Neurotrophin-Rezeptoren trk B und trk C wurden in der
embryonalen und juvenilen Taube gleichermaßen deutlich exprimiert, im adulten Tier hingegen
konnten diese Proteine nicht nachgewiesen werden. Radial zur tectalen Oberfläche orientierte
Fasern, welche intensive Immunmarkierungen gegen BDNF, NT-3, trk B und trk C zeigten,
wurden insbesondere in den juvenilen Altersstadien prominent dargestellt.
Tabelle 8: Zeitlicher Verlauf der tectalen Expression von BDNF, NT-3, trk B und trk C
S = superficiale Schichten (2-7), M = mittlere Schichten (8-12), T = tiefe Schichten (13-15)
Markierungsintensität: + = moderat; ++ = intensiv; +++ = sehr intensiv; - = nicht zu erkennen.
Die grauen Schraffierungen zeigen mehrere Schichten überspannende, immun-positive radiale
Fasern in den entsprechenden Altersstadien an.
E 14
E 16
S
BDNF
PH 4
PH 7
PH 14 Adult
++
++
++
++
++
++
++
-
+++
+++
+++
+++
+++
+++
++
T
+
++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
++
+
++
++
+
-
-
-
M
-
+
++
++
+++
+
-
-
-
T
(+)
++
+++
+++
+++
++
+
(+)
-
++
++
++
+
(+)
(+)
-
M
(+)
+
++
++
++
++
(+)
(+)
-
T
+
++
+++
+++
+++
++
++
+
-
++
++
+
+
+
(+)
-
++
++
++
+
+
(+)
-
S
trk C
PH 2
-
S
trk B
PH 1
M
S
NT-3
PH 0
M
-
+
Ergebnisse (Tectale Expression...)
T
+
++
107
+++
+++
+++
++
++
+
-
Auch im TO der Taube deuten die Ergebnisse zur Expression von BDNF, NT-3, trk B und trk C
auf neurotrophe Mechnismen innerhalb dieser mesencephalen Struktur hin. Gegenüber der Retina
waren die Antigene aber bereits im embryonalen TO zu detektieren, daß heißt vor der mit dem
Schlupftag einsetzenden massiven Lichtstimulation. Wenngleich auch die embryonale Taube durch
die Eischale dringendes Licht perzipieren kann, so deutet das in der vorliegenden Arbeit erkannte
Expressionsmuster auf intra-tectale neurotrophe Mechanismen hin, die möglicherweise in der
embryonalen Taube nicht mittelbar durch den epigenetischen Faktor Licht gesteuert sind,
während in der juvenilen Tauben solche Prozesse denkbar sind. Zwar innervieren erste retinale
Fasern ab E 14 das TO der Taube (Manns & Güntürkün, 1997), aber die Expression der
Neurotrophine und Neurotrophin-Rezeptoren beginnt zunächst in den nur bedingt retinorezipienten tiefen und mittleren tectalen Schichten während der embryonalen Altersstadien. Erst
mit dem Schlupftag, und einer damit einsetzenden massiven Lichtstimulation, dehnt sich die
Expression von BDNF, NT-3, trk B und trk C auf die superficialen, retino-rezipienten Schichten
aus. Es ist daher wahrscheinlich, daß ab dem Schlupftag der Tiere der epigenetische Faktor Licht
über neurotrophe Wechselwirkungen die retino-tectalen Verschaltungen beeinflußt.
Wenngleich die Bedeutung retino-tectaler neurotropher Wechselwirkungen mit dem Schlupftag
zunimmt, so sind auch in den juvenilen Altersstadien intra-tectale neurotrophe Mechnismen zur
Etablierung der tectalen Morphologie anzunehmen. Die Untersuchungen zeigten neben den
eindeutig zu charakterisierenden somatischen Markierungen auch Neurotrophin und
Neurotrophin-Rezeptor positive Fasern im TO sich entwickelnder Tauben. Eine genaue
Charakterisierung dieser radial zu tectalen Oberfläche verlaufenden, mehrere Zellschichten
überspannenden Fasern war zunächst nicht möglich. Möglicherweise handelte es sich um immunpositive Dendriten tectaler Neuronen oder in das TO einziehenden retinale Ganglienzellaxone. Die
wahrscheinlichste Hypothese war aber, daß es sich bei den dargestellten Fasern, die in allen
tectalen Schichten vorkamen, um Radialglia handelte.
Radialglia fungieren als Leitstrukturen der Zellmigration im sich entwickelnden Nervengewebe
(Rakic, 1971). Bei der Taube dauert die Etablierung der tectalen Schichtung bis nach dem
Schlupf an (Manns & Güntürkün, 1997). Möglicherweise deuten die mehrere Zellschichten
überspannenden Neurotrophin / Neurotrophin-Rezeptor positiven radialen Fasern auf eine
Beteiligung dieser Proteine bei der Zellmigration hin.
Ergebnisse (Tectale Expression...)
108
Ausgehend von dieser Arbeitshypothese wurden in Kolokalisationsuntersuchungen von BDNF,
NT-3, trk B und trk C mit dem für Radialglia spezifischen Intermediärfilament Vimentin, mögliche
neurotrophe Wirkungsketten zwischen Radialglia und migrierenden Neuronen erfaßt (siehe Punkt
3.5), die eine Bedeutung von Neurotrophinen als intra-tectale Signale während der Entwicklung in
der juvenilen Taube zeigten.
Die fehlende Expression von trk B und trk C Rezeptoren im TO adulter Tauben zeigt darüber
hinaus, daß die in der adulten Retina exprimierten Neurotrophine BDNF und NT-3 vermutlich
nicht als anterograde Signale im retino-tectalen System eingesetzt werden. Im retino-tectalen
System adulter Tauben kann lediglich BDNF als retrograder Signalstoff vom TO ausgeschüttet
werden, um über den von retinalen Ganglienzellen exprimierten trk B Rezeptor zu wirken. Eine
genauere Identifizierung BDNF-vermittelter trophischer Signalflüsse im retino-tectalen System
adulter Tauben gelang durch ultrastrukturellen Untersuchungen (siehe Punkt 3.4).
Ergebnisse (Ultrastrukturelle Untersuchungen...)
3.4
106
Ultrastrukturelle Untersuchungen im Tectum opticum adulter Tauben
In der adulten Taube scheinen intra-tectale neurotrophe Mechnismen eine untergeordnete Rolle zu
spielen, da lediglich BDNF exprimiert wird, nicht aber NT-3 und die korrespondierenden
Rezeptoren trk B und trk C. BDNF könnte in der adulten Taube als möglicher retrograder
Signalstoff für retinale Ganglienzellen fungieren, welche den trk B Rezeptor massiv synthetisieren.
Ebenso denkbar ist der anterograde Signalfluß von BDNF im tectofugalen System zum Nucleus
rotundus oder weiteren Zielgebieten tectaler Efferenzen. Um diese möglichen trophischen
Signalwege in adulten Tauben genauer zu erfassen, wurde in ultrastrukturellen Untersuchungen die
Morphologie dieser mesencephalen Struktur näher charakterisiert und anschließend
immunhistochemisch die genaue Lokalisation des Neurotrophins BDNF untersucht.
Morphologisch waren die superficialen Schichten 2 bis 7 durch die Somata der Horizontalzellen
und Radialzellen sowie parallel und radial zur tectalen Oberfläche verlaufende Dendriten
gekennzeichnet. In diesen Schichten waren eine Vielzahl an Synapsen, vermutlich zumeist von
einziehenden Axonen retinaler Ganglienzellen, zu erkennen, die auf den Dendriten der
superficialen Schichten terminierten. In den mittleren Zellschichten waren zahlreiche radiale
Dendriten und Somata identifizierbar, die keine synaptische Verbindungen aufwiesen. In der tiefen
tectalen Schicht 13 prominent dargestellt wurden die großen mutlipolaren Neuronen, auf deren
Dendriten eine Vielzahl von axo-somatischen Synapsen terminierten.
3.4.1
Rekonstruktion der tectalen Schichtung im Semidünnschnitt
In der fotografischen Rekonstruktion eines Semidünnschnittes der tectalen Morphologie waren
einzelne Charakteristika der Zellschichtung zu erkennen (Abbildung 46-47). Weiß erscheinende
Löcher mit runder, länglicher oder ovaler Form stellten Blutgefäße im TO dar. Neuronale
Strukturen in der lichtdichten Schicht 1 waren die myelinisierten Axone retinaler Ganglienzellen,
welche in das Tectum opticum einzogen. Die folgenden Schichten 2 bis 7 waren durch zahlreiche
Somata sowie dünne parallel und radial zur tectalen Oberfläche verlaufenden Dendriten
gekennzeichnet, wobei die Zelldichte in den Schichten 2, 3, 4 und 6 hoch, in den Schichten 5 und
7 gering war. Die mittleren Zellschichten 8-12 zeigten eine höhere Zelldichte als die superficialen
Schichten, mit einem Maximum in den Schichten 8 und 10. Neben den Somata der Nervenzellen
Ergebnisse (Ultrastrukturelle Untersuchungen...)
107
waren zahlreiche zumeist radial orientierte Dendriten auszumachen. Vereinzelt waren außerdem
Axone an der lichtdichten Myelinisierung zu identifizieren.
Auf Grund ihrer Größe prominent dargestellt waren die Neuronen der Schicht 13, deren
proximale Dendriten ebenfalls im Semidünnschnitt zu erkennen waren. Ihre Somata waren zirka
dreimal größer als die der mittleren und superficialen tectalen Schichten. Auch in dieser tiefen
tectalen Zellschicht waren zahlreiche Dendriten und myelinisierte Axone zu erkennen. In der
folgenden Schicht 14 dominierten myelinisierte Axone das Bild.
Ergebnisse (Ultrastrukturelle Untersuchungen...)
108
Abbildung 46: Semidünnschnitt der superficialen und mittleren Zellschichten
Im Semidünnschnitt des dorsalen Tectum opticum adulter Tauben waren die einzelnen
Zellschichten gegeneinander abgrenzbar (Schichten 1 bis 12). Neben den weiß erscheinenden
Anschnitten von Blutgefäßen waren die myelinisierten Axone der Schicht 1 gut zu erkennen. Die
Dichte an Nervenzellen war hoch in den superficialen Schichten 2,3,4 und 6 und ebenso in den
mittleren Zellschichten 9 bis 11. Zum Teil waren in den superficialen Schichten parallel und radial
orientierte Dendriten, in den mittleren Schichten radial orientierte Dendriten zu erkennen (kleine
Pfeile). In den mittleren Schichten zeigten sich außerdem vereinzelt myeliniserte Axone (dünne
Pfeile). Balken: 100µm.
Ergebnisse (Ultrastrukturelle Untersuchungen...)
109
Abbildung 47: Semidünnschnitt der tiefen tectalen Zellschichten
In der tiefen tectalen Schicht 13 waren die multipolaren Neuronen anhand ihrer Somagröße und
angeschnitten Dendriten (Pfeile) gut zu identifizieren. In dieser tectalen Schicht waren außerdem
zahlreiche myelinisierte Axone auszumachen. Die folgende Schicht 14 zeigte vereinzelt
Nervenzellen, zum Großteil aber myelinisierte Axone.
Balken: 100µm.
Ergebnisse (Ultrastrukturelle Untersuchungen...)
110
3.4.2 Ultrastrukturelle Lokalisation von BDNF
Im adulten TO der Tauben wurden ultrastrukturelle Untersuchungen zur Lokalisation des
Neurotrophins BDNF mit Hilfe eines Gold-markierten sekundären Antikörpers gegen Ratten IgG
durchgeführt.
Hierbei
zeigte
sich
eine
schwächere
Immunreaktivität
als
in
den
lichtmikroskopischen Untersuchungen, wobei die Goldmarkierungen zumeist auf die äußeren
Bereiche der Ultradünnschnitte begrenzt blieben. Dennoch erschien das Immunsignal eindeutig
und konsistent in verschiedenen Präparaten. Die ultrastrukturellen Darstellungen der tectalen
Morphologie beziehen sich auf Kontrolltiere, die eine wesentlich bessere Morphologieerhaltung
zeigten, als die Tauben nach der immunhistochemischen Prozedur, bei welcher die Zellmembran
mit Hilfe von Triton X 100 permeabilisiert wurde.
Ultrastrukturell waren in der tectalen Schicht 1 zahlreiche myelinisierte Axone zu erkennen
(Abbildung 48). Bei hoher elektronenmikroskopischer Auflösung konnten einzelne Myelinlamellen
sowie cytoskelettale Mikrotubuli und Neurofilamente identifiziert werden, nicht aber ein BDNFpositives Signal. In den superficialen Schichten 3 bis 5 waren myelinisierte Axone, Neuronen und
radial und parallel zur tectalen Oberfläche verlaufende Dendriten zu erkennen, wobei letztere bei
hoher elektronenmikroskopischer Vergrößerung zahlreiche Synapsen aufwiesen (Abbildung 49).
Immunhistochemisch wurde in diesen tectalen Schichten das Neurotrophin ausschließlich
postsynaptisch detektiert (Abbildung 50). Auf der präsynaptischen Seite stellten sich zahlreiche
Vesikel ohne zu erkennende BDNF Immunreaktivität dar (Abbildung 50). Die folgende
superficiale Schicht 6 war durch parallel nebeneinander angeordnete Somata gekennzeichnet, an
denen radial orientierte Dendriten ohne synaptische Kontakte vorbeiliefen (Abbildung 51).
Immunhistochemisch wurde in den Dendriten der superficialen und mittleren Zellschichten das
Neurotrophin BDNF in enger Lokalisation zu Elementen des Cytoskeletts, vermutlich
Mikrotubuli, nachgewiesen (Abbildung 51). Die tectalen Schicht 13 Neuronen zeigten sich
elektronenmikroskopisch etwa dreimal größer als die Neuronen der superficialen Schichten
(Abbildung 52). Sehr nah am Soma waren myelinisierte Axone sowie prominente Dendriten der
Schicht 13 Neuronen mit zahlreiche Synapsen zu erkennen, die deutliche präsynaptische Vesikel
erkennen ließen (Abbildung 52). In den für die Elektronenmikroskopie immunhistochemisch
aufbereiteten Präparaten konnte das Neurotrophin in dieser Schicht an den gut ausgeprägten
Synapsen nicht nachgewiesen werden (Abbildung 53).
Ergebnisse (Ultrastrukturelle Untersuchungen...)
111
Abbildung 48: Ultrastruktur der tectalen Schicht 1
Die Abbildung (a) zeigt zahlreiche in der tectalen Schicht 1 einziehende retinale Axone im
Querschnitt sowie einen längs geschnitten Dendriten einer tectalen Nervenzelle (Vergrößerung:
7260-fach). Balken: 1000nm.
In der Ausschnittsvergrößerung wurden die Myelinlamellen dieser Axone (weiße Pfeile) und das
Cytoskelett sichtbar, wobei Mikrotubuli und Neurofilamente dargestellt wurden (dünne Pfeile)
(Vergrößerung: 231000-fach). In dieser Schicht konnte ultrastrukturell kein BDNF-positives
Signal detektiert werden. Balken: 45nm.
Ergebnisse (Ultrastrukturelle Untersuchungen...)
112
Abbildung 49: Ultrastruktur der superficialen tectalen Schichten
a) In den superficialen tectalen Schichten 3 bis 5 waren Neuronen (Pfeil) sowie radiale (R) und
parallel (P) zur tectalen Oberfläche verlaufende Dendriten zu erkennen, die synaptische
Kontakte (Pfeile) zeigten (Vergrößerung: 7269-fach). Balken: 1000nm.
b) Ausschnittsvergrößerung eines radialen Dendriten mit synaptischem Kontakt (Vergrößerung:
202500-fach). Balken: 50nm.
c) Ausschnittsvergrößerung eines parallelen Dendriten mit synaptischem Kontakt (Vergrößerung:
243000-fach). Balken: 40nm.
Ergebnisse (Ultrastrukturelle Untersuchungen...)
113
Abbildung 50: Postsynaptische Lokalisation von BDNF
In der Schicht 5 wurde BDNF an axo-dendritischen Kontaktstellen detektiert. Die 10nm großen
Goldpartikel (G: Pfeile) zeigten eine postsynaptische ultrastrukturelle Lokalisation des
Neurotrophins. Präsynaptisch wurden Vesikel der Synapse erkannt (V: Pfeile), jedoch ohne ein
positives BDNF Signal. Elektronendicht stellte sich der synaptische Spalt dar (S) (Vergrößerung:
243000-fach). Balken: 40nm.
Ergebnisse (Ultrastrukturelle Untersuchungen...)
114
Abbildung 51: Ultrastruktur der Schicht 6
a) In der tectalen Schicht 6 sind zahlreiche Somata (S) dicht nebeneinander lokalisiert, an denen
radial zur tectalen Oberfläche orientierte Dendriten vorbeiziehen (R) (Vergrößerung: 7260fach). Balken: 1000nm.
b) In den immunhistochemischen Untersuchungen zeigte sich, daß das Neurotrophin BDNF in
den Dendriten der superficialen und mittleren tectalen Schichten lokalisiert war (Peile), und
zwar dicht an den cytoskelettalen Mikrotubuli.
(Vergrößerung: 164000-fach). Balken: 60nm.
Ergebnisse (Ultrastrukturelle Untersuchungen...)
115
Abbildung 52: Ultrastruktur der tectalen Schicht 13
a) In der tectalen Schicht 13 waren große Neuronen (N) lokalisiert, die von vielen Dendriten
(D) und Axonen (A) umgeben waren (Vergrößerung: 7260-fach).
Balken: 1000nm.
b) Auf den Dendriten in der Schicht 13 terminierten zahlreiche Axone mit Synapsen (S: Pfeil),
wobei präsynaptisch Vesikel zu erkennen waren (Vergrößerung: 231000-fach). Balken:
40nm.
Ergebnisse (Ultrastrukturelle Untersuchungen...)
116
Abbildung 53: Axo-dendritische Synapse in der tectalen Schicht 13
In der Schicht 13 lokalisierte axo-dendritische Syapsen zeigten präsynaptisch Vesikel (V: Pfeil),
die vermutlich kein BDNF enthielten. Ebenso wurde auf der postsynaptischen dendritischen Seite
(D) kein BDNF-positives Signal detektiert. (Vergrößerung: 172200-fach). Balken: 60nm.
