Universitätsklinikum Ulm Zentrum für Chirurgie Klinik für Allgemein-, Viszeral- und Transplantationschirurgie Prof. Dr. Doris Henne-Bruns TRANSKRIPTIONSANALYTISCHE UND IMMUNHISTOCHEMISCHE UNTERSUCHUNG ZELLZYKLUSASSOZIIERTER GENE IN GASTROINTESTINALEN STROMATUMOREN UNTER BESONDERER BERÜCKSICHTIGUNG DES PRÄDIKTIVEN WERTS VON CYCLIN H Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm Julian Dorn, Nürnberg 2010 Amtierender Dekan: Prof. Dr. rer. nat. Thomas Wirth 1. Berichterstatter: Prof. Dr. biol. hum. Uwe Knippschild 2. Berichterstatter: Prof. Dr. rer. biol. hum. Reinhold Schirmbeck Tag der Promotion: 29.10.2010 Index Inhaltsverzeichnis Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen und Kurzbezeichnungen 1. Einleitung ....................................................................................................................... 1 1.1. Neoplasien .............................................................................................................. 1 1.2. Gastrointestinale Stromatumoren (GIST) ............................................................... 3 1.2.1. Historische Entwicklung und Definition .......................................................... 3 1.2.2. Epidemiologie .................................................................................................. 3 1.2.3. Morphologie und Histologie ............................................................................ 5 1.2.4. Klassifikation und Prognose............................................................................. 6 1.2.5. Molekulare Pathogenese ................................................................................. 7 1.2.6. Klinik und Therapie .......................................................................................... 9 1.3. 2. Fragestellung......................................................................................................... 11 Material und Methoden .............................................................................................. 12 2.1. Materialien und Geräte ........................................................................................ 13 2.1.1. Gewebeproben .............................................................................................. 13 2.1.2. Fertige Gemische, Lösungen & Reagenziensets ............................................ 13 2.1.3. Chemikalien ................................................................................................... 14 2.1.4. Geräte ............................................................................................................ 15 2.1.5. Verbrauchsmaterialien .................................................................................. 16 2.2. Methoden ............................................................................................................. 17 2.2.1. Asservierung der Gewebeproben.................................................................. 17 2.2.2. Histologie – Analysen des Gradings und der Gewebemorphologie .............. 18 2.2.3. Genetik – Analysen der Gentranskription ..................................................... 20 2.2.4. Immunhistologie – Analysen der Proteinexpression .................................... 26 2.2.5. EDV-gestützte Auswertung, Statistik und Erstellung von Grafiken ............... 29 I Index 3. Ergebnisse .................................................................................................................... 30 3.1. Histologie – Analysen des Gradings und der Gewebemorphologie ..................... 30 3.2. Genetik – Analysen der Gentranskription ............................................................ 32 3.2.1. Vergleichende Analyse von Tumor- und Normalgewebe ............................. 32 3.2.2. Vergleichende Analyse zweier Tumorrezidive im Verlauf ............................. 34 3.2.3. Vergleichende Analyse von Tumoren unterschiedlichen Gradings .............. 35 3.3. 4. Immunhistochemie – Analysen der Proteinexpression ........................................ 43 Diskussion .................................................................................................................... 49 4.1. Epidemiologie und klinisches Erscheinungsbild des Versuchskollektivs .............. 50 4.2. Prädiktiver Wert der Expression von Cyclin H (CCNH).......................................... 51 4.3. Auffälligkeiten bei weiteren Genen des Cyclin-CDK-Systems .............................. 52 4.4. Inhibitoren des Cyclin-CDK-Systems ..................................................................... 55 4.5. Auffällige Gene außerhalb des Cyclin-CDK-Systems ............................................. 58 4.6. Résumé – Das Cyclin-CDK-System in der Diagnostik & Therapie von GIST ............. 60 5. Zusammenfassung ....................................................................................................... 61 6. Literaturverzeichnis ..................................................................................................... 63 II Abkürzungsverzeichnis Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen und Kurzbezeichnungen Abkürzungen: Abb. Abbildung ad auf (Auffüllen bis zu genannter Menge) cDNA complementary DNA (komplementär-DNS) Ct threshold cycle (Schwellen-Zyklus) ddH2O doppelt destilliertes Wasser dest. destillata (destilliert) DNA deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) DOG1 discovered on GIST-1 EDTA Ethylendiamintetraessigsäure eGIST Extragastrointestinaler Stromatumor G1-Phase gap1-Phase (Präsynthesephase) G2-Phase gap2-Phase (Postsynthesephase) GIST Gastrointestinaler Stromatumor H2O Wasser HCl Salzsäure HPF high-power field (Gesichtsfeld bei 40x Vergrößerung ≈ 0,1 - 0,2 mm²) M-MLV Moloney murine leukemia virus M-Phase Mitosephase MR Malignitätsrisiko (risk of malignancy nach Fletcher et al.) mRNA messenger RNA (Boten-RNS) PCR polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion) PIP2/PIP3 Phosphatidylinositol -4,5-bisphosphat / -1,4,5-trisphosphat PKCθ Proteinkinase C-theta puriss. purissimum (Reinheit ≥ 98,5 %) qRT-PCR quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion RD relative deviation (Relative Abweichung) Rez/Met Rezidiv/Metastase RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) RPE Puffer-Bezeichnung aus dem RNeasy-Kit der Firma Qiagen RQ relative quantitation (Relative Quantifizierung) RW1 Puffer-Bezeichnung aus dem RNeasy-Kit der Firma Qiagen S. Seite III Abkürzungsverzeichnis S-Phase Synthesephase STI571 Entwicklungsbezeichnung des Arzneimittelwirkstoffs Imatinib Tab. Tabelle TAE TRIS-Acetat-EDTA TFÜ tumorfreies Überleben ( = DFS, disease-free survival) TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan TSÜ tumorspezifisches Überleben ( = DSS, disease-specific survival) vs. versus (gegenüber) Gen & Proteinbezeichnungen: Die verwendeten Kurzbezeichnungen folgen in der Regel den Bestimmungen des Gene Nomenclature Committees (HGNC) der Human Genome Organisation. Entsprechend werden Gene kursiv, Proteine hingegen in normaler Schrift bezeichnet. In einigen Sonderfällen, in denen eine andere Schreibweise gebräuchlicher ist wird der besseren Verständlichkeit halber diese Bezeichnung verwendet (z.B. mTOR, p16, NFκB). ABL1 Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1 ACTB actin, beta AKT1 v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1 (protein kinase B) BCL2 b-cell CLL/lymphoma 2 BCR breakpoint cluster region BCR-ABL Fusionsgen aus BCR & ABL1, Produkt des Philadelphia Chromosoms BRCA2 breast cancer 2, early onset CAK cyclin-dependent kinase (CDK) activating kinase CCNx cyclin x (z.B. CCNH für Cyclin H) CDC2 cell division cycle 2 ( = CDK1) CDKNxx cyclin-dependent kinase inhibitor xx (z.B. CDKN2A) CDKx cyclin-dependent kinase x (z.b. CDK2) CIP/KIP CDK-Inhibitorfamilie (CDK inhibiting protein/kinase inhibiting protein) ERKx extracellular signal-regulated kinase x (z.B. ERK1/2 = MAPK3/1) GRB2 growth factor receptor-bound protein 2 HPRT1 hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 IGF1R insulin-like growth factor 1 receptor INK4 CDK-Inhibitorfamilie (inhibitors of CDK4) IRS1 insulin receptor substrate 1 IV Abkürzungsverzeichnis JAK januskinase KI67 antigen identified by monoclonal antibody Ki-67 (Gen = MKI67) KIT Humanes Homolog (CD117) des Protoonkogens v-kit aus dem HardyZuckerman 4 feline sarcoma virus (HZ4-FeSV) MAP2Kx mitogen-activated protein kinase kinase x (z.B. MAP2K1) MAP3Kx mitogen-activated protein kinase kinase kinase x (z.B. MAP3K1) MAP-Kinase x mitogen-activated protein kinase x (z.B. MAPK1) MAPKx mitogen-activated protein kinase x (z.B. MAPK1) MAT1 menage à trois 1 MDM2 mdm2 p53 binding protein homolog MEF2C MADS box transcription enhancer factor 2, polypeptide C MEKKx mitogen-activated protein kinase kinase kinase x (z.B. MEKK1) MEKx mitogen-activated protein kinase kinase x (z.B. MEK1) mTOR mammalian target of rapamycin (Gen = FRAP1) MYC v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog NFκB1 nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 1 p15 cyclin-dependent kinase inhibitor 2B (Gen = CDKN2B) p16 cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (Gen = CDKN2A) p18 cyclin-dependent kinase inhibitor 2C (Gen = CDKN2C) p19 cyclin-dependent kinase inhibitor 2D (Gen = CDKN2D) p21 cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (Gen = CDKN1A) p27 cyclin-dependent kinase inhibitor 1B (Gen = CDKN1B) p53 tumor protein p53 (Gen = TP53) p57 cyclin-dependent kinase inhibitor 1C (Gen = CDKN1C) PDGFRA platelet-derived growth factor receptor, alpha PI3K Phosphoinositol-3-Kinase PRKCA protein kinase C, alpha RAF1 Humanes Homolog des v-raf-1 murine leukemia viral oncogene 1 RAS RAS-oncogene superfamily (rat sarcoma viral oncogene homolog) Rb retinoblastoma 1 (Gen = RB1) RPRM reprimo, TP53 dependent G2 arrest mediator candidate S100 S-100 calcium-binding protein SCF stem cell factor, Ligand von KIT, Produkt des Gens KITLG SOS son-of-sevenless protein STATx signal transducer and activator of transcription x (z.B. STAT1) v-kit Protoonkogens des v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma virus V Abkürzungsverzeichnis SI-Einheiten: m Meter g Gramm l Liter h Stunde(n) min Minute(n) sek Sekunde(n) V Volt °C Grad Celsius mol Stoffmenge M Molarität Präfixe: c- Zenti- m- Milli- μ- Mikro- n- Nano- VI Einleitung 1. Einleitung 1.1. Neoplasien Neoplasien heute mit 25 % an zweiter Stelle der Todesursachenstatistik [109]. kardiovaskulären Allein die Erkrankungen fordern jährlich mehr Opfer und wenn der Trend der letzten Jahrzehnte anhält, wird sich dieses Verhältnis in naher Zukunft umkehren (Abb. 1) [59]. Todesfälle pro 100 000 Einwohner In der westlichen Welt stehen 550 500 450 Kardiale Erkrankungen 400 350 300 250 Maligne Neoplasien 200 150 100 Zerebrovaskuläre Erkrankungen 50 0 1970 1974 1978 1982 1986 1990 1994 1998 2002 2006 2010 2014 Sterbejahr Abb. 1: Altersstandardisierte Entwicklung der drei häufigsten Todesursachen in den USA zwischen 1970 und 2002 [59] mit grafischer Trendprognose Die Theorie, dass Tumoren durch Veränderungen im genetischen Material der Zellen verursacht werden, entwickelte der deutsche Biologe Boveri bereits im Jahr 1914 [42]. Erst knapp 50 Jahre später gelang Nowell mit der Entdeckung des Philadelphia-Chromosoms bei chronisch myeloischer Leukämie der Nachweis einer konstant auftretenden Chromosomenaberration bei einer Krebserkrankung [92]. Durch die Erforschung weiterer Tumorarten wurde erkannt, dass in der Ätiopathogenese meist nicht nur eine einzelne Mutation nötig ist, sondern die Tumorentstehung als Mehrschritt-Prozess zu verstehen ist [124]. Aus normalen Zellen entstehen im Laufe mehrerer Teilungen und Mutationen Hyperplasien, Atypien, in situ Neoplasien und schließlich invasive Tumoren. Mit jedem dieser Stadien gewinnen sie charakteristische neue Merkmale wie Immortalisierung oder erhöhte Proliferationsrate hinzu. Heute ist diese, als multi-hitModell bezeichnete, Theorie der Kanzerogenese unumstritten und die Forschung konzentriert sich auf das immer genauere Verständnis der molekularen Veränderungen in den verschiedenen Tumorentitäten. Ein Ergebnis dieser Bemühungen ist die Erkenntnis der Funktionsweise und Bedeutung der Epigenetik. Nach dem heutigen Stand ist bereits eine Vielzahl verschiedener Einflüsse mit ganz unterschiedlichen Ansatzpunkten bekannt. Histonmodifikationen wie die Acetylierung verschiedener Aminosäurereste beeinflussen die Nukleosomenauffaltung. Stark 1 Einleitung aufgefaltete DNA kann weniger gut abgelesen werden, weshalb dieser Vorgang als „silencing“ bezeichnet wird. Auch der DNA-Strang selbst kann, bei konstanter Basensequenz, epigenetisch verändert werden. Durch enzymatische Methylierung von Promotorregionen wird die Transkriptionshäufigkeit vieler Gene reguliert und im Verlauf von Replikationsvorgängen auftretende Punktmutationen können behoben werden. Zu diesem Zweck detektieren Reparaturproteine den älteren Strang anhand seiner stärkeren Methylierung und ersetzen dann die fehlerhafte Base im Komplementärstrang [118]. Es gibt drei große Gruppen von Genen, die bei der Tumorentstehung eine Rolle spielen: Onkogene, Tumorsuppressorgene und Mutatorgene. Onkogene sind eine deregulierte Form von Protoonkogenen, die physiologischerweise z.B. Wachstums- oder Transkriptionsfaktoren kodieren und die Zellproliferation anregen. Im normalen Zellzyklus ist die Expression dieser Gene genau reguliert und von vielen verschiedenen Einflüssen abhängig. Wachstumsfaktoren, welche als Mediatoren an Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden, können intrazelluläre Signaltransduktionswege aktivieren und so zur physiologischen Expression verschiedener Protoonkogene führen. Von einem Onkogen spricht man, wenn diese Regulation gestört ist und das betreffende Gen unkontrolliert in zu großen Mengen oder zur falschen Zeit exprimiert wird, was in einer pathologisch erhöhten Wachstums- und Teilungsrate resultiert. Tumorsuppressorgene zeigen eine den Onkogenen entgegengesetzte Wirkung. Ihre Produkte sind proliferationshemmend, woraus sich eine Kontrollfunktion über den Zellzyklus ergibt. Suppressorgene verhalten sich in der Regel dominant. Um die Proliferationsrate merklich zu beeinflussen, muss ein Gen also meist auf beiden Allelen inaktiviert sein. Die von Mutatorgenen kodierten Proteine überprüfen die Intaktheit des Genoms der Zelle. Treten in einer Zelle genetische Schäden auf, blockieren sie das Voranschreiten des Zellzyklus, bis die Schäden repariert wurden. Dies verhindert die Vererbung genetischer Defekte an Tochterzellen. Wie bei den Tumorsuppressorgenen müssen beide Allele beschädigt sein, damit ihre Funktion ausfällt [94, 95]. Die Kenntnis der pathologisch relevanten Gene einer Tumorart ist Grundlage für die Entwicklung neuer Therapieansätze. Da es leichter ist bestehende Vorgänge zu blockieren als Fehlende zu ersetzen, sind die Onkogene und entsprechende Inhibitoren das Primärziel der Forschung. Imatinib ist ein Beispiel eines solchen „small-molecule Inhibitors“, der entwickelt wurde um das Fusionsprodukt des Philadelphia-Chromosoms, die Tyrosinkina2 Einleitung se BCR-ABL, zu inhibieren [21]. Um Nebenwirkungen zu verringern, wird versucht die Inhibitoren möglichst selektiv zu gestalten, jedoch gelingt das wegen der Vielzahl und Ähnlichkeit der körpereigenen Proteine nie vollständig. Im konkreten Fall von Imatinib birgt dieser Mangel an Selektivität jedoch auch einen Vorteil: Imatinib inhibiert neben BCR-ABL auch die verwandten Rezeptortyrosinkinasen KIT und PDGFRA, welche eine Schlüsselrolle in der Pathogenese der Gastrointestinalen Stromatumoren einnehmen [21]. 1.2. Gastrointestinale Stromatumoren (GIST) 1.2.1. Historische Entwicklung und Definition Gastrointestinale Stromatumoren sind eine verhältnismäßig junge Tumorentität, welche in den letzten Jahren ein schnell zunehmendes wissenschaftliches Interesse auf sich gezogen hat. Bis vor gut 20 Jahren wurden nahezu alle mesenchymalen Tumoren des Gastrointestinaltraktes aufgrund ihrer histomorphologischen Ähnlichkeit als Tumoren glattmuskulären oder neuronalen Ursprungs eingestuft. In Abhängigkeit vom Erscheinungsbild im Einzelfall wurden sie den Leiomyomen, Leiomyoblastomen, epitheloiden Leiomyosarkomen oder auch den Schwannomen und Neurofibromen zugesprochen [79]. Die Entwicklung neuer diagnostischer Möglichkeiten zeigte jedoch, dass sich ein Großteil der Tumoren weder einem neurogenen (S100-negativ), noch einem myogenen Ursprung (elektronenmikroskopisch keine Aktin-Myosin-Filamente nachweisbar) zuordnen ließen. Als Folge wurde 1983 der Begriff „Gastrointestinaler Stromatumor“ (GIST) als Sammelbezeichnung für diese Tumoren unbekannter Abstammung eingeführt [74]. Der nächste entscheidende Schritt in der Erforschung von GIST gelang 1998, als Hirota et al. erstmals eine gain-of-function Mutation im Gen der Rezeptortyrosinkinase KIT beschrieben [51]. Diese Entdeckung legte nicht nur eine Verwandtschaft mit den Cajalschen Zellen nahe, darüber hinaus stellt KIT bis heute sowohl das wichtigste diagnostische Merkmal, als auch das wichtigste therapeutische Target dar [64]. 1.2.2. Epidemiologie Obwohl sie die größte Gruppe unter den mesenchymalen Tumoren des Magen-DarmTraktes ausmachen, handelt es sich bei GIST dennoch um eine seltene Erkrankung [81]. Populationsbezogene Studien in Island und Schweden zeigten eine jährliche Inzidenz von 1,1 bzw. 1,4 pro 100 000 [90, 121]. Unter der Annahme einer vergleichbaren Inzidenz 3 Einleitung würde das für Deutschland 900 bis 1 200 Neuerkrankungen pro Jahr bedeuten. Angesichts der kurzen Geschichte der Tumorentität, der rasanten Entwicklung der diagnostischen Möglichkeiten im vergangenen Jahrzehnt und dem damit verbundenen Anstieg der Diagnosezahlen, gibt es jedoch verschiedene Stimmen die davon ausgehen, dass die tatsächliche Inzidenz von GIST noch immer unterschätzt wird [36, 39, 81]. So nehmen Fletcher et al. eine Inzidenz von 1,7 bis 2,0 pro 100 000 an [36]. GIST sind eine Erkrankung der zweiten Lebenshälfte und treten überwiegend nach dem 50. Lebensjahr auf. Der Krankheitsgipfel liegt bei einem Alter von 55 bis 65 Jahren (Median ca. 60 Jahre) und der Anteil von Patienten unterhalb des 40. Lebensjahres liegt zwischen 5 und 20 Prozent [81, 120]. Das Verhältnis von männlichen zu weiblichen Patienten schwankt je nach betrachteter Arbeit 10 Prozentpunkte um eine ausgeglichene Verteilung. Es ist also keine klare Geschlechtsprädilektion für GIST erkennbar, allerdings beschreiben einige Autoren einen geringfügig höheren Anteil maligner Verläufe im männlichen Subkollektiv [82-84, 120]. Die Primärtumoren können vom Ösophagus bis zum Rektum im gesamten Gastrointestinaltrakt lokalisiert sein, wobei sie am häufigsten im Magen (60 %) und im Dünndarm (30 %) angesiedelt sind [36, 83]. In seltenen Fällen wurden auch an Lokalisationen außerhalb des Gastrointestinaltraktes wie den Mesenterien oder im Omentum Primärtumoren gefunden (extragastrointestinaler Stromatumor, eGIST) [78, 98, 129]. Im Jugend- und Kindesalter sind GIST ausgesprochen selten. Die beschriebenen Fälle betreffen vorwiegend weibliche Patienten im Alter zwischen 10 und 20 Jahren und treten gehäuft in Verbindung mit genetischen Tumor-Syndromen wie der Carney Triade oder Neurofibromatose auf [40]. Auch im Erwachsenenalter ist die hohe Koinzidenz von GIST mit Zweitneoplasien auffällig. Meist werden Werte zwischen 4 und 11 % angegeben, in manchen Studien hatten jedoch allein 6 % der GIST-Patienten Neurofibromatose, was einer 180-fachen Häufung gegenüber dem Bevölkerungsdurchschnitt entspricht [80, 83]. Man vermutet für neurofibromatoseassoziierte GIST jedoch eine andere Pathogenese, da in diesen Fällen weder KIT-, noch PDGFRA-Mutationen gefunden wurden [66, 97]. In der Literatur finden sich außerdem elf Beispiele familiärer GIST-Syndrome, von welchen zehn eine Keimbahnmutation im KIT-Gen aufweisen [3]. 