Kohlen- und Stickstoffmetabolismus Ustilago maydis

Kohlen- und Stickstoffmetabolismus Ustilago maydisinfizierter Maispflanzen
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Robin Horst
aus Nürtingen
Als Dissertation genehmigt von der
Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
03. März 2010
Vorsitzender der Promotionskommission:
Prof. Dr. Eberhard Bänsch
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Uwe Sonnewald
Zweitberichterstatter:
Prof. Dr. Andreas Burkovski
That’s why it’s called research, not search:
You do the experiment over and over again...
- Walter Horst
Teile dieser Arbeit sind in folgenden Publikationen zu finden:
Horst RJ, Doehlemann G, Wahl R, Hofmann J, Schmiedl A, Kahmann R, Kämper J,
Sonnewald U, Voll LM (November 18, 2009). Ustilago maydis infection strongly
alters organic nitrogen allocation in maize and stimulates productivity of systemic
source leaves. Plant Physiology. 10.1104/pp.109.147702
Doehlemann G, Wahl R, Horst RJ, Voll LM, Usadel B, Poree F, Stitt M, PonsKuehnemann J, Sonnewald U, Kahmann R, Kaemper J (2008)
Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by
the fungal biotroph Ustilago maydis. The Plant Journal 56: 181-195
Horst RJ, Engelsdorf T, Sonnewald U, Voll LM (2008) Infection of maize leaves with
Ustilago maydis prevents establishment of C-4 photosynthesis. Journal of Plant
Physiology 165: 19-28
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
Abkürzungsverzeichnis
AS
Aminosäure(n)
bp
Basenpaare
BSA
Rinderserumalbumin
ddH2O
doppelt destilliertes Wasser
dpi
Tage nach Infektion (days post infection)
DW
Trockengewicht (dry weight)
ETI
effector triggered immunity
Frc
Fructose
FW
Frischgewicht
gew%
% Gewicht pro Volumen
Glc
Glucose
hpi
Stunden nach Infektion (hours post infection)
HPLC
Hochleistungsflüssigchromatographie
kb
Kilobasen(-paare)
LB
5’-flankierende Sequenz (left border)
lN2
flüssiger Stickstoff
MAPK
mitogen activated protein kinase
MS
Massenspektrometrie
NCR
Stickstoffkatabolitrepression (nitrogen catabolite repression)
PAGE
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PAMP
pathogen associated molecular pattern
PCA
Hauptkomponentenanalyse (principle component analysis)
PEP
Phosphoenolpyruvat
PR
pathogenesis related
PTI
PAMP-triggered immunity
qRT-PCR
quantitative reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion
RACE
rapid amplification of cDNA ends
RB
3’-flankierende Sequenz (right border)
RT
Raumtemperatur
RubisCO
Ribulose-1,5-bisphosphat Carboxylase / Oxygenase
SDS
Natrium-Dodecylsulfat
UTR
untranslatierte Region von mRNA
vol%
% Volumen pro Volumen
Dreibuchstabenkode für Aminosäuren: Alanin (Ala), Asparagin (Asn), Aspartat (Asp), Arginin
(Arg), Cystein (Cys), Glycin (Gly), Histidin (His), Glutaminsäure (Glu), Glutamin (Gln), Isoleucin
(Ile), Leucin (Leu), Lysin (Lys), Methionin (Met), Phenylalanin (Phe), Prolin (Pro), Serin (Ser),
Threonin (Thr), Tyrosin (Tyr), Tryptophan (Trp), Valin (Val).
INHALTSVERZEICHNIS
Inhaltsverzeichnis
1
ZUSAMMENFASSUNG.........................................................................................................................1
2
EINLEITUNG .........................................................................................................................................3
2.1
INFEKTIONSSTRATEGIEN BIOTROPHER PHYTOPATHOGENER PILZE ........................................................3
2.1.1
Unterdrückung der Wirtsabwehr durch biotrophe Mikroorganismen .......................................3
2.1.2
Source-sink Verhältnisse und Umprogrammierung des Wirtsmetabolismus durch
Phytopathogene...................................................................................................................................4
2.2
Die Rolle von Kohlenhydraten in Pflanzen-Pathogen Interaktionen................................................. 5
2.1.2.2
Stickstoff-Stoffwechsel in Pflanzen-Pathogen Interaktionen ............................................................ 6
DIE KULTURPFLANZE MAIS (ZEA MAYS) ..............................................................................................7
2.2.1
Mais ist eine C4-Pflanze ..........................................................................................................8
2.2.2
Stickstoff-Stoffwechsel von Maispflanzen .............................................................................10
2.3
DER MODELLORGANISMUS USTILAGO MAYDIS...................................................................................10
2.3.1
Lebenszyklus von U. maydis .................................................................................................11
2.3.2
Ustilago maydis als Modellorganismus .................................................................................14
2.4
STICKSTOFF-STOFFWECHSEL IN PHYTOPATHOGENEN UND FILAMENTÖSEN PILZEN ..............................15
2.4.1
Regulation des Stickstoff-Stoffwechsels in filamentösen Pilzen ...........................................15
2.4.2
Die Rolle des Stickstoff-Stoffwechsels für die Virulenz phytopathogener Pilze ....................16
2.4.3
Stickstoff-Stoffwechsel in U. maydis .....................................................................................17
2.5
3
2.1.2.1
ZIELSETZUNGEN DIESER ARBEIT ......................................................................................................18
MATERIAL UND METHODEN ............................................................................................................19
3.1
MATERIAL .......................................................................................................................................19
3.1.1
Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien................................................................19
3.1.1.1
Herkömmliche Chemikalien und Verbrauchsmaterialien................................................................ 19
3.1.1.2
Spezielle Chemikalien und Kits ...................................................................................................... 19
3.1.2
Oligonukleotide und Sequenzierungen .................................................................................19
3.1.3
Bakterien- und Ustilago maydis Stämme ..............................................................................20
3.1.4
Vektoren ................................................................................................................................20
3.1.5
Pflanzenmaterial....................................................................................................................20
3.2
METHODEN .....................................................................................................................................21
3.2.1
Pflanzenanzucht ....................................................................................................................21
3.2.1.1
Oberflächensterilisation und Aussaat von Mais-Saatgut................................................................ 21
3.2.1.2
Wachstumsbedingungen in der Phytokammer............................................................................... 21
3.2.1.3
Wachstumsbedingungen in der Hochlicht-Phytokammer............................................................... 21
3.2.2
Mikrobiologische Methoden...................................................................................................21
3.2.2.1
Medien, Puffer und Lösungen für die Mikrobiologie ....................................................................... 21
3.2.2.2
Anzucht von U. maydis................................................................................................................... 23
3.2.2.3
Präparation von U. maydis Spheroblasten..................................................................................... 24
3.2.2.4
Transformation von U. maydis ....................................................................................................... 24
3.2.2.5
Infektion von Maispflanzen mit U. maydis ...................................................................................... 24
3.2.2.6
Induktion von filamentösem Wachstum auf artifiziellen Oberflächen ............................................. 25
3.2.2.7
Anzucht und Transformation von Escherichia coli ......................................................................... 25
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.3
Mikroskopische Untersuchungen ..........................................................................................25
3.2.3.1
Färbemethoden ..............................................................................................................................25
3.2.3.2
Konfokale Mikroskopie....................................................................................................................25
3.2.3.3
Klassische Fluoreszenz- und Durchlichtmikroskopie......................................................................26
3.2.4
Molekularbiologische Methoden............................................................................................26
3.2.4.1
Molekularbiologische Standardmethoden.......................................................................................26
3.2.4.2
Schnellpräparation von DNA aus Pflanzengewebe und Pilzzellen.................................................26
3.2.4.3
Isolation von DNA aus Pflanzengewebe und Pilzzellen .................................................................26
3.2.4.4
Southernblot ...................................................................................................................................27
3.2.4.5
Isolation von Gesamt-RNA aus Pflanzengewebe und Pilzzellen....................................................27
3.2.4.6
Denaturierende Gelelektrophorese von RNA .................................................................................28
3.2.4.7
Northernblot-Analyse ......................................................................................................................28
3.2.4.8
Sondenherstellung für Northern- und Southernblot-Analysen ........................................................28
3.2.4.9
Herstellung und Hybridisierung von radioaktiv markierten DNA-Sonden .......................................29
3.2.4.10
cDNA Synthese ............................................................................................................................29
3.2.4.11
Semiquantitative RT-PCR.............................................................................................................29
3.2.4.12
Quantitative RT-PCR (qRT-PCR) .................................................................................................29
3.2.4.13
Generierung von U. maydis Transformationskonstrukten ............................................................30
3.2.4.14
Genetische Analyse von U. maydis Transformanden...................................................................32
3.2.4.15
Bestimmung des 5’-Endes der UmNiT2 mRNA über 5’-RACE.....................................................33
3.2.5
Mikroarray Analysen..............................................................................................................33
3.2.5.1
Transkriptomanalyse von Tumoren, jungen systemischen Blättern und symptomfreien Bereichen
infizierter Blätter..............................................................................................................................................33
3.2.5.2
3.2.6
Transkriptomanalyse von angereicherten Leitbündeln systemischer source Blätter......................34
Biochemische und physiologische Methoden .......................................................................34
3.2.6.1
Bestimmung von Proteinkonzentrationen .......................................................................................34
3.2.6.2
Auftrennung von Proteinen über SDS-PAGE .................................................................................35
3.2.6.3
Chlorophyllgehalt ............................................................................................................................35
3.2.6.4
Bestimmung der Gehalte löslicher Zucker und Stärke ...................................................................35
3.2.6.5
Bestimmung von Aminosäuregehalten über reversed phase HPLC und Fluoreszenzdetektion ....35
3.2.6.6
Callose-Bestimmung.......................................................................................................................35
3.2.6.7
Quantifizierung von thiolhaltigen Molekülen und Antioxidantien.....................................................36
3.2.6.8
Bestimmung von Gehalten an aromatischen Sekundärmetaboliten...............................................36
3.2.6.9
Quantifizierung von phosphorylierten Intermediaten und organischen Säuren ..............................36
3.2.6.10
Elementaranalyse .........................................................................................................................37
3.2.6.11
Mineralstoffanalyse.......................................................................................................................37
3.2.6.12
Bestimmung von Enzymaktivitäten...............................................................................................37
3.2.6.13
Analyse der Inkorporation von
3.2.6.14
Umverteilung von reduziertem Stickstoff aus systemischen Blättern ...........................................38
3.2.6.15
Berechnung der Stickstoffaufnahme durch
15
15
N-Nitrat ......................................................................................37
15
N-Markierungen .....................................................38
3.2.6.16
Bestimmung der
3.2.6.17
14
3.2.6.18
Fütterungsexperimente mit H-Asn und H-Gln ............................................................................40
3.2.6.19
Inkorporation von
3.2.6.20
Analyse von Phloemexudaten ......................................................................................................41
3.2.6.21
Photosynthesemessungen ...........................................................................................................41
3.2.7
N-Anreicherung in freien und proteingebundenen Aminosäuren....................38
CO2 Pulsverfolgungsexperimente ..............................................................................................39
3
35
3
S-Methionin in Proteine .................................................................................40
Statistische Analysen ............................................................................................................42
3.2.7.1
Hypothesentest zur statistischen Analyse von physiologischen Parametern .................................42
INHALTSVERZEICHNIS
4
3.2.7.2
Hierarchische Clusteranalyse von Metabolitdaten ......................................................................... 42
3.2.7.3
Hauptkomponenten Analyse (principle component analysis) von Metabolitdaten ......................... 42
ERGEBNISSE......................................................................................................................................43
4.1
GLOBALE ANALYSE DES TRANSKRIPTOMS UND DER METABOLITE U. MAYDIS-INFIZIERTER PFLANZEN ...43
4.1.1
4.1.1.1
Übersicht von Veränderungen im Transkriptom von Tumoren....................................................... 43
4.1.1.2
Clusteranalyse der Metabolitgehalte von Tumoren........................................................................ 47
4.1.1.3
Hauptkomponentenanalyse (PCA) der Metabolitdaten .................................................................. 49
4.1.1.4
Metabolitgehalte in infizierten und in Kontroll-behandelten Blättern .............................................. 51
4.1.2
Transkriptom- und Metabolitanalyse von symptomfreien Bereichen infizierter Blätter..........53
4.1.2.1
Transkriptionelle Veränderungen in symptomfreien Bereichen infizierter Blätter........................... 53
4.1.2.2
Veränderungen in Metabolitgehalten symptomfreier Bereiche infizierter Blätter ........................... 53
4.1.3
4.2
Transkriptom- und Metabolitanalyse von Tumoren ...............................................................43
Analyse oberer systemischer sink-Blätter .............................................................................54
4.1.3.1
Transkriptionelle Veränderungen in oberen systemischen Blättern infizierter Pflanzen ................ 55
4.1.3.2
Veränderungen in den Metabolitgehalten oberer systemischer Blätter infizierter Pflanzen ........... 55
PHOTOSYNTHESE UND KOHLENSTOFFMETABOLISMUS U. MAYDIS-INFIZIERTER PFLANZEN....................56
4.2.1
Die (C4-)Photosynthese wird durch U. maydis stark beeinträchtigt.......................................56
4.2.1.1
Gaswechselparameter von infizierten Blättern ............................................................................... 56
4.2.1.2
Chlorophyllfluoreszenz-Parameter infizierter Blätter ...................................................................... 59
4.2.2
Lösliche Kohlenhydrate akkumulieren in Tumoren ...............................................................61
4.2.3
Invertaseaktivität ist in Tumoren stark induziert ....................................................................63
4.2.4
Untersuchung des Stärke- und Saccharosemetabolismus in Tumoren ................................64
4.2.5
Glyoxylatzyklus und Gluconeogenese in symptomfreien Bereichen infizierter Blätter und in
Tumoren ............................................................................................................................................66
4.2.6
4.3
Kohlenstoff-Flüsse in U. maydis induzierten Tumoren ..........................................................69
STICKSTOFFMETABOLISMUS U. MAYDIS-INFIZIERTER PFLANZEN .........................................................70
4.3.1
Die primäre Stickstoffassimilation ist in Tumoren herunterreguliert ......................................70
4.3.2
Aufnahme von Nitrat aus der Erde und Allokation im Spross ...............................................73
4.3.3
Der Import von organischem Stickstoff aus systemischen source-Blättern ist in Tumoren
erhöht ...............................................................................................................................................76
4.3.4
Export von Assimilaten systemischer source-Blätter nach U. maydis Infektion ....................78
4.3.5
Phloem-mobile Mineralien akkumulieren in Tumoren ...........................................................79
4.4
PHOTOSYNTHETISCHE AKTIVITÄT SYSTEMISCHER SOURCE-BLÄTTER INFIZIERTER PFLANZEN ...............80
4.4.1
4.5
Transkriptomanalyse von unteren systemischen Blättern .....................................................83
VERWERTUNG DER IN DEN TUMOR IMPORTIERTEN ASSIMILATE ..........................................................86
3
3
4.5.1
Fütterungsexperimente mit H-Asn und H-Gln.....................................................................86
4.5.2
Proteinbiosynthese in Tumoren.............................................................................................87
4.5.3
Biosynthese aromatischer Sekundärmetabolite in Tumoren .................................................89
4.6
CHARAKTERISIERUNG EINER U. MAYDIS NCR-MUTANTE ...................................................................92
4.6.1
Charakterisierung eines U. maydis NiT2 / AreA Homologs...................................................92
4.6.2
Generierung von U. maydis NiT2 knock-out Mutanten .........................................................93
4.6.3
Charakterisierung der Stickstoffverwertung von !nit2-Mutanten ..........................................94
4.6.4
Regulation der Nitratverwertung in !nit2 ...............................................................................96
4.6.5
Phänotyp von !nit2 in planta .................................................................................................97
INHALTSVERZEICHNIS
4.6.6
5
Untersuchung des filamentösen Wachstums von !nit2 Sporidien ........................................99
DISKUSSION.....................................................................................................................................102
5.1
GLOBALE TRANSKRIPTOM- UND METABOLITANALYSE VON TUMOREN ...............................................102
5.2
SINK-METABOLISMUS U. MAYDIS-INDUZIERTER TUMOREN ................................................................104
5.2.1
Tumore führen aberrante Photosynthese aus ..............................................................................104
5.2.1.2
Tumore stellen ein sink für Kohlenhydrate dar .............................................................................105
5.2.1.3
Die Zellwandbiosynthese und der Phenylpropanstoffwechsel sind in Tumoren induziert ............107
5.2.1.4
Der Kohlenstoff-Fluss durch Stoffwechselintermediate ist in Tumoren erhöht .............................109
5.2.2
5.3
Zentraler Kohlen- und Energiestoffwechsel ........................................................................104
5.2.1.1
Stickstoff-Metabolismus U. maydis-induzierter Tumore ......................................................111
5.2.2.1
Tumore stellen ein sink für Stickstoff dar......................................................................................111
5.2.2.2
Organischer Stickstoff wird aus systemischen source-Blättern in Tumore geleitet ......................112
5.2.2.3
Verwertung von Stickstoff im Tumor.............................................................................................113
5.2.2.4
Modell der Assimilatverwertung in Tumoren.................................................................................114
DIE AUSBILDUNG VON TUMOREN BEEINFLUSST DEN METABOLISMUS DER GANZEN PFLANZE ..............116
5.3.1
U. maydis-Infektion induziert Abwehr-assoziierte Genexpression in systemischen source-
Blättern ............................................................................................................................................116
5.3.2
Symptomfreie Bereiche infizierter Blätter betreiben Photosynthese und weisen erhöhte
Glyoxylatzyklus-Aktivität auf ............................................................................................................118
5.3.3
5.4
Die Produktivität systemischer source-Blätter wird durch U. maydis-Infektion erhöht ........119
5.3.3.1
Der Assimilat-Export systemischer source-Blätter ist durch U. maydis-Infektion erhöht ..............119
5.3.3.2
Systemische Blätter betreiben nach U. maydis-Infektion erhöhte Photosynthese .......................120
STICKSTOFFVERWERTUNG IN U. MAYDIS UNTERLIEGT DER KONTROLLE VON NIT2 ............................122
5.4.1
um10417 kodiert für ein NiT2-Homolog ..............................................................................122
5.4.2
UmNiT2 ist ein zentraler Regulator der NCR in U. maydis .................................................123
5.4.3
Die Stickstoffmangel-Antwort ist in !nit2-Mutanten attenuiert.............................................125
5.4.4
UmNiT2 wird für die volle Pathogenität benötigt .................................................................126
6
LITERATURVERZEICHNIS ..............................................................................................................128
7
ANHANG ................................................................................................................................................I
8
7.1
NUMMERIERUNG VON MAISBLÄTTERN .................................................................................................I
7.2
OLIGONUKLEOTIDE ............................................................................................................................II
7.3
IONENÜBERGÄNGE DER MS/MS-DETEKTION .....................................................................................III
7.4
VEKTORKARTEN ............................................................................................................................... V
7.5
DEREGULIERTE GENE IN SYMPTOMFREIEN BEREICHEN INFIZIERTER BLÄTTER ..................................... VI
7.6
METABOLITANALYSE OBERER SYSTEMISCHER SINK-BLÄTTER ............................................................ VII
7.7
AMINOSÄUREZUSAMMENSETZUNG IM PHLOEM SYSTEMISCHER SOURCE-BLÄTTER ............................. VIII
7.8
WACHSTUM VON !NIT2 AUF VERSCHIEDENEN N-QUELLEN ................................................................. IX
7.9
PROTEIN-ALIGNMENT VON UMNIT2 MIT ANDEREN NIT2-HOMOLOGEN ................................................. X
7.10
ANNOTATIONEN VON GENEN DES SHIKIMATWEGS UND DES SEKUNDÄREN METABOLISMUS ............... XII
7.11
ANNOTATIONEN DER IN TUMOREN DEREGULIERTEN GENEN DER PROTEINBIOSYNTHESE .................. XIII
DANKSAGUNG .................................................................................................................................. XX
ZUSAMMENFASSUNG
1 Zusammenfassung
Pflanzenpathogene verursachen jährlich trotz intensiver Schutzmaßnahmen Ertragsverluste von
bis zu 32%. Biotrophe Blattpathogene, die ihren Wirt generell nicht töten, verursachen dennoch
Ertragseinbußen, indem sie Kohlenstoff- und Stickstoffassimilate vom Wirt aufnehmen und
diese somit nicht mehr für das Wachstum der Wirtspflanze zur Verfügung stehen. Diese
Pathogene programmieren zu diesem Zweck den Wirtsmetabolismus um und induzieren die
Bildung eines lokalen sinks an der Infektionsstelle, welches mit Assimilaten aus nicht-infizierten
Pflanzenteilen versorgt wird. Der Maisbeulenbrand-Erreger Ustilago maydis verursacht
tumorartiges Wachstum an den infizierten Pflanzenorganen, weshalb hypothetisiert wurde, dass
die Tumorinduktion ein probates Mittel zur Erzeugung eines starken sinks darstellt.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Kolonisierung von Maisblättern nach
Blattmeristeminfektion durch U. maydis die Entwicklung des C4-Syndroms verhinderte und die
maximale Photosynthesekapazität in Tumoren verringert war. Dabei wurde durch die Infektion
der sink-Status des Blattmeristems beibehalten und die Entwicklung zum source-Blatt
verhindert, was sich durch erhöhte Invertaseaktivität und erhöhten Gehalten an löslichen
Kohlenhydraten nach der Infektion zeigte.
