vts_7397_10501. - OPARU

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Universitätsklinikum Ulm
Zentrum für Chirurgie
Klinik für Allgemein-, Viszeral- und Transplantationschirurgie
Prof. Dr. Doris Henne-Bruns
TRANSKRIPTIONSANALYTISCHE UND IMMUNHISTOCHEMISCHE
UNTERSUCHUNG ZELLZYKLUSASSOZIIERTER GENE IN
GASTROINTESTINALEN STROMATUMOREN
UNTER BESONDERER BERÜCKSICHTIGUNG
DES PRÄDIKTIVEN WERTS VON CYCLIN H
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm
Julian Dorn, Nürnberg
2010
Amtierender Dekan:
Prof. Dr. rer. nat. Thomas Wirth
1. Berichterstatter:
Prof. Dr. biol. hum. Uwe Knippschild
2. Berichterstatter:
Prof. Dr. rer. biol. hum. Reinhold Schirmbeck
Tag der Promotion:
29.10.2010
Index
Inhaltsverzeichnis
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen und Kurzbezeichnungen
1.
Einleitung ....................................................................................................................... 1
1.1.
Neoplasien .............................................................................................................. 1
1.2.
Gastrointestinale Stromatumoren (GIST) ............................................................... 3
1.2.1.
Historische Entwicklung und Definition .......................................................... 3
1.2.2.
Epidemiologie .................................................................................................. 3
1.2.3.
Morphologie und Histologie ............................................................................ 5
1.2.4.
Klassifikation und Prognose............................................................................. 6
1.2.5.
Molekulare Pathogenese ................................................................................. 7
1.2.6.
Klinik und Therapie .......................................................................................... 9
1.3.
2.
Fragestellung......................................................................................................... 11
Material und Methoden .............................................................................................. 12
2.1.
Materialien und Geräte ........................................................................................ 13
2.1.1.
Gewebeproben .............................................................................................. 13
2.1.2.
Fertige Gemische, Lösungen & Reagenziensets ............................................ 13
2.1.3.
Chemikalien ................................................................................................... 14
2.1.4.
Geräte ............................................................................................................ 15
2.1.5.
Verbrauchsmaterialien .................................................................................. 16
2.2.
Methoden ............................................................................................................. 17
2.2.1.
Asservierung der Gewebeproben.................................................................. 17
2.2.2.
Histologie – Analysen des Gradings und der Gewebemorphologie .............. 18
2.2.3.
Genetik – Analysen der Gentranskription ..................................................... 20
2.2.4.
Immunhistologie – Analysen der Proteinexpression .................................... 26
2.2.5.
EDV-gestützte Auswertung, Statistik und Erstellung von Grafiken ............... 29
I
Index
3.
Ergebnisse .................................................................................................................... 30
3.1.
Histologie – Analysen des Gradings und der Gewebemorphologie ..................... 30
3.2.
Genetik – Analysen der Gentranskription ............................................................ 32
3.2.1.
Vergleichende Analyse von Tumor- und Normalgewebe ............................. 32
3.2.2.
Vergleichende Analyse zweier Tumorrezidive im Verlauf ............................. 34
3.2.3.
Vergleichende Analyse von Tumoren unterschiedlichen Gradings .............. 35
3.3.
4.
Immunhistochemie – Analysen der Proteinexpression ........................................ 43
Diskussion .................................................................................................................... 49
4.1.
Epidemiologie und klinisches Erscheinungsbild des Versuchskollektivs .............. 50
4.2.
Prädiktiver Wert der Expression von Cyclin H (CCNH).......................................... 51
4.3.
Auffälligkeiten bei weiteren Genen des Cyclin-CDK-Systems .............................. 52
4.4.
Inhibitoren des Cyclin-CDK-Systems ..................................................................... 55
4.5.
Auffällige Gene außerhalb des Cyclin-CDK-Systems ............................................. 58
4.6.
Résumé – Das Cyclin-CDK-System in der Diagnostik & Therapie von GIST ............. 60
5.
Zusammenfassung ....................................................................................................... 61
6.
Literaturverzeichnis ..................................................................................................... 63
II
Abkürzungsverzeichnis
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen und Kurzbezeichnungen
Abkürzungen:
Abb.
Abbildung
ad
auf (Auffüllen bis zu genannter Menge)
cDNA
complementary DNA (komplementär-DNS)
Ct
threshold cycle (Schwellen-Zyklus)
ddH2O
doppelt destilliertes Wasser
dest.
destillata (destilliert)
DNA
deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)
DOG1
discovered on GIST-1
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
eGIST
Extragastrointestinaler Stromatumor
G1-Phase
gap1-Phase (Präsynthesephase)
G2-Phase
gap2-Phase (Postsynthesephase)
GIST
Gastrointestinaler Stromatumor
H2O
Wasser
HCl
Salzsäure
HPF
high-power field (Gesichtsfeld bei 40x Vergrößerung ≈ 0,1 - 0,2 mm²)
M-MLV
Moloney murine leukemia virus
M-Phase
Mitosephase
MR
Malignitätsrisiko (risk of malignancy nach Fletcher et al.)
mRNA
messenger RNA (Boten-RNS)
PCR
polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion)
PIP2/PIP3
Phosphatidylinositol -4,5-bisphosphat / -1,4,5-trisphosphat
PKCθ
Proteinkinase C-theta
puriss.
purissimum (Reinheit ≥ 98,5 %)
qRT-PCR
quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion
RD
relative deviation (Relative Abweichung)
Rez/Met
Rezidiv/Metastase
RNA
ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)
RPE
Puffer-Bezeichnung aus dem RNeasy-Kit der Firma Qiagen
RQ
relative quantitation (Relative Quantifizierung)
RW1
Puffer-Bezeichnung aus dem RNeasy-Kit der Firma Qiagen
S.
Seite
III
Abkürzungsverzeichnis
S-Phase
Synthesephase
STI571
Entwicklungsbezeichnung des Arzneimittelwirkstoffs Imatinib
Tab.
Tabelle
TAE
TRIS-Acetat-EDTA
TFÜ
tumorfreies Überleben ( = DFS, disease-free survival)
TRIS
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
TSÜ
tumorspezifisches Überleben ( = DSS, disease-specific survival)
vs.
versus (gegenüber)
Gen & Proteinbezeichnungen:
Die verwendeten Kurzbezeichnungen folgen in der Regel den Bestimmungen des Gene
Nomenclature Committees (HGNC) der Human Genome Organisation. Entsprechend werden Gene kursiv, Proteine hingegen in normaler Schrift bezeichnet.
In einigen Sonderfällen, in denen eine andere Schreibweise gebräuchlicher ist wird der
besseren Verständlichkeit halber diese Bezeichnung verwendet (z.B. mTOR, p16, NFκB).
ABL1
Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1
ACTB
actin, beta
AKT1
v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1 (protein kinase B)
BCL2
b-cell CLL/lymphoma 2
BCR
breakpoint cluster region
BCR-ABL
Fusionsgen aus BCR & ABL1, Produkt des Philadelphia Chromosoms
BRCA2
breast cancer 2, early onset
CAK
cyclin-dependent kinase (CDK) activating kinase
CCNx
cyclin x (z.B. CCNH für Cyclin H)
CDC2
cell division cycle 2 ( = CDK1)
CDKNxx
cyclin-dependent kinase inhibitor xx (z.B. CDKN2A)
CDKx
cyclin-dependent kinase x (z.b. CDK2)
CIP/KIP
CDK-Inhibitorfamilie (CDK inhibiting protein/kinase inhibiting protein)
ERKx
extracellular signal-regulated kinase x (z.B. ERK1/2 = MAPK3/1)
GRB2
growth factor receptor-bound protein 2
HPRT1
hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1
IGF1R
insulin-like growth factor 1 receptor
INK4
CDK-Inhibitorfamilie (inhibitors of CDK4)
IRS1
insulin receptor substrate 1
IV
Abkürzungsverzeichnis
JAK
januskinase
KI67
antigen identified by monoclonal antibody Ki-67 (Gen = MKI67)
KIT
Humanes Homolog (CD117) des Protoonkogens v-kit aus dem HardyZuckerman 4 feline sarcoma virus (HZ4-FeSV)
MAP2Kx
mitogen-activated protein kinase kinase x (z.B. MAP2K1)
MAP3Kx
mitogen-activated protein kinase kinase kinase x (z.B. MAP3K1)
MAP-Kinase x
mitogen-activated protein kinase x (z.B. MAPK1)
MAPKx
mitogen-activated protein kinase x (z.B. MAPK1)
MAT1
menage à trois 1
MDM2
mdm2 p53 binding protein homolog
MEF2C
MADS box transcription enhancer factor 2, polypeptide C
MEKKx
mitogen-activated protein kinase kinase kinase x (z.B. MEKK1)
MEKx
mitogen-activated protein kinase kinase x (z.B. MEK1)
mTOR
mammalian target of rapamycin (Gen = FRAP1)
MYC
v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog
NFκB1
nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 1
p15
cyclin-dependent kinase inhibitor 2B (Gen = CDKN2B)
p16
cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (Gen = CDKN2A)
p18
cyclin-dependent kinase inhibitor 2C (Gen = CDKN2C)
p19
cyclin-dependent kinase inhibitor 2D (Gen = CDKN2D)
p21
cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (Gen = CDKN1A)
p27
cyclin-dependent kinase inhibitor 1B (Gen = CDKN1B)
p53
tumor protein p53 (Gen = TP53)
p57
cyclin-dependent kinase inhibitor 1C (Gen = CDKN1C)
PDGFRA
platelet-derived growth factor receptor, alpha
PI3K
Phosphoinositol-3-Kinase
PRKCA
protein kinase C, alpha
RAF1
Humanes Homolog des v-raf-1 murine leukemia viral oncogene 1
RAS
RAS-oncogene superfamily (rat sarcoma viral oncogene homolog)
Rb
retinoblastoma 1 (Gen = RB1)
RPRM
reprimo, TP53 dependent G2 arrest mediator candidate
S100
S-100 calcium-binding protein
SCF
stem cell factor, Ligand von KIT, Produkt des Gens KITLG
SOS
son-of-sevenless protein
STATx
signal transducer and activator of transcription x (z.B. STAT1)
v-kit
Protoonkogens des v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma virus
V
Abkürzungsverzeichnis
SI-Einheiten:
m
Meter
g
Gramm
l
Liter
h
Stunde(n)
min
Minute(n)
sek
Sekunde(n)
V
Volt
°C
Grad Celsius
mol
Stoffmenge
M
Molarität
Präfixe:
c-
Zenti-
m-
Milli-
μ-
Mikro-
n-
Nano-
VI
Einleitung
1.
Einleitung
1.1.
Neoplasien
Neoplasien heute mit 25 % an
zweiter Stelle der Todesursachenstatistik [109].
kardiovaskulären
Allein
die
Erkrankungen
fordern jährlich mehr Opfer und
wenn der Trend der letzten Jahrzehnte anhält, wird sich dieses
Verhältnis in naher Zukunft umkehren (Abb. 1) [59].
Todesfälle pro 100 000 Einwohner
In der westlichen Welt stehen
550
500
450
Kardiale Erkrankungen
400
350
300
250
Maligne Neoplasien
200
150
100
Zerebrovaskuläre Erkrankungen
50
0
1970 1974 1978 1982 1986 1990 1994 1998 2002 2006 2010 2014
Sterbejahr
Abb. 1: Altersstandardisierte Entwicklung der drei häufigsten
Todesursachen in den USA zwischen 1970 und 2002 [59] mit grafischer Trendprognose
Die Theorie, dass Tumoren durch Veränderungen im genetischen Material der Zellen verursacht werden, entwickelte der deutsche Biologe Boveri bereits im Jahr 1914 [42]. Erst
knapp 50 Jahre später gelang Nowell mit der Entdeckung des Philadelphia-Chromosoms
bei chronisch myeloischer Leukämie der Nachweis einer konstant auftretenden Chromosomenaberration bei einer Krebserkrankung [92].
Durch die Erforschung weiterer Tumorarten wurde erkannt, dass in der Ätiopathogenese
meist nicht nur eine einzelne Mutation nötig ist, sondern die Tumorentstehung als Mehrschritt-Prozess zu verstehen ist [124]. Aus normalen Zellen entstehen im Laufe mehrerer
Teilungen und Mutationen Hyperplasien, Atypien, in situ Neoplasien und schließlich invasive Tumoren. Mit jedem dieser Stadien gewinnen sie charakteristische neue Merkmale
wie Immortalisierung oder erhöhte Proliferationsrate hinzu. Heute ist diese, als multi-hitModell bezeichnete, Theorie der Kanzerogenese unumstritten und die Forschung konzentriert sich auf das immer genauere Verständnis der molekularen Veränderungen in
den verschiedenen Tumorentitäten.
Ein Ergebnis dieser Bemühungen ist die Erkenntnis der Funktionsweise und Bedeutung
der Epigenetik. Nach dem heutigen Stand ist bereits eine Vielzahl verschiedener Einflüsse
mit ganz unterschiedlichen Ansatzpunkten bekannt. Histonmodifikationen wie die Acetylierung verschiedener Aminosäurereste beeinflussen die Nukleosomenauffaltung. Stark
1
Einleitung
aufgefaltete DNA kann weniger gut abgelesen werden, weshalb dieser Vorgang als „silencing“ bezeichnet wird. Auch der DNA-Strang selbst kann, bei konstanter Basensequenz,
epigenetisch verändert werden. Durch enzymatische Methylierung von Promotorregionen wird die Transkriptionshäufigkeit vieler Gene reguliert und im Verlauf von Replikationsvorgängen auftretende Punktmutationen können behoben werden. Zu diesem Zweck
detektieren Reparaturproteine den älteren Strang anhand seiner stärkeren Methylierung
und ersetzen dann die fehlerhafte Base im Komplementärstrang [118].
Es gibt drei große Gruppen von Genen, die bei der Tumorentstehung eine Rolle spielen:
Onkogene, Tumorsuppressorgene und Mutatorgene.
Onkogene sind eine deregulierte Form von Protoonkogenen, die physiologischerweise
z.B. Wachstums- oder Transkriptionsfaktoren kodieren und die Zellproliferation anregen.
Im normalen Zellzyklus ist die Expression dieser Gene genau reguliert und von vielen verschiedenen Einflüssen abhängig. Wachstumsfaktoren, welche als Mediatoren an Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden, können intrazelluläre Signaltransduktionswege aktivieren und so zur physiologischen Expression verschiedener Protoonkogene führen. Von
einem Onkogen spricht man, wenn diese Regulation gestört ist und das betreffende Gen
unkontrolliert in zu großen Mengen oder zur falschen Zeit exprimiert wird, was in einer
pathologisch erhöhten Wachstums- und Teilungsrate resultiert.
Tumorsuppressorgene zeigen eine den Onkogenen entgegengesetzte Wirkung. Ihre Produkte sind proliferationshemmend, woraus sich eine Kontrollfunktion über den Zellzyklus
ergibt. Suppressorgene verhalten sich in der Regel dominant. Um die Proliferationsrate
merklich zu beeinflussen, muss ein Gen also meist auf beiden Allelen inaktiviert sein.
Die von Mutatorgenen kodierten Proteine überprüfen die Intaktheit des Genoms der Zelle. Treten in einer Zelle genetische Schäden auf, blockieren sie das Voranschreiten des
Zellzyklus, bis die Schäden repariert wurden. Dies verhindert die Vererbung genetischer
Defekte an Tochterzellen. Wie bei den Tumorsuppressorgenen müssen beide Allele beschädigt sein, damit ihre Funktion ausfällt [94, 95].
Die Kenntnis der pathologisch relevanten Gene einer Tumorart ist Grundlage für die Entwicklung neuer Therapieansätze. Da es leichter ist bestehende Vorgänge zu blockieren als
Fehlende zu ersetzen, sind die Onkogene und entsprechende Inhibitoren das Primärziel
der Forschung. Imatinib ist ein Beispiel eines solchen „small-molecule Inhibitors“, der
entwickelt wurde um das Fusionsprodukt des Philadelphia-Chromosoms, die Tyrosinkina2
Einleitung
se BCR-ABL, zu inhibieren [21]. Um Nebenwirkungen zu verringern, wird versucht die Inhibitoren möglichst selektiv zu gestalten, jedoch gelingt das wegen der Vielzahl und Ähnlichkeit der körpereigenen Proteine nie vollständig. Im konkreten Fall von Imatinib birgt
dieser Mangel an Selektivität jedoch auch einen Vorteil: Imatinib inhibiert neben BCR-ABL
auch die verwandten Rezeptortyrosinkinasen KIT und PDGFRA, welche eine Schlüsselrolle
in der Pathogenese der Gastrointestinalen Stromatumoren einnehmen [21].
1.2.
Gastrointestinale Stromatumoren (GIST)
1.2.1.
Historische Entwicklung und Definition
Gastrointestinale Stromatumoren sind eine verhältnismäßig junge Tumorentität, welche
in den letzten Jahren ein schnell zunehmendes wissenschaftliches Interesse auf sich gezogen hat. Bis vor gut 20 Jahren wurden nahezu alle mesenchymalen Tumoren des Gastrointestinaltraktes aufgrund ihrer histomorphologischen Ähnlichkeit als Tumoren glattmuskulären oder neuronalen Ursprungs eingestuft. In Abhängigkeit vom Erscheinungsbild
im Einzelfall wurden sie den Leiomyomen, Leiomyoblastomen, epitheloiden Leiomyosarkomen oder auch den Schwannomen und Neurofibromen zugesprochen [79]. Die Entwicklung neuer diagnostischer Möglichkeiten zeigte jedoch, dass sich ein Großteil der
Tumoren weder einem neurogenen (S100-negativ), noch einem myogenen Ursprung
(elektronenmikroskopisch keine Aktin-Myosin-Filamente nachweisbar) zuordnen ließen.
Als Folge wurde 1983 der Begriff „Gastrointestinaler Stromatumor“ (GIST) als Sammelbezeichnung für diese Tumoren unbekannter Abstammung eingeführt [74]. Der nächste
entscheidende Schritt in der Erforschung von GIST gelang 1998, als Hirota et al. erstmals
eine gain-of-function Mutation im Gen der Rezeptortyrosinkinase KIT beschrieben [51].
Diese Entdeckung legte nicht nur eine Verwandtschaft mit den Cajalschen Zellen nahe,
darüber hinaus stellt KIT bis heute sowohl das wichtigste diagnostische Merkmal, als auch
das wichtigste therapeutische Target dar [64].
1.2.2.
Epidemiologie
Obwohl sie die größte Gruppe unter den mesenchymalen Tumoren des Magen-DarmTraktes ausmachen, handelt es sich bei GIST dennoch um eine seltene Erkrankung [81].
Populationsbezogene Studien in Island und Schweden zeigten eine jährliche Inzidenz von
1,1 bzw. 1,4 pro 100 000 [90, 121]. Unter der Annahme einer vergleichbaren Inzidenz
3
Einleitung
würde das für Deutschland 900 bis 1 200 Neuerkrankungen pro Jahr bedeuten. Angesichts
der kurzen Geschichte der Tumorentität, der rasanten Entwicklung der diagnostischen
Möglichkeiten im vergangenen Jahrzehnt und dem damit verbundenen Anstieg der Diagnosezahlen, gibt es jedoch verschiedene Stimmen die davon ausgehen, dass die tatsächliche Inzidenz von GIST noch immer unterschätzt wird [36, 39, 81]. So nehmen Fletcher et
al. eine Inzidenz von 1,7 bis 2,0 pro 100 000 an [36].
GIST sind eine Erkrankung der zweiten Lebenshälfte und treten überwiegend nach dem
50. Lebensjahr auf. Der Krankheitsgipfel liegt bei einem Alter von 55 bis 65 Jahren (Median ca. 60 Jahre) und der Anteil von Patienten unterhalb des 40. Lebensjahres liegt zwischen 5 und 20 Prozent [81, 120]. Das Verhältnis von männlichen zu weiblichen Patienten
schwankt je nach betrachteter Arbeit 10 Prozentpunkte um eine ausgeglichene Verteilung. Es ist also keine klare Geschlechtsprädilektion für GIST erkennbar, allerdings beschreiben einige Autoren einen geringfügig höheren Anteil maligner Verläufe im männlichen Subkollektiv [82-84, 120].
Die Primärtumoren können vom Ösophagus bis zum Rektum im gesamten Gastrointestinaltrakt lokalisiert sein, wobei sie am häufigsten im Magen (60 %) und im Dünndarm
(30 %) angesiedelt sind [36, 83]. In seltenen Fällen wurden auch an Lokalisationen außerhalb des Gastrointestinaltraktes wie den Mesenterien oder im Omentum Primärtumoren
gefunden (extragastrointestinaler Stromatumor, eGIST) [78, 98, 129].
Im Jugend- und Kindesalter sind GIST ausgesprochen selten. Die beschriebenen Fälle betreffen vorwiegend weibliche Patienten im Alter zwischen 10 und 20 Jahren und treten
gehäuft in Verbindung mit genetischen Tumor-Syndromen wie der Carney Triade oder
Neurofibromatose auf [40]. Auch im Erwachsenenalter ist die hohe Koinzidenz von GIST
mit Zweitneoplasien auffällig. Meist werden Werte zwischen 4 und 11 % angegeben, in
manchen Studien hatten jedoch allein 6 % der GIST-Patienten Neurofibromatose, was
einer 180-fachen Häufung gegenüber dem Bevölkerungsdurchschnitt entspricht [80, 83].