4 Einleitung 1.2.3. Morphologie und Histologie Makromorphologisch imponieren GIST meist als klar abgrenzbare halbkugel- oder kugelförmige Knoten. Abhängig von ihrer Größe wölben sie sich vorerst submukös in das Lumen der Hohlorgane vor, bilden mit zunehmendem Durchmesser jedoch normalerweise der Außenseite anhängende subseröse Knoten mit unterschiedlich breiter Basis. Große Tumoren sind zentral häufig zystisch-nekrotisch verändert und besitzen nur einen schmalen Randsaum vitalen Tumorgewebes, wobei das genaue Erscheinungsbild in Abhängigkeit von der Lokalisation leicht variiert [81]. Histologisch zeigen sich GIST in den meisten Fällen als zellreiche, spindelzellige (70 - 86 %) oder epitheloide (5 - 20 %) Tumoren, sie können jedoch auch gemischt (9 %) oder zu einem kleinen Prozentsatz pleomorph (< 2 - 3 %) sein [36, 84]. Diagnostisch ist bisher immunhistochemische Positivität für KIT (CD117), welche in über 90 % vorliegt, das entscheidende Merkmal. Aktuelle Studienergebnisse an 1168 GIST zeigen discovered on GIST-1 (DOG1) als einen nahezu gleichwertigen Marker [85]. Auch die Expression der Protein-Kinase-C-theta (PKCθ) wurde als ähnlich spezifischer Marker beschrieben [7, 19, 29, 86]. Beide Marker haben zunehmend Einzug in die Routinediagnostik gefunden. DOG1 oder PKCθ können die Diagnose in Grenzfällen erheblich erleichtern (> 90 % positiv in GIST). Ein weiteres Antigen, welches sowohl in GIST des Magen-Darm-Traktes, als auch in GIST anderer Lokalisationen durchgehend nachgewiesen werden kann ist Nestin [122]. Allerdings ist Nestin-Positivität nicht pathognomonisch, da es auch in anderen Tumorentitäten wie Schwannomen exprimiert wird [103]. Desweiteren sind etwa 70 % der GIST positiv für CD34 [36]. 5 Einleitung 1.2.4. Klassifikation und Prognose Gastrointestinale Stromatumoren zeigen ein sehr variables Wachstumsverhalten. Bei vielen Patienten wachsen die Tumoren lange nichtinvasiv-verdrängend und ohne ausgeprägte Metastasierungstendenz. Andererseits finden sich auch schon primär metastasierte Manifestationen [36, 82, 84]. Bis heute sind keine prädiktiven Merkmale bekannt, mit deren Hilfe man den Krankheitsverlauf im Einzelfall zuverlässig prognostizieren könnte. Zur Abschätzung des Risikos für maligne Verläufe erfolgt das individuelle Grading aus diesem Grund nach den Kriterien von Fletcher et al., die während des GIST-Symposiums im Jahr 2002 definiert wurden und die Tumoren in Abhängigkeit ihres maximalen Durchmessers und der Mitoserate (gemessen auf 50 high power fields (40 x Vergrößerung ≈ 5 - 10 mm²) in verschiedene Risikogruppen unterteilt (Tab. 1) [36, 80, 83]. Später entwi- Tab. 1: Klassifikation Gastrointestinaler Stromatumoren bezüglich des Risikos für malignes Verhaltens nach Fletcher et al. [36]. (Kriterien: Maximaler Durchmesser in Zentimetern und Mitoserate auf 50 high-power-fields (HPF)) Risikogruppe Sehr-Niedrig Niedrig Mittel Hoch ckelten Miettinen et al., Hornick et al. und Durchmesser in cm Mitoserate auf 50 HPF <2 ≥2-<5 <5 ≥ 5 - < 10 >5 > 10 jede Größe <5 <5 ≥ 6 - < 10 <5 >5 jede Rate > 10 Joensuu et al. Abwandlungen der Fletcher-Klassifikation, welche zusätzlich die Lokalisation des Primarius, sowie die Frage nach einer Tumorruptur mit einbeziehen [55, 60, 83]. Tab. 2: Klassifikation Gastrointestinaler Stromatumoren bezüglich des Risikos der Krankheitsprogression nach Miettinen et al. [83]. (Kriterien: Maximaler Durchmesser in Zentimetern, Mitoserate auf 50 high-power-fields (HPF) und Lokalisation des Primärtumors) Gruppe 1 2 3 3a 3b 4 5 6 6a 6b Durchmesser in cm ≤2 >2-≤5 > 5 - ≤ 10 > 10 ≤2 >2-≤5 > 5 - ≤ 10 >10 Mitoserate auf 50 HPF ≤5 >5 Progressionsrisiko nach Lokus des Primärtumors Magen Dünndarm Sehr-Niedrig Niedrig Niedrig Mittel Niedrig Mittel Hoch Hoch Sehr-Niedrig Niedrig Mittel Hoch Hoch Hoch Hoch Hoch 6 Einleitung 1.2.5. Molekulare Pathogenese Nach dem aktuellen Forschungsstand werden gain-of-function-Mutationen des Protoonkogens KIT als ursächlich für die Entstehung von über 90 % der GIST angenommen und etwa ein Drittel bis die Hälfte der Tumoren, die keine KIT-Mutation aufweisen, besitzen Mutationen im Gen PDGFRA (platelet derived growth factor receptor, alpha) welche einen analogen Effekt auslösen [83]. KIT ist das auf Chromosom 4 lokalisierte humane Homolog des 1986 entdeckten v-KIT (Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene) und kodiert den Tyrosinkinaserezeptor KIT [6]. Die Bezeichnung leitet sich von der genomischen Sequenz 5' Δgag-kit-Δpol-Δenv 3' des felinen Sarkomvirus ab. Die häufigsten Mutationen treten in den Exonen 11 (60 - 70 %) und 9 (ca. 10 %) auf und betreffen die Autophosphorylierungsinhibition und die Dimerisierungsdomäne des Rezeptors. Seltener sind die Exone 13 und 17 betroffen (je ca. 1 %), welche die ATP-Bindungs- und die Phosphotransferasedomäne kodieren [15, 76]. Gemeinsame Folge aller Mutationen ist eine von ihrem natürlichen Liganden KITRezeptor SCF (stem cell factor) unabhän- Zellmembran gige Aktivität der Kinase durch Trans- oder AutophosphorylierSOS ung mit nachfolgender Aktivie- JAK GRB2 MAPK JAK/STAT RAS rung der KIT-assoziierten Sig- STAT IRS1 naltransduktionskaskaden. Die- RAF1 PI3K se beinhalten unter anderem STAT PI3K-AKT AKT1 den MAP-Kinase Weg, PI3K-AKT MEK1/2 mTOR und JAK/STAT [5, 70, 93, 119]. Jede der drei Kaskaden umfasst eine Vielzahl von second messenger-Stoffen und Effektorproteinen. Um einen grundlegenden Überblick zu ermöglichen, stellt die Abbildung 2 ERK1/2 NFκB MDM2 Kernmembran ERK1/2 NFκB p53 Proliferation ApoptoseERK1/2 inhibition ERK1/2 Proliferation STAT STAT Proliferation eine Auswahl der wichtigsten Transduktionsschritte dar: Proteinsynthese Abb. 2: Die Signaltransduktionskaskaden MAPK (mitogen-activated protein kinase), PI3K-AKT (phosphoinositol-3-kinase/protein kinase B) und JAK/STAT (januskinase/signal transducer and activator of transcription) als Hauptwege der intrazellulären Signalweiterleitung der Rezeptortyrosinkinase KIT [2, 5, 26] 7 Einleitung 1. Mitogen-aktivierter Proteinkinase Weg (MAPK): Die Aktivierung erfolgt über die bei- den Protoonkogen-Produkte RAS und RAF1. RAF1 fungiert als MAP3K, welche über Phosphorylierung die Kinasen MEK1 und MEK2 aktiviert. Diese aktivieren ihrerseits als MAP2Ks die Serin/Threonin-Kinasen ERK1 & 2. ERKs (extracellular signal-regulated kinases) stellen die letzte Ebene der MAPK-Kaskade dar und translozieren in ihrer aktiven Form in den Zellkern, wo sie nukleäre Ziele wie die proliferationsfördernden Transkriptionsfaktoren ELK1 und MYC aktivieren [2, 17]. 2. Die PI3K-AKT-Kaskade hat sowohl antiapoptotische als auch translationsfördernde Wirkung. Phosphatidylinositol-3-Kinase aktiviert über eine Verschiebung des PIP2/PIP3-Gleichgewichts AKT1 (Proteinkinase B, alpha), was die subsequentielle Aktivierung von beispielsweise mTOR, NFκB und MDM2 einleitet [2, 5, 119]. 3. Der dritte bedeutende Signalweg führt über die Januskinase JAK2. Diese aktiviert die STAT-Proteine 1, 3 & 5, welche dimerisieren und ein nukleäres Lokalisationssignal präsentieren. Es ermöglicht ihnen in den Nukleus einzuwandern, wo sie direkt als Transkriptionsfaktoren wirken [2, 10, 30]. Eine gemeinsame Endstrecke der drei dargestellten Kaskaden ist das Cyclin-CDK-System, welches einer der zentralen Regulationsmechanismen des Zellzyklus ist. Es besteht aus über einem Dutzend verschiedener Kinasen, welche den Übertritt der Zelle in die verschiedenen Zyklusstadien kontrollieren (z.B. G1/S- und G2/M-Kontrollpunkt; Abb. 3). Die aktiven Kinasen des Systems bestehen jeweils aus einem Cyclin als regulatorische Untereinheit und einer Cyclin-abhängigen Kinase (CDK) [38, 48, 87]. Entsprechend weisen Cycline die namensgebenden zyklisch variierenden Expressionsmuster auf, wohingegen die CDKs eher kontinuierlich exprimiert werden [58]. Den CDKs stehen verschiedene Inhibitoren gegenüber, wovon sich die meisten zu zwei größeren Gruppen zuordnen lassen. Einerseits die KIP/CIP-Inhibitoren, welche mehrere verschiedene CDKs hemmen können und andererseits eine Gruppe von Inhibitoren, welche spezifisch mit CDK4 und CDK6 interagieren, und unter der Bezeichnung INK4 zusammengefasst werden [24]. Als weitere inhibitorische Einflüsse sind Proteinkinase C und Reprimo zu erwähnen [47]. 8 Einleitung CAK CyclinH MAT1 INK4 p15 CyclinB P CDK1 p16 p18 CDK7 p19 M P G2 CyclinB CDK1 G1 S CyclinD P CDK4/6 CyclinA P CDK2 p57 p27 KIP/CIP p21 CyclinE P CDK2 Abb. 3: Hauptwirkphasen verschiedener Cyclin-CDK-Paare im Verlauf des Zellzyklus (blaue Pfeile) In blau ist der Zellzyklus mit Präsynthese- (G1), Synthese- (S), Postsynthese- (G2) und Mitosephase (M) dargestellt. Cycline und cyclin-abhängige Kinasen (CDK) sind rot, Inhibitoren der Familien INK4 und KIP/CIP grün. Phosphatreste werden durch „P“ symbolisiert. Die CDK activating kinase (CAK) setzt sich zusammen aus Cyclin H, CDK7 und menage à trois 1 (MAT1) und übernimmt die aktivierende Phosphorylierung verschiedener Cyclin-CDK-Paare (hier an CyclinB-CDK1 dargestellt) [28, 38, 43, 87] 1.2.6. Klinik und Therapie Da GIST-Patienten im Regelfall keine ausgeprägte B-Symptomatik aufweisen und der Tumor verdrängend wächst, bleiben die Patienten lange asymptomatisch und etwa jede fünfte Diagnose wird als Zufallsbefund nach, aus anderem Anlass durchgeführten, bildgebenden Untersuchungen gestellt. In einer schwedischen Studie waren 70 % der Tumoren zum Diagnosezeitpunkt symptomatisch, 20 % asymptomatisch und 10 % wurden im Rahmen von Autopsien entdeckt [90]. Wird ein GIST symptomatisch, ist der Tumor oft schon relativ groß und das klinische Bild ergibt sich aus der Lokalisation. Das häufigste Zeichen sind Abdominalschmerzen, welche 50 - 70 % der symptomatischen Patienten aufweisen, gefolgt von gastrointestinalen Blutungen mit 20 - 50 % und Obstruktion mit 3 % [13, 90]. Die Tendenz zu malignem Verhalten ist abhängig von der Lokalisation des Primarius und dessen mitotischer Aktivität (Mitoserate). GIST der Dünndarmregion sind in 20 - 25 % maligne, wohingegen dieser Wert bei GIST des Magens auf 40 - 50 % steigt [83]. Metastasen finden sich überwiegend hepatisch oder peritoneal [40, 53]. Da herkömmliche Chemo- und Radiotherapieschemata ineffektiv sind, bestand die Therapie der Wahl für operable Tumoren bis zum Jahr 2001 uneingeschränkt in der chirurgischen Resektion [20]. Im Mai 2001 wurde der bereits angesprochene Tyrosinkinase9 Einleitung inhibitor Imatinib (Entwicklungsbezeichnung STI571) zugelassen, welcher in allen Krankheitsstadien, also auch bei inoperablen GIST, eine medikamentöse Therapieoption darstellt [21]. Imatinib ist das erste Beispiel einer auf einem molekularen Ziel basierenden Therapie für eine solide Tumorentität. Der Wirkmechanismus besteht in einer reversiblen Hemmung durch kompetitive Verdrängung von ATP an der Kinasedomäne [91, 108]. Meist spricht nicht der gesamte Tumor auf die Behandlung an, jedoch erzielt man in 50 67 % einen Teilerfolg, etwa in Form eines aufgehaltenen oder gebremsten Wachstums [41]. Mit zunehmender Behandlungsdauer wird eine Resistenzzunahme durch Sekundärmutationen beobachtet, nach zweijähriger Behandlung beträgt die Resistenzrate etwa 50 % [41]. Es sind verschiedene Ursachen dieser Sekundär-Resistenzen bekannt. Die meisten Mutationen betreffen die Kinasedomäne und führen zu strukturellen Veränderungen derselben, welche die Bindung des Inhibitors verhindern („gatekeeper-mutation“; Abb. 4) [99]. Aus diesem Grund gewinnen kombinierte, adjuvante und neoadjuvante Therapieschemata zunehmend an Bedeutung und die Entwicklung immer neuer Inhibitoren, welche die bekannten Resistenzen umgehen können, steht im Fokus der pharmakologischen Forschung [4, 23]. P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P Zellmembran KIT-Rezeptor P P P P ATP ADP Inhibitor Inaktives Substrat Aktiviertes Substrat Abb. 4: Schematische Darstellung der Resistenzentwicklung des KIT-Rezeptors durch „gatekeeper“-Mutation [99] Das erste Bild stellt die pathologische, ligandenunabhängige Aktivität der Kinase unter Verbrauch von ATP dar. Im zweiten Bild ist die Funktion der Kinase inhibiert, da ein Inhibitormolekül (wie z.B. Imatinib) die ATP-Bindungsstelle der Kinasedomäne besetzt. Im dritten Bild wird die Bindung des Inhibitors durch eine sekundär aufgetretene, strukturelle Mutation der ATPBindungsstelle („gatekeeper-mutation“) verhindert, ATP ist jedoch weiterhin bindungsfähig, weshalb die Kinase wieder aktiv ist. 10 Einleitung 1.3. Fragestellung Gastrointestinale Stromatumoren sind eine der ätiologisch am besten verstandenen soliden Tumorentitäten. Das Wissen um die konstitutionelle Aktivierung des Tyrosinkinaserezeptors KIT hat die diagnostische Abgrenzung von anderen Tumoren ermöglicht und ein innovatives Feld neuer Therapieoptionen erschlossen. Trotz dieser Errungenschaften ist die individuelle Prognostik ein bisher unzureichend gelöstes Problem. In Ermangelung zuverlässiger genetischer oder immunhistochemischer Marker basiert das Grading von GIST zum aktuellen Stand noch immer auf Größe und Mitoserate des Primärtumors, in einigen Einteilungen ergänzt durch die Kriterien Lokalisation oder Tumorruptur [36, 55, 60, 83]. Alle bekannten Klassifikationen weisen jedoch eine deutliche prognostische Unschärfe auf, wie beispielsweise der Anteil von 30 - 50 % Langzeitüberlebenden (tumorspezifische 5-Jahres-Überlebensrate) in der Gruppe mit hohem Malignitätsrisiko nach Fletcher et al. zeigt [54, 60]. Insbesondere die Verfügbarkeit alternativer Therapiestrategien, wie sie für GIST seit der Entwicklung von Imatinib gegeben ist, erfordert aus medizinischen und ökonomischen Gründen die Entwicklung neuer Verfahren zur genaueren Prognostik. Die Einschätzung des Malignitätsrisikos entscheidet über die Notwendigkeit adjuvanter Therapieprotokolle und Nebenwirkungsspektrum, Resistenzproblematik und Therapiekosten verlangen eine sorgfältige und begründete Selektion der in Betracht kommenden Patienten. Die vorliegende Arbeit befasst sich daher mit der Erforschung verschiedener zellulärer Regulationsmechanismen und Signalkaskaden in Gastrointestinalen Stromatumoren, mit dem Ziel, neue prädiktive Marker zu ermitteln, welche eine zuverlässigere Vorhersage des klinischen Krankheitsverlaufs erlauben. Im Zentrum der Untersuchung steht dabei das Cyclin-CDK-System, welches eines der entscheidenden Steuerungssysteme des Zellzyklus darstellt. 11 Material und Methoden 2. Material und Methoden Um Veränderungen in den Signalkaskaden effizient zu identifizieren und zu evaluieren, werden unterschiedliche Analyseverfahren kombiniert. Das folgende Flussdiagramm gibt einen Überblick über den experimentellen Aufbau der Arbeit: Histologische Analysen von Tumorgrading und Gewebemorphologie & Selektion der genetischen Versuchskollektive Vergleichende Transkriptionsanalyse von Normal- und Tumorgewebe eines Patienten Vergleichende Transkriptionsanalyse verschiedener Tumorprogressionsstadien eines Patienten Vergleichende Transkriptionsanalyse von zwölf Tumoren unterschiedlicher Gradingstufen qRT-PCR mit Gen-Set 1 (Cyclin-CDK-System & p53-Signalweg) qRT-PCR mit Gen-Set 2 (Cyclin-CDK-System & MAPK-Signalweg) qRT-PCR mit Gen-Set 2 (Cyclin-CDK-System & MAPK-Signalweg) Selektion eines Gens zur Untersuchung in einem Kollektiv von 92 Tumorproben Immunhistochemische Färbung von Cyclin H Abb. 5 Überblick über den experimentellen Aufbau der Arbeit Zuerst erfolgt die histologische Beurteilung der verfügbaren kryoasservierten Gewebeproben zur Bestimmung des Tumorgradings und der Probenreinheit. Anschließend werden drei Untersuchungen mit quantitativer Real-Time PolymeraseKettenreaktion (qRT-PCR) durchgeführt. Sie ermöglicht sensible Messungen der Transkriptionsaktivität einer großen Anzahl unterschiedlicher Gene, mit dem Ziel, Veränderungen im Transkriptionsverhalten aufzudecken, welche anschließend immunhistochemisch an einem größeren Kollektiv überprüft werden können. In drei aufeinander folgenden Untersuchungen werden die Transkriptionsmuster von 1. dem Tumorgewebe eines aggressiven GIST und Normalgewebe desselben Patienten, 2. zwei hochmalignen Rezidiven eines Patienten im Verlauf, sowie 3. einem Stellvertreterkollektiv von zwölf Tumoren unterschiedlichen Gradings (je drei Tumoren der FletcherKlassen Niedrig, Mittel und Hoch, sowie drei Rezidivtumoren) vergleichend analysiert. Anhand der Ergebnisse der qRT-PCRs und aufgrund seiner Schlüsselrolle innerhalb des Cyclin-CDK-Systems wird Cyclin H als Gegenstand des immunhistochemischen Versuchsteils ausgewählt. Es werden Färbungen von einem Kollektiv von 92 GIST-Tumoren erstellt und hinsichtlich des prädiktiven Werts von Cyclin H statistisch ausgewertet. 12 Material und Methoden 2.1. Materialien und Geräte 2.1.1. Gewebeproben Die für die qRT-PCR verwendeten kryoasservierten Gewebeproben und die für die vorangehende histologische Beurteilung verwendeten Proben stammen aus der Gewebebank der Klinik für Chirurgie I des Universitätsklinikums Ulm. Die Gewebeproben für den immunhistochemischen Versuchsteil werden vom Pathologischen Institut der Universität Ulm zur Verfügung gestellt. Entsprechende Anträge sind von der Ethikkommission der Universität Ulm genehmigt und werden unter den Antragsnummern 90 & 91/2006 geführt. Alle Patienten wurden vor dem Eingriff über die Gewebsentnahme aufgeklärt und haben schriftlich ihr Einverständnis erklärt. 2.1.2. Fertige Gemische, Lösungen & Reagenziensets Genetischer Versuchsteil - Agarose NEEO Roti®Garose (Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland) - Antigen Retrieval Citra Plus Solution, (BioGenex, San Ramon, Kalifornien, USA) 10X Concentrated - GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder 0,5 µg/µl (Fermentas, Burlington, Kanada) - Human MAP Kinase Signaling Pathway (SuperArray®, Frederick, Maryland, USA) RT² Profiler™ PCR Array - Human p53 Signaling Pathway (SuperArray®, Frederick, Maryland, USA) RT² Profiler™ PCR Array - RNA-Probenpuffer: 6x Loading Dye Solution (Fermentas, Burlington, Kanada) - RNase-free DNase Set (Qiagen®, Hilden, Deutschland) - RNeasy® Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen®, Hilden, Deutschland) - RT² First Strand Kit (SuperArray®, Frederick, Maryland, USA) - RT² Real-Time™ SYBR Green/ (SuperArray®, Frederick, Maryland, USA) Rox PCR master mix - RT² RNA QC PCR Array (SuperArray®, Frederick, Maryland, USA) 13 Material und Methoden Histologischer & Immunhistologischer Versuchsteil - Cedukol® (Kollodiumwolle + ca. 30 % Ethanol) (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) Citra Plus (pH 6.2) (BioGenex, San Ramon, Kalifornien, USA) Cyclin H antibody (ab54903) (Abcam®, Cambridge, Großbritannien) Entellan® (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) Eosin Y Lösung mit Phloxin (Sigma-Aldrich® GmbH, Steinheim, Deutschland) Hämatoxylinlösung Gill Nr.3 (Sigma-Aldrich® GmbH, Steinheim, Deutschland) Liquid DAB+ (Dako Cytomation, Glostrup, Dänemark) Mayers Hämalaunlösung (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) N-Histofine® Simple Stain (Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japan) MAX PO Anti-Mouse - Peroxidase Blocking Reagent (Dako Cytomation, Glostrup, Dänemark) 2.1.3. Chemikalien Die Zusammensetzung selbst hergestellter Gemische und Lösungen ist im jeweiligen Abschnitt des Methodenteils angegeben. Die Angaben beziehen sich jeweils auf ein Gesamtvolumen von einem Liter. In der folgenden Liste sind Bezeichnung und Hersteller der verwendeten Chemikalien aufgeführt: - Chloroform (Trichlormethan) (Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland) Diethylether reinst (AppliChem GmbH, Darmstadt, Deutschland) Dinatriumhydrogenphosphat (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) (Sigma-Aldrich® GmbH, Steinheim, Deutschland) Essigsäure 100 % (VWR® International, Darmstadt, Deutschland) Ethanol absolut puriss. (Riedel-de Haën®, Seelze, Deutschland) Ethidiumbromid (Roche Applied Science, Mannheim, Deutschland) Formaldehydlösung 37 % (Sigma-Aldrich® GmbH, Steinheim, Deutschland) HCl 37 % Salzsäure rauchend (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) Isopropanol (Riedel-de Haën®, Seelze, Deutschland) Methylbenzoat (Benzoesäuremethylester) (VWR® International, Darmstadt, Deutschland) Stickstoff, N2, flüssig (Air Liquide, Wiesbaden-Sonnenberg, Deutschland) Natriumchlorid (VWR® International, Darmstadt, Deutschland) Natriumdihydrogenphosphat (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) Paraffin (VWR® International, Darmstadt, Deutschland) RNase-freies ddH2O (Qiagen, Hilden, Deutschland) Toluol (Sigma-Aldrich® GmbH, Steinheim, Deutschland) TRIS (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan)(Sigma-Aldrich® GmbH, Steinheim, Deutschland) TRIS-Acetat (Sigma-Aldrich® GmbH, Steinheim, Deutschland) Triton® X-100 (Sigma-Aldrich® GmbH, Steinheim, Deutschland) Xylol (Riedel-de Haën®, Seelze, Deutschland) 14 Material und Methoden 2.1.4. Geräte Pipetten - Reference® (Eppendorf®, Hamburg, Deutschland) 0,5-10 µl 10-100 µl, 100-1 000 µl - Research® (Eppendorf®, Hamburg, Deutschland) 0,1-2,5 µl, 2-20 µl, 10-100 µl, 20-200 µl, 100-1 000 µl Zentrifugen - Zentrifuge 5417 R, Rotor FA-45-30-11 - Zentrifuge 5430, Rotor FA-45-24-11-HS - Zentrifuge