Der Fluss von Kohlenstoff durch den Citratzyklus, sowie der Aminosäureumbau waren in
Tumoren erhöht und spiegelten die hohe metabolische Aktivität der Tumorzellen wider. Dadurch
akkumlierten stickstoffreiche Aminosäuren, was ein Indiz für die hohe Stickstoffverfügbarkeit im
infizierten Gewebe ist. Stickstoff wurde vermehrt in organischer Form aus systemischen sourceBlättern importiert, während die primäre Stickstoffassimilation selbst in Tumoren reduziert war.
Der Tumor stellt somit auch ein Stickstoff-sink dar.
Systemische source-Blätter U. maydis-infizierter Pflanzen scheinen ein Signal zu erhalten,
welches die Expression Abwehr-assoziierter Gene induziert. Trotz dieser Abwehrreaktion
erhöhte die Etablierung des Tumors als starkes metabolisches sink für Kohlen- und
Stickstoffassimilate die Produktivität systemischer source-Blätter, indem die Verzögerung der
Blattseneszenz, im Vergleich zu den korrespondierenden Blättern nicht-infizierter Pflanzen, zu
erhöhten Photosyntheseraten und vermehrtem Export an Kohlenstoff- und Stickstoffassimilaten
führte. Die erhöhte Produktivität war dabei abhängig von der Tumorbildung, da U. maydisMutanten, die zwar Mais kolonisieren aber keine Tumore induzieren, die Seneszenz
systemischer Blätter nicht verzögerten. Parallel dazu waren in den Leitbündeln systemischer
source-Blätter infizierter Pflanzen Aminosäure- und Nitrattransporter stärker exprimiert, was die
erhöhte Beladung des Phloems mit Assimilaten erklären kann.
Die Analyse einer U. maydis Stickstoffkatabolitrepressions-Mutante zeigte, dass ein zu
Neurospora crassa NiT2 und Aspergillus nidulans AreA homologes Protein in U. maydis eine
ähnlich zentrale Rolle in der Regulation der Stickstoffverwertung übernimmt, dass jedoch ein
zweiter, bisher unbekannter Regulator der Stickstoffkatabolit-Derepression vorhanden sein
muss.
UmNiT2
bewirkt
die
Derepression
Stickstoff-metabolisierender
Gene
unter
1
ZUSAMMENFASSUNG
unfavorisierten Stickstoffbedingungen und reguliert damit die Verwertung der meisten
Stickstoffquellen. Darüber hinaus scheint UmNiT2 eine Rolle in der Initiierung des filamentösen
Wachstums von Sporidien und für die volle Virulenz auf Maisblättern zu spielen.
Phytopathogens cause yield losses of up to 32% per year, despite intensive crop protection.
Biotrophic leaf pathogens usually don’t kill their host, but cause yield losses by competing with
the host tissue for carbon and nitrogen assimilates. To this end, biotrophic pathogens
reprogramm the host’s metabolism and induce a local sink at the site of infection, which needs
to be supplied with assimilates from uninfected, systemic parts of the host plant. The causal
agent of corn smut disease, Ustilago maydis, induces tumors on infected plant organs. It is
hypothesized that these tumors constitute a ways of generating a strong sink organ.
In the framework of this study it was shown that the development of C4 photosynthesis is
hampered upon leaf-meristem infection by U. maydis and that the overall photosynthetic rate is
reduced in tumors. Infected leaves displayed constantly high contents of hexoses and high
invertase activity, which suggests that infection by U. maydis caused retention of the sink status
of the leaf and prevented a progression to a fully developed source organ.
The carbon flow through the tricarboxylic-acid cycle and the interconversion of amino acids was
increased in tumors, which reflects the high metabolic activity of tumor cells. Nitrogen-rich
amino acids accumulated in tumors, which indicates high nitrogen availablility, although the
primary nitrogen assimilation was reduced in infected leaves. Instead, nitrogen was imported
into tumors in organic form from systemic plant organs, which reflects the nitrogen-sink status of
the tumor.
After U. maydis infection, systemic source leaves seem to obtain a signal that induces the
expression of defense-associated genes. Nevertheless, the establishment of the tumor as a
strong metabolic sink for carbon and nitrogen increases the productivity of systemic source
leaves, which show increased photosynthesis and an increased export of assimilates, if
compared to the same leaves of non-infected plants. This higher productivity correlates with a
delay in the senescence program, which is most likely achieved by the tumor induction, since
infection by U. maydis mutants that colonize maize but do not induce tumors, did not delay
senescence in systemic source leaves. The increased export rates of systemic leaves were
paralleled by increased expression of amino acid and nitrate transporters in the vascular
bundles which may mediate the enhanced loading of the phloem with assimilates.
Analysis of a U. maydis nitrogen catabolite repression mutant showed that a GATA-transcription
factor with homology to Neurospora crassa NiT2 and Aspergillus nidulans AreA has a similar
central role in the regulation of nitrogen utilization, and that U. maydis possesses a second, so
far unknown regulator of nitrogen catabolite derepression. UmNiT2 causes the derepression of
nitrogen-metabolizing genes under unfavorable nitrogen conditions and regulates the utilization
of most nitrogen sources. UmNiT2 also appears to plays a role in filamentous growth of sporidia
and is necessary for full virulence on maize leaves.
2
EINLEITUNG
2 Einleitung
Pflanzen können von verschiedenen Krankheiten befallen werden, wobei die Erreger Pilze,
Bakterien, Viren, Oomyceten, Nematoden oder andere, parasitäre Pflanzen sein können
(Agrios, 2005). Der Pathogenbefall von Kulturpflanzen, die durch Monokultivierung und
intensive Düngung besonders gefährdet sind (Oerke und Dehne, 2004, Agrios, 2005), führt
dabei zu erheblichen Ertragseinbußen. In einer globalen Studie wurde berechnet, dass sich die
Ertragsverluste von Kulturpflanzen durch Pathogenbefall trotz intensiver Schutzmaßnahmen auf
32% belaufen, von denen 9,9% auf pilzliche und bakterielle Erreger zurückzuführen sind (Oerke
und Dehne, 2004).
Phytopathogene Mikroorganismen haben dabei verschiedene Strategien entwickelt, um ihre
pflanzlichen Wirte zu kolonisieren. Während nekrotrophe Pathogene, wie zum Beispiel die Pilze
Botrytis cinerea (Erreger der Grauschimmelfäule) oder Cochliobolus carbonum ihren Wirt
schnell töten (meistens durch die Ausscheidung von Toxinen und zellwandabbauenden
Enzymen (van Kan, 2006)) und auf totem Pflanzenmaterial proliferieren, sind biotrophe
Pathogene (z.B. die Mehltau-Erreger Blumeria sp., Rostpilze (z.B. Uromyces fabae) oder die
Brandpilze (Ustilaginomycotina)) zwingend auf lebendes Pflanzengewebe angewiesen, um
ihren Lebenszyklus abzuschließen (Divon und Fluhr, 2007). Manche Mikroorganismen haben
beide Infektionsstrategien vereinigt und weisen zunächst eine biotrophe Phase auf, welche
durch bisher unidentifizierte Signale in eine nekrotrophe Phase übergeht (Perfect und Green,
2001, Münch et al., 2008). Diese Pathogene, zu denen unter Anderem die Pilze der Gattungen
Colletotrichum oder Magnaporthe, sowie viele Bakterien, wie beispielsweise Pseudomonas
syringae gehören, nennt man daher hemibiotrophe Pathogene.
2.1 Infektionsstrategien biotropher phytopathogener Pilze
Biotrophe Pathogene begegnen bei der Infektion zwei Hauptproblemen: Einerseits müssen sie
in der Lage sein, eine effektive Abwehrantwort der lebenden Wirtszellen dauerhaft zu
unterdrücken oder zu umgehen, und andererseits stehen sie in ständiger Konkurrenz mit den
Pflanzenzellen um benötigte Nährstoffe.
2.1.1 Unterdrückung der Wirtsabwehr durch biotrophe Mikroorganismen
Jeder Mikroorganismus, der Pflanzen befällt, überwindet zunächst präformierte Barrieren wie
die pflanzliche Zellwand, und unterdrückt oder umgeht die basale Wirtsabwehr, um eine
kompatible Interaktion aufzubauen (Hückelhoven, 2005). Pflanzen erkennen über Rezeptoren
mikrobielle Signalmoleküle wie Flagellin oder Chitin, sogenannte PAMPs (pathogen associated
molecular patterns), was eine PAMP-ausgelöste Abwehrantwort (PTI, PAMP-triggered
immunity) induziert. Pathogene haben für die Unterdrückung der PTI Effektorproteine (oder
Effektoren) entwickelt, welche sekretiert werden und entweder im Apoplasten oder in der
Wirtszelle wirken und die basale Abwehr unterdrücken (Jones und Dangl, 2006). Im Zuge von
3
EINLEITUNG
Co-Evolution zwischen Wirt und Pathogen können manche Wirtsarten diese Effektoren
erkennen und eine stärkere Abwehrantwort induzieren (ETI, effector triggered immunity, Genfür-Gen Resistenz), welche zur Pathogenabwehr führt, solange das Pathogen nicht weitere
Effektoren besitzt, welche diese neue Antwort unterbinden. Dieses sogenannte „Zigzag-Modell“
wurde im Jahr 2006 von Jones und Dangl entwickelt (Jones und Dangl, 2006).
Viele bakterielle Effektoren, insbesondere von Pseudomonas syringae und Xanthomonas
campestris, sind bekannt, und von einer wachsenden Anzahl konnte auch die Funktion in der
Unterdrückung der Wirtsabwehr beschrieben werden (zusammengefasst in Block et al., 2008,
Cui et al., 2009, Cunnac et al., 2009, Kay und Bonas, 2009). Die meisten bekannten pilzlichen
Effektoren wurden aus Cladosporium fulvum und Magnaporthe oryzae beschrieben, indem ihre
Funktion
als
Avirulenzfaktor
in
inkompatiblen
Interaktionen
untersucht
wurde
(zusammengefasst in Stergiopoulos und de Wit, 2009). Kürzlich wurde Pep1 als erstes
Effektorprotein der Brandpilzarten Ustilago maydis und Ustilago hordei beschrieben. !pep1
knock-out Mutanten riefen eine stärkere Abwehrantwort der Wirtspflanze Mais als der
wildtypische Stamm hervor und waren dadurch während der initialen Penetration arretiert
(Doehlemann et al., 2009). Die molekulare oder biochemische Funktion von pilzlichen
Effektoren ist bisher jedoch meist unbekannt. Lediglich für zwei C. fulvum Effektoren, Avr2 und
Avr4, konnte eine Funktion in der Unterdrückung der Wirtsabwehr ermittelt werden: Avr2
inhibiert Wirtsproteasen, die für eine Abwehrreaktion von Bedeutung sind (Shabab et al., 2008)
und Avr4 schützt die pilzliche Zellwand vor Wirtschitinasen (van den Burg et al., 2006).
Die pflanzliche basale Wirtsabwehr umfasst neben der präformierten Abwehr auch spätere,
Pathogen-induzierte Antworten, welche häufig durch das Wechselspiel von Hormonen
ausgelöst werden und die Induktion der Expression von Abwehrgenen (pathogenesis related
(PR) genes), sowie die Produktion von Sekundärmetaboliten umfasst (Vance et al., 1980,
Herms und Mattson, 1992, Hammerschmidt, 1999). Letztere können Phytoalexine, also
antimikrobielle Substanzen, sein (zum Beispiel Camalexin oder DIMBOA (2,4-Dihydroxy-7methoxy-1,4-benzoxazin-3-on), welche jeweils von Arabidopsis thaliana bzw. Mais synthetisiert
werden (Niemeyer, 1988, Zhou et al., 1999)), oder phenolische Substanzen, welche der
Verstärkung der Lignifizierung der Zellwand dienen (Vance et al., 1980). Auch diese induzierten
Abwehrantworten müssen von einem Pathogen unterdrückt oder toleriert werden, damit eine
kompatible Interaktion aufgebaut werden kann.
2.1.2 Source-sink
Verhältnisse
und
Umprogrammierung
des
Wirtsmetabolismus durch Phytopathogene
Pflanzen betreiben Photosynthese und sind in der Lage, Reduktionsäquivalente, ATP und
Kohlenhydrate selbst zu synthetisieren. Diese aus der Photosynthese gewonnene Energie wird
verwendet, um aus anorganischen Mineralien alle zum Wachstum benötigen Substanzen, wie
beispielsweise
organische
Kohlenstoff-
(C-Assimilate),
Stickstoff-
(N-Assimilate)
und
Schwefelverbindungen, herzustellen. Blätter, welche einen netto Export an Assimilaten
4
EINLEITUNG
aufweisen, werden dabei als source-Blätter bezeichnet, während Pflanzenorgane, welche auf
den Import von Assimilaten angewiesen sind, sink-Organe genannt werden (Bresinsky et al.,
2008). Beispiele für sink-Organe sind unterirdische Wurzeln, Samen oder Knollen, aber auch
Meristeme und junge Blätter, wobei letztere zwar schon photosynthetisch aktiv sein können,
jedoch noch einen netto Import an Assimilaten aufweisen. Sich entwickelnde Blätter erfahren
also während ihrer Entwicklung einen Übergang von einem sink- zu einem source-Organ. Die
Unterteilung in sink- und source-Organe bezieht sich dabei nicht ausschließlich auf
C-Assimilate, sondern auch auf N-Assimilate, da neben Kohlenhydraten auch Aminosäuren in
sink-Gewebe importiert werden (Lalonde et al., 2003, Bresinsky et al., 2008).
Das Phloem stellt einen Ferntransportweg dar, welcher hauptsächlich über das osmotische
Gefälle zwischen source- und sink-Gewebe getrieben wird (Lalonde et al., 2003, Bresinsky et
al., 2008). Die treibenden Kräfte hinter dem Transport im Xylem, dem zweiten Ferntransportweg
in Pflanzen, sind der Transpirationssog, sowie der Wurzeldruck (Bresinsky et al., 2008). Die
Haupttransportform von Kohlenstoff in den meisten Pflanzen ist Saccharose, welche bis zu 90%
der osmotisch wirksamen Substanzen im Phloemsaft ausmachen kann (Lalonde et al., 2003,
Lalonde et al., 2004). Im Gegensatz zu Saccharose können Aminosäuren effektiv in beiden
Leitgeweben transportiert werden, jedoch wurden im Phloem von Maispflanzen 50-100-fach
höhere Konzentrationen gemessen als im Xylem (Lohaus et al., 1998).
2.1.2.1 Die Rolle von Kohlenhydraten in Pflanzen-Pathogen Interaktionen
Biotrophe Pathogene sind per se ein sink für Nährstoffe, da sie diese als Parasiten aufnehmen,
jedoch nicht selbst produzieren. Für die Nährstoffaufnahme haben viele Pilze, wie zum Beispiel
Mehltau- und Rostpilze, spezialisierte Strukturen entwickelt, welche Haustorien genannt werden
und eine große Kontaktfläche zwischen Wirt und Pathogen darstellen (Perfect und Green, 2001,
Mendgen und Hahn, 2002, Panstruga, 2003). Pathogene müssen Nährstoffe aus dem
Wirtsgewebe entnehmen, so dass allgemein angenommen wird, dass infiziertes Blattgewebe
seinen source-Status verliert und stattdessen ein sink-Gewebe wird (Panstruga, 2003,
Hückelhoven, 2005, Biemelt und Sonnewald, 2006), was sich in reduzierter photosynthetischer
Aktivität und erhöhtem Nährstoffimport manifestiert (Walters und McRoberts, 2006). In
X. campestris-infizierten Tomatenblättern (Kocal et al., 2008), P. syringae-infizierten
Arabidopsisblättern (Bonfig et al., 2006) und in Gerstenblättern, welche mit dem Mehltau
Blumeria graminis infiziert waren (Swarbrick et al., 2006), wurde eine Reduktion der
photosynthetischen Aktivität beobachtet. In Mais werden vermehrt Kohlenhydrate aus
systemischen Blättern in U. maydis infizierte Blätter transportiert (Billett und Burnett, 1978b),
was zeigt, dass die Physiologie der gesamten Wirtspflanze beeinflusst ist. Für mehrere PilzPflanze Interaktionen konnte gezeigt werden, dass der Wirtsmetabolismus umprogrammiert und
die source-sink Balance zugunsten des Pathogens verschoben war (Swarbrick et al., 2006,
Parker et al., 2009). In diesen Studien zeigte sich, dass in infizierten Blättern insbesondere
Hexosen (Fructose und Glucose) akkumulierten, was den sink-Status dieser Blätter unterstrich.
5
EINLEITUNG
Die Akkumulation von Hexosen korreliert meist mit einer erhöhten Aktivität des Saccharosespaltenden Enzyms Invertase, von dem Isoformen in der Zellwand oder der Vakuole (saure
Invertasen), sowie im Cytosol vorliegen. Da für obligat biotrophe Phytopathogene, wie
beispielsweise Mehltau- oder Rostpilze, bisher kein Saccharosetransporter kloniert werden
konnte, geht man davon aus, dass sie auf den Import von Hexosen angewiesen sind. Dazu wird
die Aktivität von zellwandgebundener Invertase erhöht, welche im Apoplasten Saccharose zu
Hexosen umsetzt, die von pilzlichen Monosaccharid-Transportern effektiv aufgenommen
werden können (Sutton et al., 1999, Swarbrick et al., 2006, Voegele et al., 2006). Eine
Erhöhung von Invertaseaktivität konnte auch nach der Infektion von Maisblättern mit U. maydis
beobachtet werden (Billett et al., 1977), jedoch konnte nicht geklärt werden, inwiefern
Wirtsinvertasen an dieser Aktivitätssteigerung beteiligt waren. Aus U. maydis wurde ein
Saccharosetransporter charakterisiert, der für die erfolgreiche Kolonisierung unerlässlich ist
(Wahl R, Wippel K, Kämper J, Sauer N, eingereicht). Es wird daher hypothetisiert, dass die
U. maydis Invertase nicht sekretiert wird, sondern die aufgenommene Saccharose im pilzlichen
Cytosol spaltet. Dies stellt für das Pathogen einen entscheidenden Vorteil dar, da Hexosen, die
aufgrund erhöhter Zellwandinvertase-Aktivität im Apoplasten akkumulieren, der Pflanze als
Signal für die Induktion von Abwehrgenen dienen können (Herbers et al., 1996a, Herbers et al.,
1996b) und gleichzeitig die Repression der photosynthetischen Genexpression bewirken.
2.1.2.2 Stickstoff-Stoffwechsel in Pflanzen-Pathogen Interaktionen
Die Rolle des Stickstoffmetabolismus für Pflanzen-Pathogen Interaktionen wurde bisher nicht
ausführlich betrachtet, obwohl gezeigt werden konnte, dass Aminosäurentransporter des
Rostpilzes U. fabae in Haustorien exprimiert werden (Hahn et al., 1997, Voegele et al., 2001,
Struck et al., 2002, Struck et al., 2004) und daher Aminosäuren diesem Pilz vermutlich als
favorisierte N-Quelle dienen. Eine funktionelle Analyse war jedoch nicht möglich, da Rostpilze
nicht transformierbar sind (Voegele et al., 2001). Es konnte auch gezeigt werden, dass
Aminosäure-Transporter (Hahn et al., 1997, Struck et al., 2002, Struck et al., 2004, Divon et al.,
2005, Takahara et al., 2009) und Gene für die Biosynthese von Aminosäuren (Stephenson et
al., 1997, Namiki et al., 2001, Both et al., 2005, Takahara et al., 2009) bereits früh in der
Infektionsphase von biotrophen und hemibiotrophen Pilzen transkriptionell induziert sind, was
auf eine Aufnahme und Metabolisierung von organischem Stickstoff durch phytopathogene
Pilze hindeutet. Dies wird durch die Beobachtung unterstützt, dass der Verlust des AreA / NiT2
Transkriptionsfaktor-Homologs, welcher die Verwertung von Stickstoffquellen in filamentösen
Pilzen reguliert (siehe 2.4 und Marzluf, 1997), in Fusarium oxysporum und Colletotrichum
lindemuthianum zu verringerter Virulenz führte (Pellier et al., 2003, Divon et al., 2006). Darüber
hinaus waren U. maydis N-auxotrophe Mutanten nicht in der Lage, ihren Infektionszyklus zu
beenden (Holliday, 1961a), und eine Histidin-auxotrophe Magnaporthe grisea Mutante
(Sweigard et al., 1998), sowie eine Arginin-auxotrophe F. oxysporum Mutante (Namiki et al.,
2001) waren weniger virulent, was die Notwendigkeit der Biosynthese von bestimmten
6
EINLEITUNG
Aminosäuren in planta unterstreicht. Dagegen zeigten Mutanten des biotrophen Pilzes
C. fulvum und des hemibiotrophen Pilzes M. grisea, welche nicht in der Lage waren, Nitrat als
N-Quelle zu verwerten, keine Reduktion in ihrer Pathogenität (Talbot, 1990, Lau und Hamer,
1996). Dies zeigt, dass Nitrat als Stickstoffquelle für diese Pathogene nicht essentiell ist und sie
stattdessen auf die Verfügbarkeit reduzierter N-Verbindungen angewiesen sind.
