Vergleichende anti-neoplastische Charakterisierung der Substanz

Vergleichende anti-neoplastische
Charakterisierung der Substanz 2250 mit ihrer
Muttersubstanz Taurolidin - in vitro und
in vivo
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
an der Fakultät für Chemie und Biochemie
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Marie Buchholz
aus Bochum
Bochum, Februar 2016
Die Arbeit wurde durchgeführt in der
Klinik für Allgemein- und Viszeralchirurgie
St. Josef-Hospital Bochum
Klinikum der Ruhr-Universität Bochum
Direktor Prof. Dr. med. W. Uhl
In der Arbeitsgruppe „Inflammation und Tumorapoptose“
unter der Leitung von PD Dr. med. Ansgar M. Chromik
und in der Abteilung für Molekulare Gastroenterologische Onkologie (MGO)
am Zentrum für Klinische Forschung der Ruhr-Universität Bochum
unter der Leitung von Prof. Dr. Stephan Hahn
Referent:
Prof. Dr. Stephan Hahn
Korreferent:
Prof. Dr. Metzler-Nolte
Tag der Abgabe der Dissertation:
10.02.2016
Tag der Disputation:
22.04.2016
Seite | 2
Danksagung
Zunächst möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Waldemar Uhl bedanken, dass er mir die Möglichkeit
bot meine Promotionsarbeit in dieser Arbeitsgruppe durchzuführen.
Des Weiteren gilt mein besonderer Dank Herrn PD Dr. Ansgar Chromik für die gute und immer motivierende Betreuung der Arbeit. Auch für die stetige Diskussionsbereitschaft, die konstruktive Kritik
und das Engagement möchte ich mich herzlichst bedanken.
Auch bedanke ich mich bei Frau Annegret Flier und Frau Dr. Britta Majchrzak-Stiller für die gute und
freundschaftliche Unterstützung im Labor, die tolle Zeit und das humorvolle Arbeitsklima.
Ebenfalls gilt mein besonderer Dank Herrn Prof. Dr. med. Stephan Hahn und der gesamten Abteilung
für molekulare gastroenterologische Onkologie für die erhaltene Unterstützung und die umfangreiche sowie freundschaftliche Beratung.
Mein Dank gilt auch Prof. Dr. Nils Metzler-Nolte für die schnelle und unkomplizierte Übernahme des
Zweitgutachtens.
Für die Korrekturen und Anregungen rund um diese Dissertation danke ich besonders Herrn Dr.
Deepak Vangala, Frau Dr. Majchrzak-Stiller und Herrn PD Dr. Chris Braumann.
Mein größter Dank gilt meinem Freund Jan Voeste, meiner Familie und meinen Freunden für die
stetige Unterstützung in den letzten Jahren.
Seite | 3
Inhalt
1
ABBILDUNGSVERZEICHNIS ......................................................................................... 6
2
TABELLENVERZEICHNIS .............................................................................................. 9
3
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS...................................................................................... 10
4
ZUSAMMENFASSUNG /ABSTRACT ........................................................................... 12
5
EINLEITUNG............................................................................................................. 16
5.1
KREBSERKRANKUNGEN .............................................................................................................. 16
5.2
DAS PANKREASKARZINOM .......................................................................................................... 17
5.2.1 Grundlagen ...................................................................................................................... 17
5.2.2 Epidemiologie .................................................................................................................. 19
5.2.3 Klassifikation des Pankreaskarzinomes ........................................................................... 19
5.2.4 Symptomatik und Diagnostik........................................................................................... 21
5.2.5 Therapie des Pankreaskarzinoms .................................................................................... 22
5.2.6 Molekulare Grundlagen der Entwicklung entarteten Gewebes ...................................... 28
5.2.7 Das Tumorprogressionsmodell des Pankreaskarzinoms.................................................. 31
5.2.8 Allgemeine Therorien des Tumorwachstums................................................................... 33
5.2.9 Identifizierung von Tumorstammzellen ........................................................................... 35
5.2.10
Limitation der Standard (Chemo) Therapie beim hierearchischen Modell.................. 37
5.3
TAUROLIDIN UND DIE SUBSTANZ 2250......................................................................................... 41
5.3.1 Anti-mikrobielle und anti-inflammatorische Wirkung des Taurolidins ............................ 42
5.3.2 Taurolidin und Substanz 2250 als anti-neoplastische Substanz ...................................... 43
5.3.3 Taurolidin und Substanz 2250 im therapeutischen Einsatz beim Menschen ................... 45
5.3.4 Anti-neoplastische Wirkungsmechanismen..................................................................... 45
5.4
ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT ....................................................................................................... 48
6
MATERIAL UND METHODEN .................................................................................... 50
6.1
MATERIAL ............................................................................................................................... 50
6.1.1 Geräte .............................................................................................................................. 50
6.1.2 Chemikalien ..................................................................................................................... 51
6.1.3 Medien, Lösungen und Puffer .......................................................................................... 53
6.1.4 Antikörper und Farbstoffe ............................................................................................... 53
6.1.5 Komplettsysteme ............................................................................................................. 54
6.1.6 Zelllinien und Gewebe ...................................................................................................... 54
6.1.7 Mutationsstatus der analysierten Pankreaskarzinomzelllinien (KRAS und TP 53) .......... 55
6.1.8 Versuchstiere ................................................................................................................... 55
6.1.9 Tierfutter .......................................................................................................................... 55
6.1.10
Verbrauchsmaterialein ................................................................................................ 55
6.1.11
Computerprogramme.................................................................................................. 56
6.2
METHODEN ............................................................................................................................. 57
6.2.1 Zellbiologische Methoden ................................................................................................ 57
6.2.2 Physiologische und funktionelle Analysen ....................................................................... 67
6.2.3 In vivo Analysen ............................................................................................................... 71
6.2.4 Histologische Analysen .................................................................................................... 74
6.2.5 Statistische Analyse ......................................................................................................... 74
6.2.6 Ethische Betrachtung ....................................................................................................... 75
7
ERGEBNISSE ............................................................................................................ 76
7.1
ANALYSE DER ED50 UND DER DOSISABHÄNGIGEN ZYTOTOXISCHEN WIRKUNG DER SUBSTANZ 2250 ...... 76
7.2
ANALYSE DER DOSISABHÄNGIGEN PROLIFERATIONSHEMMUNG DER SUBSTANZ 2250 AUF
PANKREASKARZINOMZELLLINIEN............................................................................................................... 81
Seite | 4
7.3
ANALYSE DER APOPTOSEINDUKTION DER SUBSTANZ 2250 AUF MALIGNE PANKREASKARZINOM ZELLLINIEN
84
7.4
DER RADIKALFÄNGER N-ACETYLCYSTEINE (NAC) UND PANKASPASE INHIBITOR Z-VAD ZEIGEN
VERSCHIEDENE WIRKUNGEN AUF DEN DURCH DIE SUBSTANZ 2250 INDUZIERTEN ZELLTOD ................................ 86
7.5
UNTERSTÜTZENDE WIRKUNG DER SUBSTANZ 2250 MIT HYPERTHERMISCHEN TEMPERATURVERFAHREN . 90
7.6
ANALYSE DER WIRKUNG DER SUBSTANZ 2250 UND TRD AUF TUMORZELLEN MIT STAMMZELLÄHNLICHEN
CHARAKTER .......................................................................................................................................... 94
7.6.1 Möglichkeit der Anreicherung von Zellen mit stammzellähnlichem Charakter durch
Spheroid Formation ...................................................................................................................... 94
7.6.2 Mikroskopische Analyse der Spheroidkultur nach Behandlung mit den Substanzen 2250
und TRD......................................................................................................................................... 97
7.6.3 Analyse der CD133+ Population nach Behandlung mit den Substanzen 2250 und TRD im
Vergleich zum Chemotherapeutikum Gemzitabin ........................................................................ 98
7.7
PHARMAKOKINETISCHE DATEN DER SUBSTANZ 2250 IN DER MAUS ................................................ 101
7.7.1 Analyse der metabolischen Halbwertszeit der Substanz 2250 ...................................... 101
7.7.2 Detektion der maximal tolerierbaren Dosis der Substanz 2250 .................................... 102
7.8
DIE SUBSTANZEN TRD UND 2250 INDUZIEREN EINE REDUKTION DES SUBKUTANEN TUMORWACHSTUMS IN
VIVO
103
7.9
HISTOLOGISCHE ANALYSEN DES TUMORS BO 80 .......................................................................... 107
7.9.1 HE-Färbung .................................................................................................................... 107
DISKUSSION ...........................................................................................................110
8
8.1
VERGLEICHENDE CHARAKTERISIERUNG DER NEU ENTWICKELTEN SUBSTANZ 2250 MIT IHRER
MUTTERSUBSTANZ TAUROLIDIN – IN VITRO ............................................................................................. 111
8.1.1 Zelllinienauswahl ........................................................................................................... 111
8.1.2 Zytotoxische und proliferationsinhibierende Wirkung der Substanz 2250 .................... 111
8.1.3 Apoptose induzierenden Wirkung der Substanz 2250 ................................................... 114
8.2
FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG DER SUBSTANZ 2250 ........................................................... 115
8.2.1 Wege der Zelltodinduktion durch Substanz 2250 .......................................................... 116
8.2.2 Synergistische Effekte der Substanz 2250 mit hyperthermischen Verfahren ................ 118
8.3
ANTI NEOPLASTISCHE WIRKUNG DER SUBSTANZ 250 UND TRD IM HINBLICK AUF DAS STAMMZELLMODELL
120
8.3.1 Wahl des Kultivierungsmodells und der Zelllinien ......................................................... 120
8.3.2 Wirkung der Substanz 2250 und TRD im Hinblick auf die morphologische Struktur der
Spheroid Kulturen ....................................................................................................................... 121
8.3.3 Wirkung der Substanzen 2250 und TRD auf die CD 133+ Zellpopulation ....................... 121
8.4
ANTI-NEOPLASTISCHE WIRKUNG DER SUBSTANZEN 2250 UND TRD AM PANKREASKARZINOM IN VIVO . 123
9
10
SCHLUSSFOLGERUNG UND AUSBLICK......................................................................127
LITERATURVERZEICHNIS.......................................................................................... I
Seite | 5
1 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 5.1: Lage und Anatomie des Pankreas
13
Abbildung 5.2: Stadieneinteilung
17
Abbildung 5.3: Schematische Darstellung der medikamentösen Therapie des Pankreaskarzi- 19
noms
Abbildung 5.4: Intrazellulärer Wirkmechanismus des Gemcitabins
21
Abbildung 5.5: Überblick über die Kerncharakteristika von Krebszellen
25
Abbildung 5.6: Eines der Tumorprogressionsmodelle des Pankreaskarzinoms (pancreatic 28
intraepithelial neoplasia)
Abbildung 5.7: Die beiden Modelle des Tumorwachstums
31
Abbildung 5.8: Entwicklung der hierarchischen Struktur beim Therapieverlauf
34
Abbildung 5.9: Darstellung der Stammzell-assoziierten Signalwege sowie der therapeutischen
Targets der Tumorstammzelle
36
Abbildung 5.10: Metabolisierung von Taurolidin
39
Abbildung 5.11: Darstellung der Effekte des Taurolidins auf den intrinsischen Weg der 43
Apoptoseinduktion
Abbildung 6.1: Funktionsweise der Zellviabilitätsbestimmumg mittels MTT
56
Abbildung 6.2: Funktionsweise der Proliferationsbestimmung mittels BrdU
57
Abbildung 6.3: Funktionsweise durchflusszytometrischer Analysen
58
Abbildung 6.4: Schematische Darstellung der Änderung der Membranzusammensetzung bei
Apoptoseinduktion
60
Abbildung 6.5: schematische Darstellung der Impedanzmessung
62
Abbildung 6.6: Prinzip der Spheroidkultivierung
64
Abbildung 6.7: Zellpassage
64
Abbildung 6.8: Methodik der in vivo Wachstums-experimente
69
Abbildung 7.1: Zytotoxischer Effekt der Substanz 2250 auf verschiedene Pankreaskarzinom- 71
zelllinien gemessen mittels MTT-Assay
Abbildung 7.2: Zytotoxischer Effekt der Substanz 2250 auf verschiedene maligne
Pankreaskarzionom Zelllinien gemessen mittels MTT-Assay
72
Seite | 6
Abbildung 7.3: Vergleich des zytotoxischer Effekts der Substanz 2250 und der Substanz TRD
auf verschiedene maligne Pankreaskarzionom Zelllinien gemessen mittels MTT-Assay
74
Abbildung 7.4: Proliferationshemmung der Substanz 2250 auf verschiedene maligne 76
Pankreaskarzionom Zelllinien gemessen mittels BrdU-Assay
Abbildung 7.5: Vergleich der Proliferationshemmung vonSubstanz 2250 und TRD auf ver- 77
schiedene Pankreaskarzinomzelllinien gemessen mittels BrdU-Assay
Abbildung 7.6: Die Wirkung von 1000 µmol/l und 1500 µmol/l 2250 sowie 500 µmol/l und 78
1000 µmol/l TRD auf Vitalität, Apoptose und Nekrose in verschiedenen Pankreaskarzinomzelllinien
Abbildung 7.7: Auswirkungen von NAC auf den durch Substanz 2250 induzierten Zelltod in
verschiedenen Pankreaskarzinomzelllinien
80
Abbildung 7.8: Auswirkungen von NAC auf den durch die Substanz 2250 induzierten Zelltod in 81
verschiedenen Pankreaskarzinomzelllinien
Abbildung 7.9: Auswirkungen von zVAD auf den durch die Substanz 2250 induzierten Zelltod
in ver-schiedenen Pankreaskarzinom Zelllinien
82
Abbildung 7.10: Auswirkungen der Kombination der Substanzen 2250 bzw. TRD mit hyperthermischen Inkubationsverfahren (MTT-Assay)
84
Abbildung 7.11: Auswirkungen der Kombination der Substanzen 2250 bzw. TRD mit hyperthermischen Inku-bationsverfahren (FACS Analyse)
85
Abbildung 7.12: Auswirkun-gen der Kombination der Substanzen 2250 bzw. TRD mit hyperthermischen Inku-bationsverfahren
87
Abbildung 7.13: Resultate des Spheroid Formations Assays
88
Abbildung 7.14: Ergebnisse der Anreicherung CD 133+ Zellen von Panc-TuI durch multizelluläre Spheroid Kultivierung mittles FASC Analyse
90
Abbildung 7.15: Ergebnisse des Spheroid Toxizitäts Assays
90
Abbildung 7.16: Resultate der FACS Analyse der behandelten Spheroidkulturen
92
Abbildung 7.17: Resultate der FACS Analyse der behandelten Spheroid Kulturen
92
Abbildung 7.18: Kalibrierkurve der metabolischen Halbwertszeit Messung
94
Abbildung 7.19: Wirkung der Substanzen TRD und 2250 (500 mg/kg*KG) auf das subkutane
Tumorwachstum in Nacktmäusen in vivo
96
Abbildung 7.20: Wirkung der Substanzen TRD, 2250 (500 mg/kg*KG) und Gemcitabine
(50mg/kg*KG) auf das subkutane Tumorwachstum in Nacktmäusen in vivo – hier der Tumor
Bo80 aus Patientengewebe
98
Seite | 7
Abbildung 7.21: Bilder der histologischen Hämatoxylin-Eosin-Färbung
102
Abbildung 8.1: Zytotoxische Wirkung der entwickelten Oxathiazin Derivate in LN 229
Gliomzellen
103
Abbildung 8.2: Die postulierte anti-neoplastische Wirkung der Substanz TRD
110
Seite | 8
2 Tabellenverzeichnis
Tabelle 5.1: Übersicht der TNM-Einteilung des Pankreaskarzinoms noch UICC 2010
16
Tabelle 5.2: Übersicht der Stadieneinteilung des Pankreaskarzinoms nach UICC 2010
16
Tabelle 5.3: Marker zur Identifikation von Tumorstammzellen in soliden Tumoren
33
Tabelle 6.1: Absorptionsmaxima und Emissionsmaxima der Verbindungen AnnexinV-FITC,
TMRE und PI
61
Tabelle 6.2: Zusammensetzung des Stammzellmediums
65
Tabelle 7.1: Parameter zur Halbwertszeit Bestimmung der Substanz 2250
94
Tabelle 7.2: Ergebnisse der histologischen Hämatoxylin-Eosin-Färbung
100
Tabelle 8.1: Zelllinien maligner Tumoren, bei denen TRD in vitro eine anti-neoplastische Wirkung zeigt
106
Seite | 9
3 Abkürzungsverzeichnis
5-FU
5-Fluoruracil
AIF
Apoptosis inducing factor
Apaf-1
Apoptotic protease activating factor 1
Bax
Bcl-2–associated X protein
BrdU
Bromdesoxyuridin
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonucleotidsäure (acid)
et al
lat. et altera
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
FACS
Fluorescence activated cell sorting
FADD
Fas-associated protein with death domain
FasL
Fas Ligand
FCS
fetal calf serum
FITC
Fluoresceinisothiocyanat
IL-1
Interleukin 1
ip
intraperitoneal
iv
intravenös
LPS
Lipopolysaccharide
MTT
3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-Tetrazoliumbromid
NAC
N-Acetylcystein
PBS
phosphate buffered saline
po
peroral
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qRT-PCR
Quantitative real time polymerase chain reaction
ROS
Reactive oxygen species
TRD
Taurolidin
TRLT
Taurultam
zVad
carbobenzoxy-valyl-alanyl-aspartyl-[O-methyl]
Seite | 11
4 Zusammenfassung
Das duktale Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) ist mit einer 5-Jahres Überlebensrate von 4-5 %
und einer Gesamtletalität der Erkrankung von nahezu 100% eine der aggressivsten Krebserkrankungen. Unter den tödlich endenden Krebserkrankungen innerhalb Europas und den USA steht das Pankreaskarzinom an vierter Stelle. Die Inzidenz des Pankreaskarzinoms steigt mit zunehmendem Alter.
Außerdem gilt der Konsum von Alkohol und Zigaretten als gesicherter Risikofaktor für ein Pankreaskarzinom. Die chirurgische Resektion ist eine Möglichkeit der kurativen Therapie. Auf Grund des
schlechten Outcomes nach einer alleinigen Resektion ist eine adjuvanten Chemotherapie sehr wichtig. Dabei verlängern die Therapeutika Gemcitabin und 5-Fluorouracil das Gesamtüberleben. In vielen
Fällen ist allerdings eine vollständige Resektion des Tumors nicht mehr möglich und so ist auch der
Stellenwert der palliativen Chemotherapie sehr hoch. Hier werden häufig Kombinationstherapein der
vorhandenen Chemotherapeutika wie z.B. FOLFIRINOX eingesetzt. Die bisherigen chemotherapeutischen Agenzien sind dennoch auf Grund eines nicht optimalen Ansprechens und hoher Toxizität ernüchternd, deshalb ist die Entwicklung neuer und innovativer Substanzen sehr wichtig um die therapeutischen Optionen zu erweitern.
Daher wurde in dieser Arbeit die neu entwickelte Substanz 2250, welche ein Derivat des Hauptmetaboliten von TRD darstellt, erstmals im Hinblick auf ihre anti-neoplastische Wirkung gegenüber verschiedenen Pankreaskarzinom Zelllinien in vitro und in vivo charakterisiert. Bei der in vitro Charakterisierung
der
Substanz
2250
wurden
die
zytotoxischen,
proliferationshemmenden
und
apoptoseinduzierenden Effekte mittels MTT Assays, BrdU Assays und einer FACS Analyse untersucht.
Diese Untersuchungen zeigten, dass die Substanz 2250 eine mit der Muttersubstanz TRD vergleichbare
dosisabhängige
zytotoxische
sowie
proliferationsinhibierende
Wirkung
aufweist.
Die
durchflusszytometrischen Untersuchungen ergaben in Vergleich mit der Muttersubstanz TRD einen
erhöhten Anteil an nekrotischen Zellen nach der Behandlung mit 2250, welcher dosisabhängig anstieg. Eine mögliche Ursache dieser nekrotischen Zellen ist die Induktion einer programmierten Nekrose (Nekroptose). Dies ist ein weiterer Weg des programmierten Zelltods und wurde schon bei der
Muttersubstanz TRD nachgewiesen. In den folgenden funktionellen Analysen wurde die Beteiligung
von reaktiven Sauerstoff Spezies (ROS) und der Kaspase-Kaskaden am durch die Substanz 2250 induzierten programmierten Zelltod näher betrachtet. Dazu wurden Kombinationstherapien entweder
mit dem Radikalfänger N-Acetylcystein (NAC) oder dem Pan Kaspase Inhibitor zVAD durchgeführt. Es
zeigte sich in den analysierten Pankreaskarzinom Zelllinien, dass der oxidative Stress eine wesentliche Rolle bei dem durch die Substanz 2250 induzierten Zelltod spielt. Die große Bedeutung der reaktiven Sauerstoff Spezies bei dem durch die Substanz 2250 induzierten Zelltod wird durch die vorheri-
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gen Ergebnisse der FACS Analyse untermauert. Hier wurde eine stark erhöhte Anzahl nekrotischer
Zellen nach der Behandlung mit der Substanz nachgewiesen und oxidativer Stress gilt als ein Auslöser
der programmierten Nekrose (Nekroptose). Im Gegensatz dazu war die Induktion des programmierten Zelltods durch die Kaspase-Kaskaden von geringerer Bedeutung bei den analysierten Pankreaskarzinom Zelllinien.
Des Weiteren wurden in dieser Studie erstmals die Effekte der Substanzen 2250 und TRD auf Zellen
mit stammzellähnlichem Charakter analysiert. Um die putativen Stammzellen anzureichern wurde
die Kultivierung der Zellen in einem 3D-Spheroidmodell durchgeführt. Zur Analyse der putativen
Stammzellen wurde der Marker CD133 verwendet. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Substanzen 2250 und TRD den Anteil der CD133+ Zellen im Gegensatz zu den Chemotherapeutikum
Gemcitabin bei den analysierten Spheroid Modellen veringerten.
Nach diesen vielversprechenden in vitro Ergebnisse wurden in vivo Versuche mit den Substanzen
2250 und TRD angeschlossen. Diese erfolgten in athymischen Nacktmäusen. Es wurden sowohl
Xenograft Modelle aus etablierten Zelllinein als auch PDX Modelle verwendet. Es zeigte sich, dass die
Monotherapien mit den Substanzen 2250 und TRD zwar zu einer Reduktion des Tumorwachstums
führten dennoch war nach den RESICT Kriterien ein Tumorprogress zu erkennen. Ebenfalls wurde ein
Vergleich der Substanzen 2250 und TRD mit dem Chemotherapeutikum Gemcitabin, sowie Kombinationsbehandlungen mit dem Chemotherapeutikum Gemcitabin und den analysierten Argenzien
durchgeführt. Dabei war bei dem Chemotherapeutikum Gemcitabin nach einem anfänglichen Progress bis zu einem doppelten Volumen des Ausgangstumors kein weiteres Wachtum erkennbar. Die
Kombinationtherapein sellten sich dabei als sehr hoffnungsvoll heraus, denn es konnte eine partielle
Remission des Tumorvolumens um 50% erreicht werden. Somit kann man bei diesen beiden Kombinationstherapien laut RECIST Kriterien von einem partial response (PR) sprechen, denn es kam zu
einer ≥ 30%iger Abnahme des relativen Tumorvolumens.
Zusammenfassend zeigt diese erste Studie zur Charakterisierung der Substanz 2250 das große antineoplastische Potential dieser Substanz. Damit stellt die Substanz 2250 vor allem in Kombination mit
dem Chemotherapeutikum Gemcitabin eine vielversprechende Option in der onkologischen klinischen Therapie des Pankreaskarzinoms dar.
Seite | 13
4 Abstract
Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is the most lethal common cancer, usually diagnosed at an
advanced stage when curative therapy is almost impossible. It is the fourth most common cause of
cancer-related death in Europe and in the US. The pancreatic adenocarcinoma typically has a poor
prognosis with a five year relative survival rate of 4-5%. In fact, incidence and mortality of PDAC are
almost equal. Surgical resection is the only potentially curative therapy for pancreatic cancer. Because of the poor outcome associated with surgery only, the role of adjuvant therapies has been
extensively evaluated. A series of studies revealed, that chemotherapy with gemcitabine or fluorouracil improves the overall survival of patients with pancreatic adenocarcinoma. In the majority of
cases a complete resection of the tumor is impossible. Therefore a palliative chemotherapy may be
conducted to prolong survival and improve the quality of life. In these cases new combination therapies like FOLFIRINOX are investigated in clinical trails or are in use. However, current chemotherapeutic agents are still disappointing due to their poor response and high toxicity. New and innovative
agents have to be found to expand the therapeutic opportunities.
Therefore the aim of this study was to characterise the anti-neoplastic effect of the recently developed substance 2250, which is a derivative of the main metabolite of TRD, in different pancreatic
cancer celllines in vitro and in vivo. In the first part of this study we determined the cytotoxic effects,
the inhibition of proliferation and analyzed the relative contribution of apoptosis and necrosis during
substance 2250 induced cell death by MTT assay, BrdU assay and FACS analysis. It could be shown,
that the substanz 2250 has comparable cytotoxic and proliferation inhibiting effects like its
mothersubstanz TRD. The flowcytometric analysis resulted in a higher amount of necrotic cells after
treatment with substance 2250. A possible explanation for this effect is the induction of programmed
necrosis (necroptosis). Programmed necrosis is, besides apoptosis and autophagy, another type of
programmed cell death, which was previously shown for TRD. The next part of this study deals with
the contribution of reactive oxygen species (ROS) to substance 2250 induced cell death and the analysis of another major cell death associated pathway, the caspase pathway. Hence, co-incubation
experiments with either the radical scavenger NAC for inhibition of oxidative stress or the pan
caspase inhibitor z-VAD for involvement of the caspase pathway were performed. It could be shown,
that the generation of ROS and the consequent activation of following pathways is an obvious explanation of the induction of cell death by substance 2250 in pancreatic cancer cell lines. Thus, ROS induced cell death may not be the universal mechanism of substance 2250, but our experiments highlight its central role in PCD. The major importance of ROS generation via cell death induction of substance 2250 was underlined by the previous results of FACS analysis, which showed a high amout of
necrotic cells, because ROS triggers the necroptosis. In contrast the observed response in pancreatic
Seite | 14
cancer cell lines regarding the inhibition of 2250 induced cell death, via the pan-caspase inhibitor
zVAD, leads to the assumption, that especially for pancreatic cancer cell lines the caspase dependent
PCD plays only a minor role.
Furthermore the anti-neoplastic effect of substance 2250 and TRD to putative cancer stem cells was
analysed for the first time. The cells were cultivated in a 3D-spheroide model, which was able to enrich the putative cancer stem cells. For analysing the stem cell marker CD133 was used. Thereby it
was shown that both substances in contrast to the chemotherapeutic agent gemcitabine were able
to reduce the amount of CD133+ cells.
On the basis of this foregone promising in vitro results, we analysed the anti-neoplastic effects of
substance 2250 and TRD in vivo. For the experiments xenograft models of established pancreatic
cancer cell lines and PDX models were used in athymic nude mice. A significant reduction of subcutaneous tumor growth by treatment with substance 2250 or TRD could be observed, however according to RECIST 1.1 criteria a tumor progress was still noticed. In addition, the chemotherapeutic agent
gemcitabine and combinations of gemcitabine with substance 2250 and TRD were analysed. After a
first progress until the tumorvolume was doubled no further tumorgrowth could be observed after
treatment with gemcitabine. The combinations of gemcitabine and substance 2250 resp. TRD were
the most hopeful treatments with an according to RECIST 1.1 criteria partial response.
In conclusion, this is the first study providing an evaluation of substance 2250 induced cell death
among several pancreatic cancer cell lines in vitro as well as inhibition of pancreatic tumor growth in
vivo. Substance 2250 is characterized by a clear anti-neoplastic potential. Therefore substance 2250
especially in combination with gemcitabine seems to effectively inhibit pancreatic cancer tumor
growth in mice. These encouraging results are the basis for a further evaluation of substance 2250 as
a promising new therapeutical option in the treatment of pancreatic cancer.
Seite | 15
Einleitung
5 Einleitung
5.1 Krebserkrankungen
Krebserkrankungen sind nachwievor eine der größten Herausforderungen der modernenen Medizin.
Mit 14 Millionen Neuerkrankungen und 8,2 Millionen Todesfällen allein im Jahr 2012 sind Krebserkrankungen eine der häufigsten Todesursachen weltweit [World Cancer Report, 2014]. In Industriestaaten sind Krebserkrankungen nach den Herz-Kreislauf-Erkrankungen die häufigste Todesursache.
Im Jahr 2014 ergaben sich durch Krebserkrankungen 229.800 Todesfälle und damit 27 % aller Todesfälle in Deutschland [WHO, Cancer Country Profiles, 2014]. Trotz intensiver Erforschung der Ursachen
und Grundlagen sowie einer stetig steigenden Entwicklung der diagnostischen Maßnahmen und Therapien wird eine Steigerung der Neuerkrankungen um 70% in den nächsten 20 Jahren erwartet
[World Cancer Report, 2014].
Krebs ist heutzutage eine allgemeine Bezeichnung für bösartige Tumore, die durch das unkontrollierte Wachstum entarteter Zellen entstehen. Bei einem Tumor (lat. Wucherung, Schwellung) handelt es
sich um eine abnormale Gewebeneubildung, auch Neoplasie genannt, die sowohl gutartig (benigne)
als auch bösartig (maligne) sein kann und in jedem Gewebe auftreten kann. Tumoröse Veränderungen sind wie oben bereits erwähnt durch ein abnormales Zellwachstum (Proliferation) gekennzeichnet. Bei benignen Neoplasien wird das benachbarte gesunde Gewebe meist nur verdrängt. Im Gegensatz dazu können maligne Tumoren die Basalmembran durchbrechen und so das umliegende
Gewebe infiltrieren, sowie in Blut- und Lymphgefäße eindringen. Dadurch können Aussiedlungen
(Metastasen) in entfernt gelegenen Geweben gebildet werden. Dieser Metastasierungprozess in
entfernte Organe ist eine der Hauptursachen der hohen Sterblichkeitsrate vieler Krebserkrankungen
(WHO, Cancer, Fact sheet N°297).
Die Klassifizierung der Krebserkrankungen erfolgt grundlegend nach dem Keimblatt aus dem das
entartete Gewebe des Primärtumors stammt. Dabei lassen sich grundsätzlich zwei Hauptgruppen
unterscheiden, die mesenchymalen Tumore wie Sarkome und die Tumore ephitelialen Ursprungs wie
Karzinome. Diese differenzieren sich nochmals anhand des entarteten Ephitels. Die meisten Karzinome gehen entweder von Plattenepithelien, oder von Drüsenephitelien aus und werden dementsprechend Plattenepithelkarzinome oder Adenokarzinome genannt [Weinberg et al, 2013].
Seite | 16
Einleitung
Vor allem für die Therapie und die Prognose sind diese Einteilungen von großer Bedeutung, denn
verschiedenen Tumore reagieren oft nicht gleich auf unterschiedliche Therapiemodalitäten. Zusätzlich sind weitere Klassifikationen wie TNM, UICC und Differenzierung des genetischen Profils von
großer Bedeutung für Therapie und Prognose.
5.2 Das Pankreaskarzinom
5.2.1 Grundlagen
Abbildung 5.1: Lage und Anatomie des Pankreas
Das Pankreas ist ein Drüsenorgan, welches im Retroperitonealraum gelegen ist und aus drei Kompartimenten
besteht: dem Kopf (Caput pancreatis), dem Körper (Corpus pancreatis) und dem Schwanz (Cauda pancreatis)
[Terese Winslow]
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Einleitung
Die Bauchspeicheldrüse (Pankreas) ist ein 15-20 cm langes, 3-4 cm breites und 1-2 cm dicker Drüsenstrang mit einem Gewicht von 60 – 120 g. Es ist eines der wichtigsten Drüsenorgane des menschlichen Körpers mit zwei unterschiedlichen Funktionen: der endokrinen und der exokrinen. Der endokrine Teil besteht aus den Langerhans’schen Inseln welche sich unter anderem aus α-Zellen, β-Zellen,
δ-Zellen und PP-Zellen zusammensetzen. Diese Zellen produzieren verschiedene Hormone. Dazu
gehören Insulin (β-Zellen), Glukagon (α-Zellen), Somastatin (δ-Zellen) sowie das pankreatische
Polypeptid (PP-Zellen). Insulin und Glukagon sind Antagonisten und regulieren unter anderem den
Blutzuckerspiegel. Somastatin wird als Inhibiting-Hormon des Hypothalamus bezeichnet und inhibiert
unter anderm das Wachstumshormon Somatotropin, ebenfalls hemmt es auch die Freisetzung der
Hormone Insulin und Glucagon. Das pankreatische Polypeptid ist auch ein Hormon und hemmt die
Enzym und Hydrogencarbonatproduktion des Pankreas sowie die Motilität des Darms und den Gallenfluss. Das exokrine Gewebe umgibt die Langerhans’schen Inseln und macht den Großteil des Pankreas aus. Das exokrine Gewebe besteht aus locker zusammenhängenden Läppchen. Diese Läppchen
enthalten wiederum mehrere, von sekretproduzierenden Zellen umgebene Drüsenkörperchen
(Azini). Die Ausführungsgänge der Azini münden letztendlich in den wenige Millimeter dicken Hauptausführungsgang (Ductus pancreaticus). Dieser verläuft durch das gesamte Pankreas und mündet an
der Papilla vateri major gemeinsam mit dem grossen Gallengang ins Duodenum (zusätzlich sind Varianten, wie z.B. das inkomplette/komplette pancreas divisum bekannt). Die in den Azini gebildeten
Vorläufer der Verdauungsenzyme (Zymogene) werden durch den Ductus pancreaticus ins Duodenum
sezerniert und tragen so zur Aufspaltung der Nahrungsbestandteile bei. Zu den synthetisierten Enzymen zählen Peptidasen, Lipasen, Amylasen, Glukosidasen und Nukleasen. Es werden täglich bis zu
2 Liter Bauchspeichel mit einem pH-Wert von 8-8,4 produziert. Nach der Durchmischung mit dem
Nahrungsbrei (Chymus) liegt der pH-Wert bei 7-8, was für die Aktivität der Enzyme optimal ist [LPN
Anatomie, 2011].