Megafuge 1.0 R, Rotor 2705, Schaukel 2708 (Eppendorf®, Hamburg, Deutschland) (Eppendorf®, Hamburg, Deutschland) (Heraeus GmbH, Hanau, Deutschland) Kühl- / Gefrierschränke - Comfort Hera freeze HFU 586 Basic Öko Super Profiline (Liebherr GmbH, Biberach an der Riss, Deutschland) (Heraeus GmbH, Hanau, Deutschland) (Liebherr GmbH, Biberach an der Riss, Deutschland) (Liebherr GmbH, Biberach an der Riss, Deutschland) Mikrowellengeräte - M 754 - MWU512WS (Landgraf Laborsysteme HLL GmbH, Langenhagen, Deutschland) (Bauknecht Hausgeräte GmbH, Stuttgart, Deutschland) Waagen - 440-35A - R180-D (Kern & Sohn GmbH, Balingen, Deutschland) (Sartorius GmbH, Göttingen, Deutschland) Mikroskope - Axioplan 2 - IX81 (Carl Zeiss AG, Jena, Deutschland) (Olympus Corporation, Tokio, Japan) PCR-Geräte & Thermocycler - 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA) - PTC-100™ Programmable Thermal (MJ Research, Inc., Watertown, Massachusetts, USA) Controller 15 Material und Methoden Sonstige Gerätschaften - Autoklav 32-2-3 (KSG Sterilisatoren GmbH, Olching, Deutschland) Autotechnikon Leica ASP200 (Leica, Wetzlar, Deutschland) BioPhotometer (Eppendorf®, Hamburg, Deutschland) CellCam LC (Phase, Lübeck, Deutschland) Certomat®BS-1 (B. Braun Biotech International, Melsungen, Deutschland) DPU-414 Thermal Printer (Seiko Instruments Inc., Chiba, Japan) Elektrophorese Mini-Gelapparat (Renner GmbH, Dannstadt, Deutschland) Färbeküvetten Wheaton „810“ (VWR® International, Darmstadt, Deutschland) Gel Casting System 11-14 (Gibco-BRL, Gaithersburg, Maryland, USA) Glasgefäße (VWR® International, Darmstadt, Deutschland) Mikrotom HM 450 (Microm, Walldorf, Deutschland) Mischgerät Reax top (Heidolph, Schwabach, Deutschland) Model 1 000/500 Power Supply (Bio-Rad, Hercules, Kalifornien, USA) Mörser (VWR® International, Darmstadt, Deutschland) Plastikküvette für die Mikrowelle (VWR® International, Darmstadt, Deutschland) Paraffin-Ausgießstation EC 350 (Microm, Walldorf, Deutschland) Schwenktisch KS250 basic (IKA Labortechnik, Staufen, Deutschland) Spatel (VWR® International, Darmstadt, Deutschland) Thermomixer comfort (Eppendorf®, Hamburg, Deutschland) Transilluminator Fluo-Link (Labortechnik Fröbel GmbH, Lindau, Deutschland) Video Graphic Printer UP-895CE (Sony, Tokio, Japan) 2.1.5. - Verbrauchsmaterialien Barrierestift Mini PAP Pen Plus (Zytomed Systems GmbH, Berlin, Deutschland) Deckgläser 24x60 mm (Menzel-Gläser, Braunschweig, Deutschland) DermaClean® Non-Sterile Examination Gloves M (Ansell, Kulim, Malaysia) Einmalskalpelle, No. 11 (Feather, Osaka, Japan) epT.I.P.S. Standard (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) 0,1-10 µl, 2-200 µl, 50-1 000 µl Flächendesinfektion Isopropanol 70 % (VWR® International, Darmstadt, Deutschland) Laborwischtücher Kimtech Science™ (Kimberly-Clark®, Dallas, Texas, USA) Nitra-Tex® Non-Sterile Examination Gloves M (Ansell, Tamworth, Großbritannien) Objektträger Superfrost® Plus (Menzel-Gläser, Braunschweig, Deutschland) Safe-Lock Tubes 0,5 ml, 1,5 ml, 2 ml (Eppendorf®, Hamburg, Deutschland) VWR Signature® Aerosol Filter Pipet Tips (VWR®, Darmstadt, Deutschland) 1-40 µl, 1-100 µl, 100-1 000 µl 16 Material und Methoden 2.2. Methoden 2.2.1. Asservierung der Gewebeproben Die Gewebe werden direkt nach der operativen Entfernung und pathologischen Begutachtung in flüssigem Stickstoff eingefroren bzw. mit Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Alle Operationen mit Kryoasservierung wurden an der Klinik für Allgemein-, Viszeral- und Transplantationschirurgie des Universitätsklinikums Ulm (Ärztliche Direktorin: Frau Prof. Dr. Doris Henne-Bruns) durchgeführt, so dass eine homogene Probenverarbeitung gegeben ist. 2.2.1.1. Immersionsfixation Unmittelbar nach der Entnahme erfolgt die weitere Präparation und Fixierung über 24 Stunden in Formalin. Proben, bei denen saures Formalin als Erst-Fixans verwendet wird, werden anschließend für weitere 24 Stunden in neutral gepuffertes Formalin überführt. Die Fixierungslösungen werden 4 Stunden unter fließendem Wasser ausgewaschen. Zusammensetzung selbst hergestellter Gemische & Lösungen: - Saures Formalin 4 %: 150 ml (2,62 mol) Essigsäure 100 % 108 ml Formaldehydlösung 37 % 877 ml Aqua dest. - Neutral gepuffertes Formalin 10 %: 4,0 g (33,34 mmol) Natriumdihydrogenphosphat 6,5 g (45,79 mmol) Dinatriumhydrogenphosphat 100 ml Formaldehydlösung 37 % 900 ml Aqua dest. 2.2.1.2. Einbettung des Gewebes Die Dehydrierung der Gewebestücke erfolgt über Nacht in einem Autotechnikon. Das genaue Protokoll findet sich in Tabelle 3. Zuerst durchlaufen die Proben eine aufsteigende Ethanolreihe und werden anschließend in Methylbenzoat inkubiert. Der verbliebene Alkohol wird mit Toluol ausgewaschen. Abschließend wird das Intermedium durch Paraffin ersetzt. Die fertig fixierten Gewebe wer- Tab. 3: Protokoll des Autotechnikons Reagenz Ethanol 70 % Ethanol 80 % Ethanol 96 % Ethanol 100 % Ethanol 100 % Ethanol 100 % Methylbenzoat Methylbenzoat Toluol Toluol Paraffin Paraffin Paraffin Dauer Temp. 1,5 h 2h 2,5 h 1h 2h 4h 4h 3h 0,3 h 0,3 h 1h 1h 1h 45 °C 45 °C 45 °C 45 °C 45 °C 45 °C 45 °C 45 °C 45 °C 45 °C 60 °C 60 °C 60 °C den von Hand in Paraffinblöcke eingegossen. 17 Material und Methoden 2.2.2. Histologie – Analysen des Gradings und der Gewebemorphologie Als Grundlage für die Auswahl der Kollektive zur genetischen Untersuchung werden 66 Tumorproben von 18 Patienten histologisch beurteilt. Im Mittelpunkt stehen die Begutachtung der Probenqualität und die Determination des Tumorgradings. Hierfür erfolgt eine Hämatoxylin-Eosin-Färbung von in Paraffin eingebetteten Tumorproben, welche mit den kryoasservierten Geweben direkt korrespondieren. 2.2.2.1. Entparaffinieren und Rehydrierung der histologischen Schnitte Unter Verwendung eines Schlittenmikrotoms werden 3 µm starke Schnitte des eingebetteten Gewebes angefertigt und über Nacht bei 38 °C im Wärmeschrank getrocknet. Die Präparate werden in zwei Xylolbäder mit je 10 Minuten Einwirkzeit entparaffiniert und in einer absteigenden Ethanolreihe rehydriert (3 x 100 %iges, 1 x 96 %iges, 1 x 70 %iges Ethanol, je 5 Minuten). Zuletzt werden die Präparate zweimal 5 Minuten mit destilliertem Wasser gespült. 2.2.2.2. Hämatoxylin-Eosin-Färbung Die entparaffinierten Schnitte werden für 3 Minuten in Hämatoxylinlösung getaucht und anschließend zweimal eine Minute mit destilliertem Wasser gespült. Nach der Differenzierung in 1 %igem HCl-Ethanol, werden die Schnitte 10 Minuten unter fließendem Wasser gebläut. Erneut werden die Präparate mit destilliertem Wasser gespült und zur Gegenfärbung für 10 Sekunden in Eosinlösung gestellt. Zur Dehydrierung und Fixierung werden die Präparate in einer aufsteigenden Alkoholreihe (2 x Ethanol 96 %, 3 x Ethanol 100 %, je 5 Minuten) und Xylol (2 x 10 Minuten) inkubiert und mit „Entellan®“ eingedeckt. Zusammensetzung selbst hergestellter Gemische & Lösungen: - HCl-Ethanol 1%: 40 ml HCl 25% 960 ml Ethanol 70% 2.2.2.3. Auswertung Die Beurteilung des Tumorgradings erfolgt entsprechend der Einteilung nach Fletcher et al., in welche der maximale Durchmesser, sowie die Mitoserate des Primärtumors einfließen (siehe Tab. 1) [36]. Um eine der Evaluation zugängliche Einteilung mit Unterscheidung von Primär- und Sekundärtumoren zu schaffen, werden Rezidivtumoren bei 18 Material und Methoden den genetischen Untersuchungen als eigenständige Gruppe behandelt. Dadurch entsteht eine Aufteilung in die vier Gruppen „Niedrig“, „Mittel“, „Hoch“ und „Rezidiv“, wobei die deutschen Bezeichnungen äquivalent zu den Malignitätsrisikogruppen „low“, „intermediate“ und „high“ der Klassifikation nach Fletcher et al. verwendet werden. Tumoren der niedrigsten Malignitätsrisikogruppe („very low“) werden erst im immunhistologischen Versuchsteil untersucht. Bei der Auswahl des Kollektivs für die genetische Untersuchung fließen neben Fletchers Risikoklassifikation weitere klinische Daten bezüglich Lokalisation des Primärtumors, Alter und Geschlecht mit ein. Abhängig von der verfügbaren Tumormenge sind in den meisten Fällen mehrere Gewebestücke asserviert. Zur Selektion einzelner Proben für die weiteren Versuche erfolgen Schätzungen der Anteile an Tumorgewebe, Nekrosearealen und Normalgewebe in 10 %-Schritten. Bei den für die Isolation der mRNA eingesetzten Proben wird auf einen hohen Prozentsatz (≥ 90 %) an intaktem Tumorgewebe Wert gelegt. 19 Material und Methoden 2.2.3. Genetik – Analysen der Gentranskription Nach der Zusammenstellung der Versuchskollektive auf Basis der histologischen Beurteilung der Gewebeproben und zugehörigen klinischen Daten, wird zum Screening auf genetischer Ebene ein quantitatives Real-Time Polymerase-Kettenreaktionsverfahren (qRT-PCR) eingesetzt. Es ermöglicht sensible Messungen der Transkriptionsaktivität einer großen Anzahl unterschiedlicher Gene, die auf Grundlage der aktuellen Literatur bzw. den Ergebnissen vorangehender Versuche ausgewählt werden. In drei Versuchsansätzen mit unterschiedlichem Probenmaterial werden neben Genen des Cyclin-CDK-Systems auch Vertreter des p53- und des MAPK-Signalwegs untersucht. 2.2.3.1. Isolation der RNA In der Vorbereitungs- und Etablierungsphase wurden RNA-Isolationskits verschiedener Firmen getestet und die Qualität der erzielten Aufreinigungsergebnisse verglichen. Alle für die Arbeit verwendeten RNA-Isolate werden mit dem „RNeasy® Lipid Tissue Mini Kit“, ergänzt durch das „RNase-free DNase Set“, in Übereinstimmung mit den Protokollen des Herstellers gewonnen. Dieses Kit basiert auf einer Phenol-Chloroform-Extraktion, die in Kombination mit einer Silica-Gel Membran eingesetzt wird. Die Tumorprobe wird mit flüssigem Stickstoff in einem Handmörser homogenisiert und 35 mg abgewogen. Im nächsten Schritt werden 1 000 µl des guanidiniumthiocyanat- und phenolhaltigen „QIAzol Lysis Reagent“ hinzugefügt und die Probe 30 Sekunden auf dem Vortexer durchmischt. Nach 5 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur (aufbrechen der Nukleoproteinkomplexe), ergänzt man 200 µl Chloroform und durchmischt erneut (15 Sekunden vortexen). Nach 3-minütiger Inkubation werden die Eppendorfgefäße zur Phasentrennung für 15 Minuten bei 4 °C und 12 000 g zentrifugiert. Die wässrige oberste Phase wird in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Es wird die gleiche Menge 70 %igen Ethanols ergänzt und durch vortexen gemischt. Die Probe wird in zwei Schritten durch eine Silica-Membran („RNeasy® Mini Spin Column“) zentrifugiert (je 15 Sekunden bei 9 000 g). Durch ihre selektiven Bindungseigenschaften adsorbiert die Silica-Membran die Gesamt-RNA und ermöglicht so die Abtrennung verbliebener Proteine und DNA in den folgenden Waschschritten mit den Puffern „RW1“ und „RPE“ (jeweils 15 Sekunden bei 9 000 g). Nach Zentrifugation und Verwerfen des Durchflusses werden, zum zusätzlichen Verdau eventuell zurückgebliebener DNA, 1 500 Kunitz-Einheiten DNase I in 80 µl „DNase I 20 Material und Methoden incubation mix“ aufgetragen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird die Silica-Membran erneut mit 350 µl „RW1“-Puffer und zweimal mit je 500 µl „RPE“-Puffer gespült. Der Durchfluss wird verworfen und die Membran für eine Minute bei 12 000 g in der Zentrifuge getrocknet. Sie wird in ein neues Reaktionsgefäß transferiert und 40 µl RNase-freies Wasser werden aufpipettiert. Das Wasser dient zur Elution der RNA während der folgenden, 1-minütigen Zentrifugation (9 000 g). Der Elutionsschritt wird mit dem Durchfluss noch einmal wiederholt und das Reaktionsgefäß mit dem Isolat anschließend sofort auf Eis gestellt. Nach Abnehmen der für die Qualitätskontrollen benötigten Mengen, wird die RNA in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert. 2.2.3.2. Qualitätskontrollen der RNA Da die Ergebnisse der anschließenden qRT-PCR stark von der hohen Qualität der eingesetzten mRNA abhängen, werden verschiedene Kontrollen zur Qualitätssicherung zwischengeschaltet: Zur Konzentrationsbestimmung wird 1 µl des RNA-Isolats im Verhältnis 1 : 100 mit Aqua dest. verdünnt und spektrophotometrisch die Extinktion bei den Wellenlängen 230, 260 und 280 nm gemessen. Darüber hinaus ermöglicht die Errechnung der Quotienten und eine erste Reinheitskontrolle des Isolats. Zusätzlich wird 1 µl des Isolates elektrophoretisch auf 1 %igem Agarosegel aufgetrennt (50ml Gelplatte, 30 min, 100 V). Die entstandenen Banden werden auf einem Transilluminator bei λ = 254 nm begutachtet. Zusammensetzung selbst hergestellter Gemische & Lösungen: - TAE-Puffer: 4,85 g (40 mmol) TRIS 292,24 mg (1 mmol) EDTA 500 ml Aqua dest. Essigsäure 100 % ad pH 8,0 Aqua dest. ad 1 000 ml - Agarosegel: 10 g Agarose 1000 ml TAE-Puffer 50 µl Ethidiumbromid Abb. 6: Gelelektrophoretische Auftrennung der RNA-Isolate von vier Gewebeproben. Die beiden Banden entsprechen der 18s- und der 28s-rRNA (ribosomal ribonucleic acid). 21 Material und Methoden 2.2.3.3. cDNA Synthese Zur Synthetisierung der cDNA wird der auf der Reversen Transkriptase eines murinen Leukämie Virus (M-MLV) basierende „RT² First Strand Kit“ eingesetzt. Die Durchführung läuft entsprechend dem Herstellerprotokoll ab, mit einer Ausgangsmenge von 2 µg RNA (Proben werden mit RNase-freiem Wasser auf eine einheitliche Konzentration von 0,5 µg/µl verdünnt). Zur Elimination eventuell verbliebener genomischer DNA wird die RNA mit 4 µl RNase-freiem Wasser und 2 µl „5X gDNA Elimination Buffer“ vermischt, 5 Minuten bei 42 °C inkubiert und eine Minute auf Eis gekühlt. Anschließend wird der „RT Cocktail“ (4 µl „5X RT Buffer 3“, 1 µl „Primer & External Control Mix“, 2 µl „RT Enzyme Mix 3“, 3 µl RNase-freies Wasser) zugesetzt und die Inkubation bei 42 °C für weitere 15 Minuten fortgesetzt. Die Inaktivierung der Enzyme und Degradation der RNA erfolgt über 5 Minuten bei 95 °C. Abschließend werden 91 µl ddH2O zugesetzt und die Proben in flüssigen Stickstoff schockgefroren. Bis zur qRT-PCR werden sie bei -20 °C gelagert. 2.2.3.4. Qualitätskontrollen der cDNA Zur finalen Kontrolle vor der Durchführung der qRT-PCR kommt eine spezielle 96-well Platte der Firma SuperArray® zum Einsatz, mit der verschiedene Aspekte überprüft werden: Mit der Amplifikation der Housekeeping-Gene Beta-Actin (ACTB) und Hypoxanthinphosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) werden die Intaktheit und mögliche Schwankungen in der Konzentration der eingesetzten cDNA überprüft. Außerdem wird der Wirkungsgrad der reversen Transkription wird durch die Amplifikation einer im Kit bereits enthaltenen Kontroll-RNA kontrolliert und auf Verunreinigungen durch genomische DNA oder PCR-inhibierende Stoffe getestet. Entsprechend dem Herstellerprotokoll werden in jedes Well 25 µl „1X SuperArray PCR master mix“ eingebracht, welche zusätzlich entweder 6 µl cDNA, 1 µl einer Verdünnung der eingesetzten RNA (1 : 100), oder aber kein Probenmaterial enthalten. 2.2.3.5. Quantitative Real-time PCR Analysen Zur Vorbereitung der Platten für die qRT-PCR wird ein Reaktionsansatz aus 1 275 µl 2X SuperArray PCR master mix, 1 173 µl ddH2O und 102 µl cDNA hergestellt. In jedes Well werden 25 µl dieses Ansatzes pipettiert, die fertig bestückten Platten anschließend versiegelt und bis zur Messung bei -20 °C eingefroren. 22 Material und Methoden Die PCR-Reaktion läuft in einem „7500 Fast Real-Time PCR System“ der Firma Applied Biosystems ab und basiert auf der Reaktion des Fluoreszenzfarbstoffes „SYBR® Green“, welcher bei der Interkalation Licht mit einer Wellenlänge von 521 nm emittiert. Die Stärke dieses Fluoreszenzsignals wird zum Ende jeder Elongationsphase gemessen. Bei jedem Durchgang können 84 Testgene untersucht werden, die 12 restlichen Wells dienen der Amplifikation verschiedener Housekeeping-Gene und als Kontrollen für den korrekten Verlauf von reverser Transkription und Polymerase-Kettenreaktion. 2.2.3.6. Auswertung Die Quantifizierung der in den Proben enthaltenen mRNA erfolgt als relative Messung im Verhältnis zu einer definierten Referenzprobe. Bei Vergleichen von Normal- und Tumorgewebe gilt das Normalgewebe als Referenz, bei Vergleichen von Rezidiven das früher aufgetretene Rezidiv und bei Vergleichen von Tumoren unterschiedlicher Gradings wird der Patient mit der niedrigsten Risikoeinstufung nach Fletcher et al. als Referenz eingesetzt [36]. Als Ausgangspunkt für die Quantifizierung wird der Threshold-Cycle (Ct-Wert) jeder Probe verwendet. Um den Einfluss von geringfügigen Variationen des Probenvolumens auszugleichen, werden Housekeeping-Gene als Referenz eingesetzt. Mit ihrer Hilfe werden die Ct-Werte zu ∆Ct-Werten normalisiert ( ( ) ( ) ). - Für Ge- ne, deren mittlere Threshold-Cycles demjenigen von Beta-Actin (ACTB) näher sind, wird dieses als endogene Kontrolle eingesetzt, im Bereich darüber Hypoxanthin- phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1). Basierend auf dem ∆Ct-Wert wird über die Formel ( ) ( ) der ∆∆Ct-Wert errechnet. Aus diesem ergibt sich die relative Tran- skriptmenge (RQ) als . Aus Gründen der gleichmäßigen Darstellbarkeit von Zu- und Abnahmen der mRNA-Menge, wird die relative Transkriptmenge in den relativen Abweichungsfaktor (RD) der Testprobe von der mit dem Wert 1,0 definierten Referenzprobe umgewandelt: ( ) { 23 Material und Methoden Entsprechend dem Wert der Referenzprobe liegt der Schnittpunkt der X- mit der Y-Achse in grafischen Darstellungen bei 1,0, was auch den Umschlagspunkt zwischen positiven und negativen Abweichungsfaktoren markiert. RD-Werte, die Abnahmen der mRNA-Menge beschreiben, werden stets mit negativem Vorzeichen angegeben. Der Vorteil gegenüber der Darstellung von RQ-Werten liegt in der überlegenen Überschaubarkeit und Vergleichbarkeit. Eine um den Faktor 5 ( ) geringere Menge im Testgewebe stellt sich somit nominal und grafisch im gleichen Abstand zur Referenz ( ) dar, wie eine um den gleichen Faktor ( ) grö- ßere Menge. Der Unterschied wird in Abb. 7 veranschaulicht. RQ 10,0 A 10,0 5,0 6,0 4,0 0,0 10,0 +10,0 B +5,0 5,0 8,0 2,0 RD 1,0 1,0 -5,0 0,1 0,2 1,0 -5,0 -10,0 -10,0 Abb. 7: Beispieldiagramm zur Verdeutlichung der Vorteile des relativen Abweichungsfaktors (RD) gegenüber der relativen Transkriptmenge (RQ). In beiden Diagrammen sind identische Beispielergebnisse dargestellt. Diagramm A basiert auf RQ-Werten, während für die Darstellung in Diagramm B RD-Werte verwendet werden. Folge ist eine ausgeglichene Darstellung von positiven und negativen Abweichungen der mRNA-Menge von der Referenzprobe. Alternativ würde sich das Problem der ausgeglichenen grafischen Darstellung durch die Verwendung logarithmisch skalierter Achsen lösen lassen, jedoch müsste man auf den zusätzlichen Vorteil der einfacheren Vergleichbarkeit der numerischen Werte verzichten, weswegen die beschriebene Methode vorgezogen wird. Als cut-off wird für Einzelproben eine Abweichung (RD) der mRNA-Menge im Testgewebe von der Referenzprobe um mehr als den Faktor ± 5,0 festgelegt. Einzelne Gene werden jedoch auch aufgrund ihrer funktionellen Zusammengehörigkeit in die Arbeit aufgenommen. Bei Versuchsgruppen aus mehreren Gewebeproben sind für die Selektion nicht allein der Mittelwert der Gruppe, sondern die Abweichungsfaktoren der Einzelproben entscheidend. 24 Material und Methoden Da das arithmetische Mittel nicht zur Berechnung von Mittelwerten relativer Faktoren geeignet ist, erfolgt die Berechnung ausgehend von den RQ-Werten über die Formel des geometrischen Mittels ( der Faktoren bis ). Dieses errechnet sich als die n-te Wurzel aus dem Produkt : √∏ Bei der Untersuchung mehrerer Tumoren wird die relative Transkriptionsaktivität der vier Untersuchungsgruppen als Box & Whiskers-Plots dargestellt und ergänzend die geometrischen Mittelwerte jeder der vier Gruppen einzeln, sowie der drei Primärtumorgruppen zusammengefasst mit zugehöriger Standardabweichung (SD) in Tabellenform angegeben. 25 Material und Methoden 2.2.4. Immunhistologie – Analysen der Proteinexpression Aufgrund der Ergebnisse der qRT-PCR und wegen seiner Schlüsselrolle innerhalb des Cyclin-CDK-Systems wird für diese Arbeit Cyclin H zur weiteren Erforschung ausgewählt. Die Validierung der genetischen Untersuchungsergebnisse auf Proteinebene wird immunhistologisch durchgeführt. Um eine belastbare statistische Auswertung zu ermöglichen, werden Präparate eines Kollektivs von 92 GIST-Patienten erstellt. 