Man vermutet für neurofibromatoseassoziierte GIST jedoch eine andere Pathogenese, da
in diesen Fällen weder KIT-, noch PDGFRA-Mutationen gefunden wurden [66, 97].
In der Literatur finden sich außerdem elf Beispiele familiärer GIST-Syndrome, von welchen
zehn eine Keimbahnmutation im KIT-Gen aufweisen [3].
4
Einleitung
1.2.3.
Morphologie und Histologie
Makromorphologisch imponieren GIST meist als klar abgrenzbare halbkugel- oder kugelförmige Knoten. Abhängig von ihrer Größe wölben sie sich vorerst submukös in das Lumen der Hohlorgane vor, bilden mit zunehmendem Durchmesser jedoch normalerweise
der Außenseite anhängende subseröse Knoten mit unterschiedlich breiter Basis. Große
Tumoren sind zentral häufig zystisch-nekrotisch verändert und besitzen nur einen schmalen Randsaum vitalen Tumorgewebes, wobei das genaue Erscheinungsbild in Abhängigkeit von der Lokalisation leicht variiert [81].
Histologisch zeigen sich GIST in den meisten Fällen als zellreiche, spindelzellige (70 - 86 %)
oder epitheloide (5 - 20 %) Tumoren, sie können jedoch auch gemischt (9 %) oder zu einem kleinen Prozentsatz pleomorph (< 2 - 3 %) sein [36, 84]. Diagnostisch ist bisher immunhistochemische Positivität für KIT (CD117), welche in über 90 % vorliegt, das entscheidende Merkmal. Aktuelle Studienergebnisse an 1168 GIST zeigen discovered on
GIST-1 (DOG1) als einen nahezu gleichwertigen Marker [85]. Auch die Expression der Protein-Kinase-C-theta (PKCθ) wurde als ähnlich spezifischer Marker beschrieben [7, 19, 29,
86]. Beide Marker haben zunehmend Einzug in die Routinediagnostik gefunden. DOG1
oder PKCθ können die Diagnose in Grenzfällen erheblich erleichtern (> 90 % positiv in
GIST).
Ein weiteres Antigen, welches sowohl in GIST des Magen-Darm-Traktes, als auch in GIST
anderer Lokalisationen durchgehend nachgewiesen werden kann ist Nestin [122]. Allerdings ist Nestin-Positivität nicht pathognomonisch, da es auch in anderen Tumorentitäten
wie Schwannomen exprimiert wird [103]. Desweiteren sind etwa 70 % der GIST positiv für
CD34 [36].
5
Einleitung
1.2.4.
Klassifikation und Prognose
Gastrointestinale Stromatumoren zeigen ein sehr variables Wachstumsverhalten. Bei vielen Patienten wachsen die Tumoren lange nichtinvasiv-verdrängend und ohne ausgeprägte Metastasierungstendenz. Andererseits finden sich auch schon primär metastasierte
Manifestationen [36, 82, 84]. Bis heute sind keine prädiktiven Merkmale bekannt, mit
deren Hilfe man den Krankheitsverlauf im Einzelfall zuverlässig prognostizieren könnte.
Zur Abschätzung des Risikos für maligne Verläufe erfolgt das individuelle Grading aus diesem Grund nach den Kriterien von Fletcher et
al., die während des GIST-Symposiums im
Jahr 2002 definiert wurden und die Tumoren
in Abhängigkeit ihres maximalen Durchmessers und der Mitoserate (gemessen auf 50
high
power
fields
(40 x
Vergrößerung
≈ 5 - 10 mm²) in verschiedene Risikogruppen
unterteilt (Tab. 1) [36, 80, 83]. Später entwi-
Tab. 1: Klassifikation Gastrointestinaler Stromatumoren
bezüglich des Risikos für malignes Verhaltens nach
Fletcher et al. [36]. (Kriterien: Maximaler Durchmesser
in Zentimetern und Mitoserate auf 50 high-power-fields
(HPF))
Risikogruppe
Sehr-Niedrig
Niedrig
Mittel
Hoch
ckelten Miettinen et al., Hornick et al. und
Durchmesser
in cm
Mitoserate
auf 50 HPF
<2
≥2-<5
<5
≥ 5 - < 10
>5
> 10
jede Größe
<5
<5
≥ 6 - < 10
<5
>5
jede Rate
> 10
Joensuu et al. Abwandlungen der Fletcher-Klassifikation, welche zusätzlich die Lokalisation des Primarius, sowie die Frage nach einer Tumorruptur mit einbeziehen [55, 60, 83].
Tab. 2: Klassifikation Gastrointestinaler Stromatumoren bezüglich des Risikos der Krankheitsprogression nach Miettinen et al. [83]. (Kriterien: Maximaler Durchmesser in Zentimetern, Mitoserate auf 50 high-power-fields (HPF) und Lokalisation des Primärtumors)
Gruppe
1
2
3
3a
3b
4
5
6
6a
6b
Durchmesser
in cm
≤2
>2-≤5
> 5 - ≤ 10
> 10
≤2
>2-≤5
> 5 - ≤ 10
>10
Mitoserate
auf 50 HPF
≤5
>5
Progressionsrisiko nach
Lokus des Primärtumors
Magen
Dünndarm
Sehr-Niedrig
Niedrig
Niedrig
Mittel
Niedrig
Mittel
Hoch
Hoch
Sehr-Niedrig
Niedrig
Mittel
Hoch
Hoch
Hoch
Hoch
Hoch
6
Einleitung
1.2.5.
Molekulare Pathogenese
Nach dem aktuellen Forschungsstand werden gain-of-function-Mutationen des Protoonkogens KIT als ursächlich für die Entstehung von über 90 % der GIST angenommen und
etwa ein Drittel bis die Hälfte der Tumoren, die keine KIT-Mutation aufweisen, besitzen
Mutationen im Gen PDGFRA (platelet derived growth factor receptor, alpha) welche einen analogen Effekt auslösen [83]. KIT ist das auf Chromosom 4 lokalisierte humane Homolog des 1986 entdeckten v-KIT (Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene) und
kodiert den Tyrosinkinaserezeptor KIT [6]. Die Bezeichnung leitet sich von der genomischen Sequenz 5' Δgag-kit-Δpol-Δenv 3' des felinen Sarkomvirus ab. Die häufigsten Mutationen treten in den Exonen 11 (60 - 70 %) und 9 (ca. 10 %) auf und betreffen die Autophosphorylierungsinhibition und die Dimerisierungsdomäne des Rezeptors. Seltener sind
die Exone 13 und 17 betroffen (je ca. 1 %), welche die ATP-Bindungs- und die Phosphotransferasedomäne kodieren [15, 76]. Gemeinsame Folge aller Mutationen ist eine
von ihrem natürlichen Liganden
KITRezeptor
SCF (stem cell factor) unabhän-
Zellmembran
gige Aktivität der Kinase durch
Trans- oder AutophosphorylierSOS
ung mit nachfolgender Aktivie-
JAK
GRB2
MAPK
JAK/STAT
RAS
rung der KIT-assoziierten Sig-
STAT
IRS1
naltransduktionskaskaden. Die-
RAF1
PI3K
se beinhalten unter anderem
STAT
PI3K-AKT
AKT1
den MAP-Kinase Weg, PI3K-AKT
MEK1/2
mTOR
und JAK/STAT [5, 70, 93, 119].
Jede der drei Kaskaden umfasst
eine Vielzahl von second messenger-Stoffen und Effektorproteinen. Um einen grundlegenden Überblick zu ermöglichen,
stellt
die
Abbildung 2
ERK1/2
NFκB
MDM2
Kernmembran
ERK1/2
NFκB
p53
Proliferation ApoptoseERK1/2
inhibition
ERK1/2
Proliferation
STAT
STAT
Proliferation
eine
Auswahl der wichtigsten Transduktionsschritte dar:
Proteinsynthese
Abb. 2: Die Signaltransduktionskaskaden MAPK (mitogen-activated
protein kinase), PI3K-AKT (phosphoinositol-3-kinase/protein kinase B)
und JAK/STAT (januskinase/signal transducer and activator of transcription) als Hauptwege der intrazellulären Signalweiterleitung der Rezeptortyrosinkinase KIT [2, 5, 26]
7
Einleitung
1.
Mitogen-aktivierter Proteinkinase Weg (MAPK): Die Aktivierung erfolgt über die bei-
den Protoonkogen-Produkte RAS und RAF1. RAF1 fungiert als MAP3K, welche über Phosphorylierung die Kinasen MEK1 und MEK2 aktiviert. Diese aktivieren ihrerseits als MAP2Ks
die Serin/Threonin-Kinasen ERK1 & 2. ERKs (extracellular signal-regulated kinases) stellen
die letzte Ebene der MAPK-Kaskade dar und translozieren in ihrer aktiven Form in den
Zellkern, wo sie nukleäre Ziele wie die proliferationsfördernden Transkriptionsfaktoren
ELK1 und MYC aktivieren [2, 17].
2.
Die PI3K-AKT-Kaskade hat sowohl antiapoptotische als auch translationsfördernde
Wirkung.
Phosphatidylinositol-3-Kinase
aktiviert
über
eine
Verschiebung
des
PIP2/PIP3-Gleichgewichts AKT1 (Proteinkinase B, alpha), was die subsequentielle Aktivierung von beispielsweise mTOR, NFκB und MDM2 einleitet [2, 5, 119].
3.
Der dritte bedeutende Signalweg führt über die Januskinase JAK2. Diese aktiviert die
STAT-Proteine 1, 3 & 5, welche dimerisieren und ein nukleäres Lokalisationssignal präsentieren. Es ermöglicht ihnen in den Nukleus einzuwandern, wo sie direkt als Transkriptionsfaktoren wirken [2, 10, 30].
Eine gemeinsame Endstrecke der drei dargestellten Kaskaden ist das Cyclin-CDK-System,
welches einer der zentralen Regulationsmechanismen des Zellzyklus ist. Es besteht aus
über einem Dutzend verschiedener Kinasen, welche den Übertritt der Zelle in die verschiedenen Zyklusstadien kontrollieren (z.B. G1/S- und G2/M-Kontrollpunkt; Abb. 3).
Die aktiven Kinasen des Systems bestehen jeweils aus einem Cyclin als regulatorische Untereinheit und einer Cyclin-abhängigen Kinase (CDK) [38, 48, 87]. Entsprechend weisen
Cycline die namensgebenden zyklisch variierenden Expressionsmuster auf, wohingegen
die CDKs eher kontinuierlich exprimiert werden [58].
Den CDKs stehen verschiedene Inhibitoren gegenüber, wovon sich die meisten zu zwei
größeren Gruppen zuordnen lassen. Einerseits die KIP/CIP-Inhibitoren, welche mehrere
verschiedene CDKs hemmen können und andererseits eine Gruppe von Inhibitoren, welche spezifisch mit CDK4 und CDK6 interagieren, und unter der Bezeichnung INK4 zusammengefasst werden [24]. Als weitere inhibitorische Einflüsse sind Proteinkinase C und
Reprimo zu erwähnen [47].
8
Einleitung
CAK CyclinH
MAT1
INK4
p15
CyclinB P
CDK1
p16
p18
CDK7
p19
M
P
G2
CyclinB
CDK1
G1
S
CyclinD P
CDK4/6
CyclinA P
CDK2
p57
p27
KIP/CIP
p21
CyclinE P
CDK2
Abb. 3: Hauptwirkphasen verschiedener Cyclin-CDK-Paare im Verlauf des Zellzyklus (blaue Pfeile)
In blau ist der Zellzyklus mit Präsynthese- (G1), Synthese- (S), Postsynthese- (G2) und Mitosephase
(M) dargestellt. Cycline und cyclin-abhängige Kinasen (CDK) sind rot, Inhibitoren der Familien INK4
und KIP/CIP grün. Phosphatreste werden durch „P“ symbolisiert.
Die CDK activating kinase (CAK) setzt sich zusammen aus Cyclin H, CDK7 und menage à trois 1
(MAT1) und übernimmt die aktivierende Phosphorylierung verschiedener Cyclin-CDK-Paare (hier an
CyclinB-CDK1 dargestellt) [28, 38, 43, 87]
1.2.6.
Klinik und Therapie
Da GIST-Patienten im Regelfall keine ausgeprägte B-Symptomatik aufweisen und der Tumor verdrängend wächst, bleiben die Patienten lange asymptomatisch und etwa jede
fünfte Diagnose wird als Zufallsbefund nach, aus anderem Anlass durchgeführten, bildgebenden Untersuchungen gestellt. In einer schwedischen Studie waren 70 % der Tumoren
zum Diagnosezeitpunkt symptomatisch, 20 % asymptomatisch und 10 % wurden im Rahmen von Autopsien entdeckt [90]. Wird ein GIST symptomatisch, ist der Tumor oft schon
relativ groß und das klinische Bild ergibt sich aus der Lokalisation. Das häufigste Zeichen
sind Abdominalschmerzen, welche 50 - 70 % der symptomatischen Patienten aufweisen,
gefolgt von gastrointestinalen Blutungen mit 20 - 50 % und Obstruktion mit 3 % [13, 90].
Die Tendenz zu malignem Verhalten ist abhängig von der Lokalisation des Primarius und
dessen mitotischer Aktivität (Mitoserate). GIST der Dünndarmregion sind in 20 - 25 % maligne, wohingegen dieser Wert bei GIST des Magens auf 40 - 50 % steigt [83]. Metastasen
finden sich überwiegend hepatisch oder peritoneal [40, 53].
Da herkömmliche Chemo- und Radiotherapieschemata ineffektiv sind, bestand die Therapie der Wahl für operable Tumoren bis zum Jahr 2001 uneingeschränkt in der chirurgischen Resektion [20]. Im Mai 2001 wurde der bereits angesprochene Tyrosinkinase9
Einleitung
inhibitor Imatinib (Entwicklungsbezeichnung STI571) zugelassen, welcher in allen Krankheitsstadien, also auch bei inoperablen GIST, eine medikamentöse Therapieoption darstellt [21]. Imatinib ist das erste Beispiel einer auf einem molekularen Ziel basierenden
Therapie für eine solide Tumorentität. Der Wirkmechanismus besteht in einer reversiblen
Hemmung durch kompetitive Verdrängung von ATP an der Kinasedomäne [91, 108].
Meist spricht nicht der gesamte Tumor auf die Behandlung an, jedoch erzielt man in 50 67 % einen Teilerfolg, etwa in Form eines aufgehaltenen oder gebremsten
Wachstums [41]. Mit zunehmender Behandlungsdauer wird eine Resistenzzunahme durch
Sekundärmutationen beobachtet, nach zweijähriger Behandlung beträgt die Resistenzrate
etwa 50 % [41]. Es sind verschiedene Ursachen dieser Sekundär-Resistenzen bekannt. Die
meisten Mutationen betreffen die Kinasedomäne und führen zu strukturellen Veränderungen derselben, welche die Bindung des Inhibitors verhindern („gatekeeper-mutation“;
Abb. 4) [99]. Aus diesem Grund gewinnen kombinierte, adjuvante und neoadjuvante Therapieschemata zunehmend an Bedeutung und die Entwicklung immer neuer Inhibitoren,
welche die bekannten Resistenzen umgehen können, steht im Fokus der pharmakologischen Forschung [4, 23].
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
Zellmembran
KIT-Rezeptor
P
P
P
P
ATP
ADP
Inhibitor
Inaktives Substrat
Aktiviertes Substrat
Abb. 4: Schematische Darstellung der Resistenzentwicklung des KIT-Rezeptors durch „gatekeeper“-Mutation [99]
Das erste Bild stellt die pathologische, ligandenunabhängige Aktivität der Kinase unter Verbrauch von ATP dar.
Im zweiten Bild ist die Funktion der Kinase inhibiert, da ein Inhibitormolekül (wie z.B. Imatinib) die ATP-Bindungsstelle
der Kinasedomäne besetzt.
Im dritten Bild wird die Bindung des Inhibitors durch eine sekundär aufgetretene, strukturelle Mutation der ATPBindungsstelle („gatekeeper-mutation“) verhindert, ATP ist jedoch weiterhin bindungsfähig, weshalb die Kinase wieder
aktiv ist.
10
Einleitung
1.3.
Fragestellung
Gastrointestinale Stromatumoren sind eine der ätiologisch am besten verstandenen soliden Tumorentitäten. Das Wissen um die konstitutionelle Aktivierung des Tyrosinkinaserezeptors KIT hat die diagnostische Abgrenzung von anderen Tumoren ermöglicht und ein
innovatives Feld neuer Therapieoptionen erschlossen.
Trotz dieser Errungenschaften ist die individuelle Prognostik ein bisher unzureichend gelöstes Problem. In Ermangelung zuverlässiger genetischer oder immunhistochemischer
Marker basiert das Grading von GIST zum aktuellen Stand noch immer auf Größe und Mitoserate des Primärtumors, in einigen Einteilungen ergänzt durch die Kriterien Lokalisation oder Tumorruptur [36, 55, 60, 83]. Alle bekannten Klassifikationen weisen jedoch eine
deutliche prognostische Unschärfe auf, wie beispielsweise der Anteil von 30 - 50 % Langzeitüberlebenden (tumorspezifische 5-Jahres-Überlebensrate) in der Gruppe mit hohem
Malignitätsrisiko nach Fletcher et al. zeigt [54, 60].
Insbesondere die Verfügbarkeit alternativer Therapiestrategien, wie sie für GIST seit der
Entwicklung von Imatinib gegeben ist, erfordert aus medizinischen und ökonomischen
Gründen die Entwicklung neuer Verfahren zur genaueren Prognostik. Die Einschätzung
des Malignitätsrisikos entscheidet über die Notwendigkeit adjuvanter Therapieprotokolle
und Nebenwirkungsspektrum, Resistenzproblematik und Therapiekosten verlangen eine
sorgfältige und begründete Selektion der in Betracht kommenden Patienten.
Die vorliegende Arbeit befasst sich daher mit der Erforschung verschiedener zellulärer
Regulationsmechanismen und Signalkaskaden in Gastrointestinalen Stromatumoren, mit
dem Ziel, neue prädiktive Marker zu ermitteln, welche eine zuverlässigere Vorhersage des
klinischen Krankheitsverlaufs erlauben. Im Zentrum der Untersuchung steht dabei das
Cyclin-CDK-System, welches eines der entscheidenden Steuerungssysteme des Zellzyklus
darstellt.
11
Material und Methoden
2.
Material und Methoden
Um Veränderungen in den Signalkaskaden effizient zu identifizieren und zu evaluieren,
werden unterschiedliche Analyseverfahren kombiniert. Das folgende Flussdiagramm gibt
einen Überblick über den experimentellen Aufbau der Arbeit:
Histologische Analysen von Tumorgrading und Gewebemorphologie & Selektion der genetischen Versuchskollektive
Vergleichende Transkriptionsanalyse
von Normal- und Tumorgewebe
eines Patienten
Vergleichende Transkriptionsanalyse
verschiedener Tumorprogressionsstadien eines Patienten
Vergleichende Transkriptionsanalyse
von zwölf Tumoren
unterschiedlicher Gradingstufen
qRT-PCR mit Gen-Set 1
(Cyclin-CDK-System &
p53-Signalweg)
qRT-PCR mit Gen-Set 2
(Cyclin-CDK-System &
MAPK-Signalweg)
qRT-PCR mit Gen-Set 2
(Cyclin-CDK-System &
MAPK-Signalweg)
Selektion eines Gens zur
Untersuchung in einem Kollektiv
von 92 Tumorproben
Immunhistochemische
Färbung von Cyclin H
Abb. 5 Überblick über den experimentellen Aufbau der Arbeit
Zuerst erfolgt die histologische Beurteilung der verfügbaren kryoasservierten Gewebeproben zur Bestimmung des Tumorgradings und der Probenreinheit.
Anschließend werden drei Untersuchungen mit quantitativer Real-Time PolymeraseKettenreaktion (qRT-PCR) durchgeführt. Sie ermöglicht sensible Messungen der Transkriptionsaktivität einer großen Anzahl unterschiedlicher Gene, mit dem Ziel, Veränderungen im Transkriptionsverhalten aufzudecken, welche anschließend immunhistochemisch an einem größeren Kollektiv überprüft werden können.
In drei aufeinander folgenden Untersuchungen werden die Transkriptionsmuster von
1. dem Tumorgewebe eines aggressiven GIST und Normalgewebe desselben Patienten,
2. zwei hochmalignen Rezidiven eines Patienten im Verlauf, sowie 3. einem Stellvertreterkollektiv von zwölf Tumoren unterschiedlichen Gradings (je drei Tumoren der FletcherKlassen Niedrig, Mittel und Hoch, sowie drei Rezidivtumoren) vergleichend analysiert.
Anhand der Ergebnisse der qRT-PCRs und aufgrund seiner Schlüsselrolle innerhalb des
Cyclin-CDK-Systems wird Cyclin H als Gegenstand des immunhistochemischen Versuchsteils ausgewählt. Es werden Färbungen von einem Kollektiv von 92 GIST-Tumoren
erstellt und hinsichtlich des prädiktiven Werts von Cyclin H statistisch ausgewertet.
12
Material und Methoden
2.1.
Materialien und Geräte
2.1.1.