Bisher gab es widersprüchliche Berichte, ob pilzliche Pathogene in planta Stickstoffmangel
ausgesetzt sind oder nicht. Einerseits zeigten mit Stickstoff überdüngte Pflanzen eine erhöhte
Suszeptibilität gegenüber pilzlichen Pathogenen (Jensen und Munk, 1997, Hoffland et al., 2000,
Agrios, 2005) und es wurde beobachtet, das der Infektionsindex von U. maydis auf Mais mit der
Menge und dem Zeitpunkt der Stickstoffdüngung korrelierte (Kostandi und Soliman, 1991).
Andererseits waren auch Pflanzen, die unter Stickstoffmangel litten, suszeptibler gegenüber
Infektionen,
was
vermutlich
auf
eine
generelle
Reduktion
der
pflanzlichen
Fitness
zurückzuführen ist (Snoeijers et al., 2000, Solomon et al., 2003).
Um ein Maß für die Verfügbarkeit von Stickstoff für Pathogene zu erhalten, die wie zum Beispiel
C. fulvum vorwiegend im Apoplasten wachsen und keine Haustorien ausbilden, muss man die
Konzentration von Aminosäuren im Apoplasten betrachten. In Maisblättern konnten bis zu
2,6 mM Saccharose und 1,3 mM Aminosäuren in apoplastischen Waschflüssigkeiten
nachgewiesen werden (Lohaus et al., 2000), und apoplastische Aminosäuregehalte stiegen in
Tomatenblättern nach der Infektion mit C. fulvum (Solomon und Oliver, 2001), was zeigt, dass
potentiell viel organischer Stickstoff verfügbar ist. Desweiteren war in mit Mehltau infizierten
Erbsenblättern die Aufnahme von radioaktiv markiertem Glutamin in das Pilzmyzel nur 50%
geringer als die Aufnahme von Glucose (Clark und Hall, 1998). Die Aufnahmekapazität für
Glutamin war also ähnlich hoch wie für Glucose. Zusammenfassend lassen diese Daten die
Hypothese zu, dass Stickstoff für apoplastische Pathogene nicht limitierend ist. Dennoch kann
nicht
ausgeschlossen
werden,
dass
zumindest
in
einem
begrenzten
Zeitfenster
Stickstoffmangel herrscht, beispielsweise während der frühen Infektionsphase, wenn pilzliche
Zellen auf ihre eigenen Kohlenstoff- und Stickstoffreserven angewiesen sind (zusammengefasst
von Solomon et al., 2003).
2.2 Die Kulturpflanze Mais (Zea mays)
Die Domestizierung von Mais aus wilden Zea-Spezies, den Teosinten, begann bereits vor
10000 Jahren in der südwestlichen Region des heutigen Mexico (Wang et al., 1999 und darin
aufgeführte Referenzen). Die Sequenzierung des Maisgenoms zeigte, dass es für 32540 Gene
und miRNAs kodiert (Schnable et al., 2009). Heute ist Mais eine der wichtigsten Kulturpflanzen
und weist mit rund 800 Millionen Tonnen im Jahr 2007 die weltweit höchste Produktion aller
Kulturpflanzen auf, während von Reis und Weizen im selben Jahr 600 bis 700 Millionen Tonnen
weltweit produziert wurden (Quelle: Food and Agriculture Organization of the United Nations,
http://faostat.fao.org/). Der Ertrag von Mais, also die Produktion von Körnern pro Hektar
7
EINLEITUNG
Anbaufläche, ist mit 5 t/ha höher als der Ertrag von Reis (4,2 t/ha) und Weizen (2,8 t/ha)
(http://faostat.fao.org/).
2.2.1 Mais ist eine C4-Pflanze
Was macht Mais also zu solch einer Hochleistungskulturpflanze? Mais ist eine C4-Pflanze und
Blätter zeigen die typische Kranz-Anatomie mit Bündelscheidenzellen (BSZ) entlang der
Leitbündel, und Mesophyllzellen (MZ), welche die BSZ in ein bis zwei Schichten umgeben
(Abbildung 1).
Abbildung 1
UV-Epifluoreszenz eines Maisblatt-
Querschnitts. Die blau fluoreszierende Zellwand der
Epidermis, der großen Bündelscheidenzellen (weiße
Pfeilköpfe) und des Leitgewebes (gelbe Pfeilköpfe)
ist deutlich zu erkennen. Rote Epifluoreszenz ist auf
Chlorophyll in den Chloroplasten zurückzuführen.
In diesen zwei Zelltypen wird der C4-Zyklus ausgeführt, dessen Existenz bereits 1966 in
Zuckerrohr beobachtet wurde (Hatch und Slack, 1966) und deshalb auch Hatch-Slack-Weg
genannt wird. Mais ist eine C4-Pflanze des NADP-Malatenzym (NADP-ME) Typs. Kohlendioxid
wird als Bicarbonat von C4-Phosphoenolpyruvat Carboxylase (C4-PEPC) im Mesophyll fixiert
und als Malat in die Chloroplasten der BSZ transportiert, wo Malat durch NADP-ME
decarboxyliert wird. Dabei entstehen Pyruvat und CO2. Letzteres wird dann von Ribulose-1,5bisphosphat Carboxylase / Oxygenase (RubisCO), welche in voll entwickelten Maisblättern
ausschließlich in den Chloroplasten der BSZ vorliegt, fixiert und dem Calvin-Zyklus zugeführt.
Das Pyruvat wird zurück in die Chloroplasten der MZ transportiert wo es von Pyruvat-Phosphat
Dikinase umgesetzt wird, um den Primärakzeptor von CO2, Phosphoenolpyruvat (PEP) zu
regenerieren (der C4 Zyklus ist in Abbildung 2 zusammengefasst).
8
EINLEITUNG
Abbildung 2
-
Der C4-Zyklus in Maisblättern. Phosphoenolpyruvat (PEP) und Bicarbonat (HCO3 )
werden durch C4-PEP Carboxylase (C4-PEPC) im Cytosol der Mesophyllzellen (MZ) in Oxalacetat (OA)
umgewandelt, welches im Chloroplasten der MZ durch Malatdehydrogenase (MDH) zu Malat reduziert
wird. Malat wird in Chloroplasten der Bündelscheidenzellen (BSZ) transportiert, wobei es einem
Konzentrationsgradienten zwischen den Zellen folgt. NADP-Malatenzym (NADP-ME) decarboxyliert
Malat, und Pyruvat gelangt zurück in die Chloroplasten von MZ, wo es durch die Pyruvat-Phosphat
Dikinase (PPDK) zu PEP regeneriert wird. Das in Chloroplasten der BSZ freigesetzte CO2 wird durch
RubisCO fixiert und in den Calvin-Zyklus geschleust, durch den Triosephosphate (Triose-P) synthetisiert
werden.
Neben der Kompartimentierung der am C4-Zyklus beteiligten Enzyme hat auch die Integrität der
Kranz-Anatomie maßgeblichen Einfluss auf die Effizienz der C4-Photosynthese, da der CO2konzentrierende Mechanismus nur funktioniert, wenn die CO2-Leckage von den BSZ zu den MZ
gering ist (Kiirats et al., 2002, von Caemmerer und Furbank, 2003). C4-Pflanzen sind durch
einen sehr niedrigen CO2-Kompensationspunkt, also der CO2-Konzentration, an der CO2Verbrauch und CO2-Synthese gleich hoch sind, charakterisiert und weisen insbesondere bei
sehr hohen Lichtintensitäten und hohen Temperaturen eine höhere photosynthetische Kapazität
auf als C3-Pflanzen (Heldt und Piechulla, 2008). Desweiteren ist der Wasserverlust durch
stomatäre
Transpiration
in
C4-Pflanzen
geringer,
da
aufgrund
des
CO2-
Konzentrationsmechanismus die stomatäre Apertur gering ist (Heldt und Piechulla, 2008).
Die C4-Photosynthese manifestiert sich während der Blattentwicklung: Junge Maisblätter zeigen
in ihrer Photosynthese C3- bzw. intermediäre C3-C4-Charakteristika und nur voll entwickelte
Maisblätter führen C4-Photosynthese aus (Dai et al., 1995). Dabei wird das photosynthetische
Schicksal einzelner Zellen bereits in der meristematischen Phase der jungen Blätter
determiniert, wobei diffusible Substanzen bei der räumlichen Anordnung von zukünftigen BSZ
und MZ eine Rolle spielen (Nelson und Dengler, 1992). In diesem Zusammenhang konnte
gezeigt werden, dass MZ, welche mehr als zwei Zellreihen von Leitbündeln entfernt liegen,
RubisCO enthalten und C3-Photosynthese betreiben (Langdale und Kidner, 1994), was darauf
hindeutet, dass diese Zellen nicht das Signal zur Differenzierung zu C4-MZ bekommen haben.
9
EINLEITUNG
Desweiteren konnte gezeigt werden, dass zunächst alle Zellen die enzymatische Ausstattung
haben, um C3-Photosynthese zu betreiben und erst nach Lichtinduktion in BSZ und MZ
differenzieren (Nelson und Dengler, 1992).
2.2.2 Stickstoff-Stoffwechsel von Maispflanzen
Die C4-Photosynthese erlaubt den Pflanzen eine bessere Stickstoffverwertungs-Effizienz
(nitrogen use efficiency, NUE). Im Vergleich zu C3-Pflanzen benötigen C4-Pflanzen weniger
RubisCO, welches in C3-Pflanzen mehr als 50% des gesamten Blattproteins ausmachen kann
(Leegood et al., 2000). Auf diese Weise ist es C4-Pflanzen möglich, auf stickstoffarmen Böden
mehr Biomasse zu produzieren als C3-Pflanzen (Heldt und Piechulla, 2008). Da Mais jedoch
eine sehr schnell wachsende Pflanze ist und einen sehr hohen Ertrag hat, setzt diese
Kulturpflanze in der heutigen Nutzung intensive Düngung voraus (Ma und Dwyer, 1998). Dabei
nehmen junge Maispflanzen bevorzugt Nitrat aus der Erde auf und assimilieren dieses in den
Blättern (Oaks, 1994). In Pflanzen, welche die generative Phase erreicht haben, wird die Anzahl
und die Größe der Maiskörner durch die Mobilisierung von Glutamin aus älteren Blättern
determiniert (Martin et al., 2006). Dabei scheint auch die Seneszenz älterer Blätter eine Rolle zu
spielen, da gezeigt werden konnte, dass die Verzögerung der Seneszenz von Blättern zu
höheren Erträgen von modernen Mais Hybridsorten führte (Ma und Dwyer, 1998, Rajcan und
Tollenaar, 1999a, b). Seneszenz ist eine spezielle Form des programmierten Zelltods, welcher
der Remobilisierung von Mineralien und besonders von N-Reserven aus Blättern dient, die nicht
mehr benötigt werden und stattdessen in wachsende Pflanzenorgane transloziert werden (Lim
et al., 2007). Dabei werden auch der Photosyntheseapparat und Chlorophyll abgebaut, was zu
einer Verringerung der Photosyntheserate in seneszenten Blättern führt. Dies kann auch
erklären, warum die Verzögerung der Seneszenz zu höheren Erträgen bei Mais führen kann, da
Blätter durch längere photosynthetische Aktivität eine höhere Kapazität zur Assimilation von
anorganischem Stickstoff haben (Gallais und Hirel, 2004). Welches Signal Seneszenz auslöst
ist nicht klar, jedoch scheint das Blattalter eine entscheidende Rolle zu spielen, während die
Phytohormone Ethylen, Jasmonsäure, Cytokinin, Abszisinsäure und Salicylsäure, aber auch
Stressfaktoren, wie Stickstoffmangel, Beschattung, Trockenstress oder Pathogenbefall, das
Fortschreiten der Seneszenz modulieren können (zusammengefasst in Lim et al., 2007).
2.3 Der Modellorganismus Ustilago maydis
Der Basidiomycet Ustilago maydis gehört der Familie der Ustilaginomyceten an und ist der
Erreger des Maisbeulenbrandes. Wie bei den meisten Brandpilzen ist das Wirtsspektrum dieses
Pilzes sehr eng, da er nur in der Lage ist Mais und Teosinte zu infizieren. Ustilago maydis
verursacht an allen oberirdischen Pflanzenstrukturen Infektionssymptome, an denen Tumore
ausgebildet werden (Abbildung 3). Damit unterscheidet sich U. maydis von anderen
Brandpilzen, welche meist Pflanzen im Keimlingsstadium infizieren und dann ohne äußere
Symptome proliferieren und erst an den Infloreszenzen Tumore ausbilden (Brefort et al., 2009).
10
EINLEITUNG
Ustilago-induzierte Tumore bestehen aus hypertrophem Wirtsgewebe, welches durch
Zellteilung und Zellvergrößerung entsteht. In den Zellzwischenräumen proliferiert der Pilz und
bildet schwarze Teliosporen aus (Abbildung 3B). Die Infektion mit U. maydis führt zu einem
verringerten Wachstum der Wirtspflanze, was zu Ertragseinbußen führen kann (MartinezEspinoza et al., 2002). Ustilago maydis-induzierte Tumore an den Kolben (benannt durch das
aztekische
Wort
Huitlacoche)
gelten
in
Mexico
als
kulinarische
Delikatesse,
was
möglicherweise daran liegt, dass Huitlacoche große Mengen der Aminosäure Lysin enthalten
(LizarragaGuerra und Lopez, 1996), welches in nicht-infizierten Maiskörnen kaum vorhanden ist
und eine für Menschen essentielle Aminosäure darstellt (Reyes et al., 2009).
Abbildung 3
Infektionssymptome
von
U. maydis an oberirdischen Organen von
Maispflanzen.
A
Maisblättern,
Tumorbildung
welche
an
unter
Laborbedingungen mit dem in dieser Arbeit
verwendeten
Stamm
SG200
verursacht
wurde. B Mit schwarzen Tieliosporen gefüllte
Tumore an einem Maiskolben (Abbildung
entnommen aus Kahmann et al., 2004). C
Männliche Blüten einer Maispflanze, welche
U.
maydis-induzierte
(Abbildung
Extension,
aus
Ohio
Tumore
State
aufweist
University
http://ohioline.osu.edu/hyg-
fact/3000/3119.html). D Tumorbildung am
Stamm einer Maispflanze (Abbildung von
Robert L. Nielson, Purdue University, USA).
2.3.1 Lebenszyklus von U. maydis
Ustilago maydis weist im Vergleich zu anderen phytopathogenen Pilzen einen einfachen
sexuellen Lebenszyklus auf: Haploide Sporidien ernähren sich saprophytisch und vermehren
sich durch Knospung. Um ein infektiöses Filament ausbilden zu können, müssen zwei Sporidien
unterschiedlichen Paarungstyps aufeinander treffen und konjugieren. Der Paarungsvorgang
unterliegt der Kontrolle des biallelischen a-Locus und des multiallelischen b-Locus; Ustilago
maydis weist also ein tetrapolares Paarungssystem auf (Banuett, 1995). Der a-Locus kodiert für
den Vorläufer eines sekretierten Peptidpheromons (Mfa1/2) und für einen Pheromonrezeptor
(Pra1/2), wobei der Rezeptor nur das Pheromon des anderen Allels detektieren kann (Bölker et
al., 1992). Nach der Erkennung des Pheromons des kompatiblen Paarungstyps wird vermehrt
eigenes Pheromon sekretiert und als Folge dieser gegenseitigen Pheromonstimulation bilden
11
EINLEITUNG
sich Konjugationshyphen aus, welche entlang des Pheromongradienten wachsen (Snetselaar et
al., 1996) und schließlich an ihren Spitzen verschmelzen, so dass sich ein dikaryotisches
Filament bildet (Abbildung 4A fasst den Infektionszyklus zusammen).
Der b-Locus kodiert für die zwei Homeodomänen-Transkriptionsfaktoren bEast (bE) und bWest
(bW). Nur wenn diese Proteine von unterschiedlichen b-Allelen abstammen, können sie ein
Heterodimer (bE/bW) ausbilden, welches als transkriptioneller Aktivator bzw. Repressor wirkt
und für die Integrität der dikaryotischen Zellen sowie für die Pathogenität von U. maydis
unerlässlich ist (Kämper et al., 1995). Durch Einbringung von Mfa2 und bE2 unter der Kontrolle
der endogenen Promotoren in einen U. maydis-Stamm des Paarungstyps a1b1 konnte ein
haploider, solopathogener Stamm (SG200, Kämper et al., 2006) hergestellt werden, welcher
auch ohne Paarungspartner filamentös wachsen kann und virulent ist, jedoch im Vergleich zu
den Ausgangsstämmen eine verringerte Sporenbildung aufweist. Die Signaltransduktion, die zu
der Initiierung und Fortführung des filamentösen Wachstums führt, wurde eingehend studiert
und involviert MAPK-Kaskaden und cAMP-Signalwege (zusammengefasst in Feldbrügge et al.,
2004, Kahmann und Kämper, 2004, Brefort et al., 2009).
Ein bisher unidentifiziertes Signal, welches aber vermutlich auf Hydrophobizität beruht
(Mendoza-Mendoza et al., 2009), beendet das filamentöse Wachstum auf der Wirtsoberfläche
und bewirkt die Ausbildung einer terminalen Struktur, welche den Appressorien anderer
phytopathogener Pilze ähnelt, jedoch nicht melanisiert ist (Snetselaar und Mims, 1992). Diese
Appressorien bilden Penetrationshyphen aus, welche vermutlich mit Hilfe lytischer Enzyme die
Pflanzenoberfläche penetrieren, wobei die eindringende Hyphe von der sich einstülpenden
Plasmamembran der Wirtszelle umschlossen wird (Brefort et al., 2009, Doehlemann et al.,
2009). Dabei entsteht die biotrophe Grenzfläche, an der pilzliche Sekretion zur Ausbildung einer
vesikulären Matrix führt, welche die Kontaktfläche zwischen Pilz- und Wirtszelle vergrößert und
typisch für die Ustilaginomyceten ist (Bauer et al., 1997, Begerow et al., 2006). Da U. maydis im
Gegensatz zu anderen phytopathogenen Pilzen keine Haustorien ausbildet, wird angenommen,
dass die biotrophe Grenzfläche dem Signalaustausch und der Nährstoffaufnahme dient (Brefort
et al., 2009).
In der frühen Kolonisierung der Wirtspflanze (bis 2 Tage nach Infektion (days post infection,
dpi)) wächst U. maydis hauptsächlich intrazellulär und penetriert umliegende Zellen (Abbildung
4B). Mitotische Teilungen führen zu einer verzweigten Pilzproliferation, die bevorzugt entlang
von Leitbündeln erfolgt (Doehlemann et al., 2008b, Doehlemann et al., 2009), welche hohe
Konzentrationen an Assimilaten enthalten (Lohaus et al., 1998, Lohaus et al., 2000). Ab 4 dpi
bildet sich der Tumor im Wirtsgewebe und U. maydis proliferiert interzellulär. Acht dpi haben
sich massive Aggregate von Pilzhyphen, welche vermutlich bereits diploid sind (Brefort et al.,
2009), gebildet und die Ausbildung stark melanisierter Teliosporen setzt ein (Abbildung 4B,
Doehlemann et al., 2008b, Brefort et al., 2009). Diese Sporen sind resistent gegen die meisten
Umwelteinflüsse und die Überdauerungsform von U. maydis (Sacadura und Saville, 2003) und
12
EINLEITUNG
werden durch Wind oder Regen verteilt. Unter günstigen Umweltbedingungen keimen sie aus,
teilen sich meiotisch und setzen haploide Sporidien durch Knospung vom Promycelium frei.