Ergebnisse (Ultrastrukturelle Untersuchungen...)
117
Die ultrastrukturellen Untersuchungen deuten auf die komplexe synaptische Organisation des
Tectum opticum der Taube hin, mit zahlreichen Synapsen in den retino-rezipienten superficialen
Schichten und ebenfalls prominenten axo-somatischen synaptischen Kontakten auf den
multipolaren Neuronen der Schicht 13. Mit Hilfe der Immunogold-Methode wurde das
Neurotrophin BDNF postsynaptisch in den superficialen tectalen Schichten nachgewiesen ebenso
wie in den radial orientierten Dendriten der mittleren tectalen Schichten. Die axo-somatischen
Synapsen auf den multipolaren Schicht 13 Neuronen hingegen zeigten keine BDNF
Markierungen.
Diese Ergebnisse zeigen, daß in adulten Tauben BDNF sehr wahrscheinlich als retrograder
Botenstoff des mesencephalen TO für retinale Ganglienzellen fungiert, welche den
korrespondierenden trk B Rezeptor exprimieren. Möglicherweise ist BDNF an der ständigen
Feinanpassung der retino-tectalen Verknüpfungen beteiligt, wobei zum Beispiel die synaptische
Effizienz in den retino-rezipienten Schichten des TO reguliert wird (Ebadi et al., 1997). Eine
Feinanpassung der synaptischen Morphologie ist dabei vermutlich nicht auf die in den
superficialen Schichten gelegenen Neuronen begrenzt, sondern erfolgt darüber hinaus auch an den
synaptischen Verbindungen zu Neuronen der mittleren und tiefen tectalen Schichten. Auch diese
erhalten direkten visuellen Eingang über ihre bis in die superficialen Schichten reichenden radialen
Dendriten (Hardy et al., 1985). Da auch Neuronen der mittleren und tiefen tectalen Schichten
BDNF exprimieren (siehe Punkt 3.2), und das Neurotrophin anhand der hier gewonnen
Ergebnisse entlang der Dendriten in die retino-rezipienten Schichten transportiert wird, ist auch für
diese Neuronen der retrograde Signalfluß von BDNF zu den retinalen Ganglienzellen
anzunehmen. Inwieweit BDNF auch anterograd zu den Zielgebieten tectaler Projektionen
transportiert wird, kann basierend auf den gegenwärtigen Daten nicht abschließend geklärt
werden, wenngleich auf Grund der fehlenden Lokalisation von BDNF in den Axonen tectaler
Neuronen eine anterograde Signalfortleitung nicht wahrscheinlich ist.
Insgesamt liefern die ultrastrukturellen Untersuchungen zur Lokalisation von BDNF deutliche
Hinweise für den retrograden trophischen Signalfluß vom TO zur Retina, während intratectale
BDNF vermittelte Wechselwirkungen in der adulten Taube vermutlich nicht vorliegen.
Ergebnisse (Kolokalisationsuntersuchungen...)
118
3.4 Kolokalisationsuntersuchungen im Tectum opticum
Die Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen zeigten zahlreiche immun-positive,
radial orientierten Fasern im TO der juvenilen Taube (siehe Punkt 3.2). Eine genaue Zuordnung
dieser Fasern als retinale Ganglienzellaxone, Dendriten tectaler Neuronen oder tectaler Radialglia
war zunächst nicht möglich, gleichwohl die Morphologie dieser mehrere Zellschichten
überspannenden Fasern eine Beschreibung dieser als Radialglia wahrscheinlich machte.
Die Frage nach der Herkunft dieser Fasern war für die Interpretation intra-tectaler trophischer
Mechanismen jedoch von zentraler Bedeutung. Würde es sich um Radialglia handeln, so wäre das
ein erstmaliger Beweis für neurotrophe Signalwege zwischen migrierenden Neuronen und
Radialglia. Damit einhergehend wären weitere wichtige Bausteine der Etablierung der tectalen
Morphologie erfaßt, deren morphologische Asymmetrien während der Entwicklungsphase des
TO angelegt werden.
Zur näheren Charakterisierung der radial orientierten Neurotrophin und trk-Rezeptor positiven
Fasern im TO wurden Fluoreszenz-Doppelmarkierungen mit Vimentin in den Altersstadien PH 0,
PH 2, PH 4, PH 14 und in adulten Tieren durchgeführt. Die Altersstadien wurden so gewählt,
daß eine Aussage über die Identität der beschriebenen immun-positiven radialen Fasern möglich
wurde.
Vimentin ist ein Intermediärfilament im Cytoskelett von Neuronen, welches spezifisch in
Radialglia-Zellen exprimiert wird. In der gegenwärtigen Untersuchung diente der Antikörper
gegen Vimentin zur spezifischen Markierung von Radialglia-Zellen im Tectum opticum der Taube
während der Entwicklung der tectalen Schichtung. Hierbei war die Vimentin Immunreaktivität
deutlich sichtbar in den Altersstadien PH 0 bis PH 14, wobei radial zur tectalen Oberfläche
verlaufenden Fasern mit dem Antikörper dargestellt wurden (Abbildung 54-60). Die
Immunreaktivitäten gegen die einzelnen Neurotrophine und trk-Rezeptoren waren mit den
beschriebenen Ergebnissen unter Punkt 3.2 identisch, in der Intensität der Markierung jedoch
etwas schwächer. In den superficialen und mittleren tectalen Schichten waren zumeist Fasern, in
den tiefen tectalen Schichtend darüber hinaus auch viele Somata von Nervenzellen
immunhistochemisch markiert. Bei den somatischen Signalen handelte sich um große multipolare
Neuronen der Schicht 13 und kleinere migrierende Neuronen, welche insbesondere in den
Schichten 14 und 15 sichtbar wurden. Bei den radialen Fasern handelte sich um die Fortsätze der
Ergebnisse (Kolokalisationsuntersuchungen...)
119
Radialglia Zellen, welche in der adulten Taube nicht vorhanden waren. Die zum Teil tangential
verlaufenden Fasern in den superficialen Schichten waren vermutlich Markierungen der Fortsätze
von Horizontalzellen oder auch von tangential migrierenden Neuronen.
Die Darstellungsweisen der Immunmarkierungen mittels Fluoreszenz-Doppelbelichtungen oder
der konfokalen Lasermikroskopie richtete sich zum einen nach der Signalintensität, und zum
anderen nach der Deutlichkeit der Darstellung. Grundsätzlich war das Fluoreszenzsignal im
Altersstadium PH 14 schwächer, so daß insbesondere mit Hilfe des konfokalen Lasermikroskops
ein klares Immunsignal erkannt wurde. In den Altersstadien PH 0 bis PH 4 war hingegen das
Fluoreszenzsignal in den Vibratomschnitten so intensiv, daß in den FluoreszenzDoppelbelichtungen zum Teil keine deutlich abgrenzbaren Strukturen zu erkennen waren, mit Hilfe
der
konfokalen
Lasermikroskopie
jedoch
auch
hier
scharfe
Darstellungen
der
Immunmarkierungen gelangen.
3.5.1 BDNF – Vimentin
In den Kolokalisationsuntersuchungen der beiden Proteine BDNF und Vimentin war das
Fluoreszenzsignal eindeutig und zum Teil überlagert. Die BDNF positiven Fasermarkierungen
reichten in den untersuchten Altersstadien PH 0 bis PH 14 vom Ventrikelepithel bis zu den
superficialen Schichten, wobei in den tiefen tectalen Schichten BDNF markierte Somata von
multipolaren Schicht 13 Neuronen und kleinere migrierende Neuronen in den Schichten 14 und
15 sichtbar wurden (Abbildung 54).
In den Fluoreszenz-Doppelbelichtungen von BDNF und Vimentin wurde eine Koexpression der
beiden Antigene deutlich, bei welcher mit beiden Antikörpern markierte Fasern alle tectalen
Zellschichten überspannten (Abbildung 54). Demnach synthetisierten die Vimentin markierten
Radialgliazellen auch das Neurotrophin BDNF.
Insbesondere mit Hilfe der konfokalen Lasermikroskopie wurde die enge Beziehung der kleinen,
migrierenden BDNF positiven Neuronen in den tiefen tectalen Schichten zu den Radialglia-Zellen
deutlich (Abbildung 54f), während in den superficialen Schichten in den untersuchten
Altersstadien zumeist radiale Fasern markiert waren (Abbildung 54e).
Ergebnisse (Kolokalisationsuntersuchungen...)
120
Abbildung 54: Kolokalisation von BDNF und Vimentin
Im Altersstadium PH 2 wurde in Fluoreszenz-Doppelbelichtungen eine Koexpression von BDNF
und Vimentin in radialen Fasern der superficialen tectalen Schichten erkannt (a=BDNF;
b=Vimentin). Ebenso exprimierten radiale Fasern in den tiefen tectalen Schichten BDNF und
Vimentin (c=BDNF, d=Vimentin). Außerdem wurden kleine, BDNF-positive Neuronen in den
tiefen Schichten erkannt, die in enger räumlicher Beziehung zu den Vimentin und BDNF-positiven
radialen Fasern lagen (Pfeile).
Im Altersstadium PH 14 wurde mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie das Muster einer
Koexpression der beiden Proteine in radialen Fasern der superficialen Schichten bestätigt (e),
wobei in den tiefen tectalen Schichten kleine BDNF synthetisierende Neuronen in enger
Beziehung zu den Vimentin und BDNF-positiven radialen Fasern erkannt wurden (f).
Farbkodierung: grün = BDNF; rot = Vimentin; gelb = Koexpression.
Ergebnisse (Kolokalisationsuntersuchungen...)
121
3.5.2 NT-3 – Vimentin
Die Fluoreszenzsignale von NT-3 und Vimentin waren in den in den Altersstadien PH 0 bis
PH 14 zum Teil übereinander gelagert, wodurch eine Koexpression der beiden Antigene
dargestellt wurde (Abbildungen 55-56). Das somatische NT-3 Signal entsprach dem unter Punkt
3.2 vorgestellten Muster, wobei auch in den fluoreszenzmikroskopischen Bildern tangential zur
tectalen Oberfläche verlaufende Fasern in den superficialen tectalen Schichten detektierbar waren
(Abbildung 55). Darüber hinaus waren die großen multipolaren Neuronen der Schicht 13 auf
Grund ihrer NT-3 positiven multipolaren Dendritenstruktur zu identifizieren (Abbildung 56).
Neben diesen somatischen Markierungen wurden radial orientierte NT-3-positive Fasern
offenbar, welche vom Ventrikelepithel bis in die superficialen Schichten reichten (Abbildungen
55-56). In Fluoreszenz-Doppelbelichtungen in den Altersstadien PH 2 und PH 4 zeigte sich, daß
diese NT-3 markierten Fasern auch das Intermediärfilament Vimentin exprimierten (Abbildungen
55-56). Besonders im Altersstadium PH 0 wurde in den konfokalen lasermikroskopischen
Darstellungen die Dichte der Vimentin und NT-3 synthetisierenden Radialglia in den tiefen tectalen
Schichten deutlich (Abbildung 56a,b).
Ergebnisse (Kolokalisationsuntersuchungen...)
122
Abbildung 55: Kolokalisation von NT-3 und Vimentin
Im Altersstadium PH 2 wurden in den superficialen und mittleren tectalen Schichten
Koexpressionen von NT-3 (a) und Vimentin (b) in radialen Fasern erkannt. In den superficialen
Schichten waren außerdem vereinzelte parallel zur tectalen Oberfläche verlaufende Fortsätze der
Horizontalzellen und / oder tangential migrierender Neuronen NT-3-positiv (Pfeile).
Ergebnisse (Kolokalisationsuntersuchungen...)
123
Abbildung 56: Kolokalisation von NT-3 und Vimentin
Mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie wurde im Altersstadium PH 0 die Koexpression von
NT-3 und Vimentin in radialen Fasern der mittleren und superficialen Schichten (a) und ebenso in
den tiefen tectalen Schichten (b) bestätigt. Insbesondere in den tiefen Schichten wurde ein dichtes
radiales Fasernetz erkannt. Farbkodierung: grün = BDNF; rot = Vimentin; gelb = Koexpression.
In den Fluroeszenzdoppelbelichtungen im Altersstadium PH 4 waren in den tiefen tectalen
Schichten außer den NT-3 (c) und Vimentin (d) positiven radialen Fasern auch multipolare
Schicht 13 Neuronen NT-3 markiert (c: Pfeile).
Ergebnisse (Kolokalisationsuntersuchungen...)
124
3.5.3 Trk B – Vimentin
Der trk B Rezeptor und das in Radialgliazellen vorkommende Intermediärfilament Vimentin
wurden im sich entwickelnden TO in den Altersstadien PH 0 bis PH 14 der Taube zum Teil
koexprimiert (Abbildungen 57-58). In den fluoreszenzmikroskopischen Darstellungen wurden
Fasermarkierungen mit dem Antikörper gegen trk B erkannt, begleitet von intensiven somatischen
trk B Markierungen der multipolaren Neuronen der Schicht 13 (Abbildungen 57-58). Die trk B
Fasermarkierungen in den juvenilen Altersstadien reichten vom Ventrikelepithel bis zu den
superficialen Schichten des TO, unabhängig von der lichtmikroskopischen Darstellung einer
Fluoreszenz-Doppelbelichtung in den Altersstadien PH 0 und PH 2 (Abbildungen 57, 58a,b)
oder der Betrachtung mit Hilfe des konfokalen Lasermikroskops im Altersstadium PH 14
(Abbildung 58c).
Abbildung 57: Kolokalisation von trk B und Vimentin
Im Altersstadium PH 2 wurde in den mittleren und superficialen tectalen Schichten in den
Fluoreszenz-Doppelbelichtungen eine Koexpression von trk B (a) und Vimentin (b) in radialen
Fasern erkannt. Außerdem trk B-positiv waren die multipolaren Neuronen der Schicht 13 (a:
Pfeile).
Ergebnisse (Kolokalisationsuntersuchungen...)
125
Abbildung 58: Kolokalisation von trk B und Vimentin
In den tiefen tectalen Schichten wurden am Schlupftag (PH 0) Doppelmarkierung von trk B (a)
und Vimentin (b) in radialen Fasern erkannt. Somatisch trk B markiert waren in diesem
Altersstadium die multipolaren Neuronen der Schicht 13 (Pfeile).
(c) Mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie wurde das dichte Netz radial orientierten Fasern in den
tiefen tectalen Schichten offensichtlich, die sowohl den trk B Rezeptor (grün) als auch das
Intermediärfilament Vimentin (rot) exprimierten.
Ergebnisse (Kolokalisationsuntersuchungen...)
126
3.5.4 Trk C – Vimentin
In den immunhistochemischen Untersuchungen zur Koexpression des trk C Rezeptors mit
Vimentin war teilweise eine Überlagerung der Fluoreszenzsignale zu erkennen. Vornehmlich radial
orientierte Fasern zeigten eine Kolokalisation des high-affinity Rezeptors mit Vimentin
(Abbildungen 59-60). Diese Fasern reichten im Altersstadium PH 2 vom Ventrikelepithel bis zu
den superficialen Schichten. Außerdem markierte der Antikörper gegen trk C somatisch
Neuronen in verschiedenen tectalen Schichten (Abbildungen 59-60). Zwei Tage nach dem
Schlupf waren neben den multipolaren Neuronen der Schicht 13 viele kleine Neuronen in den
Schichten 14 und 15 sowie vereinzelte in den mittleren und superficialen Schichten trk C-positiv.
Insbesondere die kleinen den trk C Rezeptor exprimierenden Neuronen zeigten eine nahe
Lokalisation zu den radialen, trk C und Vimentin markierten Fasern (Abbildung 60).
Abbildung 59: Kolokalisation von trk C und Vimentin
Zwei Tage nach dem Schlupf waren in den mittleren und superficialen tectalen Schichten in den
Fluoreszenz-Doppelbelichtungen Kolokalisationen von trk C (a) mit Vimentin (b) in radialen
Fasern sichtbar. Vereinzelt waren außerdem in diesen tectalen Laminae Neuronen somatisch trk
C markiert (a: Pfeile).
Ergebnisse (Kolokalisationsuntersuchungen...)
127
Abbildung 60: Kolokalisation von trk C und Vimentin
Radiale Fasern der tiefen tectalen Schichten zeigten zwei Tage nach dem Schlupftag (PH 2)
Doppelmarkierung von trk C (a) und Vimentin (b). In diesem tectalen Bereich somatisch trk C
markiert waren außerdem die multipolaren Neuronen der Schicht 13 und eine Vielzahl kleiner
Neuronen ebenso wie das Ventrikelepithel (Pfeile).
(c,d) Mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie wurde die enge räumliche Beziehung zwischen den
kleinen trk C-positiven Neuronen (grün) und den Vimentin synthetisierenden radialen Fasern (rot)
sichtbar.
Ergebnisse (Kolokalisationsuntersuchungen...)
128
Die Ergebnisse der Kolokalisationsuntersuchungen von Vimentin mit den Neurotrophinen BDNF
und NT-3 sowie mit den beiden high-affinity Rezeptoren trk B und trk C im Tectum opticum der
Taube sind in der Tabelle 9 zusammengefaßt. Demnach exprimierten radiale, Vimentin positive
Fasern auch die Proteine BDNF, NT-3, trk B und trk C in den Altersstadien PH 0 bis PH 14.
Kennzeichnender Weise zeigten kleine migrierende Neuronen auch BDNF und trk C positive
Signale.