Gewebeproben
Die für die qRT-PCR verwendeten kryoasservierten Gewebeproben und die für die vorangehende histologische Beurteilung verwendeten Proben stammen aus der Gewebebank
der Klinik für Chirurgie I des Universitätsklinikums Ulm. Die Gewebeproben für den immunhistochemischen Versuchsteil werden vom Pathologischen Institut der Universität
Ulm zur Verfügung gestellt.
Entsprechende Anträge sind von der Ethikkommission der Universität Ulm genehmigt und
werden unter den Antragsnummern 90 & 91/2006 geführt. Alle Patienten wurden vor
dem Eingriff über die Gewebsentnahme aufgeklärt und haben schriftlich ihr Einverständnis erklärt.
2.1.2.
Fertige Gemische, Lösungen & Reagenziensets
Genetischer Versuchsteil
- Agarose NEEO Roti®Garose
(Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland)
- Antigen Retrieval Citra Plus Solution,
(BioGenex, San Ramon, Kalifornien, USA)
10X Concentrated
- GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder 0,5 µg/µl
(Fermentas, Burlington, Kanada)
- Human MAP Kinase Signaling Pathway
(SuperArray®, Frederick, Maryland, USA)
RT² Profiler™ PCR Array
- Human p53 Signaling Pathway
(SuperArray®, Frederick, Maryland, USA)
RT² Profiler™ PCR Array
- RNA-Probenpuffer: 6x Loading Dye Solution
(Fermentas, Burlington, Kanada)
- RNase-free DNase Set
(Qiagen®, Hilden, Deutschland)
- RNeasy® Lipid Tissue Mini Kit
(Qiagen®, Hilden, Deutschland)
- RT² First Strand Kit
(SuperArray®, Frederick, Maryland, USA)
- RT² Real-Time™ SYBR Green/
(SuperArray®, Frederick, Maryland, USA)
Rox PCR master mix
- RT² RNA QC PCR Array
(SuperArray®, Frederick, Maryland, USA)
13
Material und Methoden
Histologischer & Immunhistologischer Versuchsteil
-
Cedukol® (Kollodiumwolle + ca. 30 % Ethanol)
(Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland)
Citra Plus (pH 6.2)
(BioGenex, San Ramon, Kalifornien, USA)
Cyclin H antibody (ab54903)
(Abcam®, Cambridge, Großbritannien)
Entellan®
(Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland)
Eosin Y Lösung mit Phloxin
(Sigma-Aldrich® GmbH, Steinheim, Deutschland)
Hämatoxylinlösung Gill Nr.3
(Sigma-Aldrich® GmbH, Steinheim, Deutschland)
Liquid DAB+
(Dako Cytomation, Glostrup, Dänemark)
Mayers Hämalaunlösung
(Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland)
N-Histofine® Simple Stain
(Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japan)
MAX PO Anti-Mouse
- Peroxidase Blocking Reagent
(Dako Cytomation, Glostrup, Dänemark)
2.1.3.
Chemikalien
Die Zusammensetzung selbst hergestellter Gemische und Lösungen ist im jeweiligen Abschnitt des Methodenteils angegeben. Die Angaben beziehen sich jeweils auf ein Gesamtvolumen von einem Liter. In der folgenden Liste sind Bezeichnung und Hersteller der verwendeten Chemikalien aufgeführt:
-
Chloroform (Trichlormethan)
(Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland)
Diethylether reinst
(AppliChem GmbH, Darmstadt, Deutschland)
Dinatriumhydrogenphosphat
(Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland)
EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)
(Sigma-Aldrich® GmbH, Steinheim, Deutschland)
Essigsäure 100 %
(VWR® International, Darmstadt, Deutschland)
Ethanol absolut puriss.
(Riedel-de Haën®, Seelze, Deutschland)
Ethidiumbromid
(Roche Applied Science, Mannheim, Deutschland)
Formaldehydlösung 37 %
(Sigma-Aldrich® GmbH, Steinheim, Deutschland)
HCl 37 % Salzsäure rauchend
(Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland)
Isopropanol
(Riedel-de Haën®, Seelze, Deutschland)
Methylbenzoat (Benzoesäuremethylester) (VWR® International, Darmstadt, Deutschland)
Stickstoff, N2, flüssig
(Air Liquide, Wiesbaden-Sonnenberg, Deutschland)
Natriumchlorid
(VWR® International, Darmstadt, Deutschland)
Natriumdihydrogenphosphat
(Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland)
Paraffin
(VWR® International, Darmstadt, Deutschland)
RNase-freies ddH2O
(Qiagen, Hilden, Deutschland)
Toluol
(Sigma-Aldrich® GmbH, Steinheim, Deutschland)
TRIS (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan)(Sigma-Aldrich® GmbH, Steinheim, Deutschland)
TRIS-Acetat
(Sigma-Aldrich® GmbH, Steinheim, Deutschland)
Triton® X-100
(Sigma-Aldrich® GmbH, Steinheim, Deutschland)
Xylol
(Riedel-de Haën®, Seelze, Deutschland)
14
Material und Methoden
2.1.4.
Geräte
Pipetten
- Reference®
(Eppendorf®, Hamburg, Deutschland)
0,5-10 µl 10-100 µl, 100-1 000 µl
- Research®
(Eppendorf®, Hamburg, Deutschland)
0,1-2,5 µl, 2-20 µl, 10-100 µl, 20-200 µl, 100-1 000 µl
Zentrifugen
- Zentrifuge 5417 R, Rotor FA-45-30-11
- Zentrifuge 5430, Rotor FA-45-24-11-HS
- Zentrifuge Megafuge 1.0 R, Rotor 2705,
Schaukel 2708
(Eppendorf®, Hamburg, Deutschland)
(Eppendorf®, Hamburg, Deutschland)
(Heraeus GmbH, Hanau, Deutschland)
Kühl- / Gefrierschränke
-
Comfort
Hera freeze HFU 586 Basic
Öko Super
Profiline
(Liebherr GmbH, Biberach an der Riss, Deutschland)
(Heraeus GmbH, Hanau, Deutschland)
(Liebherr GmbH, Biberach an der Riss, Deutschland)
(Liebherr GmbH, Biberach an der Riss, Deutschland)
Mikrowellengeräte
- M 754
- MWU512WS
(Landgraf Laborsysteme HLL GmbH, Langenhagen, Deutschland)
(Bauknecht Hausgeräte GmbH, Stuttgart, Deutschland)
Waagen
- 440-35A
- R180-D
(Kern & Sohn GmbH, Balingen, Deutschland)
(Sartorius GmbH, Göttingen, Deutschland)
Mikroskope
- Axioplan 2
- IX81
(Carl Zeiss AG, Jena, Deutschland)
(Olympus Corporation, Tokio, Japan)
PCR-Geräte & Thermocycler
- 7500 Fast Real-Time PCR System
(Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA)
- PTC-100™ Programmable Thermal (MJ Research, Inc., Watertown, Massachusetts, USA)
Controller
15
Material und Methoden
Sonstige Gerätschaften
-
Autoklav 32-2-3
(KSG Sterilisatoren GmbH, Olching, Deutschland)
Autotechnikon Leica ASP200
(Leica, Wetzlar, Deutschland)
BioPhotometer
(Eppendorf®, Hamburg, Deutschland)
CellCam LC
(Phase, Lübeck, Deutschland)
Certomat®BS-1
(B. Braun Biotech International, Melsungen, Deutschland)
DPU-414 Thermal Printer
(Seiko Instruments Inc., Chiba, Japan)
Elektrophorese Mini-Gelapparat
(Renner GmbH, Dannstadt, Deutschland)
Färbeküvetten Wheaton „810“
(VWR® International, Darmstadt, Deutschland)
Gel Casting System 11-14
(Gibco-BRL, Gaithersburg, Maryland, USA)
Glasgefäße
(VWR® International, Darmstadt, Deutschland)
Mikrotom HM 450
(Microm, Walldorf, Deutschland)
Mischgerät Reax top
(Heidolph, Schwabach, Deutschland)
Model 1 000/500 Power Supply
(Bio-Rad, Hercules, Kalifornien, USA)
Mörser
(VWR® International, Darmstadt, Deutschland)
Plastikküvette für die Mikrowelle
(VWR® International, Darmstadt, Deutschland)
Paraffin-Ausgießstation EC 350
(Microm, Walldorf, Deutschland)
Schwenktisch KS250 basic
(IKA Labortechnik, Staufen, Deutschland)
Spatel
(VWR® International, Darmstadt, Deutschland)
Thermomixer comfort
(Eppendorf®, Hamburg, Deutschland)
Transilluminator Fluo-Link
(Labortechnik Fröbel GmbH, Lindau, Deutschland)
Video Graphic Printer UP-895CE
(Sony, Tokio, Japan)
2.1.5.
-
Verbrauchsmaterialien
Barrierestift Mini PAP Pen Plus
(Zytomed Systems GmbH, Berlin, Deutschland)
Deckgläser 24x60 mm
(Menzel-Gläser, Braunschweig, Deutschland)
DermaClean® Non-Sterile Examination Gloves M
(Ansell, Kulim, Malaysia)
Einmalskalpelle, No. 11
(Feather, Osaka, Japan)
epT.I.P.S. Standard
(Eppendorf, Hamburg, Deutschland)
0,1-10 µl, 2-200 µl, 50-1 000 µl
Flächendesinfektion Isopropanol 70 %
(VWR® International, Darmstadt, Deutschland)
Laborwischtücher Kimtech Science™
(Kimberly-Clark®, Dallas, Texas, USA)
Nitra-Tex® Non-Sterile Examination Gloves M
(Ansell, Tamworth, Großbritannien)
Objektträger Superfrost® Plus
(Menzel-Gläser, Braunschweig, Deutschland)
Safe-Lock Tubes 0,5 ml, 1,5 ml, 2 ml
(Eppendorf®, Hamburg, Deutschland)
VWR Signature® Aerosol Filter Pipet Tips
(VWR®, Darmstadt, Deutschland)
1-40 µl, 1-100 µl, 100-1 000 µl
16
Material und Methoden
2.2.
Methoden
2.2.1.
Asservierung der Gewebeproben
Die Gewebe werden direkt nach der operativen Entfernung und pathologischen Begutachtung in flüssigem Stickstoff eingefroren bzw. mit Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Alle Operationen mit Kryoasservierung wurden an der Klinik für Allgemein-, Viszeral- und Transplantationschirurgie des Universitätsklinikums Ulm (Ärztliche Direktorin:
Frau Prof. Dr. Doris Henne-Bruns) durchgeführt, so dass eine homogene Probenverarbeitung gegeben ist.
2.2.1.1.
Immersionsfixation
Unmittelbar nach der Entnahme erfolgt die weitere Präparation und Fixierung über
24 Stunden in Formalin. Proben, bei denen saures Formalin als Erst-Fixans verwendet
wird, werden anschließend für weitere 24 Stunden in neutral gepuffertes Formalin überführt. Die Fixierungslösungen werden 4 Stunden unter fließendem Wasser ausgewaschen.
Zusammensetzung selbst hergestellter Gemische & Lösungen:
- Saures Formalin 4 %:
150 ml (2,62 mol) Essigsäure 100 %
108 ml Formaldehydlösung 37 %
877 ml Aqua dest.
- Neutral gepuffertes Formalin 10 %:
4,0 g (33,34 mmol) Natriumdihydrogenphosphat
6,5 g (45,79 mmol) Dinatriumhydrogenphosphat
100 ml Formaldehydlösung 37 %
900 ml Aqua dest.
2.2.1.2.
Einbettung des Gewebes
Die Dehydrierung der Gewebestücke erfolgt über Nacht
in einem Autotechnikon. Das genaue Protokoll findet sich
in Tabelle 3. Zuerst durchlaufen die Proben eine aufsteigende Ethanolreihe und werden anschließend in Methylbenzoat inkubiert. Der verbliebene Alkohol wird mit Toluol ausgewaschen. Abschließend wird das Intermedium
durch Paraffin ersetzt. Die fertig fixierten Gewebe wer-
Tab. 3: Protokoll des Autotechnikons
Reagenz
Ethanol 70 %
Ethanol 80 %
Ethanol 96 %
Ethanol 100 %
Ethanol 100 %
Ethanol 100 %
Methylbenzoat
Methylbenzoat
Toluol
Toluol
Paraffin
Paraffin
Paraffin
Dauer Temp.
1,5 h
2h
2,5 h
1h
2h
4h
4h
3h
0,3 h
0,3 h
1h
1h
1h
45 °C
45 °C
45 °C
45 °C
45 °C
45 °C
45 °C
45 °C
45 °C
45 °C
60 °C
60 °C
60 °C
den von Hand in Paraffinblöcke eingegossen.
17
Material und Methoden
2.2.2.
Histologie – Analysen des Gradings und der Gewebemorphologie
Als Grundlage für die Auswahl der Kollektive zur genetischen Untersuchung werden
66 Tumorproben von 18 Patienten histologisch beurteilt. Im Mittelpunkt stehen die Begutachtung der Probenqualität und die Determination des Tumorgradings. Hierfür erfolgt
eine Hämatoxylin-Eosin-Färbung von in Paraffin eingebetteten Tumorproben, welche mit
den kryoasservierten Geweben direkt korrespondieren.
2.2.2.1.
Entparaffinieren und Rehydrierung der histologischen Schnitte
Unter Verwendung eines Schlittenmikrotoms werden 3 µm starke Schnitte des eingebetteten Gewebes angefertigt und über Nacht bei 38 °C im Wärmeschrank getrocknet.
Die Präparate werden in zwei Xylolbäder mit je 10 Minuten Einwirkzeit entparaffiniert
und in einer absteigenden Ethanolreihe rehydriert (3 x 100 %iges, 1 x 96 %iges, 1 x 70 %iges
Ethanol, je 5 Minuten). Zuletzt werden die Präparate zweimal 5 Minuten mit destilliertem
Wasser gespült.
2.2.2.2.
Hämatoxylin-Eosin-Färbung
Die entparaffinierten Schnitte werden für 3 Minuten in Hämatoxylinlösung getaucht und
anschließend zweimal eine Minute mit destilliertem Wasser gespült. Nach der Differenzierung in 1 %igem HCl-Ethanol, werden die Schnitte 10 Minuten unter fließendem Wasser gebläut. Erneut werden die Präparate mit destilliertem Wasser gespült und zur Gegenfärbung für 10 Sekunden in Eosinlösung gestellt.
Zur Dehydrierung und Fixierung werden die Präparate in einer aufsteigenden Alkoholreihe (2 x Ethanol 96 %, 3 x Ethanol 100 %, je 5 Minuten) und Xylol (2 x 10 Minuten) inkubiert
und mit „Entellan®“ eingedeckt.
Zusammensetzung selbst hergestellter Gemische & Lösungen:
- HCl-Ethanol 1%:
40 ml HCl 25%
960 ml Ethanol 70%
2.2.2.3.
Auswertung
Die Beurteilung des Tumorgradings erfolgt entsprechend der Einteilung nach Fletcher et al., in welche der maximale Durchmesser, sowie die Mitoserate des Primärtumors
einfließen (siehe Tab. 1) [36]. Um eine der Evaluation zugängliche Einteilung mit Unterscheidung von Primär- und Sekundärtumoren zu schaffen, werden Rezidivtumoren bei
18
Material und Methoden
den genetischen Untersuchungen als eigenständige Gruppe behandelt. Dadurch entsteht
eine Aufteilung in die vier Gruppen „Niedrig“, „Mittel“, „Hoch“ und „Rezidiv“, wobei die
deutschen Bezeichnungen äquivalent zu den Malignitätsrisikogruppen „low“, „intermediate“ und „high“ der Klassifikation nach Fletcher et al. verwendet werden. Tumoren der
niedrigsten Malignitätsrisikogruppe („very low“) werden erst im immunhistologischen
Versuchsteil untersucht.
Bei der Auswahl des Kollektivs für die genetische Untersuchung fließen neben Fletchers
Risikoklassifikation weitere klinische Daten bezüglich Lokalisation des Primärtumors, Alter
und Geschlecht mit ein. Abhängig von der verfügbaren Tumormenge sind in den meisten
Fällen mehrere Gewebestücke asserviert. Zur Selektion einzelner Proben für die weiteren
Versuche erfolgen Schätzungen der Anteile an Tumorgewebe, Nekrosearealen und Normalgewebe in 10 %-Schritten. Bei den für die Isolation der mRNA eingesetzten Proben
wird auf einen hohen Prozentsatz (≥ 90 %) an intaktem Tumorgewebe Wert gelegt.
19
Material und Methoden
2.2.3.
Genetik – Analysen der Gentranskription
Nach der Zusammenstellung der Versuchskollektive auf Basis der histologischen Beurteilung der Gewebeproben und zugehörigen klinischen Daten, wird zum Screening auf genetischer
Ebene
ein
quantitatives
Real-Time
Polymerase-Kettenreaktionsverfahren
(qRT-PCR) eingesetzt. Es ermöglicht sensible Messungen der Transkriptionsaktivität einer
großen Anzahl unterschiedlicher Gene, die auf Grundlage der aktuellen Literatur bzw. den
Ergebnissen vorangehender Versuche ausgewählt werden. In drei Versuchsansätzen mit
unterschiedlichem Probenmaterial werden neben Genen des Cyclin-CDK-Systems auch
Vertreter des p53- und des MAPK-Signalwegs untersucht.
2.2.3.1.
Isolation der RNA
In der Vorbereitungs- und Etablierungsphase wurden RNA-Isolationskits verschiedener
Firmen getestet und die Qualität der erzielten Aufreinigungsergebnisse verglichen. Alle
für die Arbeit verwendeten RNA-Isolate werden mit dem „RNeasy® Lipid Tissue Mini Kit“,
ergänzt durch das „RNase-free DNase Set“, in Übereinstimmung mit den Protokollen des
Herstellers gewonnen. Dieses Kit basiert auf einer Phenol-Chloroform-Extraktion, die in
Kombination mit einer Silica-Gel Membran eingesetzt wird.
Die Tumorprobe wird mit flüssigem Stickstoff in einem Handmörser homogenisiert und
35 mg abgewogen. Im nächsten Schritt werden 1 000 µl des guanidiniumthiocyanat- und
phenolhaltigen „QIAzol Lysis Reagent“ hinzugefügt und die Probe 30 Sekunden auf dem
Vortexer durchmischt. Nach 5 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur (aufbrechen der
Nukleoproteinkomplexe), ergänzt man 200 µl Chloroform und durchmischt erneut
(15 Sekunden vortexen). Nach 3-minütiger Inkubation werden die Eppendorfgefäße zur
Phasentrennung für 15 Minuten bei 4 °C und 12 000 g zentrifugiert. Die wässrige oberste
Phase wird in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Es wird die gleiche Menge 70 %igen
Ethanols ergänzt und durch vortexen gemischt. Die Probe wird in zwei Schritten durch
eine Silica-Membran („RNeasy® Mini Spin Column“) zentrifugiert (je 15 Sekunden bei
9 000 g). Durch ihre selektiven Bindungseigenschaften adsorbiert die Silica-Membran die
Gesamt-RNA und ermöglicht so die Abtrennung verbliebener Proteine und DNA in den
folgenden Waschschritten mit den Puffern „RW1“ und „RPE“ (jeweils 15 Sekunden bei
9 000 g). Nach Zentrifugation und Verwerfen des Durchflusses werden, zum zusätzlichen
Verdau eventuell zurückgebliebener DNA, 1 500 Kunitz-Einheiten DNase I in 80 µl „DNase I
20
Material und Methoden
incubation mix“ aufgetragen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird die Silica-Membran erneut mit 350 µl „RW1“-Puffer und zweimal mit je 500 µl
„RPE“-Puffer gespült. Der Durchfluss wird verworfen und die Membran für eine Minute
bei 12 000 g in der Zentrifuge getrocknet. Sie wird in ein neues Reaktionsgefäß transferiert
und 40 µl RNase-freies Wasser werden aufpipettiert. Das Wasser dient zur Elution der
RNA während der folgenden, 1-minütigen Zentrifugation (9 000 g). Der Elutionsschritt
wird mit dem Durchfluss noch einmal wiederholt und das Reaktionsgefäß mit dem Isolat
anschließend sofort auf Eis gestellt. Nach Abnehmen der für die Qualitätskontrollen benötigten Mengen, wird die RNA in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren
Verwendung bei -80 °C gelagert.
2.2.3.2.
Qualitätskontrollen der RNA
Da die Ergebnisse der anschließenden qRT-PCR stark von der hohen Qualität der eingesetzten mRNA abhängen, werden verschiedene Kontrollen zur Qualitätssicherung zwischengeschaltet:
Zur Konzentrationsbestimmung wird 1 µl des RNA-Isolats im Verhältnis 1 : 100 mit Aqua
dest. verdünnt und spektrophotometrisch die Extinktion
bei den Wellenlängen 230,
260 und 280 nm gemessen. Darüber hinaus ermöglicht die Errechnung der Quotienten
und
eine erste Reinheitskontrolle des Isolats.
Zusätzlich wird 1 µl des Isolates elektrophoretisch auf 1 %igem Agarosegel aufgetrennt
(50ml Gelplatte, 30 min, 100 V). Die entstandenen Banden werden auf einem Transilluminator bei λ = 254 nm begutachtet.
Zusammensetzung selbst hergestellter Gemische & Lösungen:
- TAE-Puffer:
4,85 g (40 mmol) TRIS
292,24 mg (1 mmol) EDTA
500 ml Aqua dest.