Obwohl U. maydis-Sporidien in vitro kultiviert werden können und auch die Paarung
beziehungsweise. die Appressoriumsausbildung in vitro induziert werden kann, ist es bisher
nicht gelungen, den gesamten Sexualzyklus vollständig in vitro zu rekonstituieren, was darauf
schließen lässt, dass entwicklungsspezifische Signale von der Wirtspflanze eine entscheidende
Rolle spielen (Brefort et al., 2009).
Abbildung 4
totem
Lebenszyklus von U. maydis. A Haploide Sporidien vermehren sich im Boden oder auf
Gewebe
durch
Knospung
und
ernähren
sich
saprophytisch.
Treffen
zwei
Sporidien
unterschiedlichen Paarungstyps aufeinander, paaren sich diese und bilden ein dikaryotisches Filament
aus. Geschieht dies auf der Wirtsoberfläche, bilden sich Appressorien welche die Pflanzenoberfläche
penetrieren. Daraufhin proliferiert U. maydis im Wirtsgewebe (siehe B) durch hyphales Wachstum, bis
sich sporogene Hyphen ausbilden in denen Karyogamie stattfindet und diploide Teliosporen entstehen.
Diese werden durch Wind oder Regen verbreitet und nach erfolgter Meiose keimen die Sporen aus und
haploide Sporidien werden freigesetzt. B Hyphale Proliferation in Maisblättern. Zwölf Stunden nach
Kontakt mit der Wirtsoberfläche penetriert U. maydis mittels Appressorien die erste Wirtszelle, um in
dieser bis 1 dpi intrazellulär zu wachsen. Bis 2 dpi werden auch tiefer liegende Zellschichten kolonisiert
und verzweigte Hyphen gebildet. Ab 4 dpi beginnt die Tumorisierung des Wirtsgewebes, was mit
interzellulärem Wachstum der Pilzhyphen einhergeht. Acht dpi haben sich Tumore vollständig entwickelt
und in den interzellulären Zwischenräumen haben sich hyphale Pilzaggregate gebildet. Erste Sporen
werden ausgebildet. Abbildung B modifiziert nach Doehlemann et al., 2008a.
13
EINLEITUNG
2.3.2 Ustilago maydis als Modellorganismus
Trotz seiner Fähigkeit, alle oberirdischen Organe zu infizieren, ist U. maydis bei der Infektion
auf Gewebe angewiesen, welches noch nicht vollständig differenziert ist und sich noch teilt
(Wenzler und Meins, 1987). Aus diesem Grund erfolgt die Infektion von Maisblättern am
Blattmeristem, welches durch die Blattscheiden der älteren Blätter umgeben ist. Deshalb sind
die Effekte der Blattinfektion durch U. maydis durch das Blattwachstum bzw. die
Blattentwicklung überlagert.
Das U. maydis – Mais System stellt ein Modellsystem für die Untersuchung von Pilz –
Pflanzeninteraktionen dar, was auf mehrere Faktoren zurückzuführen ist: Ustilago maydis ist
problemlos in vitro kultivierbar, was mit den meisten obligat biotrophen Pilzen nicht möglich ist,
und genetische Analysen sind aufgrund des einfachen Sexualzyklus, welcher in zwei bis drei
Wochen abgeschlossen ist (siehe oben) leicht durchzuführen. Desweiteren ist U. maydis
molekular zugänglich und transformierbar (Schulz et al., 1990, Bölker et al., 1992).
Gendeletionen oder -insertionen können über homologe Rekombination erreicht werden
(Tsukuda et al., 1988, Wang et al., 1988), welche in U. maydis sehr effizient ist (Holliday,
1961b, 1962). Die Arbeit mit solopathogenen Stämmen, wie zum Beispiel SG200, erleichtert
darüber hinaus die Mutantenanalyse, da nur in einem Stamm das Gen deletiert / inseriert
werden muss, und nicht in zwei Stämmen unterschiedlichen Paarungstyps. Das Genom von
U. maydis ist vollständig sequenziert und annotiert (Kämper et al., 2006). Das 20,5 Mb große
Genom beherbergt etwa 6900 proteinkodierende Gene, welche meist keine Introns besitzen
und auf 23 Chromosomen verteilt sind. Durch die Verfügbarkeit der vollständigen
Genomsequenz lassen sich so über revers-genetische Ansätze Gene mit Homologien aus
anderen Organismen suchen und mittels homologer Rekombination gezielt ausschalten.
Die Analyse des U. maydis Genoms zeigte, dass Gencluster vorliegen, die für sekretierte
Proteine kodieren und deren Expression in planta induziert ist (Kämper et al., 2006). Damit sind
diese
Proteine
gute
Kandidaten
für
pilzliche
Effektoren,
welche
den
erfolgreichen
Infektionsverlauf vermitteln. Tatsächlich führt der Verlust des Genclusters 19A (Kämper et al.,
2006) dazu, dass keine Tumore mehr ausgebildet werden, obwohl der Pilz im Blattgewebe
proliferiert (T. Brefort und R. Kahmann, persönliche Kommunikation). Der bereits identifizierte
Effektor Pep1 liegt jedoch nicht in solch einem Gencluster (Doehlemann et al., 2009).
Nicht alle beschriebenen apathogenen U. maydis Mutanten haben jedoch einen Defekt in
Effektorproteinen. So wurde zum Beispiel die !clp1 Mutante beschrieben, welche einen Defekt
in der Ausbildung von Klammer-ähnlichen Strukturen aufweist, die an der korrekten
Kernsortierung bei verzweigtem hyphalen Wachstum beteiligt sind (Scherer et al., 2006). Diese
Mutante zeigte keinen Phäntotyp im Sporidienwachstum und war in der Lage, die
Pflanzenoberfläche zu penetrieren. Das Wachstum von !clp1 war jedoch unmittelbar nach der
Penetration der ersten Wirtszelle arretiert, was auf einen Fehler in der Kernsortierung
zurückzuführen war und nicht auf eine erhöhte Abwehrantwort der Pflanze. Aus diesem Grund
14
EINLEITUNG
ist das Clp1 Protein nicht als Effektor zu bezeichnen, obwohl es zwingend für die erfolgreiche
Kolonisierung des Wirts benötigt wird.
Ustilago maydis ist also durch die einfache axenische Kultivierung, molekulare Zugänglichkeit,
einfache genetische Handhabung, dem voll sequenzierten Genom und der Verfügbarkeit vieler
apathogener Mutanten ein hervorragendes Modellsystem für das Studium genereller
Infektionsmechanismen phytopathogener Pilze.
2.4 Stickstoff-Stoffwechsel in phytopathogenen und filamentösen
Pilzen
2.4.1 Regulation des Stickstoff-Stoffwechsels in filamentösen Pilzen
In filamentösen Pilzen unterliegt die Verwertung von Nitrat der Stickstoffkatabolitrepression
(NCR: nitrogen catabolite repression), welche häufig auch Stickstoffmetabolitrepression
genannt wird. Als Modellsystem für die Untersuchung der Regulationsmechanismen dienten
dabei die Ascomyceten (Schlauchpilze) Neurospora crassa und Aspergillus nidulans. Die NCR
reguliert die Verwertung sogenannter nicht-favorisierter N-Quellen, welche vollständig inhibiert
ist, solange favorisierte N-Quellen verfügbar sind (Marzluf, 1993). In A. nidulans sind
Ammonium und Gln favorisierte N-Quellen, in N. crassa Gln, Ammonium und Glu, während
andere Aminosäuren, Nitrat, Peptide und andere N-Quellen in beiden Pilzen als nicht-favorisiert
gelten (Marzluf, 1993).
Die zentrale Rolle der NCR spielt dabei der GATA-Zn-Finger Transkriptionsfaktor NiT2 (genannt
AreA in A. nidulans), welcher bei Mangel an favorisierten N-Quellen an die Promotoren
N-metabolisierender Gene bindet und damit deren Derepression bewirkt (zusammengefasst in
Marzluf, 1993 und Marzluf 1997, siehe auch Abbildung 5). NiT2 und dessen Orthologe weisen
eine hochkonservierte Zn-Finger-Domäne in der C-terminalen Region, sowie zwei weitere
konservierte NiT2-spezifische Sequenzbereiche auf (Divon et al., 2006, Wong et al., 2008): Das
N-terminale Motif RMENLTWRMM sowie das Motif EWEWLTMSL, welches am äußersten
C-Terminus liegt, ist in allen bisher charakterisierten NiT2 Orthologen aus filamentösen
Ascomyceten zu finden (Divon et al., 2006, Wong et al., 2008).
Für die Induktion der meisten NiT2-Zielgene ist in filamentösen Pilzen zusätzlich zu NiT2 noch
ein Stoffwechselweg-spezifischer Aktivator nötig. Für die Verwertung von Nitrat ist dies in
N. crassa NiT4 (NirA in A. nidulans), ein GAL4-ähnlicher Transkriptionsfaktor, welcher nur in
Kooperation mit NiT2 eine Induktion von Nitrat- und Nitritreduktase bewirken kann (Feng und
Marzluf, 1998). NiT2 oder NiT4 allein bewirken keine Induktion dieser Gene. Die Repression
N-metabolisierender Gene in Gegenwart favorisierter N-Quellen wird durch den Repressor
Nmr1 (NmrA in A. nidulans) vermittelt (Fu et al., 1988). Für dieses Protein konnte bisher keine
DNA-bindende Eigenschaft nachgewiesen werden (Young et al., 1990), aber Nmr1 interagiert
direkt mit NiT2 und verhindert dessen Interaktion mit der DNA und somit die Derepression (Xiao
et al., 1995, Pan et al., 1997). Abbildung 5 fasst die Regulation der NCR am Beispiel der
Nitratverwertung in einem Modell zusammen. Obwohl Ammonium die NCR bewirkt, konnte
15
EINLEITUNG
gezeigt werden, dass Glutamin das metabolische Signal darstellt, welches NCR auslöst, da
Ammonium in N. crassa Glutamin-Synthetase Mutanten nicht mehr repressiv auf NiT2-Zielgene
wirkte (Premakumar et al., 1979). Der Gln-Sensor selbst konnte jedoch bisher nicht ermittelt
werden.
Abbildung 5
Modell der Stickstoffkatabolitrepression (NCR) in Neurospora crassa. Der zentrale
Regulator NiT2 löst die Respression für Gene, die der NCR unterliegen (gestrichelte, grüne Pfeile). Für
die Expression der entsprechenden Gene (zum Beispiel Nitrat- (NiT3 bzw. Nar) und Nitritreduktase (NiT6
bzw. Nir)) wird noch der Stoffwechselweg-spezifische Aktivator NiT4 benötigt, dessen Wirkung durch
-
+
NO3 aktiviert wird (grüne Pfeile). Bei Anwesenheit einer favorisierten N-Quelle (z.B. NH4 , welches durch
Glutamin Synthetase (GS) in Gln überführt wird) wird die Bindung von NiT2 an die Promotoren von Nmetabolisierenden Genen unterbunden, was entweder direkt oder mittels des Repressors Nmr1
geschieht. „Andere Gene“ bezeichnet weitere Gene, die der NCR unterliegen (z.B. Uricase oder
Xanthindehydrogenase) und deren Repression von NiT2 gelöst wird.
2.4.2 Die Rolle des Stickstoff-Stoffwechsels für die Virulenz phytopathogener
Pilze
NiT2 / AreA Homologe wurden auch in phytopathogenen Pilzen gefunden und insbesondere
deren Funktion in der Virulenz dieser Pilze wurde untersucht (Bolton und Thomma, 2008). Der
Verlust der Funktion der NiT2-Homologe führt zu einer verringerten Pathogenität von Gibberella
fujikuroi (Tudzynski et al., 1999), C. lindemuthianum (Pellier et al., 2003) und verschiedenen
Fusarium sp. (Divon et al., 2006, Kim und Woloshuk, 2008). Der Verlust des C. lindemuthianum
Homologs (Clnr1) führt dazu, dass der Übergang in die nekrotrophe Phase gestört ist, während
die biotrophe Phase nicht offensichtlich betroffen ist (Pellier et al., 2003). Für M. grisea
(Froeliger und Carpenter, 1996) sowie für C. fulvum (Perez-Garcia et al., 2001) waren die AreA
/ NiT2 Homologe für die Pathogenität jedoch entbehrlich. In Colletotrichum acutatum wurde ein
NiT4 Homolog ausgeschaltet und der Pilz zeigte kein Wachstum auf Nitrat, was auf eine
funktionelle Homologie zu N. crassa NiT4 hindeutet (Horowitz et al., 2006). Dieses Gen ist in
Appressorien stark exprimiert, jedoch konnte die Expression in planta nicht nachgewiesen
16
EINLEITUNG
werden. Dennoch waren C. acutatum !nirA-Mutanten nicht mehr in der Lage, ihren Wirt,
Erdbeere, zu infizieren (Horowitz et al., 2006).
Warum genau N-regulatorische Mutanten pilzlicher Pathogene in ihrer Virulenz beeinflusst sind,
wird kontrovers diskutiert. Eine Hypothese besagt, dass Pathogene in planta durch Stickstoff
limitiert sind (siehe 2.1.2) und dass diese N-Limitation ein essentielles Signal für die Induktion
des Infektionszyklus ist (Snoeijers et al., 2000). Dies beruht auf der Beobachtung, dass der
C. fulvum Effektor Avr9 (Van den Ackerveken et al., 1994) sowie der M. grisea
Pathogenitätsfaktor Mpg1 (Talbot et al., 1993) in axenischer Kultur unter N-Limitation exprimiert
werden. Darüber hinaus steht die Expression von Avr9 unter der Kontrolle von NiT2 (PerezGarcia et al., 2001). Durch Mikroarrayanalysen konnte gezeigt werden, dass auch weitere
Pathogenitätsfaktoren von M. grisea unter N-Limitation exprimiert werden (Donofrio et al., 2006)
und Kulturfiltrate von M. grisea sind nur dann in der Lage, Seneszenz in Reisblättern zu
induzieren, wenn sie ein funktionelles NiT2 Protein aufweisen (Talbot et al., 1997). Jedoch führt
die Tatsache, dass von den neun bekannten Effektorproteinen aus C. fulvum lediglich Avr9
durch Stickstoff reguliert wird (Stergiopoulos und de Wit, 2009) und dass C. fulvum !nit2Mutanten keine reduzierte Virulenz aufwiesen, zu Zweifel an dieser Hypothese (Bolton und
Thomma, 2008). Desweiteren waren von den 21 untersuchten Pathogenitätsfaktoren aus
M. grisea lediglich fünf unter N-Mangel induziert (Donofrio et al., 2006), was zumindest darauf
hindeutet, dass auch andere Faktoren als die N-Verfügbarkeit eine Rolle bei der Induktion des
Infektionszyklus haben müssen. Diese Hypothese impliziert auch, dass die reduzierte Virulenz
mancher phytopathogener !nit2 Mutanten nicht ausschließlich auf die reduzierte Expression
von Effektorproteinen zurückzuführen ist.
Bisher sind nur wenige Untersuchungen zur NCR in Basidiomyceten durchgeführt worden, so
dass kaum Informationen über die Regulation der NCR vorliegen. Es wurde gezeigt, dass
Nitrat-verwertende
Proteine
in
dem
ectosymbiotischen
Basidiomyceten
Hebeloma
cylindrosporum durch Ammonium transkriptionell reprimiert werden. Die Expression dieser
Proteine bedarf jedoch, im Gegensatz zu der Stituation in N. crassa, nicht der Induktion durch
Nitrat (Jargeat et al., 2000, Jargeat et al., 2003). Kürzlich wurde auch ein Protein aus
Cryptococcus neoformans charakterisiert, welches zwar nur geringe Sequenzhomologie zu
Nmr1 aus Ascomyceten aufweist, jedoch ähnliche regulatorische Eigenschaften hat (Jiang et
al., 2009).
2.4.3 Stickstoff-Stoffwechsel in U. maydis
Bioinformatische Untersuchungen des U. maydis-Genoms haben gezeigt, dass dieser Pilz die
vollständige genetische Ausstattung aufweist, um anorganischen Stickstoff in alle benötigten
organischen Stickstoff-Formen zu überführen (McCann und Snetselaar, 2008) und U. maydisSporidien genügt Nitrat als einzige Stickstoffquelle (Holliday, 1961a). Die Nitratreduktase
(Nar1), Nitritreduktase und eine Nitratpermease liegen in einem Gencluster vor, wie er auch für
filamentöse Ascomyceten beschrieben ist (Marzluf, 1997, McCann und Snetselaar, 2008), was
17
EINLEITUNG
auf eine gemeinsame Regulation dieser drei Gene, die für die Aufnahme und Reduktion von
Nitrat verantwortlich sind, schließen lässt.
Durch weitere bioinformatische Analysen wurden ein NiT2 Homolog, sowie ein NiT4 Homolog
gefunden (Ho et al., 2007), jedoch konnten keine Gene mit signifikanter Sequenzhomologie zu
Nmr1 oder zu den N-regulatorischen Genen MeaB oder Dal80 aus S. cerevisae gefunden
werden, welche in Hefe die Verwertung nicht-favorisierter N-Quellen negativ regulieren (Wong
et al., 2008). Bereits früh konnte gezeigt werden, dass die Nitratreduktaseaktivität in U. maydis
durch Ammonium reprimiert wird und dass das Nitratreduktase-Protein (Nar1) nach Transfer auf
Ammonium-Medium rasch abgebaut wird (Lewis und Fincham, 1970). Die Induktion des Nar1Gens geschieht auf transkriptioneller Ebene (Banks et al., 1993). Dies deutet darauf hin, dass
zwar generell ähnliche Regulationsmechanismen der NCR auch in U. maydis aktiv sind, deren
Modulation jedoch anders abläuft als in den bisher beschriebenen Systemen, da für einige
schlüsselregulatorische Proteine keine Homologe gefunden wurden.
2.5 Zielsetzungen dieser Arbeit
Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Auswirkung der Infektion mit Ustilago maydis auf den
Kohlenstoff-
und
Stickstoffmetabolismus
von
Maispflanzen
untersucht
werden.
Durch
Transkriptom- und Metabolomdaten sollten dazu zunächst grundlegende metabolische
Veränderungen im Tumor dargestellt und dann anhand von physiologischen Methoden
charakterisiert werden. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass durch die Infektion der
Wirtsmetabolismus grundlegend umprogrammiert wird und dass dieser Prozess entscheidend
für die Kompatibilität der U. maydis-Mais Interaktion ist, da der Tumor ein sink für C- und
N-Assimilate darstellen sollte. Aus diesem Grund wurden der zentrale Kohlenstoff- und
Energiestoffwechsel,
sowie
der
Stickstoff-Stoffwechsel
eingehend
charakterisiert.
Die
Hypothese, dass die Induktion von Tumoren die source-zu-sink Balance der gesamten Pflanze
verändert, sollte durch Analysen, welche die Produktivität systemischer Blätter adressieren,
überprüft werden.
Durch diese Analysen sollte auch die Frage geklärt werden, ob U. maydis in planta N-Mangelbedingungen ausgesetzt ist, da diese Frage kontrovers diskutiert wird. Komplementär zu den
metabolischen Analysen des Tumors sollte dazu eine U. maydis-Mutante generiert werden,
welche einen Defekt in der Verwertung komplexer N-Quellen aufweist. Als Kandidat wurde dazu
ein NiT2-Homolog ausgewählt, da in anderen Pathosystemen gezeigt werden konnte, dass
dieses Protein eine Rolle in der Virulenz des Pathogens spielt. Da bisher keine funktionelle
Analyse von NiT2-Homologen in Basidiomyceten durchgeführt wurde, sollte die Funktion dieses
Proteins in der NCR eingehend untersucht werden.
18
MATERIAL UND METHODEN
3 Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien
3.1.1.1 Herkömmliche Chemikalien und Verbrauchsmaterialien
Wenn nicht anders angegeben wurden die verwendeten Chemikalien, Enzyme und
Verbrauchsmaterialien von den Firmen Carl Roth GmbH (Karsruhe), Fermentas (St. Leon-Rot),
Roche Diagnostics GmbH (Mannheim), Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) und VWR (Darmstadt)
bezogen.
3.1.1.2 Spezielle Chemikalien und Kits
Radioaktive Chemikalien wurden von der Firma Hartmann Analytic (Braunschweig), stabile
Isotope von der Firma Chemotrade Chemiehandelsgesellschaft (Leipzig) bezogen. Der AQCFarbstoff (6-Aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat)! für die Fluoreszenzdetektion von
Aminosäuren mittels HPLC wurde von Mohammad Hajirezaei (IPK Gatersleben) hergestellt.