2.2.4.1. Vorbereitung der Präparate für die immunhistochemische Färbung Die Fixierung und Einbettung des Gewebes, sowie die Gewinnung histologischer Schnitte erfolgen analog zu dem in den Kapiteln 2.2.1.1 - 2.2.2.1 beschriebenen Vorgehen, weshalb an dieser Stelle nicht mehr detailliert auf die einzelnen Schritte eingegangen wird. Bei der Rehydrierung der Präparate wird das Protokoll wegen der späteren Hitzedemaskierung der Epitope an einer Stelle abgeändert. Anstatt des 96 %igen Ethanolbades werden die Schnitte für eine Minute in 0,05 %iger Celloidinlösung inkubiert, um einem Abschwimmen während des Demaskierungsvorgangs vorzubeugen. Zusammensetzung selbst hergestellter Gemische & Lösungen: - Celloidinlösung 0,05 %: 0,5g Cedukol 500 ml Ethanol absolut 500 ml Diethylether reinst 2.2.4.2. Epitopdemaskierung Die Schnitte werden in einem Mikrowellenherd 2 Minuten bei 450 Watt erhitzt und weitere 20 Minuten bei 80 Watt gekocht. Als Pufferlösung wird Citratpuffer (pH 6,2) eingesetzt, in dem die Objektträger für 20 Minuten zum Abkühlen belassen werden. Anschließend werden die Präparate 10 Minuten mit destilliertem Wasser und weitere 10 Minuten mit TRIS/HCl-Puffer gespült. Zusammensetzung selbst hergestellter Gemische & Lösungen: - TRIS/HCl-Puffer: 500 ml Aqua dest. 4 ml (0,004 % v/v) Triton® X-100 1,21 g (10 mmol) TRIS 8,77 g (150 mmol) Natriumchlorid HCl ad pH 7,6 Aqua dest. ad 1 000 ml 26 Material und Methoden 2.2.4.3. Peroxidaseblock Die Inaktivierung der endogenen Peroxidasen erfolgt durch 10-minütige Inkubation in Methanol mit einem 0,3 %igen Anteil H2O2 („Peroxidase Blocking Reagent“). Danach werden die Präparate 2 x 10 Minuten in TRIS/HCl-Puffer gespült. 2.2.4.4. Primärantikörper Es werden 100 µl des mit TRIS/HCl-Puffer im Verhältnis 1 : 100 verdünnten Primärantikörpers aufgetragen und die Präparate ca. 12 Stunden bei 4 °C in einer feuchten Kammer inkubiert. Vor der Weiterverarbeitung werden die Objektträger 2 x 10 Minuten in TRIS/HCl-Puffer gespült. 2.2.4.5. Detektionssystem und Gegenfärbung Zur Detektion der Primärantikörper wird „N-Histofine® Simple Stain MAX PO Anti-Mouse“ eingesetzt. Es wird auf die Präparate aufgebracht und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 2 x 10 Minuten TRIS/HCl-Puffer-Spülung wird „liquid DAB+“ als chromogenes Substrat aufgetragen und 30 Minuten auf den Schnitten belassen. Nach 2 x 10 Minuten Spülung mit destilliertem Wasser werden die Schnitte zur Gegenfärbung 10 Sekunden in Mayers Hämalaunlösung getaucht und 10 Minuten unter fließendem Wasser gebläut. 2.2.4.6. Dehydrieren und Eindecken Nach Abschluss der Färbung erfolgt die Dehydrierung der Präparate in einer aufsteigenden Ethanolreihe (1 x 70 %, 1 x 96 % und 3 x 100 %) mit einer Verweildauer von je 5 Minuten. Nach zweimaliger Inkubation in Xylol für je weitere 5 Minuten werden die Schnitte mit „Entellan®“ eingedeckt. 2.2.4.7. Spezifitäts- und Positivkontrollen Bei jeder Färbung werden Proben eines Cyclin H-positiven Adenokarzinoms des Colon als Positiv- und Negativkontrollen mitgeführt. Auf die Negativkontrollen werden statt der Primärantikörperverdünnung 100 µl TRIS/HCl-Puffer aufgetragen. Alle anderen Schritte werden identisch mit den Versuchspräparaten durchgeführt. Der Spezifitätsnachweis der verwendeten Antikörper wurde von den jeweiligen Herstellerfirmen erbracht. 27 Material und Methoden 2.2.4.8. Beurteilung der Präparate und statistische Auswertung Die Präparate werden, basierenden auf den Kriterien von Bondi et al. und Kayaselcuk et al., semiquantitativ beurteilt [8, 63]. Hinsichtlich der subzellulären Lokalisation zeigen sich vorwiegend die Zellkerne positiv für Cyclin H, wobei einzelne Proben eine begleitende zytoplasmatische Positivität aufweisen. Bei der Beurteilung und Quantifizierung werden jedoch ausschließlich Zellen mit reaktivem Nukleus gewertet. Als unterer Grenzwert für Positivität wird ein Wert von ≥ 10 % positiver Zellkerne verwendet. Präparate, die diesen Wert überschreiten werden mit den Grenzen ≥ 10 % - < 25 %, ≥ 25 % - < 50 %, ≥ 50 % < 75 % und ≥ 75 % in vier Gruppen unterteilt. Nach der Erstellung von Kontingenztafeln zu verschiedenen Fragestellungen wird zur Prüfung auf Unabhängigkeit der χ²-Test durchgeführt. Unterschreitet die Anzahl der Fälle in einem Feld der Tafel den Wert 5, wird alternativ der exakte Test nach Fisher angewandt, welcher auch bei einer geringen Anzahl von Beobachtungen Gültigkeit behält. Die Berechnungen werden mit zweiseitiger Fragestellung durchgeführt. Als Signifikanzniveau wird eine Irrtumswahrscheinlichkeit kleiner 5 % definiert ( ). Zur Einschätzung von Risiken erfolgt die Berechnung des Quotenverhältnisses (odds ratio), da dieses, im Gegensatz zum relativen Risiko, auch Aussagen zu retrospektiven Studien zulässt. Es wird mit 95 %igem Konfidenzintervall (KI) gearbeitet, welches mit oberer und unterer Grenze in eckigen Klammern nach dem Quotenverhältnis angegeben wird ( ). Bei Berechnungen zur Überlebenszeit wird die Erstdiagnose als Anfangszeitpunkt definiert. Das Ende der Zeitspanne bestimmt das Datum der letzten Kontrolluntersuchung beziehungsweise das Sterbedatum. Das Kollektiv der verstorbenen Patienten muss nach tumorbedingter und anderweitiger Todesursache in zwei Untergruppen aufgeteilt werden. In die Berechnung des Gesamt-Überlebens gehen beide Gruppen als verstorben ein, beim tumorspezifischen-Überleben (TSÜ) werden hingegen nur die an den Folgen des GIST verstorbenen Patienten gewertet. Für die Übrigen geht das Todesdatum lediglich als Ende des Beobachtungszeitraums in die Berechnung ein. Diagramme zu Überlebenszeiten werden als Kaplan-Meier Kurve dargestellt. Analog zur Berechnung des tumorspezifischen-Überlebens wird auch die Bestimmung des tumorfreien-Überlebens (TFÜ) durchgeführt. Als statistisch relevantes Ereignis wird hier 28 Material und Methoden der diagnostische Nachweis von Rezidiven oder Metastasen definiert. Bei den übrigen Patienten gilt der Zeitpunkt der letzten Kontrolluntersuchung bzw. das Sterbedatum als Endpunkt. Bei zeitabhängigen Fragestellungen wird zur Detektion signifikanter Differenzen ein Log-Rang-Test vorgenommen. 2.2.5. EDV-gestützte Auswertung, Statistik und Erstellung von Grafiken Die Erstauswertung der durch die qRT-PCR erhaltenen Datensätze erfolgt mit dem Programm Sequence Detection Software Version 1.4 (Applied Biosystems®). Für die weitere statistische Analyse sowohl des genetischen, als auch des immunhistologischen Versuchsteils werden die Programme SPSS® 16 (SPSS Inc.) und Excel® 2007 (Microsoft®) eingesetzt. Die in der Arbeit enthaltenen Grafiken werden entweder anhand eigener Ergebnisse, oder auf Basis von Abbildungen aus wissenschaftlichen Publikationen erstellt. Um bei der Verwendung fremder Abbildungen reproduktionsbedingte Ungenauigkeiten zu vermeiden, wird darauf geachtet, Überarbeitungen ausgehend von einer digitalen Ursprungsdatei, möglichst in Form einer Vektorgrafik, durchzuführen. Die entsprechenden Quellen sind im Literaturverzeichnis angegeben. Die verwendeten Grafikprogramme sind CorelDraw® X4 (Corel® Corporation) und Photoshop® CS3 (Adobe® Systems Incorporated). Verfasst wird die Arbeit in Word 2007 (Microsoft®). 29 Ergebnisse 3. Ergebnisse 3.1. Histologie – Analysen des Gradings und der Gewebemorphologie Der histologische Versuchsteil dient der Bestimmung des Tumorgradings und der qualitativen Beurteilung der zur Verfügung stehenden Gewebeproben (Anteil von Nekrosearealen und Normalgewebe). Ergänzt durch klinische Details über die Patienten bilden diese Daten die Basis für die Auswahl der mittels qRT-PCR zu untersuchenden Gewebe. Niedrig n=5 Hoch & Rezidiv n=10 Mittel n=3 Rezidiv n=7 Hoch n=3 Abb. 8: Verteilung der histologisch untersuchten Tumoren auf Malignitätsrisikogruppen nach Fletcher et al. [36]. Die Hochrisikogruppe ist in der rechten Teilgrafik zusätzlich in Primärtumoren und Rezidive aufgeschlüsselt. Insgesamt wurden 66 Proben von 18 Patienten untersucht. 13 Primärtumoren traten im Bereich des Magens auf, 5 stammen aus den verschiedenen Abschnitten des Dünndarms. Wie aus Abbildung 8 ersichtlich, sind 10 Tumoren der Gruppe mit dem höchsten Malignitätsrisiko nach Fletcher et al. zuzuordnen, wobei sich dieser Wert aus Rezidiv-Tumoren (n = 7) und als Hochrisiko zu klassifizierenden Primärtumoren (n = 3) zusammensetzt. Im Falle der Rezidivtumoren wird ergänzend jeweils auch der Primärtumor des betreffenden Patienten beurteilt, welche sich ebenso ohne Ausnahme der Hochrisikogruppe zugehörig finden. Die mittlere Risikogruppe zeigt sich für 3 Tumoren zutreffend und 5 Tumoren weisen ein niedriges Malignitätsrisiko auf. 30 Ergebnisse Abbildung 9 zeigt Beispiele für die unterschiedlichen Gradingstufen der Tumoren. Der Anteil an intaktem Tumorgewebe ist bei der Mehrheit der Proben so hoch, dass die ausschließliche Verwendung von Proben mit einem Anteil von ≥ 90 % für die Isolation der RNA sichergestellt ist. Abb. 9: Hämatoxylin-Eosin Färbung Gastrointestinaler Stromatumoren aus verschiedenen Risikogruppen nach Fletcher et al. [36] A = Niedriges Malignitätsrisiko B = Mittleres Malignitätsrisiko C = Hohes Malignitätsrisiko D = Rezidivtumor (Hohes Malignitätsrisiko) 31 Ergebnisse 3.2. Genetik – Analysen der Gentranskription Das Verfahren der qRT-PCR wurde gewählt, da es eine sensitive und parallele Untersuchung einer Vielzahl von Genen ermöglicht. Aufgrund dieser Eigenschaften ist es optimal für ein umfassendes Screening der zellulären Signaltransduktionswege zur Identifikation auffälliger Transkriptionsveränderungen geeignet. In drei unterschiedlichen Ansätzen werden Tumor- und Normalgewebe, zwei Rezidive eines Patienten und zwölf Tumoren unterschiedlicher Gradingstufen untersucht. 3.2.1. Vergleichende Analyse von Tumor- und Normalgewebe Das Cyclin-CDK-System und der p53-Signalweg sind zwei der wichtigsten Regulatoren des Zellzyklus [34, 38]. Das Cyclin-CDK-System kontrolliert direkt den Übergang der Zelle in die verschiedenen Zyklusstadien, wohingegen das Tumorsuppressorgen p53 mit seinem weitverzweigten Signalweg Vorgänge wie Zellzyklus-Arrest oder Apoptose bei DNA-Schäden und Zelldifferenzierung steuert. Aufgrund ihrer Funktion ist nachvollziehbar, dass beide eine zentrale Rolle in der Pathophysiologie verschiedener Tumorentitäten spielen [34, 38, 43, 123]. Auch für GIST konnte in verschiedenen Arbeiten eine Assoziation von immunhistochemischer p53-Positivität mit gesteigerter klinischer Malignität nachgewiesen werden [50, 72, 126]. Ausgehend von dieser Grundlage wird bei der ersten qRT-PCR die Transkription von Genen des Cyclin-CDK-Systems und des p53-Signalwegs (Gen-Set 1) im Vergleich von Tumormit Normalgewebe untersucht. Hinweisen auf Veränderungen im Transkriptionsmuster kann dann in den Folgeversuchen durch Anpassung des Gen-Sets spezifischer nachgegangen werden. Da GIST in allen Abschnitten des Gastrointestinaltraktes auftreten, das physiologische Expressionsmuster sich jedoch in Abhängigkeit von der Lokalisation stark unterscheidet, ist die Definition eines gesunden Referenzgewebes schwierig. Durch die Heterogenität des Normalgewebes könnten pathologische Veränderungen überbetont oder maskiert werden. Aus diesem Grund wird der Versuch mit Tumor- und Normalgewebe eines einzelnen Patienten durchgeführt. Um ein möglichst fortgeschrittenes Tumorstadium zu garantieren, wird Probenmaterial eines Rezidiv-Falles ausgewählt. Tab. 4: Klinische und pathologische Daten des untersuchten Patienten und Tumors Malignitätsrisiko Mitoserate Größe Primärlokalisation Rezidiv 47 9,5 Jejunum Zelltyp spindelzellig Alter Geschlecht 53 weiblich 32 Ergebnisse Die nachgewiesenen Transkriptionsveränderungen sind in den Grafiken 10 und 11 dargestellt. Transkriptionssteigerungen im Tumor, wel- Genen CDKN2A (Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A, p16) mit 21,1-facher Erhöhung, RPRM (Reprimo, TP53 dependent G2 arrest mediator candidate) mit 16,3-, BCL2 (B-cell CLL/lymphoma 2) mit 11,5- und CCNH (Cyc- 25,0 Relative Abweichung (RD) che den Faktor 10 übertreffen, sind bei den 21,1 20,0 16,3 15,0 11,5 10,0 10,2 9,6 5,0 0,0 lin H) mit 10,2-facher Erhöhung nachweisbar. Auch CCNB2 (Cyclin B2) liegt mit einem Abweichungsfaktor (RD) von 9,6 deutlich über dem gewählten Grenzwert von ±5,0 facher Veränderung. Abb. 10: Gene mit gesteigerter Transkription im Tumorgewebe (Ergebnis der qRT-PCR im Vergleich mit Normalgewebe) CDKN2A = Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A RPRM = Reprimo BCL2 = B-cell CLL/lymphoma 2 CCNH = Cyclin H CCNB2 = Cyclin B2 Zudem sind erniedrigte Transkriptionsaktivi- sinkinase IGF1R (Insulin-like growth factor 1 receptor), welche mit einem RD-Faktor von -58,8 am stärksten verändert ist, und für PRKCA (Protein kinase C, alpha) mit -34,5 festzustellen. Desweiteren ist das mit Karzi- 0,0 Relative Abweichung (RD) täten für die KIT-verwandte Rezeptortyro- -10,0 -20,0 -18,2 -30,0 -40,0 -34,5 -50,0 -60,0 -70,0 -58,8 nomen der Mamma assoziierte Gen BRCA2 (Breast cancer 2, early onset) um den Faktor -18,2 erniedrigt. Abb. 11: Gene mit verminderter Transkription im Tumorgewebe (Ergebnis der qRT-PCR im Vergleich mit Normalgewebe) IGF1R = Insulin-like growth factor 1 receptor PRKCA = Protein kinase C, alpha BRCA2 = Breast cancer 2, early onset 33 Ergebnisse 3.2.2. Vergleichende Analyse zweier Tumorrezidive im Verlauf Nachdem der Nachweis veränderter Transkriptionsmuster im Vergleich von Tumor- und Normalgewebe erfolgreich war, folgt im nächsten Experiment die Betrachtung von zwei Rezidivtumoren eines Patienten, welche mit einem zeitlichen Intervall von 4 Jahren auftraten. Da beide Gewebeproben vom selben Patienten stammen, bietet sich die Möglichkeit, unter Ausschluss interindividueller Differenzen, die Transkriptionsveränderungen im Rahmen der Tumorprogression über einen vierjährigen Zeitraum zu untersuchen. Unter Beachtung der Ergebnisse der Untersuchung von Tumor- und Normalgewebe wird ein neues Set von Testgenen ausgewählt (Gen-Set 2), um spezifischer auf die im Vorversuch auffälligen Systeme und die bekannten GIST-assoziierten Signalwege einzugehen. Zum Einen werden weitere Cyclin-assoziierte Gene untersucht, um das Cyclin-CDK-System umfassend analysieren zu können. Außerdem werden Gene des MAPK-Signalwegs ergänzt, für den eine wichtige Rolle in der Pathogenese von GIST angenommen wird. Tab. 5: Klinische und pathologische Daten des untersuchten Patienten und Tumors Malignitätsrisiko Mitoserate Größe Primärlokalisation Rezidiv 89/>100 11/3 Gaster Zelltyp gemischtzellig 67/71 Alle bei dieser Untersuchung auffälligen Verän- Gene, welche im zweiten Rezidiv vermehrt exprimiert werden. Erneut fällt eine starke Erhöhung bei CDKN2A auf, welche die Werte des vorangehenden Versuchs noch übersteigt, und einen RD-Wert von 77,3 erreicht. Die Transkription 100,0 Relative Abweichung (RD) derungen der Transkriptionsaktivität betreffen Alter Geschlecht männlich 77,3 39,8 13,1 10,0 6,6 5,2 1,0 von MEF2C (Myocyte enhancer factor 2C) ist auf das 39,8-fache und CDKN2B (Cyclin-dependent kinase inhibitor 2B) auf das 13,1-fache gesteigert. Im Bereich unter einem RD von ±10 folgen die Gene CDK6 (Cyclin-dependent kinase 6) und MAP3K1 (Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1) mit den relativen Abweichungs- Abb. 12: Mit fortschreitender Progression veränderte Gene (Ergebnis der qRT-PCR zweier Rezidive im Vergleich): CDKN2A = cyclin-dependent kinase inhibitor 2A MEF2C = myocyte enhancer factor 2C CDKN2B = cyclin-dependent kinase inhibitor 2B CDK6 = cyclin-dependent kinase 6 MAP3K1 = mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1 faktoren 6,6 und 5,2. 34 Ergebnisse 3.2.3. Vergleichende Analyse von Tumoren unterschiedlichen Gradings Im abschließenden qRT-PCR-Versuch wird ein Stellvertreterkollektiv von zwölf Tumoren verschiedener Patienten mit unterschiedlichem Grading untersucht. Entsprechend dem Malignitätsrisiko nach Fletcher et al. (siehe Tab. 6) werden drei Versuchsgruppen (Niedrig, Mittel und Hoch) mit je drei Gewebeproben gebildet [36]. Zusätzlich wird eine Gruppe mit Proben von Rezidivtumoren ergänzt, unter der Annahme, dass diese in der Onkogenese am weitesten fortgeschritten sind und daher die ausgeprägtesten Transkriptionsveränderungen aufweisen sollten. Die Auswahl der einzelnen Patienten erfolgt auf der Basis der vorangegangenen histologischen Beurteilung. Bei diesem Versuch wird die bereits im Vorversuch verwendete Zusammenstellung Cyclin-CDK- und MAP-Kinase-assoziierter Gene untersucht (Gen-Set 2). Tab. 6: Klinische und pathologische Daten der untersuchten Patienten und der Tumoren Malignitätsrisiko Mitoserate Größe Primärlokalisation Zelltyp Alter Geschlecht Niedrig (Referenz) Niedrig Niedrig 0 1 1 2,8 4,4 4,7 Jejunum Duodenum Gaster spindelzellig gemischtzellig spindelzellig 76 62 55 männlich weiblich weiblich Mittel Mittel Mittel 2 2 4 7,5 7,5 5,5 Gaster Gaster Gaster spindelzellig spindelzellig spindelzellig 62 62 69 männlich männlich männlich Hoch Hoch Hoch 10 10 11 6,5 20 4,8 Ileum Gaster Jejunum spindelzellig spindelzellig gemischtzellig 63 68 64 weiblich männlich weiblich Rezidiv Rezidiv Rezidiv 47 89 >100 9,5 11 3 Jejunum Gaster Gaster spindelzellig gemischtzellig gemischtzellig 53 67 71 weiblich männlich männlich Wie in den vorhergehenden Versuchen wird die Menge an mRNA der untersuchten Gene als Abweichungsfaktor (RD) relativ zu einer Referenzprobe bestimmt. Als Referenz wird der Patient mit dem niedrigsten Malignitätsrisiko nach der Fletcher-Klassifikation definiert (1. Zeile der Tabelle 6). Die ausgeprägtesten Auffälligkeiten finden sich bei den verschiedenen Cyclinen und ihren zugehörigen Kinasen. Die folgenden Ergebnisse sind daher bereits nach ihrer funktionellen Zusammengehörigkeit im Cyclin-CDK-System gruppiert, auf welche im Diskussionsteil der Arbeit näher eingegangen wird. 35 Ergebnisse Bei beiden Subtypen der Typ-B Cycline fällt eine sprunghafte Steigerung der Transkriptionsaktivität zwischen den Primärtumoren und den Proben der Rezidivgruppe auf. Im Fall von Cyclin B1 (CCNB1) weisen die Rezidive im Vergleich zur Referenzprobe durchschnittlich die 7,5-fache mRNA-Menge auf, bei Cyclin B2 beläuft sich der Anstieg auf den Faktor 12,8. Die maximale Spanne der Schwankung zwischen den Einzelproben beläuft sich für CCNB1 auf 24,2-fache, für CCNB2 auf 74,0-fache Veränderung. Tab. 7: Ergänzende Berechnungen zur Transkriptionsaktivität der Gene für Cyclin (CCN) B1 und B2 in Abhängigkeit der vier Versuchsgruppen Geometrische Mittel ( ) der RD-Werte der vier Versuchsgruppen ± Standardabweichung, Geometrische Mittel der RD-Werte aller drei Primärtumorgruppen ± Standardabweichung Malignitätsrisiko Mittel Hoch Rezidiv Niedrig Mittel Hoch Rezidiv CCNB2 Niedrig CCNB1 der Gruppe ±SD 1,8 -1,6 2,0 7,5 2,4 1,3 1,6 12,8 ±4,0 ±0,6 ±4,6 ±3,6 ±6,0 ±3,8 ±14,2 ±1,3 Primärtumoren ±SD 1,3 1,7 ±3,7 ±8,3 RD RD 12,0 CCNB2 20,0 10,0 17,5 8,0 15,0 12,5 6,0 10,0 4,0 7,5 2,0 5,0 2,5 ±1,0 Versuchsgruppe iv z id Re ch Ho i tt el M ed -5,0 Ni iv ch z id Re Ho i tt el M Ni ed r ig -3,0 r ig -2,5 Versuchsgruppe Abb. 13: Box & Whiskers-Plots der relativen Transkriptionsaktivität der Gene Cyclin (CCN) B1 und B2: Auf der X-Achse aufgeschlüsselt nach den vier Versuchsgruppen Auf der Y-Achse ist der relative Abweichungsfaktor gegenüber der Referenzprobe (Wert 1,0) dargestellt (RD-Wert). 36 Ergebnisse Auch für die Gene der Cycline A2 und E1 (CCNA2 und CCNE1) weisen die Tumoren der Rezidivgruppe die höchste Transkriptionsrate auf, wobei die mittlere Zunahme der Transkriptionsaktivität bei Cyclin A2 mit einem Faktor von 11,1 ausgeprägter ist als bei Cyclin E1 (Faktor 3,0). Außerdem zeigt sich bei der Betrachtung von Cyclin E1 im Bereich der Primärtumoren mit zunehmendem Malignitätsrisiko eine leichte Abnahme der Transkriptionsrate. Beide Cycline interagieren mit der Cyclin-dependent kinase 2 (CDK2), die ebenfalls dargestellt ist. Die CDK2-Transkription verhält sich über alle Gruppen hinweg sehr stabil, mit steigendem Malignitätsrisiko finden sich einzelne leicht erhöhte Werte. Tab. 8: Ergänzende Berechnungen zur Transkriptionsaktivität der Gene für Cyclin (CCN) A2, E1 und Cyclindependent-kinase 2 (CDK2) in Abhängigkeit der vier Versuchsgruppen Geometrische Mittel ( ) der RD-Werte der vier Versuchsgruppen ± Standardabweichung, Geometrische Mittel der RD-Werte aller drei Primärtumorgruppen ± Standardabweichung Malignitätsrisiko Hoch Rezidiv Niedrig Mittel Hoch Rezidiv Niedrig Mittel Hoch Rezidiv CDK2 Mittel CCNE1 Niedrig CCNA2 der Gruppe ±SD 2,8 1,1 3,2 11,1 1,7 -1,1 -1,2 3,0 1,1 -1,2 1,3 1,5 ±6,2 ±1,5 ±9,7 ±6,5 ±0,9 ±2,6 ±3,6 ±0,4 ±1,4 ±1,4 ±2,1 ±2,1 Primärtumoren ±SD 2,2 1,1 1,1 ±6,5 ±2,5 ±1,5 RD CCNA2 RD CCNE1 RD 3,5 18,0 16,0 2,5 14,0 12,0 1,5 10,0 8,0 -1,5 6,0 4,0 -2,5 Re iv Versuchsgruppe iv z id z id ch Re Ho ch el itt Ho M i tt el r ig M ed ed iv ch z id Re Ho i tt el M r ig ed Ni Versuchsgruppe Ni Ni -3,5 -2,0 r ig 2,0 Versuchsgruppe Abb. 14: Box & Whiskers-Plots der relativen Transkriptionsaktivität der Gene Cyclin (CCN) A2, E1 und Cyclindependent-kinase 2 (CDK2): Auf der X-Achse aufgeschlüsselt nach den vier Versuchsgruppen Auf der Y-Achse ist der relative Abweichungsfaktor gegenüber der Referenzprobe (Wert 1,0) dargestellt (RD-Wert). 