Essigsäure 100 % ad pH 8,0
Aqua dest. ad 1 000 ml
- Agarosegel:
10 g Agarose
1000 ml TAE-Puffer
50 µl Ethidiumbromid
Abb. 6: Gelelektrophoretische Auftrennung der
RNA-Isolate von vier Gewebeproben.
Die beiden Banden entsprechen der 18s- und der
28s-rRNA (ribosomal ribonucleic acid).
21
Material und Methoden
2.2.3.3.
cDNA Synthese
Zur Synthetisierung der cDNA wird der auf der Reversen Transkriptase eines murinen
Leukämie Virus (M-MLV) basierende „RT² First Strand Kit“ eingesetzt. Die Durchführung
läuft entsprechend dem Herstellerprotokoll ab, mit einer Ausgangsmenge von 2 µg RNA
(Proben werden mit RNase-freiem Wasser auf eine einheitliche Konzentration von
0,5 µg/µl verdünnt). Zur Elimination eventuell verbliebener genomischer DNA wird die
RNA mit 4 µl RNase-freiem Wasser und 2 µl „5X gDNA Elimination Buffer“ vermischt,
5 Minuten bei 42 °C inkubiert und eine Minute auf Eis gekühlt. Anschließend wird der „RT
Cocktail“ (4 µl „5X RT Buffer 3“, 1 µl „Primer & External Control Mix“, 2 µl „RT Enzyme
Mix 3“, 3 µl RNase-freies Wasser) zugesetzt und die Inkubation bei 42 °C für weitere
15 Minuten fortgesetzt. Die Inaktivierung der Enzyme und Degradation der RNA erfolgt
über 5 Minuten bei 95 °C. Abschließend werden 91 µl ddH2O zugesetzt und die Proben in
flüssigen Stickstoff schockgefroren. Bis zur qRT-PCR werden sie bei -20 °C gelagert.
2.2.3.4.
Qualitätskontrollen der cDNA
Zur finalen Kontrolle vor der Durchführung der qRT-PCR kommt eine spezielle 96-well
Platte der Firma SuperArray® zum Einsatz, mit der verschiedene Aspekte überprüft werden:
Mit der Amplifikation der Housekeeping-Gene Beta-Actin (ACTB) und Hypoxanthinphosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) werden die Intaktheit und mögliche Schwankungen
in der Konzentration der eingesetzten cDNA überprüft.
Außerdem wird der Wirkungsgrad der reversen Transkription wird durch die Amplifikation
einer im Kit bereits enthaltenen Kontroll-RNA kontrolliert und auf Verunreinigungen
durch genomische DNA oder PCR-inhibierende Stoffe getestet.
Entsprechend dem Herstellerprotokoll werden in jedes Well 25 µl „1X SuperArray PCR
master mix“ eingebracht, welche zusätzlich entweder 6 µl cDNA, 1 µl einer Verdünnung
der eingesetzten RNA (1 : 100), oder aber kein Probenmaterial enthalten.
2.2.3.5.
Quantitative Real-time PCR Analysen
Zur Vorbereitung der Platten für die qRT-PCR wird ein Reaktionsansatz aus 1 275 µl
2X SuperArray PCR master mix, 1 173 µl ddH2O und 102 µl cDNA hergestellt. In jedes Well
werden 25 µl dieses Ansatzes pipettiert, die fertig bestückten Platten anschließend versiegelt und bis zur Messung bei -20 °C eingefroren.
22
Material und Methoden
Die PCR-Reaktion läuft in einem „7500 Fast Real-Time PCR System“ der Firma Applied
Biosystems ab und basiert auf der Reaktion des Fluoreszenzfarbstoffes „SYBR® Green“,
welcher bei der Interkalation Licht mit einer Wellenlänge von 521 nm emittiert. Die Stärke
dieses Fluoreszenzsignals wird zum Ende jeder Elongationsphase gemessen. Bei jedem
Durchgang können 84 Testgene untersucht werden, die 12 restlichen Wells dienen der
Amplifikation verschiedener Housekeeping-Gene und als Kontrollen für den korrekten
Verlauf von reverser Transkription und Polymerase-Kettenreaktion.
2.2.3.6.
Auswertung
Die Quantifizierung der in den Proben enthaltenen mRNA erfolgt als relative Messung im
Verhältnis zu einer definierten Referenzprobe. Bei Vergleichen von Normal- und Tumorgewebe gilt das Normalgewebe als Referenz, bei Vergleichen von Rezidiven das früher
aufgetretene Rezidiv und bei Vergleichen von Tumoren unterschiedlicher Gradings wird
der Patient mit der niedrigsten Risikoeinstufung nach Fletcher et al. als Referenz eingesetzt [36].
Als Ausgangspunkt für die Quantifizierung wird der Threshold-Cycle (Ct-Wert) jeder Probe
verwendet. Um den Einfluss von geringfügigen Variationen des Probenvolumens auszugleichen, werden Housekeeping-Gene als Referenz eingesetzt. Mit ihrer Hilfe werden die
Ct-Werte zu ∆Ct-Werten normalisiert (
(
)
(
) ).
-
Für Ge-
ne, deren mittlere Threshold-Cycles demjenigen von Beta-Actin (ACTB) näher sind, wird
dieses als endogene Kontrolle eingesetzt, im Bereich darüber
Hypoxanthin-
phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).
Basierend auf dem ∆Ct-Wert wird über die Formel
(
)
(
)
der ∆∆Ct-Wert errechnet. Aus diesem ergibt sich die relative Tran-
skriptmenge (RQ) als
. Aus Gründen der gleichmäßigen Darstellbarkeit von
Zu- und Abnahmen der mRNA-Menge, wird die relative Transkriptmenge in den relativen
Abweichungsfaktor (RD) der Testprobe von der mit dem Wert 1,0 definierten Referenzprobe umgewandelt:
(
)
{
23
Material und Methoden
Entsprechend dem Wert der Referenzprobe liegt der Schnittpunkt der X- mit der Y-Achse
in grafischen Darstellungen bei 1,0, was auch den Umschlagspunkt zwischen positiven
und
negativen
Abweichungsfaktoren
markiert.
RD-Werte,
die
Abnahmen
der
mRNA-Menge beschreiben, werden stets mit negativem Vorzeichen angegeben. Der Vorteil gegenüber der Darstellung von RQ-Werten liegt in der überlegenen Überschaubarkeit
und Vergleichbarkeit. Eine um den Faktor 5 (
) geringere Menge im
Testgewebe stellt sich somit nominal und grafisch im gleichen Abstand zur Referenz
(
) dar, wie eine um den gleichen Faktor (
) grö-
ßere Menge. Der Unterschied wird in Abb. 7 veranschaulicht.
RQ
10,0
A
10,0
5,0
6,0
4,0
0,0
10,0
+10,0
B
+5,0
5,0
8,0
2,0
RD
1,0
1,0
-5,0
0,1
0,2
1,0
-5,0
-10,0
-10,0
Abb. 7: Beispieldiagramm zur Verdeutlichung der Vorteile des relativen Abweichungsfaktors (RD) gegenüber
der relativen Transkriptmenge (RQ). In beiden Diagrammen sind identische Beispielergebnisse dargestellt.
Diagramm A basiert auf RQ-Werten, während für die Darstellung in Diagramm B RD-Werte verwendet werden.
Folge ist eine ausgeglichene Darstellung von positiven und negativen Abweichungen der mRNA-Menge von der
Referenzprobe.
Alternativ würde sich das Problem der ausgeglichenen grafischen Darstellung durch die
Verwendung logarithmisch skalierter Achsen lösen lassen, jedoch müsste man auf den
zusätzlichen Vorteil der einfacheren Vergleichbarkeit der numerischen Werte verzichten,
weswegen die beschriebene Methode vorgezogen wird.
Als cut-off wird für Einzelproben eine Abweichung (RD) der mRNA-Menge im Testgewebe
von der Referenzprobe um mehr als den Faktor ± 5,0 festgelegt. Einzelne Gene werden
jedoch auch aufgrund ihrer funktionellen Zusammengehörigkeit in die Arbeit aufgenommen. Bei Versuchsgruppen aus mehreren Gewebeproben sind für die Selektion nicht allein der Mittelwert der Gruppe, sondern die Abweichungsfaktoren der Einzelproben entscheidend.
24
Material und Methoden
Da das arithmetische Mittel nicht zur Berechnung von Mittelwerten relativer Faktoren
geeignet ist, erfolgt die Berechnung ausgehend von den RQ-Werten über die Formel des
geometrischen Mittels (
der Faktoren
bis
). Dieses errechnet sich als die n-te Wurzel aus dem Produkt
:
√∏
Bei der Untersuchung mehrerer Tumoren wird die relative Transkriptionsaktivität der vier
Untersuchungsgruppen als Box & Whiskers-Plots dargestellt und ergänzend die geometrischen Mittelwerte jeder der vier Gruppen einzeln, sowie der drei Primärtumorgruppen
zusammengefasst mit zugehöriger Standardabweichung (SD) in Tabellenform angegeben.
25
Material und Methoden
2.2.4.
Immunhistologie – Analysen der Proteinexpression
Aufgrund der Ergebnisse der qRT-PCR und wegen seiner Schlüsselrolle innerhalb des Cyclin-CDK-Systems wird für diese Arbeit Cyclin H zur weiteren Erforschung ausgewählt. Die
Validierung der genetischen Untersuchungsergebnisse auf Proteinebene wird immunhistologisch durchgeführt. Um eine belastbare statistische Auswertung zu ermöglichen, werden Präparate eines Kollektivs von 92 GIST-Patienten erstellt.
2.2.4.1.
Vorbereitung der Präparate für die immunhistochemische Färbung
Die Fixierung und Einbettung des Gewebes, sowie die Gewinnung histologischer Schnitte
erfolgen analog zu dem in den Kapiteln 2.2.1.1 - 2.2.2.1 beschriebenen Vorgehen, weshalb
an dieser Stelle nicht mehr detailliert auf die einzelnen Schritte eingegangen wird.
Bei der Rehydrierung der Präparate wird das Protokoll wegen der späteren Hitzedemaskierung der Epitope an einer Stelle abgeändert. Anstatt des 96 %igen Ethanolbades werden die Schnitte für eine Minute in 0,05 %iger Celloidinlösung inkubiert, um einem Abschwimmen während des Demaskierungsvorgangs vorzubeugen.
Zusammensetzung selbst hergestellter Gemische & Lösungen:
- Celloidinlösung 0,05 %:
0,5g Cedukol
500 ml Ethanol absolut
500 ml Diethylether reinst
2.2.4.2.
Epitopdemaskierung
Die Schnitte werden in einem Mikrowellenherd 2 Minuten bei 450 Watt erhitzt und weitere 20 Minuten bei 80 Watt gekocht. Als Pufferlösung wird Citratpuffer (pH 6,2) eingesetzt, in dem die Objektträger für 20 Minuten zum Abkühlen belassen werden.
Anschließend werden die Präparate 10 Minuten mit destilliertem Wasser und weitere
10 Minuten mit TRIS/HCl-Puffer gespült.
Zusammensetzung selbst hergestellter Gemische & Lösungen:
- TRIS/HCl-Puffer:
500 ml Aqua dest.
4 ml (0,004 % v/v) Triton® X-100
1,21 g (10 mmol) TRIS
8,77 g (150 mmol) Natriumchlorid
HCl ad pH 7,6
Aqua dest. ad 1 000 ml
26
Material und Methoden
2.2.4.3.
Peroxidaseblock
Die Inaktivierung der endogenen Peroxidasen erfolgt durch 10-minütige Inkubation in
Methanol mit einem 0,3 %igen Anteil H2O2 („Peroxidase Blocking Reagent“). Danach werden die Präparate 2 x 10 Minuten in TRIS/HCl-Puffer gespült.
2.2.4.4.
Primärantikörper
Es werden 100 µl des mit TRIS/HCl-Puffer im Verhältnis 1 : 100 verdünnten Primärantikörpers aufgetragen und die Präparate ca. 12 Stunden bei 4 °C in einer feuchten Kammer
inkubiert. Vor der Weiterverarbeitung werden die Objektträger 2 x 10 Minuten in
TRIS/HCl-Puffer gespült.
2.2.4.5.
Detektionssystem und Gegenfärbung
Zur Detektion der Primärantikörper wird „N-Histofine® Simple Stain MAX PO Anti-Mouse“
eingesetzt. Es wird auf die Präparate aufgebracht und 20 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert. Nach 2 x 10 Minuten TRIS/HCl-Puffer-Spülung wird „liquid DAB+“ als chromogenes Substrat aufgetragen und 30 Minuten auf den Schnitten belassen. Nach
2 x 10 Minuten Spülung mit destilliertem Wasser werden die Schnitte zur Gegenfärbung
10 Sekunden in Mayers Hämalaunlösung getaucht und 10 Minuten unter fließendem
Wasser gebläut.
2.2.4.6.
Dehydrieren und Eindecken
Nach Abschluss der Färbung erfolgt die Dehydrierung der Präparate in einer aufsteigenden Ethanolreihe (1 x 70 %, 1 x 96 % und 3 x 100 %) mit einer Verweildauer von je
5 Minuten. Nach zweimaliger Inkubation in Xylol für je weitere 5 Minuten werden die
Schnitte mit „Entellan®“ eingedeckt.
2.2.4.7.
Spezifitäts- und Positivkontrollen
Bei jeder Färbung werden Proben eines Cyclin H-positiven Adenokarzinoms des Colon als
Positiv- und Negativkontrollen mitgeführt. Auf die Negativkontrollen werden statt der
Primärantikörperverdünnung 100 µl TRIS/HCl-Puffer aufgetragen. Alle anderen Schritte
werden identisch mit den Versuchspräparaten durchgeführt.
Der Spezifitätsnachweis der verwendeten Antikörper wurde von den jeweiligen Herstellerfirmen erbracht.
27
Material und Methoden
2.2.4.8.
Beurteilung der Präparate und statistische Auswertung
Die Präparate werden, basierenden auf den Kriterien von Bondi et al. und Kayaselcuk et
al., semiquantitativ beurteilt [8, 63]. Hinsichtlich der subzellulären Lokalisation zeigen sich
vorwiegend die Zellkerne positiv für Cyclin H, wobei einzelne Proben eine begleitende
zytoplasmatische Positivität aufweisen. Bei der Beurteilung und Quantifizierung werden
jedoch ausschließlich Zellen mit reaktivem Nukleus gewertet. Als unterer Grenzwert für
Positivität wird ein Wert von ≥ 10 % positiver Zellkerne verwendet. Präparate, die diesen
Wert überschreiten werden mit den Grenzen ≥ 10 % - < 25 %, ≥ 25 % - < 50 %, ≥ 50 % < 75 % und ≥ 75 % in vier Gruppen unterteilt.
Nach der Erstellung von Kontingenztafeln zu verschiedenen Fragestellungen wird zur Prüfung auf Unabhängigkeit der χ²-Test durchgeführt. Unterschreitet die Anzahl der Fälle in
einem Feld der Tafel den Wert 5, wird alternativ der exakte Test nach Fisher angewandt,
welcher auch bei einer geringen Anzahl von Beobachtungen Gültigkeit behält. Die Berechnungen werden mit zweiseitiger Fragestellung durchgeführt. Als Signifikanzniveau
wird eine Irrtumswahrscheinlichkeit kleiner 5 % definiert (
).
Zur Einschätzung von Risiken erfolgt die Berechnung des Quotenverhältnisses
(odds ratio), da dieses, im Gegensatz zum relativen Risiko, auch Aussagen zu retrospektiven Studien zulässt. Es wird mit 95 %igem Konfidenzintervall (KI) gearbeitet, welches mit
oberer und unterer Grenze in eckigen Klammern nach dem Quotenverhältnis angegeben
wird (
).
Bei Berechnungen zur Überlebenszeit wird die Erstdiagnose als Anfangszeitpunkt definiert. Das Ende der Zeitspanne bestimmt das Datum der letzten Kontrolluntersuchung
beziehungsweise das Sterbedatum. Das Kollektiv der verstorbenen Patienten muss nach
tumorbedingter und anderweitiger Todesursache in zwei Untergruppen aufgeteilt werden. In die Berechnung des Gesamt-Überlebens gehen beide Gruppen als verstorben ein,
beim tumorspezifischen-Überleben (TSÜ) werden hingegen nur die an den Folgen des
GIST verstorbenen Patienten gewertet. Für die Übrigen geht das Todesdatum lediglich als
Ende des Beobachtungszeitraums in die Berechnung ein. Diagramme zu Überlebenszeiten
werden als Kaplan-Meier Kurve dargestellt.
Analog zur Berechnung des tumorspezifischen-Überlebens wird auch die Bestimmung des
tumorfreien-Überlebens (TFÜ) durchgeführt. Als statistisch relevantes Ereignis wird hier
28
Material und Methoden
der diagnostische Nachweis von Rezidiven oder Metastasen definiert. Bei den übrigen
Patienten gilt der Zeitpunkt der letzten Kontrolluntersuchung bzw. das Sterbedatum als
Endpunkt.
Bei zeitabhängigen Fragestellungen wird zur Detektion signifikanter Differenzen ein
Log-Rang-Test vorgenommen.
2.2.5.
EDV-gestützte Auswertung, Statistik und Erstellung von Grafiken
Die Erstauswertung der durch die qRT-PCR erhaltenen Datensätze erfolgt mit dem Programm Sequence Detection Software Version 1.4 (Applied Biosystems®). Für die weitere
statistische Analyse sowohl des genetischen, als auch des immunhistologischen Versuchsteils werden die Programme SPSS® 16 (SPSS Inc.) und Excel® 2007 (Microsoft®) eingesetzt.
Die in der Arbeit enthaltenen Grafiken werden entweder anhand eigener Ergebnisse, oder
auf Basis von Abbildungen aus wissenschaftlichen Publikationen erstellt. Um bei der Verwendung fremder Abbildungen reproduktionsbedingte Ungenauigkeiten zu vermeiden,
wird darauf geachtet, Überarbeitungen ausgehend von einer digitalen Ursprungsdatei,
möglichst in Form einer Vektorgrafik, durchzuführen. Die entsprechenden Quellen sind im
Literaturverzeichnis angegeben. Die verwendeten Grafikprogramme sind CorelDraw® X4
(Corel® Corporation) und Photoshop® CS3 (Adobe® Systems Incorporated).
Verfasst wird die Arbeit in Word 2007 (Microsoft®).
29
Ergebnisse
3.
Ergebnisse
3.1.
Histologie – Analysen des Gradings und der Gewebemorphologie
Der histologische Versuchsteil dient der Bestimmung des Tumorgradings und der qualitativen Beurteilung der zur Verfügung stehenden Gewebeproben (Anteil von Nekrosearealen und Normalgewebe). Ergänzt durch klinische Details über die Patienten bilden diese
Daten die Basis für die Auswahl der mittels qRT-PCR zu untersuchenden Gewebe.
Niedrig
n=5
Hoch & Rezidiv
n=10
Mittel
n=3
Rezidiv
n=7
Hoch
n=3
Abb. 8: Verteilung der histologisch untersuchten Tumoren auf Malignitätsrisikogruppen
nach Fletcher et al. [36]. Die Hochrisikogruppe ist in der rechten Teilgrafik zusätzlich in
Primärtumoren und Rezidive aufgeschlüsselt.
Insgesamt wurden 66 Proben von 18 Patienten untersucht. 13 Primärtumoren traten im
Bereich des Magens auf, 5 stammen aus den verschiedenen Abschnitten des Dünndarms.
Wie aus Abbildung 8 ersichtlich, sind 10 Tumoren der Gruppe mit dem höchsten Malignitätsrisiko nach Fletcher et al. zuzuordnen, wobei sich dieser Wert aus Rezidiv-Tumoren
(n = 7) und als Hochrisiko zu klassifizierenden Primärtumoren (n = 3) zusammensetzt. Im
Falle der Rezidivtumoren wird ergänzend jeweils auch der Primärtumor des betreffenden
Patienten beurteilt, welche sich ebenso ohne Ausnahme der Hochrisikogruppe zugehörig
finden. Die mittlere Risikogruppe zeigt sich für 3 Tumoren zutreffend und 5 Tumoren weisen ein niedriges Malignitätsrisiko auf.
30
Ergebnisse
Abbildung 9 zeigt Beispiele für die unterschiedlichen Gradingstufen der Tumoren. Der
Anteil an intaktem Tumorgewebe ist bei der Mehrheit der Proben so hoch, dass die ausschließliche Verwendung von Proben mit einem Anteil von ≥ 90 % für die Isolation der
RNA sichergestellt ist.
Abb. 9: Hämatoxylin-Eosin Färbung Gastrointestinaler Stromatumoren aus verschiedenen Risikogruppen
nach Fletcher et al. [36]
A = Niedriges Malignitätsrisiko
B = Mittleres Malignitätsrisiko
C = Hohes Malignitätsrisiko
D = Rezidivtumor (Hohes Malignitätsrisiko)
31
Ergebnisse
3.2.
Genetik – Analysen der Gentranskription
Das Verfahren der qRT-PCR wurde gewählt, da es eine sensitive und parallele Untersuchung einer Vielzahl von Genen ermöglicht. Aufgrund dieser Eigenschaften ist es optimal
für ein umfassendes Screening der zellulären Signaltransduktionswege zur Identifikation
auffälliger Transkriptionsveränderungen geeignet.
In drei unterschiedlichen Ansätzen werden Tumor- und Normalgewebe, zwei Rezidive
eines Patienten und zwölf Tumoren unterschiedlicher Gradingstufen untersucht.
3.2.1.
