Reportergen-Assays zur Untersuchung der

Application Note
Reportergen-Assays zur Untersuchung der Ligandenbindung
und Aufklärung der Signaltransduktion an Orexin-Rezeptoren
David Kosel und Lutz Weber, OntoChem GmbH, Heinrich-Damerow-Strasse 4, 06120 Halle (Saale)
ZUSAMMENFASSUNG
Orexine sind Neuropeptide, die den Schlaf-Wach-Rhythmus
regulieren. Unter Schlafstörungen leiden 20-30% der westlichen Bevölkerung. Für die Entwicklung von Medikamenten
gegen Schlafstörungen ist das Orexin-Rezeptorsystem (OxRSystem) von großer pharmakologischer Bedeutung. Die Signaltransduktion erfolgt über zwei G-Protein-gekoppelte Rezeptoren
– OxR1 und OxR2. Die beteiligten Signalwege und die Aktivität
der OxR-Liganden können mit Luciferase-basierten ReportergenAssays untersucht werden.
werden Transkriptionsfaktoren gebildet. Diese Transkriptionsfaktoren binden an die Promotorelemente in den Reporterplasmiden und induzieren die Expression der Luciferase. Die enzymatische Aktivität der Luciferase wird mit dem ONE-Glo™ Luciferase Assay System bestimmt. Um die verschiedenen Signalwege
des OxR2 zu untersuchen, verwenden wir Reporterplasmide für:
• den cAMP-Signalweg (pGL4.29, CRE-Reporter),
• den IP3/Ca2+-Signalweg (pGL4.30, NFAT-Reporter),
• den MAPK-Signalweg (pGL4.33, SRE-Reporter).
Nach Transfektion in HEK293- und CHO-Zellen werden die
gebildeten OxR2-Rezeptoren mit Orexin-A und Orexin-B stimu-
DAS OREXIN-REZEPTORSYSTEM
Im Jahr 1998 isoliert die Arbeitsgruppe um Yanagisawa
die Neuropeptide Orexin-A und Orexin-B aus Rattenhirnextrakten [1]. Diese Peptide werden hauptsächlich im Gehirn
von einem Neuronencluster im lateralen Hypothalamus produziert und binden an zwei G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, die
Orexin-Rezeptoren 1 und 2 (OxR1 und OxR2) [1]. OxR aktivieren Gq-Proteine, was zu einer Produktion von Inositoltriphosphat (IP3) führt, damit verbunden zu einer intrazellulären
Erhöhung des Ca2+-Spiegels und letztlich zu einer Stimulation des
MAPK-Signalweges [2]. Des Weiteren kann OxR2 die intrazelluläre Konzentration von cAMP durch Kopplung an Gs- und GiProteine modulieren [3].
Das OxR-System ist in vielfältige physiologische Funktionen involviert. Zusätzlich zu einer appetitanregenden Funktion [1] konnte
gezeigt werden, dass Orexine und deren Rezeptoren den SchlafWach-Rhythmus regulieren [3]. Daher sind Orexin-Rezeptoren
für die Entwicklung neuer Medikamente gegen Schlafstörungen
von hohem pharmakologischen Interesse. Über eine sensitive und
vielseitige Methode wie den Reportergen-Assay lassen sich sowohl
die Signalwege der Orexin-Rezeptoren untersuchen als auch die
Bindung und Aktivität der OxR-Liganden.
AKTIVIERUNG DER OxR2-SIGNALWEGE
Um die Signaltransduktion des OxR2 zu untersuchen, nutzen
wir ein Reportergen-System von Promega. In einem zellbasierten
Assay werden das Rezeptorplasmid und ein pGL4-Reporterplasmid, das ein induzierbares Luciferase-Gen beinhaltet, in
tierische Zellen co-transfiziert. Nach Bindung des Liganden an den
Rezeptor wird dieser aktiviert. Durch Signalprozesse in der Zelle
Kontaktadresse: [email protected]
Abbildung 1: Dosis-Wirkungskurven für eine Rezeptoraktivierung
des OxR2 nach Stimulation mit Orexin-A und Orexin-B für (A) den
cAMP (CRE)- und MAPK (SRE)-Weg in HEK293-Zellen, und (B) den
IP3/Ca2+ (NFAT)-Weg in CHO-Zellen.
Reportergen-Assays zur Untersuchung der Ligandenbindung und Signaltransduktion an Orexin-Rezeptoren
liert und Dosis-Wirkungskurven mithilfe der Luciferase-Aktivität
aufgezeichnet (Abb. 1A und B). Als charakteristische Kenngröße
für solche Dosis-Wirkungsbeziehungen dient der sogenannte
EC50-Wert. Dieser gibt die Konzentration des Liganden an, bei
dem 50% der maximal möglichen Rezeptoraktivierung erreicht
sind. Der EC50-Wert wird aus den Dosis-Wirkungskurven mittels
der Software GraphPad Prism 5.03 berechnet.