Aufgrund der physiologischen und zytologischen Diversität des Pankreas sind unterschiedliche Krebsentitäten des Organs mit verschiedenen histologischen Eigenschaften bekannt. Etwa 90-95 % der
malignen Bauchspeicheldrüsentumoren entstehen durch eine Umwandlung der epithelialen Zellen,
welche die kleinen Ausführungsgänge der exokrinen Drüsen auskleiden. Diese weisen duktale Differenzierungskennzeichen auf (duktales Adenokarzinom des Pankreas, PDAC). Deutlich seltener sind
die sogenannten neuroendokrinen Tumoren (NET), die von den hormonproduzierenden Zellen der
Langerhans-Inseln ausgehen [Burris et al, 1997; Schoppmeyer et al, 2004].
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Einleitung
5.2.2 Epidemiologie
Ein Karzinom ist eine maligne tumoröse Transformation eines Gewebes epithelialen Ursprungs.
Dementsprechend ist das Pankreaskarzinom der Oberbegriff für maligne Entartungen ephitelialen
Ursprungs der Bauchspeicheldrüse (Pankreas).
Das duktale Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) ist eine der aggressivsten Krebserkrankungen, die
häufig erst im fortgeschrittenen Stadium, wenn eine kurative Therapie meist unmöglich ist, diagnostiziert wird [David et al, 2014]. Unter den tödlich endenden Krebserkrankungen innerhalb Europas
und den USA steht das Pankreaskarzinom an vierter Stelle [Malvezzi et al, 2013; American Cancer
fact sheet] Daher hat es eine schlechte Prognose mit einer 5-Jahres Überlebensrate von 4-5 % und
einer Gesamtletalität der Erkrankung von nahezu 100%.
Die Inzidenz des PDAC in Deutschland beträgt etwa 13,5/100.000/Jahr wobei die Geschlechterverteilung bei 8,1/5,4 (Verhältnis m/w) liegt. Die Inzidenz steigt mit zunehmendem Alter und findet ihren
Erkrankungsgipfel zwischen der 7. und 8. Lebensdekade [Hail et al, 2006; Mayer et al, 2002;
Schoppmeyer et al, 2004].
Die Inzidenz des Pankreaskarzinoms steigt mit zunehmendem Alter. Außerdem gilt der Konsum von
Alkohol und Zigaretten als gesicherter Risikofaktor für ein Pankreaskarzinom. Als weitere Risikofaktoren gelten Vorerkrankungen wie Diabetes mellitus und chronische Pankreatitis sowie auch eine fettreiche Ernährung. Des Weiteren besteht für Verwandte eines PDAC Patienten ein erhöhtes Risiko,
denn Studien zufolge gibt es in 5-10 % der Fälle eine mögliche genetische Prädisposition. [S-3 Leitlinie; Mayer et al, 2002; Saif et al, 2007; Schoppmeyer et al, 2004; Rieder et al, 2002].
5.2.3 Klassifikation des Pankreaskarzinomes
Eine Einteilung erfolgt generell nach pathoanatomischen Kriterien: Die UICC (Union for International
Cancer Control) veröffentlichte 2010 die aktuelle Klassifikation des Pankreaskarzinoms entsprechend
des pathoanatomischen Befundes. Diese als TNM (T=Tumor, N=Node, M=Metastasis) bezeichnete
Klassifikation gibt Hinweise über die Operabilität, die möglichen Behandlungsalternativen und die zu
erwartende Prognose.
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Einleitung
Tabelle 5.1: Übersicht der TNM-Einteilung des Pankreaskarzinoms noch UICC 2010
Primärtumor
TX
Primärtumor kann nicht beurteilt werden
T0
Kein Anhalt für Primärtumor
Tis
Carcinoma in situ ( Inkl. PanIN-III-Läsionen)
T1
Tumor begrenzt auf Pankreas, 2 cm oder weniger im größter Ausdehnung
T2
Tumor begrenzt auf Pankreas, mehr als 2 cm im größter Ausdehnung
T3
T4
Tumor breitet sich jenseits des Pankreas aus, jedoch ohne Infiltration des Truncus
coeliacus oder der A. mesenterica superior
Tumor infiltriert Truncus coeliacus oder A. mesenterica superior
Regionäre Lymphknoten
NX
Regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden
N0
Keine regionären Lymphknoten-Metastasen
pN0
N1
Regionäre Lymphadenektomie und histologische Untersuchung üblicherweise von 10
oder mehr Lymphknoten
Regionären Lymphknoten-Metastasen sind vorhanden
Metastasen
M0
keine Fernmetastasen
M1
Fernmetastase(n)
Die Zusätze vor dem „TNM“, verweisen auf die Methode(n), die zur Erhebung dieses Befundes
angewandt wurde(n) (p: pathologisch, c: clinical, u: ultrasound...). Anhand der TNM Klassifikation
erfolgt eine weitere Einteilung nach Stadien gemäß der UICC. Diese Einteilung wird auch für die Abschätzung der Prognose sowie zur Festlegung von Therapierichtlinien (Tabelle 5.2) genutzt.
Tabelle 5.2: Übersicht der Stadieneinteilung des Pankreaskarzinoms nach UICC 2010
Stadieneinteilung
Stadium 0
Tis
N0
M0
Stadium I A
T1
N0
M0
Stadium I B
T2
N0
M0
Stadium II A
T3
N0
M0
Stadium II B
T1-3
N1
M0
Stadium III
T4
Jedes N
M0
Stadium IV
jedes T
jedes N
M1
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Einleitung
Abbildung
Stadieneinteilung
5.2:
Es sind die unterschiedlichen
Stadien
des
Pankreaskarzions zu sehen.
Im Stadium IA ist der Tumor
≤ 2 cm, in Stadium IIB > 2
cm, in Stadium IIA breitet
sich der Tumor schon jenseits des Pankreas aus, allerdings ohne Infiltration
des Truncus coeliacus oder
der A. mesenterica superior.
In Stadium III hingegen
kommt es zu einer Infiltration des Trucus coeliacus
oder der A. mesenterica
superior [Terese Winslow].
df
5.2.4 Symptomatik und Diagnostik
Die klinische Symptomatik des Pankreaskarzinoms ist unspezifisch und tritt im Verlauf der Tumorerkrankung meist erst spät auf. Häufige Symptome sind Verschlussikterus, Gewichtsverlust, Oberbauchschmerzen und Rückenschmerzen. Zur Klärung eines Tumorverdachts sind unterschiedliche
Verfahren geeignet wie Abdomen-Sonographie, Endosonographie – ggf mit Tumor-Probenentnahme,
Computertomographie des Pankreas (CT), Magnetresonanztomographie (MRT) mit Darstellung des
Pankreas-
und
Gallengangssystems
(MRCP)
oder
eine
endoskopisch
retrograde
Cholangiopankreatikographie (ERCP). Die bildgebende Diagnostik ist entscheidend für die
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Einleitung
Stadieneinteilung und somit auch für die Wahl des Therapieverfahrens [Scaduto et al, 2004; Schlag et
al, 2001; Wigmorde et al, 1997]
5.2.5 Therapie des Pankreaskarzinoms
5.2.5.1
Chirurgische Therapie des Pankreaskarzinoms
Grundsätzlich ist der einzige kurative Ansatz die operative Entfernung des Tumors. Bei Diagnosestellung sind nur 10-20 % der Pankreaskarzinome operabel [Schoppmeyer et al, 2004]. Als operabel gelten nicht metastasierte Tumore, die die Arteria mesenterica superior und den Truncus coeliacus nicht
infiltrieren (UICC Stadien Ia, Ib, IIa). Der endgültige Entscheid über die Resektabilitat ist oft erst intraoperativ möglich. Die Verfahren der Wahl sind die klassische (Kausch)-Whipple-Operation (magenresezierende partielle Duodenohemipankreatektomie) und die pyloruserhaltende WhippleOperation. Gleichzeitig werden die regionären Lymphknoten ausgeräumt [Cameron et al, 2006;
Stendel et al, 2004]. Die Tumorfreiheit der Resektionsränder (sog. R-Status) ist für die Prognose entscheidend, denn ein Großteil der duktalen Adenokarzinome des Pankreaskopfes rezidiviert. Trotz
verbesserter chirurgischer und onkologischer Therapien liegt im Allgemeinen das Langzeitüberleben
nach einer kurativen Resektion noch unter 20%, wobei in spezialisierten Zentren nach multimodaler
Therapie auch 5-Jahres Überlebensraten von 25-30 % erreicht werden können [Jacobsen et al, 1968].
5.2.5.2
Medikamentöse und radiologische Therapie des Pankreaskarzinoms
Die medikamentöse Therapie des Pankreaskarzinoms hat sich durch neue Substanzen und neue
Kombinationsprotokolle in den letzten Jahren deutlich verändert. Während nach kurativ intendierter
Operation weiterhin die adjuvante Monotherapie mit entweder Gemcitabine oder 5-Fluoruracil über
6 Monate als Standardtherapie angesehen werden kann, werden bei Patienten mit inoperablen Tumoren neuerdings entweder aggressive Kombinationstherapien aus Oxaliplatin, Irinotecan, und 5-FU
[Conroy et al, 2011] oder Gemcitabine mit nab-Paclitaxel eingesetzt [Goldstein et al, 2015]. Damit
konnte das Gesamtüberleben (OS, overall survival) mit FOLFIRINOX auf 11,1 Monate und mit nabPac/ Gem auf 8,7 Monate im Vergleich zu 6,7 Monaten mit Gemcitabine Monotherapie verlängert
werden. Die Erstlinienbehandlung mit FOLFIRINOX ist allerdings nur bei einem günstigen Risikoprofil
(ECOG 0-1, Bilirubinwert unter dem 1,5-fachen des oberen Normwertes, Alter bis 75 Jahre) zu empfehlen. Verglichen mit anderen Tumorentitäten sind die Gesamtüberlebensdaten jedoch unbefriedigend. Nichtsdestotrotz zeigte sich erstmals überhaupt eine Entwicklung in der Erstlinienbehandlung
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Einleitung
des fortgeschrittenen Pankreaskarzinoms, die unter anderem dazu führte, dass Zweitlinientherapien
mittlerweile in der Klinik angewendet- und in prospektiven Studien untersucht werden.
Auch neuere medikamentöse Therapiekonzepte konnten erste Erfolge zeigen: so etwa die Kombination vom EGFR-Tyrosinkinaseinhibitor Erlotinib und Gemcitabine [Heinemann et al, 2013]. Das Gesamtüberleben (OS) mit Gemcitabine/Erlotinib konnte auf 8,0 Monate im Vergleich zu 6,7 Monaten
mit Gemcitabine Monotherapie dokumentiert werden. Ein Hauptmerkmal eines Ansprechens korreliert hierbei direkt mit dem Auftreten eines Hautausschlags. Bleibt dieser nach einer Behandlungsdauer von 8 Wochen aus sollte die Gabe von Erlotinib beendet werden, da von einem fehlenden Effekt ausgegangen werden muss.
Abbildung 5.3: Schematische Darstellung der medikamentösen Therapie des Pankreaskarzinoms
Gezeigt wird das medikmentöse therapeutische Schema der Behandlung des Pankreaskarzinoms, dabei gibt es
bei der Therapie zwei Einteilungen: resektabel oder nicht resektabel. Daran orientiert sich sowohl die Erstlinien- als auch die Zweitlinientherapie
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Einleitung
Therapeutika
Zytostatika
Zytostatika sind natürliche oder synthetische Substanzen, die das Zellwachstum beziehungsweise die
Zellteilung hemmen. Das Wirkungsprinzip beruht auf unterschiedlicher Beeinflussung des Stoffwechsels von Zellen, deren Zellteilung dadurch verzögert beziehungsweise verhindert wird. Sie schädigen
somit vor allem schnell teilende Zellen und können daher zur Behandlung von malignen Tumoren
eingesetzt werden [Burris et al, 1997].
Im Folgenden wird auf die Zytostatika näher eingegangen, welche bei der Behandlung von Pankreaskarzinomen verwendet werden.
Gemcitabin
Gemcitabin (2',2'-Difluordesoxycytidin) ist ein Nukleosid aus Cytosin und einer difluorierten Desoxyribose. Es wird in die Gruppe der Antimetabolite eingeordnet und gehört zu den Pyrimidinanaloga
(Cytidinanalogon). Es wird erst intrazellulär durch spezifische Enzyme zu seinen wirksamen Formen
umgewandelt, dabei wird es durch die Desoxycytidinkinase (hier das limitierende Enzym) zuerst zu
Gemcitabinmonophosphat (dFdCMP) und anschließend weiter zu Gemcitabindiphosphat (dFdCDP)
und Gemcitabintriphosphat (dFdCTP) phosphoryliert [Heinemann et al, 1988; Gandhi et al, 1990].
Somit handelt es sich um ein klassisches Prodrug. Die zytostatische Wirkung von Gemcitabin basiert
auf zwei Wirkmechanismen zur Inhibition der DNA Synthese: zum einen den indirekten Mechanismus,
bei
dem
dFdCDP
die
Ribonucleotidreduktase
(RR),
welche
die
Desoxynukleotidtriphosphatsynthese katalysiert, hemmt und somit die Konzentration an
Desoxynukleotidtriphosphaten, die für die DNA Synthese benötigt werden, verringert. Ein niedriger
Desoxycytidintriphosphat (dCTP) Spiegel wiederum verstärkt die Phosphorylierung des Gemcitabins
[Heinemann et al, 1990; Plunkett et al, 1996]; Zum anderen den direkten Mechanismus, welcher
darauf zurückzuführen ist, dass das dFdCTP beim Einbau in die DNA mit den natürlichen dCTP konkurriert. Dies ist der maßgebende Mechanismus für die Toxizität. Durch den reduzierten Anteil an
dCTP kommt es weiterhin zu einer Selbstpotenzierung des Effekts [Huang et al, 1991; Huang et al,
1995]. Das DNA-Reparatursystem, die DNA-Polymerase Epsilon, welche Exonukleaseaktivität besitzt,
kann das modifizierte Nukleotid nicht entfernen. Wird nun nach einem Gemcitabintriphosphat mehr
als ein Nukleotid in die DNA eingebaut, folgt ein maskierter Kettenabbruch – die DNA-Polymerase
kann die Transkription nicht fortführen, was zu einem Abbruch der DNA-Synthese führt [Burris et al,
1997; Huang et al, 1995; Lehmann et al, 2003].
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Einleitung
Abbildung 5.4: Intrazellulärer Wirkmechanismus des Gemcitabins
Gemcitabindiphosphat, eine der aktiven Wirkformen von Gemcitabin, hemmt die Desoxycytidinsynthese und
verstärkt somit den Einbau von gemcitabintriphosphat in die DNA, welcher zu einem Abbruch der Transkription durch einen Stop der DNA-Polymerase führt [adaptiert nach Lehmann et al, 2003].
Die Wirksamkeit des Gemcitabins ist von der Dosis, aber auch von der Infusionsdauer abhängig. Die
weitere Metabolisierung erfolgt in der Leber und im Blut, dort wird Gemcitabintriphosphat abgebaut
und dann über die Niere ausgeschieden. Die biologische Halbwertzeit ist abhängig vom Geschlecht
und Alter des Patienten. Sie beträgt etwa 40–90 Minuten [Burris et al, 1997b].
Häufige
Nebenwirkungen
von
Gemcitabin
sind
Knochenmarkschädigung
(Leukopenie,
Thrombocytopenie), Übelkeit, Erbrechen sowie andere gastrointestinale Symptome, Mukositis, Anstieg der Leberenzyme, allergische Exantheme sowie Haarausfall. Ebenso kann es zur Nierenschädigung bis hin zum Nierenversagen kommen [Burris et al, 1997a, Katz et al, 2009]. Dennoch weist
Gemcitabin bei ähnlicher Wirksamkeit eine bessere Verträglichkeit als 5-FU auf.
Weitere Chemotherapeutika für die Therapie des Pankreaskarzinoms
Zu den weiteren Chemotherapeutika, die häufig beim Pankreaskarzinom eingesetzt werden, gehören
5-Fluoruracil, Oxaliplatin, nab-Paclitaxel und Irinotecan [Burries et al, 1997b; Rosman et al, 1996].
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Fluorouracil (INN), auch 5-Fluoruracil (5-FU) ist ein Fluoropyrimidin und damit ein Analogon der
Nukleinbase Uracil. Es ist ebenfalls ein Antimetabolit, der bei der Zellteilung aufgrund der Strukturähnlichkeit mit den Pyrimidinbasen Cytosin und Thymin (DNA-Nukleotide) beziehungsweise Uracil
(RNA-Nukleotid) anstatt dieser in die DNA bzw. RNA eingebaut wird. Die so entstehende DNA ist
nicht funktionsfähig. 5-FU hemmt darüber hinaus die RNA- und DNA-Synthese auf verschiedenen
Ebenen. Zum Beispiel hemmt 5-FU die Thymidylat-Synthase und somit die Methylierung der
Desoxyuridyl-Säure zu Thymidyl-Säure. Diese ist für die Bereitstellung der Pyrimidine für die DNASynthese notwendig.
Auch bei diesem Chemotherapeutikum können die Nebenwirkungen (Übelkeit, Erbrechen, Schleimhautentzündungen, Knochenmarkschädigung) beträchtlich sein [Burris et al, 1997a].
Oxaliplatin ist eine antineoplastische Substanz und gehört zu einer neueren Klasse von PlatinDerivaten, bei denen das Platinion mit 1,2-Diaminocyclohexan und einer Oxalatgruppe komplexiert
ist. Oxaliplatin ist ein reines Enantiomer, das cis-[oxalato(trans-L-1,2-Diaminocyclohexan)platin].
Die Wirkung der Platinkomplexe beruht auf einer Reaktion mit der DNA und daraus folgend auf einer
Hemmung der Zellteilung. In wässrigen Medien, wie auch den Körperflüssigkeiten, entstehen durch
Hydrolyse des jeweiligen Komplexes einfach oder zweifach geladene Platin-Wasserkomplexe, die mit
nucleophilen Zentren anderer Moleküle, wie der DNA reagieren. Im Falle der DNA hat dies eine
Quervernetzung mit anschließender Funktionsunfähigkeit zur Folge.
Die häufigsten Nebenwirkungen von Oxaliplatin sind Durchfall, Übelkeit, Erbrechen und Entzündungen der Schleimhäute, Veränderungen des Blutbilds und neurologische Missempfindungen. Die beiden letzten Nebenwirkungen sind häufig dosislimitierend [S3 Leitlinie, 2013].
Irinotecan ist ein semisynthetisches Derivat des natürlichen Pflanzeninhaltsstoffes Camptothectin,
dabei handelt es sich um ein Alkaloid. Pharmakologisch ist Irinotecan ein Topoisomerase-I Hemmer.
Irinotecan ist ein Prodrug und wird vor allem in der Leber mittels Carboxylesterase durch die Spaltung der Carbamatverbindung zum aktiven Metaboliten SN 38 umgesetzt, er besitzt eine bis zu 1000
fach zytotoxischere Wirkung als die Vorstufe [Santos et al, 2000; Mathijssen et al, 2002; Chu et al.,
1998].
Irinotecan und seine Metabolite wie SN 38 lagern sich an den Topoisomerase-I–DNA-Komplex an,
stabilisieren ihn und verhindern somit den Wiederverschluss des erfolgten Einzelstragbruchs. In Folge
dessen entstehen Doppelstrangbrüche. Daduch wird der Prozess der Zellteilung gestoppt und die
Apoptose induziert [Rothenberg et al, 1997; Rivory et al, 1996; Creemers et al, 1994].
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Irinotecan besitzt ebefalls ein beträchtliches Nebenwirkungsprofil. Es kann ein cholinerges Syndrom
auftreten, welches mit einer Diarrhoe einhergeht, Nieren- und Leberschädigungen bis hin zum Nierenversagen werden ebenfalls beschrieben. Weitere Nebenwirkungen sind Hypersensivität, Kolitis,
Ileus sowie Anämie, Thrombozytopenie und Neutropenie. Die Neutropenie stellt wie bei der Anwendung von Oxaliplatin die dosislimitierende Toxizität dar [Cersosimo et al, 1998; Campto®, Fachinformation, 1999].
Nab-Paclitaxel ist eine an Albumin-Nanopartikel gebundene Form von Paclitaxel. Dadurch kann das
Taxan (Paclitaxel) über den endogenen transendothelialen Albumin-Transportweg, der Proteine wie
gp60 und SPARC (Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine) nutzt, selektiv in das Tumorgewebe
aufgenommen und dort angereichert werden. Paclitaxel gehört zu den Taxanen und wird halbsynthetisch aus Blättern der Pazifischen Eibe gewonnen [Goldstein et al, 2015; Von Hoff et al, 2013].
Paclitaxel gehört zu der Familie der Zytoskelett-Inhibitoren. Es bindet an ß-Tubulin und stört den
Abbau von Mikrotubuli. Diese sind bei der Mitose Bestandteile der essenziellen Mitosespindel. Somit
kommt es zu einer Inhibition der Zellteilung [Kohler et al, 1994].
Zu den häufigsten Nebenwirkungen gehören Haarausfall, Muskel- und Gelenkschmerzen, gastrointestinale Beschwerden wie Übelkeit, Erbrechen und Diarrhoe, Blutbildungsstörungen wie Anämie,
Thrombozytopenie und Neutopenie, Blutungen sowie Empfindungstörungen [Gradishar et al, 2005;
Goldstein et al, 2015; Von Hoff et al, 2013].
Erlotinib gehört zu den sog. zielgerichteten Therapeutika (targeted therapies) und ist ein selektiver
Inhibitor des EGF-Rezeptors. Dabei greift Erlotinib intrazellulär an der Tyrosinkinase-Domäne der
EGF-Rezeptoren an. Die Aktivität der Tyrosinkinase-Domänen wird durch die Interaktion mit dem
Inhibitor blockiert, wodurch die Autophosphorylierung der Rezeptoren verhindert wird. Dies führt zu
einer Unterbrechung der für die Zellproliferation wichtigen EGFR-Signalkaskade, und somit wird
nachfolgend das Tumorzellwachstum unterbrochen [Shepherd et al, 2005; Dowell et al, 2005; Wang
et al, 2015].
Unerwünschte Nebenwirkungen sind ein Akne-ähnlicher Hautausschlag (sogenanntes Rash) zu erwähnen, der mit einem positiven Therapieansprechen korreliert. Desweiteren kommt es zu Störungen des Gastrointestinaltraktes wie Appetitlosigkeit und Diarrhoe. Im Gegensatz zu den verwendeten
Zytostatika ist die hämatotoxische Wirkung eher gering [Packungsbeilage Tarceva].
5.2.5.3
Das experimentelle Therapieverfahren der Hyperthermie
Die expermerimelle Methode der hyperthermischen Behandlung wurde in der letzten Zeit viel diskutiert und auch mit pro-apoptotischen Signalwegen assoziiert [Issels et al, 2010; Ahmed et al, 2015;
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Ahmed et al, 2013]. Diese wird grundsätzlich in zwei verschiedene Methoden eingeteilt: zum einen
die Ganzkörperhyperthermie, dabei erreicht der Körper in der komplementären Onkologie Temperaturen zwischen 39,5 und 40,5 °C. Zur Hitzeerzeugung kommen z.B. Infrarotstrahler zum Einsatz. Zum
anderen die loko-regionalen Tiefenhyperthermie bei welcher der Körper örtlich begrenzt überwärmt
wird. Die Höchsttemperaturen liegen bei 42°C bis maximal 44 °C [Issels et al, 2010]. Issels et al. konnte 2010 erstmals in einer randomisierten Phase 3 Studie zeigen dass beim Weichteilsarkom die
neoadjuvante Chemotherapie mit Etoposid, Ifosamid und Dodorubizin (EIA) in Kombination mit einer
regionale hyphertermische Behandlung einen Vorteil gegenüber der neoadjuvanten Chemotherapie
alleine aufweist. Es konnte mit der Kombination von hyperthermischer Behandlung und EIA ein signifikant besseres lokales progressionsfreies Überleben (LPFS) (HR 0,58, p = 0,003) sowie krankheitsfreies Überleben (DFS) (HR 0,70, p = 0,011) erreicht werden.
5.2.6 Molekulare Grundlagen der Entwicklung entarteten Gewebes
Die Krebsentstehung, auch Karzinogenese, ist ein vielschichtiger Prozess, bei dem die Transformation
der normalen Zelle zur Tumorzelle in mehreren Schritten erfolgt. Dabei durchläuft die Zelle mehrere
genetische sowie epigenetische Veränderungen. Hanahan und Weinberg haben die wichtigsten
Kennzeichen einer Tumorzelle zusammenfassend erstmals im Jahr 2000 beschrieben: Resistenz gegenüber apoptotischen und wachstumsinhibierenden Signalen, Unabhängigkeit von externen Wachstumssignalen, Fähigkeit zur Induktion der Angiogenese, unbegrenztes Replikationspotenzial und die
bereits beschriebene Fähigkeit zur Invasion und Metastasierung [Weinberg et al 2000; WHO, Cancer,
Fact sheet N°297]. Diesen sechs „ Hallmarks of Cancer“ wurden im Jahr 2011 ebenfalls von Hanahan
und Weinberg weitere Kennzeichen hinzugefügt. Diese beinhalteten die Ansammlung spezifischer
Mutationen sowie die genomische Instabilität, den Beitrag einer entzündlichen Mikroumgebung zum
Tumorwachstum, die Dysregulation des zellulären Energiehaushalts und die Fähigkeit eine Immunreaktion zu umgehen. Um eine Entartung der Zellen hervorzurufen sind nicht unbedingt alle dieser
Kennzeichen gleichzeitig notwendig. Wahrscheinlich reichen schon drei bis vier Kernkennzeichen aus.
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A
B
Abbildung 5.5: Überblick über die Kerncharakteristika von Krebszellen
Hanahan und Weinberg definierten im Jahr 2000 sechs Eigenschaften von Krebszelle: Aufrechterhaltung proliferativer Signale, Umgehung wachstumssupprimierender Signale, Aktivierung der Migration und Invasion,
Replikative Immortalisierung, Induktion der Angiogenese und die Vermeidung der Apoptose (A). 2011 wurden
diese von Hanahan und Weinberg um die Dysregulierung des zellulären Energiehaushalts, die Umgehung der
Immunreaktion, eine entzündliche Mikroumgebung, welche das Tumorwachstum begünstigt und die
genomische Instabilität sowie Mutation ergänzt (B) [adaptiert nach Hanahan und Weinberg, 2011].
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Einleitung
Ausgelöst werden diese Veränderungen der normalen Zelle durch genetische Defekte z.B. in wachstumsregulierenden Faktoren. Zwie Kategorien externer Agenzien können diese induzieren: erstens
die physikalischen Kanzerogene wie ultrviolettes Licht, Röntgen oder radioaktive Strahlung, die chemischen Kanzerogene wie Astbest, Aflatoxin, Arsen, Chrom, Blei, Quecksilber oder polyzyklischen
aromatischen Kohlenwasserstoffe im Tabakrauch, zweitens die biologischen Kanzerogene wie Infektionen durch Viren (HPV), Bakterien oder Parasiten. Diese Agenzien erhöhen die Mutationsfrequenz.
Der Weiteren ist der Alterungsprozess ein wichtiger Faktor in der Entwicklung von Krebserkrankungen, denn hier arbeiten die zelluläre Reparaturmechanismen nicht mehr so effektiv wie in jüngeren
Zellen [Weinberg, 2013; WHO, Cancer, Fact sheet N°297; de Martel et al, 2012].
Durch die genannten Faktoren können u.a. Mutationen in Genen ausgelöst werden, welche mit einer
begünstigten Tumorentstehung assoziiert werden. Diese Gene können in zwei Klassen eingeteilt
werden: die Proto-Onkogene und die Tumorsuppressorgene.
Die Proto-Onkogene regulieren durch ihre Genprodukte in einer normalen Zelle die Proliferation
sowie die Differenzierung. Durch unterschiedliche genetische Veränderungen wie Punktmutationen,
Translokationen oder Genamplifikationen des Genlokus kann es zu einer übermäßigen Aktivierung
(gain of function) kommen. Damit wird es zu einem Onkogen [Weinberg et al, 2013]. Bei Punktmutationen kommt es in der Regel zu Proteinen mit abgewandelter Struktur oder Funktion. Im Gegensatz
dazu führt eine Amplifikation zu einer Überexpression des Wildtyp-Proteins. Bei einer Translokation
des Genlokus können beide vorher erwähnten Effekte auftreten. Ein bekanntes Beispiel für eine Aktivierung eines Proto-Onkogens durch Punktmutation ist das Ras-Gen. Dieses kodiert für eine monomere GTPase und ist ein wichtiges Mitglied verschiedener Signaltransduktionswege, die Wachstumsund Differenzierungsprozesse regulieren. Punktmutationen in unterschiedlichen Codons führen allesamt zum Verlust der GTPase-Bindungsaktivität von Ras und daher zu einem dauerhaften Wachstumsstimulus [Bryan et al, 2014]. Auch treten Ras-Mutationen in mehr als 90% aller Pankreaskarzinome auf und gelten dabei als Treibermutationen.
Die Produkte der Tumorsuppressorgene (TSG) kontrollieren den Zellzyklus oder lösen Apoptose aus.
Im Gegensatz zu den Proto-Onkogenen genügt hier nicht die Veränderung eines Allels. Die Inaktivierung erfolgt hier generell biallelisch und dies bedingt eine Förderung der Tumorprogression (loss of
function) [Weinberg et al, 2013]. Die Mechanismen die dazu führen können sind sehr vielfältig. Zum
einen gibt es Punktmutationen in Verbindung mit einem Verlust des zweiten Allels, zum anderen
homozygote Deletionen beider Allele oder epigenetische Veränderungen wie Hypermethylierungen
von Promotoren. Ein klassisches Beispiel ist der Transkriptionsfaktor p53, welcher durch das TP53
Gen kodiert wird. Dieses ist in ca. 50% der humanen malignen Tumoren mutiert. Es wird normaler-
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wiese bei DNA Schädigung aktiviert und reguliert die Expression von Genen, welche den Zellzyklus
und die DNA-Reparatur kontrollieren. Durch einen Verlust der p53-Funktion ist ein wichtiger Mechanismus zum Erhalt der genomischen Stabilität geschädigt [Muller et al, 2012, Olivier et al, 2010]. Die
Tumorsupressorgene und Proto-Onkogene beinhalten eine Vielzahl weiterer funktionell definierter
Gengruppen. Die Karzinogenese kann sowohl durch angiogenesevermittelnde Gene, als auch durch
Überexpression von Wachstumsfaktoren und deren zugehöriger Rezeptoren gefördet werden. Ebenfalls können Gene, welche nicht für Proteine kodieren (wie mikroRNA-Gene) die Tumorprogression
beeinflussen.
Dennoch führt eine Mutation allein noch zu keiner Tumorentwicklung. Reparatursysteme minimieren
Mutationen. Schätzungen besagen, dass in etwa fünf verschiedene Gene mutiert sein müssen, um
alle Kontrollen außer Kraft zu setzen, die zu Krebswachstum führen [Stratton et al, 2011]. In der Studie von Vogelstein wurde 2013 gezeigt dass typische Tumoren 2-8 driver Mutationen aufweisen [Vogelstein et al, 2013]. Als driver werden Mutationen bezeichnet, welche die Krebsentwicklung
entscheident vorantreiben. Viele in Tumoren identifizierbare Mutationen spielen allerdings bei der
Tumorentwicklung gar keine Rolle und werden in der englischen Fachliteratur passenger genannt.
Eine der größten Herausforderungen der Tumorforschung heutzutage besteht durch die neuen Next
Generation Sequencing Methoden darin, die driver von den passenger-Mutationen abzugrenzen
[Collison et al 2012].
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Krebs auf Grund der zahlreichen Merkmale, Ursprünge,
Kennzeichen und Einflüsse äußerer Faktoren sehr divers ist. Die Veröffentlichung der Erweiterung der
hallmarks of cancer durch Hanahan und Weinberg 2011 zeigt anschaulich die Notwendigkeit der
Fortführung von Forschungen.
5.2.7 Das Tumorprogressionsmodell des Pankreaskarzinoms
Muzinöse zystische Neoplasien (MCN), intraduktale papilläre muzinöse Neoplasien (IPMN) und
pankreatische intraepitheliale Neoplasien (PanIN) können nicht-invasive Vorläuferläsionen des
duktalen Pankreaskarzinoms (PDAC) repräsentieren. Die pankreatischen intraepithelialen Neoplasien
kommen am häufigsten vor. Es wurde für die PanINs ein Progressionsmodell zum Pankreaskarzinom
entwickelt, das die Beteiligung der genetischen Alterationen mit den morphologischen Veränderungen der PanINs korreliert. Die Progression zum Pankreaskarzinom aus normalem duktalen Gewebe
wird in drei Stadien (PanIn 1-3) eingeteilt. Diese sind durch bestimmte Morphologien und assoziierte
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Einleitung
molekulare Veränderungen charakterisiert. Verschiedende molekularbiologische Studien und Untersuchungen zeigen das gehäufte Auftreten von Mutationen des K-ras Onkogens schon in den Stadien
1A und 1B. Die Mutationsfrequenz dieses Onkogens steigt mit zunehmender PanIN-Progression. Im
Pankreaskarzinom kann bei mehr als 90% der Fälle eine K-ras Mutation nachgewiesen werden. In den
weiteren Stadien kommt es zu einer Inaktivierung der p16 und p14 Gene, sowie einer Überexpression von Her2 (PanIN 2).
Abbildung 5.6: Eines der Tumorprogressionsmodelle des Pankreaskarzinoms (pancreatic intraepithelial
neoplasia)
Dargestellt ist der Übergang von normalem Gangepithel über die PanIN-Stadien bis zur Invasion.
Zusätzlich sind mit den morphologischen Veränderungen korrelierende genetische Veränderungen dargestellt
[adaptiert nach Morris IV et al, 2010].
Das PanIN 3 Stadium ist mit dem biallelischen Verlust mehrerer Tumorsupressorgene (TSG) verbunden. So kann es zu einer Inaktivierung des TP53-Gens und des SMAD4 Gens kommen. Ebenfalls ist in
einigen Fällen eine Muation des BRCA2-Gens bekannt. Neben den genetischen Veränderungen zeigen Pankreasadenokarzinome eine Deregulation von Wachstumsfaktoren und ihrer Rezeptoren. In
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Einleitung
neueren Publikationen werden auch Deregulationen des Hedgehog Signalwegs und des Wnt Signalwegs postuliert [Brosens et al, 2015; Morris et al, 2010].
Die Läsionen unterscheiden sich auch in ihrer mikroskopischen Stuktur. So weisen PanIN-1-Läsionen
flache (1A) oder papilläre (1B) Zellen auf, die noch keine atypischen Kennzeichen haben und deren
Polarität stabil ist. Beim PanIN 2 Stadium treten geringgradige bis mittelgradige Dysplasien auf. In
PanIN-3-Läsionen, auch carcinoma in situ genannt, können dagegen hochgradige Dysplasien nachgewiesen werden [Hruban et al, 2008; Morris et al, 2010; Kosmahl et al, 2004; Werner et al, 2011].