Vergleichende Analyse von Tumor- und Normalgewebe
Das Cyclin-CDK-System und der p53-Signalweg sind zwei der wichtigsten Regulatoren des
Zellzyklus [34, 38]. Das Cyclin-CDK-System kontrolliert direkt den Übergang der Zelle in die
verschiedenen Zyklusstadien, wohingegen das Tumorsuppressorgen p53 mit seinem weitverzweigten Signalweg Vorgänge wie Zellzyklus-Arrest oder Apoptose bei DNA-Schäden
und Zelldifferenzierung steuert. Aufgrund ihrer Funktion ist nachvollziehbar, dass beide
eine zentrale Rolle in der Pathophysiologie verschiedener Tumorentitäten spielen [34, 38,
43, 123]. Auch für GIST konnte in verschiedenen Arbeiten eine Assoziation von immunhistochemischer p53-Positivität mit gesteigerter klinischer Malignität nachgewiesen werden [50, 72, 126].
Ausgehend von dieser Grundlage wird bei der ersten qRT-PCR die Transkription von Genen des Cyclin-CDK-Systems und des p53-Signalwegs (Gen-Set 1) im Vergleich von Tumormit Normalgewebe untersucht. Hinweisen auf Veränderungen im Transkriptionsmuster
kann dann in den Folgeversuchen durch Anpassung des Gen-Sets spezifischer nachgegangen werden. Da GIST in allen Abschnitten des Gastrointestinaltraktes auftreten, das physiologische Expressionsmuster sich jedoch in Abhängigkeit von der Lokalisation stark unterscheidet, ist die Definition eines gesunden Referenzgewebes schwierig. Durch die Heterogenität des Normalgewebes könnten pathologische Veränderungen überbetont oder
maskiert werden. Aus diesem Grund wird der Versuch mit Tumor- und Normalgewebe
eines einzelnen Patienten durchgeführt. Um ein möglichst fortgeschrittenes Tumorstadium zu garantieren, wird Probenmaterial eines Rezidiv-Falles ausgewählt.
Tab. 4: Klinische und pathologische Daten des untersuchten Patienten und Tumors
Malignitätsrisiko Mitoserate Größe Primärlokalisation
Rezidiv
47
9,5
Jejunum
Zelltyp
spindelzellig
Alter Geschlecht
53
weiblich
32
Ergebnisse
Die nachgewiesenen Transkriptionsveränderungen sind in den Grafiken 10 und 11 dargestellt.
Transkriptionssteigerungen im Tumor, wel-
Genen CDKN2A (Cyclin-dependent kinase
inhibitor 2A, p16) mit 21,1-facher Erhöhung,
RPRM (Reprimo, TP53 dependent G2 arrest
mediator candidate) mit 16,3-, BCL2 (B-cell
CLL/lymphoma 2) mit 11,5- und CCNH (Cyc-
25,0
Relative Abweichung (RD)
che den Faktor 10 übertreffen, sind bei den
21,1
20,0
16,3
15,0
11,5
10,0
10,2
9,6
5,0
0,0
lin H) mit 10,2-facher Erhöhung nachweisbar.
Auch CCNB2 (Cyclin B2) liegt mit einem Abweichungsfaktor (RD) von 9,6 deutlich über
dem gewählten Grenzwert von ±5,0 facher
Veränderung.
Abb. 10: Gene mit gesteigerter Transkription im
Tumorgewebe (Ergebnis der qRT-PCR im Vergleich mit Normalgewebe)
CDKN2A = Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A
RPRM = Reprimo
BCL2 = B-cell CLL/lymphoma 2
CCNH = Cyclin H
CCNB2 = Cyclin B2
Zudem sind erniedrigte Transkriptionsaktivi-
sinkinase IGF1R (Insulin-like growth factor 1
receptor), welche mit einem RD-Faktor
von -58,8 am stärksten verändert ist, und
für PRKCA (Protein kinase C, alpha) mit -34,5
festzustellen. Desweiteren ist das mit Karzi-
0,0
Relative Abweichung (RD)
täten für die KIT-verwandte Rezeptortyro-
-10,0
-20,0
-18,2
-30,0
-40,0
-34,5
-50,0
-60,0
-70,0
-58,8
nomen der Mamma assoziierte Gen BRCA2
(Breast cancer 2, early onset) um den Faktor -18,2 erniedrigt.
Abb. 11: Gene mit verminderter Transkription
im Tumorgewebe (Ergebnis der qRT-PCR im
Vergleich mit Normalgewebe)
IGF1R = Insulin-like growth factor 1 receptor
PRKCA = Protein kinase C, alpha
BRCA2 = Breast cancer 2, early onset
33
Ergebnisse
3.2.2.
Vergleichende Analyse zweier Tumorrezidive im Verlauf
Nachdem der Nachweis veränderter Transkriptionsmuster im Vergleich von Tumor- und
Normalgewebe erfolgreich war, folgt im nächsten Experiment die Betrachtung von zwei
Rezidivtumoren eines Patienten, welche mit einem zeitlichen Intervall von 4 Jahren auftraten. Da beide Gewebeproben vom selben Patienten stammen, bietet sich die Möglichkeit, unter Ausschluss interindividueller Differenzen, die Transkriptionsveränderungen im
Rahmen der Tumorprogression über einen vierjährigen Zeitraum zu untersuchen.
Unter Beachtung der Ergebnisse der Untersuchung von Tumor- und Normalgewebe wird
ein neues Set von Testgenen ausgewählt (Gen-Set 2), um spezifischer auf die im Vorversuch auffälligen Systeme und die bekannten GIST-assoziierten Signalwege einzugehen.
Zum Einen werden weitere Cyclin-assoziierte Gene untersucht, um das Cyclin-CDK-System
umfassend analysieren zu können. Außerdem werden Gene des MAPK-Signalwegs ergänzt, für den eine wichtige Rolle in der Pathogenese von GIST angenommen wird.
Tab. 5: Klinische und pathologische Daten des untersuchten Patienten und Tumors
Malignitätsrisiko Mitoserate Größe Primärlokalisation
Rezidiv
89/>100
11/3
Gaster
Zelltyp
gemischtzellig 67/71
Alle bei dieser Untersuchung auffälligen Verän-
Gene, welche im zweiten Rezidiv vermehrt exprimiert werden. Erneut fällt eine starke Erhöhung bei CDKN2A auf, welche die Werte des vorangehenden Versuchs noch übersteigt, und einen RD-Wert von 77,3 erreicht. Die Transkription
100,0
Relative Abweichung (RD)
derungen der Transkriptionsaktivität betreffen
Alter Geschlecht
männlich
77,3
39,8
13,1
10,0
6,6
5,2
1,0
von MEF2C (Myocyte enhancer factor 2C) ist auf
das 39,8-fache und CDKN2B (Cyclin-dependent
kinase inhibitor 2B) auf das 13,1-fache gesteigert. Im Bereich unter einem RD von ±10 folgen
die Gene CDK6 (Cyclin-dependent kinase 6) und
MAP3K1 (Mitogen-activated protein kinase
kinase kinase 1) mit den relativen Abweichungs-
Abb. 12: Mit fortschreitender Progression veränderte Gene (Ergebnis der qRT-PCR zweier
Rezidive im Vergleich):
CDKN2A = cyclin-dependent kinase inhibitor 2A
MEF2C = myocyte enhancer factor 2C
CDKN2B = cyclin-dependent kinase inhibitor 2B
CDK6 = cyclin-dependent kinase 6
MAP3K1 = mitogen-activated protein kinase
kinase kinase 1
faktoren 6,6 und 5,2.
34
Ergebnisse
3.2.3.
Vergleichende Analyse von Tumoren unterschiedlichen Gradings
Im abschließenden qRT-PCR-Versuch wird ein Stellvertreterkollektiv von zwölf Tumoren
verschiedener Patienten mit unterschiedlichem Grading untersucht. Entsprechend dem
Malignitätsrisiko nach Fletcher et al. (siehe Tab. 6) werden drei Versuchsgruppen (Niedrig,
Mittel und Hoch) mit je drei Gewebeproben gebildet [36]. Zusätzlich wird eine Gruppe mit
Proben von Rezidivtumoren ergänzt, unter der Annahme, dass diese in der Onkogenese
am weitesten fortgeschritten sind und daher die ausgeprägtesten Transkriptionsveränderungen aufweisen sollten. Die Auswahl der einzelnen Patienten erfolgt auf der Basis der
vorangegangenen histologischen Beurteilung.
Bei diesem Versuch wird die bereits im Vorversuch verwendete Zusammenstellung Cyclin-CDK- und MAP-Kinase-assoziierter Gene untersucht (Gen-Set 2).
Tab. 6: Klinische und pathologische Daten der untersuchten Patienten und der Tumoren
Malignitätsrisiko Mitoserate Größe Primärlokalisation
Zelltyp
Alter Geschlecht
Niedrig (Referenz)
Niedrig
Niedrig
0
1
1
2,8
4,4
4,7
Jejunum
Duodenum
Gaster
spindelzellig
gemischtzellig
spindelzellig
76
62
55
männlich
weiblich
weiblich
Mittel
Mittel
Mittel
2
2
4
7,5
7,5
5,5
Gaster
Gaster
Gaster
spindelzellig
spindelzellig
spindelzellig
62
62
69
männlich
männlich
männlich
Hoch
Hoch
Hoch
10
10
11
6,5
20
4,8
Ileum
Gaster
Jejunum
spindelzellig
spindelzellig
gemischtzellig
63
68
64
weiblich
männlich
weiblich
Rezidiv
Rezidiv
Rezidiv
47
89
>100
9,5
11
3
Jejunum
Gaster
Gaster
spindelzellig
gemischtzellig
gemischtzellig
53
67
71
weiblich
männlich
männlich
Wie in den vorhergehenden Versuchen wird die Menge an mRNA der untersuchten Gene
als Abweichungsfaktor (RD) relativ zu einer Referenzprobe bestimmt. Als Referenz wird
der Patient mit dem niedrigsten Malignitätsrisiko nach der Fletcher-Klassifikation definiert
(1. Zeile der Tabelle 6).
Die ausgeprägtesten Auffälligkeiten finden sich bei den verschiedenen Cyclinen und ihren
zugehörigen Kinasen. Die folgenden Ergebnisse sind daher bereits nach ihrer funktionellen Zusammengehörigkeit im Cyclin-CDK-System gruppiert, auf welche im Diskussionsteil
der Arbeit näher eingegangen wird.
35
Ergebnisse
Bei beiden Subtypen der Typ-B Cycline fällt eine sprunghafte Steigerung der Transkriptionsaktivität zwischen den Primärtumoren und den Proben der Rezidivgruppe auf. Im Fall
von Cyclin B1 (CCNB1) weisen die Rezidive im Vergleich zur Referenzprobe durchschnittlich die 7,5-fache mRNA-Menge auf, bei Cyclin B2 beläuft sich der Anstieg auf den Faktor 12,8. Die maximale Spanne der Schwankung zwischen den Einzelproben beläuft sich
für CCNB1 auf 24,2-fache, für CCNB2 auf 74,0-fache Veränderung.
Tab. 7: Ergänzende Berechnungen zur Transkriptionsaktivität der Gene für Cyclin (CCN) B1 und B2 in Abhängigkeit
der vier Versuchsgruppen
Geometrische Mittel ( ) der RD-Werte der vier Versuchsgruppen ± Standardabweichung,
Geometrische Mittel der RD-Werte aller drei Primärtumorgruppen ± Standardabweichung
Malignitätsrisiko
Mittel
Hoch
Rezidiv
Niedrig
Mittel
Hoch
Rezidiv
CCNB2
Niedrig
CCNB1
der Gruppe
±SD
1,8
-1,6
2,0
7,5
2,4
1,3
1,6
12,8
±4,0
±0,6
±4,6
±3,6
±6,0
±3,8
±14,2
±1,3
Primärtumoren ±SD
1,3
1,7
±3,7
±8,3
RD
RD
12,0
CCNB2
20,0
10,0
17,5
8,0
15,0
12,5
6,0
10,0
4,0
7,5
2,0
5,0
2,5
±1,0
Versuchsgruppe
iv
z id
Re
ch
Ho
i tt
el
M
ed
-5,0
Ni
iv
ch
z id
Re
Ho
i tt
el
M
Ni
ed
r ig
-3,0
r ig
-2,5
Versuchsgruppe
Abb. 13: Box & Whiskers-Plots der relativen Transkriptionsaktivität der Gene Cyclin (CCN) B1 und B2:
Auf der X-Achse aufgeschlüsselt nach den vier Versuchsgruppen
Auf der Y-Achse ist der relative Abweichungsfaktor gegenüber der Referenzprobe (Wert 1,0) dargestellt (RD-Wert).
36
Ergebnisse
Auch für die Gene der Cycline A2 und E1 (CCNA2 und CCNE1) weisen die Tumoren der
Rezidivgruppe die höchste Transkriptionsrate auf, wobei die mittlere Zunahme der Transkriptionsaktivität bei Cyclin A2 mit einem Faktor von 11,1 ausgeprägter ist als bei Cyclin E1 (Faktor 3,0). Außerdem zeigt sich bei der Betrachtung von Cyclin E1 im Bereich der
Primärtumoren mit zunehmendem Malignitätsrisiko eine leichte Abnahme der Transkriptionsrate. Beide Cycline interagieren mit der Cyclin-dependent kinase 2 (CDK2), die ebenfalls dargestellt ist. Die CDK2-Transkription verhält sich über alle Gruppen hinweg sehr
stabil, mit steigendem Malignitätsrisiko finden sich einzelne leicht erhöhte Werte.
Tab. 8: Ergänzende Berechnungen zur Transkriptionsaktivität der Gene für Cyclin (CCN) A2, E1 und Cyclindependent-kinase 2 (CDK2) in Abhängigkeit der vier Versuchsgruppen
Geometrische Mittel ( ) der RD-Werte der vier Versuchsgruppen ± Standardabweichung,
Geometrische Mittel der RD-Werte aller drei Primärtumorgruppen ± Standardabweichung
Malignitätsrisiko
Hoch
Rezidiv
Niedrig
Mittel
Hoch
Rezidiv
Niedrig
Mittel
Hoch
Rezidiv
CDK2
Mittel
CCNE1
Niedrig
CCNA2
der Gruppe
±SD
2,8
1,1
3,2
11,1
1,7
-1,1
-1,2
3,0
1,1
-1,2
1,3
1,5
±6,2
±1,5
±9,7
±6,5
±0,9
±2,6
±3,6
±0,4
±1,4
±1,4
±2,1
±2,1
Primärtumoren ±SD
2,2
1,1
1,1
±6,5
±2,5
±1,5
RD
CCNA2
RD
CCNE1
RD
3,5
18,0
16,0
2,5
14,0
12,0
1,5
10,0
8,0
-1,5
6,0
4,0
-2,5
Re
iv
Versuchsgruppe
iv
z id
z id
ch
Re
Ho
ch
el
itt
Ho
M
i tt
el
r ig
M
ed
ed
iv
ch
z id
Re
Ho
i tt
el
M
r ig
ed
Ni
Versuchsgruppe
Ni
Ni
-3,5
-2,0
r ig
2,0
Versuchsgruppe
Abb. 14: Box & Whiskers-Plots der relativen Transkriptionsaktivität der Gene Cyclin (CCN) A2, E1 und Cyclindependent-kinase 2 (CDK2):
Auf der X-Achse aufgeschlüsselt nach den vier Versuchsgruppen
Auf der Y-Achse ist der relative Abweichungsfaktor gegenüber der Referenzprobe (Wert 1,0) dargestellt (RD-Wert).
37
Ergebnisse
Eine vergleichbar prominente Position der Rezidivgruppe wie bei den bereits dargestellten Genen findet sich bei den Typ-D Cyclinen nicht. CCND2 und -D3 zeigen nur geringe
Abweichungen von der Referenzprobe und verhalten sich unspezifisch. Lediglich Cyclin D1
(CCND1) weist deutliche Schwankungen auf. Obwohl sich auch hier aufgrund der starken
Streuung keine Versuchsgruppe komplett abgrenzt, finden sich in allen Gruppen einzelne
Proben, bei denen eine auffällige Reduktion der Transkriptionsrate vorliegt. Das Ausmaß
dieser Veränderung nimmt mit steigendem Malignitätsrisiko tendenziell zu und erreicht in
der Gruppe der Rezidivtumoren den Faktor -125,0.
Tab. 9: Ergänzende Berechnungen zur Transkriptionsaktivität der Gene für Cyclin (CCN) D1, D2 und D3 in Abhängigkeit
der vier Versuchsgruppen
Geometrische Mittel ( ) der RD-Werte der vier Versuchsgruppen ± Standardabweichung,
Geometrische Mittel der RD-Werte aller drei Primärtumorgruppen ± Standardabweichung
Hoch
Rezidiv
Niedrig
Mittel
Hoch
Rezidiv
Niedrig
Mittel
Hoch
Rezidiv
der Gruppe
±SD
CCND3
Mittel
Malignitätsrisiko
CCND2
Niedrig
CCND1
-2,7
-15,0
-19,5
-11,3
1,3
2,5
2,0
-1,1
-1,8
-1,6
-1,1
-2,1
±12,4 ±52,1 ±35,2 ±70,1
±0,4
±3,0
±0,2
±3,9
±2,5
±0,6
±1,6
±1,6
Primärtumoren ±SD
-9,2
1,8
-1,4
±35,6
±1,6
±1,8
RD
RD
RD
1,5
CCND3
±1,0
-1,5
-2,0
-2,5
-3,0
-3,5
Ni
e
ig
dr
M
el
itt
c
Ho
h
Re
z id
iv
Versuchsgruppe
Ni
e
ig
dr
M
el
itt
-4,0
c
Ho
h
Re
z id
iv
Versuchsgruppe
Ni
ed
r ig
M
el
itt
Ho
ch
Re
z id
iv
Versuchsgruppe
Abb. 15: Box & Whiskers-Plots der relativen Transkriptionsaktivität der Gene Cyclin (CCN) D1, D2 und D3:
Auf der X-Achse aufgeschlüsselt nach den vier Versuchsgruppen
Auf der Y-Achse ist der relative Abweichungsfaktor gegenüber der Referenzprobe (Wert 1,0) dargestellt (RD-Wert).
38
Ergebnisse
Ähnlich unspezifisch wie bei den D-Cyclinen verhält es sich mit der zugehörigen Kinase
CDK4. Sie wird über alle Gruppen hinweg sehr konstant transkribiert und zeigt keine klare
Richtungstendenz, ein einzelner Ausreißer in der Gruppe mit mittlerem Malignitätsrisiko
fällt auf, es findet sich jedoch auch hier nur eine Verminderung um den Faktor -3,6.
Indessen weist die Rezidivgruppe bei der Untersuchung von CDK6 deutlich reduzierte
Werte auf. Im Mittel wird hier weniger als ein Zehntel der in der Referenzprobe gefundenen mRNA-Menge nachgewiesen. Im Vergleich mit allen Primärtumoren ist die Menge
immer noch um den Faktor -7,1 verringert.
Tab. 10: Ergänzende Berechnungen zur Transkriptionsaktivität der Gene Cyclin-dependent-kinase (CDK) 4 und 6
in Abhängigkeit der vier Versuchsgruppen
Geometrische Mittel ( ) der RD-Werte der vier Versuchsgruppen ± Standardabweichung,
Geometrische Mittel der RD-Werte aller drei Primärtumorgruppen ± Standardabweichung
Malignitätsrisiko
Mittel
Hoch
Rezidiv
Niedrig
Mittel
Hoch
Rezidiv
CDK6
Niedrig
CDK4
der Gruppe
±SD
-1,3
-1,8
-1,0
-1,2
-2,1
-1,2
-2,3
-12,5
±1,5
±2,4
±1,6
±1,6
±4,2
±2,5
±4,1
±13,0
Primärtumoren ±SD
-1,4
-1,8
±1,7
±3,4
RD
RD
CDK6
±1,0
-5,0
-10,0
-15,0
-20,0
-25,0
-30,0
Ni
ed
r ig
M
el
itt
Ho
ch
Re
zi
v
di
Versuchsgruppe
Ni
ed
r ig
M
el
itt
Ho
ch
Re
z id
iv
Versuchsgruppe
Abb. 16: Box & Whiskers-Plots der relativen Transkriptionsaktivität der Gene Cyclin-dependent-kinase (CDK) 4
und 6:
Auf der X-Achse aufgeschlüsselt nach den vier Versuchsgruppen
Auf der Y-Achse ist der relative Abweichungsfaktor gegenüber der Referenzprobe (Wert 1,0) dargestellt (RD-Wert).
39
Ergebnisse
Die CDK-Inhibitoren der Familie 1 geben insgesamt ein gemischtes Bild ab. Der Vertreter A bewegt sich in den meisten Proben innerhalb einer relativen Abweichung um den
Faktor ±3, lediglich einzelne Patienten der Hochrisiko- und Rezidivgruppe weisen deutlichere Erhöhungen auf (bis Faktor 5,2). CDKN1B zeigt, mit einer schwachen Abwärtstendenz, die stabilsten Werte, deren Spanne zwischen größtem und kleinstem Wert lediglich
den Faktor 4,5 erreicht. Auch das letzte Mitglied dieser Inhibitorengruppe zeigt zunächst
einen Abwärtstrend im Bereich der Primärtumoren. Die Gruppe der Rezidivtumoren liegt
jedoch, trotz einer einzelnen deutlich erniedrigten Probe (Faktor -16,3), im Mittelwert
etwa auf dem Niveau der Gruppe mittleren Malignitätsrisikos, so dass dieser Trend unterbrochen wird.