37 Ergebnisse Eine vergleichbar prominente Position der Rezidivgruppe wie bei den bereits dargestellten Genen findet sich bei den Typ-D Cyclinen nicht. CCND2 und -D3 zeigen nur geringe Abweichungen von der Referenzprobe und verhalten sich unspezifisch. Lediglich Cyclin D1 (CCND1) weist deutliche Schwankungen auf. Obwohl sich auch hier aufgrund der starken Streuung keine Versuchsgruppe komplett abgrenzt, finden sich in allen Gruppen einzelne Proben, bei denen eine auffällige Reduktion der Transkriptionsrate vorliegt. Das Ausmaß dieser Veränderung nimmt mit steigendem Malignitätsrisiko tendenziell zu und erreicht in der Gruppe der Rezidivtumoren den Faktor -125,0. Tab. 9: Ergänzende Berechnungen zur Transkriptionsaktivität der Gene für Cyclin (CCN) D1, D2 und D3 in Abhängigkeit der vier Versuchsgruppen Geometrische Mittel ( ) der RD-Werte der vier Versuchsgruppen ± Standardabweichung, Geometrische Mittel der RD-Werte aller drei Primärtumorgruppen ± Standardabweichung Hoch Rezidiv Niedrig Mittel Hoch Rezidiv Niedrig Mittel Hoch Rezidiv der Gruppe ±SD CCND3 Mittel Malignitätsrisiko CCND2 Niedrig CCND1 -2,7 -15,0 -19,5 -11,3 1,3 2,5 2,0 -1,1 -1,8 -1,6 -1,1 -2,1 ±12,4 ±52,1 ±35,2 ±70,1 ±0,4 ±3,0 ±0,2 ±3,9 ±2,5 ±0,6 ±1,6 ±1,6 Primärtumoren ±SD -9,2 1,8 -1,4 ±35,6 ±1,6 ±1,8 RD RD RD 1,5 CCND3 ±1,0 -1,5 -2,0 -2,5 -3,0 -3,5 Ni e ig dr M el itt c Ho h Re z id iv Versuchsgruppe Ni e ig dr M el itt -4,0 c Ho h Re z id iv Versuchsgruppe Ni ed r ig M el itt Ho ch Re z id iv Versuchsgruppe Abb. 15: Box & Whiskers-Plots der relativen Transkriptionsaktivität der Gene Cyclin (CCN) D1, D2 und D3: Auf der X-Achse aufgeschlüsselt nach den vier Versuchsgruppen Auf der Y-Achse ist der relative Abweichungsfaktor gegenüber der Referenzprobe (Wert 1,0) dargestellt (RD-Wert). 38 Ergebnisse Ähnlich unspezifisch wie bei den D-Cyclinen verhält es sich mit der zugehörigen Kinase CDK4. Sie wird über alle Gruppen hinweg sehr konstant transkribiert und zeigt keine klare Richtungstendenz, ein einzelner Ausreißer in der Gruppe mit mittlerem Malignitätsrisiko fällt auf, es findet sich jedoch auch hier nur eine Verminderung um den Faktor -3,6. Indessen weist die Rezidivgruppe bei der Untersuchung von CDK6 deutlich reduzierte Werte auf. Im Mittel wird hier weniger als ein Zehntel der in der Referenzprobe gefundenen mRNA-Menge nachgewiesen. Im Vergleich mit allen Primärtumoren ist die Menge immer noch um den Faktor -7,1 verringert. Tab. 10: Ergänzende Berechnungen zur Transkriptionsaktivität der Gene Cyclin-dependent-kinase (CDK) 4 und 6 in Abhängigkeit der vier Versuchsgruppen Geometrische Mittel ( ) der RD-Werte der vier Versuchsgruppen ± Standardabweichung, Geometrische Mittel der RD-Werte aller drei Primärtumorgruppen ± Standardabweichung Malignitätsrisiko Mittel Hoch Rezidiv Niedrig Mittel Hoch Rezidiv CDK6 Niedrig CDK4 der Gruppe ±SD -1,3 -1,8 -1,0 -1,2 -2,1 -1,2 -2,3 -12,5 ±1,5 ±2,4 ±1,6 ±1,6 ±4,2 ±2,5 ±4,1 ±13,0 Primärtumoren ±SD -1,4 -1,8 ±1,7 ±3,4 RD RD CDK6 ±1,0 -5,0 -10,0 -15,0 -20,0 -25,0 -30,0 Ni ed r ig M el itt Ho ch Re zi v di Versuchsgruppe Ni ed r ig M el itt Ho ch Re z id iv Versuchsgruppe Abb. 16: Box & Whiskers-Plots der relativen Transkriptionsaktivität der Gene Cyclin-dependent-kinase (CDK) 4 und 6: Auf der X-Achse aufgeschlüsselt nach den vier Versuchsgruppen Auf der Y-Achse ist der relative Abweichungsfaktor gegenüber der Referenzprobe (Wert 1,0) dargestellt (RD-Wert). 39 Ergebnisse Die CDK-Inhibitoren der Familie 1 geben insgesamt ein gemischtes Bild ab. Der Vertreter A bewegt sich in den meisten Proben innerhalb einer relativen Abweichung um den Faktor ±3, lediglich einzelne Patienten der Hochrisiko- und Rezidivgruppe weisen deutlichere Erhöhungen auf (bis Faktor 5,2). CDKN1B zeigt, mit einer schwachen Abwärtstendenz, die stabilsten Werte, deren Spanne zwischen größtem und kleinstem Wert lediglich den Faktor 4,5 erreicht. Auch das letzte Mitglied dieser Inhibitorengruppe zeigt zunächst einen Abwärtstrend im Bereich der Primärtumoren. Die Gruppe der Rezidivtumoren liegt jedoch, trotz einer einzelnen deutlich erniedrigten Probe (Faktor -16,3), im Mittelwert etwa auf dem Niveau der Gruppe mittleren Malignitätsrisikos, so dass dieser Trend unterbrochen wird. Tab. 11: Ergänzende Berechnungen zur Transkriptionsaktivität der Gene Cyclin-dependent-kinase-inhibitor (CDKN) 1A, 1B und 1C in Abhängigkeit der vier Versuchsgruppen Geometrische Mittel ( ) der RD-Werte der vier Versuchsgruppen ± Standardabweichung, Geometrische Mittel der RD-Werte aller drei Primärtumorgruppen ± Standardabweichung Hoch Rezidiv Niedrig Mittel Hoch Rezidiv Niedrig Mittel Hoch Rezidiv der Gruppe ±SD CDKN1C Mittel Malignitätsrisiko CDKN1B Niedrig CDKN1A -1,2 2,0 2,4 2,1 -1,2 -1,6 -1,5 -2,0 1,3 -1,4 -2,7 -1,5 ±2,3 ±0,8 ±1,7 ±2,2 ±1,4 ±1,9 ±0,2 ±1,5 ±2,1 ±1,7 ±1,9 ±10,7 Primärtumoren ±SD 1,6 -1,4 -1,4 ±1,9 ±1,3 ±2,4 RD CDKN1A RD RD CDKN1C 3,0 5,0 2,0 4,0 ±1,0 3,0 -2,0 -3,0 2,0 -4,0 ±1,0 -5,0 -2,0 -9,1 Versuchsgruppe Versuchsgruppe Re zid iv Ho ch itt el M rig -16,4 Ni ed iv Re zid iv Re z id Ho ch h itt el M c Ho rig e el itt M Ni ig dr Ni ed -3,0 Versuchsgruppe Abb. 17: Box & Whiskers-Plots der relativen Transkriptionsaktivität der Gene Cyclin-dependent-kinase-inhibitor (CDKN) 1A, 1B und 1C: Auf der X-Achse aufgeschlüsselt nach den vier Versuchsgruppen Auf der Y-Achse ist der relative Abweichungsfaktor gegenüber der Referenzprobe (Wert 1,0) dargestellt (RD-Wert). 40 Ergebnisse Auch aus der zweiten Familie von CDK-Inhibitoren werden vier verschiedene Vertreter untersucht. CDKN2A und -B weisen eine sehr ähnliche Verteilung auf, mit den niedrigsten mRNA-Mengen in der Rezidivgruppe. Sowohl in dieser, als auch in der Mittleren Risikogruppe werden bei einzelnen Proben sehr stark verminderte Transkriptionsaktivitäten nachgewiesen. Ein Rezidivtumor erreicht bei der Untersuchung von CDKN2A mit einer Transkriptionsabnahme um den Faktor -1 275,0 die stärkste im Rahmen dieser Arbeit gemessene Veränderung. Interessanterweise schwankt die mRNA-Menge in der Hochrisikogruppe bei beiden Genen wesentlich weniger. Tab. 12: Ergänzende Berechnungen zur Transkriptionsaktivität der Gene Cyclin-dependent-kinase-inhibitor (CDKN) 2A und 2B in Abhängigkeit der vier Versuchsgruppen Geometrische Mittel ( ) der RD-Werte der vier Versuchsgruppen ± Standardabweichung, Geometrische Mittel der RD-Werte aller drei Primärtumorgruppen ± Standardabweichung Hoch Rezidiv Niedrig Mittel Hoch Rezidiv der Gruppe ±SD Mittel Malignitätsrisiko CDKN2B Niedrig CDKN2A -4,7 -41,8 -4,8 -60,9 -3,1 -4,8 -1,6 -9,9 ±13,7 ±182,7 ±1,5 ±728,3 Primärtumoren ±SD RD ±7,1 ±6,3 ±0,2 ±31,6 -9,8 -2,9 ±108,3 ±5,2 CDKN2A ±1,0 RD CDKN2B ±1,0 -50,0 -5,0 -100,0 -150,0 -200,0 -10,0 -250,0 -300,0 -15,0 -350,0 -27,0 -628,9 -1275,2 N d ie r ig M itt el Ho ch R id ez iv Versuchsgruppe -58,8 Ni ed r ig M el itt Ho ch Re z id iv Versuchsgruppe Abb. 18: Box & Whiskers-Plots der relativen Transkriptionsaktivität der Gene Cyclin-dependent-kinase-inhibitor (CDKN) 2A und 2B: Auf der X-Achse aufgeschlüsselt nach den vier Versuchsgruppen Auf der Y-Achse ist der relative Abweichungsfaktor gegenüber der Referenzprobe (Wert 1,0) dargestellt (RD-Wert). 41 Ergebnisse Die Verteilung von CDKN2C und -D zeigt erneut Ähnlichkeiten. Im Gegensatz zu den ersten beiden Vertretern der Familie findet sich jedoch bei beiden Genen mit steigendem Malignitätsrisiko auch ein Transkriptionsanstieg, welcher allerdings eher diskret ausfällt. Bei CDKN2D ist die Streuung innerhalb der einzelnen Gruppen größer, als die Differenzen zwischen ihnen. CDKN2C weist eine weniger starke Streuung in den Gruppen auf und erreicht von den Niedrigrisikotumoren zu den Rezidiven im Mittel einen Anstieg um den Faktor 5,3. Tab. 13: Ergänzende Berechnungen zur Transkriptionsaktivität der Gene Cyclin-dependent-kinase-inhibitor (CDKN) 2C und 2D in Abhängigkeit der vier Versuchsgruppen Geometrische Mittel ( ) der RD-Werte der vier Versuchsgruppen ± Standardabweichung, Geometrische Mittel der RD-Werte aller drei Primärtumorgruppen ± Standardabweichung Hoch Rezidiv Niedrig Mittel Hoch Rezidiv der Gruppe ±SD Mittel Malignitätsrisiko CDKN2D Niedrig CDKN2C -1,5 -1,3 2,0 3,4 1,5 -1,0 2,6 3,4 ±2,2 ±7,0 ±5,1 ±1,7 ±3,1 ±5,9 ±2,8 ±2,3 Primärtumoren ±SD -1,0 1,6 ±4,9 ±3,8 RD RD CDKN2D 7,0 5,0 3,0 ±1,0 -3,0 Versuchsgruppe -5,0 Re zid iv iv Ho ch Re z id itt el h M M c Ho rig e el itt Ni ed Ni ig dr Versuchsgruppe Abb. 19: Box & Whiskers-Plots der relativen Transkriptionsaktivität der Gene Cyclin-dependent-kinase-inhibitor (CDKN) 2C und 2D: Auf der X-Achse aufgeschlüsselt nach den vier Versuchsgruppen Auf der Y-Achse ist der relative Abweichungsfaktor gegenüber der Referenzprobe (Wert 1,0) dargestellt (RD-Wert). 42 Ergebnisse 3.3. Immunhistochemie – Analysen der Proteinexpression Ebenso wie die Transkription, wird auch die Translation durch Kontroll- und Steuerungsmechanismen wie beispielsweise die auch für GIST relevante PI3K-AKT-Signalkaskade genau reguliert. Deshalb ist eine zusätzliche Verifikation der Daten, welche durch die PCR-Versuche gewonnen wurden, auf Proteinebene sinnvoll. Als Methode bietet sich hierfür die Immunhistochemie an, die zusätzlich eine Erweiterung des Kollektivs auf eine statistisch aussagekräftige Größe ermöglicht. Als Gegenstand der Untersuchung wird Cyclin H ausgewählt, welches als Untereinheit der CAK (CDK-activating kinase) eine zentrale Rolle bei der Regulation des Cyclin-CDK-Systems und folglich des Zellzyklus innehat. Darüber hinaus wurde bei der genetischen Untersuchung von Tumor- und Normalgewebe eine Steigerung der Transkriptionsaktivität dieses Gens um den Faktor 10,2 im Tumor festgestellt. Die Untersuchungen werden an einem neuen Kollektiv Sehr Niedrig 15,5% n=14 von 92 Tumorproben durchgeführt. Die Verteilung der Tumoren auf die Risikogruppen nach Fletcher et al. ist in Abbildung 20 dargestellt [36]. Das Erkrankungsalter liegt im Median bei 66,48 Jahren (Mittel 64,36 Jahre), die Geschlechterverteilung ist mit Niedrig 22,2% n=20 Hoch 41,1% n=37 Mittel 21,1% n=19 45,65 % (n = 42) männlichen und 54,35 % (n = 50) weiblichen Patienten etwa ausgeglichen. 60,87 % (n = 56) der Tumoren entstammen dem Magen und 30,43 % (n = 28) dem Dünndarm. In den übrigen 8,70 % (n = 8) be- Abb. 20: Aufschlüsselung des für die immunhistochemische Untersuchung verwendeten Tumorkollektivs (n = 92) nach der Klassifizierung von Fletcher et al. [36] fand sich der Primärtumor an anderen intestinalen oder extraintestinalen Lokalisationen. Die Größe der Tumoren variiert zwischen 0,4 und 30,0 Zentimeter (Median 5,00 cm; Mittel 7,36 cm), während die Mitoserate auf 50 HPF von 0 bis 116 Mitosen reicht (Median 4; Mittel 10,74). Die mediane Followup-Dauer der überlebenden Patienten beträgt 5,4 Jahre (Mittel 6,33; Spannweite 2,28 bis 20,20 Jahre), die des gesamten Kollektivs 4,86 Jahre (Mittel 5,11; Spannweite 0,00 bis 20,20 Jahre). Der Anteil der Patienten mit metastatischer Ausstreuung stieg im Laufe der Nachbeobachtung von 15,22 % (n = 14) mit primär metastasierten Tumoren auf 29,35 % (n = 27). 17,39 % (n = 16) der Patienten verstarben tumorbedingt (tumorspezifischer Exitus letalis, TSE). Die tumorspezifische 1-, 3-, und 543 Ergebnisse Jahres Überlebenswahrscheinlichkeit (TSÜ) des Gesamtkollektives beträgt 95,5 %, 87,2 % und 82,8 % und das tumorfreie-Überleben (TFÜ) 79,2 %, 75,6 % und 71,3 %. Das unspezifische Gesamt-Überleben beträgt 67,39 % (n = 62). Die in Paraffin eingebetteten Gewebe werden geschnitten, rehydriert und mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes Cyclin H und einem peroxidasebasierten Sekundärantikörper-System immunhistochemisch gefärbt (Abbildung 21). Abb. 21: Ausschnitte verschiedener Präparate nach immunhistochemischer Cyclin H-Färbung. Die Teilbilder B bis E zeigen Beispiele aus den vier, durch den unterschiedlich hohen Anteil Cyclin H-positiver Zellen definierten, Gruppen: A = Negativ B = ≥ 10 - < 25 % positive Zellen C = ≥ 25 - < 50 % positive Zellen D =≥ 50 - < 75 % positive Zellen E = ≥ 75 % positive Zellen 44 Ergebnisse Die Auswertung ergibt folgende Verteilung: 79,3 % der Präparate (n = 73) zeigen weniger als 10 % Cyclin H-positive Zellkerne und werden als negativ gewertet. Bei 20,7 % der Tumoren (n = 19) wird dieser cut-off überschritten. 5,4 % (n = 5) weisen ≥ 10 - < 25 % reaktive Kerne auf, die zweite Gruppe enthält 7,6 % (n = 7) der Tumoren mit ≥ 25 - < 50 % positiven Kernen, weitere 5,4 % (n = 5) mit ≥ 50 - < 75 % bilden die Gruppe drei und 2,2 % (n = 2) der Tumoren, bei denen sich ≥ 75 % der Kerne positiv darstellen, werden der Gruppe vier zugeordnet. Die Ergebnisse sind in Abb. 22 grafisch dargestellt. ≥ 75 % 2,2%; n=2 ≥ 50 - < 75 % 5,4%; n=5 Negativ (<10%) 79,3%; n=73 Positiv (≥10%) 20,7%; n=19 ≥ 25 - < 50 % 7,6%; n=7 ≥ 10 - < 25 % 5,4%; n=5 Anteil Cyclin H-positiver Zellkerne: ≥ 75 % ≥ 50 - < 75 % ≥ 25 - < 50 % ≥ 10 - < 25 % < 10 % In der Gruppe mit sehr-niedrigem Malignitätsrisiko nach Fletcher et al. zeigt sich im Vergleich mit dem Rest-Kollektiv ein um den Faktor 3 bis 4 geringerer Anteil positiv reagierender Tumoren (Abb. 23). Die statistische Prüfung bezüglich der Unabhängigkeit von Cyclin H-Status und der Malignitätsrisikogruppe (Sehr-niedrig gegenüber Nicht-Sehr-niedrig) erreicht jedoch nicht das Signifikanzniveau (exakter Test nach Fisher: p = 0,285; OR = 1,053 [0,377; 2,940]). Quotenverhältnis: Anteil Cyclin H positiver Tumoren in Prozent Abb. 22: Ergebnis der immunhistochemischen Färbung von Cyclin H. Die rechte Teilgrafik zeigt eine Aufschlüsselung der positiven Tumoren (cut-off bei ≥ 10 %) nach dem Anteil Cyclin H positiver Zellkerne 35 30,0 n=6 30 21,1 21,6 n=4 n=8 25 20 15 10 7,1 n=1 5 0 Malignitätsrisikogruppe nach Fletcher et al. Abb. 23: Prozentualer Anteil Cyclin H positiver Tumoren aufgeschlüsselt nach der Klassifikation von Fletcher et al. [36] 45 Ergebnisse Während sich auch im tumorfreien Überleben (TFÜ) nur geringe Differenzen zeigen (χ²-Test: p = 0,811; Quotenverhältnis: OR = 1,138 [0,407; 3,177]), gibt die jeweils um ein Zehntel geringere tumorspezifische 1-, 3- und 5-Jahres Überlebenswahrscheinlichkeit (TSÜ) der Patienten mit Cyclin H-positiven Tumoren einen deutlichen Hinweis auf eine Assoziation von Cyclin H mit erhöhter Malignität (Tab. 14). Aktuell sind in der Gruppe der Cyclin H-positiven Tumorpatienten 26,3 % (n = 5) tumorbedingt verstorben (TSE), wohingegen nur 15,1 % (n = 11) der Cyclin H-negativen Patienten verstorben sind (χ²-Test: p = 0,249; Quotenverhältnis: OR = 2,913 [0,603; 6,722]). Bei der Klassifikation nach Fletcher et al. hat die dichotome Aufteilung in Hochrisiko- und Nicht-Hochrisikotumoren die größte Relevanz für die Einschätzung der Prognose, da sich nahezu alle tumorbedingt versterbenden Patienten aus der Hochrisikogruppe rekrutieren (Tab. 14). Im untersuchten Kollektiv ist bisher nur ein einzelner Patient außerhalb der Hochrisikogruppe (n = 55) tumorbedingt verstorben. Demgegenüber stehen 15 tumorbedingte Todesfälle in der Hochrisikogruppe (n = 37). Die gezielte Betrachtung des Subkollektivs mit hohem Malignitätsrisiko zeigt ein deutlich schlechteres Outcome der Patienten mit Cyclin H-positiven Tumoren. Die Werte sind in Tabelle 14 aufgeführt, die Berechnung des exakten Tests nach Fisher und des Quotenverhältnisses für den Zusammenhang von Cyclin H-Status und tumorbedingtem Tod ergeben p = 0,228, OR = 3,167 [0,625; 16,054]. Tab. 14: Tumorspezifische (TSÜ) und tumorfreie (TFÜ) Überlebenswahrscheinlichkeit nach 1, 3 und 5 Jahren Aufgeschlüsselt nach: Malignitätsrisikogruppen (Hoch vs. Nicht Hoch), Cyclin H-Positivität (Positiv vs. Negativ), Cyclin H-Positivität im Subkollektiv der Hochrisikotumoren (Positiv vs. Negativ) und nach der Kombination aus hohem Malignitätsrisiko und Cyclin-H Positivität (Cyclin H positive Hochrisikotumoren vs. gesamter Rest). 1-Jahres TSÜ (%) 3-Jahres TSÜ (%) 5-Jahres TSÜ (%) 1-Jahres TFÜ (%) 3-Jahres TFÜ (%) 5-Jahres TFÜ (%) Malignitätsrisiko Hoch 89,0 71,9 61,9 50,8 42,3 36,3 Nicht-Hoch 100 97,8 97,8 98,1 98,1 98,1 Cyclin H-Status Positiv 89,5 78,9 71, 8 78,9 68,4 68,4 Negativ 97,2 89,5 85,7 79,2 77,7 72,3 Cyclin H-Status (nur Tumoren der hohen Malignitätsrisikogruppe) Positiv 75,0 50,0 33,3 50,0 25,0 25,0 Negativ 89,5 78,2 69,8 51,0 47,3 39,4 Kombination von hohem Malignitätsrisiko & positivem Cyclin H-Status gegenüber Rest Hoch & Positiv 75,0 50,0 33,3 50,0 25,0 25,0 Rest 97,6 91,0 87,7 82,0 80,7 75,9 46 Ergebnisse Tab. 15: Statistische Signifikanztests zum prädiktiven Wert von Cyclin H Überprüfung der Signifikanz der in Tab. 14 dargestellten Differenzen in der tumorspezifischen (TSÜ) und tumorfreien (TFÜ) Überlebenswahrscheinlichkeit, sowie der Unabhängigkeit zwischen den verschiedenen Subkollektiven und tumorspezifischem Exitus letalis (TSE), sowie dem Auftreten von Rezidiven oder Metastasen (Rez/Met) TSE Malignitätsrisiko (MR) Hoch vs. Nicht-Hoch Cyclin H Positiv vs. Negativ Cyclin H (im Kollektiv der Hochrisikotumoren) Positiv vs. Negativ Malignitätsrisiko & Cyclin H-Status Cyclin H-positiv & MR Hoch vs. Rest TFÜ Rez/Met Anzahl Log-Rang Log-Rang χ2 / Fisher Exakt n= <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 90 0,249 0,208 0,837 0,811 92 0,228 0,032 0,511 0,685 37 0,004 <0,001 0,001 0,005 90 χ2 / Fisher Exakt TSÜ Zur Beurteilung der unterschiedlichen zeitlichen Verläufe der beiden HochrisikoSubkollektive wird ein Log-Rang-Test mitgeführt, welcher im Bezug auf das tumorspezifische Überleben einen signifikanten Wert von p = 0,032 erbringt (Tab. 15). D.h. die Patienten der Hochrisikogruppe mit einem Anteil von ≥ 10 % Cyclin H-positiven Tumorzellen versterben signifikant früher, als die Patienten mit Cyclin H-negativen Hochrisikotumoren. Abbildung 24 zeigt die tumorspezifische Überlebenszeitanalyse der Patienten mit Cyc- Tumorspezifisches Überleben lin H-positiven und -negativen Hochrisikotumoren als Kaplan-Meier Diagramm. 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 2 Ausfälle 4 6 Cyclin H positiv 8 10 Cyclin H negativ 12 14 Überlebenszeit in Jahren Abb. 24: Kaplan-Meier Diagramm der tumorspezifischen Überlebenswahrscheinlichkeit der Cyclin H positiven und negativen Tumoren mit hohem Malignitätsrisiko nach Fletcher et al. [36]. Die X-Achse stellt den zeitlichen Verlauf über 15 Jahre dar. Auf der Y-Achse ist der Anteil der tumorspezifisch überlebenden Patienten aufgetragen. 47 Ergebnisse Kombiniert man die Kriterien der Klassifikation nach Fletcher et al. mit dem Cyclin H-Status und stellt die Cyclin H-positiven Tumoren der Hochrisikogruppe der Gesamtheit der übrigen Tumoren gegenüber, ergibt sich im Log-Rang-Test ein p-Wert von < 0,001 für das tumorspezifische Überleben und ein p-Wert von 0,001 für das tumorfreie Überleben (Abb. 25, siehe auch Tabellen 14 und 15 auf den vorhergehenden Seiten). Zusammengefasst heisst das: Die Cyclin H-positiven Hochrisiko-GIST-Patienten des Versuchskollektivs zeigen sowohl im Vergleich mit allen Übrigen (p < 0,001, TSÜ), als auch gegenüber den Patienten mit Cyclin H-negativen Hochrisikotumoren (p = 0,032, TSÜ) ein 1,2 Tumorfreies Überleben Tumorspezifisches Überleben signifikat ungünstigeres Outcome. 1 0,8 0,6 0,4 0,2 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0 5 10 15 Ausfälle Überlebenszeit Restliche Tumoren in Jahren MR Hoch & Cyclin H positiv 0 5 Ausfälle Restliche Tumoren MR Hoch & Cyclin H positiv 10 15 Überlebenszeit in Jahren Abb. 25: Kaplan-Meier Diagramme der tumorspezifischen- und der tumorfreien Überlebenswahrscheinlichkeit der Cyclin H positiven Tumoren mit hohem Malignitätsrisiko (MR Hoch) gegenüber den übrigen Tumoren. Die X-Achse stellt den zeitlichen Verlauf über 15 Jahre dar. Auf der Y-Achse ist der Anteil der überlebenden Patienten aufgetragen. Weitere statistische Tests zur Prüfung der Unabhängigkeit von Cyclin H-Status und der Lokalisation (p = 0,208), dem Geschlecht (p = 0,493), sowie den immunhistochemischen Markern CD34 (p = 0,444), Smooth muscle actin (p = 0,712), Desmin (p = 0,558) und Ki-67 (p = 0,607) liefern keine signifikanten Ergebnisse. 