Die beiden anderen Vorstufen-Läsionen – MCN und IPMN – weisen ähnliche histologische und genetische Kennzeichen auf, sind jedoch seltener [Esposito et al, 2012].
5.2.8 Allgemeine Therorien des Tumorwachstums
Derzeit werden zwei primäre Theorien diskutiert, die die Heterogenität der Tumorzusammensetzung
erklären sollen: das stochastische und das hierarchische Modell (Stammzellmodell). Beide Ansätze
gehen davon aus, dass nur eine geringe Anzahl an Zellen innerhalb eines Tumorverbandes die Fähigkeit besitzt, Tumorwachstum zu initiieren und aufrecht zu erhalten.
Das erste, also das stochastische Modell, schreibt allen Tumorzellen identische biologische Eigenschaften und somit auch vergleichbare tumorigenen Eigenschaften zu. Daher kann jede einzelne Tumorzelle gleichermaßen zu Tumorwachstum und Metastasierung beitragen. Dieses Potenzial zur
Tumorgenerierung wird allerdings durch verschiedene intrinsische Faktoren wie der Anwesenheit
bestimmter Transkriptionsfaktoren und Translationsmechanismen reguliert. Weiterhin spielen verschiedene extrinsische Faktoren, wie spezifische Zytokinkonzentrationen, ein geeignetes Mikromilieu
und Zell-Zell-Interaktionen eine Rolle, die den Eintritt einer Tumorzelle in den entsprechenden Zellzyklus zu einem stochastisch unwahrscheinlichen Ereignis machen [Bomken et a, 2010; O'Brien et al,
2009].
Das zweite, also das hierarchische Modell, geht von einer gegensätzlichen Theorie aus. Dabei ist nur
eine kleine Subpopulation der Tumorzellen, die sogenannten Tumorstammzellen oder tumorinitiierenden Zellen, dazu befähigt, Tumorwachstum zu generieren. Sie ist wie ihr nicht mutierter Gegenpart, die normale Stammzelle, gekennzeichnet durch ihr Potenzial zur Selbsterneuerung, Differenzierung und insbesondere zur unbegrenzten Proliferation [Clarke et al, 2006; Shackleton et al, 2009].
Somit geht man bei diesem Modell davon aus, dass ein Tumor analog zur Zellhierarchie in gesundem
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Einleitung
Gewebe strukturiert ist. Er besteht also aus einer sehr kleinen Anzahl an Tumorstammzellen, aus
Progenitorzellen, differenzierten Zellen und terminal differenzierten Zellen [Reya et al, 2001]. Ausgehend von diesem Modell sollte es möglich sein, aus einer Tumormasse zwei Zellfraktionen zu isolieren: Zum einen die Tumor-initiierenden Zellen (Tumorstammzellen), von denen jede Einzelne zur
Initiierung von neoplastischem Wachstum befähigt ist und zum anderen die nicht-tumorigenen Zellen, die keine Veranlagung zur Tumorgenerierung besitzen.
Abbildung 5.7: Die beiden Modelle des Tumorwachstums
Es gibt zwei Modelle des Tumorwachstums, das stochastische Modell, welches jeder Zelle vergleichbare
tumorigene Eigenschaften zuschreibt (a, c) und das hierarchische Modell, auch Stammzellmodell genannt. Dies
geht davon aus, dass nur eine kleine Subpopulation der Tumorzellen, die sog. Tumorstammzellen,
tumorigenen Eigenschaften besitzen (b, d). Im ersten Modell ist jede Zelle des Tumors das Therapietarget,
wenn allerdings nicht alle Zellen von der Therapie erreicht werden, kann sich aus den überlebenden Zellen ein
Rezidiv entwickeln (e). Beim herarchischen Modell ist eine vollständige Tumorregression möglich, wenn die
Tumorstammzellen (CSC) eliminiert werden. Wenn die Tumorstammzellen mit der Therapie allerdings nicht
erreicht werden, kann es zu einem Rezidiv kommen (f) [Vochum et al, 2014]
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Einleitung
5.2.9 Identifizierung von Tumorstammzellen
Obwohl es schon sehr früh erste Hinweise auf ein hierarchisches Model des Krebswachtums gab
[Bruce et al, 1963; Park et al, 1971], gelang es erstmals im Jahre 1997 Tumorzellen zu isolieren, die
einen stammzellähnlichen Charakter aufwiesen. Dick et al. führten wegweisende Versuche durch, um
zu analysieren, ob der hierarchische Aufbau der Hämatopoese auch in Tumoren des Blutes erhalten
bleibt [Bonnet et al, 1997; Lapidot et al, 1994]. Dabei konnten sie erstmals in verschiedenen akuten
myeloischen Leukämien (AML) Zellen mit hohem tumorigenen Potential isolieren. Diese Zellen wiesen ein CD34+CD38+-Oberflächenprofil auf, welches damit phänotypisch einer nomalen
hämatopoetischen Stammzelle ähnelte. Außerdem war ausschließlich diese Zellpopulation in der
Lage in immundefizienten Mäusen Leukämien zu initiieren, welche morphologisch völlig identisch
zum Spendertumor waren.
Erst ein Jahrzehnt später im Jahr 2003 übertrugen Al Hajj et al. das Prinzip der Tumorstammzellen
ertsmals
auf
solide
Tumoren.
Dabei
stellten
sie
Einzelzellsuspensionen
humaner
Mammakarzinomproben her und konnten mittels Durchflusszytometrie eine CD44+CD24- Zellpopulation identifizieren, welche als einzige Fraktion in der Lage war einen Tumor in immundefizienten
Mäusen zu iniziieren. Nach dieser ersten Beschreibung der Tumorstammzelle beim Mammakarzinom
folgten mehrere Publikationen, die die Existenz von Tumorstammzellen in einem breiten Spektrum
solider Neoplasien untersuchten. Dazu zählen unter andem das Kolon-, das Pankreas-, das Prostataund das Lungenkarzinom sowie das Melanom. In Tabelle 5.3 ist ein Überblick über die verschiedenen
Tumorentitäten und das Spektrum an Markern dargestellt.
Ein weiterer beschriebener Marker zur Identifikation von Tumorstammzellen ist CD133. CD133 ist ein
120 kDa 5-Helix-Transmembranglykoprotein [Miraglia et al, 1997], das 1997 als neuer Zelloberflächenmarker für hämatopoetische Stammzellen entdeckt wurde [Yin et al, 1997]. Singh et al. konnten
2004 mit diesem Marker Tumorstammzellen in humanen Medulloblastomen und Glioblastomen
identifizieren. Die CD133+ Zellpopulation war in der Lage nach Injektion in immundefiziente Mäuse
ein Tumorwachstum zu initiieren. Dabei reichten schon 100 Zellen aus, um ein Tumorxenograft hervorzubringen, welches phänotypisch identisch zum Ursprungstumor war. Nach dieser ersten Publikation zu Gehirntumoren wurde das Oberflächenantigen CD133 als Tumorstammzellmarker für eine
Vielzahl weiterer Tumorentitäten analysiert, darunter das Kolon, Lungen-, und Pankreaskarzinom
[O'Brien, et al, 2007; Ricci-Vitiani et al, 2007; Bertolini et al, 2009]. Hermann et al. beschrieben 2007,
dass CD133 ein guter Marker zur Identifikation von Tumorstammzellen in der Pankreastumorzelllinie
L3.6pl ist. Dabei reichten bei einer orthotopen Implantation 500 Zellen der CD133+ Subpopulation
aus, um ein Tumorwachstum in 80% der immundefizienten Mäuse zu initiieren. Weiterhin wurden
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Einleitung
pankreatische Tumorstammzellen bei Li et al 2007 anhand der Oberflächenantigene CD44+, CD24+,
und EpCAM+ identifiziert. CXCR4+ gilt in Verbindung mit CD133+ als Marker für Tumorstammzellen,
die zur Metastasierung neigen [Hermann et al, 2007]. Als ein weiterer Marker gilt die
Rezeptortyrosinkinase cMet [Li et al, 2011]. Auch ist die Anreicherung von ALDH-1+ Zellen ein Marker
für pankreatische Tumorstammzellen und mit einer schlechteren Prognose verbunden [Feldmann et
al, 2007; Feldmann et al, 2009; Tanase et al, 2014; Penchev et al, 2012].
Tabelle 5.3: Marker zur Identifikation von Tumorstammzellen in soliden Tumoren
Tumorentität
Marker
Referenz
Mammakarzinom
CD44+ CD24-
Al-Hajj et al, 2003
CD133+
Wright et al, 2008
CD133+ CXCR4+
Hwang-Verslues et al, 2009
ALDH-1+
Ginstier et al, 2007
CD49F+ DLLhigh DNERhigh
Pece et al, 2010
CD133+
Singh et al, 2004
SSEA-1+
Son et al, 2009
CD44+ alpha2beta1high CD133+
Collins et al,2005
CD133+ CXCR4+
Miki et al, 2007
CD20+
Fang et al, 2005
ABCB5+
Schatton et al, 2008
Sca-1+ CD45+ PECAM- CD34+
Kim et al, 2005
CD133+ CXCR4+
Bertolini et al, 2009
CD133+
Ma et al, 2007
CD90+
Yang et al, 2008
CD133+
O´Brien et al, 2007; Ricci-Vitiani
Glioblastom
Prostatakarzinom
Melanom
Lungenkarzinom
Leberkarzinom
Kolonkarzinom
et al, 2007
EpCAM+ CD44+ CD166+
Pankreaskarzinom
+
+
EpCAM CD44 CD24
CD133
+
Dalerba et al, 2007
Li et al, 2007
Hermann et al, 2007
+
CD133 CXCR4
ALDH-1
+
+
+
Hermann et al, 2007
Feldmann et al, 2007, Jimeno et
al, 2009
cMet
Li et al, 2011
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Einleitung
5.2.10 Limitation der Standard (Chemo) Therapie beim hierearchischen Modell
Das Ansprechen einer Therapie (response) wird in erster Linie danach beurteilt, ob es zu einer Krankheitskontrolle, idealerweise mit objektivierbarer Regression des Tumors kommt. Allerdings ist bei
Krebspatienten häufig zu beobachten, dass trotz guten ersten Therapieansprechens ein Rezidiv auftritt. Dies geht mit den Konzept der Tumorstammzelle konform, welches davon ausgeht, dass theoretisch eine einzige Zelle in der Lage ist eine Tumor zu generieren [O'Brien et al. 2007]. Mit den momentan konvertionell verwendeten Chemotherapeutika werden vor allem die zahlenmäßig überwiegenden, sich schnell teilenden Zellen des Tumors erreicht. Dies erklärt das initial gute Therapieansprechen. Die Tumorstammzellen allerdings verfügen über ausgeprägte Resistenzmechanismen (ABC
Transporter, geringe Proliferationsraten…). Somit bleiben diese bestehen und können zu einem Rezidiv führen (Abb. 5.8).
Abbildung 5.8: Entwicklung der hierarchischen Struktur beim Therapieverlauf
Während der Chemotherapie werden die Tumorstammzellen nicht erreicht und es kann nach behandlungende
oder bei einer Resistenzentwicklung zu einem Rezidiv der Erkankung kommen. S = Tumorstammzellen, P =
Progenitorzellen, D = Differenzierte Zellen, TD = terminal differenzierte Zellen [adaptiert nach Huntly et al,
2005]
Bei mehreren Tumorentitäten konnte bereits gezeigt werden, dass konventionelle Behandlungen,
wie Chemo- und Strahlentherapie nur einen begrenzten Effekt gegenüber Tumorstammzellen aufweisen [Bao et al, 2006; Hermann et al, 2007; Ho et al, 2007; Ma et al, 2007]. Bao et al. konnten 2006
am Beispiel des Glioms zeigen, dass die Strahlendosis, welche einen Großteil aller Zellen eliminierte,
keine Wirkung auf CD 133+ Zellen hatte, sondern in serieller Transplantation die Aggressivität des
Tumors noch steigerte. Sie zeigten ebenfalls, dass die Resistenz der CD 133+ Zellen duch einen DNA
Reparatumechanismus vermittelt wird, der auf die Tumorstammzellen begrenzt ist. Dies konnte von
Phillips et al. auf das Mammakarzinom übertragen werden. Dabei blieben die CD44+ Brustkrebsstammzellen von Strahlentherapie unbeeinflusst [Phillips et al, 2006]. Bei der Behandlung von primä-
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Einleitung
ren Pankreastumorzellen konnte durch Hermann et al ebenfalls beobachtete werden, dass die
CD133+ Zellpopulation von der Standardtherapie mit Gemcitabin nicht beeinflusst werden konnte. Es
kam zwar zu einer Kontrolle des Tumorwachstums in orthotop implantierten Tumoren bei Mäusen.
Allerdings war der Anteil der CD 133+ Zellpopulation in der verbleibenden Tumormasse erhöht [Hermann et al, 2007].
Somit kann man sagen, dass eine Medikation, welche die Tumorstammzellen nicht eliminiert, zwar
erst zu einer Tumorremission führen kann, aber es mit hoher Wahrscheinlichkeit zu einem Rezidiv
kommen wird. Daher ist entweder eine gezielte Therapie zur Eliminierung der Tumorstammzelle
notwendig oder eine Therapie, welche Tumorstammzellen in die Differenzierung treibt (um sie für
eine konventionelle Chemotherapie zugänglich zu machen), damit es zu einer langfristigen Tumorremission kommen kann.
Daher wird in jüngster Zeit sehr stark an vielen neuen therapeutischen Strategien gearbeitet, um
Tumorstammzellen zu eliminieren. Bis jetzt wurden verschiedene potentiell therapeutische Targets
von Tumorstammzellen identifiziert, darunter spezifische Oberflächenmarker, die Superfamilie der
ABC Tranporter, anti-apoptotische Faktoren, DNA Reparatur Enzyme und eindeutige onkogene Signalkaskaden, wie die Wnt/β-catenin, Hedgehog, EGFR und Notch Signalwege [Wang et al, 2010; Liu
et al, 2009; Reya et al, 2005]. Eine Studie zeigte, dass Carbonanotubes in Konjugation mit einem antiCD133 Antikörper gefolgt von einer Behandlung mit infrarotem Laserlicht selektiv CD133+
Glioblastom Zellen erreichen und diese mittels Photothermolyse der Nanotubes eliminieren können
[Wang et al, 2011]. Desweiteren konzentrierte man sich in verschiedenen Studien auf die ATP gebundenen Ausfluss-Transporter, denn der Ausfluss der anti-neoplastischen Therapeutika ist einer der
primären Gründe der Chemoresistenz [Broxterman et al, 2009; Ritchie et al, 2011]. Dabei wurden
unterschiedliche Inhibitoren für ABC Transporter identifiziert, darunter auch MS-209 beim
Mammakarzinom und anderen soliden Tumoren, welches erwartungsvolle Ergebnisse zeigt
(ClinicalTrials.gov Identifier: NCT00004886) [Saeki et al, 2007]. Ein weiterer hoffnungsvoller Inhibitor
ist Tariquidar, welcher in mehreren klinischen Studien mit verschiedenen Kombinationspartnern analysiert wurde [Patil et al, 2009]. Eine weitere Strategie ist das Erreichen spezifischer Signalwege wie
z.B. dem Notch Signalweg. Die Inhibition von Notch 1 kann die CD44+/CD24- Subpopulation signifikant redizieren [Li et al, 2008; McGowan et al, 2011]. Auch die Wnt Kaskaden und der Hedgehog
Signalweg liegen im Fokus der Forschung und bieten hoffnungsvolle Therapieansätze z.B. über
Hedgehog Antagonisten [Feldmann et al, 2008]. Ein weiteres Ziel ist die Mikroumgebung des Tumors,
da diese die Tumorprogression positiv beeinflussen kann. Dabei spielt die Tumorangiogenese eine
große Rolle.
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A
B
Abbildung 5.9: Darstellung der Stammzell-assoziierten Signalwege sowie der therapeutischen Targets der
Tumorstammzelle
Zu den Signalwegen, die bei der Selbsterneuerung und Differenzierung von Tumorstammzellen sowie normalen
Stammzellen eine Rolle spielen, gehören unter anderem der PI3K/Akt, JAK/STAT, Wnt/β-catenin, Hedgehog,
Notch, NF-κB Signalweg und die Signalwege der ABC Superfamilie (A).
In den letzten Jahren wurden viele therapeutische Möglichkeiten entwickelt welche auf eine Eliminierung der
Tumorstammzellen abzielten. Die populärsten Ideen können in vier verschiedene Gruppen eingeteilt werden.
Bei selektiver Therapie der Oberflächemarker kann präziser und mit weniger Nebenwirkungen behandelt werden. Auch konnten durch Inhibition bestimmter Signalwege einige charakteristische Eigenschaften der Stammzellen unterdrückt werden. Ebenfalls sind Inhibitoren der ABC Kassette wichtige molekulare Medikamente.
Desweiteren ist die Mikroumgebung der Tumorstammzellen ein wichtiges Ziel. Die Regulation der Blutgefäßbildung sowie das Ausnutzen der speziellen pH-Umgebung zeigten bereits Potential (B) [adaptiert nach Chen K et
al, 2013].
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Einleitung
All diese Wege Tumorstammzellen zu eliminieren sind hoffnungsvolle Strategien, welche die Effizienz
bereits vorhandener Agenzien erhöhen, ein Rezidiv verhindern und das Patientenüberleben verlängern sollen [Dragu et al, 2015; Chen et al, 2013; Ning et al, 2013].
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Einleitung
5.3 Taurolidin und die Substanz 2250
Taurolidin
(Bis–(1,1-dioxoperhydro-1,2,4-thiadiazynol-4)
methan)
ist
aufgrund
seiner
anti-
mikrobiellen und anti-inflammatorischen Wirkung schon seit mehreren Jahren im klinischen Einsatz
[Reith et al, 1997; Baker et al, 1994; Schneider et al, 2005; Simon et al, 2006; Sherertz et al, 2006;
Betjes et al, 2004; Jurewitsch et al, 2005]. Es ist aber auch aufgrund seiner anti-neoplastischen Eigenschaften in den letzten Jahren zunehmend in den Fokus der onkologischen Forschung gelangt [Neary
et al, 2009]. Die Strukturformel von Taurolidin sowie weiterer Metabolite sind in Abbildung 5.10 dargestellt. Beim Taurolidin handelt es sich um ein kleines dimeres Molekül, welches ein Molekulargewicht von 284 Da aufweist. Die erste Synthese und die Charakterisierung der Struktur von Taurolidin
erfolgte durch die Firma Geistlich Pharma (Schweiz) in den siebziger Jahren. Die Struktur des
Taurolidins beinhaltet zwei Taurinamid Ringe, welche durch eine Methylengruppe miteinander verbunden sind. Die Grundstruktur Taurinamid leitet sich von der Aminosulfonsäure Taurin ab. Diese ist
ein Abbauprodukt der Aminosäuren Cystein und Methionin und daher ubiquitär im Körper verfügbar
[Jacobi et al, 1997; Jacobsen et al, 1968].
Durch magnetresonanzspektroskopische und pharmakologische Untersuchungen konnte gezeigt
werden, dass Taurolidin in wässriger Lösung in einem Gleichgewicht mit seinen beiden Metaboliten
Hydroxymethyl-Taurultam und Taurultam steht. Das Gleichgewicht ist stark in Richtung der beiden
Metabolite verschoben. Dadurch erfolgt eine sehr rasche Metabolisierung des Taurolidins. Durch
eine weitere Hydrolyse entstehen die Metabolite Hydroxymethyl-Taurinamid und Taurinamid. Nun
erfolgt die letzte Metabolisierung zu Taurin und CO2 [Caruso et al, 2010; Dofferhoff et al, 1993; Erb et
al, 1982; Jacoben et al, 1968; Stendel et al, 2007].
Die neu entwickelte Substanz 2250 leitet sich in ihrer Grundstruktur von Taurultam ab und ist damit
ebenfalls ein Oxathiazin Derivat, bei dem lediglich ein Stickstoffatom in der Ringstruktur durch ein
Sauerstoffatom ersetzt wurde. Die Biochemie der Substanzen leiten sich aus der Biotransformation
von Cystein und Methionin zu Hypotaurin und Isäthionsäure ab. Die entsprechenden Sulfonamide
sind hoffnungsvolle Substanzen für hochaktive neue Bakterizide und antineoplastische Medikamente. 1,4,5 Oxathiazin-Derivate sind Verbindungen, die bisher unbekannt waren. Dagegen sind 1,2,3
Oxathiazin-Derivate als künstliche Süssmittel bekannt [Karl Clauß et al, 1973].
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Abbildung 5.10: Metabolisierung von Taurolidin
Taurolidin liegt in wässriger Lösung im Gleichgewicht mit Taurultam und Hydroxymethyl-Taurultam vor.
Taurultam wird zu Hydroxymethyl-Taurinamid und schließlich zu Taurin metabolisiert [nach Pfirrmann et al,
1985].
Die folgenden (teilweise historischen) Informationen dienen der Beschreibung der Basissubstanz
Taurolidin und beziehen in vitro und in vivo Daten ein. Da die Substanz 2250 aus Taurolidin / (Methyl)-Taurultam entwickelt wurde, ist davon auszugehen, dass Basiseigenschaften ebenfalls zu beobachten sind. Nicht zuletzt wird deswegen im Detail darauf eingegangen.
5.3.1 Anti-mikrobielle und anti-inflammatorische Wirkung des Taurolidins
Aufgrund einer anti-mikrobiellen und anti-inflammatorischen Wirkung befindet sich Taurolidin (TRD)
schon seit mehreren Jahren im klinischen Einsatz [Reith et al, 1997; Baker et al, 1994; Schneider et al,
2005; Simon et al, 2006; Sherertz et al, 2006; Betjes et al, 2004; Jurewitsch et al, 2005].
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Die anti-mikrobielle Wirkung beruht auf einer kovalenten Vernetzung von primären Amino-Gruppen
in bakteriellen Endotoxinen und Exotoxinen durch die Methylolgruppe, welche die beiden
Taurinamidringe verbindet [Daigeler et al, 2008; Han et al, 2002; Hail et al, 2006; Pfirrmann et al,
1979]. Desweiteren kann Taurolidin über direkte Interaktion mit bakteriellen Adhäsionsmolekülen
die adhäsiven Eigenschaften von Bakterien reduzieren. Dies konnte z.B. für das Fimbrien Protein
FimH in E. coli gezeigt werden. Darüber hinaus wird TRD auch eine anti-inflammatorische Wirkung
zugeschrieben, die auf eine Modulation und Inhibition von pro-inflammatorischen Zytokinen zurückzuführen sind. Dies konnte sowohl in vitro, durch die Hemmung der LPS stimulierten Freisetzung von
TNF und IL-1 aus Monozyten und anderen Immunzellen als auch in vivo an Peritonitis-Modellen
nachgewiesen werden [Bedrosian et al, 1991; Erb et al, 1982; Knight et al, 1983; Rossmann et al,
1996; Wigmorde et al, 1997].
5.3.2 Taurolidin und Substanz 2250 als anti-neoplastische Substanz
Über mögliche Effekte der Substanz 2250 auf Karzinomzellen ist bisher kaum etwas bekannt. Im Gegensatz zu Substanz 2250 liegen für Taurolidin, d.h. für die sog. „Muttersubstanz“, bereits zahlreiche
Erkenntnisse über den anti-neoplastischen Effekt vor. So besitzt Taurolidin die Fähigkeit, in vitro und
in vivo Apoptose in unterschiedlichen Tumorzellen auszulösen [Calabresi et al, 2001; Pfirrmann et al,
1979; Jacobi et al, 2005]. In Zellkultur-Versuchen konnte in verschiedenen neoplastischen Zelllinien
ein pro-apoptotischer Effekt gezeigt werden - so auch durch unsere Arbeitsgruppe für das Kolonkarzinom [Chromik et al, 2007], das Ösophaguskarzinom [Daigeler et al, 2008], das Fibrosarkom [Harati
et al, 2012], das Rhabdomyosarkom [Karlisch et al, 2013] und das Pankreaskarzinom [Chromik et al,
2010] sowie durch andere Arbeitsgruppen für das maligne Melanom [Shrayer et al, 2003],
Mesotheliom [Nici et al, 2004], Prostatakarzinom [Darnowski et al, 2004], Osteosarcom [Walters et
al, 2007, Marley et al, 2013], die Leukämie [Ribizzi et al, 2002]und das Neuroblastom [Luckert et al,
2014; Eschenbeurg et al, 2014]. Dabei scheint dieser Effekt auf neoplastische Zellen begrenzt zu sein
[Walters et al, 2007; Stendel et al, 2002]. Dennoch zeigt sich eine divergente Datenlage bei der DosisWirkungs-Beziehung. Die ED50 wurde von drei Autoren für einen Bereich 10-126 µM ermittelt [Stendel et al, 2003]. Untersucht wurden hierbei Konzentrationen von 0,1 µM - 14 mM. Noch größere
Differenzen traten in den Ergebnissen zu Apoptoseinduktion auf. Hier postulierten McCourt et al,
dass bei 18 µM maximale Apoptoseeffekte auftraten, die unter steigender Konzentration wieder
rückläufig waren [McCourt et al, 2000]. Han et al. fanden dagegen an humanen Leukämiezellen (HL60) 90% Apoptoseinduktion bei einer Konzentration von 150 µM [Han et al, 2002]. Darüber hinaus
liegen die Werte bei Stendel und Petrovic noch höher. (704 µM [44] / 1,76 mM [Petrovic et al, 2003]).
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Unterschiedliche Studienbedingungen, wie Inkubationszeit, unterschiedliche Zellreihen und differente Apoptosemarker erschweren die Vergleichbarkeit zusätzlich.
Auch in Tumor-Xenograft-Tiermodellen konnte eine wachstumsinhibierende Wirkung von intraperitoneal (ip) oder intravenöse (iv) appliziertem Taurolidin gezeigt werden, so etwa für das Kolonkarzinom [Braumann et al, 2005, Braumann et al, 2005], maligne Melanom [Braumann et al, 2008] und
Prostatakarzinom [Darnowski et al, 2004]. Dennoch gab es auch kontroverse Datenlagen. So untersuchten Braumann et al. in zwei Studien [Braumann et al, 2003; Braumann et al, 2000] an einem Kolonkarzinom-Modell der Ratte (BD-IX - Ratten mit syngenetischen Kolon-Karzinomen; DHD/K12/TRb)
den Unterschied zwischen ip Therapie und iv Therapie. In Übereinstimmung mit ähnlichen Studien
[Calabresi et al, 2001] konnte das lokale Wachstum durch die ip gehemmt werden. Das Tumorgewicht unterschied sich hingegen nach einer iv Bolusgabe von 1 ml 0,5% Taurolidin nicht von der Kontrollgruppe. Darüber hinaus konnte auch ein parallel angelegter subkutaner Tumor am Rücken der
Tiere nicht im Wachstum inhibiert werden. Hier wirkte auch die intraperitoneale Applikationsform
nicht tumorsuppressiv. Weberschock et al. konnten im Kontrast zu dieser Arbeit eine Wirksamkeit
von 2% iv an einem Modell der Lebermetastasierung eines kolorektalen Karzinoms konstatieren
[Weberschock 2000 Int. Conference Berlin]. In einer tierexperimentellen Studie an 45 WAG/Rij Ratten wurde Taurolidin systemisch in verschiedenen Konzentrationen (0,5% und 2%) eingesetzt. Die
operative Intervention bestand in einer medianen Laparotomie. Die Tumorzellen (CC531) wurden
daraufhin intralienal appliziert. Es wurde eine Tumorsuppression durch 2% Taurolidin nachgewiesen.
Bei 0,5% Taurolidin unterschieden sich die Ergebnisse nicht von der Kontrollgruppe. Auch fanden sich
im Tierversuch keine signifikanten Auswirkungen auf die Leukopoese nach iv Applikation in unterschiedlichen Dosierungen (bis zu 500 mg/kg) [Braumann et al, 2006].
In Hinblick auf das Pankreaskarzinom liegen dagegen bisher kaum Daten vor. Erste Anhaltspunkte
wurden in dieser Forschungsgruppe erarbeitet. In dieser Studie wurde die relative Beteiligung von
Apoptose und Nekrose am TRD-induzierten Zelltod untersucht. Dabei wurden u.a. zwei
Pankreaskarzinomzelllinen untersucht. Weiterhin wurden die Mechanismen der Apoptose-Induktion
durch Taurolidin mit Hilfe von funktionellen Untersuchungen genauer beleuchtet. Insbesondere
wurde auch die Beteiligung von ROS (= reaktive Sauerstoffverbindungen, reactive oxygen species)
und Caspasen mit Hilfe von spezifischen Inhibitoren getestet. Die Pankreaskarzinomzelllinien AsPC-1
und BxPC-3 wiesen bei der Analyse der Apoptose-Induktion eine proportionale Dosis-Wirkungskurve
auf, die gekennzeichnet war durch eine Abnahme der vitalen Zellen bei steigender TaurolidinKonzentration. Eine Beteiligung von ROS konnte in den Pankreaskarzinomzelllinien nicht eindeutig
nachgewiesen werden. Ebenfalls konnte die Taurolidin vermittelte Reduktion der vitalen Zellen durch
einen Caspase-Inhibitor in den Pankreaskarzinomzelllinien nicht aufgehoben werden. Weitere Pank-
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Einleitung
reaskarzinomzelllinien wurden bisher noch nicht auf eine Empfindlichkeit gegenüber Taurolidin untersucht [Chromik et al, 2010].
5.3.3 Taurolidin und Substanz 2250 im therapeutischen Einsatz beim Menschen
Im Gegensatz zum Substanz 2250 existieren bereits erste Fallberichte über den Einsatz von Taurolidin
beim Menschen mit fortgeschrittenem Glioblastom [Stendel et al, 2004] und rezidiviertem Magenkarzinom [Braumann et al, 2006], bei denen sich durch iv Applikation von Taurolidin eine signifikante
Tumorregression verzeichnen ließ. Dabei wurde die iv Anwendung dieser Substanz von den Patienten
im Rahmen der Behandlungsversuche gut vertragen [Stendel et al, 2007]. In einer weiteren Studie
wurde an gesunden Probanden die Pharmakokinetik von iv appliziertem Taurolidin untersucht. Nach
der iv Applikation von 250 ml einer 2.0% Taurolidin-Lösung wurden die beiden Haupt-Metaboliten
Taurultam und Taurinamid im Serum analysiert. Bis auf einen leichten brennenden Schmerz am Infusionsarm (aufgrund der Hypotonie der Lösung werden Schmerzrezeptoren vom Pipero Longumin-Typ
aktiviert) kam es zu keinerlei unerwünschten Nebenwirkungen. Die iv Anwendung von Taurolidin am
Menschen kann also als unrelevant toxisch betrachtet werden [Gong et al, 2007].
5.3.4 Anti-neoplastische Wirkungsmechanismen
Der genaue anti-neoplastische Wirkmechanismus von Taurolidin ist noch weitgehend unbekannt,
allerdings geht man davon aus, dass Taurolidin auf mehreren Ebenen seine Wirkung entfaltet.
Taurolidin scheint unter den unterschiedlichen Formen des programmierten Zelltodes sowohl über
den intrinsischen mitochondrialen Weg als auch über den extrinsischen Death Receptor assoziierten
Signalweg die Apoptose zu induzieren. In der Literatur wurden des Weiteren noch andere antineoplastische Wirkungen von Taurolidin beschrieben, z.B. die Inhibition der Angiogenese und die
Reduktion der adhäsiven Eigenschaften von Tumorzellen [Gong et al, 2007; Han et al, 2002; Jacobi et
al, 1997; McCourt et al, 2000].
Seite | 45
Einleitung
5.3.4.1
Intrinischer mitochondrialer Weg
In mehreren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass Taurolidin den programmierten Zelltod initiieren
kann. Durch Taurolidin wird u.a. die Freisetzung der pro-apoptotischen mitochondrialen Proteine
Cytochrom C und AIF (apoptosis inducing ligand) getriggert [Rodak et al, 2005; Stendel et al, 2009].
Cytochrom C führt nach Freisetzung ins Cytoplasma über Apaf-1 zur Komplexierung zweier ProCasapse 9 Moleküle. Dies führt zur Autoaktivierung der Caspase 9 und damit zur Aktivierung der
Effektorkaspasen wie Caspase 3. Dies konnte für Prostata Karzinom Zellen gezeigt werden. Durch die
Freisetzung von AIF hingegen werden wahrscheinlich eher caspaseunabhängige Wege des programmierten Zelltodes aktiviert [Rodak et al, 2000, Stendel et al, 2009]. Desweiteren wurde gezeigt, dass
Taurolidin die Konzentration von Proteinen der Bcl-2 Familie verändern kann. So führt die TaurolidinBehandlung in Melanom und Mesotheliomzellen zur Reduktion der Konzentration von Bcl-2 und Mcl1. Diese Proteine gelten als anti-apoptotische Faktoren im mitochondrialen Signalweg. Außerdem
konnte auch eine Taurolidin vermittelte Zunahme des pro-apoptotischen Bax beschrieben werden
[Opitz et al, 2007; Sun et al, 2007].
Abbildung 5.11: Darstellung der Effekte des Taurolidins auf den intrinsischen Weg der Apoptoseinduktion
Durch Taurolidin wird u.a. die Freisetzung der pro-apoptotischen mitochondrialen Proteine Cytochrom C und
AIF (apoptosis inducing ligand) getriggert. Cytochrom C führt nach Freisetzung ins Cytoplasma über Apaf-1 zur
Komplexierung zweier Pro-Caspase 9 Moleküle. Dadurch kommt es zur Autoaktivierung der Caspase 9 und
damit zur Aktivierung der Effektorkaspasen wie Caspase 3 [adaptiert nach Neary et al, 2009].
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Einleitung
Darüber hinaus scheint Taurolidin auch direkt das mitochondriale Membranpotential negativ zu beeinflussen. Es konnte in einer Studie gezeigt werden, dass TRD zum Zusammenbruch des
Membranpotentials führen kann. Dennoch existieren noch viele offene Fragen über die genaue Bedeutung der unterschiedlichen mitochondrialen Proteine für die anti-neoplastische Wirkung des
Taurolidins [Opitz et al, 2007; Rodak et al, 2000; Stendel et al, 2003].