Tabelle 9: Koexpression von BDNF, NT-3, trk B und trk B mit Vimentin
Radiale
Vimentin
positive Fasern
Migrierende
Neuronen
BDNF
NT-3
Trk B
Trk C
+
+
+
+
+
-
-
+
Diese Untersuchungen zeigen, daß Radialglia sowohl die Neurotrophine BDNF und NT-3 als
auch die Neurotrophin-Rezeptoren trk B und trk C exprimieren, wodurch neurotrophe
Mechanismen während der Etablierung der tectalen Morphologie sehr wahrscheinlich sind. Bei
Hühnchen wird die Zielfindung tectaler Neuronen durch Radialglia gestützt (Gray & Sanes,
1991). Bislang nicht geklärt sind hierbei die Wechselwirkungen zwischen migrierenden Neuronen
und der Radialglia. In einer Arbeit von Yuasa und Mitarbeitern (1996) wurde in diesem
Zusammenhang über die Rezeptor vermittelte Aufnahme von Wachstumsfaktoren zur Steuerung
der Zellmigration entlang der Radialglia spekuliert.
Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Kolokalisationsstudien sind ein erster Hinweis
darauf, daß von Radialgliazellen exprimierte Neurotrophine als Substrat für die migrierenden
Neuronen dienen könnten. Zum Beispiel könnte von den Radialglia exprimiertes NT-3 über den
trk C Rezeptor von den migrierenden Neuronen aufgenommen werden, die ihrerseits wiederum
mit den Radialglia über BDNF wechselwirken. Radialglia exprimieren die korrespondieren
Rezeptoren trk B und trk C, wodurch eine Neurotrophin gestützte Festigung und Etablierung der
Radialglia erfolgen könnte. Desweiteren sind die Expressionsdaten aber auch ein Hinweis auf
mögliche autocrine, BDNF vermittelte Wechselwirkungen der Radialglia selbst, wobei BDNF
zum Beispiel die Morphologie der das Neurotrophin synthetisierenden Zelle beeinflußt.
Diskussion
129
4 Diskussion
In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression der beiden Neurotrophine BDNF und NT-3
sowie ihrer korrespondierenden high-affinity Rezeptoren trk B und trk C in der Retina und dem
Tectum opticum (TO) während der Entwicklung des retino-tectalen Systems der Taube
Columba livia untersucht. Abhängig vom Alter der Tiere zeigt sich eine deutliche Expression
dieser Neurotrophine und Neurotrophin Rezeptoren, wobei das Expressionsmuster zum Teil
zeitlich mit Entwicklungsvorgängen in diesem Teil des visuellen Systems korrelierte. In der Retina
war die Expression beider Neurotrophine und der trk Rezeptoren ab dem Schlupftag zu
beobachten, und im TO waren BDNF, NT-3, trk B und trk C in diversen Schichten bereits ab
dem Embryonaltag E 14 zu detektieren.
Die zeitlichen Korrelationen zwischen der Expression von Neurotrophinen und Neurotrophin
Rezeptoren und den in diesen Altersstadien ablaufenden Entwicklungsvorgängen im visuellen
System lassen den Schluß zu, daß Neurotrophine an diesen Entwicklungsprozessen direkt
beteiligt sind. Hierbei fungieren BDNF und NT-3 vermutlich zum einen als intraretinale und
intratectale trophische Signale bei der Entwicklung dieser Strukturen, und zum anderen als
retrograde und anterograde trophische Signalstoffe bei der Etablierung der retino-tectalen
Konnektivitäten. Für das Neurotrophin BDNF sind darüber hinaus auch trophische Funktionen
im retino-tectalen System adulter Tauben wahrscheinlich.
In der anschließenden Diskussion werden zunächst intrinsische trophische Mechanismen von
BDNF und NT-3 in der Retina und dem TO der Taube diskutiert. Solche lokalen Wirkungen von
Neurotrophinen in den jeweiligen Geweben ihrer Synthese wurden bereits in der Retina
(de Araujo & Linden, 1993) und im TO gezeigt (Herzog et al., 1994). Insbesondere im TO
deuten in der vorliegenden Arbeit durchgeführte Kolokalisationsuntersuchungen der
Neurotrophine sowie der entsprechenden Rezeptoren mit dem für Radialglia spezifischen
Intermediärfilament Vimentin darauf hin, daß in dieser mesencephalen Struktur Neurotrophine
auch die Entstehung der tectalen Laminierung beeinflussen.
In den folgenden Diskussionspunkten werden anschließend mögliche neurotrophe Signalflüsse im
retino-tectalen System juveniler und adulter Tauben diskutiert. In adulten Tauben durchgeführte
Diskussion
130
elektronenmikroskopische Untersuchungen konnten dabei weitere Erkenntnisse über mögliche
BDNF vermittelte Signalwege in diesem System geben.
Basierend auf den Expressionsdaten der hier untersuchten Neurotrophine und Neurotrophin
Rezeptoren werden im Anschluß aktivitätsabhängige Prozesse der Neurotrophin Ausschüttung
und Expression erörtert, bevor intrazelluläre Signalkaskaden nach Neurotrophin-Bindung an den
trk Rezeptoren vorgestellt werden.
Wie in dem sich anschließenden Abschnitt dargelegt wird, werden möglicherweise über solche
Neurotrophin induzierten Signalkaskaden morphologische Asymmetrien im visuellen System der
Taube etabliert. Die in diesem Abschnitt aufgestellten Hypothesen zur Wirkung von
Neurotrophinen bei der Entstehung der Lateralisation im visuellen System der Taube könnten in
weiterführenden Experimenten, wie sie im Punkt „Ausblick“ vorgeschlagen werden, experimentell
überprüft werden.
Im abschließenden Diskussionspunkt werden diverse Einsatzmöglichkeiten von Neurotrophinen
bei der Therapie humaner neurodegenerativer Erkrankungen des Nervensystems darzulegen,
deren Erforschung gegenwärtig intensiv bearbeitet wird.
4.1
Trophische Mechanismen in der Retina
In der Taubenretina wurde eine zunächst schwache BDNF Expression vom Schlupftag an in den
retinalen Ganglienzellen, ab dem Tag zwei nach dem Schlupf zusätzlich in der inneren nukleären
Schicht, und in adulten Tauben auch in den Somata der Photorezeptoren erkannt. NT-3 wurde
hingegen bereits ab dem Schlupftag massiv in retinalen Ganglienzellen und einen Tag später auch
von Neuronen der inneren nukleären Schicht snythetisiert. Zwei Tage nach dem Schlupf schien ein
Maximum der NT-3 Expression erreicht zu sein, deutlich sichtbar an der massiven NT-3
Immunreaktivität in der retinalen Ganglienzellschicht und der inneren nukleären Schicht, in welcher
insbesondere die Bipolarzellen NT-3-positiv waren. In den folgenden Untersuchungsstadien nahm
die Expression des Neurotrophins ab, bis schließlich in Adulten nur noch ein schwaches NT-3
Signal in den retinalen Ganglienzellen und Amakrinzellen der inneren nukleären Schicht detektiert
wurde. Die vorgestellten Daten zeigen Übereinstimmungen mit den Expressionsmustern dieser
Neurotrophine in Ratten und Hühnchen. In der embryonalen Retina des Hühnchens wurde BDNF
mRNA in geringen Mengen in Photorezeptoren (Hallböök et al., 1996), in nicht eindeutig
identifizierten Neuronen der inneren nukleären Schicht (Pérez & Caminos, 1995; Hallböök et al.,
Diskussion
131
1996), und in retinalen Ganglienzellen beobachtet (Herzog et al., 1998). Auch in embryonalen
und adulten Rattenretinae wird BDNF in nicht eindeutig zu bestimmenden Neuronen der inneren
nukleären Schicht (Pérez & Caminos, 1995) und retinalen Ganglienzellen exprimiert (von
Bartheld, 1998).
Die Expression der entsprechenden high-affinity Rezeptoren trk B und trk C in der Taubenretina
konnte ab dem Schlupftag verfolgt werden. Dabei wurde der trk B Rezeptor in vereinzelten
retinalen Ganglienzellen und sehr schwach in der inneren nukleären Schicht ab dem Schlupftag
detektiert. In den folgenden Untersuchungsstadien bis vierzehn Tage nach dem Schlupf wurde ein
Expressionsanstieg von trk B deutlich, bei dem retinale Ganglienzellen und vermutlich
Amakrinzellen der inneren nukleären Schicht trk B-positiv waren, bevor sich in den Adulten die
Synthese von trk B auf die retinalen Ganglienzellen reduzierte. Der trk C Rezeptor zeigte ein
ähnliches Expressionsmuster, beginnend mit vereinzelt trk C markierten retinalen Ganglienzellen
und einzelnen Photorezeptorzellen am Schlupftag und einer darauf folgenden Steigerung der
Expression bis zur adulten Taube, mit deutlich trk C-positiven retinalen Ganglienzellen und
Neuronen der inneren nukleären Schicht. Bei den Letzteren handelte es sich wahrscheinlich um
Amakrinzellen und/oder displaced Ganglienzellen. Ein Vergleich mit den Expressionsdaten
anderer Studien zeigt auch hier Übereinstimmungen zwischen Säugern und Vögeln.
Photorezeptoren der Mäuse- und Hühnchenretina zeigten trk B und trk C Immunreaktivität
(Llamosas et al., 1997; Garner et al., 1996; von Bartheld, 1998). In der inneren nukleären
Schicht waren Bipolarzellen des Hühnchens trk C-positiv (Hallböök et al., 1996) sowie
Amakrinzellen trk B und trk C markiert (Garner et al., 1996; Hallböök et al., 1996). In Ratten
und Hühnchen exprimierten retinale Ganglienzellen sowohl trk B als auch trk C Rezeptoren
(Jelsma et al., 1993, Hallböök et a., 1996; von Bartheld et al., 1996).
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit als auch die Daten der Literatur zeigen, daß neben den
Projektionsneuronen der Retina, den retinalen Ganglienzellen, auch weitere retinale Zellen
Neurotrophine und Neurotrophin-Rezeptoren exprimieren. Eine mögliche Funktion der
Neurotrophine in diesen Neuronen sind intrinsische trophische Signalflüsse innerhalb der Retina
selbst. Bovolenta und Mitarbeiter (1996) demonstrierten, daß die Neutralisation von NT-3 durch
entsprechende Antikörper die Entwicklung der Retina massiv störte. Hierdurch wurde die Anzahl
retinaler Axone im optischen Trakt reduziert, ebenso wie die Ausdehnung der Zellschichten und
Diskussion
132
die dendritische Verzweigung retinaler Ganglienzellen in der inneren plexiformen Zellschicht.
Desweiteren wurde gezeigt, daß bereits ab dem fünften Embryonaltag NT-3 mRNA im
Pigmentepithel und Neuronen der Hühnchenretina exprimiert wird, um vermutlich als intrinsisches
Signal die Entwicklung und Differenzierung retinaler Zellen zu regulieren (Bovolenta et al., 1996).
Der korrespondierende trk C Rezeptor wurde im selben Altersstadium von retinalen Zellen
synthetisiert, und war ab dem Embryonaltag zwölf in allen retinalen Schichten detektierbar
(Hallböök et al., 1996).
Außerdem verhindert NT-3 zwischen den Embryonaltagen E 9 und E 11 den Zelltod von
Amakrinzellen und retinalen Ganglienzellen bei Hühnchen (de la Rosa et al., 1994). Ebenfalls
positive Effekte auf die Überlebensrate retinaler Zellen wurde durch in vitro-Experimente für das
Neurotrophin BDNF dokumentiert (Johnson et al., 1986; Rodríguez-Tébar et al., 1989; Thanos
et al., 1989), während in BDNF knock-out Mäusen in vivo kein signifikantes Zellsterben
retinaler Zellen beobachtet wurde (Jones et al., 1994). Vermutlich ist ein Zusammenspiel beider
Neurotrophine, BDNF und NT-3, für die retinale Entwicklung entscheidend, bei welchem NT-3
verschiedene Schritte der frühen retinalen Entwicklung steuert, und BDNF das Zellüberleben und
das Neuritenwachstums in späteren Entwicklungsstadien beeinflußt (von Bartheld, 1998).
Für das retinale Pigmentepithel in Xenopus laevis wurde aber auch eine sehr frühe kritische
Funktion von BDNF als autocriner trophischer Faktor erkannt, der möglicherweise die
Differenzierung der Neuroblasten reguliert (Liu et al., 1997). Weitere Aufgaben des
Pigmentepithels sind die Phagocytose verbrauchter äußerer Photorezeptorsegmente (Young &
Bok, 1969) und die Regeneration der Photopigmente (Bridges, 1976), Prozesse, bei denen die
Neurotrophine BDNF und NT-3 möglicherweise regulierend unterstützen (Bovolenta et al.,
1996; Hackett et al., 1998).
In der Taube spricht die Expression von trk C in retinalen Photorezeptorzellen für eine mögliche
neurotrophe Wechselwirkung mit dem Pigmentepithel, aber auch mit den NT-3 exprimierenden
Bipolarzellen der inneren nukleären Schicht. Eine positive Stimulation durch Neurotrophine,
speziell durch BDNF, wurde für das dendritische Wachstum der dopaminergen Amakrinzellen
der inneren nukleären Schicht bei Ratten drei Wochen nach der Geburt gezeigt (Cellerino et al.,
1998).
Zumindest ein Teil der Amakrinzellen der Taubenretina synthetisieren BDNF und steht in
synaptischem Kontakt mit Bipolarzellen und retinalen Ganglienzellen in der inneren plexiformen
Schicht. Die diffusen BDNF und trk B Markierungen der inneren plexiformen Schicht und die
Diskussion
133
somatischen trk B Expressionen von vermutlich Amakrinzellen und retinalen Ganglienzellen deuten
auf BDNF vermittelte, wechselseitige trophische Signalflüsse zwischen diesen Neuronen hin.
Ebenso wahrscheinlich sind auch NT-3 vermittelte intrinsische, wechselseitige trophische
Signalwege zwischen Bipolarzellen, Amakrinzellen und retinalen Ganglienzellen in der juvenilen
Taubenretina. Da die NT-3-positiven Signale vornehmlich in der juvenilen Retina erkannt wurden,
unterstützt NT-3 vermutlich die Etablierung der Dendritenmorphologie sowie synaptische
Kontakte zwischen den Neuronen, während BDNF wahrscheinlich auch in adulten Tauben
retinale Feinanpassungen regulierend beeinflußt.
Die in der gegenwärtigen Arbeit dargestellten Ergebnisse zur immunhistochemischen Detektion
der Neurotrophine BDNF und NT-3 sowie der korrespondierenden trk B und trk C Rezeptoren
in der Taubenretina zeigen generell Übereinstimmungen mit dem Daten aus anderen Spezies.
Auffällig ist jedoch die zeitlich abweichende Expression dieser Antigene im Vergleich mit
Hühnchen, in welchen bereits in der embryonalen Retina diese Neurotrophine und Neurotrophin
Rezeptoren detektiert wurden.
An dieser Stelle kann die Möglichkeit eines methodischen Fehlers zur immunhistochemischen
Darstellung der Neurotrophine im embryonalen retinalen Gewebe der Taube nicht ausgeschlossen
werden. Möglicherweise exprimieren auch Tauben diese Proteine in retinalen Nervenzellen,
wobei die Konzentration an BDNF, NT-3, trk B und trk C in der embryonalen Taubenretina
aber zu gering war, als das sie mit den hier angewendeten Darstellungsverfahren detektiert
werden konnte. Hierbei ist zu erwähnen, daß die Techniken der Immunhistochemie ebenso wie
der nicht eingesetzten in-situ Hybridisierung relativ wenig sensitiv bezüglich der Detektion nur sehr
schwach vorkommender trophischer Moleküle sind (Anderson et al., 1995; Ibánez, 1996).
Ebenso denkbar ist, daß BDNF und NT-3 vermittelte neurotrophe Mechanismen in der
Taubenretina im Vergleich zum Hühnchen erst zu späteren Entwicklungszeitpunkten notwendig
werden, und somit erst zu diesem Zeitpunkt detektierbar sind, da die gesamte retino-tectale
Entwicklung der nesthockenden Taube gegenüber dem nestflüchtenden Hühnchen deutlich
verzögert ist. Aufgrund der im folgenden Abschnitt diskutierten immunhistochemischen Detektion
von BDNF und NT-3 sowie der entsprechenden high-affinity Rezeptoren im embryonalen TO
derselben Tauben, von denen die Retinae stammen, und die somit gleiche Vorbedingungen
bezüglich der Präparation und Fixierung erfahren haben, erscheint die Möglichkeit eines
methodischen Fehlers gering.
Diskussion
134
Wie im folgenden Abschnitt diskutiert wird, sind die zeitlich mit Entwicklungsvorgängen
assoziierten Expressionsmuster der beiden Neurotrophine BDNF und NT-3 sowie der trk B und
trk C Rezeptoren ein Hinweis auf trophische Mechanismen innerhalb dieser mesencephalen
Struktur in embryonalen, juvenilen und adulten Tauben.
4.2
Trophische Mechnismen im Tectum opticum
Die immunhistochemischen Untersuchungen der Expression von BDNF im TO der Taube zeigten
zunächst eine schwache neuronale Immunreaktivität am Embryonaltag vierzehn (E 14) in den
tiefen und mittleren tectalen Schichten, die sich in den folgenden Altersstadien bis zu den adulten
Tieren prominent auf Neuronen der superficialen, mittleren und tiefen tectalen Schichten
ausdehnte. Die immunhistochemisch sichtbare Expression von NT-3 war hingegen auf die
Entwicklung des TO beziehungsweise des retino-tectalen Systems begrenzt. Ab E 14 waren
Neuronen in den tiefen tectalen Schichten NT-3-positiv. In den folgenden Altersstadien dehnte
sich die Immunreaktivität auf die mittleren und superficialen tectalen Schichten aus und erreichte
zwei bis vier Tage nach dem Schlupf eine maximale Intensität. In sieben und vierzehn Tage alten
Tieren hingegen reduzierte sich das NT-3 Signal auf die tiefen tectalen Schichten und verschwand
in adulten Tauben ganz.
Das Expressionsmuster von BDNF zeigte Übereinstimmungen mit dem anderer Spezies. In der
adulten Maus wurde BDNF mRNA in superioren Colliculus detektiert (Leibrock et al., 1989;
Hofer et al., 1990), wobei vor allem die superficialen Schichten dieser Struktur durch das massive
Vorkommen von BDNF mRNA gekennzeichnet waren (Weltmore et al., 1990; Gall et al.,
1992), übereinstimmend mit Hühnchen (Herzog & von Bartheld, 1998).