48 Diskussion 4. Diskussion Die Einschätzung des Malignitätsrisikos von Gastrointestinalen Stromatumoren stützt sich – in Ermangelung zuverlässiger genetischer oder immunhistochemischer Marker – noch immer auf Tumorgröße und Mitoserate [36]. Die Klassifikation nach Fletcher et al. differenziert die Tumoren in vier Risikostufen (sehr niedriges, niedriges, mittleres und hohes Malignitätsrisiko). Größte praktische Relevanz hat die Unterscheidung zwischen Hochrisiko- und Nicht-Hochrisikotumoren, die eine signifikante Prädiktion des Auftretens von Rezidiven oder Metastasen ermöglicht (85 - 97 % der betroffenen Patienten gehören der Hochrisikogruppe an) [36]. Insbesondere die Verfügbarkeit adjuvanter Therapieoptionen hat daher eine Diskussion über die Indikation einer generellen TyrosinkinaseinhibitorTherapie von Hochrisikopatienten nach R0-Resektion entfacht (DeMatteo et al. / Hohenberger, Lancet 2009) [22, 54]. Jedoch ist die Gruppe der Hochrisikotumoren in Bezug auf tumorspezifisches und tumorfreies Überleben sehr inhomogen (TSÜ 62 %, TFÜ 36 % nach 5 Jahren im beobachteten Kollektiv; Tab. 14). Hohenberger fordert aufgrund der starken Risiko-Schwankungen von nahezu 0 - 100 % für das Auftreten von Rezidiven oder tumorbedingten Tod bei GIST > 3 cm zusätzliche Prädiktoren für die Indikationsstellung der adjuvanten Therapie [54]. Die Identifikation neuer prognostischer Marker zur weiteren Eingrenzung der Risikopatienten ist außerdem von großer klinischer Relevanz, da mit der Applikation von Tyrosinkinaseinhibitoren Nebenwirkungen, die Entwicklung von Sekundärresistenzen und hohe Behandlungskosten verbunden sind [27, 54, 111]. Das Cyclin-CDK-System ist aufgrund seiner Rolle als zentraler Regulator des Zellzyklus dafür prädestiniert, im Hinblick auf seine mögliche pathogenetische oder prognostische Bedeutung innerhalb der Onkogenese von GIST untersucht zu werden. Darüber hinaus ist es Ansatzpunkt neuer, aktuell in klinischen Studien befindlicher, molekularer Therapieansätze für verschiedene andere Tumorentitäten [25, 57, 61, 71, 107, 115]. Ziel der vorliegenden Arbeit ist daher die Untersuchung zellulärer Regulationssysteme und Signaltransduktionskaskaden in Gastrointestinalen Stromatumoren zur Identifikation von Markern mit prognostischem und potentiell therapeutischem Wert. Zu diesem Zweck erfolgt zuerst ein genetisches Screening durch quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR). In drei aufeinander folgenden Untersuchungen werden die Transkriptionsmuster von 1. dem 49 Diskussion Tumorgewebe eines aggressiven GIST und Normalgewebe desselben Patienten, 2. zwei hochmalignen Rezidiven eines Patienten im Verlauf, sowie 3. einem Stellvertreterkollektiv von zwölf Tumoren unterschiedlichen Gradings (je drei Tumoren der Fletcher-Klassen Niedrig, Mittel und Hoch, sowie drei Rezidivtumoren) vergleichend analysiert. Das für die zweite und dritte qRT-PCR verwendete Set von Testgenen wird entsprechend den Ergebnissen des ersten Versuchs adaptiert. Neben dem Cyclin-CDK-System werden Gene der tumor-assoziierten p53- und MAPK-Kaskade untersucht. Cyclin H wird aufgrund seiner Schlüsselrolle bei der Aktivierung weiterer Cyclin-CDK-Paare und weil in der ersten qRT-PCR eine 10,2-fache Transkriptionssteigerung im Tumorgewebe nachgewiesen wird, für die nachfolgende Untersuchung der Proteinexpression via Immunhistologie ausgewählt. Es erfolgt die immunhistochemische Färbung der Tumorproben von 92 Patienten, wobei die Ergebnisse in Relation zu klinischen Daten sowie zu krankheitsfreiem und krankheitsspezifischem Überleben gesetzt werden. 4.1. Epidemiologie und klinisches Erscheinungsbild des Versuchskollektivs Im immunhistologisch untersuchten Kollektiv von 92 GIST-Patienten findet sich für das Erkrankungsalter eine linksschiefe Verteilung mit einem Median bei 66,48 und einem arithmetischen Mittel bei 64,36 Jahren, was die Daten der Literatur bestätigt [83]. Es findet sich keine signifikante Geschlechtsprädilektion (männlich : weiblich = 42 : 50). Demgegenüber gibt die Literatur Hinweise auf einen höheren Anteil männlicher Patienten und eine Tendenz zu einer höheren Malignitätsrate in diesem Subkollektiv, jedoch ohne statistische Signifikanz [36, 52, 83, 104]. Die Lokalisation des Primärtumors liegt im Versuchskollektiv in 60,87 % im Magen und in 30,43 % im Dünndarm, was den Daten der Literatur entspricht [60, 120]. Das Outcome des hier untersuchten Kollektivs ist mit einer 5-Jahresüberlebenswahrscheinlichkeit bzw. -tumorfreiheit von 82,8 % (TSÜ) bzw. 71,3 % (TFÜ) im Vergleich zu den Literaturdaten mit 68 % (TSÜ) bzw. 38 - 65 % (TFÜ) deutlich günstiger [20, 49, 100]. Dies könnte mit der unterschiedlichen Risikoklassifikationsverteilung zusammenhängen. In einem Kollektiv von Hassan et al. (n = 191) findet sich eine Verteilung auf die Risikoklassen (hoch, mittel, niedrig bzw. sehr-niedrig) von 54 %, 22 %, 18 % bzw. 8 % und damit ein größerer Anteil von Hochrisikopatienten, im Vergleich zu 41,1 %, 21,1 %, 22,2 % bzw. 15,5 % im hier untersuchten Kollektiv [49]. 50 Diskussion Demgegenüber finden sich in einer großen bevölkerungsbezogenen Studie in Schweden für die Prävalenz der verschiedenen Risikoklassen – (hohes, mittleres, niedriges und sehr niedriges Malignitätsrisiko nach Fletcher et al.) – Werte von 18,4 %, 20,1 %, 43,1 % und 18,4 %, wobei hier Obduktionsbefunde mit eingeschlossen sind [90]. 4.2. Prädiktiver Wert der Expression von Cyclin H (CCNH) Neben der mehr als zehnfach gesteigerten Transkriptionsaktivität von Cyclin H in der qRT-PCR, ist vor allem seine besondere Bedeutung innerhalb des Cyclin-CDK-Systems ausschlaggebend für die weitere immunhistochemische Untersuchung an einem statistisch aussagefähigen Kollektiv. Cyclin H übernimmt, gemeinsam mit CDK7, als Bestandteil der Cyclin-dependent kinase activating kinase (CAK) eine Schlüsselrolle bei der aktivierenden Phosphorylierung weiterer Cyclin-CDK Paare. Hierzu gehören beispielsweise der Mitosis-promoting factor (MPF), bestehend aus Cyclin B1/2 und CDK1, sowie die CDKs 1, 2, 4, und 6, welche CDK7 als einzige Cyclin-abhängige Kinase phosphorylieren und somit aktivieren kann [14, 69]. CAK ist darüber hinaus im Transkriptionsfaktor IIH enthalten, der die Expression und vermutlich auch die Phosphorylierung der RNA Polymerase II kontrolliert, was den Einflussbereich von Cyclin H auf die Proteinbiosynthese während der G1- und der G2-Phase erweitert [33, 35, 125, 131]. Diese Doppelrolle legt einen wichtigen Verknüpfungspunkt von ZellzyklusKoordination und Transkriptionskontrolle nahe und prädestiniert Cyclin H für weitere Untersuchungen bezüglich seiner Rolle in der Pathologie von GIST. Bei der immunhistochemischen Analyse der Cyclin H-Expression in 92 Tumorproben findet sich ein signifikant früherer tumorspezifischer Exitus letalis bei Patienten mit Cyclin Hpositiven GIST der Hochrisikogruppe gegenüber den Patienten mit Cyclin H-negativen Tumoren gleichen Malignitätsrisikos (Log-Rang-Test: p = 0,032; Seite 47, Tab. 15). Das ungünstigere Outcome stellt sich auch in der geringeren tumorfreien und tumorspezifischen 5-Jahres-Überlebenswahrscheinlichkeit dar (33,3 % vs. 69,8 % TSÜ; 25,0 % vs. 39,4 % TFÜ; S. 46, Tab. 14). In Anbetracht der beschriebenen Schlüsselrolle bei der Kontrolle des Zellzyklus, würde eine Cyclin H-vermittelte Steigerung der Tumoraktivität als Erklärung für das kürzere Überleben schlüssig sein, sollte jedoch in zukünftigen Untersuchungen weiter überprüft werden. Bisher ist die Rolle des Cyclin-CDK-Systems in der Pathogenese von GIST noch nicht um51 Diskussion fassend erforscht, jedoch wurden gesteigerte Aktivitätsniveaus des Cyclin-CDK-Systems bereits bei verschiedenen anderen Tumorentitäten (Tumoren der Mamma, HCC, Kolorektales Karzinom) beschrieben und die Entwicklung artifizieller CDK-Inhibitoren ist Gegenstand der aktuellen Forschung [25, 57, 61, 71, 107, 115]. Ob sich dadurch auch für GIST ein neuer Zweig alternativer oder kombinierbarer molekularer Therapieansätze eröffnen wird, bleibt künftigen Untersuchungen vorbehalten. Aus den vorliegenden Ergebnissen ergibt sich vorrangig der potentielle prädiktive Wert von Cyclin H. Die vorliegenden Daten stellen die Erstbeschreibung einer prädiktiven Bedeutung von Cyclin H in GIST dar. Die immunhistochemische Untersuchung von Cyclin H könnte eine neue Option zur weiteren Differenzierung von Tumoren der Hochrisikogruppe nach Fletcher et al. durch Abspaltung einer Gruppe von Patienten mit sehr-hohem Malignitätsrisiko sein (very-high risk of malignancy; Log-Rang-Test: p < 0,001 für TSÜ, p = 0,001 für TFÜ; Cyclin H-positive Hochrisiko-GIST vs. alle Übrigen; S. 47, Tab. 15) [36]. Die jüngst neu entbrannte Diskussion um die Indikation zur adjuvanten Therapie von R0-resezierten Hochrisiko-GIST-Patienten verdeutlicht die damit verbundene klinische Relevanz [22, 54]. 4.3. Auffälligkeiten bei weiteren Genen des Cyclin-CDK-Systems Neben der Transkriptionssteigerung von Cyclin H finden sich Auffälligkeiten in der Transkriptionsaktivität verschiedener weiterer Gene des Cyclin-CDK-Systems. Besonders auffällig sind jeweils die Ergebnisse der Rezidivtumorgruppe bei der Untersuchung der zwölf Tumoren des Stellvertreterkollektivs. So zeigen die Gene für die Cycline B1, B2, A2 und E1, sowie für CDK2 Zunahmen der mRNA-Menge im Sinne einer Transkriptionssteigerung im Vergleich von Tumor- zum Normalgewebe oder im Verlauf der Tumorprogression. Dies unterstützt die Annahme einer möglichen Bedeutung des Cyclin-CDK-Systems in der Pathophysiologie von GIST. Ähnlich wie bei Cyclin H findet sich auch bei Cyclin B2 eine 9,6-fache Erhöhung beim Vergleich von Normal- mit Tumorgewebe und die Untersuchung der zwölf Tumoren verschiedener Malignitätsrisikogruppen deutet auf eine Transkriptionssteigerung mit fortschreitender Progression hin. So zeigt sich in der Rezidivgruppe eine im Vergleich zur Referenzprobe um die Faktoren 7,5 und 12,8 gesteigerte Transkriptionsrate von Cyclin B1 und B2 (S. 36, Abb. 13). Diese Veränderungen unterstreichen die Bedeutung der bei Cyclin H gemessenen Transkriptionssteigerung, da sich sowohl Cyclin B1, als auch B2 im Zyto52 Diskussion plasma mit CDK1 zum Mitosis-promoting factor (MPF) verbindet [58, 133]. MPF ist eines der Phosphorylierungssubstrate der CAK [18, 67]. Da die Cyclin B-CDK1 Komplexe an der inaktivierenden Hyperphosphorylierung von Retinoblastoma 1 (Rb, RB1) beteiligt sind, ist diese komplexe Interaktion essentiell für den Übergang der Zelle aus der G2- in die M-Phase des Zellzyklus [18]. Nakamura et al. und Koon et al. beschreiben in ihren Veröffentlichungen eine Korrelation zwischen immunhistologischer Positivität bzw. gesteigerter Transkription von Cyclin B1 und aggressivem Verhalten von GIST [65, 88]. Darüber hinaus finden sich keine weiteren Daten zu Cyclin B1 & B2 im Bezug auf GIST, jedoch wurden Aberrationen in der Expression der B-Cycline, sowie die Bildung von anti-Cyclin B-Antikörpern, in Verbindung mit einer Vielzahl von anderen Tumorentitäten und -zelllinien beschrieben (HCC, Adenokarzinome der Mamma, Plattenepithelkarzinome des Kopf- und Halsbereichs) [25, 31, 62, 133]. Die Cycline A2 und E1 stellen zusammen mit CDK2 eine weitere funktionelle Gruppe des Cyclin-CDK-Systems dar. Bei der Untersuchung des Stellvertreterkollektivs von zwölf Tumoren findet sich bei allen drei Genen eine Steigerung der Transkriptionsaktivität in der Rezidivgruppe, wobei diese bei Cyclin A2 mit dem Faktor 11,1 am stärksten ausgeprägt ist. Bei Cyclin E1 und CDK2 finden sich in dieser Gruppe im Mittel Abweichungen um die Faktoren 3,0 und 1,5 (S. 37, Abb. 14). Eine mögliche Erklärung für die geringen Beträge der bei CDK2 festgestellten Schwankungen könnte die gegenüber den Cyclinen physiologischerweise konstantere Expression der Kinasen sein. Betrachtet man die Funktion der untersuchten Proteine gemeinsam mit den nachgewiesenen Veränderungen, so kann sich das zu dem Bild einer Proliferationssteigerung durch Überaktivierung des Cyclin-CDK-Systems fügen: Cyclin A2 und E1 interagieren mit CDK2 und werden in dieser Kombination als S-phase promoting factor (SPF) bezeichnet, welcher den Übergang von der G1- in die S-Phase kontrolliert. Cyclin A2 kann darüber hinaus auch als Partner von CDK1 agieren und trägt daher zusätzlich zum G2-M-Übergang bei, was eine hohe Proliferationsrate ermöglicht [113]. Passend hierzu beschreiben Nakamura et al. in einer Arbeit zu GIST eine Korrelation von immunhistologischer Cyclin A- mit Ki-67-Positivität und einem verkürzten tumorfreiem Überleben [88]. Zu CDK2 konnte gezeigt werden, dass eine hohe Kinaseaktivität die Aktivierung von Cyclin B-CDK1Komplexen positiv beeinflusst, was erneut den G2-M Übergang fördert [44]. 53 Diskussion Des Weiteren ist auch CDK2 ein Aktivierungssubstrat der Cyclin H-kontrollierten CAK und wird von Proteinkinase C gehemmt (für welche in der vorliegenden Arbeit bei der Untersuchung von Tumor und Normalgewebe eine Abnahme der Transkriptionsaktivität im Tumor um den Faktor -34,5 festgestellt wurde) [38, 87]. Zu Cyclin E1 ist zu bemerken, dass eine gesteigerte Expression bereits in verschiedenen Tumoren nachgewiesen wurde und chromosomale Instabilität damit einhergeht, was ebenfalls die Tumorgenese begünstigt [32]. Verglichen mit den besprochenen Cyclinen der Typen A, B & E, zeigen die im untersuchten Kollektiv erhobenen Werte für die Cycline D1-D3 und die zugehörigen Kinasen CDK4 & 6 weniger deutliche Richtungstendenzen. Die Gruppe der D-Cycline unterliegt jedoch auch physiologisch geringeren Schwankungen als die übrigen Cycline und wird während G1-, S- und G2-Phase exprimiert. Allein bei Cyclin D1 ist bei der Untersuchung des Stellvertreterkollektivs eine ausgeprägte Abnahme der Transkriptionsaktivität in den Gruppen mit mittlerem und hohem Malignitätsrisiko, sowie in der Rezidivgruppe festzustellen (Faktoren -15,0, -19,5 und -11,3; S. 38, Abb. 15). Und bei CDK6 zeigt sich ebenfalls eine verminderte mRNA-Menge in der Rezidivgruppe (Faktor -12,5). In GIST wurde Cyclin D bereits mehrfach immunhistochemisch untersucht, ohne dass wegweisende Auffälligkeiten oder ein prognostischer Wert festgestellt werden konnten [88, 89, 128]. Sabah et al. geben den Anteil immunhistologisch Cyclin D1-positiver GIST-Tumoren mit 30,4 % an, jedoch ohne Schlussfolgerungen daraus abzuleiten [101]. Über CDK4 wird im Bezug auf GIST in einer Arbeit von Haller et al. berichtet. Er beschreibt eine Konstellation mit hohen Transkriptionswerten für CDK4 und einige weitere Faktoren, in Kombination mit einer Erniedrigung der CDKN2A-Transkripte p14 und p16, welche mit einer schlechteren Prognose assoziiert ist und erklärt dies durch die verminderte Aktivität des Tumorsuppressorgens CDKN2A [46]. Zu einer möglichen Bedeutung von CDK6 in GIST finden sich in der aktuellen Literatur keine Angaben. 54 Diskussion 4.4. Inhibitoren des Cyclin-CDK-Systems Die Untersuchungsergebnisse zu den Inhibitoren des Cyclin-CDK-Systems zeigen im Gegensatz zu den transkriptionsgesteigerten Cyclinen bzw. CDKs überwiegend Abnahmen der Transkription mit fortschreitender Tumorprogression. Die Gesamtwirkrichtung beider Ergebnisse ist damit gleichsinnig. Auffällig ist jedoch, dass die Ergebnisse weniger homogen ausfallen, als bei den untersuchten Cyclinen und CDKs. Bei der Cyclin-dependent kinase-Inhibitorfamilie 1 (Cip/Kip) mit den Vertretern CDKN1A, B & C liegen die Werte der Messungen in Tumor- und Normalgewebe und den Rezidiven eines Patienten unterhalb des für Einzelproben gewählten cut-offs von ± 5-facher Abweichung von der Referenzprobe. Allein bei der Untersuchung des Stellvertreterkollektivs von zwölf Tumoren finden sich einzelne Proben mit größeren Transkriptionsveränderungen. Diese decken sich tendenziell mit den Ergebnissen aus der aktuellen Literatur: Liu et al. beschreiben eine Korrelation von immunhistochemischer Positivität für p21 (CDKN1A) und gesteigerter Malignität in GIST und schließen auf eine Bedeutung von p21 für den Übergang des Tumors von benignem zu malignem Verhalten [68]. Auch im durchgeführten qRT-PCR-Versuch zeigen einzelne Proben der Hochrisiko- und Rezidivgruppe bis zu 5,2-fach erhöhte Werte für CDKN1A (siehe Seite 40, Abb. 17). Für CDKN1B zeigt sich im untersuchten Kollektiv eine verminderte Transkription assoziiert mit höherem Malignitätsrisiko und schlechterer Prognose (Faktor -2,0 in der Rezidivgruppe; S. 40, Abb. 17). Dies geht mit den Ergebnissen von Sabah et al. und Nemoto et al. konform, welche es daher als potentiellen prognostischen Marker vorschlagen [89, 101]. Betreffs CDKN1C weisen die Resultate der am Stellvertreterkollektiv durchgeführten qRT-PCR-Analysen am ehesten auf eine Transkriptionsabnahme mit steigendem Malignitätsrisiko hin (maximaler Abweichungsfaktor -16,4 bei einer Probe der Rezidivgruppe; S. 40, Abb. 17). Über eine Rolle von CDKN1C in GIST finden sich in der Literatur derzeit keine Daten. Die Ergebnisse der verschiedenen qRT-PCR-Versuche zu den Mitgliedern der zweiten großen Inhibitorfamilie – der INK4-Gruppe mit den Vertretern CDKN2A, B, C & D – sind diskrepant. Die Untersuchungen von Tumor- und Normalgewebe, sowie zweier Rezidive eines Patienten ergeben für CDKN2A und CDKN2B teils deutliche Steigerungen der Transkriptionsaktivität (Faktoren 77,3 und 21,1 für CDKN2A; Faktor 13,1 für CDKN2B beim Rezidiv-Vergleich), wohingegen im Stellvertreterkollektiv mit steigendem Malignitätsrisiko 55 Diskussion ein Rückgang der mRNA-Menge beider Gene beobachtet wird, welcher bei einzelnen Proben der Rezidivgruppe extrem ausgeprägt ist (Faktoren -1275,2 für CDKN2A und -58,8 für CDKN2B; S. 41, Abb. 18). Die Gene CDKN2C und CDKN2D erscheinen beim Rezidiv-Vergleich unauffällig und bleiben unter dem cut-off, dagegen zeigt sich in der dritten qRT-PCR mit zunehmendem Malignitätsrisiko bei beiden eine Transkriptionssteigerung (Faktor 3,4 sowohl für CDKN2C, als auch für CDKN2D, bei Betrachtung der Rezidivgruppe gegenüber der Referenzprobe; S. 42, Abb. 19). Die Inhomogenität dieser Ergebnisse erschwert die Beurteilung der Bedeutung der CDK-Inhibitorfamilie 2 in GIST. Viele Fragen bleiben offen und es bedarf weiterer Versuche um diese zu klären. In Bezug auf GIST existieren bereits mehrere Studien, in denen Veränderungen wie Methylierung, Punktmutationen oder Deletionen am Genlokus von CDKN2A nachgewiesen werden konnten, wobei das Hauptaugenmerk auf das Genprodukt p16 gelegt wird [46, 56, 102, 106]. Die Interpretation dieser Ergebnisse wird kontrovers diskutiert. Es finden sich sowohl Arbeiten, welche p16-Negativität als Hinweis für eine höhere Risikoeinstufung werten, als auch solche, in denen p16-Positivität mit einer ungünstigeren Prognose korreliert [46, 106, 110]. Immer wieder finden sich Argumente, dass ein unerwartet gegensinniges Expressions- bzw. Regulationsmuster als reaktiv erklärbar sein könnte. Das heißt, dass bei überschießender Zellteilungsaktivität eine Reduktion von mitosefördernden oder die Steigerung mitosehemmender Faktoren nicht als Ursache sondern als Reaktion zu deuten ist [105, 110]. Zu CDKN2B und D finden sich Arbeiten, welche auf eine Hypermethylierung der Promotorregion in GIST hinweisen, darüber hinaus ist die Rolle des Gens in GIST noch nicht erforscht [102, 130]. Zu CDKN2C finden sich aktuell keine Arbeiten mit Bezug auf GIST. Abgesehen von den beiden beschriebenen Familien der INK4- und Cip/Kip-Inhibitoren, wirken eine Reihe weiterer einzelner Proteine hemmend auf das Cyclin-CDK-System. Zu diesen zählt beispielsweise Reprimo, für das sich bei der Analyse von Tumor- und Normalgewebe eine 16,3-fache Steigerung der mRNA-Menge im Tumor findet. Reprimo ist ein Mediator des p53 vermittelten G2-Zellzyklus-Arrests, welchen er vorwiegend über eine Inhibition von Cyclin B1/B2-CDK1-Komplexen bewirkt [116]. Während es dazu noch keine Veröffentlichungen in Bezug auf GIST gibt, wurden Hyper56 Diskussion methylierungen der Promotorregion von RPRM z.B. bei Tumoren der Lunge und des Pankreas festgestellt. In der Folge kommt es zu verminderter Expression des Mediators und somit zur Apoptoseinhibition [114, 115]. Eine abschließende Einschätzung, ob die in dieser Arbeit im Tumor gemessene Transkriptionssteigerung (16,3-fach) reaktiv auf die allgemeine Aktivitätssteigerung des Cyclin-CDK-Systems auftritt, oder auf andere Ursachen zurückgeht ist ohne weitere Versuchsreihen nicht möglich und muss in künftigen Arbeiten geklärt werden. Ein weiterer Inhibitor des Cyclin-CDK-Systems ist Proteinkinase C. Für den alpha-Subtyp von Proteinkinase C (PRKCA) zeigt sich bei der qRT-PCR von Tumor- und Normalgewebe eine Transkriptionsabnahme um den Faktor -34,5. Proteinkinase C wirkt inhibitorisch auf die Aktivierung von CDK2 durch die CAK [47]. In Anbetracht der im vorliegenden Versuch sowohl bei Cyclin H (Bestandteil der CAK) als auch bei CDK2 nachgewiesenen Transkriptionssteigerungen, entspricht die entgegengesetzte Regulation von PRKCA der gleichen Gesamtwirkrichtung. Der hier untersuchte Subtyp spielt außerdem eine Rolle an den Zellzykluskontrollpunkten, welche er durch die Induktion von p15- und p16-Expression (CDKN2B & CDKN2A) beeinflusst [47, 73, 127]. Bezüglich einer möglichen Bedeutung in GIST finden sich zum alphaSubtyp jedoch keine Daten. 