Zur Stimulation des cAMP-Signalwegs müssen deutlich höhere
Konzentrationen an Orexin-Peptiden eingesetzt werden als
zur Stimulation der IP3/Ca2+- und MAPK-Signalwege (EC50Werte cAMP: 110–255 nM; EC50-Werte IP3/Ca2+- und MAPK:
0,2–6,3 nM). Dies zeigt, dass die verschiedenen G-Proteine einer
Zelle mit unterschiedlicher Effizienz an die aktive Konformation
des OxR2 binden. Der Reportergen-Assay ist dabei so sensitiv,
dass sich auch schwächere Signalwege, wie der cAMP-Weg am
OxR2, gut detektieren lassen.
IDENTIFIZIERUNG VON REZEPTOR-LIGANDBINDEPOSITIONEN IM OxR2
Für die Wirkstoffentwicklung ist die Kenntnis der an der Ligandenbindung beteiligten Aminosäuren im Orexin-Rezeptor von
entscheidender Bedeutung. Die Identifizierung der Aminosäuren
erfolgt experimentell, indem einzelne Aminosäuren im OrexinRezeptor
molekularbiologisch
durch
die
„neutrale“
Aminosäure Alanin ausgetauscht werden. Der Effekt der
ausgetauschten Aminosäure auf die Rezeptor-LigandenBindung kann vergleichend zum Wildtyp-Rezeptor untersucht werden. Um zu zeigen, dass Orexin-Rezeptormutanten auch mit dem Reportergen-Assay charakterisiert werden
können, werden im OxR2 die Aminosäuren Isoleucin320
(I320) und Asparagin324 (N324) gegen Alanin ausgetauscht.
Diese beiden Aminosäuren sind in den für die Rezeptoraktivierung wichtigen Proteinbereichen im OxR2 lokalisiert. Die
mutierten Rezeptoren werden in CHO-Zellen transfiziert
und mittels Reportergen-Assay auf ihre Aktivierbarkeit mit
Orexin-B untersucht (Abb. 2). Der Austausch von I320A zeigt
kaum Einfluss auf die Signaltransduktion des OxR2. Die aus
Dosis-Wirkungskurven ermittelten EC50-Werte von Wildtyp-
2
OxR2 und OxR2-I320A sind gleich (1,2 nM für wt-OxR2 und
1,9 nM für OxR2-I320A). I320 scheint keine Wechselwirkung
mit Orexin-B einzugehen und keinen Einfluss auf die
Aktivierung des Rezeptors zu haben. Ein ganz anderes
Bild zeigt die Mutation N324A. Hier verschlechtert sich der
EC50-Wert von wt-OxR2 zu OxR2-N324A um das 40-fache
(1,2 nM für wt-OxR2; 40,9 nM für OxR2-N324A). Eine solche
Verschiebung des EC50-Wertes deutet auf eine Beteiligung der
Aminosäure N324 an der Bindung des Liganden Orexin-B im
OxR2 hin. Diese Daten stimmen mit Resultaten aus einer Studie
überein, bei der ein Ca2+/FLIPR-Assay zur Untersuchung dieser
OxR2-Mutanten genutzt wurde [4].
SCHLUSSFOLGERUNG
Für die Untersuchung und Charakterisierung der Signaltransduktion von Orexin-Rezeptoren kann der sensitive ReportergenAssay vielseitig eingesetzt werden: Die verschiedenen Signalwege
der Orexin-Rezeptoren können mit dem Reportergen-Assay in
einem einzigen Testsystem erfasst werden. Zudem lässt sich
mit dem Reportergen-Assay der Einfluss unterschiedlicher
Aminosäuren auf der Aktivierung der Orexin-Rezeptoren studieren. Die Kenntnis der für die Liganden-Rezeptor-Interaktion wichtigen Aminosäuren ist eine grundlegende Voraussetzung für die Entwicklung niedermolekularer Wirkstoffe an
Orexin-Rezeptoren.
LITERATUR
[1] Sakurai, T, Amemiya, A, Ishii, M et al. (1998) Orexins and
orexin receptors: a family of hypothalamic neuropeptides and G
protein-coupled receptors that regulate feeding behavior. Cell
92: 573-585
[2] Ramanjaneya, M, Conner, AC, Chen JC et al. (2009) Orexin-stimulated MAP kinase cascades are activated through multiple G-protein signalling pathways in human H295R adrenocortical cells: divers roles for orexins A and B. J. Endocrinol. 202:
249-261
[3] Scammell, TE, Winrow, CJ (2011) Orexin receptors: pharmacology and therapeutic opportunities. Annu. Rev. Pharmacol.
Toxicol. 51: 243-266
[4] Tran, DT, Bonaventure, P, Hack, M et al. (2011) Chimeric, mutant orexin receptors show key interactions between
orexin receptors, peptides and antagonists. Eur. J. Pharmacol.
667: 120-128
Abbildung 2: Dosis-Wirkungskurven für Orexin-Rezeptormutanten
nach Stimulation mit Orexin-B in CHO-Zellen.
Kontaktadresse: [email protected]