In Ratten stieg die BDNF mRNA Transkription im superioren Colliculus von der Geburt zum
adulten Tier stetig an (Friedman et al., 1991). Auch im Hühnchen wurde BDNF im sich
entwickelnden TO nachgewiesen (Herzog et al., 1994; Hallböök et al., 1996), mit einem
Maximum um den Embryonaltag vier (E 4) und E 11, um anschließend in adulten Hühnchen in der
Konzentration wieder abzusinken (Herzog et al., 1994). Ein ähnliches zeitliches BDNFExpressionsmuster wurde auch im TO von Fröschen erkannt (Cohen-Cory & Fraser, 1994).
Diskussion
135
Die gegenwärtigen Daten der NT-3 Expression im TO der Taube zeigen Übereinstimmungen mit
dem Vorkommen von NT-3 mRNA im superioren Colliculus von Ratten, mit abnehmender
Konzentration von der Geburt zum adulten Tier, während NT-3 mRNA im TO von Hühnchen
nicht detektiert wurde (von Bartheld et al., 1996).
Die Expression der high-affinity Rezeptoren trk B und trk C in der Taube erfolgte ab E 14
schwach in den tiefen tectalen Schichten, dehnte sich in den folgenden Altersstadien bis vier Tage
nach dem Schlupf auf die superficialen und mittleren tectalen Zellschichten aus und reduzierte sich
anschließend wieder auf die tiefen tectalen Schichten, bevor in den adulten Tieren keinerlei
Immunreaktivität gegen trk B und trk C nachgewiesen werden konnte. Im Vergleich mit anderen
Spezies wurde der trk B Rezeptor im superioren Colliculus von Ratten nachgewiesen (Cabelli et
al., 1996; Furukawa et al., 1998) und trk B mRNA im TO von Hühnchen (Escandón et al.,
1994; Garner et al., 1996). Ebenso wurde die mRNA sowie der trk C Rezeptor im superioren
Colliculus von Säugern (Merlio et al., 1992; Allendoerfer et al., 1994) und im TO von Hühnchen
detektiert (Escandón et al., 1994; von Bartheld et al., 1996).
Eine fehlende Detektion von trk B und trk C Rezeptoren in den adulten Tauben ist
möglicherweise durch eine Verschiebung des Verhältnisses der katalytisch aktiven trk Rezeptoren
zu den katalytisch inaktiven truncated-trk Rezeptoren während der tectalen Entwicklung erklärbar
- die mit dem eingesetzten Antikörper nicht detektiert werden können - wie dies für die Reifung
des superioren Colliculus der Säuger gezeigt wurde (Allendoerfer et al., 1994).
Bei der Betrachtung des zeitlichen Expressionsmuster von BDNF und NT-3 im TO der Taube,
beginnend mit E 14 bis zu den Adulten wird deutlich, daß beide Neurotrophine in den frühen
Phasen der tectalen Entwicklung exprimiert werden. Die Annahme, daß in diesen frühen
Altersstadien intrinsische tectale trophische Mechanismen vorkommen, bevor retinale Neuronen
das mesencephale Gebiet innervieren, wird durch die zeitgleiche trk B und trk C Rezeptor
Expression in dem Kerngebiet unterstützt. Für Hühnchen wurde die BDNF Expression im
Altersstadium E 4 gezeigt (Herzog et al., 1994), zwei Tage bevor die ersten retinalen Axone das
TO innervieren (Crossland et al., 1975). Da die Differenzierung der tectalen Neuronen des
Hühnchens zwischen E 3 und E 4 beginnt (Goldberg, 1974; Puelles & Bendala, 1978), könnte
BDNF die phänotypische Differenzierung sowie das Neuritenwachstum beeinflussen (Herzog et
al., 1994). Die Annahme intrinsischer Wirkungsmechanismen im TO wird durch die Expression
Diskussion
136
des trk B Rezeptors in tectalen Neuronen in diesen Altersstadien unterstützt (Biffo et al., 1994).
Intrinsische Wirkungen von BDNF bezüglich des Neuritenwachstums und der Differenzierung
sind für Spinalganglien gezeigt (Wright et al., 1992), ebenso wie für die phänotypische
Differenzierung von Neuralleistenzellen (Sieber-Blum, 1991).
Möglicherweise sind die ab E 14 im TO der Taube exprimierten Neurotrophine BDNF und
NT-3 intrinsische Signale zur Etablierung der tectalen Morphologie, wie zum Beispiel der
Dendritenreifung und der neuronalen Migration (Vergleich: 4.3 „Neuronale Migration tectaler
Neuronen“).
Vermutlich bleiben intrinsische trophische Wechselwirkungen aber nicht auf die embryonalen
Altersstadien begrenzt sondern regulieren auch in den juvenilen und adulten Tieren die tectale
Morphologie. Da aber in der juvenilen und adulten Taube zusätzlich retino-tectale
Wechselwirkungen anzunehmen sind (siehe Punkt 4.4 und 4.5), können intrinsische trophische
Signalwege in der Retina und dem TO in diesen Altersstadien in der vorliegenden Arbeit nicht
eindeutig charakterisiert werden.
Während der Entwicklung der tectalen Morphologie wurden radiale, Neurotrophin- und
Neurotrophin Rezeptor-positive Fasern detektiert, deren Zuordnung zu einem speziellen Zelltyp
basierend auf diesen Daten nicht möglich war. Da radiale Fasern in Adulten nicht detektiert
wurden, lag die Vermutung nahe, daß es sich um speziell für die Reifung des TO wichtige
Strukturen handelte. Die Morphologie dieser radialen Fasern, die mehrere Zellschichten
überspannten, führte zu der Hypothese, daß es sich um Radialglia handelte. Mit Hilfe von
Kolokalisationsuntersuchungen
zwischen
dem
Radialglia-spezifischen
Intermediärfilament
Vimentin und den Neurotrophinen und Neurotrophin-Rezeptoren wurden neurotrophe
Mechanismen während der embryonalen und juvenilen Etablierung der tectalen Zellschichtung
näher untersucht.
Diskussion
4.3
137
Neuronale Migration tectaler Neuronen
Die neuronale Migration postmitotischer Neuronen aus der Ventrikularzone zur letztendlichen
Position im entsprechenden Zielgebiet ist entscheidend für die Etablierung der neuronalen
Morphologie, der sinnvollen Bildung von Synapsen und der Funktionsaufnahme der einzelnen
Neuronentypen (Rakic, 1990). Ein nicht korrektes Auswandern der Nervenzellen bedingt
zahlreiche Defekte, mit der Konsequenz einer nicht oder nur teilweise erfüllbaren Funktion des
neuronalen Gewebes (Rakic, 1990; Reiner et al., 1995). Die neuronale Migration bildet somit die
Basis für das Entstehen neuronaler Systeme, deren zumeist komplexe Vernetzung
morphogenetische Mechanismen während der Wanderung von Neuronen in die entsprechenden
Zielgebiete erfordert.
Als Führungsleitern und Substrat für die neuronale Migration fungieren gemäß der von Rakic
(1971) postulierten „Radialglia-Hypothese“ spezifische Radialgliazellen. Neue postmitotische
Neuronen zeigen demnach eine bipolare Morphologie und kontaktieren die Fortsätze der
Radialglia, um entlang dieser aus der Ventrikularzone in ihr Zielgebiet auszuwandern (Meller &
Tetzlaff, 1975; Meller, 1979; Rakic, 1990). Die Perikarien der Radialglia liegen in der
Ventrikularzone und ihre Fortsätze reichen von der Ventrikeloberfläche bis zur pialen Oberfläche
(Rakic, 1971), wobei eine kolumnäre Anordnung der Radialglia zu erkennen ist (Meller &
Tetzlaff, 1975, 1976; Meller, 1979). Bestätigungen dieser Hypothese kommen durch
verschiedene in vivo-Untersuchungen im Cortex und Cerebellum und in vitro-Experimenten, in
denen dissoziierte Neuronen entlang von Radialglia-Fortsätzen wanderten (Hatten et al., 1986;
Hatten et al., 1990).
Zur Etablierung der neuronalen Morphologie wird neben der Radialglia-Hypothese auch die von
Morest entworfene Hypothese der „Perikaryon-Translokation“ von Neuronen im sich
entwickelnden Gewebe diskutiert (Morest, 1970a,b). Gemäß dieser Hypothese bilden neue
postmitotische Neuronen Fortsätze zur pialen und zur ventrikulären Oberfläche, und das Soma
dieser Zellen „wandert“ entlang dieser Fortsätze zur Endposition im Gewebe. Während der
Perikaryon-Translokation bleibt dabei ein Fortsatz der Nervenzelle mit der ventrikulären
Oberfläche des Neuroepithels in Verbindung. Nach Abschluß der Wanderung werden beide
Fortsätze wieder zurückgebildet. Retrograde Markierungen in sich entwickelnden neuronalen
Geweben bei Säugern (Dunlop, 1990) und Vögeln (Snow & Robson, 1994) sprechen für die
Perikaryon-Translokations-Hypothese, wenngleich in ultrastrukturellen Untersuchungen vom
Diskussion
138
inneren bis zum äußeren Neuroepithel reichende Fortsätze während der Entwicklung nicht gezeigt
werden konnten (Snow & Robson, 1995).
In der vorliegenden Arbeit wurden im TO der Taube Radialglia durch die immunhistochemische
Darstellung von Vimentin, einem spezifisch in Radialglia von Säugern und Vögeln vorkommenden
Intermediärfilament (Lemmon, 1985, Alvarez-Buylla et al., 1987), markiert. In den untersuchten
Altersstadien PH 0 bis PH 14 zeigten sich dabei deutliche Vimentin-positive radiale Fasern, die
vom Ventrikelepithel bis zu den superficialen Schichten verfolgt werden konnten, während in den
adulten Tauben Vimentin nicht detektiert wurde.
Bei Säugern werden Radialglia im Verlaufe der Entwicklung in Vimentin-negative Astrocyten
umgewandelt, die spezifisch das „glial fibrillary acidic protein“ (GFAP) synthetisieren (Bignami et
al., 1980). Bei Vögeln werden neben den reifen Astrocyten auch Vimentin-positive radiale Fasern
in Adulten, zum Beispiel im Hippocampus, detektiert (Alvarez-Buylla et al., 1987). Im TO von
Hühnchen wiederum findet ein bis drei Tage nach dem Schlupf die auch die für Säuger
charakteristische Transformation sämtlicher Vimentin-positiver Radialglia in GFAP-markierte
Astrocyten statt (Gray & Sanes, 1992; Kálmán et al., 1998). Das unterschiedliche Zeitmuster der
tectalen Vimentin Synthese zwischen Hühnchen und Taube erklärt sich durch die bei den
nestflüchtenden Hühnchen beim Schlupf abgeschlossene Entwicklung der Zellschichtung im TO
(LaVail & Cowan, 1971, McLoon, 1985), ein Prozeß, der bei den nesthockenden Tauben noch
für zwei bis drei Wochen nach dem Schlupf andauert (Manns & Güntürkün, 1997).
Gemeinsam für Hühnchen und Tauben ist aber, daß die Expression von Radialglia im TO auf die
Entwicklungsphasen der tectalen Schichtendifferenzierung begrenzt bleibt, und dieses zeitliche
Expressionsmuster eine Beteiligung von Radialglia an tectalen Entwicklungsprozessen in diesen
beiden Spezies sehr wahrscheinlich werden läßt.
In einem Überblick über Mechanismen der neuronalen Migration diskutieren Snow und Robson
(1995), daß möglicherweise sowohl die Perikaryon-Translokation als auch die Radialgliagestützte Zellmigration koexistente Formen des zielgerichteten Auswandern von Nervenzellen
darstellen. In der Hühnchen Retina wurde zum Beispiel die Translokation des Perikaryons zur
inneren Retina entlang der zwischen beiden retinalen Oberflächen aufgespannten Fortsätze gezeigt
(Snow & Robson, 1995). Auch im TO von Hühnchen treten erste postmitotische Neuronen ab
E 4 auf (LaVail & Cowan, 1971), deren Fortsätze sowohl die piale als auch die ventrikuläre
Oberfläche berühren. In den Altersstadien E 4 bis E 6, während des Entstehens der tiefen tectalen
Diskussion
139
Schichten, zeigen diese Nervenzellen eine Perikaryon-Translokation (Domesick & Morest,
1977a,b). Bei der weiteren tectalen Schichtendifferenzierung wurde hingegen die Radialgliagestützte Zellmigration beobachtet (Domesick & Morest, 1977a,b). In einer weiteren Arbeit
wurde im Hühnchen vereinzelt auch die Perikaryon-Translokation im TO in Altersstadien nach
E 6 beobachtet (Puelles & Bendale, 1978), während aber die Zielfindung tectaler Neuronen in
dieser Spezies überwiegend durch Radialglia gestützt ist (Puelles & Bendale, 1978). Wird die
enge Bindung zwischen migrierenden Neuronen und Radialglia im TO von Hühnchen verhindert,
zum Beispiel durch die Unterdrückung des an diesen Prozessen beteiligten Bindungsproteins
Integrin, so wird die Zellmigration verhindert (Galileo et al., 1992).
Zusammen bestätigen diese Daten und die in der gegenwärtigen Arbeit vorgestellten
Expressionsmuster von Radialglia während des Entstehens der tectalen Morphologie, mit an
diesen Radialglia eng assoziierten wandernden Neuronen, die Radialglia-Hypothese als einen
bedeutenden Mechanismus der Etablierung der tectalen Morphologie bei Tauben, wie es von
weiteren Arbeitsgruppen im Hühnchen demonstriert wurde (Galileo et al., 1992).
Untersuchungen zur Expression von Radialglia im Cortex bei Säugern (Levitt & Rakic, 1980) mit
enger Assoziation zu migrierenden Neuronen (Gadisseux et al., 1990) ebenso wie
Untersuchungen zu den im Kleinhirn auftretenden Bergmann-Glia (Rakic, 1971), deuten auch in
diesen Geweben auf Funktionen der Radialglia während der neuronalen Migration hin.
Wenngleich Radialglia die Etablierung der tectalen Morphologie in der Phase der tectalen
Entwicklung zu unterstützen scheinen, so bleiben Fragen bezüglich der Wechselwirkungen
zwischen Radialglia und migrierenden Neuronen weitgehend ungeklärt. Bislang wurde gezeigt,
daß die neuronale Migration entlang der Radialglia über verschiedene Faktoren gefördert wird.
Zu erwähnen sind Astrotactin, ein möglicher Ligand während der Migration (Zheng et al., 1996),
ß1-Integrin, das mit dem von Radialglia exprimierten extrazellulären Matrixmolekül Laminin
interagiert (Galileo et al., 1992) und das von Radialglia synthetisierte Neuron-Glia-AdhäsionsMolekül Tenascin (Husmann et al., 1992). Im sich entwickelnden Gehirn dienen Radialglia aber
vermutlich nicht nur als Leitstrukturen für auswandernde Neuronen sondern haben wahrscheinlich
darüber hinaus trophischen Einfluß auf die unreifen postmitotischen Nervenzellen (Yuasa et al.,
1996).
In der hier vorgestellten Arbeit wurden im TO der Taube die Expression von Neurotrophinen und
Neurotrophin Rezeptoren in Radialglia mittels Doppelmarkierungen von Vimentin mit BDNF,
Diskussion
140
NT-3 und trk B und trk C in diversen juvenilen Altersstadien untersucht. Die Ergebnisse zeigten,
daß im sich entwickelnden TO Radialglia sowohl die Neurotrophine BDNF und NT-3 als auch
die Rezeptoren trk B und trk C exprimieren. In enger räumlicher Lage zu den Radialglia waren
insbesondere in den tiefen tectalen Schichten kleine, vermutlich migrierende Neuronen lokalisiert,
welche die Neurotrophine BDNF und NT-3 sowie den trk C Rezeptor exprimierten. Trk BMarkierungen wurden in diesen kleinen Neuronen nicht erkannt. Es ist denkbar, daß die von den
Radialglia exprimierten Neurotrophine trophische Signale für migrierende Neuronen darstellen,
ebenso wie auch der BDNF und NT-3 vermittelte trophische Signalfluß von den migrierenden
Neuronen auf die Radialglia wahrscheinlich erscheint.
In reifen Astrocyten, also bereits transformierten Radialglia, wurde die Expression und
Freisetzung des Neurotrophins NGF („nerve growth factor“), vermittelt über die Aktivierung von
NMDA-Rezeptoren und einem Anstieg der intrazellulären Calzium-Konzentration, aufgedeckt
(Abiru et al., 1998). Im Hühnchen ist möglicherweise die Ausschüttung von Neurotrophinen nach
glutamaterger exzitatorischer Erregung auch in den Bergmann-Glia des Kleinhirns und MüllerZellen der Retina denkbar (siehe Punkt 4.7), da beide Zelltypen NMDA-Rezeptoren exprimieren
(Lopez et al., 1997). Ähnliche Prozesse der Neurotrophin Expression und Freisetzung sind auch
für die Radialglia im Tectum opticum der Taube denkbar, wenngleich Radialglia im zentralen
Nervensystem in den verschiedenen Anteilen Unterschiede aufweisen und für Cortex, Kleinhirn
und Mesencephalon spezifisch sind (Götz et al., 1998).
Trophische Einflüsse von migrierenden Neuronen auf Radialglia über den „glial growth factor“
(GGF), die lösliche Form von Neuregulin, wurden im Cortex von Ratten demonstriert (Anton et
al., 1997). Die Ausschüttung von GGF aus den migrierenden Neuronen fördert hierbei die
Richtungsfindung und das Längenwachstum der Radialglia-Fortsätze. Bei Neuregulin handelt es
sich um einen Membran-gebundenen, sekretorisch-peptidergen Wachstumsfaktor, der an
Rezeptoren der „epidermal growth factor Rezeptor-Familie“ bindet (Carrway & Burden, 1995),
wobei die Wirkung über ein sogenanntes „Brain-Lipid-Binding Protein“ vermittelt wird (Anton et
al.,
1997).