57 Diskussion 4.5. Auffällige Gene außerhalb des Cyclin-CDK-Systems Neben den Beschriebenen weisen eine Reihe weiterer Gene Auffälligkeiten auf, welche sich nicht im engeren Sinne mit dem Cyclin-CDK-System in Verbindung bringen lassen. Diese werden im folgenden Absatz kurz besprochen. Da die meisten Gene in keinem direkten funktionellen Zusammenhang stehen, sind sie nach der qRT-PCR-Untersuchung gegliedert, in deren Rahmen die Transkriptionsveränderung festgestellt wird: - Vergleich von Tumor- und Normalgewebe: IGF1R, BRCA2, BCL2 (4.5.1 - 4.5.3) - Vergleich zweier Tumorrezidive im Verlauf: MEF2C, MAP3K1 (4.5.4 & 4.5.5) 4.5.1. Insulin-like growth factor I Rezeptor (IGF1R) In Relation zum gesunden Referenzgewebe zeigt sich im Tumorgewebe eine ausgeprägte Erniedrigung der mRNA-Menge von IGF1R, welche sich auf den Faktor -58,8 beläuft. IGF1R kodiert den Tyrosinkinaserezeptor für Insulin-like growth factor I, welcher ein ähnliches Spektrum an Signaltransduktionskaskaden wie KIT aktiviert. Die Expression von IGF1R, als auch des Gens für den entsprechenden Liganden IGF1 ist in verschiedenen Neoplasien gesteigert [12, 37]. Auch zu GIST gibt es Arbeiten, die eine immunhistologische Positivität und Genamplifikationen von IGF1R beschreiben [9, 117]. Interessanterweise findet sich eine Amplifikationen signifikant häufiger bei Patienten, die Wildtyp-Allele für KIT und PDGFRA tragen, was auch für viele der seltenen pädiatrischen GIST-Patienten gilt [1, 117]. Dieses Phänomen deutet eine zu KIT analoge Funktion des IGF1-Rezeptors an. Die Ursache der beim untersuchten Tumor festgestellten Abnahme der Transkriptionsaktivität sollte in künftigen Arbeiten geklärt werden. 4.5.2. Breast cancer 2 (BRCA2) Im untersuchten Tumor ist die Menge an BRCA2-mRNA im Vergleich zum Normalgewebe um den Faktor -18,2 vermindert. BRCA2 (Breast Cancer Type 2 susceptibility protein) ist ein, aufgrund seiner Rolle bei familiär und sporadisch auftretenden Mammakarzinomen, umfassend erforschtes Tumorsuppressorgen [75, 132]. Ob die BRCA2-Transkriptionsreduktion generell in GIST eine vergleichbare Rolle spielen könnte ist ungeklärt, jedoch finden sich bei der Literaturrecherche keine Erkenntnisse über eine Beteiligung von BRCA2 an der Pathogenese von GIST. 58 Diskussion 4.5.3. B-Zell CLL/Lymphom 2 (BCL2) Bei der genetischen Untersuchung von Tumor- und Normalgewebe kann eine um das 11,5-fache stärkere Transkription von BCL2 im Tumor nachgewiesen werden. In der Literatur zu GIST finden sich einige Arbeiten, welche bei der immunhistochemischen Untersuchung hohe Anteile BCL2-positiver GIST feststellen. Die angegebenen Werte schwanken zwischen 75 und 100 % [11, 77, 101, 112]. Der prognostische Wert dieses Markers ist umstritten, manche Arbeiten bezweifeln eine relevante Aussagekraft, wohingegen andere ein kürzeres Überleben des Patientenkollektivs mit BCL2-positiven Tumoren beschreiben [16, 72, 77, 112]. 4.5.4. Myocyte enhancer factor 2C (MEF2C) Das untersuchte spät aufgetretene Rezidiv zeigt im Vergleich mit dem bereits vier Jahre zuvor Aufgetretenen eine um den Faktor 39,8 erhöhte Transkription des Gens MEF2C. Es handelt sich hierbei um einen Transkriptionsfaktor, welcher die Funktion von Histondeacetylasen antagonisiert. Im adulten Organismus wird MEF2C durch verschiedene zelluläre Stressoren und Wachstumssignale aktiviert, was den Nachweis gesteigerter MEF2C-Expression bei verschiedenen neoplastischen Erkrankungen erklärt [96, 134]. Im Bezug auf GIST finden sich aktuell jedoch keine Arbeiten. 4.5.5. Mitogen-activated Protein Kinase Kinase Kinase 1 (MAP3K1) Der im zweiten Rezidiv gemessene Wert für MAP3K1 liegt um das 5,2-fache über der mRNA-Menge im ersten (ca. vier Jahre zuvor aufgetretenen) Rezidiv und damit knapp über dem Schwellenwert von ± 5-facher Veränderung der Transkriptionsaktivität. Das von MAP3K1 kodierte Protein ist vorwiegend unter den Bezeichnungen MEKK1 oder MEK-Kinase 1 bekannt und ist Teil des MAPK-Signaltransduktionswegs, für den eine Beteiligung an der Pathogenese Gastrointestinaler Stromatumoren bekannt ist [26, 45]. Hierzu beschreiben Bauer et al. bei Imatinib-resistenten GIST eine Wachstumsinhibition durch MEK-Inhibition, jedoch erwies sich die Inhibition des PI3K-AKT-Signalwegs als überlegen, weswegen Bauer der MAPK-Signalkaskade nur eine Randbedeutung beimisst [5]. Die Tatsache, dass im Rahmen der für diese Arbeit durchgeführten Screeninguntersuchungen nicht mehr Vertreter der MAPK-Kaskade auffällige Veränderungen aufweisen, unterstützt diese Einschätzung. 59 Diskussion 4.6. Résumé – Das Cyclin-CDK-System in der Diagnostik & Therapie von GIST Auf den vorangehenden Seiten wurden Veränderungen im Transkriptionsverhalten einer Vielzahl verschiedener Gene beschrieben und diskutiert. Was jedoch viel wichtiger ist als die Betrachtung der einzelnen Gene, ist das Gesamtbild dieser Auffälligkeiten. Die Untersuchungen zeigen Zunahmen der Transkriptionsaktivität der Cycline A2, B1, B2, E1 und H, sowie von CDK2 im Tumor bzw. im Krankheitsverlauf. Zusätzlich ist die Transkription verschiedener Inhibitoren wie Proteinkinase C alpha und einzelner Vertreter der beiden CDK-Inhibitorfamilien INK4 und Cip/Kip (CDKN1B & C, sowie CDKN2A & B) bei einem Teil der Proben vermindert. Gemeinsam betrachtet weisen diese Ergebnisse auf eine Aktivitätssteigerung des Cyclin-CDK-Systems in Gastrointestinalen Stromatumoren hin und sollten in künftigen Studien weiterverfolgt werden. Nicht zuletzt auch zur Klärung der Frage, ob die aktuell in der Entwicklung befindlichen CDK-Inhibitoren auch für Gastrointestinale Stromatumoren eine ergänzende Therapieoption darstellen werden. Darüber hinaus lassen die Ergebnisse des immunhistochemischen Versuchsteils hoffen, dass die Untersuchung des Cyclin H-Status in Kombination mit der Klassifikation nach Fletcher et al. eine weitere Differenzierung der Patienten der Hochrisikogruppe erlaubt und GIST sehr-hohem Malignitätsrisiko (very-high risk of malignancy) anzeigt. 60 Zusammenfassung 5. Zusammenfassung Mit der Entwicklung zielgerichteter Tyrosinkinaseinhibitoren hat sich ein ganzes Feld neuer und erweiterter Behandlungsoptionen für Gastrointestinale Stromatumoren (GIST) eröffnet, welches jedoch auch neue Problematiken mit sich bringt. Das Auftreten von Sekundärresistenzen, das Nebenwirkungsspektrum und auch die hohen Behandlungskosten erfordern in noch größerem Maß als bisher eine zuverlässige Prognostik des individuellen Malignitätsrisikos um eine differenzierte Selektion geeigneter Patienten zu ermöglichen. Aktuell sind jedoch keine zuverlässigen genetischen oder immunhistologischen Marker bekannt und die gängige Klassifikation nach Fletcher et al. bietet, basierend auf Tumorgröße und Mitoserate, zwar eine gute Sensitivität bei der Vorhersage des Auftretens von Metastasen oder Rezidiven (85 - 97 % der betroffenen Patienten fallen in die Gruppe mit hohem Malignitätsrisiko), jedoch bei mangelnder Spezifität (Tumorspezifisches Überleben 62 %, Tumorfreies Überleben 36 % nach 5 Jahren in der Hochrisikogruppe des beobachteten Kollektivs). Alternative Klassifikationen nach Miettinen et al., Hornick et al. oder Joensuu et al. erbringen ähnliche Ergebnisse. Ziel der vorliegenden Arbeit ist daher die Untersuchung zellulärer Signaltransduktionskaskaden und Regulationssysteme zur Identifizierung neuer Marker mit möglichem prognostischem oder therapeutischem Wert. Mittels quantitativer Real-Time Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR) wird hierzu in drei unterschiedlichen Versuchsteilen ein Screening der Transkriptionsaktivität von Genen des Cyclin-CDK-Systems (CDK = cyclin dependent kinase), sowie des p53- und des MAPKSignalwegs (MAPK = mitogen associated protein kinase) an insgesamt 16 kryoasservierten Gewebeproben durchgeführt. Die Ergebnisse dienen als Grundlage für die Selektion von Cyclin H als Zielgen des zweiten experimentellen Teils der Arbeit: Immunhistochemische Präparate von 92 GIST-Proben werden angefertigt, um die Ergebnisse der genetischen Untersuchungen in einem Kollektiv von statistisch aussagefähiger Größe auf Proteinebene zu verifizieren. Die Mehrheit der im Rahmen der genetischen Versuche nachgewiesenen Transkriptionsveränderungen weißt kohärent auf eine Aktivitätssteigerung des Cyclin-CDK-Systems im Rahmen der Entstehung bzw. des Krankheitsverlaufs von Gastrointestinalen Stromatumo61 Zusammenfassung ren hin. Beispielsweise zeigen sich Steigerungen der Transkriptionsaktivität der Cycline A2, B1, B2, E1 und H, sowie der Cyclin-abhängigen Kinase CDK2. Hierzu passend erbringt die Untersuchung verschiedener Inhibitoren des Cyclin-CDK-Systems vorwiegend Transkriptionsabnahmen (z.B. bei Cyclin-dependent kinase-Inhibitor 1B, 1C, 2A & 2B, sowie Proteinkinase C, alpha), was der gleichen Wirkrichtung entspricht. Das Cyclin-CDKSystem steht als zentraler Regulator des Zellzyklus im Fokus der onkologischen Forschung und erste klinische Studien zum therapeutischen Einsatz von CDK-Inhibitoren laufen. Die in dieser Arbeit dargestellten Hinweise auf eine Aktivitätssteigerung des Cyclin-CDKSystems in GIST werfen die Frage auf, ob die Entwicklung von CDK-Inhibitoren die therapeutischen Möglichkeiten erneut erweitern könnte und sollten in künftigen Arbeiten weiterverfolgt werden. Darüber hinaus zeigt die Expression von Cyclin H bei der immunhistochemischen Untersuchung von 92 GIST-Proben prognostischen Wert: Bei Patienten mit Cyclin H-positiven GIST der Hochrisikogruppe nach Fletcher et al. findet sich ein signifikant früherer tumorbedingter Exitus letalis, als bei Patienten mit Cyclin H-negativen Tumoren der gleichen Malignitätsrisikogruppe (Log-Rang-Test: p = 0,032). Die Ergebnisse zur Proteinexpression unterstützen damit den Hinweis der Transkriptionsanalytik auf die pathogenetisch relevante Rolle des Cyclin-CDK-Systems und verfeinern darüber hinaus die diagnostischen Möglichkeiten. Die Kombination von positivem Cyclin H-Status und Hochrisikoklassifikation nach Fletcher et al. erweist sich in GIST als signifikanter Prädiktor für ein ungünstiges Outcome (Log-Rang-Test: p < 0,001 für tumorspezifisches Überleben, p = 0,001 für tumorfreies Überleben, Cyclin H-positive Hochrisiko-GIST vs. alle Übrigen). Die klinische Relevanz dieses Ergebnisses zeigt die jüngst im Lancet neu entbrannte Diskussion um die Indikation zur adjuvanten Therapie von R0-resezierten Hochrisiko-GISTPatienten. 62 Literaturverzeichnis 6. Literaturverzeichnis 1. Agaram N.P., Laquaglia M.P., Ustun B., Guo T., Wong G.C., Socci N.D., Maki R.G., DeMatteo R.P., Besmer P., Antonescu C.R.: Molecular characterization of pediatric gastrointestinal stromal tumors. Clin Cancer Res 14: 3204-3215 (2008) 2. Ali S.: Role of c-kit/SCF in cause and treatment of gastrointestinal stromal tumors (GIST). Gene 401: 38-45 (2007) 3. Antonescu C.R.: Gastrointestinal stromal tumor (GIST) pathogenesis, familial GIST, and animal models. Semin Diagn Pathol 23: 63-69 (2006) 4. Baselga J.: Targeting tyrosine kinases in cancer: the second wave. Science 312: 1175-1178 (2006) 5. Bauer S., Duensing A., Demetri G.D., Fletcher J.A.: KIT oncogenic signaling mechanisms in imatinib-resistant gastrointestinal stromal tumor: PI3-kinase/AKT is a crucial survival pathway. Oncogene 26: 7560-7568 (2007) 6. Besmer P., Murphy J.E., George P.C., Qiu F.H., Bergold P.J., Lederman L., Snyder H.W., Jr., Brodeur D., Zuckerman E.E., Hardy W.D.: A new acute transforming feline retrovirus and relationship of its oncogene v-kit with the protein kinase gene family. Nature 320: 415-421 (1986) 7. Blay P., Astudillo A., Buesa J.M., Campo E., Abad M., Garcia-Garcia J., Miquel R., Marco V., Sierra M., Losa R., Lacave A., Brana A., Balbin M., Freije J.M.: Protein kinase C theta is highly expressed in gastrointestinal stromal tumors but not in other mesenchymal neoplasias. Clin Cancer Res 10: 4089-4095 (2004) 8. Bondi J., Husdal A., Bukholm G., Nesland J.M., Bakka A., Bukholm I.R.: Expression and gene amplification of primary (A, B1, D1, D3, and E) and secondary (C and H) cyclins in colon adenocarcinomas and correlation with patient outcome. J Clin Pathol 58: 509-514 (2005) 9. Braconi C., Bracci R., Bearzi I., Bianchi F., Sabato S., Mandolesi A., Belvederesi L., Cascinu S., Valeri N., Cellerino R.: Insulin-like growth factor (IGF) 1 and 2 help to predict disease outcome in GIST patients. Ann Oncol 19: 1293-1298 (2008) 10. Brizzi M.F., Dentelli P., Rosso A., Yarden Y., Pegoraro L.: STAT protein recruitment and activation in c-Kit deletion mutants. J Biol Chem 274: 16965-16972 (1999) 11. Chilosi M., Facchettti F., Dei Tos A.P., Lestani M., Morassi M.L., Martignoni G., Sorio C., Benedetti A., Morelli L., Doglioni C., Barberis M., Menestrina F., Viale G.: bcl-2 expression in pleural and extrapleural solitary fibrous tumours. J Pathol 181: 362-367 (1997) 12. Chitnis M.M., Yuen J.S., Protheroe A.S., Pollak M., Macaulay V.M.: The type 1 insulin-like growth factor receptor pathway. Clin Cancer Res 14: 6364-6370 (2008) 13. Cipolla C., Fulfaro F., Sandonato L., Fricano S., Pantuso G., Grassi N., Vieni S., Valerio M.R., Lo Dico R., Gebbia N., Latteri M.A.: Clinical presentation and treatment of gastrointestinal stromal tumors. Tumori 92: 279-284 (2006) 63 Literaturverzeichnis 14. Clarke P.R.: Cyclin-dependent kinases. CAK-handed kinase activation. Curr Biol 5: 40-42 (1995) 15. Corless C.L., Fletcher J.A., Heinrich M.C.: Biology of gastrointestinal stromal tumors. J Clin Oncol 22: 3813-3825 (2004) 16. Cunningham R.E., Abbondanzo S.L., Chu W.S., Emory T.S., Sobin L.H., O'Leary T.J.: Apoptosis, bcl-2 expression, and p53 expression in gastrointestinal stromal/smooth muscle tumors. Appl Immunohistochem Mol Morphol 9: 19-23 (2001) 17. Davis R.J.: Transcriptional regulation by MAP kinases. Mol Reprod Dev 42: 459-467 (1995) 18. De Souza C.P., Ellem K.A., Gabrielli B.G.: Centrosomal and cytoplasmic Cdc2/cyclin B1 activation precedes nuclear mitotic events. Exp Cell Res 257: 11-21 (2000) 19. Debiec-Rychter M., Wasag B., Stul M., De Wever I., Van Oosterom A., Hagemeijer A., Sciot R.: Gastrointestinal stromal tumours (GISTs) negative for KIT (CD117 antigen) immunoreactivity. J Pathol 202: 430-438 (2004) 20. DeMatteo R.P., Lewis J.J., Leung D., Mudan S.S., Woodruff J.M., Brennan M.F.: Two hundred gastrointestinal stromal tumors: recurrence patterns and prognostic factors for survival. Ann Surg 231: 51-58 (2000) 21. DeMatteo R.P., Heinrich M.C., El-Rifai W.M., Demetri G.: Clinical management of gastrointestinal stromal tumors: before and after STI-571. Hum Pathol 33: 466-477 (2002) 22. DeMatteo R.P., Ballman K.V., Antonescu C.R., Maki R.G., Pisters P.W., Demetri G.D., Blackstein M.E., Blanke C.D., von Mehren M., Brennan M.F., Patel S., McCarter M.D., Polikoff J.A., Tan B.R., Owzar K.: Adjuvant imatinib mesylate after resection of localised, primary gastrointestinal stromal tumour: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet 373: 1097-1104 (2009) 23. Demetri G.D., van Oosterom A.T., Garrett C.R., Blackstein M.E., Shah M.H., Verweij J., McArthur G., Judson I.R., Heinrich M.C., Morgan J.A., Desai J., Fletcher C.D., George S., Bello C.L., Huang X., Baum C.M., Casali P.G.: Efficacy and safety of sunitinib in patients with advanced gastrointestinal stromal tumour after failure of imatinib: a randomised controlled trial. Lancet 368: 1329-1338 (2006) 24. Denicourt C., Dowdy S.F.: Cip/Kip proteins: more than just CDKs inhibitors. Genes Dev 18: 851-855 (2004) 25. Deshpande A., Sicinski P., Hinds P.W.: Cyclins and cdks in development and cancer: a perspective. Oncogene 24: 2909-2915 (2005) 26. Dhillon A.S., Hagan S., Rath O., Kolch W.: MAP kinase signalling pathways in cancer. Oncogene 26: 3279-3290 (2007) 27. Dirnhofer S., Leyvraz S.: Current standards and progress in understanding and treatment of GIST. Swiss Med Wkly 139: 90-102 (2009) 28. Donovan J., Slingerland J.: Transforming growth factor-beta and breast cancer: Cell cycle arrest by transforming growth factor-beta and its disruption in cancer. Breast Cancer Res 2: 116-124 (2000) 64 Literaturverzeichnis 29. Duensing A., Joseph N.E., Medeiros F., Smith F., Hornick J.L., Heinrich M.C., Corless C.L., Demetri G.D., Fletcher C.D., Fletcher J.A.: Protein Kinase C theta (PKCtheta) expression and constitutive activation in gastrointestinal stromal tumors (GISTs). Cancer Res 64: 5127-5131 (2004) 30. Duensing A., Medeiros F., McConarty B., Joseph N.E., Panigrahy D., Singer S., Fletcher C.D., Demetri G.D., Fletcher J.A.: Mechanisms of oncogenic KIT signal transduction in primary gastrointestinal stromal tumors (GISTs). Oncogene 23: 3999-4006 (2004) 31. Egloff A.M., Vella L.A., Finn O.J.: Cyclin B1 and other cyclins as tumor antigens in immunosurveillance and immunotherapy of cancer. Cancer Res 66: 6-9 (2006) 32. Ekholm-Reed S., Mendez J., Tedesco D., Zetterberg A., Stillman B., Reed S.I.: Deregulation of cyclin E in human cells interferes with prereplication complex assembly. J Cell Biol 165: 789-800 (2004) 33. Feaver W.J., Svejstrup J.Q., Henry N.L., Kornberg R.D.: Relationship of CDKactivating kinase and RNA polymerase II CTD kinase TFIIH/TFIIK. Cell 79: 11031109 (1994) 34. Feng Z., Hu W., Rajagopal G., Levine A.J.: The tumor suppressor p53: cancer and aging. Cell Cycle 7: 842-847 (2008) 35. Fisher R.P.: Secrets of a double agent: CDK7 in cell-cycle control and transcription. J Cell Sci 118: 5171-5180 (2005) 36. Fletcher C.D., Berman J.J., Corless C., Gorstein F., Lasota J., Longley B.J., Miettinen M., O'Leary T.J., Remotti H., Rubin B.P., Shmookler B., Sobin L.H., Weiss S.W.: Diagnosis of gastrointestinal stromal tumors: A consensus approach. Hum Pathol 33: 459-465 (2002) 37. Frasca F., Pandini G., Sciacca L., Pezzino V., Squatrito S., Belfiore A., Vigneri R.: The role of insulin receptors and IGF-I receptors in cancer and other diseases. Arch Physiol Biochem 114: 23-37 (2008) 38. Fung T.K., Poon R.Y.: A roller coaster ride with the mitotic cyclins. Semin Cell Dev Biol 16: 335-342 (2005) 39. Goettsch W.G., Bos S.D., Breekveldt-Postma N., Casparie M., Herings R.M., Hogendoorn P.C.: Incidence of gastrointestinal stromal tumours is underestimated: results of a nation-wide study. Eur J Cancer 41: 2868-2872 (2005) 40. Gold J.S., Dematteo R.P.: Combined surgical and molecular therapy: the gastrointestinal stromal tumor model. Ann Surg 244: 176-184 (2006) 41. Gold J.S., Dematteo R.P.: Neoadjuvant therapy for gastrointestinal stromal tumor (GIST): racing against resistance. Ann Surg Oncol 14: 1247-1248 (2007) 42. Goldschmidt R.: Theodor Boveri. Science 43: 263-270 (1916) 43. Golias C.H., Charalabopoulos A., Charalabopoulos K.: Cell proliferation and cell cycle control: a mini review. Int J Clin Pract 58: 1134-1141 (2004) 44. Guadagno T.M., Newport J.W.: Cdk2 kinase is required for entry into mitosis as a positive regulator of Cdc2-cyclin B kinase activity. Cell 84: 73-82 (1996) 65 Literaturverzeichnis 45. Hagemann C., Blank J.L.: The ups and downs of MEK kinase interactions. Cell Signal 13: 863-875 (2001) 46. Haller F., Gunawan B., von Heydebreck A., Schwager S., Schulten H.J., Wolf-Salgo J., Langer C., Ramadori G., Sultmann H., Fuzesi L.: Prognostic role of E2F1 and members of the CDKN2A network in gastrointestinal stromal tumors. Clin Cancer Res 11: 6589-6597 (2005) 47. Hamada K., Takuwa N., Zhou W., Kumada M., Takuwa Y.: Protein kinase C inhibits the CAK-CDK2 cyclin-dependent kinase cascade and G1/S cell cycle progression in human diploid fibroblasts. Biochim Biophys Acta 1310: 149-156 (1996) 48. Hartwell L.H., Kastan M.B.: Cell cycle control and cancer. Science 266: 1821-1828 (1994) 49. Hassan I., You Y.N., Shyyan R., Dozois E.J., Smyrk T.C., Okuno S.H., Schleck C.D., Hodge D.O., Donohue J.H.: Surgically managed gastrointestinal stromal tumors: a comparative and prognostic analysis. Ann Surg Oncol 15: 52-59 (2008) 50. Hata Y., Ishigami S., Natsugoe S., Nakajo A., Okumura H., Miyazono F., Matsumoto M., Hokita S., Aikou T.: P53 and MIB-1 expression in gastrointestinal stromal tumor (GIST) of the stomach. Hepatogastroenterology 53: 613-615 (2006) 51. Hirota S., Isozaki K., Moriyama