Kits zur Aufreinigung von Plasmiden, PCR Produkten und zur Aufreinigung von DNA
Fragmenten aus Agarosegelen wurden von Qiagen (Hilden) bezogen.
3.1.2 Oligonukleotide und Sequenzierungen
Alle Oligonukleotide wurden bei der Firma Metabion International AG (Martinsried) bestellt und
sind im Anhang angeführt. Sequenzierungen wurden von der Firma GATC (Konstanz)
durchgeführt.
19
MATERIAL UND METHODEN
3.1.3 Bakterien- und Ustilago maydis Stämme
Für die Amplifikation von Plasmiden wurden chemisch kompetente E. coli Zellen vom Stamm
XL1-blue (Stratagene, La Jolla, CA) verwendet.
Folgende Stämme von U. maydis wurden im Rahmen dieser Arbeit verwendet:
Stamm
Bezugsquelle
Beschreibung
Resistenzmarker
SG200
Jörg Kämper (TU
solopathogener Stamm (a1mfa2
Phleomycin
Karlsruhe)
bW2bE1, Kämper et al. 2006)
Jörg Kämper (TU
KO von um02438, unmittelbar Phleomycin
Karsruhe)
nach
SG200-!clp1
der
Wirtspenetration
Hygromycin
arretiert (Scherer et al., 2006)
SG200-!nit2
in
dieser
Arbeit
generiert
KO
von
um10417,
Neurospora
einem
crassa
Phleomycin
NiT2- Hygromycin
Homolog
SG200-!nit2-
in
dieser
p123_NiT2
generiert
Arbeit
Komplementation
von
SG200- Phleomycin
!nit2 durch um10417
Hygromycin
Carboxin
SG200-!19A
Thomas
Brefort
(MPI Marburg)
KO des Sekretionsclusters 19A
Phleomycin
(siehe Kämper et al., 2006)
Hygromycin
/
3.1.4 Vektoren
Folgende Vektoren wurden verwendet:
Vektor
Bezugsquelle
Verwendung
bakterieller
Resistenzmarker
p123
pBS-hhn
Regine
Kahmann
Komplementationsvektor
(MPI
Marburg)
maydis
(siehe
(Spellig et al., 1996)
Vektorkarte)
Jörg
enthält
Kämper
(TU
für
Anhang
U.
für
Hygromycinresistenzkassette
Karlsruhe)
für U. maydis knock-out Konstrukte
(Kämper, 2004)
(siehe Anhang für Vektorkarte)
Invitrogen (Carlsbad,
Amplifikation von Fragmenten in E.
USA)
coli
pGEM-T®
Promega (Madison,
Amplifikation von Fragmenten in E.
Easy
USA)
coli
pCR®-Blunt
Ampicillin
Ampicillin
Kanamycin
Ampicillin
3.1.5 Pflanzenmaterial
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ausschließlich die Zuckermaissorte Zea mays cv. Early Golden
Bantam verwendet (zur Verfügung gestellt von Regine Kahmann und Jörg Kämper).
20
MATERIAL UND METHODEN
3.2 Methoden
3.2.1 Pflanzenanzucht
3.2.1.1 Oberflächensterilisation und Aussaat von Mais-Saatgut
Nach Größe sortierte Maiskörner wurden 1 min in 80% Ethanol zur Oberflächensterilisation
geschwenkt, 8 mal in Leitungswasser gewaschen und 4 h in Leitungswasser quellen gelassen.
Anschließend wurden die gequollenen Maiskörner ca. 2 cm tief in feuchter P-Typ Erde
(Frühstorfer Erde, www.hawita-gruppe.de) ausgesät. Falls nicht anders angegeben wurden
Töpfe mit 12 cm Durchmesser verwendet.
3.2.1.2 Wachstumsbedingungen in der Phytokammer
Falls nicht anders genannt wurden die Anzuchten in einer begehbaren Phytokammer (Plant
Master, CLF Plant Climatics, Emersacker) durchgeführt. Die Pflanzen wurden in einem 14 h /
10 h Tag- / Nachtrhythmus bei 28°C / 20°C angezogen. Die Lichtphase bei einer
Photonenflussdichte (PFD) von 350 !mol.m-2.s-1 beinhaltete jeweils 1 h simulierten Sonnenaufund Sonnenuntergang. Die relative Luftfeuchte (RF) betrug in der Lichtphase 60%, in der
Dunkelphase 70-80%.
3.2.1.3 Wachstumsbedingungen in der Hochlicht-Phytokammer
Für die Anzuchten des Zentralexperimentes (CET), aus denen die Transkriptom- und
Metabolitdaten erhoben wurden, wurden die Maispflanzen in einer Hochlichtkammer (am MaxPlanck-Institut für terrestrische Mikrobiologie, Marburg) bei ~1100 !mol.m-2.s-1 Lichtintensität
und einem 15 h / 9h Tag- / Nachtrhythmus (28°C / 20 °C und 40% / 60% RF) angezogen.
3.2.2 Mikrobiologische Methoden
Alle mikrobiologischen Methoden, die eine Kultivierung von Pilz- oder Bakterienzellen auf
Nährmedium erforderten, wurden unter sterilen Bedingungen in einer Sterilbank (Heraeus
HERAsafe Modell KS 12) durchgeführt
3.2.2.1 Medien, Puffer und Lösungen für die Mikrobiologie
Folgende Medien und Lösungen wurden für mikrobiologische Methoden verwendet:
Puffer / Lösung
bottom agar
Komponenten
Endkonzentration
wie top agar, supplementiert mit 400 !g/mL Hygromycin B (Duchefa,
Haarlem, Niederlande) oder 8 !g/mL Carboxin (Sigma-Aldrich)
21
MATERIAL UND METHODEN
CM Medium
Casaminoacids
0,25 gew%
Hefeextrakt
0,1 gew%
Vitaminlösung nach Holliday
1 gew%
Salzlösung nach Holliday
6,25 vol%
Heringssperma DNA, degradiert
0,05 gew%
NH4NO3
0,15 gew%
Glukose (nach dem Autoklavieren steril 2 gew%
hinzugegeben)
auf pH 7.0 eingestellt
für festes Medium wurden 2% Agar (w/v) (BD Biosciences,
Heidelberg) zugegeben
LB Medium
Trypton
1 gew%
Hefeextrakt
0,5 gew%
NaCl
0,5 gew%
für festes Medium wurden 1,5% Agar zugegeben
Minimalmedium (MM)
Salzlösung nach Holliday
6,25 vol%
Glukose (nach dem Autoklavieren steril 2 gew%
hinzugegeben)
Stickstoffquelle (KNO3 oder (NH4)2SO4)
0,3 gew%
auf pH 7.0 eingestellt
für festes Medium wurden 2% (w/v) Agar zugegeben
PC-Minimalmedium
Prolin
Salzlösung nach Holliday
Agar
Glukose (nach dem Autoklavieren
hinzugegeben)
KClO3 (nach dem Autoklavieren
hinzugegeben)
steril
10 mM
6,25 vol%
2 gew%
2 gew%
steril 250 mM
PD Medium
potato dextrose broth (Duchefa)
2,4 gew%
für festes Medium wurden 2% Agar zugegeben
Salzlösung
(Holliday, 1974)
KH2PO4
Na2SO4
KCl
MgSO4
CaCl2 x 2 H2O
Spurenelemente nach Holliday
0,16 gew%
0,4 gew%
0,8 gew%
0,2 gew%
0,132 gew%
0,8 vol%
SCS Puffer
tri-Natriumcitrat / Zitronensäure, pH 5,8
Sorbitol
20 mM
1M
22
MATERIAL UND METHODEN
Spurenelemente
(Holliday, 1974)
H3BO3
MnCl2 x 4 H2O
ZnCl2
Na2MoO4 x 2 H2O
FeCl3 x 6 H2O
CuSO4 x 5 H2O
0,006 gew%
0,014 gew%
0,04 gew%
0,04 gew%
0,01 gew%
0,003 gew%
STC Puffer
Tris / HCl, pH 7,5
Sorbitol
CaCl2
10 mM
1M
100 mM
top agar
Hefeextrakt
Pepton
Saccharose
Sorbitol
Agar
1 gew%
2 gew%
2 gew%
1M
1,5 gew%
Vitaminlösung
(Holliday, 1974)
Thiamin Hydrochlorid
Riboflavin
Pyridoxin Monohydrochlorid
Calcium-Panthothenat
Aminobenzoesäure
Nicotinsäure
Cholinchlorid
myo-Inositol
0,01 gew%
0,005 gew%
0,005 gew%
0,02 gew%
0,005 gew%
0,02 gew%
0,02 gew%
0,1 gew%
YEPS Medium
Hefeextrakt
1 gew%
Pepton
2 gew%
Saccharose
2 gew%
für festes Medium wurden 2% (w/v) Agar zugegeben
YEPSlight Medium
Hefeextrakt
1 gew%
Pepton
0,4 gew%
Saccharose
0,4 gew%
für festes Medium wurden 2% Agar zugegeben
YNB Medium
yeast nitrogen base
Glukose (nach dem Autoklavieren steril
hinzugegeben)
ggf. Stickstoffquelle (KNO3 oder (NH4)2SO4)
0,17 gew%
2 gew%
0,3 gew%
3.2.2.2 Anzucht von U. maydis
Soweit nicht anders angegeben wurden die verschiedenen U. maydis Stämme auf PD oder CM
Platten oder in YEPSlight Flüssigmedium bei 28°C angezogen. Flüssigkulturen wurden bei 200
rpm geschüttelt.
23
MATERIAL UND METHODEN
3.2.2.3 Präparation von U. maydis Spheroblasten
Die Präparation und Transformation von U. maydis Spheroblasten erfolgte wie beschrieben
(Schulz et al., 1990, Bölker et al., 1992). Dazu wurden Kulturen in 50 mL YEPS Medium zu
einer OD600 von 0,6-1 angezogen, per Zentrifugation geerntet und in 25 mL SCS Puffer
resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation wurde das Zellsediment in 2 mL SCS Puffer mit
5 mg/mL Novozym 234 (Gerbu Biotechnik, Gaiberg) resuspendiert, und der Verlauf des
Zellwandverdaus wurde mikroskopisch verfolgt. Nach 10-15 min, wenn aus fast allen Zellen
Spheroblasten ausgetreten waren, wurden vorsichtig 10 mL SCS Puffer dazugegeben und
10 min bei 1100 g in einer Schwenkrotorzentrifuge (Centrifuge 5810 R, Eppendorf, Hamburg)
sedimentiert. Die Spheroblasten wurden zweimal mit jeweils 10 mL SCS Puffer und einmal mit
STC Puffer gewaschen. Dann wurde das Zellsediment vorsichtig in 500 !L eiskaltem STC
Puffer aufgenommen. Die Spheroblastenpräparation wurde in 50 !L Aliquots geteilt und
entweder sofort verwendet oder bei -80°C bis zu 6 Monate eingefroren.
3.2.2.4 Transformation von U. maydis
Zu 50 !L der Spheroblasten wurden 2-5 !g (max. 10 !L) linearisierte DNA (siehe 3.2.4.13) und
1 !L steriles Heparin (15 !g/!L) gegeben. Nach 10 min Inkubation auf Eis wurden 500 !L
steriles PEG3350 (40% in STC Puffer) dazugegeben, vorsichtig gemischt und weitere 15 min
auf Eis inkubiert. Anschließend wurde die Suspension auf 2 Selektionsplatten (10 mL bottom
agar mit 10 mL top agar überschichtet) ausplattiert. Nach 3-5 Tagen bei 28°C waren einzelne
Kolonien zu erkennen, welche einzeln in flüssiges YEPS Medium (mit Selektionsmarker)
überimpft und auf neuen Selektionsplatten ausgestrichen wurden. Von diesen Platten wurden
Zellen in etwas YEPSlight Medium aufgenommen und mindestens 6 Zellen pro Klon wurden auf
Selektionsplatten mit einem Mikromanipulator (MSM System, Singer Instruments, Roadwater,
UK) vereinzelt. Diese Kulturen wurden anschließend über PCR genetisch analysiert (siehe
3.2.4.14).
3.2.2.5 Infektion von Maispflanzen mit U. maydis
Maiskeimlinge wurden in dem Zeitraum 7-10 Tage nach Aussaat wie beschrieben mit U. maydis
infiziert (Gillissen et al., 1992). Dazu wurden Kulturen bis zu einer OD600 von ungefähr 1
angezogen, durch Zentrifugation (8 min, 3500 rpm, RT in einer Schwenkrotorzentrifuge)
geerntet, in ddH2O gewaschen und in ddH2O so resuspendiert, dass eine OD600 von 1 bis 3
erreicht wurde. Mit einer Spritze (Sterican® 0,40 x 12 mm, 27 G x 1/2“, Braun, Melsungen)
wurden 0,5 mL dieser Suspension in den Blattkanal von Maiskeimlingen, etwa 1,5 cm oberhalb
der Erde, injiziert. Je nach Infektionszeitpunkt wurde so eine lokale Infektion des 3.-4. Blattes
beziehungsweise 4.-5. Blattes erreicht (für eine Darstellung der Blattnummerierung siehe
Anhang).
24
MATERIAL UND METHODEN
3.2.2.6 Induktion von filamentösem Wachstum auf artifiziellen Oberflächen
Die Induktion von filamentösem Wachstum von Sporidien wurde mit leichten Modifikationen wie
beschrieben durchgeführt (Mendoza-Mendoza et al., 2009). Eine Übernachtkultur von Sporidien
wurde durch Zentrifugation geerntet (siehe 3.2.2.5), mit ddH2O gewaschen und mit ddH2O auf
eine OD600 von 0,1 eingestellt. Die Suspension wurde mit einer Pumpsprühflasche auf Parafilm
„M“ (Pechiney Plastic Packaging, Chicago, USA) gesprüht und in mit feuchtem Papier
ausgelegten Petrischalen bei 28°C inkubiert. Die Auszählung von filamentös wachsenden
Sporidien erfolgte nach 16 h und 21 h Inkubation.
3.2.2.7 Anzucht und Transformation von Escherichia coli
Kulturen von E. coli wurden auf LB Medium bei 37°C angezogen. Die Transformation wurde
mittels Hitzeschock nach den Angaben des Herstellers der kompenenten Zellen durchgeführt.
Die Selektion von Transformanden wurde je nach Resistenzmarker des Plasmids (siehe 3.1.4)
durch Zugabe von 50 !g/mL Kanamycin oder 100 !g/mL Ampicillin nach dem Autoklavieren
erreicht.
3.2.3 Mikroskopische Untersuchungen
3.2.3.1 Färbemethoden
Calcofluor
(Fluorescence
Brightener
28,
Sigma)
Färbungen
zur
Visualisierung
von
Pilzstrukturen auf der Blattoberfläche wurden wie folgt durchgeführt: Blattsegmente wurden mit
ddH2O abgespült, 1 min in Calcofluor-TBS (0,1% Calcofluor in 50 mM Tris.HCl, pH 7.4 und
150 mM NaCl) gefärbt und mit ddH2O abgespült. Mikroskopische Untersuchungen (siehe
3.2.3.3) wurden unmittelbar nach der Färbung durchgeführt.
Für Färbungen mit dem Chitin-spezifischen Antikörper WGA-AF488 (einem Konjugat des
Weizenkeim-Agglutins mit dem Farbstoff Alexafluor 488 (Invitrogen)) wurde Blattmaterial 24 h in
Ethanol entfärbt und über Nacht in 10% KOH geklärt. Die geklärten Blätter wurden für 30 min in
Färbelösung (10 !g/mL WGA-AF488, 0,02% Tween20 in PBS Puffer (137 mM NaCl, 27 mM
KCl, 100 mM Na2HPO4, 2 mM K2HPO4, pH 7,4)) durch dreimaliges Vakuuminfiltrieren für 1 min
gefärbt. Anschließend wurden die Blätter in PBS gespült und mikroskopisch analysiert (siehe
3.2.3.3).
Chlorazol Schwarz E Färbungen zur Visualisierung pilzlicher Strukturen in infiziertem
Blattmaterial wurden wie beschrieben durchgeführt (Brundrett et al., 1984) und im Durchlicht
mikroskopisch dokumentiert.
3.2.3.2 Konfokale Mikroskopie
Konfokale Mikroskopie zur Bestimmung des pilzlichen Anteils am Gesamtvolumen von acht
Tage alten Tumoren wurde wie beschrieben an WGA-AF488 gefärbten Blättern an einem Leica
TCS SP5 konfokalen Mikroskop bei einer Anregung von 488 nm durchgeführt (Doehlemann et
al., 2008b). Fluoreszenz wurde zwischen 500 und 540 nm Wellenlänge aufgezeichnet. Dabei
25
MATERIAL UND METHODEN
wurden 3D Projektionen von konfokalen Schnitten und die Kalkulation des hyphalen Volumens
mit dem Imaris 6.3 Programmpaket (Bitplane, Zürich, Schweiz) durchgeführt. Die gefärbten
Hyphen einer 3D Projektion wurden in Voxel transformiert und anschließend wurde das
Volumen der Voxel, welche Hyphen repräsentierten, vom Gesamtvolumen der 3D-Projektion
abgezogen, um das Verhältnis von pilzlichen zu pflanzlichen Material zu bestimmen.
3.2.3.3 Klassische Fluoreszenz- und Durchlichtmikroskopie
Alle weiteren mikroskopischen Analysen wurden an einem Leica DMR Fluoreszenzmikroskop
(Leica, Wetzlar) durchgeführt. Dokumentiert wurde mit einer Digitalkamera (Spot Flex, Visitron
Systems, Puchheim). Zellwand-Epifluoreszenz und Calcofluorfluoreszenz wurde bei UVBeleuchtung visualisiert (Leica Filter Kubus A: Anregungsfilter: Bandpass 340 bis 380 nm;
dichromatischer Spiegel: 400 nm; Suppressionsfilter: Langpass 425 nm).
3.2.4 Molekularbiologische Methoden
3.2.4.1 Molekularbiologische Standardmethoden
Molekularbiologische Standardmethoden wie Restriktionsverdau, PCR, Ligation und AgaroseGelelektrophorese wurden wie beschrieben durchgeführt (Sambrook und Russell, 2001).
Plasmid-DNA aus E. coli wurde mit dem QiaPrep® Spin Miniprep Kit (Qiagen) isoliert. PCR
Reaktionen wurden mit dem QiaQuick® PCR Purification Kit (Qiagen) aufgereinigt und
Gelextraktionen wurden mit dem QiaQuick® Gel Extraction Kit (Qiagen) durchgeführt.
3.2.4.2 Schnellpräparation von DNA aus Pflanzengewebe und Pilzzellen
Für
die
Schnellpräparation
von
DNA
aus
Pflanzen-
oder
Pilzzellen
wurde
in
lN2
schockgefrorenes Material in zweimal 200 !L Puffer (200 mM Tris-HCl, pH 7,5, 250 mM NaCl,
25 mM EDTA, 0,5% SDS) mit einem rotierenden Pistill (RZR 1, Heidolph, Schwabach) in 2 mL
Reaktionsgefäßen aufgeschlossen. Die Zelltrümmer wurden 2 min bei 21000 g in der
Tischzentrifuge sedimentiert und der Überstand in ein 1,5 mL Reaktionsgefäß überführt. Es
wurden 300 !L Isopropanol dazugegeben und 2 min bei RT inkubiert. Nach 5 min Zentrifugation
bei 21000 g wurde der Überstand sorgfältig abgenommen und das DNA Sediment im Abzug
getrocknet. Anschließend wurde die DNA in 50 !L RNase (0,1 mg/mL) resuspendiert.
3.2.4.3 Isolation von DNA aus Pflanzengewebe und Pilzzellen
Um hochreine DNA zu isolieren wurden Pflanzenmaterial oder Pilzzellen in lN2 schockgefroren
und mit vorgekühltem Mörser und Pistill zu einem feinen Pulver zerrieben, welches in
vorgekühlte 2 mL Reaktionsgefäße aliquotiert wurde. Das pulverisierte Material wurde zweimal
mit 250 !L DNA Extraktionspuffer mit einem rotierenden Pistill vermengt. Anschließend wurden
200 !L Phenol und 200 !L CI (Chloroform : Isoamylalkohol, 24:1) hinzugegeben und kräftig
geschüttelt. Nach 15 min Zentrifugation bei 17000 g in der Tischzentrifuge wurde der Überstand
mit 0,8 Volumen Isopropanol vermischt und 10 min bei RT inkubiert. Nach 10 min zentrifugieren
26
MATERIAL UND METHODEN
bei 21000 g wurde das DNA Sediment zweimal mit 80% Ethanol gewaschen, im Abzug
getrocknet und in 50 !L RNase (10 !g/mL) gelöst.