Möglicherweise
reguliert
GGF
die
Expression
von
Neurotrophinen,
Zelladhäsionsmolekülen, Neurotransmitter Rezeptoren und Ionen-Kanälen (Corfas & Fischbach,
1993; Falls et al., 1993; Mahanthappa et al., 1996).
Auf Grund der gegenwärtigen Arbeit sind Neurotrophin regulierte Mechanismen der Etablierung
tectaler Morphologie in der Taube sehr wahrscheinlich, wobei basierend auf den Daten der
Diskussion
141
Expression von Neurotrophinen und Neurotrophin Rezeptoren gegenwärtig vier vermutlich
koexistente Mechanismen der trophischen Wirkung während der Zellmigration denkbar sind:
1. Von Radialgliazellen exprimiertes NT-3 übt direkten trophischen Einfluß auf die kleinen,
migrierenden und trk C synthetisierenden Neuronen aus. Möglicherweise dient NT-3 als
Substrat für die Wanderung. Ein nach der Sekretion des Neurotrophins aus den Radialglia
einhergehender Konzentrationsgradient könnte hierbei die Auswanderungsdistanz in der
radialen Achse des TO regulieren.
2. Das von migrierenden Neuronen ausgeschüttete NT-3 bindet an den von Radialglia
exprimierten trk C Rezeptoren, wobei als mögliche Konsequenzen die Radialglia in Position
und Ausdehnung gefestigt werden. Zusammen mit dem unter Punkt eins erläuterten Weg
ergeben sich NT-3 vermittelte trophische Wechselwirkungen zwischen Radialglia und
migrierenden Neuronen.
3. Migrierende Neuronen üben möglicherweise über das Neurotrophin BDNF paracrine
trophische Wirkungen auf diejenigen Radialglia aus, die den entsprechenden high-affinity
Rezeptor trk B exprimieren. Mögliche Wirkungen sind auch hier die unter 2. beschriebenen
Etablierungen von Radialglia.
4. Für die Radialglia sind auch autocrine Wirkungen von BDNF denkbar, da sie sowohl das
Neurotrophin BDNF als auch den korrespondierenden trk B Rezeptor exprimieren.
Durch verschiedene Arbeiten werden diese vier hypothetischen Wege der trophischen Wirkung
von BDNF und NT-3 bei der Radialglia-gestützten Etablierung der tectalen Morphologie
untermauert. In ultrastrukturellen Untersuchungen migrierender Neuronen wurden dünne Fortsätze
erkannt, die in ihrer Morphologie den Filopodien von Wachstumskegeln gleichen (Meller, 1979;
Yuasa et al., 1996). In diesen Fortsätzen, die sich entlang der Radialglia erstreckten, wurden
endocytotische Vesikel detektiert, wie sie auch in axonalen Wachstumskegeln (Grainger et al.,
1968; Grainger & James, 1970; Cheng & Reese, 1987) und bei der Glia-geleiteten Migration
von Kleinhirn-Zellen in vitro zu beobachten sind (Gregory et al., 1988). Yuasa und Mitarbeiter
(1996) spekulierten daher, daß unter anderem die Rezeptor-gesteuerte Endocytose von
Wachstumsfaktoren die Zellmigration entlang der Radialglia fördert. Die in der vorliegenden
Arbeit gezeigten Daten zur BDNF und NT-3 Synthese in Radialglia sowie zur trk C Expression in
Diskussion
142
migrierenden Neuronen sind eine erste Bestätigung für ein Zusammenwirken von Neurotrophinen
und Zellmigration entlang von Radialglia.
Als Stop-Signale der neuronalen Migration werden afferente Fasern im Zielgebiet oder dort
bereits existente Neuronen diskutiert (Sidman & Rakic, 1973; Hatten, 1990). Möglicherweise
sind es aber auch Zelloberflächenmoleküle der Radialglia, die ein Stop-Signal erkennen lassen
(Gregory et al., 1988).
In diversen Studien wurde neben der radialen auch die tangentiale Migration von Neuronen
demonstriert (Walsh & Cepko, 1988, Gray & Sanes, 1991). Denkbar ist, daß zunächst über die
Radialglia-gestützte Migration von Neuronen das vorläufige Muster der nervalen Struktur angelegt
wird, um im fortgeschrittenen Stadium der Entwicklung die Feinabstimmung der Morphologie zu
erreichen (Walsh & Cepko, 1992). Die in der vorgestellten Arbeit gezeigten NT-3 und trk B
positiven tangentialen Fasern in den superficialen Schichten sind möglicherweise die Zellfortsätze
von tangential migrierenden Neuronen, die in den retino-rezipienten Schichten unabhängig von den
Radialglia zu ihrer Zielposition migrieren. Inwieweit die Expression von NT-3 und trkB eine
möglicherweise stattfindende tangentiale Zellmigration trophisch reguliert, bleibt spekulativ.
Denkbar ist, daß in diesem Zielgebiet Wechselwirkungen mit afferenten Fasern oder bereits
etablierten Zellpopulationen eine Rolle spielen.
Wie in den vorangegangen Abschnitten dargestellt wurde, regulieren trophische Signale als
intrinsische Faktoren eine Vielzahl von Prozessen im Nervengewebe. Darüber hinaus stehen
nervale Strukturen aber auch im ständigen Austausch mit den innervierten Gebieten. Hierbei
werden nicht nur elektrische Signale gegenseitig integriert, sondern auch trophische Signale
ausgetauscht. Zum Beispiel benötigen retinale Ganglienzellen trophische Signale vom innervierten
TO (Hughes & McLoon, 1979) und tectale Neuronen wiederum anterograde trophische Signale
von der innervierenden Retina (Catsicas et al., 1992; Garner et al., 1996; von Bartheld, 1996).
Im folgenden werden basierend auf den Ergebnissen der Expression von BDNF, NT-3, trk B
und trk C im retino-tectalen System der Taube die beiden Richtungen trophischer Signalflüsse,
der retrograde und der anterograde Signalfluß diskutiert.
Diskussion
4.4
143
BDNF und NT-3 als retrograde Signalstoffe
In diversen Studien wurde gezeigt, daß ein Überleben retinaler Zellen entscheidend durch das
innervierte Gewebe reguliert wird. Zum Beispiel wurde im visuellen System nach Entfernung des
TO oder Durchtrennung des Tractus opticus ein signifikantes Absterben retinaler Zellen
beobachtet (Vanselow et al., 1990). Vermutlich sind hierbei im Zielgebiet ausgeschüttete
Neurotrophine regulative Elemente innerhalb einer Signalkaskade vom innervierten zum
innervierenden Gewebe. Im folgenden Abschnitt werden in einem Überblick Erkenntnisse über
retrograde neurotrophe Signalwege skizziert, die anschließend mit den in der vorliegenden Arbeit
gewonnenen Daten verglichen und diskutiert werden.
Fournier und Mitarbeiter (1997) demonstrierten den retrograden Transport von mikroinjiziertem
BDNF vom TO zu den retinalen Ganglienzellen in der Ratte, und im Hamster reduzierte in den
superioren Colliculus injiziertes BDNF den retinalen Ganglienzelltod während der retinalen
Entwicklung (Ma et al., 1998). Hierbei fungiert BDNF als trophischer Überlebensfaktor für
retinale Ganglienzellen und reguliert darüber hinaus auch die axonalen Verzweigungen retinaler
Ganglienzellen im TO von Xenopus (Cohen-Cory & Fraser, 1995), wie auch im Rattencortex
(Cabelli et al., 1995). Jüngste Untersuchungen deuten darauf hin, daß BDNF und NT-3 auch als
morphogenetische und chemotopische Agenzien auf das neuronale Wachstum Einfluß ausüben
(Ming et al., 1997). Axone retinaler Ganglienzellen wachsen zunächst entlang des unreifen
optischen Traktes ins Zielgebiet, wobei unter anderem neuroepitheliale Gliazellen (McLoon &
Lund, 1980), Proteoglycane (McAdams & McLoon, 1995) und Tenascin (Perez & Halfter,
1993) axonales Wachstum während der Entwicklung regulieren (Tan & Harvey, 1997). Im TO
angekommen beeinflussen trophische Signale der superficialen Schichten das Einwachsen retinaler
Axone (Hanklin & Lund, 1987), indem hier die Substanzen Ephrin-A2 und Ephrin-A5
Leitmoleküle in rostro-caudalen Achse darstellen (Cheng et al., 1995; Drescher et al., 1995),
hingegen Zelloberflächenmoleküle wie N-Cadherin die tectale Terminierung in einzelnen retinorezipienten Schichten regulieren (Inoue & Sane, 1997). In der Feinabstimmung dieser retinalen
Terminationen steigern Neurotrophine die Komplexität retinaler Verzweigungen (Gallo &
Letourneau, 1998), beeinflussen aber nicht die laminäre Verteilung (Inoue & Sane, 1997).
Auf Grund der vorliegenden Resultate zur Expression der Neurotrophine und der
korrespondierenden Rezeptoren in der Taube, ist auch hier eine BDNF vermittelte Zielsteuerung
Diskussion
144
retinaler Axone im TO denkbar. Erste BDNF-positive Neuronen wurden im TO der Tauben ab
E 14, dem ersten untersuchten embryonalen Stadium, in den tiefen Schichten A-C (adulte
Schichten 15 bis 13) des rostralen TO detektiert. Zwei Tage später dehnte sich das BDNF Signal
über die gesamte rostro-caudale Achse des TO aus. Vom Schlupftag an bis PH 4 zeigten alle zu
diesem Zeitpunkt angelegten tectalen Schichten (5-15) ein deutliches BDNF-positives Signal,
wobei insbesondere die superficialen und mittleren Schichten kolumnenartige Markierungen
aufwiesen. In sieben und vierzehn Tage alten Tauben waren vornehmlich Neuronen der tiefen und
mittleren Zellschichten BDNF markiert, wohingegen im adulten Tier Nervenzellen der tectalen
Schichten 2-14 BDNF synthetisierten. Diese differentielle Expression des Neurotrophins im TO
zeigt auffällige Gemeinsamkeiten mit dem Innervationsmuster retinaler Axone. In umfassenden
morphologischen Untersuchungen zeigten Manns und Güntürkün (1997), daß die tectale
Innervation retinaler Fasern ab E 14 im rostralen TO beginnt, um sich in den folgenden Tagen
über das gesamte TO auszudehnen. Die Innervation retinaler Fasern dauert etwa bis PH 20 an.
Die zeitliche Übereinstimmung zwischen dem Expressionsmuster von BDNF und dem
Einwachsen retinaler Fasern ist ein Hinweis darauf, daß im Zielgebiet exprimiertes und vermutlich
auch freigesetztes BNDF das korrekte Einwachsen retinaler Fasern sowie das Etablieren
entsprechender Zellkontakte reguliert. Insbesondere Horizontalzellen der superficialen Schichten
und Radialzellen der superficialen und mittleren Zellschichten, welche direkten retinalen Input
erhalten, zeigten eine deutliche BDNF Expression ab PH 0.
Obgleich BNDF ab E 14 im TO der Taube exprimiert wird, so scheint der entsprechende trk B
Rezeptor nicht vor dem Schlupftag in der Retina synthetisiert zu werden. Vielleicht ist die
Expression des Rezeptors in retinalen Zellen in den embryonalen Entwicklungsstadien noch zu
gering, als daß der trk B Rezeptor immunhistochemisch detektiert werden könnte. Auch denkbar
ist, daß BDNF nicht der einzige, retrograd zur Retina transportierte trophische Faktor ist, welcher
retino-tectale Konnektivitäten stabilisieren hilft. So wurde zum Beispiel gezeigt, daß in sich
entwickelnden retinalen Ganglienzellen des Hamsters die exogene Applikation von BDNF die
Apoptose reduziert (Ma et al., 1998), nicht aber bei Hühnchen (Drum et al., 1996). Es ist daher
denkbar, daß andere Neurotrophine die Wirkungen von BDNF auf retinale Zellen kompensieren
können, beziehungsweise in anderen Spezies generell erfüllen (Herzog & von Bartheld, 1998).
Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse der Expression von NT-3 im retino-tectalen System der
Taube unterstützen diese Hypothese.
Diskussion
145
In der Taube waren die ersten NT-3-positiven Neuronen in den tiefen und mittleren tectalen
Schichten ab E 14 zu beobachten. In den folgenden Untersuchungsstadien (E 16 bis PH 4)
wurden NT-3 Antigen tragende Neuronen in allen, zum jeweiligen Zeitpunkt existierenden
Zellschichten detektiert, wobei insbesondere Horizontalzellen der superficialen Schichten
Immunreaktivität gegen NT-3 zeigten. Wie bei den BDNF-positiven Markierungen wurden auch
für NT-3 breite kolumnenartige Markierungen der mittleren und superficialen Schichten
beobachtet. In den sich anschließenden Untersuchungsstadien PH 7 bis PH 14 war die neuronale
NT-3 Expression tectaler Zellen auf die Schicht 13 begrenzt, bevor im adulten Tier keine NT-3positiven tectalen Neuronen erfaßt werden konnten.
Auffällig ist der zeitliche Gradient in der Expression des Neurotrophins NT-3, welcher sehr genau
mit der Etablierung retino-tectaler Konnektivitäten im Zeitraum E 14 bis PH 20 korreliert. Im
adulten Tier wird NT-3 vermutlich gar nicht oder in immunhistochemisch nicht zu detektierenden
Mengen exprimiert. Die retinale Expression des korrespondierenden trk C Rezeptors wurde
immunhistochemisch ab PH 0 in retinalen Ganglienzellen registriert. Für die Etablierung retinotectaler Konnektivitäten mittels NT-3 wäre aber eine Expression von trk C in retinalen
Ganglienzellen bereits zu einem früheren Zeitpunkt nötig. Gegenwärtig kann nur spekuliert
werden, ob der trk C Rezeptor bereits in embryonalen Stadien in der Retina exprimiert wird, die
Menge aber unter der immunhistochemisch detektierbaren Grenze liegt oder andere Faktoren,
wie zum Beispiel weitere neurotrophe Faktoren, die frühe Etablierung des retino-tectalen Systems
steuern, wobei dann NT-3 und BDNF erst nach dem Schlupf regulierend auf das System
einwirken. Insbesondere die BDNF und NT-3 Expression in den superficialen, retino-rezipienten
tectalen Schichten, mit deutlichen Markierungen von Radialzellen und zumindest zum Teil von
Horizontalzellen, während der Etablierung retino-tectaler Kontakte läßt diese Steuerungsprozesse
für die beiden Neurotrophine sehr wahrscheinlich werden.
Gleichwohl zeigen die Ergebnisse, daß zumindest ab dem Schlupftag die Entwicklung der retinotectalen Konnektivitäten der Taube vermutlich synergistisch durch BDNF und NT-3 unterstützt
werden. Das folgende Modell erläutert den möglichen Wirkungsmechanismus: an einer Synapse
vom innervierten Neuron postsynaptisch freigesetzte Neurotrophine diffundieren über den
synaptischen Spalt zur präsynaptischen Membran, um dort an den entsprechenden Rezeptoren zu
binden. Anschließend kommt es zu einer Initialisierung des Rezeptor-Neurotrophin-Komplex,
Diskussion
146
welcher zum Soma des innervierenden Neurons retrograd transportiert wird (Bhattacharyya et al.,
1997).
4.5
BDNF und NT-3 als anterograde trophische Signalstoffe
Neben dem seit einigen Jahren bekannten retrograden Weg der trophischen Signalfortleitung
wurde erst in jüngerer Zeit der vorwärts gerichtete, anterograde Signalfluß trophischer Moleküle
nachgewiesen (von Bartheld, 1996; Zhou & Rush, 1996). Wie im folgenden Abschnitt diskutiert
wird, sind, basierend auf den Ergebnissen im visuellen System verschiedener Spezies wie Ratten
und Hühnchen sowie den Expressionsdaten der vorliegenden Arbeit, anterograde neurotrophe
Wirkungsmechnismen auch im retino-tectalen System der Taube denkbar.
Während der Entwicklung des retino-tectalen Systems wird ein Überschuß von Nervenzellen im
TO angelegt, deren Überleben unter anderem von der Innervation afferenter Fasern abhängt.
Gezeigt wurde dies in Untersuchungen, bei denen eine operative Entfernung des Auges ein
dramatisches Zellsterben im TO (Kelly & Cowan, 1972) sowie in anderen Zielgebieten des
visuellen Systems bewirkte (Cowan, 1973). Auch die Unterbindung des anterograden axonalen
Transports wie auch der elektrischen Aktivität in afferenten Fasern führte zu einem signifikanten
Absterben neuronaler Zielzellen (Catsicas et al., 1992). Demzufolge benötigen die tectalen Zellen
trophische Signale, möglicherweise Neurotrophine, aus der Retina (Catsicas et al., 1992).
Jüngere Studien in verschiedenen nervalen Geweben demonstrierten einen anterograden
Transport von Neurotrophinen, wobei das Neurotrophin vom Perikarion des innervierenden
Neurons entlang des Axons zur Nervenendigung im Zielgebiet transportiert wurde (von Bartheld,
1996; Zhou & Rush, 1996; Conner et al., 1997). Basierend auf den Daten über einen
anterograden Neurotrophin-Transport wird gegenwärtig der anterograde trophische Signalfluß
seitens des innervierenden Neurons diskutiert (Fawcett et al., 1998; Herzog & von Bartheld,
1998).
Im sich entwickelnden retino-tectalen System des Hühnchens wurde exogenes, radioaktiv
markiertes BNDF und NT-3 von der Retina zum TO transportiert, präsynaptisch freigesetzt und
schließlich in den superficialen tectalen Schichten akkumuliert (von Bartheld, 1996). Da in diesen
tectalen Schichten des Hühnchens die high-affinity trk B und trk C Rezeptoren exprimiert werden
(Bothwell, 1995), ist ein anterograder trophischer Signalfluß von der Retina zum TO zu vermuten.
Diskussion
147
Da in der Taubenretina vom Schlupftag bis zum adulten Tier die Neurotrophine BDNF und NT-3
exprimiert werden, sind auch hier anterograde Wirkungsmechanismen auf Neuronen in
Zielgebieten außerhalb der Retina, wie zum Beispiel dem TO, denkbar.