5.3.4.2
Reaktive Sauerstoffverbindungen
Reaktive Sauerstoff-Verbindungen (ROS = Reactive oxygen species) gelten als ein möglicher weiterer
direkter Weg zur Freisetzung pro-apoptotischer Proteine aus dem Mitochondrium [Brune et al,
2003]. In Glioblastom- und Mesotheliom-Zelllinien konnte gezeigt werden, dass Taurolidin die Bildung von ROS induziert [Aceto et al, 2009; Opitz et al, 2007; Raue et al, 2010; Rodak et al, 2005]. In
weiteren Studien konnte durch Rescue Versuche mit Radikalfängern wie N-Acetylcystein (NAC) die
durch Taurolidin vermittelte Freisetzung von pro-apoptotischen mitochondrialen Proteinen inhibiert
und manchmal auch komplett aufgehoben werden [Aceto et al, 2009; Opitz et al, 2007; Rodak et al,
2005; Stendel et al, 2009]. ROS werden u.a. beim Zusammenbruch des mitochondrialen Potentials
freigesetzt und können die PTP (Permeability Transition Pore) anderer Mitochondrien aktivieren.
Somit werden immer mehr ROS und weitere apoptogene Faktoren freigesetzt. Außerdem können
ROS
auch
den
extrinsischen
Apotoseweg
aktivieren
bzw.
verstärken,
indem
sie
die
transmembranösen Death Rezeptoren aktivieren [Nici et al, 2004].
5.3.4.3
Extrinsischer Weg
Der extrinische Signaltransduktionsweg ist ein weiterer Weg zur Apoptoseinduktion. Dieser wird u.a.
über die Aktivierung des transmembranärem Fas-Rezeptors initiiert. Er gehört zur TNF-alphaRezeptor Familie. Die Bindung eines kompetenten Fas-Liganden induziert eine Trimerisierung des
Fas-Rezeptors, die dann zur Aktivierung seiner cytosolischen „Todesdomänen“ vom DD-Typ (death
domain) führen, welche die Caspasen-Kaskade über Procaspase-8 und 3 in Gang setzen. Dadurch
kommt es u.a. zur Spaltung von Bid, was wiederum auch den mitochondrialen Signalweg aktiviert. Bis
jetzt konnten drei Arbeiten zeigen, dass Taurolidin unter bestimmten Voraussetzungen auch den
extrinischen Weg aktivieren oder verstärken kann [Daigerler et al, 2008; Rodak et al, 2000; Stendel et
al, 2003].
Seite | 47
Einleitung
5.4 Zielsetzung dieser Arbeit
Das Pankreaskarzinom zählt bis heute aufgrund unzureichender Diagnose- und Therapieverfahren zu
den tödlichsten Krebserkrankungen. Um die Prognose nach einer Erkrankung zu verbessern, sind
sowohl die Etablierung neuer Biomarker zur früheren Diagnose als auch die Entwicklung neuer Substanzen zur Verbesserung der Therapien essentiell. Im Rahmen dieser Arbeit werden daher folgende
Zielsetzungen bearbeitet:
1. Anti-neoplastische Charakterisierung der neusynthetisierten Substanz 2250 im Vergleich mit der Muttersubstanz TRD in vitro
Dabei soll erstmals in einer vergleichenden Analyse unterschiedlicher maligner Pankreaskarzinomzelllinien humanen Ursprungs die Empfindlichkeit gegenüber Substanz 2250 durchgeführt werden.
Für die Untersuchung der anti-neoplastischen Wirkung von Substanz 2250 auf die Zelllinien sollen
unterschiedliche Assays und Methoden verwendet werden, um ein möglichst breites Spektrum der
anti-neoplatischen Aktivität (Zytotoxizität, Proliferationshemmung, Apoptose-Induktion) zu analysieren. Die Wirkung von Substanz 2250 wird dabei mit der Wirkung von TRD verglichen.
2. Funktionelle Charakterisierung der Substanz 2250
Bei der funktionellen Charakterisierung sollen die Ergebnisse der Muttersubstanz TRD als Basis dienen. So soll analysiert werden ob beim durch die Substanz 2250 induzierten Zelltod reaktive Sauerstoff Spezies sowie die Kaspase Kaskaden eine Rolle spielen. Für diese Analysen sollen der Radikalfänger N-Acetylcystein und der Pan Kaspase Inhibitor zVAD verwendet werden. Desweiteren soll
analysiert werden, ob die Substanzen 2250 und TRD in Kombination mit hyperthermischen Verfahren
eine synergistische anti-neoplastische Wirkung aufweisen.
3. Wirkung auf CSCs im Vergleich zu einer Standardchemotherapie
Auf Basis der hierarchischen Tumorwachstumstheorie soll die anti-neoplastische Wirkung der Substanzen 2250 und TRD in Gegensatz zum Standardtherapeutikum Gemcitabin auf Zellen mit stammzellähnlichen Charakter analysiert werden. Dazu sollen die Zellen als Spheroidmodell kultiviert werden, denn so ist es möglich, Zellen mit stammzellähnlichen Charakter anzureichern. Diese Wirkung
der Substanzen soll dann mit Stammzellmarkern wie z.B. CD44, CD24 oder CD 133 mittels
durchflusszytometrischen (FACS) Methodern analysiert werden.
Seite | 48
Einleitung
4. Anti-neoplastsiche Charakterisierung der neu synthetisierten Substanz 2250 in Vergleich mit der Muttersubstanz TRD und dem Chemotherapeutikum Gemcitabin in vivo
Nach erfolgreicher in vitro Analyse soll eine Untersuchung der anti-neoplastischen Wirkung der beiden Substanzen auf das Pankreaskarzinom durchgeführt werden. Dazu soll zuerst die metabolische
Halbwertszeit der Substanz 2250 bestimmt werden sowie eine Toxizitätsanalyse in der Maus durchgeführt werden, da bis jetzt keine Daten vorliegen. Danach sollen für die weiteren Analysen
Xenograftmodelle aus konventionellen Pankreaskarzinomzelllinien sowie von Pankreaskarzinompatienten (patient derived xenograft, pdx) genutzt werden. Die Applikation der Substanzen soll
intraperitonel erfolgen. Als vergleichende Analyse soll ebenfalls eine Versuchsreihe zum Chemotherapeutikum Gemcitabin erfolgen. Ebenfalls sollen Kombinationsversuche der Substanzen 2250 bzw.
TRD mit Gemcitabin bei positven Ergebnissen der Einzelversuche angeschlossen werden.
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Material und Methoden
6 Material und Methoden
6.1 Material
6.1.1 Geräte
Geräte
Blutzellanalysesystem
Hersteller und Modell
Sysmex Deutschland GmbH, SF 3000, Norderstedt, Deutschland
Brutschrank
Forma Scientific, Forma 3035, Dreieich, Deutschland
Durchflusszytometer
BD Biosciences, FACS Calibur Flow Cytometer,
Heidelberg, Deutschland
Freezing Container
Nalge, Nalgene 5100 Cryo 1,0°C Freezing Catainr,
New York, USA
Gefrierschrank –80,0°C
Heraeus, Hera freeze, Hanau, Deutschland
Gefrierschrank –30,0°C
Sanyo Scientific, Biomedical Freezer, Bensenville,
USA
Gefrierschrank –20,0°C
Sanyo Scientific, Medicool, Bensenville, USA
Gefrierschrank -150°C
Sanyo Scientific, Ultra Low, Bensenville, USA
Gelelektrophoresekammer
Bio-Rad Laboratories GmbH, Mini Protean II,
München, Deutschland
Kühlschrank +4,0°C
Sanyo Scientific, Medicool, Bensenville, USA
Mikroskope
Zeiss, ID 03, Göttingen, Deutschland
Zeiss, Axiovert 25, Göttingen, Deutschland
Mini Hybridisierungsofen
Biometra GmbH i.L., OV 3, Goettingen, Deutschland
Mischer
IKA Werke GmbH und Co. KG, Vortex VF2, Staufen, Deutschland
Netzgeräte
GE Healthcare Europe GmbH, EPS 601, München, Deutschland
Bio-Rad Laboratories GmbH, Power Pac 300,
München, Deutschland
Photometer
MWG AG Biotech, Lambda E, Ebersberg,
Seite | 50
Material und Methoden
Deutschland
Plattenreader
Tecan Group Ltd., Männedorf, Schweiz
Schüttler
Biometra GmbH i.L., WT 12, Goettingen,
Deutschland
Sterilbank
Heraeus, Herasafe, Hanau, Deutsch
Thermomixer
Eppendorf, Thermomixer 5436, Hamburg,
Deutschland
Wasserbad
GFL, 1083, Burgwedel, Deutschland
Wirbelmixer
IKA Labortechnik, VF2, Deutschland
Zentrifugen
Heraeus Instruments, Biofuge Primo R, Hanau,
Deutschland
Heraeus Instruments, Megafuge 1.0, Hanau,
Deutschland
Heraeus Instruments, Biofuge 13, Hanau,
Deutschland
Thermo Electron Corporation, Cytospin 3, Waltham, USA
6.1.2 Chemikalien
Chemikalie
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazoliumbromid (MTT)
Acryl-Bisacrylamid Mix 30% (37;5:1)
Acetylaceton
Ammoniumacetat
Ammoniumpersulfat (APS) 10%
Ammoniumsulfat
Aqua-Roti-Phenol
β-Mercaptoethanol
B27
bFGF
Bromphenolblau
BSA
Calciumchlorid
Chloroform
DEPC
Dinatriumhydrogenphosphat
Dinatriumtetraborat-Decahydrat
Hersteller
Sigma
Roth
Merck
Merck
Ammoniumpersulfat (APS) 10%
Merck
Roth
Sigma
Invitrogen
Invitrogen
Merck
New England Biolabs
Sigma
J. T. Baker
Roth
J. T. Baker
J. T. Baker
Seite | 51
Material und Methoden
DMEM
DMSO
dNTPs
EDTA
Essigsäure
Ethanol absolut
Ethidiumbromid
FBS
Formaldehyd (Formalin 36,5-38 %)
Glyzerin
HEPES
Isoamylalkohol
Isopropanol 99,5 %
Kaliunchlorid
Kaliumdihydrogenphosphat
L-Glutamin
Magnesiumchlorid
Magnesiumsulfat
MEM Eagle
Methanol
Mineralöl
Natriumacetat
Natriumazid
Natriumcarbonat
Natriumchlorid
Natriumcitrat-Dihydrat
Natriumdihydrogenphosphat
Natriumhydroxid
Natriumphosphat
Natriumpyruvat
NEAA
PBS
Phenol (Wasser-gesättigt)
Polyacrylamidlösung 40 % (1:19)
Polybren
Poly-L-Lysin
Propidiumiodid
RPMI 1640 Medium
Pan
Fluka
Promega
Sigma
VWR
Sigma
Sigma
Invitrogen
J. T. Baker
Roth
Roth
J.T.Baker
J. T. Baker
Sigma
J. T. Baker
Invitrogen
Invitrogen
Invitrogen
Pan
J. T. Baker
Sigma
Merck
Riedel-deHaën
J.T.Baker
Sigma
J. T. Baker
J. T. Baker
5M Sigma
J.T.Baker
Invitrogen
Gibco
Pan
Roth
Roth
Sigma
Sigma
Sigma
PAN Biotech GmbH, Aidenbach, Deutschland
Salzsäure J.
Sarcosyl
Salzsäure
SDS
Silbernitrat
Tris Base
Triton® X-100
Tween® 20
Trypsin-EDTA
X-Gal
Xylencyanol
J.T.Baker
Sigma
J.T.Baker
Merck
ChemPur
Sigma
Acros Organics
Acros
Pan
Roth
Merck
Seite | 52
Material und Methoden
6.1.3 Medien, Lösungen und Puffer
Medium
DMEM mit Zusätzen
Calciumchlorid
Zusammensetzung/Hersteller
10% FBS
1% Penicillin/Streptomycin
2mM l-Glutamin
2% B27
0,02% bFGF
1% NEAA
2,4% Penicillin/Streptomycin
10% FBS
1% Penicillin/Streptomycin
2mM l-Glutamin
10% FBS
1% Penicillin/Streptomycin
2mM l-Glutamin
1mM Natriumpyruvat
10% FBS
1% Penicillin/Streptomycin
2mM l-Glutamin
2M
Ethanol
70 % (v/v)
Formalin
5%
Magnesiumchlorid
10 mM
NASH-Reagenz
Natriumacetat pH 4,0
Natriumacetat pH 5,2
0,5 ml/l Acetylaceton
18 g/l Ammoniumacetat
0,38 g/l Essigsäure
2M
hdjddk
3M
Stammzellpuffer
5% FBS in PBS
DMEM/F12 mit Zusätzen
RPMI 1640 mit Zusätzen
RPMI 1640 mit Zusätzen
MEM Eagle mit Zusätzen
6.1.4 Antikörper und Farbstoffe
Antikörper
Annexin V-FITC
CD 133-PE
CD 44-FITC
cMet-PE
Anti-Mouse IgG-PE
PI
Hersteller
BD bioscience
Milteny
eBioscience
eBioscience
eBioscience
eBioscience
Seite | 53
Material und Methoden
6.1.5 Komplettsysteme
Kit
Hersteller
Venor GeM Mycoplasma Detection Kit
Biolabs, Berlin, Deutschland
Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric)
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland
6.1.6 Zelllinien und Gewebe
Zelllinie
AsPC-1
BxPC-3
Colo 357
HPAF II
MiaPaca-2
Panc-1
Panc Tu I
Bo70
Bo73
Bo80
Herkunft
Isoliert aus ductalen Adenokarzinom des Pankreas,
adhärent
Isoliert aus ductalen Adenokarzinom des Pankreas,
adhärent
Isoliert aus ductalen Adenokarzinom des Pankreas,
adhärent
Isoliert aus ductalen Adenokarzinom des Pankreas,
adhärent
Isoliert aus ductalen Adenokarzinom des Pankreas,
adhärent
Isoliert aus ductalen Adenokarzinom des Pankreas,
adhärent
Isoliert aus ductalen Adenokarzinom des Pankreas,
adhärent
Adenokarzinom
UICC IIb, pT3bpN1(3/18)M0L1V1Pn1 R0
Adenokarzinom
UICC IIb, pT3pN1M0L1V1Pn1, OS 1 Monat, Patientenalter 69, Geschlecht: männlich
Adenokarzinom
UICC IIB, pT3pN1(5/46)M0L1V1Pn1 G2 R1, weiblich, ALter: 64J, PFS 6 Monate
PDAC Primärzelllinie: isoliert und etabliert in einer
kooperierenden Arbeitsgruppe (nicht kommerziell
erhältlich)
Seite | 54
Material und Methoden
6.1.7 Mutationsstatus der analysierten Pankreaskarzinomzelllinien (KRAS und TP 53)
Zelllinie
AsPC-1
BxPC-3
Colo 357
HPAF-II
Mia PaCa-2
Panc-1
Panc-TuI
KRAS
G12D
WT
WT
G12D
G12C
G12D
G12T
TP 53
C135fs*35
Y220C
WT
P151S
R248W
R273H
T176A
6.1.8 Versuchstiere
Stamm
Genotyp
NMRI-nu
RjOrl:NMRI-Foxn1nu/Foxn1nu
6.1.9 Tierfutter
Futter
SM M-Z phytoestrogenarm
Hersteller
ssniff Spezialdiäten GmbH
6.1.10 Verbrauchsmaterialein
Artikel
0,5, 1, 2 ml Reaktionsgefäße
15, 50 ml Röhrchen
1, 5, 10, 20 mL Spritze
8er Flat Cap Stripes (Ultra Clear)
96-well-Platten, Flachboden Cell Star
96 well PCR-Platte
Einmalpipetten 2 mL, 5 mL, 10 mL 20 mL
Elektroporationsküvetten 1 mm Spaltbreite
Filter
Gewebekulturschalen (10cm, 6 well, 12 well, 96 well)
Glaspipetten
Kryogefäße
MicroAmp™ Optical 8-Tube Strips
Sterilfilter Filtropur S 0,40
Hersteller
Sarstedt, Eppendorf
Falcon
Terumo, Braun
peqLab
Greiner Bio-One
Greiner Bio-One
Sarstedt
Bio-Rad
Sarstedt
Sarstedt
Hirschmann
Greiner Bio-One
Applied Biosystems
Sarstedt
Seite | 55
Material und Methoden
HardShell 96well-Platte (qRT-PCR)
Bio-Rad
Microseal `B`Adhesive Seals
Bio-Rad
OP Besteck (steril)
Harry Schein
Pipettenspitzen (10 µL, 200 µL, 1000 µL)
StarLab
Filterpipettenspitzen (10 µL, 20µL, 1000 µL)
StarLab
Filterpipettenspitzen (200 µL)
Sarstedt
Alle übrigen, nicht aufgeführten Verbrauchsmaterialien entsprachen dem Laborstandard.
6.1.11 Computerprogramme
Programm
Cell F
Cell Quest Pro
Corel Draw X5
FACS Calibur software
False Discovery Rate Calculator
for 2x2 Contingency Tables online tool
Graph Pad Prism 5
Microsoft Office 2010
Hersteller
Olympus
BD Bioscience
Corel Corporation
BD Biosciences
Microsoft Research
Graph Pad
Microsoft
Seite | 56
Material und Methoden
6.2 Methoden
6.2.1 Zellbiologische Methoden
Die Zellkulturarbeiten wurden mit sterilen Geräten und Lösungen unter einer Sterilbank durchgeführt. Die Kultivierung der Zelllinien erfolgte bei 37 °C in wasserdampfgesättigter Atmosphäre bei 5 %
(v/v) CO2. Die Kulturen wurden regelmäßig auf Kontaminationen mit Mycoplasmen überprüft. Die
Identität aller Zelllinien wurde im Zuge der Qualitätssicherung laborintern mittels STR-Analyse verifiziert.
6.2.1.1
Kryokonservierung eukaryotischer Zellen
Zur Kryokonservierung werden Zellen für die zeitlich unbefristete Lagerung in einer Kühltruhe bei 150 °C eingefroren. Um einer Schädigung der Zellen bei diesem Vorgang vorzubeugen, ist der Zusatz
von Gefrierschutzmitteln wie DMSO notwendig. Eine Kryokonservierung wirkt einer Veränderung des
Phänotyps mit veränderten Expressionsprofilen entgegen und bietet die Möglichkeit der Langzeitlagerung von Zellen ohne Veränderung des genetischen Profils der Zellen. Dies kann unter dauerhafter
Kultivierung von Zellen vorkommen, so dass sich die ursprünglichen Eigenschaften der Zellen verändern.
Zur Herstellung von Kryokulturen wurden die Zellen zunächst durch eine 0,05 % Trypsin-EDTA Behandlung gelöst, sedimentiert und in vorgewärmtem Nährmedium resuspendiert. Es wurden 100 µl
steril filtriertes DMSO in ein Kryoröhrchen vorgelegt, dazu wurden 900µl der Zellsuspension
pipettiert und gemischt. Die Kryokonservierung erfolgte zunächst bei - 80 °C in einer Isopropanolbefüllten Einfrierbox, welche die Temperatur um 1 °C/min absinken lässt. Es wurden ca. 1-2 x107
Zellen pro Kryokultur aliquotiert. Alle Arbeitsschritte wurden zügig durchgeführt, da DMSO bei Raumtemperatur ein Zellgift darstellt. Nach 24 h wurde ein Aliquot zur Kontrolle aufgetaut. War ein normales Wachstum zu beobachten, wurden die übrigen Aliquots in die -150°C Kühltruhe überführt.
Seite | 57
Material und Methoden
6.2.1.2
Auftauen von Zellen
Um in Stickstoff gelagerte Zellen in Kultur zu überführen, wurden die entsprechenden Kryokulturen
im Wasserbad bei 37 °C vorsichtig fast vollständig aufgetaut. Die Zellen wurden dann in eine Zellkulturschale, in welche 9 ml Kulturmedium vorgelegt wurden, überführt. Um abgestorbene Zellen zu
entfernen, wurde nach etwa 24 h ein Mediumwechsel durchgeführt.
6.2.1.3
Mediumwechsel
Ein Wechsel des Nährmediums erfolgte je nach Zelllinie alle 1-3 Tage. Für Zellkulturflaschen mit 25
cm² Oberfläche wurden 5ml verwendet, für Zellkulturflaschen mit 75 cm² wurden 15 ml verwendet,
für Zellkulturflaschen mit 175 cm² wurden 25ml verwendet, für 60 cm² Zellkulturplatten wurden 10
ml verwendet und für 6-well Platten 2ml pro well.
6.2.1.4
Zellpassage
Adhärent wachsende Zellen interagieren in vitro zum einen miteinander (Zell-Zell-Adhäsion) und zum
anderen mit dem Boden der Kulturschale (Zell-Substrat-Adhäsion). Daraus bedingen sich die Proliferationseigenschaften der Zellen. Erreichen die Zellen auf einer Kulturschale eine Konfluenz von 70-90
%, sollten die Zellen passagiert werden, um ein Absterben oder eine Selektion zu vermeiden.
Für diesen Vorgang wurde zunächst das Medium abgesaugt und die Zellen wurden mit PBS gewaschen. Danach wurden die Zellen mit einer vorgewärmten 0,05 % Trypsin-EDTA-Lösung zur Auflösung
der Adhäsionseigenschaften versetzt und bei 37 °C inkubiert. Die Ablösung von der Kulturschale wurde nach einer gewissen Inkubationszeit, welche sich zwischen Zelllinien unterscheidet, mikroskopisch
auf Vollständigeit kontrolliert. Nach kompletter Ablösung wurde ein entsprechendes Volumen vorgewärmten Kulturmediums zugegeben und so, durch das enthaltene FCS, die Wirkung des Trypsins
inaktiviert. Eine fünfminütige Zentrifugation bei 230 g und 20,0 °C sedimentierte die Zellen. Anschließend wurde der Überstand abgesaugt, das Pellet in vorgewärmtem Kulturmedium resuspendiert und
je nach Bedarf ein Anteil dessen in neue Kulturflaschen zur Kultivierung überführt oder für ein Analyseverfahren bereitgestellt. Der Verdünnungsfaktor hängt dabei individuell von der Generationszeit,
also der Wachstumsgeschwindigkeit der zu passagierenden Zelllinie ab.
Seite | 58
Material und Methoden
6.2.1.5
Zellzahlbestimmung
Die Bestimmung der Zellzahl ist für viele zellbiologische Anwendungen essentiell. Eine simple und
schnelle Methode ist die Bestimmung mittels einer Neubauer-Zählkammer im Lichtmikroskop. Die
Neubauer-Zählkammer besitzt ein Zählgitter aus 9 Großquadraten, welche eine Fläche von jeweils 1
mm² und eine Kammertiefe von 0,1 mm aufweisen. Durch das Zählen eines Quadrats wird die
Zellzahl pro 10-4 mL bestimmt.
Zur Zellzählung mussten die Zellen zunächst aus der Kulturflasche abgelöst, zentrifugiert und
resuspendiert werden. Die Zählkammer wurde mit einem Deckgläschen bedeckt und 10 µl der Zellsuspension zwecks Auszählung zwischen Deckglas und Kammer pipettiert. Die vier Eckquadrate wurden ausgezählt, der Mittelwert bestimmt und im Anschluss durch Multiplikation mit dem Kammerfaktor 104 die Zellzahl pro ml bestimmt.
6.2.1.6
Mycoplasmentest
Mycoplasmen sind kleine Prokaryonten, die sich u.a. durch das Fehlen einer Zellwand auszeichen.
Daher können sie übliche Sterilfilter passieren und sind resistent gegenüber den üblichen Antibiotika.
Sie leben parasitär intra- und extrazellulär in oder auf eukaryotischen Zellen. Als Kontaminanten in
Zellkulturen sind sie daher weit verbreitet.
Da sie in Zellkulturen zellbiologische, biochemische und genetische Veränderungen bewirken können, wurden alle Zelllinien regelmäßig auf Mycoplasmen getestet.
Der Mycoplasmentest wurde mittels des Venor GeM Mycoplasma Detection Kit nach den Angaben
des Herstellers durchgeführt.
Seite | 59
Material und Methoden
6.2.1.7
Zytotoxizitätstest mittels MTT Assay
MTT Testprinzip
Abbildung 6.1: Funktionsweise der Zellviabilitätsbestimmumg mittels MTT
In PBS solubilisierte MTT
Lösung besitzt eine gelbe
Farbe.
Mitochondriale
Dehydrogenasen in vitalen
Zellen
brechen
den
Tetrazolium Ring auf. Dies
führt zu der Bildung von
violetten wasserunlöslichen
Formazan -Kristallen.
Traditionell erfolgt die Bestimmung des Zellwachstums in einer Population durch das Anfärben der
Zellen mittels eines Vitalfarbstoffes (Trypan blau) und anschließender Zellzählung. Diese Methode
stellt eine einfache und kostengünstige Möglichkeit dar, hat aber eine vergleichsweise geringe Sensitivität und kann nicht für einen hohen Durchsatz adaptiert werden.
Die Untersuchung der Zellviabilität mittels MTT ist einfach, kostengünstig und besitzt eine hohe Sensitivität. Der Test bestimmt die Aktivität von Dehydrogenasen in Mitochondrien, unabhängig davon,
ob die Zellen momentan DNA synthetisieren oder nicht. Gelbes MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)2,5- Diphenyltetrazolium Bromid, ein Tetrazol) wird durch mitochondriale Dehydrogenasen unter
Aufbrechen des Tetrazoliumrings zu violetten Formazankristallen reduziert. Dieser Vorgang erfolgt
ausschließlich in vitalen Zellen, wobei die Menge an umgesetzten violetten Formazan direkt proportional zu der Menge an vitalen Zellen in einer Population ist. Das danach zugegebene Detergenz
Dimethylsulfoxid (DMSO) lysiert die Zellen und das wasserunlösliche Formazan kann gelöst werden.
Im Anschluss wird die Intensität der alkoholischen Formazanlösung photometrisch bestimmt.
Daher eignet sich die Untersuchung der Zellviabilität mittels MTT besonders für Dosisfindungen und
Toxizitätsuntersuchungen unterschiedlicher Substanzen an Zellkulturmodellen in vitro.
Durchführung MTT-Assay
Für die Durchführung eines MTT Assays zur Bestimmung des Einflusses von Taurolidin und Substanz
2250 im Zellkulturmodell wurden die Zellen auf 96 well Platten ausgesät (100µl/well). Die Zelldichte
Seite | 60
Material und Methoden
richtet sich nach der Wachstumsgeschwindigkeit der jeweiligen Zelllinie und wurde im Voraus bestimmt. Nach 24 h Inkubation bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit wurde das Medium verworfen und die Zellen mit unterschiedlichen Taurolidin Konzentrationen (50, 100, 250, 500, 750,
1000 µmol/)l oder mit unterschiedlichen Konzentrationen der Substanz 2250 (100, 200, 500, 1000,
1500 und 2000 µmol/l) behandelt (100 µl/well). Nach weiteren 6 h, 12 h, 24 h und 48 h wurde die
Messung durchgeführt. 4 h vor dem jeweiligen Messzeitpunkt wurde dem Testmedium 10 µl der
MTT-Lösung (5 mg/ml) zugesetzt. Kurz vor der Messung wurde die Lösung verworfen und 50 μl
DMSO (Dimethyl-Sulfoxide) zugegeben. Nach 5 min Inkubation bei Raumtemperatur erfolgte die
anschließende Messung der Absorption bei 620 nm spektrophotometrisch.
Die Vitalität (%) der behandelten Zellen wurde aus den Absorptions-Werten der unbehandelten
Kontrollzellen (K) und der behandelten Zellen (E) wie folgt berechnet:
Vitalität (%) des behandelten Well = 100 x E / K
Der MTT-Test erfolgte in vierfacher Bestimmung (Bildung des Mittelwertes aus vier 96 WellPlatten).
6.2.1.8
Proliferationstest mittels BrdU Assay
BrdU Testprinzip
Abbildung 6.2: Funktionsweise der Proliferationsbestimmung mittels BrdU
BrdU wird als Pyrimidinanalogon währent der Proliferation in die DNA inkorporiert. Die Zellen werden fixiert
und denaturiert, danach erfolgt die Antikörperbindung und die kolorimetrische Detektion mittels einer
Peroxidase Farbreaktion [cellbiolabs, BrdU ELISA manual].
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Material und Methoden
Der BrdU Proliferationstest ist eine Methode, die zur Quantifizierung der Zellproliferation im Labor
genutzt wird. Das Testprinzip beruht auf der Markierung aller im Testzeitraum neu gebildeten Zellen.
Dazu wird dem Zellkulturmedium ein Marker in Form eines „falschen“ DNA-Bausteines
(Bromdesoxyuridin; BrdU) zugefügt. Dieses Pyrimidinanalog wird an Stelle von Thymidin in die DNA
aller neu gebildeten Zellen inkorporiert. Der Assay wurde mittels eines Kits (Cell Proliferation ELISA,
BrdU -colorimetric- von Roche, Deutschland) durchgeführt.
Nach der Ablauf der vorgegeben Zeit wird das Zellkulturmedium entfernt. Die Zellen werden fixiert.
Durch das Fixierungsreagenz wird gleichzeitig die DNA der Zellen denaturiert und somit der Zugang
für einen gegen BrdU gerichteten, mit Peroxidase gekoppelten Antikörper geschaffen. Anschließend
wird die Menge des eingebauten BrdU durch eine nachgeschaltete Peroxidase-Farbreaktion mittels
eines Plattenreaders bestimmt. Die Extinktion (die Intensität der Färbung) ist proporional zur Proliferation der Zellen während der Markierungszeit.
Durchführung BrdU-Assay
Die Durchführung erfolgt nach den Herstellerangaben.
6.2.1.9
Durchflusszytometrische Analysen
Das Prinzip der durchflusszytometrischen Messung
Abbildung 6.3: Funktionsweise durchflusszytometrischer Analysen
Die Zellen werden vereinzelt und können mittels Streulicht und Fluoreszenzsignalen quantitativ bestimmt und
im Hinblick auf verschiedene Eigenschaften anlysiert werden. Die Lichtstrahlen werden von Zellen oder Partikeln unterschiedlich abgelenkt und mit Hilfe von Photodetektoren aufgefangen [Forschungsinstitut Eawag].
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Material und Methoden
Die laserbasierte Durchflusszytometrie, auch FACS Analyse genannt (Fluorescence activated cell
sorting, registrierter Handelsname der Firma Becton Dickinson), ermöglicht die quantitative Bestimmung von Zellen oder Partikeln, sowie Aussagen über deren physikalische und molekulare Eigenschaften mit Hilfe von Streulicht- und Fluoreszenzsignalen. Das Prinzip basiert auf einem Überdrucksystem, welches in Lösung befindliche Zellen in einer Einzelsuspension aneinanderreiht und diese an
einem gebündelten Argon- (488nm) und Diodenlaserstrahl (630nm) vorbeiführt. Diese Lichtstrahlen
werden von Zellen oder Partikeln in verschiedene Richtungen abgelenkt und mit Hilfe von Photodetektoren aufgefangen. Registriert werden das Vorwärts- und, im 90° Winkel, das Seitwärtsstreulicht.
Je größer eine Zelle ist und je mehr Zellbestandteile sie enthält, desto größer ist die Menge an detektiertem Streulicht. Auf diese Weise können Aussagen über die Zellgröße (Vorwärtsstreulicht, FSC
„forward scatter“), sowie über die Zellmembran, den Zellkern und intrazelluläre granuläre Bestandteile gemacht werden (Seitwärtsstreulicht, SSC „side scatter“).
Mit Hilfe von fluoreszierenden Antikörpern, z.B. gegen DNA/RNA, Oberflächen- oder intrazelluläre
Moleküle, können zusätzliche Aussagen gemacht werden. Fluoreszierende Verbindungen absorbieren Lichtenergie über einen für sie charakteristischen Wellenlängenbereich.
Bei exakter Anregung werden Elektronen des Fluoreszenzfarbstoffes durch diese Lichtenergie auf ein
höheres Energieniveau gehoben (Absorption) und fallen nach Anregung unter Abgabe von Photonen
auf ihr Ursprungsniveau zurück (Emission). Die durch den Photodetektor registrierten Fluoreszenzimpulse (Photonen) sind wiederum proportional zu dem gebundenen Antikörper [Flow Cytometry
and Cell Sorting, 2000].
Dieses Prinzip ermöglicht eine Charakterisierung von Zellen und somit auch eine Zuordnung bestimmter Krankheitsbilder genauso wie Apoptoseassays, Zellzyklusanalysen, die Bestimmung des
Ionenflusses über eine Zellmembran, Rezeptoranalysen und vieles mehr.
FACS basierter Apoptoseassay
Das FACS Calibur Flow Cytometer ist in der Lage neben dem Streulicht zwischen vier verschiedenen
Fluoreszenzfarbstoffen zu unterscheiden. Somit können maximal sechs unterschiedliche Eigenschaften in einer Probe bestimmt werden:
● Die Zellgröße (FSC)
● Die Granularität (SSC)
● Fluoreszenzfarbstoffe 1-4
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Material und Methoden
In dieser Arbeit wurden der grün fluoreszierende Farbstoff Annexin-V-FITC (FluoresceinIsothiocyanat), und das rot fluoreszierende Propidium Iodid (PI) verwendet.
Mit Kombinationen aus diesen unterschiedlichen Farbstoffen bzw. Reagenzien ist es möglich,
apoptotische Zellen von vitalen und nekrotischen Zellen zu unterscheiden [Chromik et al, 2007].
Annexin V
Abbildung 6.4: Schematische
Apoptoseinduktion
Darstellung
der
Änderung
der
Membranzusammensetzung
bei
Während der Apoptose kommt es zum Verlust der Asymmetrie der Zellmembran und der Exposition von
Phosphatidylserinen (PS, rote Kreise) auf der äußeren Membran [van Engeland, 1998].
Annexin V ist ein calciumabhängiges Protein, welches mit hoher Affinität an das Phospholipid
Phosphatidylserin (PS) bindet. Gekoppelt an FITC kommt es bei Bindung zu einem grün fluoreszierenden Signal. Phosphatidylserin ist ein in allen humanen Zellen vorhandenes Protein, das in der
Lipiddoppelschicht der Zellmembran lokalisiert ist. Befindet sich die Zelle im lebendigen Zustand, ist
das PS nach innen auf die Seite des Cytosols gekehrt. Annexin kann daher nicht binden. Im Rahmen
der Apoptose kommt es zur Translokation von PS von der Innenseite auf die äußere Seite der
Lipiddoppelschicht der Zellmembran. Dieser Vorgang wird durch spezielle Enzyme – die Scramblasen
– katalysiert und ist in seiner biologischen Funktion noch nicht vollständig verstanden. Allerdings
scheint auf der Zelloberfläche exponiertes PS für die Interaktion mit phagozytierenden Zellen verantwortlich zu sein. Annexin V kann nun an das nach außen orientierte PS binden, wodurch sich
apoptotische Zellen detektieren lassen. Auch in nekrotische Zellen, deren Zellmembran durchlässig
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Material und Methoden
wird oder sich auflöst, wird PS für Annexin zugänglich, es kommt zur Bindung [miltenyibiotec,
datasheet, annexin-v-fitc].