2x DNA Puffer
DNA-Extraktionspuffer
0,6 M NaCl
25 mL 2x DNA Puffer
100 mM Tris-HCl, pH 7,5
20 mL 12 M Harnstoff
40 mM EDTA
2,5 mL Phenol
4% N-Lauroylsarkosin
2,5 mL ddH2O
1% SDS
3.2.4.4 Southernblot
Für Southernblot-Analysen wurden 4 !g genomischer U. maydis DNA mit 20 U EcoRI in 70 !L
Gesamtvolumen für 15 h verdaut und auf einem 0,8%igem Agarosegel aufgetrennt. Die
geschnittene DNA wurde durch 20 min schwenken in 0,25 M HCl depuriniert und durch 2 mal
20 min schwenken in Denaturierungspuffer
(0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl) denaturiert. Durch
Kapillartransfer mit Denaturierungspuffer wurde die DNA auf eine Membran (GeneScreenTM
Hybridisation Transfer Membrane, PerkinElmer, Rodgau) übertragen. Nach einmaligem
Waschen der Membran in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, wurde die DNA durch UVBestrahlung
kovalent
mit
der
Membran
vernetzt.
Die
Hybridisierung
mit
einer
Hygromycinresistenz-spezifischen Sonde erfolgte wie unter 3.2.4.9 beschrieben.
3.2.4.5 Isolation von Gesamt-RNA aus Pflanzengewebe und Pilzzellen
Für die Isolation von RNA aus Pflanzengewebe oder Pilzzellen wurde die RNase-all Methode
verwendet (Chomczynski und Sacchi, 1987). Alle wässrigen Lösungen wurden vor Benutzung
16 h mit 0,1% Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandelt und anschließend autoklaviert, um
RNAsen zu inaktivieren. Schockgefrorenes Material wurde im vorgekühlten Mörser zu einem
feinen Pulver zerrieben und sofort mit 3 mL RNase-all Arbeitslösung (wassergesättigtes Phenol
: RNAse-all, 1:1) bedeckt. Während des Auftauens wurde die zähflüssige Masse regelmäßig
vermengt, um zu garantieren, dass das Material ausschließlich im Puffer auftaute. Zweimal
1,7 mL der Extrakte wurden in Reaktionsgefäße überführt, mit 0,3 mL CI versetzt und 10 s
ausgeschüttelt. Nach 30 min Inkubation auf Eis wurde für 15 min bei 17000 g und RT
zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 0,7 mL wassergesättigtem Phenol und 0,3 mL CI
ausgeschüttelt, nochmals zentrifugiert und ein letztes Mal mit 0,3 mL CI gewaschen. Die RNA
wurde durch die Zugabe von 1/20 Volumen 1 N Essigsäure und 1 Volumen Ethanol gefällt und
durch Zentrifugation bei 4°C sedimentiert. Anschließend wurde sie nacheinander mit 1 mL 3 M
Natriumacetat (pH 6,0) und 1 mL 80% Ethanol gewaschen. Die RNA wurde unter der Sterilbank
getrocknet und in 30-100 !L H2O aufgenommen. Die RNA-Konzentration und Reinheit wurde
nach 5 min Denaturieren bei 60°C im Photometer (Nanodrop® ND-1000, Peqlab, Erlangen) bei
A260, A280 und A230 bestimmt. RNA wurde bis zur weiteren Verwendung bei -80°C gelagert.
27
MATERIAL UND METHODEN
RNase-all
4 M Guanidin-Isothiocyanat
25 mM Natriumacetat
0,5% N-Lauroylsarkosin
0,7% "-Mercaptoethanol
pH auf 7,0 eingestellt und sterilfiltriert
3.2.4.6 Denaturierende Gelelektrophorese von RNA
Die Integrität von RNA Präparationen wurde über denaturierende Gelelektrophorese überprüft.
Dazu wurden 5 bis 10 !g RNA durch 5 minütiges Erhitzen bei 60°C denaturiert und auf ein
Volumen von 16 !L gebracht, mit 35 !L Ladepuffer versetzt und 15 min bei 65°C erhitzt. Die
Auftrennung erfolgte auf mit 1x MEN gepufferten, 1%igen Agarosegel, das mit 6,7%
Formaldehyd versetzt war. Als Laufpuffer diente 1x MEN. Die Dokumentation der RNA erfolgte
mittels UV-Licht in einer Geldokumentationskammer (Peqlab).
10x MEN Puffer
RNA-Ladepuffer
200 mM MOPS, pH 7,6
200 !L 10x MEN
10 mM EDTA
240 !L Formaldehyd
50 mM Natriumacetat
800 !L deionisiertes Formamid
160 !L Ethidiumbromid (1 mg/mL)
3.2.4.7 Northernblot-Analyse
Für den Nachweis von Nitratreduktase- und Nitrattransporter-Transkripten aus U. maydis
Sporidien wurde RNA wie unter 3.2.4.5 isoliert und 10 !g RNA wie beschrieben aufgetrennt
(siehe 3.2.4.6). Über einen aufwärts gerichteten Kapillartransfer wurde die RNA auf eine
Membran (GeneScreenTM Hybridisation Transfer Membrane) übertragen, wobei 10x SSC
(150 mM Natriumcitrat, 1,5 M NaCl, pH 7,0) als Transferpuffer verwendet wurde. Die RNA
wurde durch UV-Licht auf der Membran fixiert. Die Hybridisierung mit UmNar1, UmNrt und
Solanum lycopersicon 18S rRNA spezifischen Sonden erfolgte wie unter 3.2.4.9 beschrieben.
3.2.4.8 Sondenherstellung für Northern- und Southernblot-Analysen
Sonden für Northernblot-Analysen wurden über PCR von genomischer DNA mit folgenden
Oligonucleotiden amplifiziert: UmNar1 (RH228 und RH229), UmNrt (RH265 und RH266), 18S
rRNA (RH267 und RH268). Die Hygromycinresistenz-spezifische Sonde für die SouthernblotAnalysen wurde mit pBS-hhn als Matrize mit dem Primern RH212 und RH213 amplifiziert. Zur
Vermehrung wurden die Sonden in pGEM-T® easy subkloniert und wurden vor der radioaktiven
Markierung (siehe 3.2.4.9) aus dem Vektor herausgeschnitten.
28
MATERIAL UND METHODEN
3.2.4.9 Herstellung und Hybridisierung von radioaktiv markierten DNA-Sonden
Northern- und Southernblots wurden nach dem Vernetzen der Nukleinsäuren (siehe 3.2.4.4 und
3.2.4.7) 2 h in modifiziertem Church und Gilbert Puffer (0,5 M Phosphatpuffer, pH 7,2; 10 mM
EDTA; 7% SDS; 1% BSA) bei 65°C vorhybridisiert. Währenddessen wurden die Sonden mit
40 µCi ["32P]dCTP mittels High Prime Mix (Roche) nach Herstellerangaben radioaktiv markiert.
Nach dem Vorhybridisieren wurde die markierte Sonde 2 min bei 95°C denaturiert, zu dem
Hybridisierungspuffer gegeben und über Nacht bei 65°C hybridisiert. Spezifische Signale
wurden durch Exposition auf einen Röntgenfilm (Kodak) detektiert.
3.2.4.10 cDNA Synthese
Vor der Synthese von cDNA wurde Gesamt-RNA den Herstellerangaben entsprechend mit
DNaseI (Fermentas) behandelt, um Kontamination durch genomische DNA zu vermeiden. Die
cDNA wurde mit Hilfe der RevertAid™ H Minus M-MuLV Reverse Transcriptase (Fermentas)
laut
Herstellerangaben
synthetisiert.
Falls
nicht
anders
erwähnt
wurden
oligo(dT)18
Oligonukleotide als Primer für die cDNA Synthese eingesetzt.
3.2.4.11 Semiquantitative RT-PCR
Für semiquantitative RT-PCR Analysen von Mais- und U. maydis Transkripten wurden als
Ladekontrollen Mais Actin1 (Primer RH46 / RH47) bzw. U. maydis Actin (Primer RH58 / RH59)
verwendet. Weitere, für RT-PCR verwendete Primerkombinationen sind im Folgenden
aufgelistet: Mais Zellwandinvertase 1 (Incw1, Unigene-ID Zm.409): RH12 / RH13, Incw2
(Zm.1497): RH14 / RH15, Incw3 (Zm.14531): RH16 / RH17, Incw4 (Zm.13430): RH18 / RH19,
Mais vakuoläre Invertase 1 (Ivr1, Zm.81096): RH20 / RH21, Ivr2 (Zm.38958): RH22 / RH23,
U. maydis Invertase (UmSUC2, um01945): RH24 / RH25.
3.2.4.12 Quantitative RT-PCR (qRT-PCR)
Transkriptmengen der Seneszenzmarker ZmSee1 (Zm.82264) und ZmSee2b (Zm.308) wurden
relativ zur cytosolischen Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase (ZmGAPDH, Zm.3765)
auf einem Mx3000P qPCR System (Stratagene) mit dem Brilliant II SYBR® Green QPCR
Master
Mix
(Stratagene)
den
Herstellerangaben
entsprechend
bestimmt.
Folgender
Temperaturzyklus wurde verwendet: 10 min 95°C, gefolgt von 40 Zyklen 20 s 95°C, 30 s 60°C
and 20 s 72°C. Als Primer dienten RH259 / RH260 (ZmSee1), RH261/RH262 (ZmSee2b) und
RH230 / RH231 (ZmGAPDH). Die Effizienz der verwendeten Primerpaare wurde anhand von
Verdünnungsreihen bestimmt, um die relative Expression von Genen anhand der Methode von
Pfaffl berechnen zu können, welche gegen unterschiedliche Amplifikationseffizienzen korrigiert
(Pfaffl, 2001).
29
MATERIAL UND METHODEN
3.2.4.13 Generierung von U. maydis Transformationskonstrukten
Für die Transformation von U. maydis wurde die hohe Effizienz der homologen Rekombination
in diesem Organismus ausgenutzt. Eine hohe Rekombinationseffizienz wird jedoch nur mit
homologen Sequenzen um die 1 kb erreicht (Kämper, 2004). Daher mussten die homologen
Sequenzen über PCR amplifiziert werden.
Für die Erstellung von knock-out Mutanten wurde das gesamte Leseraster des Zielgens durch
eine Hygromycin-Resistenzkassette ersetzt. Dazu wurden jeweils 1 kb der linken (LB) und der
rechten
flankierenden
Sequenz
(RB)
mit
einer
thermostabilen
DNA-Polymerase
mit
Korrekturleseaktivität (Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase, Finnzymes, Espoo, Finnland)
amplifiziert. Über die Oligonukleotide wurden dazu am 3’-Ende des LB, sowie am 5’-Ende des
RB Fragments zwei unterschiedliche SfiI-Schnittstellen eingefügt, die eine gerichtete Ligation
an die Hygromycin-Resistenzkassette des Vektors pBS-hhn ermöglichen (Abbildung 6). Das
LB-Hyg-RB Ligationsprodukt wurde anschließend in pCR®-Blunt kloniert, in E. coli transformiert
und vermehrt. Die Identität des Fragmentes wurde über Restriktionsverdau und Sequenzierung
der LB und RB Bereiche verifiziert. Vor der Transformation von U. maydis Spheroblasten wurde
das LB-Hyg-RB Fragment aus dem Vektor geschnitten, über Gelelektrophorese mit dem
Qiagen Gel Extraction Kit aufgereinigt und wie unter 3.2.2.4 beschrieben für die Transformation
von U. maydis eingesetzt.
30
MATERIAL UND METHODEN
Abbildung 6
Schema für die Erstellung von knock-out Konstrukten für U. maydis. Die 5’ (LB) und die
3’ (RB) Regionen des zu löschenden Gens wurden über PCR separat amplifiziert und mit SfiI an den
durch lb2 und rb1 eingebrachten Schnittstellen geschnitten. Diese flankierenden Sequenzen wurden an
die ebenfalls mit SfiI geschnittene Hygromycin-Resistenzkassette (Hyg-Kassette) aus pBS-hhn ligiert und
das Ligationsprodukt in pCR®-Blunt kloniert. Nach Amplifikation in E. coli und herausschneiden des LBHyg-RB Fragmentes wurden U. maydis Spheroblasten transfiziert (siehe 3.2.2.4). Über homologe
Rekombination wurde das Zielgen durch die Hygromycin-Resistenzkassette ersetzt. Die Korrekte
Integration wurde in Hygromycin-resistenten Klonen über insertionsspezifische PCR verifiziert (siehe
3.2.4.14). Abbildung modifiziert nach Kämper et al. (2004).
31
MATERIAL UND METHODEN
Im Folgenden sind die Oligonukleotide für die Generierung des Um10417 (UmNiT2) knock-out
Konstrukts aufgelistet.
Oligonukleotide für das UmNiT2 knock-out Konstrukt
LB1:
RH163
LB2:
RH164
RB1:
RH160
RB2:
RH161
Die Komplementation von SG200-!nit2 Mutanten mit einem genomischen Fragment des
U. maydis NiT2 Gens wurde mittels des Vektors p123 durchgeführt, mit dessen Hilfe DNAFragmente in den Succinatdehydrogenase-Lokus integriert werden können. Dabei wird eine
Mutation in diesen Lokus eingeführt, welche die Funktion der Succinatdehydrogenase nicht
beeinträchtigt, jedoch Resistenz gegen das Fungizid Carboxin vermittelt (Broomfield und
Hargreaves, 1992, Spellig et al., 1996). Dazu wurde die gesamte kodierende Sequenz inklusive
der Promotorregion (1 kb vor dem annotierten Startkodon) mit den Primern RH263 und RH264
über PCR amplifiziert und über HindIII und NotI Schnittstellen in p123 kloniert, woraus Plasmid
p123_NiT2 resultierte. Vor der Transformation wurde p123_NiT2 mit SspI linearisiert. Die
daraus resultierenden Transformanden wurden auf Carboxin selektiert, vereinzelt und ein
zweites Mal auf Nitrat-Minimalmediumplatten und Carboxin selektiert.
3.2.4.14 Genetische Analyse von U. maydis Transformanden
Die genetische Charakterisierung der erzeugten knock-out Mutanten erfolgte über PCR mit
insertionsspezifischen Oligonukleotiden. Dazu wurden die Primerpaare so gewählt, dass der
erste Primer an die im Kontrukt enthaltende Hygromycin-Resistenzkassette (hhn5 oder hhn3)
und der zweite (LBx oder RBx) wenige Basen außerhalb des homologen Bereichs lagen
(Abbildung 6). Mit diesen Primerkombinationen werden nur dann Fragmente amplifiziert, wenn
das Konstrukt das Zielgen ersetzt hat. Zusätzlich wurde über eine weitere PCR mit
genspezifischen Oligonukleotiden (GSP) die Abwesenheit des gelöschten Gens überprüft. Die
dazu verwendeten Oligonukleotide sind im Folgenden aufgelistet.
Oligonukleotide für die Charakterisierung der !nit2 Stämme
LBx:
RH165
RBx:
RH162
hhn5:
RH87
hhn3:
RH191
GSP1:
RH192
GSP2:
RH193
32
MATERIAL UND METHODEN
Darüber hinaus wurde überprüft, ob mehrere Insertionsereignisse, z.B. durch illegitime
Rekombination, aufgetreten sind. Dazu wurden Southernblots durchgeführt bei denen eine
Sonde verwendet wurde, die spezifisch für die Hygromycinkassette war (siehe 3.2.4.4 und
3.2.4.8).
3.2.4.15 Bestimmung des 5’-Endes der UmNiT2 mRNA über 5’-RACE
Um das 5’-Ende der UmNiT2 mRNA zu bestimmen wurde das SMARTTM RACE cDNA
Amplification Kit (Clontech, Mountain View, USA) nach Herstellerangaben verwendet. Neben
dem Adapterprimer wurde die cDNA Synthese dabei einmal mit oligo(dT) und einmal mit
genspezifischen Primern durchgeführt. In beiden Fällen konnten mehrere PCR Produkte vom
5’-Ende amplifiziert werden, welche in pGEM-T® easy kloniert und sequenziert wurden.
3.2.5 Mikroarray Analysen
3.2.5.1 Transkriptomanalyse
von
Tumoren,
jungen
systemischen
Blättern
und
symptomfreien Bereichen infizierter Blätter
Transkriptomdaten von Mais wurden mit dem Genechip® Maize Genome Array (Affymetrix,
Santa Clara, USA) erhoben. Die auf dem Chip vorhandenen probe sets und deren Annotationen
sind
unter
http://www.affymetrix.com/products_services/arrays/specific/maize.affx#1_1
abzurufen. Aus drei unabhängigen biologischen Anzuchten in der Hochlicht Phytokammer
(siehe 3.2.1.3) wurden jeweils 4 Pools, bestehend aus Material von 4 bis 8 Pflanzen, zu den
Zeitpunkten 12 hpi, 1 dpi, 2 dpi, 4 dpi, 4,5 dpi und 8 dpi in Alutütchen geerntet. Aliquots des
zerbröselten Materials aus den vier Pools pro Zeitpunkt und Replikat wurden für die
Mikroarrayanalysen vereinigt und bei -80°C gelagert. Das verbliebene Material wurde für die
Metabolitprofilierung verwendet (siehe 3.2.6). Je Zeitpunkt und Replikat wurden Tumore,
symptomfreie Bereiche infizierter Blätter und junge systemische Blätter beprobt. Als Kontrolle
dienten die entsprechenden Blätter wasserbehandelter Pflanzen. Gesamt-RNA wurde mittels
des
TRIzol®-Reagenz
(Invitrogen)
den
Herstellerangaben
entsprechend
isoliert.
Die
Probenaufbereitung, Arrayhybridisierung und statistische Auswertung wurden in Kooperation
durch Gunther Döhlemann (MPI Marburg) und Jörg Kämper (TU Karlsruhe) wie beschrieben
durchgeführt (Eichhorn et al., 2006). Dabei wurden zweifache Änderungen in der
Transkriptmenge und ein korrigierter p-Wert von <0,001 als signifikant erachtet. Die
Expressionsdaten wurden im GeneExpressionOmnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/),
unter der Nummer GSE10023 hinterlegt. Für die Visualisierung einzelner Stoffwechselwege
wurde das MapMan Programm (Thimm et al., 2004) verwendet, welches für Mais adaptiert
wurde (Doehlemann et al., 2008a).
33
MATERIAL UND METHODEN
3.2.5.2 Transkriptomanalyse von angereicherten Leitbündeln systemischer source Blätter
Transkriptomanalysen von unteren systemischen source Blättern infizierter und Wasserbehandelter Maispflanzen wurden mit selbst entwickelten 4x44k Mikroarrays (Uwe Scholz,
Sophia Sonnewald, unveröffentlichte Daten) der Firma Agilent (Santa Clara, USA) durchgeführt.
Für die Auswahl der Gene auf dem Chip wurden die Sequenzen 75388 elektronisch annotierter
Maisgene (www.maizesequence.org, Release 3b.50) mit dem MIRA 3 Whole Genome Shotgun
and EST Assembler (http://chevreux.org/projects_mira.html) assembliert, um Redundanz zu
verringern. Daraus resultierten 34604 Unigenes, welche mit 7396 Sequenzen der NCBI MaisUnigene
Datenbank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/UGOrg.cgi?TAXID=4577)
komplementiert wurden, welche nicht in den MIRA-Unigenes vertreten waren. Spezifische
60-mer
Sonden
für
die
42000
Gene
wurden
mit
dem
Programm
eArray
(www.chem.agilent.com/en-US/products/instruments/dnamicroarrays/pages/gp50660.aspx) berechnet. Für 41780 Gene konnten so spezifische Sonden generiert werden.
Die Leitbündel des 3. Blattes infizierter (Tumore an Blatt 4 und 5) und wasserbehandelter
Pflanzen (je zwei biologische Replikate) wurden 9 dpi nach Entfernen der Mittelrippe durch
differenzielles Zerreiben unter lN2 und mehrfachem Filtern durch ein 120 !m Nylonnetz (Typ
NY2H, Millipore, Billerica, USA) angereichert und die Anreicherung wurde mikroskopisch
verifiziert. Anschließend wurde Gesamt-RNA wie unter 3.2.4.5 beschrieben extrahiert und
mittels des RNeasy purification Kit (Qiagen) aufgereinigt. Die Qualität der RNA wurde über
einen Agilent 2100 Bioanalyzer mit dem Agilent RNA 6000 Nano Kit überprüft. Die cDNA- und
anschließende cRNA Synthese erfolgte mit dem One-Color Spike-Mix (Agilent) nach
Herstellerangaben. Die somit durch Cy3 markierte cRNA wurde fragmentiert und auf die
Mikroarrays hybridisiert (17 h bei 65°C) und anschließen nach Herstellerangaben gewaschen.