Tab. 11: Ergänzende Berechnungen zur Transkriptionsaktivität der Gene Cyclin-dependent-kinase-inhibitor (CDKN)
1A, 1B und 1C in Abhängigkeit der vier Versuchsgruppen
Geometrische Mittel ( ) der RD-Werte der vier Versuchsgruppen ± Standardabweichung,
Geometrische Mittel der RD-Werte aller drei Primärtumorgruppen ± Standardabweichung
Hoch
Rezidiv
Niedrig
Mittel
Hoch
Rezidiv
Niedrig
Mittel
Hoch
Rezidiv
der Gruppe
±SD
CDKN1C
Mittel
Malignitätsrisiko
CDKN1B
Niedrig
CDKN1A
-1,2
2,0
2,4
2,1
-1,2
-1,6
-1,5
-2,0
1,3
-1,4
-2,7
-1,5
±2,3
±0,8
±1,7
±2,2
±1,4
±1,9
±0,2
±1,5
±2,1
±1,7
±1,9
±10,7
Primärtumoren ±SD
1,6
-1,4
-1,4
±1,9
±1,3
±2,4
RD
CDKN1A
RD
RD
CDKN1C
3,0
5,0
2,0
4,0
±1,0
3,0
-2,0
-3,0
2,0
-4,0
±1,0
-5,0
-2,0
-9,1
Versuchsgruppe
Versuchsgruppe
Re
zid
iv
Ho
ch
itt
el
M
rig
-16,4
Ni
ed
iv
Re
zid
iv
Re
z id
Ho
ch
h
itt
el
M
c
Ho
rig
e
el
itt
M
Ni
ig
dr
Ni
ed
-3,0
Versuchsgruppe
Abb. 17: Box & Whiskers-Plots der relativen Transkriptionsaktivität der Gene Cyclin-dependent-kinase-inhibitor
(CDKN) 1A, 1B und 1C:
Auf der X-Achse aufgeschlüsselt nach den vier Versuchsgruppen
Auf der Y-Achse ist der relative Abweichungsfaktor gegenüber der Referenzprobe (Wert 1,0) dargestellt (RD-Wert).
40
Ergebnisse
Auch aus der zweiten Familie von CDK-Inhibitoren werden vier verschiedene Vertreter
untersucht. CDKN2A und -B weisen eine sehr ähnliche Verteilung auf, mit den niedrigsten
mRNA-Mengen in der Rezidivgruppe. Sowohl in dieser, als auch in der Mittleren Risikogruppe werden bei einzelnen Proben sehr stark verminderte Transkriptionsaktivitäten
nachgewiesen. Ein Rezidivtumor erreicht bei der Untersuchung von CDKN2A mit einer
Transkriptionsabnahme um den Faktor -1 275,0 die stärkste im Rahmen dieser Arbeit gemessene Veränderung. Interessanterweise schwankt die mRNA-Menge in der Hochrisikogruppe bei beiden Genen wesentlich weniger.
Tab. 12: Ergänzende Berechnungen zur Transkriptionsaktivität der Gene Cyclin-dependent-kinase-inhibitor (CDKN)
2A und 2B in Abhängigkeit der vier Versuchsgruppen
Geometrische Mittel ( ) der RD-Werte der vier Versuchsgruppen ± Standardabweichung,
Geometrische Mittel der RD-Werte aller drei Primärtumorgruppen ± Standardabweichung
Hoch
Rezidiv
Niedrig
Mittel
Hoch
Rezidiv
der Gruppe
±SD
Mittel
Malignitätsrisiko
CDKN2B
Niedrig
CDKN2A
-4,7
-41,8
-4,8
-60,9
-3,1
-4,8
-1,6
-9,9
±13,7 ±182,7 ±1,5 ±728,3
Primärtumoren ±SD
RD
±7,1
±6,3
±0,2
±31,6
-9,8
-2,9
±108,3
±5,2
CDKN2A
±1,0
RD
CDKN2B
±1,0
-50,0
-5,0
-100,0
-150,0
-200,0
-10,0
-250,0
-300,0
-15,0
-350,0
-27,0
-628,9
-1275,2
N
d
ie
r ig
M
itt
el
Ho
ch
R
id
ez
iv
Versuchsgruppe
-58,8
Ni
ed
r ig
M
el
itt
Ho
ch
Re
z id
iv
Versuchsgruppe
Abb. 18: Box & Whiskers-Plots der relativen Transkriptionsaktivität der Gene Cyclin-dependent-kinase-inhibitor
(CDKN) 2A und 2B:
Auf der X-Achse aufgeschlüsselt nach den vier Versuchsgruppen
Auf der Y-Achse ist der relative Abweichungsfaktor gegenüber der Referenzprobe (Wert 1,0) dargestellt (RD-Wert).
41
Ergebnisse
Die Verteilung von CDKN2C und -D zeigt erneut Ähnlichkeiten. Im Gegensatz zu den ersten beiden Vertretern der Familie findet sich jedoch bei beiden Genen mit steigendem
Malignitätsrisiko auch ein Transkriptionsanstieg, welcher allerdings eher diskret ausfällt.
Bei CDKN2D ist die Streuung innerhalb der einzelnen Gruppen größer, als die Differenzen
zwischen ihnen. CDKN2C weist eine weniger starke Streuung in den Gruppen auf und erreicht von den Niedrigrisikotumoren zu den Rezidiven im Mittel einen Anstieg um den
Faktor 5,3.
Tab. 13: Ergänzende Berechnungen zur Transkriptionsaktivität der Gene Cyclin-dependent-kinase-inhibitor (CDKN)
2C und 2D in Abhängigkeit der vier Versuchsgruppen
Geometrische Mittel ( ) der RD-Werte der vier Versuchsgruppen ± Standardabweichung,
Geometrische Mittel der RD-Werte aller drei Primärtumorgruppen ± Standardabweichung
Hoch
Rezidiv
Niedrig
Mittel
Hoch
Rezidiv
der Gruppe
±SD
Mittel
Malignitätsrisiko
CDKN2D
Niedrig
CDKN2C
-1,5
-1,3
2,0
3,4
1,5
-1,0
2,6
3,4
±2,2
±7,0
±5,1
±1,7
±3,1
±5,9
±2,8
±2,3
Primärtumoren ±SD
-1,0
1,6
±4,9
±3,8
RD
RD
CDKN2D
7,0
5,0
3,0
±1,0
-3,0
Versuchsgruppe
-5,0
Re
zid
iv
iv
Ho
ch
Re
z id
itt
el
h
M
M
c
Ho
rig
e
el
itt
Ni
ed
Ni
ig
dr
Versuchsgruppe
Abb. 19: Box & Whiskers-Plots der relativen Transkriptionsaktivität der Gene Cyclin-dependent-kinase-inhibitor
(CDKN) 2C und 2D:
Auf der X-Achse aufgeschlüsselt nach den vier Versuchsgruppen
Auf der Y-Achse ist der relative Abweichungsfaktor gegenüber der Referenzprobe (Wert 1,0) dargestellt (RD-Wert).
42
Ergebnisse
3.3.
Immunhistochemie – Analysen der Proteinexpression
Ebenso wie die Transkription, wird auch die Translation durch Kontroll- und Steuerungsmechanismen wie beispielsweise die auch für GIST relevante PI3K-AKT-Signalkaskade genau reguliert. Deshalb ist eine zusätzliche Verifikation der Daten, welche durch die
PCR-Versuche gewonnen wurden, auf Proteinebene sinnvoll. Als Methode bietet sich
hierfür die Immunhistochemie an, die zusätzlich eine Erweiterung des Kollektivs auf eine
statistisch aussagekräftige Größe ermöglicht.
Als Gegenstand der Untersuchung wird Cyclin H ausgewählt, welches als Untereinheit der
CAK (CDK-activating kinase) eine zentrale Rolle bei der Regulation des Cyclin-CDK-Systems
und folglich des Zellzyklus innehat. Darüber hinaus wurde bei der genetischen Untersuchung von Tumor- und Normalgewebe eine Steigerung der Transkriptionsaktivität dieses
Gens um den Faktor 10,2 im Tumor festgestellt.
Die Untersuchungen werden an einem neuen Kollektiv
Sehr
Niedrig
15,5%
n=14
von 92 Tumorproben durchgeführt. Die Verteilung der
Tumoren auf die Risikogruppen nach Fletcher et al. ist
in Abbildung 20 dargestellt [36].
Das Erkrankungsalter liegt im Median bei 66,48 Jahren
(Mittel 64,36 Jahre), die Geschlechterverteilung ist mit
Niedrig
22,2%
n=20
Hoch
41,1%
n=37
Mittel
21,1%
n=19
45,65 % (n = 42) männlichen und 54,35 % (n = 50) weiblichen Patienten etwa ausgeglichen. 60,87 % (n = 56)
der Tumoren entstammen dem Magen und 30,43 %
(n = 28) dem Dünndarm. In den übrigen 8,70 % (n = 8) be-
Abb. 20: Aufschlüsselung des für die
immunhistochemische Untersuchung
verwendeten Tumorkollektivs (n = 92)
nach der Klassifizierung von Fletcher et
al. [36]
fand sich der Primärtumor an anderen intestinalen oder extraintestinalen Lokalisationen.
Die Größe der Tumoren variiert zwischen 0,4 und 30,0 Zentimeter (Median 5,00 cm; Mittel 7,36 cm), während die Mitoserate auf 50 HPF von 0 bis 116 Mitosen reicht (Median 4;
Mittel 10,74). Die mediane Followup-Dauer der überlebenden Patienten beträgt 5,4 Jahre
(Mittel 6,33; Spannweite 2,28 bis 20,20 Jahre), die des gesamten Kollektivs 4,86 Jahre
(Mittel 5,11; Spannweite 0,00 bis 20,20 Jahre). Der Anteil der Patienten mit metastatischer Ausstreuung stieg im Laufe der Nachbeobachtung von 15,22 % (n = 14) mit primär
metastasierten Tumoren auf 29,35 % (n = 27). 17,39 % (n = 16) der Patienten verstarben
tumorbedingt (tumorspezifischer Exitus letalis, TSE). Die tumorspezifische 1-, 3-, und 543
Ergebnisse
Jahres Überlebenswahrscheinlichkeit (TSÜ) des Gesamtkollektives beträgt 95,5 %, 87,2 %
und 82,8 % und das tumorfreie-Überleben (TFÜ) 79,2 %, 75,6 % und 71,3 %. Das unspezifische Gesamt-Überleben beträgt 67,39 % (n = 62).
Die in Paraffin eingebetteten Gewebe werden geschnitten, rehydriert und mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes Cyclin H und einem peroxidasebasierten Sekundärantikörper-System immunhistochemisch gefärbt (Abbildung 21).
Abb. 21: Ausschnitte verschiedener Präparate nach immunhistochemischer Cyclin H-Färbung.
Die Teilbilder B bis E zeigen Beispiele aus den vier, durch den unterschiedlich hohen Anteil Cyclin H-positiver Zellen
definierten, Gruppen:
A = Negativ
B = ≥ 10 - < 25 % positive Zellen
C = ≥ 25 - < 50 % positive Zellen
D =≥ 50 - < 75 % positive Zellen
E = ≥ 75 % positive Zellen
44
Ergebnisse
Die Auswertung ergibt folgende Verteilung: 79,3 % der Präparate (n = 73) zeigen weniger
als 10 % Cyclin H-positive Zellkerne und werden als negativ gewertet. Bei 20,7 % der Tumoren (n = 19) wird dieser cut-off überschritten. 5,4 % (n = 5) weisen ≥ 10 - < 25 % reaktive
Kerne auf, die zweite Gruppe enthält 7,6 % (n = 7) der Tumoren mit ≥ 25 - < 50 % positiven
Kernen, weitere 5,4 % (n = 5) mit ≥ 50 - < 75 % bilden die Gruppe drei und 2,2 % (n = 2) der
Tumoren, bei denen sich ≥ 75 % der Kerne positiv darstellen, werden der Gruppe vier zugeordnet. Die Ergebnisse sind in Abb. 22 grafisch dargestellt.
≥ 75 %
2,2%; n=2
≥ 50 - < 75 %
5,4%; n=5
Negativ (<10%)
79,3%; n=73
Positiv (≥10%)
20,7%; n=19
≥ 25 - < 50 %
7,6%; n=7
≥ 10 - < 25 %
5,4%; n=5
Anteil Cyclin H-positiver Zellkerne:
≥ 75 %
≥ 50 - < 75 %
≥ 25 - < 50 %
≥ 10 - < 25 %
< 10 %
In der Gruppe mit sehr-niedrigem Malignitätsrisiko
nach Fletcher et al. zeigt sich im Vergleich mit dem
Rest-Kollektiv ein um den Faktor 3 bis 4 geringerer
Anteil positiv reagierender Tumoren (Abb. 23). Die
statistische Prüfung bezüglich der Unabhängigkeit
von Cyclin H-Status und der Malignitätsrisikogruppe
(Sehr-niedrig gegenüber Nicht-Sehr-niedrig) erreicht
jedoch nicht das Signifikanzniveau (exakter Test
nach
Fisher:
p = 0,285;
OR = 1,053 [0,377; 2,940]).
Quotenverhältnis:
Anteil Cyclin H positiver Tumoren in Prozent
Abb. 22: Ergebnis der immunhistochemischen Färbung von Cyclin H.
Die rechte Teilgrafik zeigt eine Aufschlüsselung der positiven Tumoren (cut-off bei ≥ 10 %)
nach dem Anteil Cyclin H positiver Zellkerne
35
30,0
n=6
30
21,1 21,6
n=4 n=8
25
20
15
10
7,1
n=1
5
0
Malignitätsrisikogruppe
nach Fletcher et al.
Abb. 23: Prozentualer Anteil Cyclin H positiver Tumoren aufgeschlüsselt nach der
Klassifikation von Fletcher et al. [36]
45
Ergebnisse
Während sich auch im tumorfreien Überleben (TFÜ) nur geringe Differenzen zeigen
(χ²-Test: p = 0,811; Quotenverhältnis: OR = 1,138 [0,407; 3,177]), gibt die jeweils um ein
Zehntel geringere tumorspezifische 1-, 3- und 5-Jahres Überlebenswahrscheinlichkeit
(TSÜ) der Patienten mit Cyclin H-positiven Tumoren einen deutlichen Hinweis auf eine
Assoziation von Cyclin H mit erhöhter Malignität (Tab. 14). Aktuell sind in der Gruppe der
Cyclin H-positiven Tumorpatienten 26,3 % (n = 5) tumorbedingt verstorben (TSE), wohingegen nur 15,1 % (n = 11) der Cyclin H-negativen Patienten verstorben sind (χ²-Test:
p = 0,249; Quotenverhältnis: OR = 2,913 [0,603; 6,722]).
Bei der Klassifikation nach Fletcher et al. hat die dichotome Aufteilung in Hochrisiko- und
Nicht-Hochrisikotumoren die größte Relevanz für die Einschätzung der Prognose, da sich
nahezu alle tumorbedingt versterbenden Patienten aus der Hochrisikogruppe rekrutieren (Tab. 14). Im untersuchten Kollektiv ist bisher nur ein einzelner Patient außerhalb der
Hochrisikogruppe (n = 55) tumorbedingt verstorben. Demgegenüber stehen 15 tumorbedingte Todesfälle in der Hochrisikogruppe (n = 37).
Die gezielte Betrachtung des Subkollektivs mit hohem Malignitätsrisiko zeigt ein deutlich
schlechteres Outcome der Patienten mit Cyclin H-positiven Tumoren. Die Werte sind in
Tabelle 14 aufgeführt, die Berechnung des exakten Tests nach Fisher und des
Quotenverhältnisses für den Zusammenhang von Cyclin H-Status und tumorbedingtem
Tod ergeben p = 0,228, OR = 3,167 [0,625; 16,054].
Tab. 14: Tumorspezifische (TSÜ) und tumorfreie (TFÜ) Überlebenswahrscheinlichkeit nach 1, 3 und 5 Jahren
Aufgeschlüsselt nach: Malignitätsrisikogruppen (Hoch vs. Nicht Hoch), Cyclin H-Positivität (Positiv vs. Negativ),
Cyclin H-Positivität im Subkollektiv der Hochrisikotumoren (Positiv vs. Negativ) und nach der Kombination aus
hohem Malignitätsrisiko und Cyclin-H Positivität (Cyclin H positive Hochrisikotumoren vs. gesamter Rest).
1-Jahres
TSÜ (%)
3-Jahres
TSÜ (%)
5-Jahres
TSÜ (%)
1-Jahres
TFÜ (%)
3-Jahres
TFÜ (%)
5-Jahres
TFÜ (%)
Malignitätsrisiko
Hoch
89,0
71,9
61,9
50,8
42,3
36,3
Nicht-Hoch
100
97,8
97,8
98,1
98,1
98,1
Cyclin H-Status
Positiv
89,5
78,9
71, 8
78,9
68,4
68,4
Negativ
97,2
89,5
85,7
79,2
77,7
72,3
Cyclin H-Status (nur Tumoren der hohen Malignitätsrisikogruppe)
Positiv
75,0
50,0
33,3
50,0
25,0
25,0
Negativ
89,5
78,2
69,8
51,0
47,3
39,4
Kombination von hohem Malignitätsrisiko & positivem Cyclin H-Status gegenüber Rest
Hoch & Positiv
75,0
50,0
33,3
50,0
25,0
25,0
Rest
97,6
91,0
87,7
82,0
80,7
75,9
46
Ergebnisse
Tab. 15: Statistische Signifikanztests zum prädiktiven Wert von Cyclin H
Überprüfung der Signifikanz der in Tab. 14 dargestellten Differenzen in der tumorspezifischen (TSÜ) und tumorfreien
(TFÜ) Überlebenswahrscheinlichkeit, sowie der Unabhängigkeit zwischen den verschiedenen Subkollektiven und
tumorspezifischem Exitus letalis (TSE), sowie dem Auftreten von Rezidiven oder Metastasen (Rez/Met)
TSE
Malignitätsrisiko (MR)
Hoch vs. Nicht-Hoch
Cyclin H
Positiv vs. Negativ
Cyclin H (im Kollektiv der Hochrisikotumoren)
Positiv vs. Negativ
Malignitätsrisiko & Cyclin H-Status
Cyclin H-positiv & MR Hoch vs. Rest
TFÜ
Rez/Met
Anzahl
Log-Rang
Log-Rang
χ2 / Fisher
Exakt
n=
<0,001
<0,001
<0,001
<0,001
90
0,249
0,208
0,837
0,811
92
0,228
0,032
0,511
0,685
37
0,004
<0,001
0,001
0,005
90
χ2 / Fisher
Exakt
TSÜ
Zur Beurteilung der unterschiedlichen zeitlichen Verläufe der beiden HochrisikoSubkollektive wird ein Log-Rang-Test mitgeführt, welcher im Bezug auf das
tumorspezifische Überleben einen signifikanten Wert von p = 0,032 erbringt (Tab. 15).
D.h. die Patienten der Hochrisikogruppe mit einem Anteil von ≥ 10 % Cyclin H-positiven
Tumorzellen versterben signifikant früher, als die Patienten mit Cyclin H-negativen
Hochrisikotumoren.
Abbildung 24 zeigt die tumorspezifische Überlebenszeitanalyse der Patienten mit Cyc-
Tumorspezifisches Überleben
lin H-positiven und -negativen Hochrisikotumoren als Kaplan-Meier Diagramm.
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
2
Ausfälle
4
6
Cyclin H positiv
8
10
Cyclin H negativ
12
14
Überlebenszeit
in Jahren
Abb. 24: Kaplan-Meier Diagramm der tumorspezifischen Überlebenswahrscheinlichkeit der Cyclin H positiven und
negativen Tumoren mit hohem Malignitätsrisiko nach Fletcher et al. [36].
Die X-Achse stellt den zeitlichen Verlauf über 15 Jahre dar.
Auf der Y-Achse ist der Anteil der tumorspezifisch überlebenden Patienten aufgetragen.
47
Ergebnisse
Kombiniert man die Kriterien der Klassifikation nach Fletcher et al. mit dem
Cyclin H-Status und stellt die Cyclin H-positiven Tumoren der Hochrisikogruppe der
Gesamtheit der übrigen Tumoren gegenüber, ergibt sich im Log-Rang-Test ein p-Wert von
< 0,001 für das tumorspezifische Überleben und ein p-Wert von 0,001 für das tumorfreie
Überleben (Abb. 25, siehe auch Tabellen 14 und 15 auf den vorhergehenden Seiten).
Zusammengefasst heisst das: Die Cyclin H-positiven Hochrisiko-GIST-Patienten des
Versuchskollektivs zeigen sowohl im Vergleich mit allen Übrigen (p < 0,001, TSÜ), als auch
gegenüber den Patienten mit Cyclin H-negativen Hochrisikotumoren (p = 0,032, TSÜ) ein
1,2
Tumorfreies Überleben
Tumorspezifisches Überleben
signifikat ungünstigeres Outcome.