In der gegenwärtigen Untersuchung zeigte sich eine deutliche tectale Expression der high-affinity
Rezeptoren trk B und trk C vom Embryonalstadium E 14 bis PH 14. Zum Zeitpunkt E 14 waren
zunächst Neuronen der tiefen und mittleren Schichten des rostralen TO trk B- und trk C-positiv.
In den folgenden Untersuchungsstadien (E 16 bis PH 4) dehnte sich die Markierung über die
gesamte rostro-caudale Achse aus, wobei ab PH 0 auch die vorhandenen superficialen tectalen
Schichten trk B und trk C-positive Neuronen aufwiesen. Insbesondere in den mittleren und
superficialen Schichten waren trk B-, als auch trk C-positive Neuronen in breiten Kolumnen
angeordnet. Anhand ihrer Morphologie wurden sie als Radialzellen und zum Teil als
Horizontalzellen identifiziert. Zwischen PH 7 und PH 14 waren trk B und trk C markierte
Nervenzellen vornehmlich in der Schicht 13 lokalisiert, in der adulten Taube hingegen konnten
beide high-affinity Rezeptoren nicht mehr detektiert werden.
In den Tauben zeigte sich ein zeitlicher Gradient der Expression der beiden high-affinity
Rezeptoren trk B und trk C im TO, welcher mit dem Entstehungsmuster retino-tectaler
Konnektivitäten im Zeitraum (E 14 bis PH 20) korreliert. Einwachsende retinale Axone bilden
direkte Kontakte mit den Dendriten tectalen Neuronen in den retino-rezipienten Schichten 2-7
des TO, wobei die Somata der Neuronen über die Schichten 2-13 verteilt liegen. Es sind
vornehmlich Radialzellen der superficialen und mittleren Schichten sowie Horizontalzellen der
superficialen Schichten, welche direkte retinale Efferenzen erhalten, aber auch die multipolaren
Neuronen der Schicht 13 (Hayes & Webster, 1975; Hardy et al., 1985), deren Dendriten bis in
die Schichten 4 und 5 reichen (Hellmann & Güntürkün, 1999). Da Neuronen dieser Schichten die
entsprechenden Neurotrophin-Rezeptoren exprimieren und retinale Ganglienzellen BDNF und
NT-3 produzieren, ist eine anterograde Neurotrophinfreisetzung in den retino-rezipienten tectalen
Schichten seitens dieser retinalen Zellen wahrscheinlich. Möglicherweise regulieren anterograd
freigesetzte Neurotrophine das Überleben tectaler Nervenzellen oder / und beeinflussen während
der Entwicklung des Systems auch die tectale Zellmorphologie, wie im Cortex oder Cerebellum
für das Dendritenwachstum gezeigt (McAllister, 1995; Velier et al., 1997).
Diskussion
148
In den vorangegangenen Abschnitten wurden die beiden möglichen Wege der trophischen
Signalleitung im retino-tectalen System der Taube beschrieben und diskutiert. Zusammengefaßt
wurde dargestellt, daß in der juvenilen und adulten Retina die beiden Neurotrophine BDNF und
NT-3 exprimiert werden, die entsprechenden Rezeptoren trk B und trk C aber nur im juvenilen
und nicht im adulten TO zu erkennen sind. Daher ist eine anterograde Signalleitung mit
gleichzeitiger Neurotrophin-Freisetzung im juvenilen TO denkbar, während ein solcher Signalfluß
im adulten TO mutmaßlich wirkungslos bleiben würde. Dagegen sind die biochemischen
Voraussetzungen für eine exzitatorische Signalleitung von der Retina zum TO sowie die
postsynaptischen Neurotrophin-ausschüttung im juvenilen wie auch adulten TO gegeben: retinale
Ganglienzellen exprimieren vom Schlupftag an trk B und trk C Rezeptoren, und eine tectale
BDNF Expression ist ebenfalls in den Entwicklungsstadien bis zum adulten Tier zu erkennen.
Lediglich das Neurotrophin NT-3 wird nur im sich entwickelnden TO der Taube synthetisiert.
Altersabhängige Neurotrophin-Expressionen wurden bereits im Säugerhirn beobachtet, wobei
NT-3 insbesondere in den Entwicklungsstadien und BDNF auch in Adulten nachgewiesen
werden konnte (Katoh-Semba et al., 1998).
In der gegenwärtigen Arbeit wurde die genaue Lokalisation von BDNF im TO adulter Tauben in
elektronenmikroskopischen
Untersuchungen
nachgewiesen.
In
diesen
ultrastrukturellen
Untersuchungen der Morphologie des TO sowie der Lokalisation von BDNF wurde zum einen
die Hypothese über retrograde Signalflüsse im retino-tectalen System adulter Tauben bestärkt,
und zum anderen gezeigt, daß BDNF vermutlich ausschließlich in den retino-rezipienten tectalen
Schichten freigesetzt wird, gleichwohl es auch in den Neuronen der mittleren und tiefen tectalen
Schichten synthetisiert wird.
4.6
Ultrastrukturelle Untersuchungen des Tectum opticum
Das adulte fünfzehn-schichtige TO der Taube kennzeichnet eine hohe Komplexität in der
Verarbeitung visueller und nicht-visueller Eingänge (Brecha, 1978). Die visuellen Projektionen
kommen zum Großteil von der Retina, und zu geringeren Anteilen vom visuellen Wulst und dem
multimodal assoziativen Archistriatum. Etwa 90% der retinalen Axone ziehen durch die Schicht
eins nach vollständiger Kreuzung im Chiasma opticum in das TO der Taube ein (Remy &
Güntürkün, 1991). Sie terminieren in den superficialen Schichten 2 bis 7 auf den Dendriten der
Diskussion
149
Radialzellen und Horizontalzellen sowie auf den bis in die superficialen Schichten reichenden
großen multipolaren Dendriten der Schicht 13 Neuronen (Hayes & Webster, 1975; Angaut &
Reperant, 1976; Reperant & Angaut, 1977; Hardy et al., 1985, Hellmann & Güntürkün, 1999).
Eingänge vom visuellen Wulst und dem Archistriatum terminieren in den mittleren und tiefen
tectalen Schichten 11 bis 13 (Zeier & Karten, 1971; Hunt & Webster, 1972; Karten et al.,
1973; Brecha, 1978). Die Verarbeitung visuelle Eingänge im TO der Tauben erfolgt in den
Schichten 1-13, während vornehmlich Neuronen der tiefen Schichten bi- oder multimodal
visuelle, akustische und somatosensorische Afferenzen integrieren (Cotter, 1976; Knudsen &
Knudsen, 1983; Hunt & Brecha, 1984).
In den hier durchgeführten elektronenmikroskopischen Untersuchungen wurde deutlich, daß in
den superficialen tectalen Schichten eine Vielzahl an Synapsen auf horizontalen und radialen
Dendriten die Informationsfortleitung gewährleisten, wobei nach Hayes und Webster (1985) die
höchste synaptische Dichte in der tectalen Schicht 5 erreicht wird. In verschiedenen
Untersuchungen wurde gezeigt, daß insbesondere die Horizontalzellen der Schicht 5 retinale
Efferenzen erhalten und präsynaptische Kontakte mit radialen Dendriten in den superficialen
Schichten bilden (Hayes & Webster, 1975; Angaut & Reperant, 1976; Reperant & Angaut,
1977). Die strukturelle Organisation von retinalen Terminalien auf Horizontalzellen und radialen
Dendriten tiefer gelegener Neuronen ist auch vom Colliculus superior der Säuger bekannt (Lund,
1969; Sterling, 1971; Liebermann & Webster, 1974). Nach exzitatorischer Erregung der
Horizontalzellen über glutamaterge Rezeptoren (Theiss et al., 1998) üben retinale Axone an den
synaptischen Verbindungen mit den radialen Dendriten vermutlich inhibierende Wirkungen über
den Neurotransmitter GABA aus (Henke et al., 1976a, b).
Diese komplexen synaptischen Verbindungen bilden die Basis für die beiden, in
elektrophysiologischen Untersuchungen entschlüsselten, Wege der Signalfortleitung visueller
Information im TO (Hardy et al., 1985). Zum einen erhalten die multipolaren Neuronen der
Schicht 13 über ihre bis in die superficialen Schichten reichenden Dendriten direkten axodendritischen retinalen Eingang, und zum anderen wird das Signal zunächst axo-dendritisch auf
Radialzellen der mittleren Zellschichten übertragen, bevor diese über axo-dendritische und axosomatische Kontakte die Signalfortleitung zu den multipolaren Neuronen der Schicht 13
gewährleisten. Die elektronenmikroskopischen Bilder zeigten in der Schicht 13 eine sehr hohe
Dichte an Synapsen auf den proximalen Dendriten der multipolaren Neuronen. Vermutlich
handelte es sich um synaptische Kontakte der als Interneuronen fungierenden Radialzellen der
Diskussion
150
mittleren Zellschichten. Den Hauptteil der Efferenzen aus dem TO bildeten die Neuronen der
Schicht 13 mit ihren in der Schicht 13 und 14 deutlich sichtbaren myelinisierten Axonen zu
visuellen, motorischen und multimodal arrangierten Kerngebieten (Hunt & Künzle, 1976).
In den hier aufgeführten immunhistochemischen elektronenmikroskopischen Untersuchungen
wurde das Neurotrophin BDNF postsynaptisch in den superficialen Schichten sowie in radialen
Dendriten der superficialen und mittleren tectalen Zellschichten in direkter Nähe zu den
cytoskelettalen Elementen lokalisiert. An den Synapsen der tiefen tectalen Schicht 13 Neuronen
fehlte hingegen jegliche ultrastrukturelle BDNF Immunreaktivität. Diese Ergebnisse machen zwei
Schlußfolgerungen wahrscheinlich. Erstens liegt das Neurotrophin BDNF im TO adulter Tauben
hauptsächlich in den superficialen Schichten vor, gleichwohl es in den mittleren und tiefen tectalen
Schichten exprimiert wird. Durch in-vitro Experimente wurde gezeigt, daß die mRNA von
BDNF und trk B im somato-dendritischen Kompartiment kultivierter Hippocampus Neuronen
lokalisiert ist, wobei synaptische Aktivität den dendritischen Transport dieser in die distalen
Bereiche fördert (Tongiorgi et al., 1997). Vermutlich wird ebenso in der Taube in tectalen
Neuronen der tiefen und mittleren Zellschichten exprimiertes BDNF entlang von Mikrotubuli,
welche als cytoskelettale Basis für den schnellen anterograden vesikulären Transport fungieren
(Schmitt 1968; Paulson & McClure 1975; Theiss & Meller, 1999), in die retino-rezipienten
Schichten transportiert. Der vesikuläre Transport von BDNF und die synaptische Lokalisation
wurde auf Grund lichtmikroskopischer in vitro-Untersuchungen vermutet (Haubensak et al.,
1998). Zweitens macht die anscheinend ausschließlich postsynaptische Lokalisation von BDNF
den retrograden trophischen Signalfluß vom TO zur Retina nach visueller Erregung in adulten
Tauben wahrscheinlich. Wie in vitro gezeigt reguliert BDNF an den Synapsen sekretorische
Mechanismen über eine gesteigerte Expression verschiedener Vesikelproteine (Takei et al.,
1997), mit der Folge einer schnellen Freisetzung des exzitatorischen Neurotransmitters Glutamat
(Takei et al., 1998). BDNF fungiert darüber hinaus auch als spezifischer trophischer Faktor für
GABAerge Interneuronen (Marty et al., 1997), und fördert die spezifische Ausschüttung von
GABA im Rattencortex (Sala et al., 1998). Da tectale Horizontalzellen der Taube als GABAerge
Interneuronen wirken (Henke et al., 1976a,b), welche synaptische Verbindungen mit
postsynaptischer BDNF Lokalisation zeigten, sind die beschriebenen BDNF vermittelten
Mechanismen auch für Horizontalzellen im TO der Taube sehr wahrscheinlich.
Diese Daten deuten auf direkte Zusammenhänge zwischen nervaler Aktivität und der Freisetzung
und Wirkung von Neurotrophinen hin, die im nächsten Abschnitt näher dargestellt werden.
Diskussion
4.7
151
Aktivitätsabhängige Ausschüttung der Neurotrophine
Die Phänomene einer aktivitätsabhängigen Freisetzung von Neurotrophinen wurden bereits im
Säugercortex, einer ebenfalls funktionell und morphologisch in mehrere Schichten unterteilbaren
Hirnstruktur, beschrieben, wo über diese Mechanismen die Entstehung und Etablierung okulärer
Dominanzsäulen reguliert werden (Elliot & Shadbolt, 1998).
In einer jüngsten Studie wird außerdem die „Neurotrophin induzierte Neurotrophin-Freisetzung“
postuliert (Krüttgen et al., 1998). Nach exzitatorischer Erregung und ihrer damit einhergehenden
Freisetzung könnten Neurotrophine demnach ihre eigene Sekretion induzieren, um gezielte
positive Signale auf subzellulärer Ebene zu bewirken.
Ob die Freisetzung eine generelle neuronale Aktivität im Sinne eines exzitatorischen oder
inhibitorischen Signalflusses erfordert oder nicht, ist gegenwärtig nicht zu beantworten. Gleichwohl
werden unter anderem Glutamatrezeptoren für eine exzitatorische Signalleitung mit anschließender
Neurotrophinfreisetzung diskutiert (Lindholm et al., 1994). Gemäß einem Modell von James E.
Johnson von der „Wake Forest University“ in Amerika (persönliche Korrespondenz) kommt es
hierbei zu einer präsynaptischen Ausschüttung des Neurotransmitters Glutamat, welcher
postsynaptisch an den entsprechenden Glutamatrezeptoren bindet. Die anschließende, durch
einen Natrium-Ionen Einstrom vermittelte, postsynaptische Depolarisation bewirkt eine durch
zyklisches
Adenosin-Mono-Phosphat
(cAMP)
regulierte
Aktivierung
des
sekundären
Botenstoffes Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP 3), welches wiederum Calcium-Ionen aus
intrazellulären Speichern wie dem endoplasmatischen Retikulum freisetzt. Diese Calcium-Ionen
regulieren möglicherweise die postsynaptische BDNF-Sekretion, mit der Folge des unter Punkt
4.4 beschriebenen retrograden neurotrophen Signalflusses. Ebenfalls denkbar ist auch eine
synergistische präsynaptische Ausschüttung eines Neurotransmitters und entsprechender
Neurotrophine, mit der Konsequenz des unter Punkt 4.5 erläuterten anterograden neurotrophen
Signalfluß.
Entsprechend dem vorgestellten Modell sind Glutamat vermittelte, aktivitätsabhängige Prozesse
der Neurotrophin-Freisetzung im retino-tectalen System der Taube denkbar. Im adulten TO der
Taube wurden diverse AMPA-Rezeptor Untereinheiten (α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4isoxazolpropionsäure), welche zur Gruppe der ionotrophen non-NMDA Glutamatrezeptoren
Diskussion
152
zählen, detektiert (Theiss et al., 1998). Immunhistochemisch wurde die Untereinheit Glu R1 in den
tectalen Schichten 2 bis 5, 9, 10 und 13, die Untereinheiten Glu R2/3 in den Schichten 9, 10 und
13 dargestellt. In einer aktuellen Kooperation mit dem Institut für Hirnforschung (Prof. Zilles) von
der Universität Düsseldorf wurden in autoradiographischen Untersuchungen außerdem
glutamaterge Kainat-Rezeptoren und NMDA-Rezeptoren insbesondere in den superficialen
Schichten des adulten TO der Taube gezeigt. Für das Neurotrophin BDNF wurde eine
gesteigerte glutamaterge synaptische Übertragung durch vermehrte präsynaptische Transmitterausschüttung gezeigt (Leßmann & Heumann, 1998), die vermutlich durch eine BDNF induzierte
Phosphorylierung von NMDA Rezeptoren induziert wird (Leßmann, 1998).
Bislang fehlen Daten zur Expression von Glutamatrezeptoren in der embryonalen und juvenilen
Taube. Dennoch konnten erste elektrophysiologische Ableitungen infolge visueller Reize der
Retina in der ersten Woche nach dem Schlupf im TO der Taube erfolgen (Bagnoli et al., 1985,
1987), was auf eine funktionsfähige exzitatorische Signalleitung in diesem Entwicklungsstadium
schließen läßt.
Die elektrophysiologischen Daten und die Ergebnisse zur Expression der Neurotrophine und
Neurotrophin Rezeptoren lassen den Schluß zu, daß eine aktivitätsabhängige BDNF-Freisetzung
tectaler Neuronen nach erregender Signalleitung im retino-tectalen System der adulten Taube sehr
wahrscheinlich ist, dieser Weg für NT-3 aber auf die juvenilen Stadien der Entwicklung begrenzt
bleibt.
Neben
der
hier
dargestellten
vermutlich
aktivitätsabhängigen
Ausschüttung
der
Neurotrophine weist das zeitlich graduierte Signal dieser Proteine auch auf eine
aktivitätsabhängige Expression hin, die im nächsten Abschnitt diskutiert wird.
4.8
Aktivitätsabhängige Expression von BDNF, NT-3, trk B und trk C
Die Annahme einer aktivitätsabhängigen Expression von Neurotrophinen und NeurotrophinRezeptoren leitet sich in der gegenwärtigen Arbeit aus den Daten zur BDNF, NT-3, trk B und
trk C Synthese im retino-tectalen System der Taube ab. Retinale BDNF und NT-3 Expression,
ebenso wie eine trk B und trk C Synthese wurde in der Taube ab dem Schlupftag beobachtet,
dem Zeitpunkt einer gesteigerten retinalen Lichtstimulation. Bei Ratten wurden im Cortex eine
Licht regulierte BDNF Expression nachgewiesen (Castren et al., 1992), und auch in der
Diskussion
153
Hühnchen-Retina steigerte Licht die trk B und trk C Rezeptor-Expression, während diese bei
Dunkelheit reduziert wurde (Okazawa et al., 1994).