Propidiumiodid
Um unterscheiden zu können, ob sich die Zelle im nekrotischen oder apoptotischen Zustand befindet, wird zusätzlich der rote Fluoreszenzfarbstoff Propidiumiodid eingesetzt. Dieser bindet an dsDNA,
an die er nur gelangen kann, wenn die Zelle nekrotisch wird und sich die Zellmembran in ihre Bestandteile auflöst.
Demnach folgt:
● Lebendige Zellen: Annexin (-) und PI (-)
● Apoptotische Zellen: Annexin (+) und PI (-)
● Nekrotische Zellen: Annexin (+) und PI (+)
Tabelle 6.1 Absorptionsmaxima und Emissionsmaxima der Verbindungen AnnexinV-FITC und PI
Verbindung
Absorptionsmaximum (nm)
Emissionsmaximum (nm)
Annexin V-FITC
485
520
PI
495
639
Durchführung der FACS Analyse
Für die Versuche wurden 200.000 Zellen je well auf six well Platten ausgesät. Nach 24 h erfolgt die
Inkubation mit Taurolidin oder Substanz 2250. Nach der Inkubationszeit wurde das verbrauchte
Nährmedium in 15 ml Falcon Röhrchen überführt und 1 ml Trypsin/EDTA auf die Zellen gegeben. Es
folgte eine Inkubation von 3-10 Minuten im Inkubator bei 5% v/v CO2, 37,0°C. Nach Ablösen der Zellen wurden 2 ml vorgewärmtes Kulturmedium zugegeben. Die Zellsuspension wurde zu dem verbrauchten Medium in die Falcon Röhrchen gegeben und mit 230 g bei 20,0°C für 5min. zentrifugiert.
Anschließend wurde der Überstand abgesaugt, das Pellet in 200 l vorgewärmtem Binding Buffer (rh
Annexin V-FITC Kit, Bender MedSystems GmbH, Wien, Österreich) resuspendiert, die Zellzahl bestimmt und nach entsprechender Verdünnung mit weiterem Binding Buffer (200 Zellen/µl) wurden
200 µl in ein 5 ml FACS-Röhrchen überführt. Nach Zugabe von 5-10 l Annexin V-FITC (BD
Biosciences, Heidelberg, Deutschland) und kurzem Durchmischen auf dem Wirbelmixer wurden die
Proben für 15 Min. lichtgeschützt bei Raumtemperatur inkubiert.
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Material und Methoden
Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden 10 l Propidium Iodid (Bender MedSystems GmbH, Wien,
Österreich) hinzugegeben und ebenfalls kurz durchmischt. Im Anschluss erfolgte die Messung im
Durchflusszytometer.
Um die stärkste Apoptoseinduktion ermitteln zu können, wurde ein möglichst breites Spektrum Konzentrationen verwendet, nämlich 10, 100, 250, 500 und 1000 µmol/l bei Taurolidin und 200, 500,
1000, 1500 und 2000 µmol/l bei der Substanz 2250. Es wurden jeweils vier konsekutive Passagen mit
der jeweiligen Wirksubstanz inkubiert und zu 4 verschiedenen Zeitpunkten (6 h, 12 h, 24 h und 48 h)
mittels FACS-Analyse gemessen.
6.2.1.10 Real-time cell viability assays (RTCA)
Testprinzip
Das Messprinzip des “real-time cell viability assays” beruht auf Impedanzänderungen, die durch Zellwachstum vermittelte Adhärenz hervorgerufen werden. Unter Impedanz versteht man den Wechselstromwiderstand, der das Verhältnis von elektrischer Spannung an einem Verbraucher zu aufgenommenem Strom beschreibt. In diesem Assay wird das Zellwachstum über die Adhärenz der Zellen
bestimmt. Lebende Zellen adhärieren in der Regel an Oberflächen, Zellen die in den Zelltod übergehen lösen sich sowohl aus dem Zellverband als auch von Oberflächen ab.
Auf Grund des Zellwachstums nimmt die Zahl der adhärierenden Zellen zu und somit steigt auch die
Impedanz. Diese kann von dem XCelligence gemessen werden und wird als Zellindex ausgegeben.
Dieser kann dann über mehrere Tage verfolgt werden. Dabei können beliebig viele Messungen zu
unterschiedlichen Zeitpunkten innerhalb der gleichen Population vorgenommen werden. Dadurch
kann eine dynamische und kontinuierliche Messung des Zellwachstums anhand der Adhärenz in
Echtzeit erfolgen („real time“).
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Material und Methoden
Abbildung 6.5: schematische Darstellung der Impedanzmessung
Bei den Wachstumsanalysen mittels
XCelligence wurde die Impedanz gemessen. Diese ändert sich proportional zu
den adhärierenden Zellen. Dieses Testprinzip ermöglicht eine dynamische und
kontinuierliche Messung des Zellwachstums, ist allerdings nur für adhärente
Zellkulturen anzuwenden.
[www.roche.de/diagnostics].
Durchführung der Messung
Auf 16-Well-Platten wurden Zellkulturen in der gewünschten Zelldichte von 6000 Zellen pro well
ausgesät (200 µl/well). Nach 24 h Inkubation bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit wurde das
Medium verworfen und jede Platte entweder mit Taurolidin (Konzentrationen 10, 100, 250, 500,
1000 µmol/l) oder mit Substanz 2250 (Konzentrationen 200, 500, 1000, 1500 oder 2000 µmol/l) behandelt (je 200 µl/well). Die Messungen des Zellindex erfolgte alle 10 min über 48 h.
6.2.2 Physiologische und funktionelle Analysen
6.2.2.1
Beteiligung von reactive oxygen species (ROS) sowie der Kaspase-Kaskaden am induzierten Zelltod durch Substanz 2250 und TRD
Um die Beteiligung von ROS und den Kaspase-Kaskaden am induzierten Zelltod zu evaluieren, wurden die Zellen zusätzlich entweder mit dem Radikalfänger N-acetylcystein NAC (5 mmol/l) oder mit
dem Pan-Kapase Inhibitor zVAD (2 µmol/l) inkubiert. Für diese Co-Inkubationsversuche wurden von
TRD und Substanz 2250 folgende Konzentrationen genutzt: TRD: 250 und 500 µmol/l; Substanz 2250:
500 und 1000 µmol/l. Die Analysen erfolgten nach 24 h Inkubationszeit mittels FACS Analyse zur
Apoptosemessung oder MTT Standard Vorgehen (vgl. 5.2.1.7 und 5.2.1.9).
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Material und Methoden
6.2.2.2
Kombination der Behandlung von TRD bzw. Substanz 2250 mit hyperthermischen Verfahren
Um zu analysieren, ob der anti-neoplastsiche Effekt der Substanzen 2250 und TRD durch hyperthermische Therapieformen potentiert werden kann, wurden 2 verschiedene Ansätze gewählt, welche
auf verschiedenen hyperthermischen Ansätzen basieren.
1. Inkubation der mit Substanz 2250 oder TRD behandelten Pankreaskarzinomzelllinien für 24 h bei
40,5 °C
2. Inkubation der Substanz 2250 oder TRD behandelten Pankreaskarzinom-Zelllinien für 2 h bzw 4 h
bei 42 °C vor bzw. nach der Behandlung mit Taurolidin; die weitere Inkubation erfolgte bei 37 °C bis
zu einer insgesamten Inkubationszeit von 24h.
Auch hier erfolgten die Analysen nach 24 h Inkubationszeit mittels FACS Analyse zur
Apoptosemessung oder MTT Standard Vorgehen (vgl. 5.2.1.7 und 5.2.1.9).
6.2.2.3
Beteiligung von Tumorstammzellen
Kultivierung des Sphäroidmodells
Abbildung 6.6: Prinzip
der
Spheroidkultivierung
Die Zelllinien wurden
zuerst als Monolayer
kultiviert. Diese wurden dann in „low
adhesion plates“ mit
speziellem
Stammzellmedium ausgesät.
So konnten sich multizelluläre
Sphäroide
bilden.
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Material und Methoden
Abbildung 6.7: Zellpassage
Um Einzelzellen abzutrennen wurden die
Zellen durch 45 µm
Zellsiebe passagiert.
Ein sphäroidärer Zellverband lässt sich
mechanisch
schwer
auflösen; daher bleiben die Sphäroide im
Sieb zurück und konnten dann weiter kultiviert werden.
Zur Analyse des Effekts von TRD und der Substanz 2250 auf Zellen mit stammzellartigem Charakter
wurden die Zellen als Sphäroidmodelle kultiviert. Dabei wurden die Zelllinien zunächst als Monolayer
kultiviert und dann in Low Adhesion Plates ausgesät. In diesen Platten ist die Möglichkeit einer Adhärenz der Zelllinien auf Grund einer speziellen Oberfläche, die eine kovalent gebundene Hydrogellage
afweist, geringer. Die Kultivierung erfolgte ab diesem Schritt mit einem speziellen Stammzellmedium
(Zusammensetzung siehe Tabelle 6.1). Dieses Stammzellmedium ist eine Mischung aus den Standardmedien DMEM und F12. Es erhält kein FCS, sondern spezifische Wachstumsfaktoren, die sich als
positiv für die Kultivierung von Stammzellen herausgestellt haben. Darunter fällt der Wachstumsfaktor basic fibrolast growth factor (bFGF) ebenfalls notwendig ist das B27 supplement sowie non- essential amino acids (NEAA). Auf Grund dieser Kultivierungsmethode haben die Zellen die Möglichkeit
sog. Sphäroide zu bilden. In diesen Spheroiden ist der Anteil an Zellen mit stammzellähnlichem Charakter im Gegensatz zur Monolayer Kultivierung erhöht. Zur Passage der Zellen und zur Differenzierung der Sphäroide von Zellaggregaten sowie von Einzelzellen wurde die Zellkultur durch ein 45µm
Zellsieb passagiert. Dabei wurden die Zellaggregate mechanisch aufgelöst und die Einzelzellen wurden ebenfalls abgetrennt. Bei den Strukturen, welche im Filter verbleiben und sich somit mechanisch
nicht disaggregieren lassen handelt es sich um Sphäroide. Diese konnten dann erfolgreich weiterkultiviert werden [Heeschen et al, 2014].
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Material und Methoden
Tabelle 6.1: Zusammensetzung des Stammzellmediums
Volumen
38 ml
960 µl
800 µl
400µl
8 µl
Chemikalie
DMEM/F12
Penicillin/ Streptomycin
B 27
NEAA
bFGF
Analyse der Sphäroidkulturen
Mikroskopisch
Die Zelllinien, welche kompakte multizelluläre Spheroide bilden, die sich nicht durch mechanische
Beanspruchung dissaggregieren lassen, werden für die Evaluation des anti-neoplastischen Effektes
der Substanz TRD und 2250 verwendet. Dazu werden die Kulturen mit unterschiedlichen Konzentrationen (500 und 1000 µmol/l) der Agenzien behandelt. Durch zusätzliches Passagieren über Zellsiebe
(45 µm) nach der Behandlung werden die Spheroide mechanischer Beanspruchung (z.B. häufig auf
und ab pipettieren) ausgesetzt, um die Stabilität der Formationen unter Behandlung zu testen. Der
Effekt wird optisch durch Lichtmikroskopie dokumentiert. Dies liefert zum einen erste Hinweise auf
Effekte der Agenzien auf Zellen mit stammzellähnlichen Charakter und dient des Weiteren der
Dosisfindung für folgende Experimente.
FACS basiert
Die Analyse der Sphäroidkulturen erfolgte mittels eines FACS basierenden Antikörper Assays
(vgl.5.2.1.9). Dazu wurden die Zellen nach dem ersten Splitten der Sphäroidkultur 72h kultiviert und
dann entweder mit TRD (500 µmol/l), der Substanz 2250 (500 µmol/l) und Gemcitabine (10 µmol/l)
behandelt. Nach 24 h wurde die Kultur in ein 15 ml Falcon überführt und bei 230 g 5 min zentrifugiert. Das Medium wurde verworfen und das Zellpellet in 1,5 ml Trypsin/EDTA resuspendiert. Das
Falcon wurde für 15 min im Wasserbad bei 37°C inkubiert. Es erfolgte eine mikroskopische Kontrolle
der Vereinzelung, falls diese nicht vollständig war wurde erneut 5 min bei 37°C im Wasserbad
inkubiert. Falls notwendig wurde noch unterstützend mechanisch mittels mehrfachen Pipettierens
vereinzelt. Dies wurde so lange wiederholt bis alle Zellen vereinzelt waren. Dann wurden Die Falcons
erneut bei 230 g für 5 min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Zellen wurden in 500 µl
PBS + FCS resuspendiert. Es folgt eine Inkubation mit einen gegen humanes CD133 gerichtetem antiCD133 Antikörper als Stammzellmarker für Stammzellen des Pankreaskarzinoms. Dazu wurden entweder 10 ml anti-CD133-PE gekoppelt oder ein Anti-Mouse IgG-PE als Iso-Kontrolle zur Suspension
gegeben. Diese wurden dann für 30 min bei 4 °C inkubiert. Danach folgten zwei Waschschritte mit je
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Material und Methoden
1 ml Pufferlösung (PBS + 5% FCS). Für die anschließende Messung mit dem FACS Calibur wurde das
Zellpellet in 300 µl Pufferlösung resuspendiert und in ein 5 ml FACS-Röhrchen überführt. Die Auswertung erfolgte mit der Software Cell Quest Pro und das Gating wurde anhand der Isotypen Kontrolle
durchgeführt.
6.2.3 In vivo Analysen
Um die anti-neoplastische Wirkung der Substanzen TRD und 2250 in vivo analysieren zu können,
wurden entweder etablierte Pankreastumorzelllinien den 5 Wochen alten weiblichen Nachtmäusen
(NMRI Foxn1nu/Foxn1nu) subkutan unterhalb der Schultern injiziert oder es wurden patient derived
Xenograft (PDX) Modelle verwendet.
Die Nacktmaus wurde gewählt, da ihre Immundefizienz das Anwachsen humaner Tumore im Mausmodell ermöglicht, denn auf Grund des Mangels an reifen T-Lymphozyten gibt es keine vom Immunsystem induzierte Abstoßungsreaktion.
Beim PDX Modell wird humanes Gewebe eines Patienten Primärtumors direkt in immundifferente
Nager (z.B. athymische Mäuse oder serve combined immune deficient Mäuse (SCID)) implantiert und
dort als Tumormodell etabliert. Diese Modelle reflektieren die Heterogenität in einem Tumor und
zwischen verschieden Tumorentitäten wesentlich besser als Modelle generiert aus etablierten Zelllinien. In der Regel weisen die Tumore der PDX Modelle die gleichen histologischen Charakteristika auf
wie der parentale Patiententumor auf [Tendler et al, 2012]. Weiterhin konnte in mehreren Studien
gezeigt werden, dass bei PDX Modellen die vorhandenen Mutations Profile sowie das Ansprechen auf
gerichtete Therapien aufrechterhalten bleibt [Fiebig et al, 1999, Fiebig et al, 2001; Uronis et al, 2012;
Guerreschi et al, 2013; Jin et al, 2010]. Diese Eigenschaften machen PDX Modelle zu einer gute Möglichkeit sich dem dem humanen Karzinom anzunähern.
6.2.3.1
Serumspiegelanalysen zur Halbwertszeitbestimmung
Zur Bestimmung der Halbwertszeit sowie des Serumspiegels der beiden Substanzen TRD und 2250
wurde ein colorimetrischer Nachweis mittels Hantzsch-Reaktion unter Verwendung des NASHReagenz (Ammoniumacetat 18 g/l, Essigsäure 0,38 g/l, Acetylaceton 0,5 g/l) durchgeführt [Nash et al,
1953].
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Material und Methoden
Dazu wurden mehrere Mäuse mit verschiedenen Konzentrationen der Substanzen behandelt und
ihnen wurde 4 h nach der Behandlung mittels Herzpunktion Blut abgenommen. Zur Bestimmung der
Halbwertszeit der Substanz 2250 wurden 2 Mäuse mit der gleichen Konzentration (500 mg/kg*KG)
behandelt und einer Maus nach 1 h Blut abgenommen, der anderen Maus 24 h später.
Das entnommene Vollblut wurde 10 min bei 4000 rpm zentrifugiert, und anschließend wurde das
Serum abgenommen. Zur Aufarbeitung des Serums, durch Fällung der Proteine mittels SDS und Ammoniumsulfat, wurden 200 µl des Serums mit 100µl SDS (10 %) und 210-140 mg Ammoniumsulfat
gemischt. Danach folgte ein Zentrifugationsschritt für 10 min bei 4000 rpm, der klare Überstand
wurde abgenommen und nochmals bei 15.000 rpm für 5 min zentrifugiert und für die Quantifizierung
eingesetzt.
Es wurden 50 µl vom Überstand mit 200 µl NASH-Reagenz versetzt und gemischt, 60 min bei 60 °C
und danach 2 h bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Die Quantifizierung der Reaktionslösung erfolgte
mittels Tecan Plattenreader bei 414 nm mit einer Referenzwellenlänge von 500 nm.
Die Bestimmung der Substanzkonzentrationen erfolgte über eine Standardreihe der beiden Substanzen. Dazu wurden Aliquots der Serumproben (200 µl) von unbehandelten Tieren vor der Proteinfällung mit verschiedenen Konzentrationen der Substanzen versetzt. Die gesamte Konzentrationsreihe
wurde bei jeder Analyse mit gemessen.
6.2.3.2
Analyse der maximal tolerierbaren Dosis von Substanz 2250 in der Nacktmaus
Akute Toxizität
Zur Bestimmung der akuten Toxizität wurden die Mäuse einmalig mit verschiedenen Konzentrationen der Substanz 2250 (500, 1000, 1500, 2000 mg/kg*KG) intraperitoneal (ip) behandelt. Es erfolgte
eine Kontrolle des Gewichts und des allgemeinen Vitalzustands.
Chronische Toxizität
Bei der Analyse der chronischen Toxizität der Substanz 2250 wurden die Mäuse alle zwei Tage für
insgesamt 3 Wochen mit verschiedenen Konzentrationen der Substanz 2250 (500, 1000, 1500
mg/kg*KG) behandelt. Hier erfolgte ebenfalls eine Kontrolle des Gewichts und der allgemeinen Vitalzustands. Nach der Behandlungsdauer wurde eine Serumspiegelanalyse durchgeführt.
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Material und Methoden
6.2.3.3
Wachstumsanalysen in vivo
Die zu untersuchenden Zellen wurden für die subkutane Injektion in ausreichender Menge (über 50
% Überschuss) auf 14 cm Schalen kultiviert. Die Zellen wurden trypsiniert, in FCS aufgenommen und
zentrifugiert (1500 rpm, 3 min, RT). Zur Zellzahlbestimmung wurden die Zellen anschließend in 1x
PBS mit 4 % FCS aufgenommen. Die Zellsuspension wurde ab diesem Zeitpunkt auf Eis gelagert. Für
die Injektion wurden die Zellen in dem Volumen PBS resuspendiert, das notwendig ist, damit sich die
zu injizierende Anzahl (5x106) in 100 μL befand. Die Injektion erfolgte mit einer 1 mLTuberkulinspritze mit einer 27G-Nadel in die linke und rechte Schulterregion der Mäuse. Für die PDX
Modelle wurde das Gewebe zuerst in einer kleinen Anzahl an Mäusen angereichert. Für die Mäuse im
Experiment wurde dann ein bestimmtes Volumen an Tumorgewebe mit Matrigel gemischt und in die
Schulterregion der Tiere implantiert.
Das Volumen der Tumore wurde mit einem Messschieber analysiert, sobald sie gut tastbar war. Erreichten sie ein Volumen zwischen 200 mm³ und 250 mm³, wurde die Behandlung begonnen. Die
Tiere wurden in bis zu 6 Gruppen mit je 5 Tieren eingeteilt. Gruppe 1: Kontrollgruppe, therapiert mit
5% Povidonlösung, Gruppe 2: TRD-Gruppe, therapiert mit TRD (500mg/kg*KG), Gruppe 3: 2250Gruppe, therapiert mit der Substanz 2250 (500mg/kg*KG), Gruppe 4: Gemzar-Gruppe, therapiert mit
Gemcitabin (50mg/kg*KG), Gruppe 5 : TRD+Gemzar Gruppe, therapiert mit TRD (500mg/kg*KG), und
Gemcitabin (50mg/kg*KG) und Gruppe 6: 2250+Gemzar Gruppe, therapiert mit der Substanz 2250
(500mg/kg*KG) und Gemcitabin (50mg/kg*KG). Die Therapie erfolgte mit Povidonlösung, TRD und
Substanz 2250 an alternierenden Tagen, mit Gemzar 2x wöchentlich. Um erhöhte Nebenwirkungen
zu vermeiden, wurde bei einer Doppeltherapie die TRD oder 2250 Injektion ausgesetzt, wenn sie am
gleichen Tag der Gemcitabintherapie erfolgen sollte. Für die Volumenberechnung wurde die folgende
Formel unter Annahme einer ellipsoiden Form des Tumors zugrunde gelegt:
In dieser Formel steht a für die maximalen Durchmesser des Tumors, während b den minimalen
Durchmesser bezeichnet. Die Messung erfolgte alle zwei Tage. Nach drei Wochen oder spätestens
beim Erreichen eines Volumens von 1000 mm³ wurde das Experiment beendet und ein Teil der Tumoren in Stickstoff schockgefroren und bei -70 °C gelagert. Der andere Teil wurde in Formalin fixiert.
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Material und Methoden
Abbildung 6.8: Methodik
der in vivo Wachstumsexperimente
Zuerst erfolgte die Injektion der Tumorzellen
bzw. die Implantation des
PDX-Gewebes. Ab einem
Volumen von 200 mm³
begann die Behandlung
mit den Substanzen TRD,
2250 (500mg/kg*KG) und
Gemzar (50mg/kg*KG),
sowie der Kontrolle.
6.2.4 Histologische Analysen
Die histologischen Arbeiten wurden im Institut für Pathologie am Universitätsklinikum Bergmannsheil
von Herrn Dr. med. Jütte durchgeführt. Dabei wurde routinemäßg eine HE Färbung durchgeführt.
6.2.5 Statistische Analyse
Die Darstellung der Messergebnisse aus MTT, BrdU, FACS-Analyse und der in vivo Daten erfolgte als
Mittelwert (mean) mit dem Standardfehler (SEM = standard error of the mean). Der Vergleich der
Mittelwerte erfolgte mittels ANOVA oder T-Test. Die Gruppen wurden untereinander mittels posthoc Tests (Tukey) verglichen. Als Signifikanzniveau wurde p ≤ 0,05 gewählt. Für geeignete Daten
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Material und Methoden
wurde der Fisher´s exact Test genutzt. In den Abbildungen wurden die Signifikanzniveaus wie folgt
graphisch dargestellt: * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001, n.s. = nicht signifikant. Für die mathematische Analyse der Halbwertszeit wurde die folgende Formel genutzt:
.
6.2.6 Ethische Betrachtung
Die lokale Ethikkomission genehmigte die Sammlung von Gewebeproben aus Patienten mit der Diagnose PDAC genauso wie die Implantation und Expansion des Karzinomgewebes in Xenograft Mausmodellen. Das schriftliche Einverständnis aller Patienten wurde nach den lokalen Ethikrichtlinien
dokumentiert. Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit der Helsinki Erklärung durchgeführt. Alle
Abläufe wurden anhand von, durch die Ethikkommission der Ruhr-Universität Bochum genehmigten,
Protokollen durchgeführt (Registernummer: 2392 (3. Amendment)). Alle Tierexperimente wurden
nach den Richtlinien des lokalen Tier Komitees durchgeführt (Registernummer: 84-02.04.2012.A395).
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Ergebnisse
7 Ergebnisse
7.1 Analyse der ED50 und der dosisabhängigen zytotoxischen Wirkung der
Substanz 2250
Der MTT Assay zeigt die zytotoxische Eigenschaft der Substanz 2250 bzw. Taurolidin (TRD) auf die
verschiedenen Pankreaskarzinomzelllinien. Mit dem gelben Farbstoff MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid), welcher von vitalen Zellen zum blauen Formazan umgesetzt
wird, kann man den Anteil vitaler Zellen photometrisch nachweisen. Der Test wurde zusätzlich mit
Taurolidin (TRD) durchgeführt, um einen Vergleich mit der Muttersubstanz darstellen zu können.
Um die Auswirkungen der Substanz 2250 auf die Zellvitalität zu bestimmen wurde der MTT Assay im
Zellkulturmodell angewandt. Wie in Abbildung 7.1 und 7.2 gezeigt, resultiert die Inkubation mit der
Substanz 2250 in steigenden Konzentrationen (100, 200, 500, 1000, 1500, 2000 µmol/l) für 24 h und
48 h in einer dosisabhängigen Reduktion der lebenden Zellen.
In allen analysierten Zelllinien wurde nach 24h ab einer Konzentration von 500 µmol/l Substanz 2250
ein zytotoxischer Effekt beobachtet. Dies führte zu einer Zellvitalität mit einem Minimum von 39,38
% (± 3,8 %) (BxPC-3) und einem Maximun von 85,67 % (± 3,6 %) (HPAF-II) im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (ddH2O). Der Unterschied war statistisch signifikant (Abb 7.1 b, c). Bei der
folgenden Konzentration von 1000 µmol/l konnte eine Reduktion der Zellvitalität von nahezu 50 % in
den analysierten Zelllinien mit Ausnahme von HPAF-II (82,9 % ± 3,7 %) beobachtet werden. Diese
deutliche Reduktion, herbeigeführt durch Substanz 2250, resultierte in Werten für die lebenden Zellen zwischen 33,34 % (± 1,2 %) für BxPC-3 und 59,13 % (± 2,6 %) für Panc-TuI (Abb7.1 b, f). Die maximale Dosis von 2000 µmol/l führte zu einem starken zytotoxischen Effekt in allen analysierten Zelllinien. Im Ergebnis ergab sich eine im Allgemeinen proportionale Dosis Wirkung Beziehung der Substanz 2250 in allen analysierten Pankreaskarzinom Zelllinien (Abb 7.1), allerdings zeigen die Kurven
bei den Zelllinien BxPC-3 und MiaPaca2 einen angedeuteten sigmoiden Charakter.
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Ergebnisse
Abbildung 7.1: Zytotoxischer Effekt der Substanz 2250 auf verschiedene Pankreaskarzinomzelllinien gemessen mittels MTT-Assay.
AsPC-1 (a), BxPC-3 (b), HPAF-II (c), MiaPaca-2 (d), Panc-1 (e) und Panc TuI Zellen (f) wurden mit 2250 (100, 200,
500, 1000, 1500, 2000 µmol/l) und ddH2O (Kontrolle) für 24 h inkubiert und mittels MTT Assay gemessen. Gezeigt werden die Mittelwerte ± SEM von 6 Replikaten in 3 unabhängigen Experimenten konsekutiver Passagen.
Die Sternsymbole zeigen die Unterschiede der Kontrolle, welche auf 100% gesetzt wurde, zur 2250 Behandlung. *** p ≤ 0,001, ** p ≤ 0,01, * p ≤ 0,05, n.s. p > 0,05 (one-way ANOVA gefolgt vom Tukey’s post-hoc Test)
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Ergebnisse
Abbildung 7.2: Zytotoxischer Effekt der Substanz 2250 auf verschiedene maligne Pankreaskarzionom Zelllinien gemessen mittels MTT-Assay
AsPC-1 (a), BxPC-3 (b), HPAF-II (c), MiaPaca-2 (d), Panc-1 (e) und Panc TuI Zellen (f) wurden mit 2250 (100, 200,
500, 1000, 1500, 2000 µmol/l) und ddH2O (Kontrolle) für 48 h inkubiert und mittels MTT Assay gemessen. Gezeigt werden die Mittelwerte ± SEM von 6 Replikaten in 3 unabhängigen Experimenten konsekutiver Passagen.
Die Sternsymbole zeigen die Unterschiede der Kontrolle, welche auf 100% gesetzt wurde, zur 2250 Behandlung. *** p ≤ 0,001, ** p ≤ 0,01, * p ≤ 0,05, n.s. p > 0,05 (one-way ANOVA gefolgt vom Tukey’s post-hoc Test)
Nach einer Inkubation von 48 h (Abb 7.2) war dieser Effekt noch deutlicher. Bei einer Konzentration
von 500 µmol/l wurde eine minimale Zellvitalität von 16,62 % (± 1,8 %) (BxPC-3) und eine maximale
Zellvitalität von 75,24 % (± 8,0 %) (Panc-1), welche im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (ddH2O)
signifikant geringer war, beobachtet. Bei höheren Konzentrationen ab 1000 µmol/l wurde dieser
Effekt noch deutlicher. Dort lag die Zellvitalität bei allen analysierten Zellen unter 50 %. Dies resul-
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Ergebnisse
tierte in Werten der vitalen Zellen zwischen 19,2 % (± 3,3 %) für BxPC-3 und 40,56 % (± 5,9 %) für
Panc TuI. Bei der maximalen Dosis von 200 µmol/l war nur noch eine minimale Zell Vitalität von ca.
10 % erkennbar.
Die effective dosis (ED) 50 variierte bei den analysierten Zelllinien zwischen 221 µmol/l (BxPC-3) und
1400 µmol/l bei HPAF-II (MiaPaca2: 528 µmol/l; Panc TuI: 627 µmol/l; AsPC-1: 901 µmol/l; Panc-1:
1032 µmol/l) bei einer Inkubationszeit von 24 h sowie zwischen 210 µmol/l (Panc TuI) und 824 µmol/l
bei Panc-1 (MiaPaca2: 282 µmol/l; AsPC-1: 459 µmol/l; HPAF-II: 751 µmol/l) bei einer Inkubation für
48 h. Sie gibt die Konzentration an bei der nur noch 50 % der behandelten Zellen lebten. So kann das
anti-neoplastische Potential verschiedener Substanzen nur anHand eines Wertes verglichen werden.
Im Vergleich mit der Muttersubstanz Taurolidin (TRD) konnte eine nahezu gleiche zytotoxische Wirkung ausgemacht werden (Abb. 7.3). Zum Vergleich mit 1 Mol TRD wurden 2 Mol der Substanz 2250
verwendet, da die Substanz 2250 ein Derivat von Taurultam ist. Dies entsteht bei der
Metabolisierung von 1 Mol TRD mit doppelter Molarität. Verglichen wurden die Konzentrationen 500
µmol/l der Substanz 2250 mit 250 µmol/l der Substanz TRD, dabei konnte nur bei der Zelllinie BxPC-3
ein signifikanter Unterschied beobachtet werden. Bei dem Vergleich der höchsten verwendeten Konzentrationen 2000 µmol/l der Substanz 2250 mit 1000 µmol/l der Substanz TRD konnte ausschließlich
bei der Zelllinie MiaPaca-2 ein signifikanter Unterschied nachgewiesen werden.
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Ergebnisse
Abbildung 7.3: Vergleich
des zytotoxischer Effekts der Substanz 2250
und der Substanz TRD
auf verschiedene maligne Pankreaskarzionom
Zelllinien
gemessen
mittels MTT-Assay
AsPC-1 (a), BxPC-3 (b)
und MiaPaca-2 (c) wurden entweder mit Substanz 2250 oder TRD für
24 h inkubiert. Danach
folgte die Analyse mittels MTT Tests. Gezeigt
werden die Mittelwerte
± SEM von 6 Replikaten
in 3 unabhängigen Experimenten konsekutiver
Passagen. Die Sternsymbole zeigen die Unterschiede der Kontrolle,
welche auf 100% gesetzt
wurde, zur Behandlung.
*** p ≤ 0,001, ** p ≤
0,01, * p ≤ 0,05, n.s. p >
0,05 (one-way ANOVA
gefolgt vom Tukey’s
post-hoc Test)
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Ergebnisse
7.2 Analyse der dosisabhängigen Proliferationshemmung der Substanz
2250 auf Pankreaskarzinomzelllinien
Um die Effekte der Substanz 2250 auf die Zellproliferation in Pankreaszellkulturen zu analysieren,
wurde der BrdU-Assay genutzt. Wie in Abbildung 7.4 dargestellt, resultierte die Inkubation mit Substanz 2250 in steigenden Konzentrationen (100, 200, 500, 1000, 1500, 2000 µmol/l) in einer
dosisabhängigen Reduktion der Proliferationsrate.
In fünf der analysierten Zelllinien konnte selbst eine Konzentration von 200 µmol/l die Proliferation
signifikant inhibieren was zu Proliferationsraten zwischen 12,68 % (± 1,3 %) (Panc-TuI) und 77,16 % (±
1,6 %) (AsPC-1) führte (Abb 7.4 a, c, d, e, f). Ab einer Konzentration von 500 µmol/l inhibierte die
Substanz 2250 signifikant die Proliferation in allen analysierten Zelllinien. Diese Inhibition resultierte
in Proliferationsraten zwischen 4,26 % (± 0,6 %) für Panc-TuI und 54,27 % (± 1,2 %) für Panc-1 (Abb
7.4 e, f). Die maximale Dosis von 2000 µmol/l führte zu einer geringen Proliferationsrate von höchstens 10 % verglichen mit der Kontrollgruppe.
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Ergebnisse
Abbildung 7.4: Proliferationshemmung der Substanz 2250 auf verschiedene maligne Pankreaskarzionom Zelllinien
gemessen mittels BrdU-Assay
AsPC-1 (a), BxPC-3 (b), HPAF-II (c), MiaPaca-2 (d), Panc-1 (e) und PancTuI Zellen (f) wurden mit 2250 (100, 200, 500,
1000, 1500, 2000 µmol/l) oder ddH2O (Kontrolle) für 6 h inkubiert und mittels BrdU Assay analysiert. Gezeigt werden die Mittelwerte ± SEM von 6 Replikaten in 3 unabhängigen Experimenten konsekutiver Passagen. Die Sternsymbole zeigen die Unterschiede der Kontrolle, welche auf 100% gesetzt wurde, zur 2250 Behandlung. *** p ≤
0,001, ** p ≤ 0,01, * p ≤ 0,05, n.s. p > 0,05 (one-way ANOVA gefolgt vom Tukey’s post-hoc Test)
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Ergebnisse
Abbildung 7.5: Vergleich der
Proliferationshemmung
vonSubstanz 2250 und TRD
auf verschiedene Pankreaskarzinomzelllinien gemessen
mittels BrdU-Assay
AsPC-1 (a), BxPC-3 (b) und
MiaPaca-2 (c) wurden entweder mit Substanz 2250 oder
mit TRD für 6 h inkubiert.