Die Chips wurden mit einem Agilent DNA Microarray Scanner eingelesen und Daten wurden mit
dem „feature extraction“-Programm (v9.5.3.1) extrahiert.
Die weitere Auswertung der Daten erfolgte mit dem GeneSpring GX 7.3.1 Programm (Agilent).
Die Normalisierung erfolgte pro Chip auf das 50igste Perzentil. Anschließend wurde die
Intensität jedes Gens durch den Median seiner Werte in allen Proben geteilt. Durch einen
Volcano plot wurden Gene gefiltert, welche eine mindestens zweifach veränderte Signalstärke
zwischen infizierten und Kontrollpflanzen aufwiesen, sowie statistisch signifikant (p<0,05, t-Test
mit Annahme ungleicher Varianzen) dereguliert waren.
3.2.6 Biochemische und physiologische Methoden
3.2.6.1 Bestimmung von Proteinkonzentrationen
Die Konzentration von Proteinen in Extrakten wurde durch eine modifizierte Bradford Methode
bestimmt (Bradford, 1976, Zor und Seliger, 1996). Dazu wurde nach Zugabe von Bradford
Färbereagenz (Bradford Protein Assay, Bio-Rad, München) zum Proteinextrakt die Extinktion
bei 590 nm und 450 nm im Photometer bestimmt. Über eine mitgeführte Eichreihe von BSA
konnte so mit Hilfe des Quotienten A590/A450 die Proteinkonzentration ermittelt werden.
34
MATERIAL UND METHODEN
3.2.6.2 Auftrennung von Proteinen über SDS-PAGE
Für die anschließende Auftrennung durch SDS-PAGE wurden Proteine mit Extraktionspuffer
(50 mM Tris/HCl, pH 7,4; 1 mM EDTA; 0,01% Triton X-100; Roche Complete Protease Inhibitor
Cocktail) isoliert. Die Auftrennung unter denaturierenden Bedingungen erfolgte dann nach der
Methode von Laemmli (Laemmli, 1970) mit Hilfe eines 4%igen Sammel- und 12%igen
Trenngels. Proteine wurden durch Färbung mit Coomassie Brilliant Blau visualisiert (Weber und
Osborn, 1969).
3.2.6.3 Chlorophyllgehalt
Chlorophyll wurde mit 80% Aceton extrahiert und der Gehalt photometrisch wie beschrieben
bestimmt (Graan und Ort, 1984).
3.2.6.4 Bestimmung der Gehalte löslicher Zucker und Stärke
Lösliche Zucker wurden aus ca. 30 mg Pflanzen- oder Pilzmaterial zweimal mit 1 mL 80%
Ethanol bei 80°C extrahiert. Die vereinigten Überstande wurden im Vakuumkonzentrator zur
Trockne eingeengt, in 200 bis 400 !L ddH2O aufgenommen und die Gehalte von Glucose,
Fructose und Saccharose wurden wie beschrieben (Bergmeyer, 1972) spektrophotometrisch
bestimmt, jedoch wurde das Volumen der Reaktionsansätze auf 200 !L herunterskaliert und die
Analyse im Mikrotiterplatten-Photometer (BioTek, Bad Friedrichshall) durchgeführt. Die in
Ethanol nichtlösliche Stärke wurde mit Amyloglucosidase in Glukose gespalten, welche
spektrophotometrisch quantifiziert wurde (siehe oben).
3.2.6.5 Bestimmung
von
Aminosäuregehalten
über
reversed
phase
HPLC
und
Fluoreszenzdetektion
Proteinogene Aminosäuren (außer Trp und Cys) wurden über eine HPLC Methode nach
Derivatisierung mit dem Fluoreszenzfarbstoff AQC (siehe 3.1.1.2) wie beschrieben anhand von
Standards quantifiziert (Cohen und Michaud, 1993, Abbasi et al., 2009).
3.2.6.6 Callose-Bestimmung
Callose wurde spektrophotometrisch aus 50 bis 100 mg Ethanol-geklärtem Gewebe bestimmt
(Köhle et al., 1985). Das geklärte Gewebe wurde in zwei mal 250 !L 1 N NaHO mit einem
rotierenden Pistill aufgeschlossen und 15 min bei 80°C inkubiert. Nach 5 min Zentrifugation bei
21000 g wurden 100 !L des Überstandes nacheinander mit 200 !L 1 N NaOH, 400 !L 0,1%
Anilinblau, 210 !L 1 N HCl und 590 !L 1 M Glycin-NaOH, pH9,5 versetzt und 20 min bei 50°C,
gefolgt von 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Dreihundert !L der nun fast farblosen Lösung
wurden im Fluoreszenz-Photometer (FLx800, Bio-Tek) mit 400 nm Anregungs- und 510 nm
Emissionsfiltern vermessen. Die Quantifizierung erfolgte anhand einer Eichkurve von 0 bis 5 !g
Pachyman, einem pilzlichen 1,3-Betaglucan.
35
MATERIAL UND METHODEN
3.2.6.7 Quantifizierung von thiolhaltigen Molekülen und Antioxidantien
Die Gehalte von oxidiertem und reduziertem Glutathion (GSH), Cystein und #-Glutamylcystein
(#EC) wurden wie in Abbasi et al., (2009) beschrieben nach der Glutathionmethode bestimmt.
Reduziertes und oxidiertes Ascorbat wurde nach der spektrophotometrischen Methode von Law
et al., (1983) bestimmt, die Methode zur Messung der Gehalte an Tocopherol wurde von Abbasi
et al., (2007) übernommen.
3.2.6.8 Bestimmung von Gehalten an aromatischen Sekundärmetaboliten
Aromatischen Sekundärmetabolite wurden mit Perchlorsäure und Methanol extrahiert, um
wasserlösliche und -unlösliche Substanzen zu berücksichtigen. Die Absorption der Extrakte bei
534 nm (Anthocyane), 310 nm (Flavonole) und 290 nm (Hydroxyzimtsäurederivate) wurde
anschließend im Photometer bestimmt (Pinto et al., 1999).
3.2.6.9 Quantifizierung von phosphorylierten Intermediaten und organischen Säuren
Phosphorylierte Intermediate und organische Säuren wurden aus 50 mg Material durch Mörsern
in 1 mL eiskalter 1 M Perchlorsäure extrahiert. Der Mörser wurde mit 1 mL 0,1 M kalter
Perchlorsäure gespült und die Extrakte vereinigt. Durch Zentrifugation (2 min bei 21000 g und
4°C) wurden Zelltrümmer entfernt, bevor 1,8 mL des Überstandes durch Zugabe von zweimal
50 !L 5 M K2CO3 neutralisiert wurden. Präzipitiertes Kaliumchlorat wurde abzentrifugiert (5 min
bei 21000 g und 4°C) und der Extrakt bei -80°C gelagert. Unmittelbar vor Beladung des
automatischen Probengebers (siehe unten) wurden 200 !L des Extraktes mittels AcroPrepTM
Omega 10K Filterplatten (Pall Corporation, East Hills, USA) filtriert, und innerhalb von 12 h
wurden 10 !L des Filtrats auf einem ICS3000 HPLC System (Dionex, Idstein), welches mit
einem QTrap 3200 Tripel-Quadrupol Massenspektrometer (Applied Biosystems, Foster City,
USA) gekoppelt war, im MRM Modus analysiert. Das System wurde durch das Programm
Chromeleon v6.8 und DCMS-Link v1.1 (Dionex) in Kombination mit Analyst 1.4.1 (Applied
Biosystems) kontrolliert.
Die Substanzen wurden über zwei seriell angebrachte IonPac® AS11HC Säulen (2x250 mm,
Dionex), welche durch eine AG11HC Vorsäule (2x50 mm) geschützt waren, aufgetrennt. Die
Säulenofentemperatur betrug 35°C und der Elutionsgradient wurde mit Wasser (Eluent A) und
100 mM KOH (Eluent B) bei einer Flussrate von 0,25 ml.min-1 folgendermaßen aufgebaut: 0 min
4%, 0-1 min 4%, 1-6 min 15%, 6-12 min 19%, 12-22 min 20%, 22-24 min 23%, 24-27 min 35%,
27-37 min 38%, 37-39 min 45%, 39-44 min 100%, 44-71 min 100%, 71-76 min 4% und
76-80 min 4% Eluent B. Der Lesebereich für die Massen der Vorläuferionen lag zwischen m/z
87 und 606, bzw. 59 und 385 für die Produktionen. Die Ionenquellenparameter waren auf -4500
eV bei 600°C und der Sticktoffgasdruck war auf 20 psi (curtaingas), bzw. 30 psi (gas1) und 20
psi (gas2) eingestellt. Kollisionsgas war auf „mittel“ eingestellt und die Haltezeit für Ionen betrug
75 ms. Die Ionenübergänge der einzelnen Metabolite sind im Anhang zusammengefasst. Die
Gehalte der Metaboliten wurden anhand von Standards berechnet.
36
MATERIAL UND METHODEN
3.2.6.10 Elementaranalyse
Die Gehalte von Kohlenstoff- (C) und Stickstoff- (N) Isotopen wurden aus fein zerriebenem und
gefriergetrocknetem Material mit einem Elementar Analysensystem (Vario EL, Elementar
Analysensysteme, Hanau) im Auftrag an der Leibniz-Universität Hannover bestimmt.
3.2.6.11 Mineralstoffanalyse
Mineralstoffe wurden aus dem gleichen Material, welches für die Elementaranalyse verwendet
wurde, im Auftrag and der Leibniz-Universität Hannover bestimmt. Dazu wurde das getrocknete
Material nach Trockenveraschung (8 h bei 480°C) in 6 M HCl mit 1,5
gew%
Hydroxylammoniumchlorid aufgenommen und in wässrigen 1:10 (v/v) Verdünnungen durch ein
ICP (inductively coupled plasma) Spektrometer (Spectro Analytical Instruments, Kleve) wie
beschrieben analysiert (Fuehrs et al., 2008).
3.2.6.12 Bestimmung von Enzymaktivitäten
Die Aktivitäten der Stickstoffassimilationsenzyme Glutaminsynthetase (GS) und Nitratreduktase
(NR) wurden wie beschrieben bestimmt (Gibon et al., 2004) und auf gFW normiert.
Für die Bestimmung der Phenylalanin-Ammonium Ligase (PAL) Aktivität wurden 50 mg
Blattmaterial in 200 !L Extraktionspuffer (100 mM Borsäure, pH 8,8, 0,1 mM PefaBloc, 5 mM
#-Mercaptoethanol, unlösliches Polyvinylpyrrolidon) homogenisiert und 30 min auf Eis inkubiert.
Nach 30 s Sonifikation wurde die lösliche Fraktion über Sephadex G25 Säulchen entsalzt und
der Proteingehalt wie unter 3.2.6.1 beschrieben bestimmt. Die PAL Aktivität wurde mit 80 !L
Extrakt in Reaktionspuffer (60 mM L-Phe, 40 mM Boratpuffer, pH 8,8, 400 !L Gesamtvolumen)
bestimmt. Der Anstieg in freigesetzter trans-Zimtsäure wurde für 1 h bei 290 nm im
Spektrophotometer verfolgt und anhand einer Eichkurve quantifiziert.
Vakuoläre Invertase wurde aus ca. 50 mg Material extrahiert (500 !L 50 mM Tris / HCl, pH 6.8,
5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 15 vol% Glycerin, 0.1 mM Pefabloc
Proteinase Inhibitor), abzentrifugiert und über Sephadex G25 Säulchen entsalzt. Ein Aliquot
wurde dann in 90 !L 50 mM Acetatpuffer, pH 5,2 in Anwesenheit von 0,1 M Saccharose 40 min
bei 37°C inkubiert und die Reaktion durch 5 minütiges Erhitzen auf 95°C abgestoppt. Der
Reaktionsansatz wurde durch Zugabe von 10 !L 1 M Tris-HCl, pH 8,0 neutralisiert und die
freigewordene Glucose wie in 3.2.6.4 beschrieben quantifiziert. Aus dem Zellwandsediment
wurde die Aktivität der zellwandgebundenen Invertase wie für die vakuoläre Invertase bestimmt.
Die Aktivitäten von Phosphoenolpyruvat Carboxylase (PEPC), NADP-Malatenzym (ME) und
plastidärer
NADP-Glycerinaldehyd-3-phosphat
Dehydrogenase
wurden
wie
beschrieben
bestimmt (Voll et al., 2003).
3.2.6.13 Analyse der Inkorporation von 15N-Nitrat
Die Inkorporation und Verteilung von Nitrat aus dem Boden im Spross wurde wie folgt
analysiert: In kleinen Töpfen (8 cm Kantenlänge) angezogene Maispflanzen wurden 8 dpi mit
37
MATERIAL UND METHODEN
40 mL einer 20 mM KNO3 Lösung, welche mit 20%
15
NO3- angereichert war, gegossen. Die
Probennahme von infizierten Blättern bzw. den korrespondierenden Blättern nicht infizierter
Pflanzen und vom verbliebenen, symptomfreien Spross erfolgte 4, 7, 10, 24 und 48 h nach
Beginn der Markierung mit K15NO3. Das Pflanzenmaterial wurde unter lN2 zu einem feinen
Pulver zerrieben und für die Elementaranalyse (siehe 3.2.6.10) sowie für die Bestimmung des
Markierungsgrades der freien und der proteingebundenen Aminosäuren (siehe 3.2.6.16)
verwendet.
3.2.6.14 Umverteilung von reduziertem Stickstoff aus systemischen Blättern
Für die Analyse der Umverteilung von reduziertem Stickstoff aus systemischen Blättern wurden
100 !L 200 mM 98%
15
N-Harnstoff (versetzt mit 0,05% Silwet L-77 als Netzmittel) gleichmäßig
auf das Blatt (Blatt 3) unterhalb der infizierten Blätter verteilt. Die Markierung erfolgte 8 dpi, als
Tumore bereits voll entwickelt waren. Dreißig Stunden nach Applikation des Harnstoffs wurden
Proben vom markierten und infizierten Blättern (bzw. den korrespondierenden Blättern nicht
infizierter Pflanzen), sowie von den alten und jungen systemischen Blättern separat geerntet
und für die Elementar- und Aminosäureanalyse aufbereitet (siehe 3.2.6.10 und 3.2.6.16).
3.2.6.15 Berechnung der Stickstoffaufnahme durch 15N-Markierungen
Das System für die Elementaranalyse (siehe 3.2.6.10) erlaubt die Diskriminierung zwischen
und
15
15
14
N
N. Stickstoffaufnahme / -import in ein bestimmtes Gewebe ab Beginn der Markierung mit
N wurde über folgende Formel berechnet:
neues N (g.gDW-1) = [(15NGewebe – 15Nnatürlich)/(15NMarkierung – 15Nnatürlich)].NGewebe
wobei
15
NGewebe den Atom %
Abundanz von
15
15
N relativ zum Gesamt-N im Gewebe,
N (0.3663 atom %),
15
NMarkierung die Atom %
15
15
Nnatürlich die natürliche
N in der Markierungslösung und
NGewebe der N-Gehalt des Gewebes (g.gDW-1) ist.
3.2.6.16 Bestimmung der 15N-Anreicherung in freien und proteingebundenen Aminosäuren
Freie Aminosäuren wurden wie unter 3.2.6.4 beschrieben extrahiert. Proteine wurden mit
Extraktionspuffer (50 mM Tris/HCl, pH 7,4; 1 mM EDTA; 0,01% Triton X-100; Roche Complete
Protease Inhibitor Cocktail) extrahiert und durch Zugabe von 4 Volumen Methanol, 1 Volumen
Chloroform und 3 Volumen ddH2O gefällt. Nach Zentrifugation sammelten sich die Proteine an
der Interphase. Nach Entfernen der wässrigen Oberphase wurden weitere 4 Volumen Methanol
dazugegeben, gevortext und die Proteine bei 21000 g für 2 min pelletiert. Das getrocknete
Proteinsediment wurde in 100 !L 6 N HCl, 4% Thioglycolsäure aufgenommen und 24 h bei
110°C hydrolysiert. Die Proben wurden im Vakuumkonzentrator zur Trockne eingeengt und für
die Aminosäureanalytik verwendet (siehe unten).
38
MATERIAL UND METHODEN
Der Gehalt an unmarkierten und einfach markierten Aminosäuren wurde auf einem HPLC-MS
System, welches unter 3.2.6.9 beschrieben ist, jedoch mit einer anderen Säule ausgestattet
war, bestimmt. Zehn !L des gefilterten Extraktes freier oder proteingebundener Aminosäuren
wurden auf einer a C18RP-Acclaim® OA Säule (5 !m, 4x250 mm, Dionex), welche durch eine
Acclaim® OA Vorsäule (5 !m, 4,3x10 mm, Dionex) geschützt wurde, aufgetrennt. Die mobile
Phase wurde durch 50 mM Ammoniumacetat, pH 3,5 (Eluent A), Wasser (Eluent C) und
Acetonitril (Eluent D) bei einer Flussrate von 0,25 mL.min-1 und einer Säulentemperatur von
30°C folgendermaßen hergestellt: 0-2 min 5%A / 95%C, 2-20 min 30%A / 70%C, 20-25 min
30%A / 70%C, 25-35 min 5%A / 55%C / 40%D, 35-45 min 5%A / 5%C / 90%D, 45-50 min 5%A
/ 5%C / 90%D, 50-65 min 5%A / 95%C, 65-75 min 5%A / 95%C. Die Ionisierung erfolgte bei
+5500 eV und 500°C. Der Stickstoffdruck betrug 10 psi (curtaingas), 40 psi (gas1) und 45 psi
(gas2). Das Kollisionsgas war auf „mittel“ eingestellt und die Haltezeit für Ionen betrug 50 ms.
Ionenübergänge, die eine Differenzierung zwischen
14
15
N- und einfach
N-markierten
Aminosäuren ermöglichten wurden anhand der Vorläufer- / Tochterionenübergänge, die aus
unmarkierten Standards abgeleitet wurden, bestimmt und sind im Anhang zusammengefasst.
Um die Anreicherung von
15
N (%15N) in einer bestimmten Aminosäure zu berechnen, wurde die
Peakfläche des „schweren“ Ionenübergangs (A15N) durch die Peakfläche der „schweren“ und
„leichten“ (A14N) Ionenübergänge geteilt. Die natürliche Abundanz von
13
C und
15
N wurde zuvor
aus unmarkierten Extrakten bestimmt, und diese Werte wurden zur Korrektur der markierten
Extrakte verwendet. Die Formel zur Berechnung lautete also
%15 N =
A15N
A15Nref
"100 #
" 100
A15N + A14N
A15Nref + A14Nref
wobei A15Nref und A14Nref aus unmarkierten Referenzproben bestimmt wurden.
!
3.2.6.17
14
CO2 Pulsverfolgungsexperimente
Sechs dpi wurden Tumore und Kontrollblätter mit
14
CO2 markiert, um die Inkorporation von
Kohlenstoff in verschiedene Metabolitfraktionen zu bestimmen.
Dazu wurden je sechzehn 2 cm lange Segmente von Tumoren oder Kontrollblättern
gleichmäßig auf einem Gitter ausgelegt, welches in eine luftdichte Kammer gelegt wurde, deren
Boden mit zwei Lagen, in 10 mL 1M NaHCO3, pH 9,1 getränktem Whatmanpapier (MachereyNagel, Düren) ausgelegt war. Die Blattsegmente wurden während des gesamten Experimentes
durch eine Kaltlichtquelle (KL2500 LCD, Schott, Mainz) gleichmäßig ausgeleuchtet. Die
Markierung mit
14
C wurde durch Injektion von 100 !L NaH14CO3 (25 !Ci) durch ein Septum
gestartet. Nach 45 min wurde der Puls durch Einspritzen von 2 N NaOH und Ausblasen der
Kammer über eine Natronkalksäule gestoppt. Die Blattsegmente wurden in Petrischalen
überführt, welche mit in 5 mL unmarkiertem 1 M NaHCO3, pH 9,1 getränktem Whatmanpapier
ausgelegt waren, und bis zu 180 min im Licht inkubiert. Jeweils vier Segmente von Tumoren
39
MATERIAL UND METHODEN
und Kontrollblättern wurden direkt nach dem Puls und 15 min, 45 min und 180 min nach Beginn
der Verfolgung in Reaktionsgefäße mit jeweils 1 mL 80% Ethanol überführt und wie in 3.2.6.4
beschrieben extrahiert. Aus dem ethanolunlöslichen Sediment wurde Stärke wie beschrieben
extrahiert (siehe 3.2.6.4) und die ethanollösliche Fraktion wurde weiter subfraktioniert.