Im TO der Taube deutet die Expression von BDNF und NT-3 im Altersstadium E 14, dem
Zeitpunkt des Einwachsens erster retinaler Axone in die mesencephale Struktur (Manns &
Güntürkün, 1997), auf trophische Wechselwirkungen im retino-tectalen System hin. Gleichwohl
sind es vornehmlich Neuronen der tiefen tectalen Schichten, die bedingt retino-rezipient sind
(Hayes & Webster 1975; Hellmann & Güntürkün, 1999), und in den frühen Embryonalstadien
BDNF und NT-3 synthetisieren.
Als Voraussetzung für eine durch Licht gesteuerte Expression von Proteinen in den vom Auge
entfernten Strukturen des visuellen Systems sind einwachsende axonale Projektionen retinaler
Fasern in die betreffenden Hirnregionen anzunehmen. Die Reifung des TO der Taube vom
3-schichtigen Stadium zum Zeitpunkt E 11 bis zur 15-schichtigen und komplex verschalteten
Struktur im juvenilen Altersstadium PH 15 dauert insgesamt etwa drei Wochen (Manns &
Güntürkün, 1997). Erste retinale Axone erreichen das mesencephale TO im Altersstadium E14, in
welchem die tectalen Laminae 7-15 angelegt sind. Als funktionell im Sinne einer exzitatorischen
Signalleitung im retino-tectalen System wird das System in der ersten Woche nach dem Schlupf
betrachtet, dem frühsten Zeitpunkt, zu welchem visuell erzeugte intratectale Antworten abgeleitet
werden konnten (Bagnoli et al., 1985, 1987). Da sich allerdings Bagnoli und Mitarbeiter
vornehmlich auf die foveale Region der Retina konzentrierte, ist es denkbar, daß Photorezeptoren
der peripheren Retina in der Reifung der zentralen Retina voraus sind, und von diesen elektrische
Impulse zum TO geleitet werden können. Für diese Hypothese spricht, daß bereits im
Altersstadium E 15 der Pupillen Licht-Reflex ausgelöst werden kann (Heaton & Harth, 1974),
gesteuert über eine kleine Anzahl an Ganglienzellen der peripheren Retina (Gamlin et al., 1984).
Ein solcher räumlicher und zeitlicher Gradient wurde in der Hühnchen-Retina sowohl für die
Expression verschiedener Photopigmentmoleküle wie Opsin und Rhodopsin (Bruhn & Cepko,
1996), als auch in der Entwicklung der retinalen Ganglienzellen von der Peripherie zu den
zentralen Bereichen gezeigt (Rager et al., 1993). Ebenfalls denkbar sind aber auch spontan aktive
retinale Ganglienzellen mit funktionellen Synapsen im retino-tectalen System bereits vor
Beendigung der ersten Lebenswoche, über welche trk B und trk C vermittelte trophische
Signalkaskaden (siehe Punkt 4.9) induzieren werden könnten.
Über solche Wirkungsketten ist eine durch den epigenetischen Faktor Licht regulierte Expression
der Neurotrophine und Neurotrophin-Rezeptoren im TO vor dem Schlupf der Taube denkbar,
Diskussion
154
wobei funktionsfähige Photorezeptoren das durch die Eischale dringende Licht verarbeiten, die
Erregung anschließend über die Bipolarzellen zu den retinalen Ganglienzellen gelangt, woraufhin
deren Efferenzen den Impuls zum sich entwickelnden TO leiten.
In der gegenwärtigen Arbeit wurde eine Neurotrophin Expression in der Taubenretina jedoch erst
ab dem Schlupftag detektiert. Neben der Möglichkeit eines methodischen Fehlers bei der
Darstellung dieser Antigene in den embryonalen Altersstadien, sind an der frühen Entwicklung der
Retina und des retino-tectalen System möglicherweise andere Faktoren, zum Beispiel weitere
Neurotrophine, beteiligt. Die Neurotrophine BNDF und NT-3 würden den Ergebnissen zur Folge
erst ab dem Schlupf intrinsische trophische Funktionen in der Retina sowie anterograde
trophische Signale im retino-tectalen System darstellen, erkennbar an der einsetzenden massiven
Expression dieser Proteine und der entsprechenden trk Rezeptoren auf retinaler Ebene.
Im juvenilen TO deuten die kolumnenartigen Expressionen der Neurotrophine und NeurotrophinRezeptoren in den superficialen und mittleren Zellschichten des juvenilen TO vermutlich auf
Bereiche hin, in denen zum gegebenen Zeitpunkt retinale Fasern einwachsen, und dort
möglicherweise die Expression von Neurotrophinen und Neurotrophin Rezeptoren über Aktivität
fördern.
Im anschließenden Kapitel werden bislang aufgeklärte intrazelluläre Signalkaskaden nach Bindung
von Neurotrophinen an den korrespondierenden Rezeptoren dargestellt, um die steuernde
Wirkung dieser trophischen Substanzen auf die Expression von Proteinen darzulegen.
4.9
Neurotrophin-induzierte intrazelluläre Signale
Nach der Bindung der Neurotrophine an die entsprechenden trk Rezeptoren wird eine hoch
komplexe intrazelluläre Signalkaskade aktiviert, über welche Neurotrophin-induzierte Wirkungen
reguliert werden (Überblick: Heumann, 1994). Die Neurotrophin-Bindung am trk Rezeptor
bewirkt die Phosphorylierung verschiedener Bereiche der Kinase-Region des Rezeptors (Jing et
al., 1992). Hierdurch werden Bindungsstellen für Proteine mit src-Homologen Motiven (SH2) frei
(Schlessinger, 1994). Bei den SH2 handelt es sich um Domänen mit mehr als hundert
Aminosäuren, die eine hohe Affinität zu Protein-phosphorylierten Tyrosinresten zeigen
(Schlessinger, 1994). Die SH2 Domänen werden wiederum durch die Rezeptor-Kinase der
Diskussion
155
trk Rezeptoren phosphoryliert, mit der Folge einer aktivierten Signalkaskade. Phosphotyrosin
Bindungsstellen für intrazelluläre SH2 Proteine auf trk Rezeptoren sind das Adapterprotein shc
und die Phospholipase C (PLC). In einem möglichen Wirkungskreis assoziiert das Rezeptorgebundene shc-Protein mit dem Adapterprotein Grb, um anschließend einen Komplex mit dem
cytoplasmatischen Protein SOS (son of sevenless) zu bilden (Suen et al., 1993; Hashimoto et al.,
1994; Ohmichi et al., 1994). SOS aktiviert daraufhin das kleine G-Protein p21 Ras unter
Umwandlung von Guanosindiphosphat zu Guanosintriphosphat (Burgering et al., 1993). Das
aktivierte p21 Ras Signal führt wiederum zur Phosphorylierung des Serin/Threonin Kinase protoOncogens Raf, mit der Folge einer Raf vermittelten Phosphorylierung der Mitogen-aktivierten
Protein Kinase Kinase (MAPKK), welche wiederum die Mitogen-aktivierte Protein Kinase
(MAPK) durch Phosphorylierung anregt. In PC 12 Zellen besitzt die MAPK zwei extrazelluläre
Signal-regulierte Kinasen: ERK 1 und ERK 2. Die ERKs haben verschiedene Ziele, wie die
Zellzyklus steuernde S6-Kinase p90rsk (Blenis, 1993) oder auch Transkriptionsfaktoren (Janknecht
et al., 1993).
In diversen Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß die beiden Neurotrophine BDNF und
NT-3 vermutlich über die dargestellten Signalkaskaden die Hydrolyse der Phospholipase und die
gesteigerte Transkription von c-fos bewirken (Widmer et al., 1993; Ohsawa et al., 1993), mit der
letztendlichen Konsequenz eines Faserwachstums der aktivierten Zellen. Vermutlich sind die
intrazellulären Wege für das Faserwachstum aber nicht identisch mit den bislang geklärten
Signalwegen für die Steuerung der Zellmotilität (Heumann, 1994). Auf Grund der Komplexität
dieser Signalwege ist es wahrscheinlich, daß weitere, spezifische Signalkaskaden an der
Vermittlung trophischer Wirkungen hinsichtlich der Transmittersynthese, der Modulation
synaptischer Effizienz, der zellulären Morphologie, oder auch der Neurotrophin induzierten
Neurotrophinsynthese beteiligt sind (Cellerino & Maffei, 1996).
Im folgenden Abschnitt wird diskutiert, welche Funktion Neurotrophine bei der Entstehung von
Lateralisation ausüben könnten. Hierbei werden diverse morphologische Diskussionspunkte der
vorangegangenen Abschnitte bezüglich des anterograden und retrograden trophischen
Signalflusses, der aktivitätsabhängigen Expression und Freisetzung von Neurotrophinen und der
intrazellulären Signalkaskade nach Neurotrophin-Bindung aufgegriffen und mit den Daten
verschiedener Lateralisationsexperimente konferiert. Das abschließend dargelegte Modell zur
Wirkung von Neurotrophinen ist gegenwärtig als rein hypothetisch zu bewerten.
Diskussion
156
4.10 Wird visuelle Lateralisation durch Neurotrophine gesteuert?
Seit Broca (1865) die asymmetrische Verarbeitung von Sprache der linken Hemisphäre
zuordnete, hat das Wissen über die Lateralisation des Gehirns stetig zugenommen. Dennoch sind
bis heute zahlreiche Fragen zu den Mechanismen von Lateralisation und deren Funktionen sowie
der Entstehung der Hirnasymmetrien nicht beantwortet. Wenngleich mit Hilfe von
Verhaltensexperimenten verschiedene Fragen zur lateralisierten Informationsverarbeitung des
menschlichen Gehirns untersucht werden können, so sind insbesondere morphologische
Untersuchungen dieses Gewebes meist nur sehr eingeschränkt möglich. Da aber auch im Tierreich
lateralisierte Gehirne weit verbreitet sind, können gerade hier grundlegende morphologische
Charakterisierungen von Hirnasymmetrien, die zumeist ein Indiz für funktionelle Asymmetrien sind,
durchgeführt werden.
Ein verbreitetes Modell zur Erforschung von Asymmetrien des Vertebratengehirns sind die Vögel.
Untersuchungen zur asymmetrischen Informationsverarbeitung in verschiedenen Vogelspezies
zeigen, daß Höhrempfindungen bei diesen primär in der linken Hemisphäre lokalisiert sind
(Rogers & Anson, 1979), während Geruchsempfindungen dominant in der rechten Hemisphäre
verarbeitet werden (Vallortigera & Andrew, 1994). Visuelle Eindrücke werden je nach
Information unterschiedlich verarbeitet, bei Tauben im tectofugalen System primär linkshemisphärisch (Güntürkün, 1997c), und zumindest bei jungen Hühnchen im thalamofugalen
System primär rechts-hemisphärisch (Rogers, 1996). Die bei der Taube in visuellen
Diskriminationsversuchen gezeigte funktionelle Lateralisation des tectofugalen Systems mit einer
Dominanz des rechten Auges sowie der linken Hirnhemisphäre spiegelt sich auch in
morphologischen Asymmetrien des tectofugalen Systems wieder (Güntürkün, 1997a). Die
Somata tectaler Neuronen der Schichten 2 bis 12 sind links-hemisphärisch größer, wohingegen
die Neuronen der Schicht 13 in der rechten tectalen Hemisphäre größere Soma zeigen
(Güntürkün, 1997a). Ebenfalls links-hemisphärisch größere Somata liegen im Nucleus rotundus
der Taube vor (Manns & Güntürkün, 1999b). Neben den Unterschieden in den Somagrößen
zwischen linker und rechter Hemisphäre wurde auch die asymmetrische Projektion des Tectum
opticum auf den Nucleus rotundus gezeigt, wobei etwa zweimal mehr Fasern vom rechten TO
zum linken Nucleus rotundus ziehen als umgekehrt (Güntürkün et al., 1999).
Diskussion
157
Für die Etablierung dieser links-rechts Asymmetrien im visuellen System der Tauben ist ein
Zusammenspiel von genetischen Faktoren und dem epigenetischen Faktor Licht während der
Embryonalentwicklung maßgeblich verantwortlich (Güntürkün, 1993). In einer komplexen
Signalkaskade bewirkt eine genetisch determinierte, asymmetrische Expression verschiedener
Gene (siehe Einleitung) während der Gastrulationsphase die Rotation des Embryos im Ei. Hieraus
resultiert bei Hühnchen und Tauben eine Drehung des Kopfes, in deren Folge das rechte Auge
zur lichtdurchlässigen Eischale zeigt, das linke Auge hingegen durch den Körper des Tieres
abgeschattet wird (Kuo, 1932). Diese Lage des Kopfes führt bereits vor dem Schlupf zu einer
asymmetrischen Lichtstimulation des rechten Auges, während das linke Auge einer natürlichen
monokularen Deprivation unterliegt.
Wie Untersuchungen an hell-dunkel inkubierten Eiern oder monokular deprivierten Jungtieren
zeigten, wird die Somagröße im Tectum opticum (Güntürkün, 1993; Manns & Güntürkün,
1999a), im Nucleus rotundus (Hermann & Bischof, 1986a), und im Ectostriatum (Hermann &
Bischof, 1986b) entscheidend beeinflußt durch diese asymmetrische Lichtstimulation. Während in
der embryonalen Entwicklungsphase des Tieres eine natürliche monokulare Deprivation des
linken Auges vorliegt, so konnte bei Tauben auch direkt nach dem Schlupf eine Plastizität des
visuellen Systems durch gezielte Manipulation mit Hilfe von Augenklappen demonstriert werden
(Manns & Güntürkün, 1999a).
Wenngleich das Zusammenspiel genetischer und epigenetischer Faktoren zur Etablierung von
Hirnasymmetrien im visuellen System der Vertebraten bekannt ist, so bleibt die Frage, wie
epigenetische Faktoren eine Asymmetrie des Gehirns induzieren, bislang unbeantwortet.
Möglicherweise sind aktivitätsabhängige freigesetzte trophische Faktoren an der Etablierung
visueller Asymmetrien beteiligt.
Da die Projektionen der Retina im tectofugalen System komplett zur kontralateralen Hemisphäre
ziehen, ist mit Ausnahme des Nucleus rotundus, welcher Efferenzen vom Tectum opticum beider
Hemisphären erhält, keine synaptische Kompetition der Projektionen beider Augen in diesem
System vorhanden. Im Tectum opticum ist es daher nicht die Konkurrenz zwischen
innervierenden Axone an den Synapsen nach dem „Hebbschen Prinzips“ (Hebb, 1949), welche
eine asymmetrische Morphologie dieser mesencephalen Struktur bewirkt, sondern es sind
vermutlich aktivitätsabhängige, durch den epigenetischen Faktor Licht gesteuerte Prozesse. Im
tectofugalen System der Taube könnten sich zum Beispiel morphologische Unterschiede durch
Diskussion
158
aktivitätsabhängige Einflüsse retinaler Zellen auf tectale Neuronen manifestieren, bei welchen
Neurotrophine entsprechend der Stärke retinaler Aktivität im TO der Taube ausgeschüttet
werden (Güntürkün, 1997 a,b).
Gemäß dieser Hypothese sind Neurotrophine als Teil einer „biochemischen Brücke“ zwischen
dem epigenetischen Faktor Licht und dem Auftreten morphologischer Asymmetrien denkbar, um
unter anderem vielfältige morphologische Effekte über eine gesteigerte Transkription
verschiedener Gene zu induzieren. Evidenzen für ein solches Modell bilden einige Arbeiten, die
unter anderem im TO von Hühnchen positive neurotrophe Effekte auf die Bildung retinaler
Verzweigungen (Inoue & Sanes, 1997) sowie die Größe neuronaler Zellsoma aufzeigen
(Ventimiglia et al., 1995). In kombinierten elektrophysiologischen und morphologischen Arbeiten
wurde darüber hinaus gezeigt, daß aktivitätsabhängig freigesetzte Neurotrophine auch das axonale
und dendritische Wachstum von Neuronen regulieren (McAllister, 1995, 1996). Bei Säugern
wurde im Cortex in in vivo- und in vitro-Experimenten eine Signalkaskade mit der
aktivitätsabhängigen Expression und Ausschüttung von Neurotrophinen demonstriert (Thoenen,
1995; Bonhoeffer, 1996; McAllister, 1996).
Im visuellen System der Taube ist eine ähnliche Wirkungskette denkbar, bei welcher die
asymmetrische Lichtstimulation des rechten Auges zu einer erhöhten Aktivität retinaler
Ganglienzellen führt, mit der Folge einer aktivitätsabhängigen Sekretion von Neurotrophinen
retinaler Efferenzen im linken Tectum opticum, in dem Zeitraum, in welchem funktionelle und
morphologische Lateralisationen determiniert werden.
Basierend auf den Ergebnissen der vorliegenden Untersuchungen werden vom Schlupftag an bis
zum adulten Tier die Neurotrophine BDNF und NT-3 in der Retina und vom embryonalen Tag
E 14 bis PH 14 die korrespondierenden Rezeptoren trk B und trk C im Tectum opticum
exprimiert. Dadurch sind die Voraussetzungen für einen anterograden trophischen Signalfluß von
der Retina zum Tectum opticum in diesem Zeitraum gegeben. Da die beiden Neurotrophine
BDNF und NT-3 ab E 14 auch im Tectum opticum exprimiert werden, und retinale
Ganglienzellen die entsprechenden Rezeptoren trk B und trk C ab PH 0 synthetisieren, ist
desweiteren der retrograde trophische Signalfluß von BDNF und NT-3 vom Tectum opticum zur
Retina ab dem Schlupftag der Tauben denkbar. Die Funktion eines solchen retrograden
Signalweges liegt möglicherweise in einer verstärkten Transmitterausschüttung retinaler Axone auf
tectalen Neuronen und der Stabilisierung der Synapsen.