Danach folgte die Analyse
mittels BrdU Test. Gezeigt
werden die Mittelwerte ±
SEM von 6 Replikaten in 3
unabhängigen Experimenten
konsekutiver Passagen. Die
Sternsymbole zeigen die Unterschiede der Kontrolle,
welche auf 100% gesetzt wurde, zur Behandlung. *** p ≤
0,001, ** p ≤ 0,01, * p ≤ 0,05,
n.s. p > 0,05 (one-way ANOVA
gefolgt vom Tukey’s post-hoc
Test)
Im Vergleich mit der Muttersubstanz Taurolidin (TRD) konnte eine nahezu gleiche proliferationshemmende Wirkung erkannt werden (Abb. 7.5). Verglichen wurden die Konzentrationen 500 µmol/l
der Substanz 2250 mit 250 µmol/l der Substanz TRD. Dabei konnte nur bei der Zelllinie BxPC-3 ein
signifikanter Unterschied beobachtet werden. Außerdem wurden die höchsten verwendeten Konzentrationen 2000 µmol/l der Substanz 2250 mit 1000 µmol/l der Substanz TRD geprüft. Hier konnte
kein signifikanter Unterschied nachgewiesen werden.
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Ergebnisse
7.3 Analyse der Apoptoseinduktion der Substanz 2250 auf maligne Pankreaskarzinom Zelllinien
Abbildung 7.6: Die Wirkung von 1000 µmol/l und 1500 µmol/l 2250 sowie 500 µmol/l und 1000 µmol/l TRD
auf Vitalität, Apoptose und Nekrose in verschiedenen Pankreaskarzinomzelllinien.
AsPC-1, BxPC-3 und Panc-TuI Zellen wurden entweder mit Substanz 2250 (1000 und 1500 µmol/l) oder TRD
(500 und 1000 µmol/l) und ddH2O/Pov 5 % (Kontrollen) für 24 h inkubiert. Der Anteil an vitalen, apoptotischen
und nekrotischen Zellen wurde mittels FACS Analyse bestimmt; dazu wurde Annexin V-FITC und Propidiumiodid
verwendet Gezeigt werden die Mittelwerte ± SEM von 4-6 Replikaten von 3 unabhängigen Experimenten konsekutiver Passagen. Die Sternsymbole zeigen die Unterschiede der Kontrolle zur 2250/TRD Behandlung. *** p ≤
0,001, ** p ≤ 0,01, * p ≤ 0,05, n.s. p > 0,05 (one-way ANOVA gefolgt vom Tukey’s post-hoc Test)
Weiterführende durchflusszytometrische Analysen waren auf den Einfluss der Substanz 2250 auf den
apoptotischen sowie den nekrotischen Zelltod fokussiert.
Wie in Abbildung 7.6 dargestellt, resultierte die Inkubation mit Substanz 2250 für 24 h in den Konzentrationen 1000 und 1500 µmol/l in einer signifikanten Reduktion der lebenden Zellen im Vergleich
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Ergebnisse
zur Kontrollpopulation, welche nur mit ddH2O behandelt wurde. Dies wurde im FACS Calibur mittels
Annexin V-FITC und PI bestimmt. Es konnte eine gegensätzliche Entwicklung der vitalen zu den
apototischen Zellen mit steigender Konzentration beobachtet werden. Eine signifikante Reduktion
der vitalen Zellen bei 1000 µmol/l Substanz 2250 ging mit einer signifikanten Erhöhung der
apoptotischen Zellen einher.
In Abbildung 7.6 ist zu sehen, dass die Zahl der lebenden Zellen nach einer Inkubation mit 1000
µmol/l Substanz 2250 zwischen 41,1 % (± 0,72 %) für BxPC-3 und 59,0 % (± 1,96 %) für AsPC-1 variiert. Der apoptotische Effekt bewegte sich zwischen 14,2 % (± 1,51 %) für AsPC-1 und 35,0 % (± 2,01
%) für Panc-TuI. Die darauffolgende Konzentration von 1500 µmol/l Substanz 2250 zeigte eine Variation der Zellvitalität zwischen 28,5 % (± 1,50 %) für Panc-TuI und 7,6 % (± 0,77 %) für BxPC-3 Zellen.
Auch diese signifikante Reduktion der Zellvitalität ging mit einer signifikanten Erhöhung der
apoptotischen Population in zwei der analysierten Zelllinien (AsPC-1, Panc-TuI) einher. In BxPC-3
konnte keine Änderung verifiziert werden. Zusätzlich wurde in allen drei analysierten Zelllinien eine
signifikante Erhöhung der nekrotischen Population, insbesondere nach der Inkubation mit 1500
µmol/l 2250, sichtbar.
Im Vergleich mit der Muttersubstanz TRD war die Abnahme der vitalen Zellen mit steigender Konzentration der Substanzen ähnlich. Diese dosisabhängige Reduktion ist bei der Zelllinie Panc-TuI bei
einer Konzentration von 1000 µmol/l der Substanz 2250 allerdings signifikant stärker als bei einer
Konzentration von 500µmol/l TRD. Im Gegensatz dazu gab es Unterschiede bei dem Anteil der
apototischen und nekrotischen Zellen. Dabei war zu erkennen, dass zwei Zelllinien (AsPC-1, BxPC-3)
gerade bei einer Konzentration von 1500 µmol/l Substanz 2250 einen stark erhöhten Anteil an nekrotischen Zellen aufweisen. Passend dazu stieg der Anteil der apoptotischen Zellen geringer als bei den
vergleichbaren TRD Konzentrationen. In der Zelllinie Panc-TuI war der Anteil an apoptotischen sowie
nekrotischen Zellen nach der Behandlung mit Substanz 2250 vergleichbar mit den Werten nach Behandlung mit der Muttersubstanz TRD.
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Ergebnisse
7.4 Der Radikalfänger N-acetylcysteine (NAC) und Pankaspase Inhibitor zVAD zeigen verschiedene Wirkungen auf den durch die Substanz 2250
induzierten Zelltod
Co-Inkubationsversuche der Substanz 2250 mit NAC und z-VAD sollen aufklären welche Signalwege
bei der Induktion des Zelltods beteiligt sind.
Abbildung 7.7: Auswirkungen von NAC auf den durch Substanz 2250 induzierten Zelltod in verschiedenen
Pankreaskarzinomzelllinien
AsPC-1 (a), BxPC-3 (b), HPAF-II (c), MiaPaca-2 (d), Panc-1 (e) und PancTuI Zellen (f) wurden entweder mit 2250
(500, 1,000 µmol/l), NAC (5 mmol/l) oder einer Kombination der beiden Agenzien (2250 500, 1000 µmol/l +
NAC 5mmol/l) und ddH2O als Kontrolle für 24 h inkubiert und mittels MTT Assay analysiert. Gezeigt werden
die Mittelwerte ± SEM von 6 Replikaten in 3 unabhängigen Experimenten konsekutiver Passagen. Die Sternsymbole zeigen die Unterschiede der Kontrolle, welche auf 100% gesetzt wurde, zur 2250 Behandlung. *** p ≤
0,001, ** p ≤ 0,01, * p ≤ 0,05, n.s. p > 0,05 (one-way ANOVA gefolgt vom Tukey’s post-hoc Test).
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Ergebnisse
In AsPC-1, Panc-1 und HPAF-II führte die Co-Inkubation der Substanz 2250 mit NAC für 24h zu einem
kompletten Schutz vor dem durch Substanz 2250 induzierten Zelltod, bei der Zelllinie HPAF-II allerdings nur bei einer Konzentration von 500 µmol/l 2250. NAC hob die durch Substanz 2250 induzierte
Reduktion der vitalen Zellen in Gänze auf. Dies führte zu einer Zellvitalität, die mit der unbehandelten
Kontrolle vergleichbar war. Bei der höheren Konzentration von Substanz 2250 kam es in der Zelllinie
HPAF-II zwar nicht zu einem kompletten Rescue, aber zu einem wesentlich geringerem Abfall der
vitalen Zellen (Abb. 7.7 a, c, e).
In BxPC-3, MiaPaca-2 und Panc-TuI, war die Co-Inkubation der Substanz 2250 mit NAC charakterisiert
durch einen wesentlich geringeren Abfall der vitalen Zellen. Allerdings kam es nicht zu einer kompletten Erholung des Anteils der vitalen Zellen im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Daher kann
man hier nur von einem teilweisen Schutz sprechen (Abb 7.7 b, d, f).
Weitere Daten der FACS Analyse (Abb 7.8) der Zelllinie AsPC-1 bestätigten bei einer Co-Inkubation
mit der Substanz 2250 und NAC die vorherigen Resultate. Dabei war die Co-Inkubation durch einen
kompletten Schutz gegen die, durch 2250 induzierte, Reduktion der vitalen Zellen gekennzeichnet
(Abb. 7.8 a). Es wurden keine Unterschiede zur unbehandelten Kontrolle festgestellt. In Abb 7 b und c
ist zu sehen, dass NAC in der Lage war die Anzahl der apoptotischen Zellen geringfügig aber signifikant zu reduzieren wohingegen das Auftreten nekrotischer Zellen unter NAC Behandlung komplett
verhindert wurde.
Bei TRD konnte durch unsere Arbeitsgruppe ein ähnliches Bild in den Zelllinien AsPC-1 und BxPC-3
gezeigt werden. In der Zelllinie AsPC-1 wurde bei der Co-Inkubation von 1000 µmol/l TRD mit NAC
eine signifikant geringere Reduktion der vitalen Zellen im Gegensatz zur alleinigen Behandlung mit
TRD beobachtet. Ebenfalls wurde ein signifikant geringerer Anstieg der nekrotischen Zellpopulation
bei einer Co-Inkubation deutlich sichtbar. Und es konnte auch hier eine geringfügige aber signifikante
Erhöhung der apoptotischen Zellen ausgemacht werden. In der Zelllinie BxPC-3 war bei der CoInkubation von 250 µmol/l TRD mit NAC ein ähnliches Bild sichtbar. Allerdings war hier auch eine
signifikate Reduktion der apoptotischen Zellen zu erkennen. Dennoch konnte in keiner der analysierten Zelllinien ein vollständiger Schutz durch NAC gegenüber der Zelltod Induktion durch TRD ausgemacht werden [Chromik et al, 2008].
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Ergebnisse
Abbildung 7.8: Auswirkungen
von NAC auf den durch die Substanz 2250 induzierten Zelltod in
der
Pankreaskarzinomzelllinie
AsPC-1
Die Zellen wurden entweder mit
2250 (500, 1,000 µmol/l), NAC (5
mmol/l) oder einer Kombination
der beiden Agenzien (2250 500,
1000 µmol/l + NAC 5mmol/l) und
ddH2O als Kontrolle für 24 h
inkubiert. Der Anteil an vitalen
(a), apoptotitischen (b) und nekrotischen (c) Zellen wurde mittels
FACS bestimmt. Gezeigt werden
die Mittelwerte ± SEM von 6
Replikaten in 3 unabhängigen
Experimenten konsekutiver Passagen. Die Sternsymbole zeigen
die Unterschiede der Kontrolle,
welche auf 100% gesetzt wurde,
zur 2250 Behandlung. *** p ≤
0.001, ** p ≤ 0.01, * p ≤ 0.05, n.s.
p > 0.05 (one-way ANOVA gefolgt
vom Tukey’s post-hoc Test).
In den mittels FACS-Assays analysierten Pankreaskarzinom Zelllinien (AsPC-1 und BxPC-3) konnten
keine Differenzen zwischen den mit der Substanz 2250 und den co-inkubierten Zellen mit 2250 und
zVAD beobachtet werden (Abb. 7.9). Auch bei der Analyse dieser Zelllinien mit TRD und zVAD konnte
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Ergebnisse
unsere Arbeitsgruppe keine Unterschiede zu den Zellen, welche nur mit TRD behandelt wurden,
ausmachen [Chromik et al, 2010].
Abbildung 7.9: Auswirkungen von
zVAD auf den durch die Substanz
2250 induzierten Zelltod in der
Pankreaskarzinomzelllinie AsPC-1
Die Zellen wurden entweder mit
2250 (500, 1000 µmol/l), zVAD
(2µmol/l) oder einer Kombination
der beiden Agenzien (2250 500,
1000 µmol/l + zVAD 2µmol/l) und
ddH2O als Kontrolle für 24 h
inkubiert. Der Anteil an vitalen (a),
apoptotischen (b) und nekrotischen
(c) Zellen wurde mittels FACS bestimmt. Gezeigt werden die Mittelwerte ± SEM von 6 Replikaten in
3 unabhängigen Experimenten
konsekutiver Passagen. Die Sternsymbole zeigen die Unterschiede
der Kontrolle, welche auf 100%
gesetzt wurde, zur Behandlung.
*** p ≤ 0,001, ** p ≤ 0,01, * p ≤
0,05, n.s. p > 0,05 (one-way ANOVA
gefolgt vom Tukey’s post-hoc Test).
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Ergebnisse
7.5 Unterstützende Wirkung der Substanz 2250 mit hyperthermischen
Temperaturverfahren
Um zu analysieren, ob die anti-neoplastische Wirkung der Substanzen 2250 bzw. TRD durch die Kombination mit einer hyperthermischen Behandlung verstärkt werden kann, wurde eine Kombinationstherapie durchgeführt. Um dabei den unterschiedlichen hyperthermischen Vefahren gerecht zu werden, wurden drei verschiedene Ansätze gewählt. Im ersten Modell wurden die Zellen mit der Substanz 2250 (200 und 1000 µmol/l) bzw. TRD (100 und 500 µmol/l) behandelt und dann vergleichend
einmal unter normalen Bedingungen und einmal bei Hyperthermie, also bei 40,5 °C für 24 h,
inkubiert. Diese Bedingungen sind vergleichbar mit einer Ganzkörperhyperthermie in therapeutischer Anwendung. Dabei konnte bei den höheren Konzentrationen bei den Substanzen in zwei der
analysierten Zelllinien eine signifikante Reduktion der Zellvitalität festgestellt werden. Die Werte
rangierten zwischen 14,6 ± 1,9 % (AsPC-1) und 21,2 ± 1,5 % (HPAF-II) bei Substanz 2250 mit hyperthermischer Behandlung in Gegensatz zur alleinigen Therapie mit Werten bei 42,6 +/- 1,6 % (AsPC-1)
bzw. 65,9 ± 1,0 % (HPAF-II). Bei der Behandlung mit 500 µmol/l TRD ergab sich ein vergleichbares
Ergebnis (Abb. 7.10). Allerdings war bei diesem Ansatz (24 h bei 40,5 °C) eine Tendenz zur Reduktion
der Zellvitalität der Kontrollzellen zu sehen.
Bei der folgenden FACS Analyse (Abb.7.11) von zwei der analysierten Zelllinien (AsPC-1, BxPC-3) wurde dabei allerdings sichtbar, dass der reduzierte Anteil an lebenden Zellen mit einem deutlichen Anstieg nekrotischer Zellen einherging. Der Anteil der apoptotischen Zellen war nur bei der Kombinationsbehandlung der Substanz 2250 (200 µmol/l) mit Hyperthermie in der Zelllinie AsPC-1 signifikant
höher als bei der Monotherapie.
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Ergebnisse
Abbildung 7.10: Auswirkungen der Kombination der Substanzen 2250 bzw. TRD mit hyperthermischen Inkubationsverfahren (MTT-Assay)
Die Zellen wurden entweder mit 2 unterschiedlichen Konzentrationen (200, 1000µmol/l) der Substanz 2250 (b,
d, f) oder mit unterschiedlichen Konzentrationen (100, 500 µmol/l) der Substanz TRD (a, c, e) behandelt. Die
Inkubation erfolgte dann entweder unter normalen Bedingungen bei 37°C oder unter Hyperthermie (40,5°C).
Die Analyse erfolgte nach 24h Inkubationszeit mittels MTT Assay. Gezeigt werden die Mittelwerte ± SEM von 6
Replikaten in 3 unabhängigen Experimenten konsekutiver Passagen. Die Sternsymbole zeigen die Unterschiede
der Kontrolle, welche auf 100% gesetzt wurde, zur Behandlung. *** p ≤ 0,001, ** p ≤ 0,01, * p ≤ 0,05, n.s. p >
0,05 (one-way ANOVA gefolgt vom Tukey’s post-hoc Test).
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Ergebnisse
Abbildung 7.11: Auswirkungen der Kombination der Substanzen 2250 bzw. TRD mit hyperthermischen Inkubationsverfahren (FACS Analyse)
Die Zellen wurden entweder mit 2 unterschiedlichen Konzentrationen (200,1000µmol/l) der
Substanz 2250 (b, d) oder mit unterschiedlichen
Konzentrationen (100, 500 µmol/l) der Substanz
TRD (a, c) behandelt. Die Inkubation erfolgte
entweder unter normalen Bedingungen bei
37°C oder unter hyperthermischen Konditionen
(40,5°C). Die Analyse der vitalen, apoptotischen
und nekrotischen Zellpopulationen erfolgte
nach 24 h Inkubationszeit mittels FACS Analyse.
Gezeigt werden die Mittelwerte ± SEM von 6
Replikaten in 3 unabhängigen Experimenten
konsekutiver Passagen. Die Sternsymbole zeigen die Unterschiede der Kontrolle, welche auf
100% gesetzt wurde, zur Behandlung. *** p ≤
0,001, ** p ≤ 0,01, * p ≤ 0,05, n.s. p > 0,05 (oneway ANOVA gefolgt vom Tukey’s post-hoc Test).
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Ergebnisse
Abbildung 7.12: Auswirkungen der Kombination der
Substanzen 2250 bzw. TRD
mit hyperthermischen Inkubationsverfahren
Die Zellen wurden entweder
mit unterschiedlichen Konzentrationen (200, 1000
µmol/l) der Substanz 2250 (a)
oder mit unterschiedlichen
Konzentrationen (100, 500
µmol/l) der Substanz TRD (b)
behandelt. Die Inkubation
erfolgte dann entweder unter
normalen Bedingungen bei
37°C oder unter hyperthermischen Konditionen (42°C).
Dabei erfolgte die hyperthermische Behandlung entweder
vor der Behandlung mit den
Agenzien oder direkt im Anschluss an die Behandlung für
2h. Die Analyse erfolgte nach
insgesamt 24h Inkubationszeit
mittels MTT Assay. Gezeigt
werden die Mittelwerte ± SEM
von 6 Replikaten in 3 unabhängigen Experimenten konsekutiver Passagen. Die Sternsymbole zeigen die Unterschiede der Kontrolle, welche
auf 100% gesetzt wurde, zur
Behandlung. *** p ≤ 0.001, **
p ≤ 0.01, * p ≤ 0.05, n.s. p >
0.05 (one-way ANOVA gefolgt
vom Tukey’s post-hoc Test).
Bei dem zweiten Ansatz wurde eine särker erhöhte Temperatur von 42°C, sowie eine geringere Inkubationszeit der Hyperthermie. Somit sollte eine Art loko regionale Tiefenhyperthermie imitiert werden. Dazu wurden die Zelllinien entweder vor der Behandlung mit den Substanzen für 2h bei 42 °C
oder nach der Behandlung mit den Substanzen für 2 h bei 42 °C inkubiert, die weitere Inkubation
erfolgte wiederrum bei den normalen Konditionen (37 °C). Die Analyse erfolgte mittels MTT Assays
nach insgesamt 24 h Inkubationszeit. Es konnte bei den Zelllinien BxPC-3 (Abb 7.12) und HPAF-II bei
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Ergebnisse
der hohen Konzentration der beiden Substanzen eine ähnlich unterstützende Wirkung der hyperthermischen Therapie vor allem nach der Behandlung ausgemacht werden. Dabei kam es zu einer
signifikanten Reduktion der Zellvitalität im Vergleich mit den Zellen die nur mit den Substanzen 2250
oder TRD behandelt wurden. Bei der Zelllinie BxPC-3 allerdings nur bei der Substanz 2250. Hier war
einer Reduktion der Zellvitalität von 33,5 % ± 0,7 % (Substanz 2250 mit 1000 µmol/l) auf 13,4 % ± 1,9
% (Substanz 2250 mit 1000 µmol/l bei 42 °C nach der Behandlung) deutlich erkennbar. Bei der Zelllinie HPAF-II war dieser Effekt ebenfalls geringfügig zu erkennen, diesmal bei beiden Substanzen, und
wurde mit Erhöhung der Inkubationszeit bei 42 °C auf 4 h deutlicher.
7.6 Analyse der Wirkung der Substanz 2250 und TRD auf Tumorzellen mit
stammzellähnlichen Charakter
7.6.1 Möglichkeit der Anreicherung von Zellen mit stammzellähnlichem Charakter durch
Spheroid Formation
Um Tumorzellen mit stammzellähnlichem Charakter innerhalb der Kultur anzureichern, gibt es mehrere Möglichkeiten. Prinzipiell werden 3D Modelle erstellt, in dem Zellen auf nicht adhäsiven Oberflächen oder in Matrixgewebe wie Weichagar kultiviert werden. Man unterscheidet dabei Methoden
bei denen die Kulturen ruhig stehen oder kontinuierlich bewegt werden (roller-bottle-Technik). Hier
wurde die Methodik der Spheroidkultivierung auf nicht adhäsiven Oberflächen ohne Bewegung genutzt. Bei dieser Methode werden die Zellen unter low-adhesion Bedingungen kultiviert was ein adhärieren dieser verhindert. Der Zusatz spezieller Wachstumsfaktoren und vor allem die FBS-Freiheit
im Medium begünstigt zusätzlich die Anreicherung von Tumorstammzellen im dreidimensionalen
Modell [Heeschen C et al, 2014]. In unseren Experimenten wurden die Pankreaskarzinomzelllinien
zuerst in Monolayer-Kulturen herangezogen. Anschließend erfolgte eine Weiterkultivierung in ultralow adhesion plates. Dabei konnte nach 5 Tagen bei drei der analysierten Zelllinien eine Formation
von multizellulären Spheroiden, welche sich nicht durch mechanische Beanspruchung disaggregieren
ließen, ausgemacht werden (Abb. 7.13). Bei den Zelllinien AsPC-1 und MiaPaca-2 bildeten sich lediglich Aggregate, die während des Passagierens durch das Zellsieb wieder in Einzelzellen zerfielen (Abb.
7.13).
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Ergebnisse
Abbildung 7.13: Resultate des Spheroid Formations Assays
Pankreaskarzinomzelllinien (ASPC1, Mia Paca-2, Panc TuI, BxPC-3, Colo357) und Primärzellen eines PDXPankreaskarzinoms (Bo80) wurde zwecks Formation in ultra-low adhesion Platten gesät und unter StammzellKonditionen in speziellem Medium angezogen. Nach 5 Tagen erfolgte bei einigen der Zelllinien die Formation
kompakter multizellulärer Spheroide (A), welche sich nicht durch mechanische Beanspruchung disaggregieren
lassen (B). Einige Zelllinien bildeten lediglich Aggregate, welche während des Passagierens durch das Zellsieb
zerfallen (ASPC1, Mia Paca-2). Genutzt wurde eine 10x Vergrößerung.
Des Weiteren sollte analysiert werden, ob sich durch diese Art der Kultivierung auch in unseren genutzten Zelllinien die Zellen mit stammzellähnlichem Charakter anreichern lassen. Dazu wurde der
etablierte Stammzellmarker CD133 genutzt. Wir konnten zeigen, dass sich in den Zelllinien welche
bei dieser Kultivierung Spheroide bildeten die Zahl der CD133+ Zellen anreichern ließ. In der Zelllinien
Panc TuI stieg der relative Anteil der CD133+ Zellen um das 10 fache von 0,3 % auf 3 % (Abb 7.14).
Seite | 95
Ergebnisse
A
B
+
Abbildung 7.14: Ergebnisse der Anreicherung CD 133 Zellen von Panc-TuI durch multizelluläre Spheroid
Kultivierung mittles FASC Analyse
CD133 ist ein bekannter und etablierter Marker für Stammzellen des Pankreas [Hermann et al, 2007]. Es konn+
te gezeigt werden, dass die Anzahl der CD 133 Zellen durch die multizelluläre Spheroidkultivierung der Zelllinie Panc-TuI in Vergleich mit der Monolayer Kultivierung der Zellen angereichert werden konnte (10x) (B).
(Isotyp IgG wurde als Negativkontrolle genutzt (A)).
Seite | 96
Ergebnisse
7.6.2 Mikroskopische Analyse der Spheroidkultur nach Behandlung mit den Substanzen 2250
und TRD
Die Zelllinien, welche kompakte multizelluläre Sheroide bilden (Panc TuI, BxPC-3, Colo357 und Bo80),
die sich nicht durch mechanische Beanspruchung dissaggregieren lassen, wurden für die Evaluation
des anti-neoplastischen Effektes von TRD und Substanz 2250 verwendet. Dazu wurden die Kulturen
mit unterschiedlichen Konzentrationen der Agenzien behandelt. Die Spheroide wurden nach einer
Inkubationszeit von 24 h mechanischer Beanspruchung ausgesetzt (mehrfaches auf und ab
pipettiren) um die Stabilität der Formationen unter Behandlung zu testen. Durch zusätzliches Passagieren über ein Zellsieb (45 µm) konnten dann die Spheroide von den Einzelzellen getrennt werden.
Lichtmikroskopisch konnte bei beiden Substanzen ein Zerfallen der spheroidären Struktur beobachtet
weden. Nach dem Passagieren über das 45 µm Zellsieb konnten bei den behandelten Spheroiden nur
noch sehr wenige kleine Zellaggregate ausgemacht werden (Abb 7.15). Dies konnte zeigen, dass die
Substanzen TRD und 2250 auch eine Wirkung gegenüber spheroidären Strukturen aufweisen und
somit wahrscheinlich auch gegenüber stammzellähnliche Zellen.
A
B
B
A
Kontrolle
Kontrolle
TRD
TRD
2250
2250
Abbildung 7.15: Ergebnisse des Spheroid Toxizitäts Assays
Multizelluläre Pankreastumor Spheroide (Wachstum über 5 Tage, danach passagiert über ein 45µm Zellsieb)
wurden entweder mit TRD (500 µM) oder mit der Substanz 2250 (1000 µM) für 48h behandelt (A). Nach der
Behandlung wurde die komplette Zellsuspension nochmals durch ein 45µm Zellsieb passagiert um die noch
vorhandenen Zellaggregate in Hinblick auf ihre Stabilität zu analysieren. (B). 10x Vergrößerung
Seite | 97
Ergebnisse
7.6.3 Analyse der CD133+ Population nach Behandlung mit den Substanzen 2250 und TRD im
Vergleich zum Chemotherapeutikum Gemzitabin
Um dies zu verifizieren wurde eine Analyse der CD 133+ Population und Behandlung mit den Substanzen TRD und 2250 im Vergleich zum Chemotherapeutikum Gemcitabin (Gemzar) angeschlossen.
Abbildung 7.16: Resultate der FACS Analyse der behandelten Spheroidkulturen
Für das Toxizitätsassay mit anschließender FACS Analyse wurden kompakte multizelluläre Spheroidkulturen
aus Pankreaszelllinien und Tumorzellen eines PDX mit TRD (500 µM), der Substanz 2250 (1000 µM) oder
Gemzar (10 µg/ml) für 48 h behandelt. Nach Ablauf der Behandlungsdauer wurde die gesamte Kultur mit AK
gegen CD133 gefärbt (rote 5 Angaben) und mittels FACS analysiert. Die mit TRD oder der Substanz 2250 behandelten multizellulären Spheroidkulturen zeigten im Gegensatz zu den mit Gemzar behandelten reduzierte
+
Anteile an CD 133 Zellen in der Population.
Seite | 98
Ergebnisse
Abbildung 7.17: Resultate der FACS
Analyse der behandelten Spheroid
Kulturen:
Für das Toxizitätsassay mit anschließender FACS Analyse wurden kompakte multizelluläre Sheroidkulturen
aus Pankreaszelllinien und Tumorzellen eines Primärtumors mit der Substanz 2250 (1000 µM), TRD (500
µM), oder Gemzar (10 µg/ml) für 48
h behandelt. Nach Ablauf der Behandlungsdauer, wurde die gesamte
Kultur mit AK gegen CD133 gefärbt
und mittels FACS analysiert. Gezeigt
werden die Mittelwerte ± SEM von 4
Replikaten in 4 unabhängigen Experimenten konsekutiver Passagen. Die
Sternsymbole zeigen die Unterschiede der Kontrolle, welche auf
100% gesetzt wurde, zur Behandlung. *** p ≤ 0,001, ** p ≤ 0,01, * p
≤ 0,05, n.s. p > 0,05 (one-way ANOVA gefolgt vom Tukey’s post-hoc
Test).
Für das Toxizitätsassay mit anschließender FACS Analyse wurden kompakte multizelluläre
Spheroidkulturen aus Pankreaszelllinien (Panc TuI und Colo 357) und Tumorzellen eines Primärtu-
Seite | 99
Ergebnisse
mors (Bo 80) mit TRD (500 µM), Substanz 2250 (1000 µM) oder Gemcitabin (10 µg/ml) für 48 h behandelt. Nach Ablauf der Behandlungsdauer, wurde die gesamte Kultur mit einem Antikörper gegen
CD133 inkubiert und mittels FACS analysiert. Die Pankreaszelllinie BxPC-3 konnte für diese Analysen
nicht verwendet werden, da sich die Spheroide der Kontrollen chemisch nicht vereinzeln ließen weder mit Trypsin/EDTA noch mit Accutase.
In Abbildung 7.16 sind die Dot Plots einer dieser Analysen zu sehen. Dort zeigen die FACS Daten, dass
nur bei einer Behandlung mit TRD und der Substanz 2250 eine Reduktion der CD133+ Zellpopulation
innerhalb der Kultur stattgefunden hat. Durch eine Behandlung mit Gemcitabin wurde dieser Anteil
an der Gesamtkultur nicht beeinflusst.
Abbildung 7.17 zeigt die statistische Auswertung der Ergebnisse der CD 133+ Zellpopulation mittels
FACS Analyse. Dabei zeigte sich dass die Substanzen 2250 und TRD in zwei der analysierten
Spheroidkulturen (a+b) den Anteil der CD 133+ Zellen signifikant reduzierten. Im Gegensatz dazu
wurde die Zahl der CD 133+ Zellen durch die Behandlung mit Gemcitabine nicht beeinflusst. In der
dritten analysierten Spheroidkultur der Zelllinie Colo 357 konnte nur eine Tendenz zur Reduktion der
CD 133+ Zellen durch die Substanzen 2250 und TRD ausgemacht werden. Allerdings zeigte sich bei
dieser Zelllinie eine signifikante Zunahme/ ein signifikanter Anstieg der CD 133+ Zellpopulation bei
der Behandlung mit Gemcitabine.
Seite | 100
Ergebnisse
7.7 Pharmakokinetische Daten der Substanz 2250 in der Maus
7.7.1 Analyse der metabolischen Halbwertszeit der Substanz 2250
Um die metabolische Halbwertszeit der neuen Substanz 2250 im Blut der Nacktmaus zu bestimmen
wurde ein colorimetrischer Assay mittels NASH Reagenz genutzt. Der Abgleich der gemessenen Werte der Substanz 2250 im Maus Serum nach 1 h und nach 25 h mit der Kalibrierkurve ergab eine
metabolische Halbwertszeit von 13,8 h (Abb 7.18, Tabelle 7.1).
Abbildung 7.18: Kalibrierkurve der metabolischen Halbwertszeit Messung
Die Kalibrierkurve bestehend aus fünf verschiedenen Konzentrationen der Substanz 2250 in der Nacktmaus
diente als Standard für die Kalkulation der metabolischen Halbwertszeit. Dies resultiert in einem Wert von 13,8
h. Die dazu gehörigen Parameter sind in der unteren Tabelle dargestellt.
Seite | 101
Ergebnisse
Tabelle 7.1: Parameter zur Halbwertszeit Bestimmung der Substanz 2250
Konzentration in der
Maus
[mg/kgKG]
relative Extinktion
Konzentration im Serum
[µg/ml]
500 (1 h)
0,475
29,044
500 (25 h)
0,128
8,954
7.7.2 Detektion der maximal tolerierbaren Dosis der Substanz 2250
Bei der Analyse der akuten Toxizität der Substanz 2250 in der Nacktmaus war die höchste verwendete Konzentration von 2000 mg/kg*KG toxisch. Das Körpergewicht reduzierte sich um 1,5 g innerhalb
von 48h und die Maus verstarb 5 Tage nach der Behandlung. Für die anderen Konzentrationen (500,
1000 und 1500 mg/kg*KG) konnten keine Veränderungen beim Körpergewicht und den Vitalfunktionen beobachtet werden.
Bei der Bestimmung der chronischen Toxizität konnte eine toxische Wirkung in der Nacktmaus ab
einer Konzentration von 1000 mg/kg*KG beobachtet werden. Wohingegen bei der Behandlung mit
500 mg/kg*KG 2250 kein toxischer Effekt gemessen werden konnte.
Seite | 102
Ergebnisse
7.8 Die Substanzen TRD und 2250 induzieren eine Reduktion des subkutanen Tumorwachstums in vivo
Um die Wirkung der Substanzen TRD und 2250 in vivo zu testen, wurde der Einfluss der Behandlung
mit der Agenzien in Standard Xenograft Modellen sowie auch in PDX-Modellen untersucht.
Abbildung 7.19: Wirkung der Substanzen TRD und 2250 (500 mg/kg*KG) auf das subkutane Tumorwachstum
in Nacktmäusen in vivo.
Nacktmäuse mit Tumoren aus MiaPaca-2 (a+b), Panc-TuI (c+d) oder PDX Modelle (e+f) wurden mit den Substanzen TRD oder 2250 (500 mg/kg*BW) und Povidon 5%ig (Kontrolle) über 3 Wochen behandelt. Das Tumorvolumen wurde an alternierenden Tagen über 3 Wochen gemessen. Die Sternsymbole zeigen die Unterschiede
der Kontrolle, welche auf 100% gesetzt wurde, zur 2250 Behandlung. *** p ≤ 0,001, ** p ≤ 0,01, * p ≤ 0,05, n.s.
p > 0,05 (one-way ANOVA gefolgt vom Tukey’s post-hoc Test).
Seite | 103
Ergebnisse
Wie in Abbildung 7.19 gezeigt reduziert die intraperitoneale (ip) Applikation der Substanze TRD (500
mg/kg*KG) und 2250 (500 mg/kg*KG) das subkutane Tumorwachstum sowohl in Tumoren aus etablierten Zelllinien (MiaPaca-2, Panc-TuI) als auch in Xenograftmodellen aus Patientengewebe. Die zelllinien MiaPaca-2 und Panc-TuI wurden gewählt, da in vivo Mausmodelle mit diesen Zelllinien der
Arbeitsgruppe gut etabliert sind und die Tumore eine hohe Anwachsrate ausweisen.