Y., Hashimoto K., Nishida T., Ishiguro S., Kawano K., Hanada M., Kurata A., Takeda M., Muhammad Tunio G., Matsuzawa Y., Kanakura Y., Shinomura Y., Kitamura Y.: Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors. Science 279: 577-580 (1998) 52. Hohenberger P., Reichardt P., Stroszczynski C., Schneider U., Hossfeld D.K.: Gastrointestinale Stromatumoren — Tumorentität und Therapie mit Imatinib. Dtsch Arztebl 100: A 1612–1618 (2003) 53. Hohenberger P., Wardelmann E.: Surgical considerations for gastrointestinal stroma tumor. Chirurg 77: 33-40 (2006) 54. Hohenberger P.: Adjuvant imatinib in GIST: a self-fulfilling prophecy, or more? Lancet 373: 1058-1060 (2009) 55. Hornick J.L., Fletcher C.D.: The role of KIT in the management of patients with gastrointestinal stromal tumors. Hum Pathol 38: 679-687 (2007) 56. House M.G., Guo M., Efron D.T., Lillemoe K.D., Cameron J.L., Syphard J.E., Hooker C.M., Abraham S.C., Montgomery E.A., Herman J.G., Brock M.V.: Tumor suppressor gene hypermethylation as a predictor of gastric stromal tumor behavior. J Gastrointest Surg 7: 1004-1014 (2003) 57. Hunter T., Pines J.: Cyclins and cancer. Cell 66: 1071-1074 (1991) 58. Jackson P.K.: The hunt for cyclin. Cell 134: 199-202 (2008) 59. Jemal A., Ward E., Hao Y., Thun M.: Trends in the leading causes of death in the United States, 1970-2002. Journal of the American Medical Association (JAMA) 294: 1255-1259 (2005) 60. Joensuu H.: Risk stratification of patients diagnosed with gastrointestinal stromal tumor. Hum Pathol 39: 1411-1419 (2008) 66 Literaturverzeichnis 61. Johansson M., Persson J.L.: Cancer therapy: targeting cell cycle regulators. Anticancer Agents Med Chem 8: 723-731 (2008) 62. Kao H., Marto J.A., Hoffmann T.K., Shabanowitz J., Finkelstein S.D., Whiteside T.L., Hunt D.F., Finn O.J.: Identification of cyclin B1 as a shared human epithelial tumorassociated antigen recognized by T cells. J Exp Med 194: 1313-1323 (2001) 63. Kayaselcuk F., Erkanli S., Bolat F., Seydaoglu G., Kuscu E., Demirhan B.: Expression of cyclin H in normal and cancerous endometrium, its correlation with other cyclins, and association with clinicopathologic parameters. Int J Gynecol Cancer 16: 402-408 (2006) 64. Kindblom L.G., Remotti H.E., Aldenborg F., Meis-Kindblom J.M.: Gastrointestinal pacemaker cell tumor (GIPACT): gastrointestinal stromal tumors show phenotypic characteristics of the interstitial cells of Cajal. Am J Pathol 152: 1259-1269 (1998) 65. Koon N., Schneider-Stock R., Sarlomo-Rikala M., Lasota J., Smolkin M., Petroni G., Zaika A., Boltze C., Meyer F., Andersson L., Knuutila S., Miettinen M., El-Rifai W.: Molecular targets for tumour progression in gastrointestinal stromal tumours. Gut 53: 235-240 (2004) 66. Lasota J., Miettinen M.: Clinical significance of oncogenic KIT and PDGFRA mutations in gastrointestinal stromal tumours. Histopathology 53: 245-266 (2008) 67. Lindqvist A., Kallstrom H., Lundgren A., Barsoum E., Rosenthal C.K.: Cdc25B cooperates with Cdc25A to induce mitosis but has a unique role in activating cyclin B1-Cdk1 at the centrosome. J Cell Biol 171: 35-45 (2005) 68. Liu F.Y., Qi J.P., Xu F.L., Wu A.P.: Clinicopathological and immunohistochemical analysis of gastrointestinal stromal tumor. World J Gastroenterol 12: 4161-4165 (2006) 69. Lolli G., Johnson L.N.: CAK-Cyclin-dependent Activating Kinase: a key kinase in cell cycle control and a target for drugs? Cell Cycle 4: 572-577 (2005) 70. Maertens O., Prenen H., Debiec-Rychter M., Wozniak A., Sciot R., Pauwels P., De Wever I., Vermeesch J.R., de Raedt T., De Paepe A., Speleman F., van Oosterom A., Messiaen L., Legius E.: Molecular pathogenesis of multiple gastrointestinal stromal tumors in NF1 patients. Hum Mol Genet 15: 1015-1023 (2006) 71. Malumbres M.: Cyclins and related kinases in cancer cells. Journal of B.U.ON.: official journal of the Balkan Union of Oncology 12 Suppl 1: 45-52 (2007) 72. Martinez-Consuegra N., Baquera-Heredia J., de Leon-Bojorge B., Padilla-Rodriguez A., Hidalgo C.O.: Expression of p53 and BCI-2 as prognostic markers and for anatomical location in gastrointestinal stromal tumors (GIST). Clinico-pathological and immunohistochemistry study of 19 cases. Rev Gastroenterol Mex 71: 269-278 (2006) 73. Martiny-Baron G., Fabbro D.: Classical PKC isoforms in cancer. Pharmacol Res 55: 477-486 (2007) 74. Mazur M.T., Clark H.B.: Gastric stromal tumors. Reappraisal of histogenesis. Am J Surg Pathol 7: 507-519 (1983) 67 Literaturverzeichnis 75. McCabe N., Turner N.C., Lord C.J., Kluzek K., Bialkowska A., Swift S., Giavara S., O'Connor M.J., Tutt A.N., Zdzienicka M.Z., Smith G.C., Ashworth A.: Deficiency in the repair of DNA damage by homologous recombination and sensitivity to poly(ADP-ribose) polymerase inhibition. Cancer Res 66: 8109-8115 (2006) 76. McLean S.R., Gana-Weisz M., Hartzoulakis B., Frow R., Whelan J., Selwood D., Boshoff C.: Imatinib binding and cKIT inhibition is abrogated by the cKIT kinase domain I missense mutation Val654Ala. Mol Cancer Ther 4: 2008-2015 (2005) 77. Meara R.S., Cangiarella J., Simsir A., Horton D., Eltoum I., Chhieng D.C.: Prediction of aggressiveness of gastrointestinal stromal tumours based on immunostaining with bcl-2, Ki-67 and p53. Cytopathology 18: 283-289 (2007) 78. Miettinen M., Monihan J.M., Sarlomo-Rikala M., Kovatich A.J., Carr N.J., Emory T.S., Sobin L.H.: Gastrointestinal stromal tumors/smooth muscle tumors (GISTs) primary in the omentum and mesentery: clinicopathologic and immunohistochemical study of 26 cases. Am J Surg Pathol 23: 1109-1118 (1999) 79. Miettinen M., Sarlomo-Rikala M., Lasota J.: Gastrointestinal stromal tumors: recent advances in understanding of their biology. Hum Pathol 30: 1213-1220 (1999) 80. Miettinen M., Kopczynski J., Makhlouf H.R., Sarlomo-Rikala M., Gyorffy H., Burke A., Sobin L.H., Lasota J.: Gastrointestinal stromal tumors, intramural leiomyomas, and leiomyosarcomas in the duodenum: a clinicopathologic, immunohistochemical, and molecular genetic study of 167 cases. Am J Surg Pathol 27: 625-641 (2003) 81. Miettinen M., Lasota J.: Gastrointestinal stromal tumors (GISTs): definition, occurrence, pathology, differential diagnosis and molecular genetics. Pol J Pathol 54: 3-24 (2003) 82. Miettinen M., Sobin L.H., Lasota J.: Gastrointestinal stromal tumors of the stomach: a clinicopathologic, immunohistochemical, and molecular genetic study of 1765 cases with long-term follow-up. Am J Surg Pathol 29: 52-68 (2005) 83. Miettinen M., Lasota J.: Gastrointestinal stromal tumors: review on morphology, molecular pathology, prognosis, and differential diagnosis. Arch Pathol Lab Med 130: 1466-1478 (2006) 84. Miettinen M., Makhlouf H., Sobin L.H., Lasota J.: Gastrointestinal stromal tumors of the jejunum and ileum: a clinicopathologic, immunohistochemical, and molecular genetic study of 906 cases before imatinib with long-term follow-up. Am J Surg Pathol 30: 477-489 (2006) 85. Miettinen M., Wang Z.F., Lasota J.: DOG1 antibody in the differential diagnosis of gastrointestinal stromal tumors: a study of 1840 cases. Am J Surg Pathol 33: 14011408 (2009) 86. Motegi A., Sakurai S., Nakayama H., Sano T., Oyama T., Nakajima T.: PKC theta, a novel immunohistochemical marker for gastrointestinal stromal tumors (GIST), especially useful for identifying KIT-negative tumors. Pathol Int 55: 106-112 (2005) 87. Murray A.W.: Recycling the cell cycle: cyclins revisited. Cell 116: 221-234 (2004) 68 Literaturverzeichnis 88. Nakamura N., Yamamoto H., Yao T., Oda Y., Nishiyama K., Imamura M., Yamada T., Nawata H., Tsuneyoshi M.: Prognostic significance of expressions of cell-cycle regulatory proteins in gastrointestinal stromal tumor and the relevance of the risk grade. Hum Pathol 36: 828-837 (2005) 89. Nemoto Y., Mikami T., Hana K., Kikuchi S., Kobayashi N., Watanabe M., Okayasu I.: Correlation of enhanced cell turnover with prognosis of gastrointestinal stromal tumors of the stomach: relevance of cellularity and p27kip1. Pathol Int 56: 724-731 (2006) 90. Nilsson B., Bumming P., Meis-Kindblom J.M., Oden A., Dortok A., Gustavsson B., Sablinska K., Kindblom L.G.: Gastrointestinal stromal tumors: the incidence, prevalence, clinical course, and prognostication in the preimatinib mesylate era--a population-based study in western Sweden. Cancer 103: 821-829 (2005) 91. Nishida T., Yasumasa K.: Target-based therapy against gastrointestinal stromal tumors--from molecular diagnosis to molecular target therapy. Gan To Kagaku Ryoho 30: 1071-1078 (2003) 92. Nowell P.C., Hungerford D.A.: Chromosome studies on normal and leukemic human leukocytes. J Natl Cancer Inst 25: 85-109 (1960) 93. Paner G.P., Silberman S., Hartman G., Micetich K.C., Aranha G.V., Alkan S.: Analysis of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) in gastrointestinal stromal tumors. Anticancer Res 23: 2253-2260 (2003) 94. Park T.W., Simon M.: Molekulare Grundmechanismen in der Onkogenese. Der Gynäkologe 37: 196-202 (2004) 95. Poremba C., Simon R., Boecker W., Dockhorn-Dworniczak B.: Molekulare Ursachen der Tumorentstehung. Der Onkologe 5: 847-854 (1999) 96. Potthoff M.J., Olson E.N.: MEF2: a central regulator of diverse developmental programs. Development 134: 4131-4140 (2007) 97. Prakash S., Sarran L., Socci N., DeMatteo R.P., Eisenstat J., Greco A.M., Maki R.G., Wexler L.H., LaQuaglia M.P., Besmer P., Antonescu C.R.: Gastrointestinal stromal tumors in children and young adults: a clinicopathologic, molecular, and genomic study of 15 cases and review of the literature. J Pediatr Hematol Oncol 27: 179-187 (2005) 98. Reith J.D., Goldblum J.R., Lyles R.H., Weiss S.W.: Extragastrointestinal (soft tissue) stromal tumors: an analysis of 48 cases with emphasis on histologic predictors of outcome. Mod Pathol 13: 577-585 (2000) 99. Rubin B.P., Duensing A.: Mechanisms of resistance to small molecule kinase inhibition in the treatment of solid tumors. Lab Invest 86: 981-986 (2006) 100. Rutkowski P., Nowecki Z.I., Michej W., Debiec-Rychter M., Wozniak A., Limon J., Siedlecki J., Grzesiakowska U., Kakol M., Osuch C., Polkowski M., Gluszek S., Zurawski Z., Ruka W.: Risk criteria and prognostic factors for predicting recurrences after resection of primary gastrointestinal stromal tumor. Ann Surg Oncol 14: 2018-2027 (2007) 69 Literaturverzeichnis 101. Sabah M., Cummins R., Leader M., Kay E.: Altered expression of cell cycle regulatory proteins in gastrointestinal stromal tumors: markers with potential prognostic implications. Hum Pathol 37: 648-655 (2006) 102. Saito K., Sakurai S., Sano T., Sakamoto K., Asao T., Hosoya Y., Nakajima T., Kuwano H.: Aberrant methylation status of known methylation-sensitive CpG islands in gastrointestinal stromal tumors without any correlation to the state of c-kit and PDGFRA gene mutations and their malignancy. Cancer Sci 99: 253-259 (2008) 103. Sarlomo-Rikala M., Tsujimura T., Lendahl U., Miettinen M.: Patterns of nestin and other intermediate filament expression distinguish between gastrointestinal stromal tumors, leiomyomas and schwannomas. Acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica (APMIS) 110: 499-507 (2002) 104. Scarpa M., Bertin M., Ruffolo C., Polese L., D'Amico D.F., Angriman I.: A systematic review on the clinical diagnosis of gastrointestinal stromal tumors. J Surg Oncol 98: 384-392 (2008) 105. Schmieder M., Wolf S., Danner B., Stoehr S., Juchems M.S., Wuerl P., Henne-Bruns D., Knippschild U., Hasel C., Kramer K.: p16 expression differentiates high-risk gastrointestinal stromal tumor and predicts poor outcome. Neoplasia 10: 11541162 (2008) 106. Schneider-Stock R., Boltze C., Lasota J., Peters B., Corless C.L., Ruemmele P., Terracciano L., Pross M., Insabato L., Di Vizio D., Iesalnieks I., Dirnhofer S., Hartmann A., Heinrich M., Miettinen M., Roessner A., Tornillo L.: Loss of p16 protein defines high-risk patients with gastrointestinal stromal tumors: a tissue microarray study. Clin Cancer Res 11: 638-645 (2005) 107. Senderowicz A.M.: Cell cycle modulators for the treatment of lung malignancies. Clin Lung Cancer 5: 158-168 (2003) 108. Sleijfer S., Wiemer E., Verweij J.: Drug Insight: gastrointestinal stromal tumors (GIST)--the solid tumor model for cancer-specific treatment. Nat Clin Pract Oncol 5: 102-111 (2008) 109. Statistisches-Bundesamt: Jeder vierte Gestorbene erlag im Jahr 2002 einem Krebsleiden. Pressemitteilung 41: http://www.destatis.de/jetspeed/portal/cms/Sites/destatis/Internet/DE/Presse/p m/2004/01/PD04__041__232,templateId=renderPrint.psml (Abrufdatum: 12.04.2008) (2004) 110. Steigen S.E., Bjerkehagen B., Haugland H.K., Nordrum I.S., Loberg E.M., Isaksen V., Eide T.J., Nielsen T.O.: Diagnostic and prognostic markers for gastrointestinal stromal tumors in Norway. Mod Pathol 21: 46-53 (2008) 111. Steigen S.E., Eide T.J.: Gastrointestinal stromal tumors (GISTs): a review. Acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica (APMIS) 117: 73-86 (2009) 112. Steinert D.M., Oyarzo M., Wang X., Choi H., Thall P.F., Medeiros L.J., Raymond A.K., Benjamin R.S., Zhang W., Trent J.C.: Expression of Bcl-2 in gastrointestinal stromal tumors: correlation with progression-free survival in 81 patients treated with imatinib mesylate. Cancer 106: 1617-1623 (2006) 70 Literaturverzeichnis 113. Strausfeld U.P., Howell M., Descombes P., Chevalier S., Rempel R.E., Adamczewski J., Maller J.L., Hunt T., Blow J.J.: Both cyclin A and cyclin E have S-phase promoting (SPF) activity in Xenopus egg extracts. J Cell Sci 109: 1555-1563 (1996) 114. Suzuki M., Shigematsu H., Takahashi T., Shivapurkar N., Sathyanarayana U.G., Iizasa T., Fujisawa T., Gazdar A.F.: Aberrant methylation of Reprimo in lung cancer. Lung Cancer 47: 309-314 (2005) 115. Takagi K., Sowa Y., Cevik O.M., Nakanishi R., Sakai T.: CDK inhibitor enhances the sensitivity to 5-fluorouracil in colorectal cancer cells. Int J Oncol 32: 1105-1110 (2008) 116. Takahashi T., Suzuki M., Shigematsu H., Shivapurkar N., Echebiri C., Nomura M., Stastny V., Augustus M., Wu C.W., Wistuba, II, Meltzer S.J., Gazdar A.F.: Aberrant methylation of Reprimo in human malignancies. Int J Cancer 115: 503-510 (2005) 117. Tarn C., Rink L., Merkel E., Flieder D., Pathak H., Koumbi D., Testa J.R., Eisenberg B., von Mehren M., Godwin A.K.: Insulin-like growth factor 1 receptor is a potential therapeutic target for gastrointestinal stromal tumors. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 8387-8392 (2008) 118. Ting A.H., McGarvey K.M., Baylin S.B.: The cancer epigenome--components and functional correlates. Genes Dev 20: 3215-3231 (2006) 119. Tornillo L., Terracciano L.M.: An update on molecular genetics of gastrointestinal stromal tumours. J Clin Pathol 59: 557-563 (2006) 120. Tran T., Davila J.A., El-Serag H.B.: The epidemiology of malignant gastrointestinal stromal tumors: an analysis of 1,458 cases from 1992 to 2000. Am J Gastroenterol 100: 162-168 (2005) 121. Tryggvason G., Gislason H.G., Magnusson M.K., Jonasson J.G.: Gastrointestinal stromal tumors in Iceland, 1990-2003: the icelandic GIST study, a population-based incidence and pathologic risk stratification study. Int J Cancer 117: 289-293 (2005) 122. Tsujimura T., Makiishi-Shimobayashi C., Lundkvist J., Lendahl U., Nakasho K., Sugihara A., Iwasaki T., Mano M., Yamada N., Yamashita K., Toyosaka A., Terada N.: Expression of the intermediate filament nestin in gastrointestinal stromal tumors and interstitial cells of Cajal. Am J Pathol 158: 817-823 (2001) 123. Vazquez A., Bond E.E., Levine A.J., Bond G.L.: The genetics of the p53 pathway, apoptosis and cancer therapy. Nat Rev Drug Discov 7: 979-987 (2008) 124. Vogelstein B., Kinzler K.W.: The multistep nature of cancer. Trends Genet 9: 138141 (1993) 125. Wallenfang M.R., Seydoux G.: cdk-7 Is required for mRNA transcription and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans embryos. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 5527-5532 (2002) 126. Wang Q., Kou Y.W.: Study of the expressions of p53 and bcl-2 genes, the telomerase activity and apoptosis in GIST patients. World J Gastroenterol 13: 2626-2628 (2007) 71 Literaturverzeichnis 127. Wen-Sheng W., Jun-Ming H.: Activation of protein kinase C alpha is required for TPA-triggered ERK (MAPK) signaling and growth inhibition of human hepatoma cell HepG2. J Biomed Sci 12: 289-296 (2005) 128. Wong N.A., Young R., Malcomson R.D., Nayar A.G., Jamieson L.A., Save V.E., Carey F.A., Brewster D.H., Han C., Al-Nafussi A.: Prognostic indicators for gastrointestinal stromal tumours: a clinicopathological and immunohistochemical study of 108 resected cases of the stomach. Histopathology 43: 118-126 (2003) 129. Yamamoto H., Oda Y., Kawaguchi K., Nakamura N., Takahira T., Tamiya S., Saito T., Oshiro Y., Ohta M., Yao T., Tsuneyoshi M.: c-kit and PDGFRA mutations in extragastrointestinal stromal tumor (gastrointestinal stromal tumor of the soft tissue). Am J Surg Pathol 28: 479-488 (2004) 130. Yang J., Du X., Lazar A.J., Pollock R., Hunt K., Chen K., Hao X., Trent J., Zhang W.: Genetic aberrations of gastrointestinal stromal tumors. Cancer 113: 1532-1543 (2008) 131. Yonaha M., Chibazakura T., Kitajima S., Yasukochi Y.: Cell cycle-dependent regulation of RNA polymerase II basal transcription activity. Nucleic Acids Res 23: 4050-4054 (1995) 132. Yoshida K., Miki Y.: Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage. Cancer Sci 95: 866-871 (2004) 133. Yuan J., Yan R., Kramer A., Eckerdt F., Roller M., Kaufmann M., Strebhardt K.: Cyclin B1 depletion inhibits proliferation and induces apoptosis in human tumor cells. Oncogene 23: 5843-5852 (2004) 134. Zhao M., New L., Kravchenko V.V., Kato Y., Gram H., di Padova F., Olson E.N., Ulevitch R.J., Han J.: Regulation of the MEF2 family of transcription factors by p38. Mol Cell Biol 19: 21-30 (1999) 72 Danksagung Danksagung Ich möchte Allen danken, die mich während den letzten drei Jahren bei der Erstellung dieser Arbeit unterstützt haben. Insbesondere gilt mein Dank meinem Doktorvater Herrn Prof. Uwe Knippschild für die stets offene Tür und das stets offene Ohr für Fragen, die schnellen Korrekturen, die Bereitstellung des Labors, sowie die Übernahme des Erstgutachtens. Ebenso sehr danke ich meinem Betreuer Herrn Dr. Klaus Kramer für die herzliche und freundschaftliche Betreuung, die vielen motivierenden Worte des Lobs und die Bereitschaft zu fast jeder Tages und Nachtzeit noch ein paar Extrastunden in die Forschung zu investieren. Auch allen medizinisch-technischen Assistentinnen im Labor der Chirurgischen Klinik und Frau Heidrun Hirner bin ich zu großem Dank verpflichtet für die engagierte Unterstützung bei meiner Arbeit und das nette Arbeitsklima. Des Weiteren danke ich Herrn Prof. Thomas Barth für die Hilfe bei der Etablierung der Cyclin H-Färbung und Frau Dr. Ursula Wegenka und Frau Rosi Rittelmann für die Zeit am qRT-PCR-Gerät. Außerdem möchte ich mich bei allen Doktoranden der Arbeitsgruppe GIST für die nette Zusammenarbeit und insbesondere bei Dr. Michael Schmieder für die Starthilfe auf dem Gebiet der Statistik bedanken. Und ich danke meinen drei Eltern, die an mich geglaubt und mir dadurch das Medizinstudium erst ermöglicht haben! 73 Curriculum vitae Curriculum vitae Julian Dorn Persönliche Daten Geburtsdatum 17. März 1983 Geburtsort Nürnberg Schulbildung 08.1989 – 06.2002 Besuch der Grundschule und des Gymnasiums in Erlangen 28.06.2002 Erwerb der Allgemeinen Hochschulreife Zivildienst 09.2002 – 06.2003 Herzchirurgische Klinik, Universitätsklinikum Erlangen CA Prof. Michael Weyand (Herzchirurgie) Universitätsausbildung 10.2003 – 11.2009 Studium der Humanmedizin an der Universität Ulm 26.09.2005 Erwerb des ersten Abschnitts der Ärztlichen Prüfung 08.2008 – 07.2009 Praktisches Jahr (Chirurgie, Innere Medizin und Anästhesie), Klinik an Eichert, Göppingen 20.11.2009 Erwerb des zweiten Abschnitts der Ärztlichen Prüfung 30.11.2009 Approbation als Arzt Wissenschaftliche Arbeit & Publikationen 11.2003 – 03.2004 Wissenschaftliche Hilfskraft am Institut für Geschichte und Ethik der Medizin, Universität Erlangen 11.2006 – 10.2010 Doktorand an der Klinik für Allgemein-, Viszeral- und Transplantationschirurgie, Universitätsklinikum Ulm 02.07.2010 Publikation: „Cyclin H expression is increased in GIST with very-high risk of malignancy“ BMC Cancer (Erstautorenschaft) Beruf 04.2010 Assistenzarzt in der Abteilung für Chirurgie, Klinik Mühldorf am Inn CA Dr. Wolfgang Richter (Allgemein-, Thorax- & Viszeralchirurgie) CA Dr. Stefan Trabhardt (Orthopädie und Unfallchirurgie) CA Dr. Reinhard Lerch (Gefäßchirurgie) 74