Diskussion
159
In der Retina setzt die Expression der untersuchten Proteine mit dem Schlupftag ein, daß heißt
dem Zeitpunkt einer massiven Lichtstimulation. Möglicherweise werden die untersuchten
Neurotrophine bereits vor dem Schlupftag exprimiert, wobei die Konzentration aber unter einer
hier zu detektierenden Schwelle liegt. Die entsprechenden Rezeptoren für BDNF und NT-3
vermittelte Signale sind im Tectum opticum bereits in der embryonalen Taube vorhanden,
beginnend mit dem Entwicklungszeitpunkt, an welchem retinale Fasern diese mesencephale
Struktur erreichen. Eventuell sind aber an der embryonalen Anlage der Asymmetrien des retinotectalen System weitere Neurotrophine oder andere Faktoren beteiligt, während BDNF und
NT-3 erst ab dem Schlupftag die primären Asymmetrien stabilisieren und etablieren. In einer
aktuellen Arbeit wurde gezeigt, daß morphologische Asymmetrien im retino-tectalen System
durch experimentelle monokulare Deprivation während einer kurzen Phase nach dem Schlupf
beeinflußbar bleiben (Manns & Güntürkün, 1999a). Diese Phase der Plastizität des Systems
stimmt überein mit den Entwicklungsprozesse des retino-tectalen Systems sowie dem Zeitraum
der Expression der Neurotrophin Rezeptoren trk B und trk C im Tectum opticum.
Zusammengenommen ist auf Grund der bisher gewonnen Daten eine Signalkaskade
wahrscheinlich, bei welcher in der juvenilen Taube anterograde trophische BDNF und NT-3
Signale der Retina morphologische Charakteristika tectaler Neuronen, wie zum Beispiel die
Größe des Somata, stabilisieren. Inwieweit BDNF und NT-3 auch als trophischen Faktoren an
der primären Entwicklung der Asymmetrien des retino-tectalen System fungieren, müssen
zukünftige Experimente zeigen.
Ein solches Modell zu den möglichen Wirkungen von Neurotrophinen bei der Entstehung von
Lateralisationen des Gehirns ist als Arbeitshypothese für weiterführende Experimente zu
bewerten. In dem sich anschließenden Kapitel „4.11 Ausblick“ werden daher weitere
Untersuchungen vorgeschlagen, die zusätzliche Erkenntnisse zur Wirkung von Neurotrophinen im
retino-tectalen System der Taube erwarten lassen. Darüber hinaus wird im Kapitel „4.12
Therapeutische Einsatzmöglichkeiten von Neurotrophinen“ versucht, eine kurze Zusammenfassung
der verschiedenen Einsatzmöglichkeiten von Neurotrophinen bei der Therapie neurodegenerativer
Erkrankungen beim Menschen zu geben.
Diskussion
160
4.11 Ausblick
Die Ergebnisse zur Expression der Neurotrophine BDNF und NT-3 sowie der Neurotrophin
Rezeptoren trk B und trk C zeigen eine Vielzahl von trophischen Mechanismen im untersuchten
Tiermodell auf. Die in der Taube Columba livia auch nach dem Schlupf anhaltende Entwicklung
des retino-tectalen Systems ebenso wie die in diesen Strukturen charakterisierten funktionellen
und morphologischen Asymmetrien bieten eine gute Möglichkeit, in zukünftigen Arbeiten die
Wirkungsmechanismen von Neurotrophinen bei der Etablierung von Hirnasymmetrien, als auch
bei Entwicklungsprozessen von Neuronen zu untersuchen.
•
Durch Störungen der Neurotrophin Expression oder Blockierung der Substanzen zu
entsprechenden Zeitpunkten sollten weitere Aufschlüsse über trophische Signalflüsse und
deren Wirkungen erzielt werden. In weiterführenden Versuchen könnten dabei mittels
eingesetzter Antikörper oder anti-sense Proben gegen BDNF, NT-3, trk B und trk C
intraretinale, intratectale und ebenso retino-tectale trophische Wechselwirkungen studiert
werden. Eine weitere Möglichkeit der Blockade trophischer Signalwege wäre die Applikation
von Colchicin. Das Gift der Herbstzeitlosen depolymerisiert Mikrotubuli, die als Basis für
den schnellen und langsamen anterograden Transport fungieren (McClure 1972, Krah &
Meller, 1999).
•
Insbesondere die tectale Entwicklung bietet die Möglichkeit neuronale Migrationsprozesse
und insbesondere die Zielfindung der Neuronen zu studieren. Hierbei könnten ultrastrukturelle
Untersuchungen, speziell die Immunogold-Methode dazu dienen, eine genaue Lokalisation
von Neurotrophinen und Neurotrophin Rezeptoren in Radialgliazellen zu ermitteln, um somit
Wechselwirkungen von migrierenden Neuronen und Radialglia weitergehend zu erklären.
Diskussion
•
161
Die Ergebnisse zur Expression von BDNF und NT-3 im retino-tectalen System der Taube
legen den Schluß nahe, daß die visuelle Lateralisation in diesen Tieren möglicherweise durch
Neurotrophine beeinflußt wird. Da für die visuelle Lateralisation asymmetrische Lichteinflüsse
verantwortlich sind, könnten Experimente mit dunkel-inkubierten Tieren und anschließenden
quantifizierbaren biochemischen Verfahren möglicherweise Hinweise auf unterschiedlich stark
exprimierte Neurotrophine in der linken versus der rechten Hemisphäre zu gewinnen.
Alternativ bieten sich auch Versuche mit einseitigen Augenklappen oder Tetrodotoxin zur
Verringerung der retinalen Aktivität an.
4.12 Therapeutische Einsatzmöglichkeiten von Neurotrophinen
In der gegenwärtige Arbeit wurden neurotrophe Mechnismen während der Entwicklung und
Etablierung in einem Teilbereich des visuellen Systems anhand der Taube Columba livia
untersucht. Solche, im Tierexperiment gewonnenen Daten bilden zumeist die Basis für das
Verständnis der Wirkungsweise von trophischen Substanzen im Nervengewebe allgemein. Im
folgenden sollen in einem kurzen Überblick therapeutische Ansätze und Erfolge durch den Einsatz
von Neurotrophinen bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen des Menschen
diskutiert werden, wobei tierexperimentelle und humane Arbeiten, welche mögliche
Wirkungsmechanismen erklären helfen, skizziert werden.
Bei einer neurodegenerativen Erkrankung von Motoneuronen im Rückenmark, Hirnstamm und
Cortex, die als amyotrophe laterale Sklerose bezeichnet wird (Rowland, 1987), wurde die
abnorme Expression von Neurofilamenten beobachtet (Cöté et al., 1993). Verschiedene
Experimente konzentrieren sich auf den therapeutischen Einsatz von Neurotrophinen bei dieser
Erkrankung, da insbesondere die im Vorderhorn des Rückenmarks gelegenen MotoNeuronen
einen guten experimentellen Zugang über ihre Axone gewährleisten.
Wie in Tierexperimenten gezeigt wurde exprimieren Motoneuronen den trk B Rezeptor
(Koliatsos et al., 1993). Eine Verletzung der Axone resultiert in einer gesteigerten Expression der
trk B und BDNF Gene in diesen Nervenzellen (Kobayashi et al., 1996). Darüber hinaus in
Zellkulturen gewonnene Daten zeigen, daß BDNF und NT-4 das Überleben der Motoneuronen
fördert (Henderson et al., 1993), ebenso wie in verschiedenen in Hühnchen und Ratte
Diskussion
162
durchgeführten in vivo-Untersuchungen. Die Ergebnisse klinischer Tests zur Wirkung von
Neurotrophinen bei der amyotrophen lateralen Sklerose stehen jedoch noch aus (Hefti, 1997).
Die Degeneration peripherer sensorischer Neuronen wird als sensorische Neuropathie
bezeichnet, und tritt gehäuft bei Diabetes, nach einer Chemotherapie, Alkoholismus, AIDS, oder
durch genetische Defekte bedingt auf (Watkins, 1992). Da Neurotrophine das Überleben
sensorischer Neuronen im Tierexperiment zeigen (Hohn et al., 1990), sind klinische
Anwendungen bei der Therapie dieser Erkrankungen denkbar.
Die meisten sensorischen Neuronen exprimieren Neurotrophin Rezeptoren der trk Familie
(Henderson et al., 1993). So wurde in Nagern durch NGF die sensorische Neuropathie
eingeschränkt (Apfel et al., 1991, 1992). Außerdem zeigte NGF auch Effekte auf das
Immunsystem (Torcia et al., 1996), wie zum Beispiel die stimulierte Histamin Freisetzung aus
Mastzellen (Mazurek, 1986). Aber auch das Neurotrophin NT-3 ist vermutlich für das Überleben
propriozeptiver sensorischer Neuronen verantwortlich (Snider, 1994). In klinischen Tests wird
zur Zeit die Wirkung von Kombinationen aus verschiedenen Neurotrophinen, zum Beispiel durch
synthetisch hergestellte NGF und NT-3 Heterodimere (Treanor et al., 1995), untersucht.
Da bei der Parkinsonschen Krankheit dopaminerge Neuronen in der mesencephalen
Substantia nigra sterben und der Ersatz des von diesen Nervenzellen produzierten
Neurotransmitters L-Dopa bei ständiger Applikation an Wirkung verliert, bieten Neurotrophine
neue therapeutische Ansätze zur Bekämpfung der Krankheit. In Tierexperimenten konnte gezeigt
werden, daß unter anderem BDNF das Überleben von dopaminergen Neuronen fördert (Knusel
et al., 1991; Hyman et al., 1991), wenngleich in adulten Ratten eine neuroprotektive Rolle für
BDNF nach nigrostriataler Transsektion nicht bestätigt werden konnte (Knusel et al., 1992). Die
bislang durchgeführten Experimente sind daher nicht ausreichend, um einen therapeutischen
Einsatz von BDNF zur Abwehr der Degeneration dopaminerger Neuronen bei Parkinson
Patienten sinnvoll erscheinen zu lassen.
Charakteristische Kennzeichen der Alzheimer Krankheit sind Demenzen und der Verlust an
Nervenzellen mit dem Entstehen von Plaques. Vor allem Bereiche im Gehirn, die mit dem
Hippocampus verknüpft sind, werden von der Krankheit betroffen. Im Krankheitsbild besteht
eine direkte Korrelation zwischen dem Verlust an Nervenzellen und Demenzen. Cholinerge
Diskussion
163
Afferenzen bilden den Großteil der Eingangssignale zum Hippocampus, und eine Beeinflussung
dieses Systems resultiert in einer beeinträchtigten Gedächtnisleistung (DeKosky et al., 1992;
Lehericy et al., 1993). In Tierversuchen konnte gezeigt werden, daß durch das Neurotrophin
NGF die Atrophie cholinerger Neuronen vermindert und Gedächtnisleistungen gesteigert wurden
(Hefti et al., 1984, Hefti, 1986). Klinische Daten zur Wirkung von NGF bei Alzheimer Patienten
liegen gegenwärtig nur eingeschränkt vor.
Neben diesen kurz skizzierten, in der Zukunft möglicherweise in der Klinik nutzbaren Ergebnisse,
sind zum Beispiel weitere Einsatzfelder bei Schlaganfall Patienten denkbar. Da nach einem
Schlaganfall häufig Hirngewebe abstirbt, könnte die neuroprotektive Wirkung der Neurotrophine,
die in Tierexperimenten dargestellt wurden (Buttini et al., 1996), neue Ansätze in der
Akuttherapie darstellen.
Allgemeine Zusammenfassung
Das Gehirn der Vertebraten wird in seiner Komplexität von keinem anderen Organ übertroffen. Als
höchstes Koordinationszentrum kennzeichnet es eine hohe Vielschichtigkeit bei der Verarbeitung von
Informationen der Umwelt. Wenngleich das Wissen über einzelne Bauelemente des Gehirns, den
Nervenzellen und Gliazellen, recht gut ist, so sind komplexe Prozesse, wie zum Beispiel die
lateralisierte Verarbeitung von Informationen aus der Umwelt in der linken oder rechten Hemisphäre,
bislang nicht umfassend verstanden. Insbesondere die Wirkungsketten, welche zur Ausbildung
solcher Hirnasymmetrien führen, sind unbekannt.
Grundsätzlich sind alle nervalen Systeme, einschließlich ihrer Musterbildung während der
ontogenetischen Entwicklung determiniert. Die genetische Information allein reicht aber nicht aus,
um sinnvolle Zellkontakte zwischen einzelnen Neuronen zu etablieren, unsinnige hingegen wieder zu
verwerfen. Vielmehr sind weitere Faktoren für das Überleben einzelner Nervenzellen, die korrekte
Verschaltung zwischen den Neuronen sowie der Etablierung von Asymmetrien im Gehirn
erforderlich. Insbesondere den Neurotrophinen, es handelt sich hierbei um endogene, lösliche
Proteine, die das Überleben, das Wachstum, die morphologische Plastizität und die Synthese von
Proteinen in Neuronen regulieren, kommen zahlreiche Funktionen zu, welche sich zum einen auf die
Etablierung nervaler Systeme, zum anderen aber auch auf die ständigen Feinanpassungen des
Systems im adulten Tier beziehen.
In der vorliegenden Arbeit wurden mögliche Funktionen der beiden Neurotrophine BDNF (brainderived neurotrophic factor) und NT-3 (neurotrophin-3) während der Entwicklung des Sehsystems
der Taube Columba livia untersucht. Es handelt sich hierbei um ein System mit deutlichen
morphologisch und funktionell charakterisierten Asymmetrien, die sich in einem Zeitraum von zirka
zwanzig Tagen, beginnend vier Tage vor dem Schlupf, unter dem Einfluß einer asymmetrischen
Lichtstimulation im Taubenei etablieren.
Funktionell zeigen die Tiere eine Dominanz des rechten Auges, und aufgrund der exklusiven
Verschaltung mit der linken Hirnhälfte auch eine Dominanz dieser bei der Erkennung und
Verarbeitung von Objektinformationen und geometrischen Illusionen, im visuellen Gedächtnis, und
beim Zurückfinden zu ihrem Heim über ein bekanntes Gebiet, sofern die Tiere mit dem rechten Auge
sehen können. Auf mikroskopischer Ebene lassen sich in histologischen Untersuchungen strukturelle
Korrelate dieser funktionellen Lateralisation erkennen, die sich in signifikant stärkeren Projektionen
der rechten auf die linken Hemisphäre als umgekehrt sowie links-hemisphärisch größeren
Nervenzellen ausdrücken.
Für die Etablierung dieser Asymmetrien verantwortlich ist ein exaktes Zusammenspiel genetischer
Faktoren und von Umwelteinflüssen während einer kritischen Phase der Entwicklung des visuellen
Systems. Eine genetisch determinierte einseitige Expression bestimmter Signalmoleküle steuert
zunächst eine Rotation des Taubenembryos im Ei, und diese Position des Embryos im Ei wiederum
bedingt eine Abschattung des linken Auges durch den Körper, während das rechte Auge der Eischale
zugewandt ist. Durch die Eischale eindringendes Licht, welches primär vom rechten Auge
empfangen werden kann, ist bei der Taube der Umweltfaktor, welche die Ontogenese der visuellen
Lateralisation des Taubengehirns in einem Zeitraum von zwei bis drei Wochen nach dem Schlupf
steuert.
In der von mir angefertigten Dissertation stellte sich nun die Frage, über welche Mechanismen diese
asymmetrische Lichtstimulation in ein für Nervenzellen erkennbares Signal transferiert wird. Mit
Hilfe verschiedener histologischer Untersuchungen, die am Lichtmikroskop, Fluoreszenzmikroskop
und ultrastrukturell am Elektronenmikroskop ausgewertet wurden, konnte gezeigt werden, daß
Neurotrophine eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung nervaler Strukturen der Taube spielen.
Sowohl in der Netzhaut der Tiere, als auch in den nachfolgenden Gebieten der visuellen Verarbeitung
werden diese Proteine produziert. Ein sehr interessanter Befund der Arbeit war hierbei, daß
Neurotrophine vermutlich auch an der Zellmigration, daß heißt dem Auswandern von Nervenzellen
von ihrem Entstehungsort zu ihrem Zielgebiet im Hirngewebe eine entscheidende Rolle spielen. Mit
Hilfe der elektronenmikroskopischen Untersuchungen gelang es, die genauen Signalwege zwischen
der Netzhaut und den nachfolgenden Hirnstrukturen zu erfassen, wobei das Neurotrophin NT-3
vornehmlich Entwicklungsprozesse der Verbindungen zwischen dem Auge und dem Gehirn reguliert,
während BDNF darüber hinaus auch in den erwachsenen Tieren eine ständige Feinanpassung des
Systems ermöglicht.
Auf Grund der in der vorliegenden Arbeit gewonnen Daten ist eine Beteiligung von BDNF und NT-3
an der Etablierung von Hirnasymmetrien in der Taube sehr wahrscheinlich. In der jungen Taube
stabilisieren BDNF und NT-3 vermutlich morphologische Charakteristika von Nervenzellen, wie zum
Beispiel die Größe der Nervenzellen oder deren Verzweigungen, und regulieren somit morpholgische
Asymmetrien, die wiederum die Grundlage der funktionellen Lateralisation sind. Ob Neurotrophine
auch primär das Umweltsignal Licht in eine für Nervenzellen verständliche Form übersetzen, oder
Ihrerseits wiederum Teil einer größeren Signalkaskade sind, bleibt bislang noch unbeantwortet.
Literatur
6
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Erklärung:
Ich versichere, daß ich die von mir vorgelegte Dissertation selbständig und ohne
unzulässige Hilfe angefertigt und die benutzten Quellen und Hilfsmittel vollständig
angegeben habe, daß diese Dissertation noch keiner anderen Fakultät zur Prüfung
vorgelegen hat, daß sie abgesehen von der unten angegebenen Teilpublikation noch nicht
veröffentlicht worden ist sowie, daß ich eine solche Veröffentlichung vor Abschluß des
Promotionsverfahrens nicht vornehmen werde. Die Bestimmungen der geltenden
Promotionsordnung sind mir bekannt.
Ein Teil der Ergebnisse wurde an folgender Stelle veröffentlicht:
Theiss, C, Güntürkün, O (1998) „NT-3 and trk C expression in the developing
retinotectal system in pigeons.“ In: Göttingen Neurobiology Report 1998, Proceedings of
the 26th Göttingen Neurobiologen Conference, Vol. II (Elsner, N. and Wehner, R., eds), G.
Thieme Verlag Stuttgart, New York, S. 489 (Abstract).