Die ip Applikation der Substanz 2250 führte bei Tumoren ausgehend von der etablierten Zelllinie
MiaPaca-2 verglichen mit der Kontrollgruppe zu einer signifikanten Reduktion des Tumorwachstums.
Das Tumorvolumen der behandelten Mäuse war um 57 % geringer als bei der Kontrolltieren nach
einer Anwendungsdauer von 3 Wochen (a). Im zweiten Tumormodell, ausgehend von der etablierten
Zelllinie Panc TuI, konnte ein vergleichbares Ergebnis beobachtet werden. Es wurde eine signifikante
Reduktion des relativen Tumorvolumens um 49,7 %, verglichen mit der Kontrollgruppe, nach einer
Behandlungsdauer von 2 Wochen beobachtet (c). Das Experiment wurde nach 2 Wochen beendet, da
das Endvolumen der Kontrolltumore von 1000 mm³ erreicht war. In einem weiteren Tumormodell
wurde der PDX Tumor (Bo70) analysiert, dabei war ebenfalls eine signifikante Reduktion des relativen Tumorvolumens um 36,8 % zu erkennen (e).
Die ip Applikation der Substanz TRD führte bei Tumoren ausgehend von der etablierten Zelllinie
MiaPaca-2 verglichen mit der Kontrollgruppe ebenfalls zu einer signifikanten Reduktion des Tumorwachstums. Das Tumorvolumen der behandelten Mäuse war um 36,9 % geringer als bei der Kontrolltieren nach einer Anwendungsdauer von 3 Wochen (b). Im zweiten Tumormodell ausgehend von der
etablierten Zelllinie Panc TuI konnte ein vergleichbares Ergebnis beobachtet werden. Es wurde eine
signifikante Reduktion des relativen Tumorvolumens um 47,8 %, verglichen mit der Kontrollgruppe,
nach einer Behandlungsdauer von 2 Wochen beobachtet (d). Das Experiment wurde nach 2 Wochen
beendet, da das Endvolumen der Kontrolltumore von 1000 mm³ erreicht war. In einem weiteren
Tumormodell wurde der PDX Tumor (Bo70) analysiert. Dabei war eine signifikante Reduktion des
relativen Tumorvolumens um 41,1 % zu erkennen (f).
Seite | 104
Ergebnisse
Abbildung 7.20: Wirkung der Substanzen TRD, 2250 (500 mg/kg*KG) und Gemcitabine (50 mg/kg*KG) auf das
subkutane Tumorwachstum in Nacktmäusen in vivo – hier der Tumor Bo80 aus Patientengewebe
Nacktmäuse mit Tumoren aus Patientengewebe (Bo80) wurden mit den Substanzen TRD, 2250 (500
mg/kg*BW) oder Gemcitabine (50mg/kg*KG) und Povidon 5%ig (Kontrolle) über 3 Wochen behandelt. Das
Tumorvolumen wurde alle zwei Tage über 3 Wochen gemessen. Die Sternsymbole zeigen die Unterschiede der
Kontrolle, welche auf 100% gesetzt wurde, zur 2250 Behandlung. *** p ≤ 0,001, ** p ≤ 0,01, * p ≤ 0,05, n.s. p >
0,05 (one-way ANOVA gefolgt vom Tukey’s post-hoc Test). --- bezeichnen die Grenzen einer Progression (1,2)
und eines partiellen Ansprechens (0,7) nach RECIST Kriterien.
In Abbildung 7.20 sind die Ergebnisse des Xenograftmodells des Tumors Bo80 aus Patientengewebe
mit verschiedenen therapeutischen Ansätzen zu erkennen. Dabei wurden die Mäuse entweder mit
Seite | 105
Ergebnisse
Monotherapien der Substanzen 2250, TRD und Gemcitabin oder Kombinationen von Gemcitabin
entweder mit der Substanz 2250 oder TRD behandelt. Wie schon in Abbildung 7.19 gezeigt reduziert
die intraperitoneale (ip) Applikation der Substanz TRD (500 mg/kg*KG) und 2250 (500 mg/kg*KG)
auch hier das subkutane Tumorwachstum. Die ip Applikation der Substanz 2250 führte bei Tumoren
ausgehend von Patientengewebe (Bo 80), verglichen mit der Kontrollgruppe, zu einer Reduktion des
Tumorwachstums. Das Tumorvolumen der behandelten Mäuse war um 30,5 % geringer als bei den
Kontrolltieren nach einer Anwendungsdauer von 3 Wochen. Bei der ip Applikation der Substanz TRD
konnte ein vergleichbares Ergebnis beobachtet werden. Es wurde eine signifikante Reduktion des
relativen Tumorvolumens um 27,3 %, verglichen mit der Kontrollgruppe nach einer Behandlungsdauer von 3 Wochen beobachtet. Bei der ip Applikation der Substanz Gemcitabin konnte nach Behandlungstag 9 Kein weiteres Tumorwachstum beobachtete werden. Im Gegensatz dazu stieg das Tumorvolumen der Kontrolle nach einer Behandlungsdauer von 3 Wochen bis auf das 4,4 fache des Ausgangsvolumens an.
Bei den beiden Kombinationstherapien aus Gemcitabin mit entweder der Substanz 2250 oder TRD
konnte sogar eine Reduktion des Tumorvolumens um 50% innerhalb einer Behandlungsdauer von 3
Wochen erreicht werden. Dabei reduzierte sich das Tumorvolumen innerhalb einer Behandlungsdauer von 3 Wochen bei der Kombinationstherapie von Gemcitabine mit der Substanz 2250 auf weniger
als die Hälfte des Ausgangsvolumens. Bei der ip Kombinationstherapie von Gemcitabin mit der Substanz TRD reduzierte sich das Tumorvolumen innerhalb einer Behandlungsdauer von 3 Wochen auf
die Hälfte. Das Tumorvolumen der Kontrollen stieg im Gegensatz dazu nach einer Behandlungsdauer
von 3 Wochen bis auf das 4,4 fache des Ausgangsvolumens an.
Seite | 106
Ergebnisse
7.9 Histologische Analysen des Tumors Bo 80
7.9.1 HE-Färbung
Tabelle 7.2: Ergebnisse der histologischen Hämatoxylin-Eosin-Färbung
fibrotischer
Anteil
max.
Dicke des
fib. Anteils
nekrotischer
Anteil
Differen
zierungsgrad
Kontrolle
5,50
0,11
46,50
2,00
Stabw
1,58
0,05
11,56
0,00
Taurolidin
(500mg/kg*KG)
Stabw
5,00
0,12
48,00
2,00
0,00
0,04
15,25
0,00
2250 (500mg/kg*KG)
6,33
0,11
45,56
2,00
Stabw
2,18
0,04
14,24
0,00
Gemcitabine (50
mg/kg*KG)
Stabw
25,63
0,41
30,00
2,00
22,75
0,47
28,03
0,00
Kombination
Gemcitabine und 2250
Stabw
57,86
0,82
5,00
2,57
17,76
0,55
0,00
0,53
Kombination
Gemcitabine und TRD
Stabw
62,86
0,87
14,29
2,57
22,15
0,42
12,72
0,53
Seite | 107
Ergebnisse
Abbildung 7.21: Bilder der histologischen Hämatoxylin-Eosin-Färbung
Das Gewebe aus dem PDX Modell Bo80 wurden nach der Behandlung mit den verschiedenen Agenzien (Kontrolle, TRD, Substanz 2250, Gemcitabin, TRD + Gemcitabin und Substanz 2250 + Gemcitabin) histologisch mittels Hämatoxylin-Eosin- Färbung analysiert. Es sind zwei verschiedene Vergrößerungen - 2,5x (A) und 10x (B) der histologischen Schnitte dargestellt.
Seite | 108
Ergebnisse
Zur histologischen Bewertung der mit den Substanzen 2250, TRD, Gemcitabine sowie denen Kombinationen behandelten Tumoren, ausgehend von dem Patientengewebe Bo80, wurde eine Hämatoxylin-Eosin-Färbung durchgeführt (Abb 7.21).
Dabei zeigten sich bei der Kontrolle und den Monotherapien mit den Substanzen 2250 oder TRD im
Allgemeinen keine wesentlichen Unterschiede. Bei der Monotherapie mit Gemcitabine wurde ein
erhöhter fibrotischer Anteil von 25,63 % im Gegensatz zur Kontrolle (5,5 %) beobachtet werden.
Auch wurde ein geringerer nekrotischer Anteil (30 %) beobachtet.
Bei den Kombinationstherapien zeigten sich deutlicherer Differenzen, die Werte des fibrotischen
Anteils lagen bei beiden Kombinationen über 55 %, der strikt duktale Anteil bei ca 95 % und der Anteil an nekrotischen Zellen bei unter 15 %.
Seite | 109
Diskussion
8 Diskussion
Die anti-neoplastische Aktivität der Muttersubstanz Taurolidin konnte bis jetzt schon in mehreren
Studien an unterschiedlichen Tumorentitäten in vitro und in vivo gezeigt werden [Caruso et al, 2010;
Stendel et al, 2007; Gong et al, 2007; Gidley et al, 1981; Gorman et al, 1987; Jacobi et al, 1997; Jacobi
et al, 1999; Koldehoff et al, 2004; Solomon et al, 2010]. Diese Ergebnisse wurden bislang in einigen
klinischen Pilotstudien bestätigt [Watson et al, 1995; Reith et al, 1997; Staubach et al, 1997]. Zur antineoplastischen Wirkung der kürzlich entwickelten neuen Substanz 2250 gibt es bislang keine publizierten Daten. Es wurde bis jetzt nur ein Vortest zur zytotoxischen Wirkung während der Entwicklung
durchgeführt [Pfirrmann, persönliche Korrespondenz]. Bei diesem Test an der Gliomzellline LN 229
deutete sich ein hoffnungsvolles anti-neoplastischen Potential der Substanz 2250 an (EC 50 = 55
µg/ml), welches Ähnlichkeiten mit der Muttersubstanz Taurolidin aufwies. Im Vergleich dazu war
eine dritte getestete Oxathiazin Verbindung, die Substanz 2256, wirkungslos. Dies zeigt, dass schon
kleine Strukturänderungen die Eigenschaften einer Verbindung maßgeblich beeinflussen können
[Pfirrmann, persönliche Korrespondenz].
Abbildung 8.1: Zytotoxische Wirkung der entwickelten Oxathiazin Derivate in LN 229 Gliomzellen
Strukturen der Oxathiazin Derivate 2250, 2255 und 2256. Der zytotoxische Assay während der Entwicklungsphase zeigte, dass die Substanzen 2250 und 2255 im Vergleich zur Substanz 2256 einen zytotoxischen Effekt
aufweisen.
++ effectiv, - ineffectiv [Pfirrmann, persönliche Korrespondenz]
Ziel des Projekts war daher, die anti-neoplastische Wirkung der Substanz 2250 eingehender zu charakterisieren. Zunächst erfolgte eine anti-neoplastische in vitro Charakterisierung sowie eine Analyse
der zugrundeliegenden Mechanismen. Ebenfalls wurde der Effekt der Substanz gegenüber Zellen mit
Seite | 110
Diskussion
stammzellähnlichen Charakter geprüft. Auf Basis der erarbeitete Ergebnisse wurde eine in vivo Charakterisierung der Substanz 2250 angeschlossen.
8.1 Vergleichende Charakterisierung der neu entwickelten Substanz 2250
mit ihrer Muttersubstanz Taurolidin – in vitro
Dieser Teil der Prüfung war der Bestimmung von Dosis-Wirkungs-Charakteristika gewidmet. Die Beteiligung von Apoptose und Nekrose am induzierten Zelltod durch die Substanz 2250 wurde folgend
erforscht.
8.1.1 Zelllinienauswahl
Die analysierten Pankreaskarzinomzelllinien wurden gewählt um die ein breites Genspektrum an
Wildtyp bzw. Mutanten der Gene aufwiesen, die im Pankreaskarzinom als driver Mutationen eingestuft werden und die höchste Mutationfrequenzen haben [Deer et al, 2010].
Dazu zählt das KRAS Gen, welches eine Mutationfrequenz von 75-100 % im Pankreaskarzinom aufweist [Almoguera et al, 1988; Smit et al, 1988; Pelleata et al, 1994; Deramaudt et al, 2005. Sowie
TP53 als ein weiteres Gen mit hoher Mutationsfrequenz, denn 50-70% der Pankreaskarzinome weisen eine TP53 Mutationen auf [Scarpa et al, 1993; Yonezawa et al, 2008].
Desweiteren wurde eine Pankreaskarzinom Zelllinie (Bo80) verwendet, welche 2013 in einer kooperierenden Arbeitsgruppe aus einem Patiententumor etabliert wurde und die in vitro dem Primärtumor ähnlichen Wachstumscharakteristika aufweist.
8.1.2 Zytotoxische und proliferationsinhibierende Wirkung der Substanz 2250
Um die zytotoxische Wirkung der Substanz 2250 zu analysieren, wurde ein MTT Assay duchgefüht. In
allen analysierten Pankreaskarzinom Zelllinien führte die Inkubation in steigenden Konzentrationen
für 24 h und 48 h zu einer nahezu homogenen dosisabhängigen Reduktion der lebenden Zellen. Es
konnte bei vier der analysierten Zelllinien ein proportionaler Dosis Wirkungs Effekt beobachtet werden. Bei den Zelllinien BxPC-3 und MiaPaca 2 war ein sigmoider Kurvenverlauf erkennbar. Die proportionale Dosis-Wirkungs-Beziehung ist analog zu der am häufigesten beschriebenen Dosis-
Seite | 111
Diskussion
Wirkungs-Beziehung der Muttersubstanz TRD [Gorman et al, 1987; Jacobi et al, 1997; Koldehoff et al,
2004; Bedrosian et al, 1991; Leithauser et al, 1997; Stendel et al, 2009]. Unsere Arbeitsgruppe konnte
dies 2010 ebenfalls in zwei Pankreaskarzinomzelllinien für TRD nachweisen. Allerdings zeigten Zelllinien anderer Entitäten bei dieser Analyse auch andere Dosis-Wirkungs-Beziehungen. Bei den Zelllinien HT 29 (Kolonkarzinom Zelllinie) und Chang Liver (Leberkarzinom Zelllinie) wiesen die DosisWirkungs-Beziehungen einen v-förmigen Charakter auf. Dies konnte bis jetzt nur in zwei Arbeiten
unserer Gruppe gezeigt werden [Chromik et al, 2010; Daigerler et al, 2008]. In einer kürzlich erschienenen Arbeit konnten Eschenburg et al. 2014 in Neuroblastom Zelllinien ebenfalls eine proportionale
Dosis Wirkungs Beziehung von TRD aufzeigen.
Aus der Dosis-Wirkungskurve wurde für die Substanz 2250 zelllinienspezifisch eine ED 50 abgeleitet,
die zwischen 221 µmol/l bei der Zelllinie BxPC-3 und 1400 µmol/l bei der Zelllinie HPAF II mit einer
Inkubationszeit von 24 h rangiert. Weitere veröffentliche Daten zur ED 50 liegen zu der Substanz
2250 bisher nicht vor. Bei der Muttersubstanz TRD variiert die Datenlage zur ED 50 je nach Zelllinie
und Zytotoxizitätstuntersuchung (colorimetrische Assays mit Tetrazoliumsalzen wie XTT, MTT, MTS,
WST) oder direkter Zellzahlbestimmung nach Vitalfärbung erheblich und bewegt sich zwischen 16
µmol/l und 17 mmol/l (Tabelle 8.1). In der neuesten Arbeit wurde eine ED 50 von TRD bei Neuroblastom Zelllinien zwischen 126 µmol/l und 353 µmol/l angegeben [Eschenberg et al, 2014].
Seite | 112
Diskussion
Tabelle 8.1: Zelllinien maligner Tumoren, bei denen TRD in vitro eine anti-neoplastische Wirkung zeigt
Die Bestimmung der EC50 erfolgte mittels Vitalfärbung und Zellzahlbestimmung durch Zytotoxizitätsversuche
über colorimetrische Assays mit Tetrazoliumsalzen (XTT, MTT, MTS, WST).
Tumor-Entität
Glioblastom
Assay
Vitalfärbung
ED50
133-350µM
Referenz
[Stendel
al,2009]
Glioblastom
Zelllinie
LN-18, LN-229, U87MG, U-138, U-251, U373
U-373
WST
125µM
Malignes Melanom
MNT-1, B16F10
Vitalfärbung
25-30µM
Malignes Melanom
Mesotheliom
Mesotheliom
Mesotheliom
Prostatakarzinom
B164A5, B16F10
REN, LRK, H28
ZL5, ZL34, ZL55, H28
MMB, MMP
DU145
MTT
MTT
MTT
MTT
MTT
ca. 50µM
49-135µM
50-100µM
ca. 100µM
16,8µM
Urothelkarzinom
HCV-29, RT-4, RT-112, J82, AY-27
U2OS,
SaOS,
LM5,
HOS,143B, MG-63, Hu09
SCC4, SCC15
XTT
25-100µM
WST
28-95µM
[Stendel et al,
2003]
[Shayer et al,
2003]
[Sun et al, 2007]
[Nici et al, 2004]
[Opitz et al, 2007]
[Aceto et al, 2009]
[Darowski et al,
2004]
[Abramjuk et al,
2009]
[Walters et al,
2007]
WST
ca. 351µM
DHD/K12/TRb, CX-1 /
HV1A3, TFK-1
Vitalfärbung
ca. 17mM
Colonkarzinom
DHD/K12/Trb
MTS
53-88µM
Colonkarzinom
HT29
XTT
ca. 8-12mM
Hepatozelluläres Karzinom
HepG2, Hep3B
MTT
ca. 1750µM
Osteosarkom
Plattenepithelkarzinom der
Zunge
Colon/Gallenblasenkarzinom
[Petrovic et
2003]
[Jacobi et
1999; Jacobi et
1997]
[McCourt et
2000]
[Braumann et
2004]
[Wordemann
al, 1998]
et
al,
al,
al,
al,
al,
et
Vergleichend mit der Muttersubstanz TRD liegen die Werte für die ED 50 der Substanz 2250 beim
Pankreaskarzinom etwas höher. Um diesen Wert allerdings genauer beurteilen zu können ist es wichtig die weiteren Eigenschaften der Substanz zu kennen. In diesem Fall liegen die Werte der ED 50
zwar generell recht hoch, allerdings weist die Substanz 2250 eine sehr gute Löslichkeit in Wasser auf
(> 1mg/ml). Somit ist dies bei der gemessenen ED 50 kein limitierender Faktor. Desweiteren erwarten wir im Hinblick auf das Risikoprofil der Muttersubstanz TRD auch bei der Substanz 2250 ein eher
geringes toxisches Nebenwirkungsprofil. Eine Mögliche Erklärung für die höhere ED 50 könnte sein,
dass die Substanz 2250 einen ähnlichen anti-neoplastischen Mechanismus aufweist, denn auf Grund
der Doppelringstruktur von TRD kommt es bei der Metabolisierung zu einer doppelten Molarität der
Einzelringstrukturen.
Neben der zytotoxischen Wirkung der Substanz 2250 sollte auch der proliferationinhibierende Effekt
analysiert werden. Dazu wurde ein BrdU Assay durchgeführt. In allen analysierten Zelllinien konnte
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ein proliferatinsinhibierender Effekt festgestellt werden, der mit steigender Konzentration in allen
Zelllinen zunahm (bis zu einem max. Abfall der Proliferationsrate um 90%). Verglichen mit der Muttersubstanz TRD konnte ein nahezu gleicher inhibierender Effekt der Proliferation beobachtet werden. Die in unserer Studie beschriebene sigmoide Dosis Wirkungs Beziehung wurde in der Literatur
für die Muttersubstanz TRD bisher nicht beschrieben.
Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Substanz 2250, im Hinblick auf die zytotoxische
und die proliferationsinhibierende Wirkung in Pankreaskarzinom Zelllinien, ähnliche Eigenschaften
aufweist wie ihre Muttersubstanz TRD. Im Weiteren Verlauf dieser Studie wird nun näher auf die
beteiligten anti-neoplastischen Mechanismen eingegangen.
8.1.3 Apoptose induzierenden Wirkung der Substanz 2250
Um die zytotoxische Wirkung der Substanz weitergehend zu charakterisieren wurde eine FACS Analyse duchgeführt, bei welcher es anhand verschiedener Marker möglich ist, apoptotische von nekrotischen Zellen zu differenzieren. Es wurden drei der analysierten Zelllinien verwendet, da die weiteren
Zelllinien entweder nicht ausreichend gut vereinzelt werden konnten (HPAF II und Panc-1) oder eine
zu hohe Autofluoreszenz aufweisen (MiaPaca2), was eine FACS anlyse unmöglich macht.
Die drei analysierten Pankreaskarzinomzelllinien (AsPC-1, BxPC-3 and PancTuI) wiesen ebenfalls eine
dosisiabhängige Beziehung im Hinblick auf die relative Verteilung der lebenden, apoptotischen und
nekrotischen Zellen auf. Dabei reduzierte sich der Anteil der lebenden Zellen mit zunehmender Konzentration der Substanz 2250. Dieser dosisabhängige Anteil der lebenden und Zellen stimmt mit den
Ergebnissen vorheriger Studien mit der Muttersubstanz TRD unserer Arbeitsgruppe [de Bruin et al,
2008] und mit denen anderer [Jacobi et al, 2005; Jacobi et al, 1997] überein. Dennoch schwanken
auch hier die Konzentration der maximalen Apoptose Induktion mit den verschiedenen Tumorentitäten. McCourt et al. postulieren für Zelllinien des kolorektalen Karzinoms der Ratte [DHB/K12/Trb),
dass bei 18 µM maximale Apoptoseeffekte auftraten, die unter steigender Konzentration wieder
rückläufig waren [McCourt et al, 2000]. Han et al. fanden dagegen an einer humanen Leukämie Zelllinie (HL-60) eine 90%ige Apoptoseinduktion bei einer Konzentration von 150 µM [Han et al, 2002].
Darüber hinaus liegen die Werte für eine maximale Apoptose Induktion nach Stendel et al. an
Glioblastom Zelllinien bei 175-350 µM [Stendel et al, 2009] und nach Petrovic et al. an Plattenepithel
Zelllinien bei 1,76 mM [Petrovic et al, 2003] nochmals deutlich höher. Allerdings erschweren unterschiedliche Studienbedingungen, wie Inkubationszeit, verschiedene Konzentrationsreihen und diffe-
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rente Apoptosemarker die Vergleichbarkeit. Der nekrotische Anteil der Zellen ist mit zunehmender
Konzentration der Substanz 2250 verglichen mit den der Muttersubstanz TRD allerdings ausgeprägter. Eine mögliche Erklärung diesbezüglich wäre das verwendete Zellkulturmodell. Denn im Allgemeinen führt die Apoptose zu einem Caspase abhängigen Zelltod mit anschließender Phagozytose der
apoptotischen Zellen [Zimmermann et al, 2001] Im Zellkulturmodell ist aufgrund fehlender
phagozytierender Zellen eine Phagozytose nicht möglich und es folgt auf die Apoptose eine sekundäre Nekrose. Diese hat die gleichen Merkmale wie eine primäre Nekrose [Vanden et al, 2010]. Der für
die Nekrosedetektion verwendete Marker Propidium Iodid (PI) kann letztendlich nicht zwischen der
Substanz induzierten primären Nekrose und der sekundären Nekrose, herbeigeführt durch die nicht
vorhandene Möglichkeit der Phagozytose, differenzieren. Eine weitere mögliche Erklärung ist die
Induktion einer programmierten Nekrose durch Substanz 2250 [Zhang et al, 2014]. Die programmierte Nekrose (Nekroptose) ist neben der Apoptose und der Autophagie die dritte Form des programmierten Zelltods. Die programmierte Nekrose beinhaltet das Anschwellen der Zellen, die Organellendysfunktion sowie die Zelllyse. Sie kann durch verschiedene Signalwege induziert werden, z.B. durch
Aktivierung des Death Receptors (DR) oder durch Zell-Stress induzierte Aktivierung der Kinasen RIP1
und RIP3, was die Freisetzung von reaktiven Sauerstoff Spezies (ROS) der Mitochondrien begünstigt
[Stendel et al, 2003; Ouyang et al, 2012]. Bei der Muttersubstanz TRD konnte schon gezeiget werden,
dass neben anderen Zelltod induzierenden Prozessen auch die Nekroptose eine Rolle spielt [Stendel
et al, 2009]. So konnten Stendel et al beim Glioblastom nicht die Hypothese der klassischen Apoptose
bei der Zelltodinduktion durch TRD unterstützen, denn es wurde eine steigende Anzahl an
spätapoptotischen und nekrotischen Zellen nachgewiesen. Dies widerspricht allerdings nicht anderen
Formen des programmierten Zelltods wie Autophagie oder Nekroptose. Um die relativ neue Hypothese der Beteiligung der Nekroptose zu analysieren wurde bei Stendel et al. ein selektiver Inhibitor
der receptor-interacting protein kinase RIP1 (Nekrostatin-1) verwendet, wodurch die TRD induzierte
Zytotoxizität herabgesetzt werden konnte [Stendel et al, 2009]. Um diese Hypothese der programmierten Nekrose für die Substanz 2250 zu klären sollten weitereführende Experimente zur funktionellen Analyse mit dem RIP1 Inhibitor Nekrostatin-1 durchgeführt werden.
8.2 Funktionelle Charakterisierung der Substanz 2250
Da sich bei den ersten in vitro Analysen eine vielversprechende anti-neoplastsiche Wirkung der Substanz 2250 erkennen lies, wurde eine weiterführende funktionelle Charakterisierung im Vergleich zur
Muttersubstanz durchgeführt. So wurde analysiert, ob am induzierten Zelltod durch die Substanz
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2250 reaktive Sauerstoff Spezies sowie Kaspase Kaskaden beteiligt sind. Desweiteren sollte analysiert
werden, ob die Substanzen 2250 und TRD in Kombination mit hyperthermischen Verfahren eine synergistische anti-neoplastische Wirkung aufweisen.
8.2.1 Wege der Zelltodinduktion durch Substanz 2250
Bei bisherigen Studien mit TRD wurde die Beteiligung von reaktiven Sauerstoff Spezies (ROS)
[Pfirrmann et al, 1979; Leithauser et al, 1997; Stendel et al, 2003; Möhler et al, 2014] sowie eines
weiteren wichtigen Zelltod assoziierten Signalwegs, dem Kaspase Signalweg [Chromik et al, 2010;
Stendel et al, 2004b; Leithauser et al, 1997; Rosman et al, 1996], beschrieben. Auf Grund dieser
Ergenisse wurde im weiteren Verlauf dieser Arbeit die Beteiligung der reaktiven Sauerstoff Spezies
sowie der Kaspase Kaskaden an der Zelltod Induktion durch die Substanz 2250 analysiert. Weiterhin
konnten bisherige Studien zeigen, dass der Radikalfänger N-acelylcystein (NAC) vor dem ROSinduziertem Zelltod schützen kann [Pfirrmann et al, 1979; Stendele et al, 2003; Leithauser et al, 1997;
Jacobi et al, 1997]. Daher wurden in dieser Studie Rescue-Experimente mit entweder dem Radikalfänger N-Acetylcystein zur Inhibition des oxidativen Stresses oder mit dem Pan Kaspase Inhibitor zVAD, um Beteiligungen der Kaspase Kaskaden nachzuweisen, durchgeführt.
Bei den Rescue-Expperimenten mit NAC reagierten alle analysierten Pankreaskarzinomzelllinien mit
einem verminderten, durch die Substanz 2250 induzierten, Zelltod. Dennoch war das Ausmaß des
Schutzes vor dem Zelltod zwischen den analysierten Zelllinien unterschiedlich. Es erstreckt sich von
partiellem Schutz (BxPC-3, MiaPaca-2, PancTuI) bis hin zur kompletten Inhibition des Zelltods bei den
Zelllinien AsPC-1 und Panc-1.
Allerdings werden die reaktiven Sauerstoff Spezies im Hinblick auf die anti-neoplastische Aktivität
kontrovers diskutiert [45]. Auf der einen Seite können ROS die Proliferation und das Überleben von
Tumorzellen begünstigen [16, 45]. Andererseits ist eine überhöhte ROS Generierung in Tumorzellen
mit anschließender Aktivierung des programmierten Zelltods eine bekannte therapeutische Strategie
mehrerer Platin-, Arsen-, Ascorbat- oder Piperolongumin-basierter Chemotherapeutika [15, 45 - 48].
Tumorzellen weisen generell ein erhöhtes Level an ROS auf, wodurch ihr Zellstresstoleranzlimit im
Vergleich zu Normalzellen nur noch begrenzt ist [Luo et al 2009; Trachootham et al 2009; Gorrini et al
2013]. Durch die antioxidante Fähigkeit und das geringere basale Level an ROS in normalen Zellen,
können diese mit der Wirkung pro-oxidanter Agenzien besser umgehen, so dass sie gegenüber
Therapetika mit pro-oxidativer Wirkung toleranter sind [Wondrak et al, 2009, Möhler et al, 2014,
Aceto et al, 2009; Calabresi et al, 2001; Ribizzi et al, 2002]. Ähnliches konnte auch in vivo in Tiermo-
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dellen mit Nagern sowie bei ersten humanan Studien beobachtet werden. Die Leukopoese sowie
Erythropoese blieben bei der Behandlung mit Taurolidin in Ratten unbeeinflusst und bei humanan
Probanten kam es bei der iv Applikation nur zu einem leichte Brennschmerz an der Applikationsstelle
[Braumann et al, 2005; Jacobi et al, 1997]. Dieses geringe Nebenwirkungsprofil unterscheidet TRD
von anderen Agenzien, welche das ROS Level beeinflussen wie z.B. Paclitaxel, Bleomycin, Cisplatin
und dem Glutathion Synthase Hemmer BSO [Trachootham et al, 2006; Huang et al, 2000; Shaw et al,
2011; Dolan et al, 2003; Guzman et al, 2007].
Abbildung 8.2: Die postulierte anti-neoplastische Wirkung der Substanz TRD
Durch das Ansteigen der ROS induziert TRD Zytotoxizität in Tumor Zellen. Diese Zytotoxizität wird sowohl
durch die Induktion der Apoptose als auch über Autophagie und Nekroptose vermittel. Dennoch variiert der
Grad der Beteilgung dieser Prozesse zwischen den verschiedenen Tumor Zell Entitäten. Reduzierenden
Argenzien wie N-Acetylcystein (NAC) oder Gluthathion (GSH) inhibieren die zytotoxische Wirkung und unterstützen daher den Mechanismus der redox gerichteten antineoplastischen Wirkung [adaptiert nach Möhler et
al, 2014]
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Generierung von ROS und die nachfolgend aktivierten Signalwege eine naheliegende Erklärung für den durch die Substanz 2250 induzierten Zelltod
inbesondere in Pankreaskarzinom Zelllinien darstellen. Wahrscheinlich ist der ROS induzierte Zelltod
nicht der alleinige Wirkmechanismus der Substanz 2250. Die Ergebnisse dieser Arbeit betonen jedoch
die zentrale Rolle der ROS beim induzierten Zelltod durch die Substanz 2250. Die aktuellen Ergebnisse betätigen auch die hier gezeigten Daten im Hinblick auf die Apoptose und Nekrose Induktion,
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Diskussion
denn oxidativer Stress, welcher zu einem erhöhten ROS Spiegel führt, kann auch die programmierte
Nekrose in einem hohen Maße induzieren [Zhang et al, 2014].
Ebenfalls wurde in dieser Studie die Beteiligung der Kaspase Signalwege, welche hauptsächlich mit
programmiertem Zelltod assoziiert werden, analysiert [Jacobi et al, 1997; Leithauser et al, 1997;
Rosman et al, 1996; Schneider etal, 2005]. In der Literatur wurde die Aktivierung der KaspaseKaskaden durch TRD schon für mehrere Tumorzelllinien beschrieben. Dennoch bestehen Unterschiede zwischen den Tumorentitäten. Außerdem wurden auch weitere kaspaseunabhängige Wege der
Apoptoseinduktion in der Literatur beschrieben [Chromik et al, 2010; Jacobi et al, 1997], so wurde
die Apoptoseinduktion über das mitochondriale Protein AIF (apoptosis-inducing factor) nachgewiesen. Das proapoptotische Protein AIF sowie auch die Endonuklease G können bei Apoptoseinduktion
aus dem mitochondrialen Intermembranraum freigesetzt werden und translozieren in den Zellkern
wo sie internukleosomale DNA-Fragmentierung und DNA-Kondensation ohne Beteiligung von aktivierten Kaspasen induzieren können [Li et al, 2001; Miramar et al, 2001; Susin et al, 1999, Joza et al,
2001]. Die in der vorliegenden Studie analysierten Zelllinien (AsPC-1, BxPC-3) waren in unseren Experimenten nicht durch die Inhibition der Pan Kaspasen vor dem durch die Substanz 2250 induzierten
Zelltod geschützt. Frühere Studien unserer Arbeitsgruppe konnten zeigen, dass Pankreaskarzinomzelllinien durch die Inhibition der Pan Kaspasen ebenfalls nicht vor dem programmierten Zelltod,
induziert durch die Muttersubstanz TRD, geschützt waren [Chrimok et al, 2010]. Durch die hier beobachtete Reaktion der Pankreaskarzinom Zelllinien kann vorsichtig vermutet werden, dass der
kaspaseabhängige programmierte Zelltod speziell beim Pankreaskarzinom eher eine untergeordnete
Rolle spielt. Daher wird die Möglichkeit, dass andere Signalwege wie Nekroptose oder weitere
kaspaseunabhängige Signalwege eine erheblichere Rolle spielen immer wahrscheinlicher. Diese rücken im Hinblick auf die Krebstherapie auch in der neueren Literatur immer mehr in den Fokus [Jacobi et al, 1973; McCourt et al, 2000; Billing et al, 1992; Stephen et al, 2014; Kroemer et al, 2005; Kim et
al, 2014; Leon et al, 2013]. Dennoch sind weitere Studien notwendig, um die Beteiligung
kaspaseunabhängiger Signalwege, wie die Apoptose Induktion über AIF, nach der Behandlung mit
Substanz 2250 zu verifizieren.