1
0,8
0,6
0,4
0,2
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
0
5
10
15
Ausfälle
Überlebenszeit
Restliche Tumoren
in Jahren
MR Hoch & Cyclin H positiv
0
5
Ausfälle
Restliche Tumoren
MR Hoch & Cyclin H positiv
10
15
Überlebenszeit
in Jahren
Abb. 25: Kaplan-Meier Diagramme der tumorspezifischen- und der tumorfreien Überlebenswahrscheinlichkeit der
Cyclin H positiven Tumoren mit hohem Malignitätsrisiko (MR Hoch) gegenüber den übrigen Tumoren.
Die X-Achse stellt den zeitlichen Verlauf über 15 Jahre dar.
Auf der Y-Achse ist der Anteil der überlebenden Patienten aufgetragen.
Weitere statistische Tests zur Prüfung der Unabhängigkeit von Cyclin H-Status und der
Lokalisation (p = 0,208), dem Geschlecht (p = 0,493), sowie den immunhistochemischen
Markern CD34 (p = 0,444), Smooth muscle actin (p = 0,712), Desmin (p = 0,558) und Ki-67
(p = 0,607) liefern keine signifikanten Ergebnisse.
48
Diskussion
4.
Diskussion
Die Einschätzung des Malignitätsrisikos von Gastrointestinalen Stromatumoren stützt sich
– in Ermangelung zuverlässiger genetischer oder immunhistochemischer Marker – noch
immer auf Tumorgröße und Mitoserate [36]. Die Klassifikation nach Fletcher et al. differenziert die Tumoren in vier Risikostufen (sehr niedriges, niedriges, mittleres und hohes
Malignitätsrisiko). Größte praktische Relevanz hat die Unterscheidung zwischen Hochrisiko- und Nicht-Hochrisikotumoren, die eine signifikante Prädiktion des Auftretens von Rezidiven oder Metastasen ermöglicht (85 - 97 % der betroffenen Patienten gehören der
Hochrisikogruppe an) [36]. Insbesondere die Verfügbarkeit adjuvanter Therapieoptionen
hat daher eine Diskussion über die Indikation einer generellen TyrosinkinaseinhibitorTherapie von Hochrisikopatienten nach R0-Resektion entfacht (DeMatteo et al. / Hohenberger, Lancet 2009) [22, 54]. Jedoch ist die Gruppe der Hochrisikotumoren in Bezug auf
tumorspezifisches und tumorfreies Überleben sehr inhomogen (TSÜ 62 %, TFÜ 36 % nach
5 Jahren im beobachteten Kollektiv; Tab. 14). Hohenberger fordert aufgrund der starken
Risiko-Schwankungen von nahezu 0 - 100 % für das Auftreten von Rezidiven oder tumorbedingten Tod bei GIST > 3 cm zusätzliche Prädiktoren für die Indikationsstellung der adjuvanten Therapie [54]. Die Identifikation neuer prognostischer Marker zur weiteren Eingrenzung der Risikopatienten ist außerdem von großer klinischer Relevanz, da mit der
Applikation von Tyrosinkinaseinhibitoren Nebenwirkungen, die Entwicklung von Sekundärresistenzen und hohe Behandlungskosten verbunden sind [27, 54, 111]. Das Cyclin-CDK-System ist aufgrund seiner Rolle als zentraler Regulator des Zellzyklus dafür prädestiniert, im Hinblick auf seine mögliche pathogenetische oder prognostische Bedeutung
innerhalb der Onkogenese von GIST untersucht zu werden. Darüber hinaus ist es Ansatzpunkt neuer, aktuell in klinischen Studien befindlicher, molekularer Therapieansätze für
verschiedene andere Tumorentitäten [25, 57, 61, 71, 107, 115].
Ziel der vorliegenden Arbeit ist daher die Untersuchung zellulärer Regulationssysteme
und Signaltransduktionskaskaden in Gastrointestinalen Stromatumoren zur Identifikation
von Markern mit prognostischem und potentiell therapeutischem Wert. Zu diesem Zweck
erfolgt zuerst ein genetisches Screening durch quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR). In
drei aufeinander folgenden Untersuchungen werden die Transkriptionsmuster von 1. dem
49
Diskussion
Tumorgewebe eines aggressiven GIST und Normalgewebe desselben Patienten, 2. zwei
hochmalignen Rezidiven eines Patienten im Verlauf, sowie 3. einem Stellvertreterkollektiv
von zwölf Tumoren unterschiedlichen Gradings (je drei Tumoren der Fletcher-Klassen
Niedrig, Mittel und Hoch, sowie drei Rezidivtumoren) vergleichend analysiert. Das für die
zweite und dritte qRT-PCR verwendete Set von Testgenen wird entsprechend den Ergebnissen des ersten Versuchs adaptiert. Neben dem Cyclin-CDK-System werden Gene der
tumor-assoziierten p53- und MAPK-Kaskade untersucht.
Cyclin H wird aufgrund seiner Schlüsselrolle bei der Aktivierung weiterer Cyclin-CDK-Paare
und weil in der ersten qRT-PCR eine 10,2-fache Transkriptionssteigerung im Tumorgewebe nachgewiesen wird, für die nachfolgende Untersuchung der Proteinexpression via Immunhistologie ausgewählt. Es erfolgt die immunhistochemische Färbung der Tumorproben von 92 Patienten, wobei die Ergebnisse in Relation zu klinischen Daten sowie zu
krankheitsfreiem und krankheitsspezifischem Überleben gesetzt werden.
4.1.
Epidemiologie und klinisches Erscheinungsbild des Versuchskollektivs
Im immunhistologisch untersuchten Kollektiv von 92 GIST-Patienten findet sich für das
Erkrankungsalter eine linksschiefe Verteilung mit einem Median bei 66,48 und einem
arithmetischen Mittel bei 64,36 Jahren, was die Daten der Literatur bestätigt [83]. Es findet sich keine signifikante Geschlechtsprädilektion (männlich : weiblich = 42 : 50). Demgegenüber gibt die Literatur Hinweise auf einen höheren Anteil männlicher Patienten und
eine Tendenz zu einer höheren Malignitätsrate in diesem Subkollektiv, jedoch ohne statistische Signifikanz [36, 52, 83, 104]. Die Lokalisation des Primärtumors liegt im Versuchskollektiv in 60,87 % im Magen und in 30,43 % im Dünndarm, was den Daten der Literatur
entspricht [60, 120].
Das Outcome des hier untersuchten Kollektivs ist mit einer 5-Jahresüberlebenswahrscheinlichkeit bzw. -tumorfreiheit von 82,8 % (TSÜ) bzw. 71,3 % (TFÜ) im Vergleich zu
den Literaturdaten mit 68 % (TSÜ) bzw. 38 - 65 % (TFÜ) deutlich günstiger [20, 49, 100].
Dies könnte mit der unterschiedlichen Risikoklassifikationsverteilung zusammenhängen.
In einem Kollektiv von Hassan et al. (n = 191) findet sich eine Verteilung auf die Risikoklassen (hoch, mittel, niedrig bzw. sehr-niedrig) von 54 %, 22 %, 18 % bzw. 8 % und damit ein
größerer Anteil von Hochrisikopatienten, im Vergleich zu 41,1 %, 21,1 %, 22,2 % bzw.
15,5 % im hier untersuchten Kollektiv [49].
50
Diskussion
Demgegenüber finden sich in einer großen bevölkerungsbezogenen Studie in Schweden
für die Prävalenz der verschiedenen Risikoklassen – (hohes, mittleres, niedriges und sehr
niedriges Malignitätsrisiko nach Fletcher et al.) – Werte von 18,4 %, 20,1 %, 43,1 % und
18,4 %, wobei hier Obduktionsbefunde mit eingeschlossen sind [90].
4.2.
Prädiktiver Wert der Expression von Cyclin H (CCNH)
Neben der mehr als zehnfach gesteigerten Transkriptionsaktivität von Cyclin H in der
qRT-PCR, ist vor allem seine besondere Bedeutung innerhalb des Cyclin-CDK-Systems ausschlaggebend für die weitere immunhistochemische Untersuchung an einem statistisch
aussagefähigen Kollektiv.
Cyclin H übernimmt, gemeinsam mit CDK7, als Bestandteil der Cyclin-dependent kinase
activating kinase (CAK) eine Schlüsselrolle bei der aktivierenden Phosphorylierung weiterer Cyclin-CDK Paare. Hierzu gehören beispielsweise der Mitosis-promoting factor (MPF),
bestehend aus Cyclin B1/2 und CDK1, sowie die CDKs 1, 2, 4, und 6, welche CDK7 als einzige Cyclin-abhängige Kinase phosphorylieren und somit aktivieren kann [14, 69]. CAK ist
darüber hinaus im Transkriptionsfaktor IIH enthalten, der die Expression und vermutlich
auch die Phosphorylierung der RNA Polymerase II kontrolliert, was den Einflussbereich
von Cyclin H auf die Proteinbiosynthese während der G1- und der G2-Phase erweitert [33,
35, 125, 131]. Diese Doppelrolle legt einen wichtigen Verknüpfungspunkt von ZellzyklusKoordination und Transkriptionskontrolle nahe und prädestiniert Cyclin H für weitere Untersuchungen bezüglich seiner Rolle in der Pathologie von GIST.
Bei der immunhistochemischen Analyse der Cyclin H-Expression in 92 Tumorproben findet sich ein signifikant früherer tumorspezifischer Exitus letalis bei Patienten mit Cyclin Hpositiven GIST der Hochrisikogruppe gegenüber den Patienten mit Cyclin H-negativen
Tumoren gleichen Malignitätsrisikos (Log-Rang-Test: p = 0,032; Seite 47, Tab. 15). Das ungünstigere Outcome stellt sich auch in der geringeren tumorfreien und tumorspezifischen
5-Jahres-Überlebenswahrscheinlichkeit dar (33,3 % vs. 69,8 % TSÜ; 25,0 % vs. 39,4 % TFÜ;
S. 46, Tab. 14). In Anbetracht der beschriebenen Schlüsselrolle bei der Kontrolle des Zellzyklus, würde eine Cyclin H-vermittelte Steigerung der Tumoraktivität als Erklärung für
das kürzere Überleben schlüssig sein, sollte jedoch in zukünftigen Untersuchungen weiter
überprüft werden.
Bisher ist die Rolle des Cyclin-CDK-Systems in der Pathogenese von GIST noch nicht um51
Diskussion
fassend erforscht, jedoch wurden gesteigerte Aktivitätsniveaus des Cyclin-CDK-Systems
bereits bei verschiedenen anderen Tumorentitäten (Tumoren der Mamma, HCC, Kolorektales Karzinom) beschrieben und die Entwicklung artifizieller CDK-Inhibitoren ist Gegenstand der aktuellen Forschung [25, 57, 61, 71, 107, 115]. Ob sich dadurch auch für GIST
ein neuer Zweig alternativer oder kombinierbarer molekularer Therapieansätze eröffnen
wird, bleibt künftigen Untersuchungen vorbehalten. Aus den vorliegenden Ergebnissen
ergibt sich vorrangig der potentielle prädiktive Wert von Cyclin H.
Die vorliegenden Daten stellen die Erstbeschreibung einer prädiktiven Bedeutung von
Cyclin H in GIST dar. Die immunhistochemische Untersuchung von Cyclin H könnte eine
neue Option zur weiteren Differenzierung von Tumoren der Hochrisikogruppe nach Fletcher et al. durch Abspaltung einer Gruppe von Patienten mit sehr-hohem Malignitätsrisiko sein (very-high risk of malignancy; Log-Rang-Test: p < 0,001 für TSÜ, p = 0,001 für TFÜ;
Cyclin H-positive Hochrisiko-GIST vs. alle Übrigen; S. 47, Tab. 15) [36]. Die jüngst neu entbrannte Diskussion um die Indikation zur adjuvanten Therapie von R0-resezierten Hochrisiko-GIST-Patienten verdeutlicht die damit verbundene klinische Relevanz [22, 54].
4.3.
Auffälligkeiten bei weiteren Genen des Cyclin-CDK-Systems
Neben der Transkriptionssteigerung von Cyclin H finden sich Auffälligkeiten in der Transkriptionsaktivität verschiedener weiterer Gene des Cyclin-CDK-Systems. Besonders auffällig sind jeweils die Ergebnisse der Rezidivtumorgruppe bei der Untersuchung der zwölf
Tumoren des Stellvertreterkollektivs. So zeigen die Gene für die Cycline B1, B2, A2 und E1,
sowie für CDK2 Zunahmen der mRNA-Menge im Sinne einer Transkriptionssteigerung im
Vergleich von Tumor- zum Normalgewebe oder im Verlauf der Tumorprogression. Dies
unterstützt die Annahme einer möglichen Bedeutung des Cyclin-CDK-Systems in der Pathophysiologie von GIST.
Ähnlich wie bei Cyclin H findet sich auch bei Cyclin B2 eine 9,6-fache Erhöhung beim Vergleich von Normal- mit Tumorgewebe und die Untersuchung der zwölf Tumoren verschiedener Malignitätsrisikogruppen deutet auf eine Transkriptionssteigerung mit fortschreitender Progression hin. So zeigt sich in der Rezidivgruppe eine im Vergleich zur Referenzprobe um die Faktoren 7,5 und 12,8 gesteigerte Transkriptionsrate von Cyclin B1
und B2 (S. 36, Abb. 13). Diese Veränderungen unterstreichen die Bedeutung der bei Cyclin H gemessenen Transkriptionssteigerung, da sich sowohl Cyclin B1, als auch B2 im Zyto52
Diskussion
plasma mit CDK1 zum Mitosis-promoting factor (MPF) verbindet [58, 133]. MPF ist eines
der Phosphorylierungssubstrate der CAK [18, 67]. Da die Cyclin B-CDK1 Komplexe an der
inaktivierenden Hyperphosphorylierung von Retinoblastoma 1 (Rb, RB1) beteiligt sind, ist
diese komplexe Interaktion essentiell für den Übergang der Zelle aus der G2- in die
M-Phase des Zellzyklus [18].
Nakamura et al. und Koon et al. beschreiben in ihren Veröffentlichungen eine Korrelation
zwischen immunhistologischer Positivität bzw. gesteigerter Transkription von Cyclin B1
und aggressivem Verhalten von GIST [65, 88]. Darüber hinaus finden sich keine weiteren
Daten zu Cyclin B1 & B2 im Bezug auf GIST, jedoch wurden Aberrationen in der Expression
der B-Cycline, sowie die Bildung von anti-Cyclin B-Antikörpern, in Verbindung mit einer
Vielzahl von anderen Tumorentitäten und -zelllinien beschrieben (HCC, Adenokarzinome
der Mamma, Plattenepithelkarzinome des Kopf- und Halsbereichs) [25, 31, 62, 133].
Die Cycline A2 und E1 stellen zusammen mit CDK2 eine weitere funktionelle Gruppe des
Cyclin-CDK-Systems dar. Bei der Untersuchung des Stellvertreterkollektivs von zwölf Tumoren findet sich bei allen drei Genen eine Steigerung der Transkriptionsaktivität in der
Rezidivgruppe, wobei diese bei Cyclin A2 mit dem Faktor 11,1 am stärksten ausgeprägt
ist. Bei Cyclin E1 und CDK2 finden sich in dieser Gruppe im Mittel Abweichungen um die
Faktoren 3,0 und 1,5 (S. 37, Abb. 14). Eine mögliche Erklärung für die geringen Beträge
der bei CDK2 festgestellten Schwankungen könnte die gegenüber den Cyclinen physiologischerweise konstantere Expression der Kinasen sein.
Betrachtet man die Funktion der untersuchten Proteine gemeinsam mit den nachgewiesenen Veränderungen, so kann sich das zu dem Bild einer Proliferationssteigerung durch
Überaktivierung des Cyclin-CDK-Systems fügen: Cyclin A2 und E1 interagieren mit CDK2
und werden in dieser Kombination als S-phase promoting factor (SPF) bezeichnet, welcher
den Übergang von der G1- in die S-Phase kontrolliert. Cyclin A2 kann darüber hinaus auch
als Partner von CDK1 agieren und trägt daher zusätzlich zum G2-M-Übergang bei, was
eine hohe Proliferationsrate ermöglicht [113]. Passend hierzu beschreiben Nakamura et
al. in einer Arbeit zu GIST eine Korrelation von immunhistologischer Cyclin A- mit
Ki-67-Positivität und einem verkürzten tumorfreiem Überleben [88]. Zu CDK2 konnte gezeigt werden, dass eine hohe Kinaseaktivität die Aktivierung von Cyclin B-CDK1Komplexen positiv beeinflusst, was erneut den G2-M Übergang fördert [44].
53
Diskussion
Des Weiteren ist auch CDK2 ein Aktivierungssubstrat der Cyclin H-kontrollierten CAK und
wird von Proteinkinase C gehemmt (für welche in der vorliegenden Arbeit bei der Untersuchung von Tumor und Normalgewebe eine Abnahme der Transkriptionsaktivität im
Tumor um den Faktor -34,5 festgestellt wurde) [38, 87].
Zu Cyclin E1 ist zu bemerken, dass eine gesteigerte Expression bereits in verschiedenen
Tumoren nachgewiesen wurde und chromosomale Instabilität damit einhergeht, was
ebenfalls die Tumorgenese begünstigt [32].
Verglichen mit den besprochenen Cyclinen der Typen A, B & E, zeigen die im untersuchten Kollektiv erhobenen Werte für die Cycline D1-D3 und die zugehörigen Kinasen CDK4 &
6 weniger deutliche Richtungstendenzen. Die Gruppe der D-Cycline unterliegt jedoch
auch physiologisch geringeren Schwankungen als die übrigen Cycline und wird während
G1-, S- und G2-Phase exprimiert. Allein bei Cyclin D1 ist bei der Untersuchung des Stellvertreterkollektivs eine ausgeprägte Abnahme der Transkriptionsaktivität in den Gruppen
mit mittlerem und hohem Malignitätsrisiko, sowie in der Rezidivgruppe festzustellen (Faktoren -15,0, -19,5 und -11,3; S. 38, Abb. 15). Und bei CDK6 zeigt sich ebenfalls eine verminderte mRNA-Menge in der Rezidivgruppe (Faktor -12,5).
In GIST wurde Cyclin D bereits mehrfach immunhistochemisch untersucht, ohne dass
wegweisende Auffälligkeiten oder ein prognostischer Wert festgestellt werden
konnten [88, 89, 128]. Sabah et al. geben den Anteil immunhistologisch Cyclin D1-positiver GIST-Tumoren mit 30,4 % an, jedoch ohne Schlussfolgerungen daraus abzuleiten [101].
Über CDK4 wird im Bezug auf GIST in einer Arbeit von Haller et al. berichtet. Er beschreibt
eine Konstellation mit hohen Transkriptionswerten für CDK4 und einige weitere Faktoren,
in Kombination mit einer Erniedrigung der CDKN2A-Transkripte p14 und p16, welche mit
einer schlechteren Prognose assoziiert ist und erklärt dies durch die verminderte Aktivität
des Tumorsuppressorgens CDKN2A [46]. Zu einer möglichen Bedeutung von CDK6 in GIST
finden sich in der aktuellen Literatur keine Angaben.
54
Diskussion
4.4.
Inhibitoren des Cyclin-CDK-Systems
Die Untersuchungsergebnisse zu den Inhibitoren des Cyclin-CDK-Systems zeigen im Gegensatz zu den transkriptionsgesteigerten Cyclinen bzw. CDKs überwiegend Abnahmen
der Transkription mit fortschreitender Tumorprogression. Die Gesamtwirkrichtung beider
Ergebnisse ist damit gleichsinnig. Auffällig ist jedoch, dass die Ergebnisse weniger homogen ausfallen, als bei den untersuchten Cyclinen und CDKs.
Bei der Cyclin-dependent kinase-Inhibitorfamilie 1 (Cip/Kip) mit den Vertretern CDKN1A,
B & C liegen die Werte der Messungen in Tumor- und Normalgewebe und den Rezidiven
eines Patienten unterhalb des für Einzelproben gewählten cut-offs von ± 5-facher Abweichung von der Referenzprobe. Allein bei der Untersuchung des Stellvertreterkollektivs
von zwölf Tumoren finden sich einzelne Proben mit größeren Transkriptionsveränderungen. Diese decken sich tendenziell mit den Ergebnissen aus der aktuellen Literatur: Liu et
al. beschreiben eine Korrelation von immunhistochemischer Positivität für p21 (CDKN1A)
und gesteigerter Malignität in GIST und schließen auf eine Bedeutung von p21 für den
Übergang des Tumors von benignem zu malignem Verhalten [68]. Auch im durchgeführten qRT-PCR-Versuch zeigen einzelne Proben der Hochrisiko- und Rezidivgruppe bis zu
5,2-fach erhöhte Werte für CDKN1A (siehe Seite 40, Abb. 17). Für CDKN1B zeigt sich im
untersuchten Kollektiv eine verminderte Transkription assoziiert mit höherem Malignitätsrisiko und schlechterer Prognose (Faktor -2,0 in der Rezidivgruppe; S. 40, Abb. 17).
Dies geht mit den Ergebnissen von Sabah et al. und Nemoto et al. konform, welche es
daher als potentiellen prognostischen Marker vorschlagen [89, 101]. Betreffs CDKN1C
weisen die Resultate der am Stellvertreterkollektiv durchgeführten qRT-PCR-Analysen am
ehesten auf eine Transkriptionsabnahme mit steigendem Malignitätsrisiko hin (maximaler
Abweichungsfaktor -16,4 bei einer Probe der Rezidivgruppe; S. 40, Abb. 17). Über eine
Rolle von CDKN1C in GIST finden sich in der Literatur derzeit keine Daten.