8.2.2 Synergistische Effekte der Substanz 2250 mit hyperthermischen Verfahren
Die Methode der hyperthermischen Behandlung mit unterschiedlichsten Verfahren ist in der letzten
Zeit viel diskutiert worden [Issels et al, 2010; Ahmed et al, 2015; Ahmed et al, 2013]. In der onkologischen Therapie des Pankreaskarzinoms wird die Kombiation aus milder Hyperthermie (bis 42°C) mit
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Diskussion
Gemcitabin beladenen liposomalen Nanaopartikeln analysiert. Dabei konnten Affram et al. feststellen, dass die liposomalen Nanopartikel eine lokale Applikation von Gemcitabin in der Nähe der Tumorzelle positiv beeinflussen. Ebenfalls konnten sie die antineoplastische Wirkung von Gemcitabin
durch die Kombination mit Hyperthermie deutlich steigern. Dies konnte von dieser Arbeitsgruppe
sowohl in vitro an Pankreaskarzinom Zelllinien als auch an immunsuprimierten Nacktmäusen gezeigt
werden [Affram et al, 2015a; Affram et al, 2015b]. Des Weiteren ist die Hyperthermie auch in der
chirurgischen Onkologie von großem Interesse. Die Methode der HIPEC (Hyperthermische intraperitoneale Chemotherapie) gerät immer mehr in den Fokus vor allen bei der Behandlung von
Peritonealkarzinosen [Halkaia et al, 2015; Lambert et al, 2015] aber auch die Behandlung vom Pankreaskarzinom kann durch die Methode der HIPEC positiv beeinflusst werden. In einer klinischen Studie von Tendes et al. konnte gezeigt werden, dass es einen Überlebensvorteil bei der Resektion des
Pankreaskarzinoms in Kombination mit einer Gemcitabin HIPEC sogar bei Patienten mit Lymphknoten
Beteiligung gibt [Tendes et al, 2015]. Auch die nicht invasive Anwendung der Hyperthermie beim
Pankreaskarzinom wird in Betracht gezogen. Bei Roesch et al. wurde die bisherigen Forschungsergebnisse zusammengefasst und dargelegt dass die hyperthermischen Verfahren das Potential besitzen die Lebenserwartung von Pankreaskarzinom Patienten zu verlängern sowie die Lebensqualität
positiv zu beeinflussen [Roesch et al, 2015].
In unserer Studie haben wir daher die Substanzen 2250 und TRD mit einer hyperthermischen Behandlung kombiniert um eine synergistische Wirkung zu erreichen. Dabei konnten bei den analysierten Zelllinien gegenläufige Ergebnisse erzielt werden. Nur in den Zelllinien HPAF II und AsPC-1 konnte
bei dem ersten Ansatz, bei dem die mit den Substanzen behandelten Zellen 24h bei 40,5 °C inkubiert
wurden, ein synergistischer Effekt ausgemacht werden. Bei dem zweiten Ansatz, der eine Inkubationszeit der Zellen von 2h bei 42 °C aufwies, konnte ebenfalls nur in einigen Zelllinien (HPAF-II, BxPC3) eine verstärkende Wirkung der Hyperthermie gezeigt werden. Die positive Hyperthermiewirkung
war somit zelllinienabhängig. Eine ausgeprägte synergistische Wirkung der Hyperthermie konnte
gerade bei der Zelllinie beobachtet werden, die ein relativ langsames Ansprechen auf die Therapie
mit den Substanzen 2250 und TRD aufweist (HPAF II). Allerdings ist eine Behandlung mit dem Ansatz,
der die lokale Hyperthermie imitieren soll, bei 2 h und 42,5 °C empfehlenswerter, da dort kein negativer Effekt gegenüber der Kontrollzellen zu sehen war. In einem nächsten Schritt wäre es daher
wichtig die Kombination aus Substanz 2250 und Hyperthermie in PDX-Modellen auf ihre synergistische Wirksamkeit hin zu überprüfen[Fujimoto S, 1991; Visaria et al, 2006].
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Diskussion
8.3 Anti neoplastische Wirkung der Substanz 250 und TRD im Hinblick auf
das Stammzellmodell
Da in der Literatur das hierarchische Modell des Tumorwachstums in letzter Zeit viel diskutiert wird
[Chen et al, 2013; Abel et al, 2013; Pistol et al, 2014; Dragu et al, 2015], wurde in dieser Studie die
anti-neolastische Wirkung der Substanzen 2250 und TRD auf Zelle mit stammzellähnlichem Charakter
untersucht.
8.3.1 Wahl des Kultivierungsmodells und der Zelllinien
Die Zellkulturen wurden in einem dreidimensionalen (3D) Spheroidmodell kultiviert, da dieses im
Vergleich zu zwei dimensionalen (2D) Modellen wesentlich besser die zellulären Charakteristika in
natürlichem Gewebe nachahmt [Müller-Klieser et al, 1997] und somit die Lücke zwischen den herkömmlichen Monolayer in vitro Kulturen und den bekannten in vivo Modellen an Nagern schließt. Die
multizellulären Spheroidmodelle sind dabei die am meisten genutzten 3D Modelle. Sie können die
zelluläre Umgebung, die Tumorwachstumskinetik und die Zellärchitektur vergleichend mit denen von
Mikrometastasen, blutgefäßlosen Tumorknoten oder intervaskulären Regionen von soliden Tumoren
besser darstellen [Wen et al, 2013]. Ebenfalls ist es auf Grund dieser Merkmale möglich mit dem 3D
Spheroid Modell Zellen mit stammzellähnlichem Charakter anzureichern [Heeschen et al, 2014].
Das bisher eingesetzte Zelllinienpanel wurde zunächst im Spheroid Formations Assay auf ihre Fähigkeit Spheroide zu bilden untersucht. Damit Zellverbände als Spheroide eingestuft werden durften sie
sich nicht merh mechanisch vereinzeln lassen. Dabei bildeten MiaPaca-2, AsPC-1 und Panc-1 nur Zellaggregate und konnten somit nicht weiter analysiert werden. Die Zelllinien BxPC-3 bildete zwar
Spheroide, diese ließen sich allerdings auch chemisch nicht wieder vereinzeln, weder mit Trypsin/EDTA, 10x Trypsin oder mit Accutase. Somit konnten mit der Zellinie BxPC-3 die Analyse der
CD133+ Zellpopulation nicht durchgeführt werden. Die Zelllinien Panc TuI, Colo 357 und die Zelllinie
Bo80, welche in einer kooperierenden Arbeitsgruppe aus einem PDX Modell etabliert wurde, bildeten Spheroide und konnten für die weiteren Analysen verwendet werden.
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Diskussion
8.3.2 Wirkung der Substanz 2250 und TRD im Hinblick auf die morphologische Struktur der
Spheroid Kulturen
Für die Evalutaion des Effektes der Substanz 2250 und TRD auf Spheroide wurden die Zelllinien Panc
TuI, BxPC-3, Colo357 und Bo80 analysiert. Es konnte lichtmikroskopisch bei beiden Substanzen ein
Zerfallen der spheroidären Struktur beobachtet weden. Dies könnte darauf hinweisen, dass die Substanz 2250 und TRD auch eine Wirkung gegenüber spheroidären Strukturen aufweisen, welche durch
die bereits analysierten Effekte der Apoptose und Nekroptose sowie auch durch einen antiadhärenten Effekt charakterisiert sein kann. Diese u.a. antiadhärente Eigenschafte der Substanz TRD ist in der
Literatur bereits beschrieben worden. Sie wird durch die biochemische Struktur belegt: Taurolidin
wird aus der nicht essentiellen Aminosulfonsäure Taurin (Aminoethylsulfonsäure) synthetisiert. In
Lösung liegt Taurolidin im Gleichgewicht mit seinen Metaboliten Taurultam und Methyloltaurultam
vor, welche als Überträger von Methylolgruppen fungieren. Die aktiven Methylolgruppen sind in der
Lage mit Bestandteilen der bakteriellen Zellwand zu interagieren und zu einer irreversiblen Kreuzvernetzung der extrazellulären Matrix sowie einem Aufreißen der Zellmembran zu führen [Pfirrmann,
1985]. TRD wirkt so auf ein breites Spektrum von Bakterien und Fungi, der beschiebene antiadhäsive
Effekt kann aber auch an eukaryotischen Zellen beobachtet werden und wurde klinisch zur Prophylaxe postoperativer Adhäsionen genutzt [Bedrosian et al, 1991]. Auch weitere in vitro Versuche belegen, dass sich mit Taurolidin inkubierte Zellen von der Unterlage lösen und frei in der Lösung schweben. Nach 72h Inkubation mit 50-100 µM Taurolidin verloren 50-80% der Zellen ihre Fähigkeit an
Oberflächen zu haften [Shrayer et al, 2003]. Diese Arbeiten zeigen, dass ein Teil der Wirksamkeit von
Taurolidin über die Methylierung freier Domänen der Extrazellulärmatrix vermittelt wird. Hierzu ist
ein direkter Kontakt von Taurolidin notwendig. Um zu bestätigen, dass den Ergebnissen dieser Analyse ein antiadhärenter Effekt zu Grunde liegt sollte noch ein Vitalitätsassay duchgeführt werden um
die Beteiligung von Apoptose und Nekroptose beurteilen zu können.
8.3.3 Wirkung der Substanzen 2250 und TRD auf die CD 133+ Zellpopulation
Zur weiterführenden Analytik wurde die Auswirkung der Substanzen TRD und 2250 im Vergleich zum
Chemotherapeutikum Gemcitabin auf die putativen Tumorstammzellen untersucht. Zur Markierung
der putativen Tumorstammzellen wurde ein CD133-Antikörper verwendet und die CD 133+ Zellfraktion mittels FACS quantitativ bestimmt. Die statistische Auswertung der Ergebnisse der CD 133+ Zell-
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population zeigte, dass es durch die Substanz 2250 und TRD in zwei der analysierten
Spheroidkulturen zu einer signifikanten Reduktion des Anteils der CD 133+ Zellen kam. Im Gegensatz
dazu wurde die Zahl der CD 133+ Zellen durch die Behandlung mit Gemcitabin nicht beeinflusst. In
der dritten analysierten Spheroidkultur der Zelllinie Colo 357 konnte nur eine Tendenz zur Reduktion
der CD 133+ Zellen durch die Substanz 2250 und TRD ausgemacht werden. Allerdings zeigte sich bei
dieser Zelllinie ein signifikanter Anstieg der CD 133+ Zellpopulation bei der Behandlung mit
Gemcitabin. Diese Daten unterstützen die schon zuvor in der Literatur beschriebene Befunde zur
Wirkung des Chemotherapeutikums Gemcitabin auf die tumorigenen Tumorstammzellfraktion, dort
wurde gezeigt, dass es keinen Einfluss auf die CD133+ Zellpopulation hat [Hermann et al, 2007]. Ein
ähnlicher Effekt wurde auch für andere Tumorentitäten beschrieben, dort hatte die konventionelle
Chemo-und Strahlentherapie ebenfalls nur einen sehr begrenzen, bis gar keinen Effekt auf Zellen mit
stammzellähnlichem Charakter [Bao et al, 2006, Hermann et al, 2007, Ho et al, 2007, Ma et al, 2007].
Für die Substanzen TRD und 2250 ist die momentane Datenlage zur Wirkung gegenüber Tumorstammzellen noch sehr begranzt. Nur für TRD wurde bisher gezeigt, dass die Substanz eine Wirkung
gegenüber murinen und humanen Tumorstammzellen des Glioms mit einer ED 50 von 12 ± 2 µg/ml
und 13 ± 2 µg/ml aufweist. Dabei wurden die Tumorstammzellen aus entweder der murinen Gliom
Zelllinie SMA 560 oder aus Patienten Gewebe jeweils mittels Formation von Neurospheroiden angereichert [Möhler et al, 2014]. Durch die Ergebnisse unserer Studie wird der antineoplastischer Effekt
der Substanz TRD gegenüber Tumorstammzellen weiter untermauert und auch die Substanz 2250
weist in unserer Studie dieses Potential auf und ist wie TRD im Hinblick auf die therapeutische Möglichkeit eines hierarchischen Tumormodells ein aussichtsreiches Agens. Dennoch ist eine Analyse der
putativen Tumorstammzellen mittels eines weiteren Markers sinnvoll um die bisherigen Ergebnisse
zu bestätigen, denn auch in der Literatur werden unterschiedliche Marker und Markerkombinationen
für das Pankreaskarzinom beschrieben.Die erste bescheibene Markerkombination für Zellen mit
stammzellähnlichem Charakter des Pankreaskarzinoms war die Kombination der Oberflächenantigene CD44, CD24 und EpCAM (Epithelial Cell Adhesion Molecule) [Li et al, 2007]. In der Studie wurde
allerdings die vermeintliche Stammzellfraktion mit einer Zellpopulation welche keinen der drei Marker exprimierte verglichen. Diese Beschränkung der Kontrollgruppe auf EpCam negative Zellen ist
wohl etwas zu restriktiv, da alle epithelialen Tumorzellen EpCAM exprimieren, und es würde sich
somit in der Kontrollgruppe eher um Entzündungs-, Stroma- und Endothelzellen handeln. Desweiteren führt die Kombination aus CD44 und CD24 in den meisten Pankreaskarzinom Zelllinien nicht zu
einer Anreicherung der Tumorstammzellpopulation, da diese Antigene von fast allen Tumorzellen
exprimiert werden. Dies konnte in unserer Studie ebenfalls festgestellt werden. Die zur Analyse verwendeten Zelllinien (Panc-TuI, Bo80 und Colo 357) exprimierten die beiden Marker schon in der
Monolayer Kultur im hohen Maße und die Anzahl der CD24 und CD44 positiven Zellen konnte bei der
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Spheroidkultivierung nicht weiter angereichert werden. Daher wurden diese Marker nicht verwendet. Der verwendete Marker CD 133 ist ein Oberflächenantigen und wurde in verschiedenen Tumorentitäten bisher als sehr erfolgreich beschrieben [Wright et al, 2003; Miki et al, 2007; O`Brien et al,
2007, Hermann et al, 2007]. Dennoch sind die Ergebnisse, welche allein duch diesen Marker generiert werden, kritisch zu beurteilen und ein weiterer Marker wie z.B. die Side population sollte noch
hinzugezogen werden. Auch muss darauf geachtet werden, dass ein Antikörper für CD133 verwendet
wird, welcher die glykosilierte Form des CD133 bindet, denn CD133 wird sowohl auf Tumorstammzellen als auch auf stark differenzierten Tumorzellen exprimiert unterscheidet sich aber in der
Glykosilierung und kann somit differenziert werden [Kemper et al, 2010; Immervoll et al, 2008].
8.4 Anti-neoplastische Wirkung der Substanzen 2250 und TRD am Pankreaskarzinom in vivo
Auf der Basis der vorhergegangenen vielversprechenden in vitro Ergebnisse analysierten wir den antineoplastischen Effekt der Substanz 2250 und TRD im Pankreaskarzinom in vivo. Zunächst wurde eine
Toxizitätsanalyse der Substanz 2250 an den Nacktmäusen durchgeführt. Hierdurch konnte die akute
maximal tolerierbare Dosis auf 1500 mg/kg*KG festgelegt werden. Bei der Bestimmung der chronischen Toxizität konnte ebenfalls eine toxische Wirkung ab einer Konzentration von 1000 mg/kg*KG
beobachtet werden. Desweiteren wurde zusätzlich die metabolische Halbwertszeit der Substanz
2250 in der Nacktmaus bestimmt. Unsere Analyse ergab mit einer Halbwertszeit von 13,8 h in der
Nacktmaus eine wesentlich höhere metabolische Stabilität der Substanz 2250 verglichen mit ihrer
Muttersubstanz TRD. Diese besitzt nur eine sehr kurze Halbwertszeit von wenigen Minuten in der
Maus [data not shown]. Diese längere Halbwertszeit könnte in der therapeutischen Anwendung ein
großer Vorteil beim Behandlungsschema sein.
In der Literatur konnte bisher nur für die Muttersubstanz TRD eine Tumor suprimierende Wirkung in
verschiedenen Tumorentitäten in Nagern gezeigt werden [Jacobi et al, 1997; McCourt et al, 2000;
Jacobi et al, 1997; Jacobi et al, 1999; Braumenn et al, 2003; Opitz et al, 2003; Bobrich et al, 2007;
Opitz et al, 2007; Braumann et al, 2005; Nestler et al, 2005; Raue et al, 2010; Kilian et al, 2003;
Braumann et al, 2007]. So inhibiert die ip Applikation von TRD das ip Tumor Wachstum im Kolonkarzinom [Nestler et al, 2005], Mesotheliom [Nici et al, 2004], malignem Melanom [Braumann et al,
2007; Sun et al, 2007] und Pankreaskarzinom [Kilian et al, 2003]. Ebenfalls konnte bisher gezeigt
werden, dass die intravenöse (iv) Applikation von TRD das ip Tumorwachstum auch reduziert
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Diskussion
[Braumann et al, 2000; Braumann et al, 2003; Braumann et al, 2005]. Auch existierten einige Studien
die sich mit dem subcutanen Tumorwachstum nach der TRD Applikation beschäftigen. Im
Kolonkazinom bleib das subcutane Tumorwachstum nach der Applikation von TRD unbeeinflusst
[Braumann et al, 2003; Braumann et al, 2000], wohingegen das subcutane Tumorwachstum im malignen Melanom [Sun et al, 2007; Da Costa et al, 2001] und im Proststakarzinom [Darnowski et al,
2004] durch die ip sowie auch die iv Instillation von TRD inhibiert wurde.
Daher basierte unsere experimentelle in vivo Studie auf der Hypothese, dass sowohl TRD als auch die
Substanz 2250 das Wachstum des Pankreaskarzinoms nach einer ip Applikation in etablierten Zelllinienmodellen sowie im PDX Modell in Nacktmäusen inhibieren. Wir beobachteten eine signifikante
Reduktion des Tumorwachstums, sowohl in Tumoren induziert durch etablierte Pankreaskarzinom
Zelllinien (MiaPaca 2, PancTuI) als auch in PDX Modellen. In keinem der untersuchten Tumore konnte
jedoch nach RECIST(Response Evaluation Criteria In Solid Tumors) 1.1 Kriterien ein Ansprechen nachgewiesen werden, denn auch wenn das Tumorvolumen der behandelten Tiere gegenüber der Kontrolle deutlich kleider war, so nahm das Tumorvolumen unter Therapie dennoch um mehr als 20 %
gegenüber dem Ausgangsvolumen zu [Eisenhauser et al, 2009]. Somit ist die alleinige Behandlung mit
der Substanz 2250 oder TRD im Hinblick auf eine onkologische Therapie nicht ausreichend effektiv.
Dennoch ist eine weitere Analyse der Wirkung der Substanz 2250 und TRD in vivo Im Hinblick auf
eine chirurgische Anwendung, z.B. eine introperitoneale Chemoperfusion, von Interesse. Dazu wäre
die Behandlung eines Mausmodells ohne bereits soliden Tumor sinnvoll, um analysieren zu können,
ob sich unter Behandlung mit der Substanz 2250 und TRD ein solider Tumor aus injizierten Tumorzellen formieren kann. Bei diesem Modell würden die injizierten Tumorzellen die nach der Resektion im
Bauchraum verbliebenen freien vitalen Tumorzellen simulieren. Auch eine iv Anwendung der Substanzen 2250 und TRD bezüglich im Blut zirkulierender Tumorzellen (CTC) ist hier denkbar.
Für die weiteren Untersuchungen wurde ausschließlich das PDX Modell eingesetzt, da dies bekanntermaßen die beste Vorhersagekraft zu einer möglichen Wirkung im Patienten hat. Der Vergleich der
Substanzen 2250 und TRd mit dem Chemoherapeutikum Gemcitabin, welches bei der Therapie des
PDAC eingesetzt wird, bestätigte zum einen die Daten der vorherigen in vivo Therapieversuche mit
dem PDX Bo 70 und zum anderen konnte nachgewiesen werden, dass die Gemcitabin Monotherapie
der Monotherapie mit den Substanzen 2250 und TRD überlegen ist. Dennoch war auch Gemcitabin
nicht in der Lage ein Ansprechen nach RECIST 1.1 Kriterien in diesem PDX Modell auszulösen [Eisenhauser et al, 2009]. Ähnliche Ergebnisse zu der Wirkung von Gemcitabin auf Pankreaskarzinom Modelle in Nacktmäusen wurden auch in anderen Studien gefunden. In einer Studie von Shen et al.
wurde ebenfalls eine Reduktion des Tumorwachstums beobachtet. Nach einer Behandlungdauer von
30 Tagen mit 50 mg/kg*KG iv kam es hier zu einer Inhibitionsrate von 77,53 %. Bei weiteren neueren
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Diskussion
Studien wurde ebenfalls ein ähnliches Ansprechen beobachtet [Shez et al, 2015; Qiao et al, 2015;
Burkhart et al, 2014], allerdings wurde nur selten das subcutane Tumorwachstum analysiert. Es kam
aber in keiner der Studien zu einer Remission des Tumorvolumens.
Bei den beiden Kombinationstherapien aus Gemcitabin mit der Substanz 2250 oder TRD konnte allerdings eine Reduktion des Tumorvolumens um 50 % gegenüber den Volumen zu Therapiebeginn
innerhalb von einer Behandlungsdauer von 3 Wochen erreicht werden. Somit kann man bei beiden
Kombinationstherapien laut RECIST Kriterien von einer partial response (PR) sprechen, denn es kam
in diesen Versuchen zu einer ≥ 30 %igen Abnahme des relativen Tumorvolumens [Eisenhauser et al,
2009].
Die Kombination von TRD mit üblichen Chemotherapeutika wurde bisher nur in drei Studien in vitro
analysiert. Bei Hararati et al. 2012 konnte kein synergistischer Effekt von TRD mit Tabectedin,
Mafosfamid und Doxorubicin bei der Behandlung der Fibrosarkom Zelllinie HT1080 nachgewiesen
werden [Hararati et al, 2012]. Marley et al. haben 2013 die synergistsiche Wirkung von TRD mit
Doxorubicin und Carboplatin anhand des caninen Osteosarkoms analysiert. Dabei zeigte sich ein synergistischer Effekt von TRD (20 µmol/l) mit Doxorubicin in allen analysierten Zelllinien (u.a. der
caninen Zelllinie D17 und der humanen Zelllinie SAOS-2). Bei der Kombination mit Carboplatin konnte
bei einer Kontzentration von 20 µmol/l TRD kein synergistischer Effekt ausgemacht werden. Bei einer
erhöhten Konzentration von 100 µmol/l TRD war die alleinige Behandlung so effektiv, dass die zusätzliche Behandlung mit Carboplatin keinen Effekt zeigte [Marley et al, 2013]. In der neuesten Studie
von Eschenburg et al. 2014 wurden die synergistsichen Effekte von TRD mit Vincristin sowie
Doxorubicin bei der Behandlung von Neuroblastom Zelllinien analysiert. Es konnte bei der Kombination mit Vincristin eine erhöhte Apoptoseinduktion in den Zelllinien SH-EP TET21N und SK-N-BE(2)M17 beobachtet werden. Auch bei der Kombination mit Doxorubicin konnte eine erhöhte
Apoptoseinduktion in allen analysierten Zelllinien mit Außnahme von SK-N-BE(2)-M17 gezeigt werden [Eschenbuerg et al, 2014]. Gerade die letzten beiden Studien zeigen, dass TRD die Effekte der
anerkannten Chemotherapeutika in vitro positiv unterstützen kann. In dieser Studie wurde nun erstmals die synergistische Wirkung der Substanz 2250 und TRD mit Gemcitabin bei der Behandlung des
Pankreaskarzinoms in einem präklinischen in vivo Modell nachgewiesen. Dieser Ansatz verspricht mit
der Basis der in dieser Studie erarbeiteten Daten einen positiven Verlauf. Denn unsere Ergebnisse
weisen darauf hin, dass die Substanz 2250 und TRD im Gegensatz zu Gemcitabin auch eine Wirkung
gegenüber Zellen mit Stammzellcharakteristika besitzen. Somit ist eine Kombination dieser Therapien
sehr vielversprechend. Die Ergebnisse bestätigten diese Theorie. Es konnte bei beiden Kombinationen ein partial response (PR) erreicht werden. Bei der Therapie mit TRD und Gemcitabin kam es zu
Beginn (Tag 6-10) zu einen progressive disease (PD) danach allerdings zu einer starken Resission des
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Diskussion
Tumorvolumens. In einer humanen Studie würde auf Grund des anfänglichen PD die Therapie beendet. Die Ergebnisse dieser Studie sprechen allerdings dafür, dass auch bei einem anfänglichen progressive disease ein partial response erreicht werden kann. Daher sind die RECIST Kriterien bei dieser
Anwendung möglicherweise etwas zu restriktiv. Bei der Kombination der Substanz 2250 mit
Gemcitabin war dieser das Durchgangsstadium des progressive disease nicht zu beobachten. Diese
Ergebnisse sollten in weiteren Experimenten mit anderen PDX Modellen mit einer längeren
Behandlungdauer unterstützt werden. In der hier vorliegenden Analyse wurde die Therapie nach drei
Wochen beendet, da bei den Kontrolltumoren das Endvolumen von 1000 mm³ erreicht war. Durch
die Verlängerung der Behandlungdauer kann ein weiterer Verlauf der Tumorremision unter Kombinationstherapie weiter analysiert werden. Des Weiteren sind Experimente zur Sekundärresistenz der
Kombinationstherapie mit der Substanz 2250 und TRD mit Gemcitabin sinnvoll. Gerade im Hinblick
darauf, dass die Substanzen 2250 und TRD, im Gegensatz zum Chemotherapeutikum Gemcitabin,
auch eine Wirkung gegenüber Zellen mit Stammzellcharakteritika haben könnten. Zur weiteren Analyse der Wirkung der Substanz 2250 und TRD gegenüber Zellen mit Stammzellcharakteristika sollte
eine immunhistologische Analyse der behandelten Gewebe aus dem PDX Modell mit idealerweise
mehreren Stammzellmarkern wie z.B. CD133, CD24, CD44, EpCAM, cMet oder der Side Population
durchgeführt werden.
Zusammenfassend stellt sich gerade die Kombination der Substanz 2250 und TRD mit Gemcitabin im
Hinblick auf eine onkologische klinische Relevanz als hoffnungsvoll dar. Diese Daten bilden eine solide Grundlage um erste humane Therapieversuche anschließen zu können.
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Schlussfolgerung und Ausblick
9 Schlussfolgerung und Ausblick
In dieser Arbeit wurde die Substanz 2250 erstmals im Hinblick auf ihre anti-neoplastische Wirkung
gegenüber verschiedenen Pankreaskarzinom Zelllinien in vitro und in vivo charakterisiert.
Bei der in vitro Charakterisierung der Substanz 2250 konnte gezeigt werden, dass die Substanz 2250
eine mit der Muttersubstanz TRD vergleichbare dosisabhängige zytotoxische sowie proliferationsinhibierende Wirkung aufweist. Dies konnten in unserer Arbeitsgruppe auch anhand einer weiteren
Tumorentität, dem kolorektalen Karzinom, bestätigt werden [data not shown]. Die Analyse weiterer
Tumorentitäten soll noch erfolgen. Die durchflusszytometrischen Untersuchungen ergaben in Vergleich mit der Muttersubstanz TRD einen erhöhten Anteil an nekrotischen Zellen nach der Behandlung mit 2250, welcher dosisanhängig anstieg. Eine mögliche Ursache dieser nekrotischen Zellen die
Induktion einer programmierten Nekrose (Nekroptose). Diese ist ein weiterer Weg des programmierten Zelltods und wurde schon bei der Muttersubstanz TRD nachgewiesen [39]. Somit liegt die Möglichkeit nahe, dass auch bei dem induzierten Zelltod durch die Substanz 2250 die Nekroptose eine
Rolle spielt. Um in diesem Punkt Klarheit zu erlangen sollen weiterführenden Experimente mit einem
Inhibitor der Rezeptor interagierenden Protein Kinase 1 (RIPK 1) dem Nekrostatin 1 (Nec-1) durchgeführt werden.
In den folgenden funktionellen Analysen mittels Rescue Experimenten mit NAC oder zVAD, zeigte sich
in den analysierten Pankreaskarzinom Zelllinien, dass der oxidative Stress eine wesentliche Rolle bei
dem durch die Substanz 2250 induzierten Zelltod spielt. Im Gegensatz dazu war die Induktion des
programmierten Zelltods durch die Kaspase-Kaskaden von geringerer Bedeutung bei den analysierten
Pankreaskarzinom Zelllinien. Die Beteiligung dieser zwei verschiedenen Signalwege konnte unsere
Arbeitsgruppe ebenfalls bei der Muttersubstanz TRD beobachten [Chromik et al, 2008]. Die große
Bedeutung der reaktiven Sauerstoff Spezies bei dem durch die Substanz 2250 induzierten Zelltod
wird durch die vorherigen Ergebnisse der FACS Analyse untermauert. Hier wurde eine stark erhöhte
Anzahl nekrotischer Zellen nach der Behandlung mit der Substanz nachgewiesen und oxidativer
Stress gilt als ein Auslöser der programmierten Nekrose (Nekroptose) [Zhang et al, 2014]. Dies sollte
daher wie bereits erwähnt weiter verifiziert werden. Desweiteren sollte analysiert werden in wie
weit die durch die Substanz 2250 induzierte Apoptose wirklich Kaspase unabhängig ist, dazu sollte
unter anderem die Beteiligung des Proteins AIF an induzierten Zelltod näher betrachtet werden.
Auf Grund des in der Literatur viel diskutierten hierarchischen Modells des Tumorwachstums und der
fehlenden Daten zu den in dieser Studie analysierten Argenzien, wurden die Effekte der Substanzen
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Schlussfolgerung und Ausblick
2250 und TRD auf Zellen mit stammzellähnlichem Charakter analysiert. Es konnte gezeigt werden,
dass die Substanzen 2250 und TRD im Gegensatz zum Chemotherapeutikum Gemcitabin einen antineoplastischen Effekt auf CD 133+ Zellen aufweisen. Diese Daten unterstützen die schon zuvor in der
Literatur beschriebene nicht vorhandene Wirkung des Chemotherapeutikums Gemcitabin auf die
tumorigene Tumorstammzellfraktion [Hermann et al, 2007]. Auf Grund der erarbeiteten Ergebnisse
erscheint eine Kombinationstherapie der Substanzen 2250 bzw. TRD mit dem Chemotherapeutikum
Gemcitabin im Hinblick auf das hierarchische Tumorwachstumsmodell von großem Interesse, denn
durch eine Kombination der Agenzien könnten sowohl die differenzierten Tumorzellen als auch die
Tumorstammzellen bei einer Therapie erreicht werden erreicht werden. Die Versuche dazu sollten
auch im Spheroidmodell mit mehreren Stammzellmarkern durchgeführt werden.
Nach diesen vielversprechenden in vitro Ergebnisse wurden in vivo Versuche mit den Substanzen
2250 und TRD angeschlossen. Diese erfolgten in athymischen Nacktmäusen. Zuerst wurde die metabolische Halbwertszeit der Substanz 2250 bestimmt. Die Halbwertszeit der Muttersubstanz TRD ist
mit wenigen Minuten in der Maus generell sehr kurz. Die analysierte Halbwertszeit der Substanz
2250 ist mit 13,8 h in der Nacktmaus wesentlich höher. Dies kann bei der Therapie einen Vorteil darstellen.
Bei den in vivo Experimenten mit Tumoren induziert durch etablierte Zelllinien sowie im PDX Modell
konnte eine Reduktion des Tumorwachstums in Vergleich zur Kontrolle durch die Monotherapie mit
den Substanzen 2250 und TRD erreicht werden, dennoch konnte in keinem der analysierten
Tzumormodelle nach RECIST ein Ansprechen der Tumore nachgewiesen werden. Dies ist das erste
Mal, dass die beiden Substanzen im PDX Modell analysiert wurden.
Des Weiteren wurden noch ein Vergleich der Substanzen 2250 und TRD mit dem Chemotherapeutikum Gemcitabin, sowie Kombinationsbehandlungen mit dem Chemotherapeutikum Gemcitabin und
den analysierten Argenzien durchgeführt. Dabei war bei dem Chemotherapeutikum Gemcitabin nach
einem anfänglichen Progress bis zu einem doppelten Volumen des Ausgangstumors kein weiteres
Tumorwachstum zu erkennen. Ähnliche Ergebnisse zu dem Chemotherapeutikum Gemcitabin konnten in der neueren Literatur gefunden werden [Shen et al, 2015; Qiao et al, 2015; Burkhart et al,
2014].
Von besonderer Bedeutung sind allerdings die in vivo Experimente zu den Kombinationtherapien.
Dabei konnte eine partielle Remission des Tumorvolumens um 50% innerhalb von einer Behandlungsdauer von 3 Wochen erreicht werden. Somit kann man bei beiden Kombinationstherapien laut
RECIST Kriterien von einem partial response (PR) sprechen, denn es kam zu einer ≥ 30%iger Abnahme
des relativen Tumorvolumens [Eisenhauser et al, 2009].
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Schlussfolgerung und Ausblick
Diese vielversprechenden Ergebnisse sind die Grundlage für weitere funktionelle Analysen zum
Wirkmechanismus. Wie schon erwähnt gibt es noch einige offene Fragen zur Beteiligung der
Nekroptose am induzierten Zelltod durch die Substanz 2250. Des Weiteren wäre es interessant zu
analysieren ob die Substanz 2250, analog zu ihrer Muttersubstanz TRD [O’Brien et al, 2006; Opitz et
al, 2007a; Opitz et al, 2007b, Pfirrmann et al, 1979], ebenfalls eine anti-inflammatorische Aktivität
durch die Reduktion pro-inflammatorischer Cytokine aufweist. Ebenfalls wäre die Betrachtung möglicher Sekundärresistenzen der Kombinationstherapien im in vivo PDX Modell interessant, da es bei
vielen bisher verwendeten Chemotherapeutikern zu Sekundärresistenzen kommen kann. Bei den
hier analysierten Kombinationstherapien wurde ein konventionelles Chemotherapeutikum
(Gemcitabin) mit einer neuen Substanz, welche unter anderem auch einen zytotoxischen Effekt auf
putative Tumorstammzellen aufweist, kombiniert. Dies könnte sich positiv auf ein Vermeiden von
Sekundärresistenzen auswirken.
Zusammenfassend ist diese erste Studie zur Charakterisierung der Substanz 2250 eine gute Basis um
das große anti-neoplastische Potential weiter zu analysieren. Gerade die Kombination der Substanz
2250 mit dem Chemotherapeutikum Gemcitabin stellte sich als eine vielversprechende Option in der
onkologischen klinischen Therapie des Pankreaskarzinoms heraus.
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Schlussfolgerung und Ausblick
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