Die Ergebnisse der verschiedenen qRT-PCR-Versuche zu den Mitgliedern der zweiten großen Inhibitorfamilie – der INK4-Gruppe mit den Vertretern CDKN2A, B, C & D – sind diskrepant. Die Untersuchungen von Tumor- und Normalgewebe, sowie zweier Rezidive eines Patienten ergeben für CDKN2A und CDKN2B teils deutliche Steigerungen der Transkriptionsaktivität (Faktoren 77,3 und 21,1 für CDKN2A; Faktor 13,1 für CDKN2B beim Rezidiv-Vergleich), wohingegen im Stellvertreterkollektiv mit steigendem Malignitätsrisiko
55
Diskussion
ein Rückgang der mRNA-Menge beider Gene beobachtet wird, welcher bei einzelnen Proben der Rezidivgruppe extrem ausgeprägt ist (Faktoren -1275,2 für CDKN2A und -58,8 für
CDKN2B; S. 41, Abb. 18).
Die Gene CDKN2C und CDKN2D erscheinen beim Rezidiv-Vergleich unauffällig und bleiben
unter dem cut-off, dagegen zeigt sich in der dritten qRT-PCR mit zunehmendem Malignitätsrisiko bei beiden eine Transkriptionssteigerung (Faktor 3,4 sowohl für CDKN2C, als
auch für CDKN2D, bei Betrachtung der Rezidivgruppe gegenüber der Referenzprobe;
S. 42, Abb. 19).
Die Inhomogenität dieser Ergebnisse erschwert die Beurteilung der Bedeutung der
CDK-Inhibitorfamilie 2 in GIST. Viele Fragen bleiben offen und es bedarf weiterer Versuche um diese zu klären. In Bezug auf GIST existieren bereits mehrere Studien, in denen
Veränderungen wie Methylierung, Punktmutationen oder Deletionen am Genlokus von
CDKN2A nachgewiesen werden konnten, wobei das Hauptaugenmerk auf das Genprodukt
p16 gelegt wird [46, 56, 102, 106]. Die Interpretation dieser Ergebnisse wird kontrovers
diskutiert. Es finden sich sowohl Arbeiten, welche p16-Negativität als Hinweis für eine
höhere Risikoeinstufung werten, als auch solche, in denen p16-Positivität mit einer ungünstigeren Prognose korreliert [46, 106, 110]. Immer wieder finden sich Argumente,
dass ein unerwartet gegensinniges Expressions- bzw. Regulationsmuster als reaktiv erklärbar sein könnte. Das heißt, dass bei überschießender Zellteilungsaktivität eine Reduktion von mitosefördernden oder die Steigerung mitosehemmender Faktoren nicht als
Ursache sondern als Reaktion zu deuten ist [105, 110].
Zu CDKN2B und D finden sich Arbeiten, welche auf eine Hypermethylierung der Promotorregion in GIST hinweisen, darüber hinaus ist die Rolle des Gens in GIST noch nicht erforscht [102, 130]. Zu CDKN2C finden sich aktuell keine Arbeiten mit Bezug auf GIST.
Abgesehen von den beiden beschriebenen Familien der INK4- und Cip/Kip-Inhibitoren,
wirken eine Reihe weiterer einzelner Proteine hemmend auf das Cyclin-CDK-System. Zu
diesen zählt beispielsweise Reprimo, für das sich bei der Analyse von Tumor- und Normalgewebe eine 16,3-fache Steigerung der mRNA-Menge im Tumor findet. Reprimo ist
ein Mediator des p53 vermittelten G2-Zellzyklus-Arrests, welchen er vorwiegend über
eine Inhibition von Cyclin B1/B2-CDK1-Komplexen bewirkt [116].
Während es dazu noch keine Veröffentlichungen in Bezug auf GIST gibt, wurden Hyper56
Diskussion
methylierungen der Promotorregion von RPRM z.B. bei Tumoren der Lunge und des Pankreas festgestellt. In der Folge kommt es zu verminderter Expression des Mediators und
somit zur Apoptoseinhibition [114, 115]. Eine abschließende Einschätzung, ob die in dieser Arbeit im Tumor gemessene Transkriptionssteigerung (16,3-fach) reaktiv auf die allgemeine Aktivitätssteigerung des Cyclin-CDK-Systems auftritt, oder auf andere Ursachen
zurückgeht ist ohne weitere Versuchsreihen nicht möglich und muss in künftigen Arbeiten
geklärt werden.
Ein weiterer Inhibitor des Cyclin-CDK-Systems ist Proteinkinase C. Für den alpha-Subtyp
von Proteinkinase C (PRKCA) zeigt sich bei der qRT-PCR von Tumor- und Normalgewebe
eine Transkriptionsabnahme um den Faktor -34,5. Proteinkinase C wirkt inhibitorisch auf
die Aktivierung von CDK2 durch die CAK [47]. In Anbetracht der im vorliegenden Versuch
sowohl bei Cyclin H (Bestandteil der CAK) als auch bei CDK2 nachgewiesenen Transkriptionssteigerungen, entspricht die entgegengesetzte Regulation von PRKCA der gleichen
Gesamtwirkrichtung.
Der hier untersuchte Subtyp spielt außerdem eine Rolle an den Zellzykluskontrollpunkten,
welche er durch die Induktion von p15- und p16-Expression (CDKN2B & CDKN2A) beeinflusst [47, 73, 127]. Bezüglich einer möglichen Bedeutung in GIST finden sich zum alphaSubtyp jedoch keine Daten.
57
Diskussion
4.5.
Auffällige Gene außerhalb des Cyclin-CDK-Systems
Neben den Beschriebenen weisen eine Reihe weiterer Gene Auffälligkeiten auf, welche
sich nicht im engeren Sinne mit dem Cyclin-CDK-System in Verbindung bringen lassen.
Diese werden im folgenden Absatz kurz besprochen. Da die meisten Gene in keinem direkten funktionellen Zusammenhang stehen, sind sie nach der qRT-PCR-Untersuchung
gegliedert, in deren Rahmen die Transkriptionsveränderung festgestellt wird:
- Vergleich von Tumor- und Normalgewebe: IGF1R, BRCA2, BCL2 (4.5.1 - 4.5.3)
- Vergleich zweier Tumorrezidive im Verlauf: MEF2C, MAP3K1 (4.5.4 & 4.5.5)
4.5.1.
Insulin-like growth factor I Rezeptor (IGF1R)
In Relation zum gesunden Referenzgewebe zeigt sich im Tumorgewebe eine ausgeprägte
Erniedrigung der mRNA-Menge von IGF1R, welche sich auf den Faktor -58,8 beläuft.
IGF1R kodiert den Tyrosinkinaserezeptor für Insulin-like growth factor I, welcher ein ähnliches Spektrum an Signaltransduktionskaskaden wie KIT aktiviert. Die Expression von
IGF1R, als auch des Gens für den entsprechenden Liganden IGF1 ist in verschiedenen Neoplasien gesteigert [12, 37]. Auch zu GIST gibt es Arbeiten, die eine immunhistologische
Positivität und Genamplifikationen von IGF1R beschreiben [9, 117]. Interessanterweise
findet sich eine Amplifikationen signifikant häufiger bei Patienten, die Wildtyp-Allele für
KIT und PDGFRA tragen, was auch für viele der seltenen pädiatrischen GIST-Patienten
gilt [1, 117]. Dieses Phänomen deutet eine zu KIT analoge Funktion des IGF1-Rezeptors
an. Die Ursache der beim untersuchten Tumor festgestellten Abnahme der Transkriptionsaktivität sollte in künftigen Arbeiten geklärt werden.
4.5.2.
Breast cancer 2 (BRCA2)
Im untersuchten Tumor ist die Menge an BRCA2-mRNA im Vergleich zum Normalgewebe
um den Faktor -18,2 vermindert.
BRCA2 (Breast Cancer Type 2 susceptibility protein) ist ein, aufgrund seiner Rolle bei familiär und sporadisch auftretenden Mammakarzinomen, umfassend erforschtes Tumorsuppressorgen [75, 132]. Ob die BRCA2-Transkriptionsreduktion generell in GIST eine vergleichbare Rolle spielen könnte ist ungeklärt, jedoch finden sich bei der Literaturrecherche keine Erkenntnisse über eine Beteiligung von BRCA2 an der Pathogenese von GIST.
58
Diskussion
4.5.3.
B-Zell CLL/Lymphom 2 (BCL2)
Bei der genetischen Untersuchung von Tumor- und Normalgewebe kann eine um das
11,5-fache stärkere Transkription von BCL2 im Tumor nachgewiesen werden.
In der Literatur zu GIST finden sich einige Arbeiten, welche bei der immunhistochemischen Untersuchung hohe Anteile BCL2-positiver GIST feststellen. Die angegebenen Werte schwanken zwischen 75 und 100 % [11, 77, 101, 112]. Der prognostische Wert dieses
Markers ist umstritten, manche Arbeiten bezweifeln eine relevante Aussagekraft, wohingegen andere ein kürzeres Überleben des Patientenkollektivs mit BCL2-positiven Tumoren beschreiben [16, 72, 77, 112].
4.5.4.
Myocyte enhancer factor 2C (MEF2C)
Das untersuchte spät aufgetretene Rezidiv zeigt im Vergleich mit dem bereits vier Jahre
zuvor Aufgetretenen eine um den Faktor 39,8 erhöhte Transkription des Gens MEF2C.
Es handelt sich hierbei um einen Transkriptionsfaktor, welcher die Funktion von Histondeacetylasen antagonisiert. Im adulten Organismus wird MEF2C durch verschiedene zelluläre Stressoren und Wachstumssignale aktiviert, was den Nachweis gesteigerter
MEF2C-Expression bei verschiedenen neoplastischen Erkrankungen erklärt [96, 134]. Im
Bezug auf GIST finden sich aktuell jedoch keine Arbeiten.
4.5.5.
Mitogen-activated Protein Kinase Kinase Kinase 1 (MAP3K1)
Der im zweiten Rezidiv gemessene Wert für MAP3K1 liegt um das 5,2-fache über der
mRNA-Menge im ersten (ca. vier Jahre zuvor aufgetretenen) Rezidiv und damit knapp
über dem Schwellenwert von ± 5-facher Veränderung der Transkriptionsaktivität.
Das von MAP3K1 kodierte Protein ist vorwiegend unter den Bezeichnungen MEKK1 oder
MEK-Kinase 1 bekannt und ist Teil des MAPK-Signaltransduktionswegs, für den eine Beteiligung an der Pathogenese Gastrointestinaler Stromatumoren bekannt ist [26, 45]. Hierzu
beschreiben Bauer et al. bei Imatinib-resistenten GIST eine Wachstumsinhibition durch
MEK-Inhibition, jedoch erwies sich die Inhibition des PI3K-AKT-Signalwegs als überlegen,
weswegen Bauer der MAPK-Signalkaskade nur eine Randbedeutung beimisst [5]. Die Tatsache, dass im Rahmen der für diese Arbeit durchgeführten Screeninguntersuchungen
nicht mehr Vertreter der MAPK-Kaskade auffällige Veränderungen aufweisen, unterstützt
diese Einschätzung.
59
Diskussion
4.6.
Résumé – Das Cyclin-CDK-System in der Diagnostik & Therapie von GIST
Auf den vorangehenden Seiten wurden Veränderungen im Transkriptionsverhalten einer
Vielzahl verschiedener Gene beschrieben und diskutiert. Was jedoch viel wichtiger ist als
die Betrachtung der einzelnen Gene, ist das Gesamtbild dieser Auffälligkeiten.
Die Untersuchungen zeigen Zunahmen der Transkriptionsaktivität der Cycline A2, B1, B2,
E1 und H, sowie von CDK2 im Tumor bzw. im Krankheitsverlauf. Zusätzlich ist die Transkription verschiedener Inhibitoren wie Proteinkinase C alpha und einzelner Vertreter der
beiden CDK-Inhibitorfamilien INK4 und Cip/Kip (CDKN1B & C, sowie CDKN2A & B) bei einem Teil der Proben vermindert. Gemeinsam betrachtet weisen diese Ergebnisse auf eine
Aktivitätssteigerung des Cyclin-CDK-Systems in Gastrointestinalen Stromatumoren hin
und sollten in künftigen Studien weiterverfolgt werden. Nicht zuletzt auch zur Klärung der
Frage, ob die aktuell in der Entwicklung befindlichen CDK-Inhibitoren auch für Gastrointestinale Stromatumoren eine ergänzende Therapieoption darstellen werden.
Darüber hinaus lassen die Ergebnisse des immunhistochemischen Versuchsteils hoffen,
dass die Untersuchung des Cyclin H-Status in Kombination mit der Klassifikation nach
Fletcher et al. eine weitere Differenzierung der Patienten der Hochrisikogruppe erlaubt
und GIST sehr-hohem Malignitätsrisiko (very-high risk of malignancy) anzeigt.
60
Zusammenfassung
5.
Zusammenfassung
Mit der Entwicklung zielgerichteter Tyrosinkinaseinhibitoren hat sich ein ganzes Feld neuer und erweiterter Behandlungsoptionen für Gastrointestinale Stromatumoren (GIST)
eröffnet, welches jedoch auch neue Problematiken mit sich bringt. Das Auftreten von Sekundärresistenzen, das Nebenwirkungsspektrum und auch die hohen Behandlungskosten
erfordern in noch größerem Maß als bisher eine zuverlässige Prognostik des individuellen
Malignitätsrisikos um eine differenzierte Selektion geeigneter Patienten zu ermöglichen.
Aktuell sind jedoch keine zuverlässigen genetischen oder immunhistologischen Marker
bekannt und die gängige Klassifikation nach Fletcher et al. bietet, basierend auf Tumorgröße und Mitoserate, zwar eine gute Sensitivität bei der Vorhersage des Auftretens von
Metastasen oder Rezidiven (85 - 97 % der betroffenen Patienten fallen in die Gruppe mit
hohem Malignitätsrisiko), jedoch bei mangelnder Spezifität (Tumorspezifisches Überleben
62 %, Tumorfreies Überleben 36 % nach 5 Jahren in der Hochrisikogruppe des beobachteten Kollektivs). Alternative Klassifikationen nach Miettinen et al., Hornick et al. oder
Joensuu et al. erbringen ähnliche Ergebnisse.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist daher die Untersuchung zellulärer Signaltransduktionskaskaden und Regulationssysteme zur Identifizierung neuer Marker mit möglichem prognostischem oder therapeutischem Wert.
Mittels quantitativer Real-Time Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR) wird hierzu in drei
unterschiedlichen Versuchsteilen ein Screening der Transkriptionsaktivität von Genen des
Cyclin-CDK-Systems (CDK = cyclin dependent kinase), sowie des p53- und des MAPKSignalwegs (MAPK = mitogen associated protein kinase) an insgesamt 16 kryoasservierten
Gewebeproben durchgeführt. Die Ergebnisse dienen als Grundlage für die Selektion von
Cyclin H als Zielgen des zweiten experimentellen Teils der Arbeit: Immunhistochemische
Präparate von 92 GIST-Proben werden angefertigt, um die Ergebnisse der genetischen
Untersuchungen in einem Kollektiv von statistisch aussagefähiger Größe auf Proteinebene
zu verifizieren.
Die Mehrheit der im Rahmen der genetischen Versuche nachgewiesenen Transkriptionsveränderungen weißt kohärent auf eine Aktivitätssteigerung des Cyclin-CDK-Systems im
Rahmen der Entstehung bzw. des Krankheitsverlaufs von Gastrointestinalen Stromatumo61
Zusammenfassung
ren hin. Beispielsweise zeigen sich Steigerungen der Transkriptionsaktivität der Cycline A2, B1, B2, E1 und H, sowie der Cyclin-abhängigen Kinase CDK2. Hierzu passend erbringt die Untersuchung verschiedener Inhibitoren des Cyclin-CDK-Systems vorwiegend
Transkriptionsabnahmen (z.B. bei Cyclin-dependent kinase-Inhibitor 1B, 1C, 2A & 2B, sowie Proteinkinase C, alpha), was der gleichen Wirkrichtung entspricht. Das Cyclin-CDKSystem steht als zentraler Regulator des Zellzyklus im Fokus der onkologischen Forschung
und erste klinische Studien zum therapeutischen Einsatz von CDK-Inhibitoren laufen. Die
in dieser Arbeit dargestellten Hinweise auf eine Aktivitätssteigerung des Cyclin-CDKSystems in GIST werfen die Frage auf, ob die Entwicklung von CDK-Inhibitoren die therapeutischen Möglichkeiten erneut erweitern könnte und sollten in künftigen Arbeiten weiterverfolgt werden.
Darüber hinaus zeigt die Expression von Cyclin H bei der immunhistochemischen Untersuchung von 92 GIST-Proben prognostischen Wert: Bei Patienten mit Cyclin H-positiven GIST
der Hochrisikogruppe nach Fletcher et al. findet sich ein signifikant früherer tumorbedingter Exitus letalis, als bei Patienten mit Cyclin H-negativen Tumoren der gleichen Malignitätsrisikogruppe (Log-Rang-Test: p = 0,032). Die Ergebnisse zur Proteinexpression unterstützen damit den Hinweis der Transkriptionsanalytik auf die pathogenetisch relevante
Rolle des Cyclin-CDK-Systems und verfeinern darüber hinaus die diagnostischen Möglichkeiten. Die Kombination von positivem Cyclin H-Status und Hochrisikoklassifikation nach
Fletcher et al. erweist sich in GIST als signifikanter Prädiktor für ein ungünstiges Outcome
(Log-Rang-Test: p < 0,001 für tumorspezifisches Überleben, p = 0,001 für tumorfreies
Überleben, Cyclin H-positive Hochrisiko-GIST vs. alle Übrigen).
Die klinische Relevanz dieses Ergebnisses zeigt die jüngst im Lancet neu entbrannte Diskussion um die Indikation zur adjuvanten Therapie von R0-resezierten Hochrisiko-GISTPatienten.
62
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72
Danksagung
Danksagung
Ich möchte Allen danken, die mich während den letzten drei Jahren bei der Erstellung
dieser Arbeit unterstützt haben.
Insbesondere gilt mein Dank meinem Doktorvater Herrn Prof. Uwe Knippschild für die
stets offene Tür und das stets offene Ohr für Fragen, die schnellen Korrekturen, die Bereitstellung des Labors, sowie die Übernahme des Erstgutachtens.
Ebenso sehr danke ich meinem Betreuer Herrn Dr. Klaus Kramer für die herzliche und
freundschaftliche Betreuung, die vielen motivierenden Worte des Lobs und die Bereitschaft zu fast jeder Tages und Nachtzeit noch ein paar Extrastunden in die Forschung zu
investieren.
Auch allen medizinisch-technischen Assistentinnen im Labor der Chirurgischen Klinik und
Frau Heidrun Hirner bin ich zu großem Dank verpflichtet für die engagierte Unterstützung
bei meiner Arbeit und das nette Arbeitsklima. Des Weiteren danke ich Herrn Prof. Thomas
Barth für die Hilfe bei der Etablierung der Cyclin H-Färbung und Frau Dr. Ursula Wegenka
und Frau Rosi Rittelmann für die Zeit am qRT-PCR-Gerät.
Außerdem möchte ich mich bei allen Doktoranden der Arbeitsgruppe GIST für die nette
Zusammenarbeit und insbesondere bei Dr. Michael Schmieder für die Starthilfe auf dem
Gebiet der Statistik bedanken.
Und ich danke meinen drei Eltern, die an mich geglaubt und mir dadurch das Medizinstudium erst ermöglicht haben!
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Curriculum vitae
Curriculum vitae
Julian Dorn
Persönliche Daten
Geburtsdatum
17. März 1983
Geburtsort
Nürnberg
Schulbildung
08.1989 – 06.2002
Besuch der Grundschule und des Gymnasiums in Erlangen
28.06.2002
Erwerb der Allgemeinen Hochschulreife
Zivildienst
09.2002 – 06.2003
Herzchirurgische Klinik, Universitätsklinikum Erlangen
CA Prof. Michael Weyand (Herzchirurgie)
Universitätsausbildung
10.2003 – 11.2009
Studium der Humanmedizin an der Universität Ulm
26.09.2005
Erwerb des ersten Abschnitts der Ärztlichen Prüfung
08.2008 – 07.2009
Praktisches Jahr (Chirurgie, Innere Medizin und Anästhesie),
Klinik an Eichert, Göppingen
20.11.2009
Erwerb des zweiten Abschnitts der Ärztlichen Prüfung
30.11.2009
Approbation als Arzt
Wissenschaftliche Arbeit & Publikationen
11.2003 – 03.2004
Wissenschaftliche Hilfskraft am Institut für Geschichte und Ethik
der Medizin, Universität Erlangen
11.2006 – 10.2010
Doktorand an der Klinik für Allgemein-, Viszeral- und
Transplantationschirurgie, Universitätsklinikum Ulm
02.07.2010
Publikation: „Cyclin H expression is increased in GIST with very-high
risk of malignancy“ BMC Cancer (Erstautorenschaft)
Beruf
04.2010
Assistenzarzt in der Abteilung für Chirurgie, Klinik Mühldorf am Inn
CA Dr. Wolfgang Richter (Allgemein-, Thorax- & Viszeralchirurgie)
CA Dr. Stefan Trabhardt (Orthopädie und Unfallchirurgie)
CA Dr. Reinhard Lerch (Gefäßchirurgie)
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