Die Subfraktionierung der ethanollöslichen Fraktion erfolgte mit Anionen- (Dowex AG 1-X8,
100-200 mesh, BioRad) und Kationenaustauscherharz (Dowex AG 50W-X8, 100-200 mesh,
Bio-Rad), welches 5 cm hoch in Pasteurpipetten gefüllt wurde. Diese Säulchen wurden durch
mehrfaches Spülen mit ddH2O für die Subfraktionierung vorbereitet. Die Austauschersäulchen
wurden so ineinander angeordnet, dass das Eluat des Kationenaustauschers auf die Säule mit
dem Anionenaustauscher tropfte. Die obere Säule wurde mit 300 !L der Ethanolfraktion
beladen (der Durchfluss wurde verworfen) und die neutrale Fraktion wurde mit zweimal 100 !L
und siebenmal 250 !L ddH2O eluiert. Anschließend wurden die Säulen voneinander getrennt
und die Kationenaustauschersäule fünfmal mit 300 !L 5 M NH4OH gespült. Die
Anionenaustauschersäule wurde zunächst mit fünfmal 300 !L 3 M Ameisensäure gespült, um
phosphorylierte Intermediate zu eluieren. Anschließend wurde die Säule fünfmal mit 300 !L
2 M HCl gespült, um Carbonsäuren zu eluieren. Alle Subfraktionen (und die Stärkefraktion)
wurden mit 3 mL Szintillationscocktail (Rotiszint® eco plus, Roth) vermischt und im
Szintillationszähler vermessen.
3.2.6.18 Fütterungsexperimente mit 3H-Asn und 3H-Gln
Die
Aufnahme
und
Metabolisierung
3
von
Gln
und
Asn
in
Tumoren
wurde
über
3
Markierungsexperimente mit H-Gln und H-Asn analysiert. Dazu wurden jeweils vier Blätter,
welche gleich stark ausgeprägte Tumore beherbergten, und vier Kontrollblätter 8 dpi an der
Blattbasis in 5 mM EDTA Lösung mit einer Rasierklinge geschnitten und mit der Schnittkante in
ein Röhrchen gestellt, welches 2,5 mL einer 1 mM 3H-Gln (0,66 !Ci) / 5 mM EDTA Lösung
beziehungsweise einer 1 mM Asn (1,5 !Ci) / 5 mM EDTA Lösung enthielt.
Die Blätter wurden 2 h unter gleichmäßiger Beleuchtung durch eine Kaltlichtquelle markiert. Von
Tumoren, symptomfreien Bereichen in unmittelbarer Nähe zu Tumoren und von Kontrollblättern
wurden
Metabolite
ethanolisch
isoliert
(siehe
3.2.6.4),
welche
anschließend
über
Ionenaustausch-Chromatographie in vier Subfraktionen unterteilt wurden (siehe 3.2.6.17). Aus
dem ethanolunlöslichen Pellet wurde Stärke isoliert und wie beschrieben zu Glucoseeinheiten
verdaut (siehe 3.2.6.4). Alle fünf Fraktionen wurden wie unter 3.2.6.17 im Szintillationszähler
vermessen.
3.2.6.19 Inkorporation von 35S-Methionin in Proteine
Um die Inkorporation von Aminosäuren in Proteine zu bestimmen wurden sieben Tage alte
Maiskeimlinge dreimal im Intervall von zwei Tagen mit 2 mM
35
S-Methionin gegossen und zwei
Tage später wie beschrieben mit U. maydis infiziert. Acht dpi wurden Proben von Tumoren und
von korrespondierenden nicht-infizierten Blättern genommen und unter lN2 zu einem feinen
40
MATERIAL UND METHODEN
Pulver zerrieben. Hundert bis 300 mg des geernteten Blattmaterials wurden mit 500 !L
Extraktionspuffer (50 mM Tris/HCl, pH 7,4; 1 mM EDTA; 0,01% Triton X-100; Roche Complete
Protease Inhibitor Cocktail) vermengt und Proteine wurden durch Zugabe von 500 !L 20%
Trichloressigsäure (TCA) gefällt. Das Pellet wurde zweimal mit 10% TCA gewaschen, und die
Radioaktivität wurde aus den vereinigten Extrakten, welche die freien Aminosäuren enthielten
und aus dem Proteinsediment durch Szintillationzählung bestimmt.
3.2.6.20 Analyse von Phloemexudaten
Phloemexudate wurden 9 dpi von systemischen Blättern (Blatt 3) direkt unter den infizierten
Blättern (Blatt 4 und 5) gesammelt. Dazu wurden die Blätter ca. 2 cm oberhalb der Ligula unter
5 mM EDTA, pH 8 mit einer Rasierklinge geschnitten, um ein Verschließen der Gefäße durch
Kallose zu verhindern. Die Schnittkanten wurden in ein Plastikröhrchen mit 1,5 mL 5 mM EDTA
gestellt und die Blätter ambienter Belichtung (350 !mol.m-2.s-1) ausgesetzt. Die ersten 15 min
der Exudation wurden verworfen und anschließen wurden die Blätter alle 30 min in frische
EDTA-Lösung überführt. Die Exudate wurden schockgefroren und Aminosäuren und Zucker wie
beschrieben bestimmt (siehe 3.2.6.4 und 3.2.6.5). Die Exudationsraten für Saccharose und
Aminosäuren wurde aus dem linearen Bereich der Exudation berechnet.
3.2.6.21 Photosynthesemessungen
Photosynthetische Parameter wurden mit einem kombinierten System zur Bestimmung von
Gaswechsel- und Chlorophyllfluoreszenz-Parametern gemessen (GFS-3000 und MINI-Imaging
PAM Chlorophyll Fluorometer, Walz, Effeltrich). Die CO2 Assimilationsrate (A), stomatäre
Leitfähigkeit für CO2 (gCO2) und der interzelluläre CO2-Partialdruck (ci) wurden nach von
Caemmerer und Farquhar, (1981) berechnet. Die von der Chlorophyllfluoreszenz abgeleiteten
Parameter $PSII (effektive Quantenausbeute) und Fv/Fm (maximale Quantenausbeute von
dunkeladaptierten Blättern) wurden nach Genty et al., (1989), die Quantenausbeute der nichtregulierten Energiedissipation (Y(NO)) nach Kramer et al., (2004) und die nicht-photochemische
energielöschung (NPQ) nach Bilger und Bjorkman, (1990) berechnet. Die Absorptivität (abs)
wurde nach folgender Formel berechnet: abs = 1-R/NIR, wobei R die Signalintensität für
reflektiertes rotes Licht (660 nm) und NIR die Intensität für reflektiertes dunkelrotes Licht (nearinfrared, 780 nm) ist. Die Elektronentransportrate (ETR) wurde dann durch die Formel
ETR = 0,5. $PSII.PFD.abs
berechnet, wobei PFD die Photonenflussdichte in !mol.m-2.s-1 darstellt.
A/ci Kurven von infizierten und von Kontrollblättern wurden bei 10, 20, 50, 100, 350, 750 und
1500 ppm CO2 bei einer PFD von 1500 !mol.m-2.s-1 und einem H2O Anteil von 10000 ppm bei
28°C Blatttemperatur aufgezeichnet.
41
MATERIAL UND METHODEN
Parameter von systemischen, nicht-infizierten Blättern wurden bei 400 und 2200 !mol.m-2.s-1
PFD und 10000 ppm H2O, 350 ppm CO2 und 28°C Blatttemperatur bestimmt.
3.2.7 Statistische Analysen
3.2.7.1 Hypothesentest zur statistischen Analyse von physiologischen Parametern
Statistische Analysen von Metabolitgehalten und physiologischen Parametern wurden mit dem
Welch-Satterthwaite t-Test durchgeführt, welcher in dem Programm VANTED integriert ist
(Junker et al., 2006).
3.2.7.2 Hierarchische Clusteranalyse von Metabolitdaten
Für die hierarchische Clusteranalyse wurde das Cluster 3.0 Programm für Macintosh PCs
verwendet (de Hoon et al., 2004). Die Clusterbäume wurden anschließend mit TreeView
(http://jtreeview.sourceforge.net) visualisiert.
3.2.7.3 Hauptkomponenten Analyse (principle component analysis) von Metabolitdaten
Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) von Metabolitdaten wurde mit dem MarkerView
Programm (Version 1.1.0.7, Applied Biosystems) mit dem integrierten Autoscale Algorithmus
durchgeführt.
42
ERGEBNISSE
4 Ergebnisse
4.1 Globale Analyse des Transkriptoms und der Metabolite U.
maydis-infizierter Pflanzen
Um einen detaillierten Überblick über die Veränderungen, die durch die Infektion von
Maisblättern mit U. maydis und der damit verbundenen Ausbildung von Tumoren zu erhalten,
wurde eine kombinierte Transkriptom- und Metabolitanalyse durchgeführt. Dazu wurden in drei
unabhängigen Anzuchten in einer Hochlicht-Phytokammer (siehe 3.2.1.3) Proben von infizierten
und Kontrollpflanzen 12 hpi, 1 dpi, 2 dpi, 4 dpi, 4,5 dpi und 8 dpi geerntet. Dabei wurde das
infizierte und korrespondierende Blatt Kontroll-behandelter Pflanzen und 8 dpi das erste obere
systemische sink-Blatt, welches keine Infektionssymptome zeigte, beprobt. Darüber hinaus
wurden 4 und 8 dpi Blattbereiche von infizierten Blättern geerntet, die selbst keine
Infektionssymptome aufwiesen. Dasselbe Material wurde für Mikroarrayhybridisierungen sowie
für die einzelnen Metabolitmessungen verwendet, was es ermöglichte, die Daten der beiden
Analysen übereinander zu legen. Die Metabolitanalyse allein ließ keinen Rückschluss darauf
zu, ob bestimmte Metabolite im Wirtsgewebe oder im Pilzgewebe akkumulierten. Eine
mikroskopische Quantifizierung von Pilzgewebe in 8 Tage alten Tumoren zeigte jedoch, dass
das Volumen des Pilzgewebes nur 2,3% des Gesamttumorvolumens ausmachte (Abbildung 7),
weshalb angenommen werden kann, dass der Hauptanteil der quantifizierten Metabolite im
Wirtsgewebe vorlag.
Abbildung 7
Quantifizierung des Pilzmaterials in
Tumoren 8 dpi. Gezeigt ist ein konfokaler Schnitt durch
einen Tumor 8 dpi. Pilzhyphen wurden mit WGA-AF488
gefärbt und konfokale Schnitte angefertigt. Durch die
Generierung einer 3D-Projektion aus den einzelnen
Schnitten konnte anhand dieser Bilderreihe mit dem
Programm Imaris 6.3 der prozentuale Volumenanteil
von U. maydis am Gesamttumor berechnet werden
(siehe 3.2.3.2). Diese Analyse wurde von Gunther
Döhlemann (MPI Marburg) durchgeführt.
4.1.1 Transkriptom- und Metabolitanalyse von Tumoren
4.1.1.1 Übersicht von Veränderungen im Transkriptom von Tumoren
Der verwendete GeneChip® Microarray von Affymetrix beherbergte 17555 probe sets welche
13339 Gene repräsentierten. Da zwischen den unterschiedlichen Maiskultivaren erhebliche
43
ERGEBNISSE
Sequenzunterschiede auftreten, welche Mikroarrayhybridisierungen stören können, wurde
zunächst überprüft, ob eine Hybridisierung verlässlich durchführbar war. Von den probe sets
gaben 70,8% ein signifikantes Signal in mindestens einem der Experimente, 53% gaben in allen
Experimenten ein signifikantes Signal, was die Verlässlichkeit der Hybridisierung unterstrich.
Veränderungen in der Genexpression wurden relativ zur Wasser-behandelten Probe berechnet.
Dabei ergab sich, dass 2891 Gene zu mindestens einem der beprobten Zeitpunkte differentiell
exprimiert waren. Zwölf hpi waren 208 Gene differentiell exprimiert und 1 dpi reduzierte sich die
Anzahl auf 116 Gene. Zu beiden Zeitpunkten war der Großteil der differentiell regulierten Gene
den Kategorien „Stress“ und „Redoxregulation“ zuzuordnen (Abbildung 8). Bereits 2 dpi stieg
die Anzahl an deregulierten Genen auf 575, wobei eine signifikante Anreicherung in den
Kategorien
„Zellwandmetabolismus“,
„Sekundärmetabolismus“,
„Transport“,
„Proteinmetabolismus“ und „Transkription“ zu beobachten war. Vier und 8 dpi (1582 und 2420
regulierte Gene) waren dann auch regulierte Gene in den Kategorien „Lipidmetabolismus“,
„Photosynthese“ und „primärer C-Stoffwechsel“ überrepräsentiert, 8 dpi war dies auch in der
Kategorie „Aminosäuremetabolismus“ der Fall (Tabelle 1). Die größte Anzahl an deregulierten
Genen fand sich 4,5 dpi, als die Proben zu Beginn der Lichtperiode geerntet worden waren.
Abbildung 8
Einteilung von durch U. maydis Infektion regulierten Maisgenen in funktionelle
Kategorien. Die einzelnen probe sets wurden entsprechend den MapMan BINs in Kategorien eingeteilt.
Schwarze und graue Balken repräsentieren die absolute Anzahl an regulierten Genen relativ zu Wasserbehandelten Blättern, wobei die Anzahl der Gene mit bekannten Annotationen in schwarz und
unbekannte Gene in grau dargestellt sind. Farbige Balken zeigen die relative Verteilung von bekannten
Genen innerhalb der BINs (siehe Legende). Die hier gezeigten Transkriptdaten wurden aus der
gemeinsam mit dem MPI Marburg durchgeführten Anzuchten in der Hochlichtkammer erhoben. Die
Kategorisierung der Gene und die statistischen Analysen für diese Abbildung wurden durch Gunther
Döhlemann (MPI Marburg) und Ramon Wahl (TU Karlsruhe) durchgeführt.
44
ERGEBNISSE
Kategorie
12 hpi
1 dpi
2 dpi
4 dpi
4,5 dpi
8 dpi
Stress (biotisch, abiotisch)
3,1E-12*
2,1E-11*
1,9E-11*
2,1E-06*
4,5E-4*
2,5E-10*
Sekundärmetabolismus
5,7E-02
6,1E-06*
4,9E-07*
6,6E-07*
2,1E-03
2,8E-09*
Hormonmetabolismus
5,1E-02
4,2E-02
6,4E-02
3,6E-03
1,1E-02
2,9E-03
Signaltransduktion
3,5E-02
8,9E-02
9,4E-02
5,1E-03
9,5E-03
7,8E-03
Redoxregulation
4,1E-06*
7,3E-02
1,6E-01
1,9E-05*
2,4E-03
3,1E-05*
Zellwandmetabolismus
1,0E-01
2,7E-01
4,5E-06*
6,4E-05*
5,3E-04*
3,0E-09*
Transport
5,1E-02
1,4E-01
1,6E-05*
3,8E-02
2,7E-02
4,2E-02
Aminosäuremetabolismus
5,1E-02
1,5E-01
1,1E-02
2,1E-03
2,4E-02
5,7E-04*
Lipidmetabolismus
9,7E-02
1,4E-01
1,8E-02
2,2E-04*
6,1E-04*
1,5E-05*
primärer C-Stoffwechsel
1,6E-01
2,3E-01
9,8E-02
5,0E-06*
8,6E-03
7,3E-05*
Photosynthese
2,0E-01
3,6E-01
2,1E-02
0,0E-00*
0,0E-00*
0,0E-00*
Proteinmetabolismus
3,3E-03
8,7E-03
3,5E-06*
4,2E-07*
2,9E-08*
2,1E-05*
DNA Metabolismus
2,0E-01
2,4E-01
7,3E-02
2,5E-02
4,7E-02
5,7E-02
Transkription
8,9E-03
4,9E-02
6,2E-06*
1,6E-11*
1,1E-06*
1,1E-10*
zelluläre Organisation
2,5E-02
2,2E-02
9,2E-02
5,8E-02
1,3E-02
3,4E-02
andere
1,7E-02
4,6E-02
1,9E-05*
9,8E-05*
5,1E-03
7,3E-07*
Tabelle 1
Anreicherung von durch die Infektion transkriptionell deregulierten Genen in entsprechenden
funktionellen Kategorien. Die einzelnen probe sets wurden entsprechend den MapMan BINs in
Kategorien
eingeteilt. Überrepräsentationen
von
regulierten
Genen
in
bestimmten
Kategorien
(hypergeometrische Verteilung, p<0,001) sind mit einem Stern markiert und fett hinterlegt. Die
angegebenen Zahlen entsprechen den p-Werten. Die hier gezeigten Transkriptdaten wurden aus der
gemeinsam mit dem MPI Marburg durchgeführten Anzuchten in der Hochlichtkammer erhoben. Die
Kategorisierung der Gene und die statistischen Analysen für diese Tabelle wurden durch Gunther
Döhlemann (MPI Marburg) und Ramon Wahl (TU Karlsruhe) durchgeführt.
Mit fortschreitender Infektion stieg die Anzahl der deregulierten Gene, die mit dem
Wirtsmetabolismus in Verbindung gebracht werden können. Dieser Prozess begann bereits
2 dpi und war am stärksten 4 und 8 dpi ausgeprägt (Abbildung 8 und Tabelle 1). Aus diesem
Grund wurde das MapMan Programm (Thimm et al., 2004, Doehlemann et al., 2008a)
verwendet, um die Regulation einzelner Gene in den entsprechenden Stoffwechselwegen zu
visualisieren (Abbildung 9). Die überwiegende Anzahl an Genen, denen eine Funktion in der
photosynthetischen Elektronentransportkette, dem Photorespirationsweg sowie dem CalvinZyklus zugeordnet werden, waren in Tumoren deutlich herunterreguliert. Auch die Abundanz
der Transkripte der primären Stickstoffassimilation war verringert. Die überwiegende Mehrheit
der Gene mit Stoffwechselfunktion war jedoch in Tumoren induziert. Insbesondere die
Zellwandbiosynthese sowie der Phenylpropanstoffwechsel waren stark induziert, aber auch der
Citratzyklus, die Fermentation, der Aminosäurestoffwechsel und der Lipidkatabolismus waren in
Tumoren transkriptionell induziert.
45
ERGEBNISSE
Zusammenfassend zeigte die Transkriptomanalyse von Tumoren, dass bereits früh im
Infektionsverlauf eine starke Stress- / Abwehrantwort durch U. maydis induziert wurde, sowie
dass der Wirtsmetabolismus trotz transkriptionell reprimierter Photosynthese hoch aktiv war.
Abbildung 9
MapMan-Visualisierung
der
im
Tumor
differentiell
exprimierten
Gene
des
Wirtsmetabolismus. Gezeigt sind signifikant (p<0,001, n=3) hoch (rot) bzw. herunterregulierte (blau)
Gene in sich entwickelnden (4 dpi) und in voll entwickelten Tumoren (8 dpi). Die Kategorisierung der
Affymetrix Genechip® probe sets erfolgte entsprechend den MapMan BINs. Der Grad der Deregulierung
ist in log2-Skala zwischen -3 und 3-facher Veränderung der Trankriptmenge farblich angegeben (siehe
Legende).
46
ERGEBNISSE
4.1.1.2 Clusteranalyse der Metabolitgehalte von Tumoren
Zunächst sollte überprüft werden, ob die Metabolitanalysen der drei unabhängigen Anzuchten
reproduzierbar waren, oder ob die Varianz zwischen den einzelnen Anzuchten größer war als
die durch die Infektion hervorgerufenen Veränderungen. Zu diesem Zweck wurde eine
hierarchische Clusteranalyse durchgeführt (Abbildung 10), in welche die Metabolitgehalte von
Aminosäuren, Kohlenhydraten, Antioxidantien und Stoffwechselintermediaten einflossen. Für
diese Analyse wurden die Mittelwerte der Metabolitgehalte der einzelnen Pools (3-4 Pools pro
Anzucht) herangezogen.
Die Replikate der frühen Zeitpunkte (12 hpi, 1 dpi) gruppierten nicht nach Replikaten
zusammen,
was
darauf
hindeutet
dass
zu
diesen
Zeitpunkten
die
metabolischen
Veränderungen, die durch die Infektion hervorgerufen wurden, minimal waren und / oder die
Metabolitgehalte nicht von der Infektion beeinflusst wurden. Ab dem Heraustreten der Blätter
aus dem Blattkanal (2 dpi) war eine hohe Reproduzierbarkeit der drei Anzuchten zu
beobachten, da die einzelnen Replikate für jeden Zeitpunkt zusammen gruppierten. Aus diesem
Grund wurden für spätere Analysen die Metabolitgehalte über alle drei Anzuchten gemittelt.
Die einzelnen untersuchten Proben teilten sich in zwei Hauptcluster auf: die späten Zeitpunkte
der Kontrollblätter (ab 2 dpi) bildeten einen Arm, die späten Zeitpunkte der infizierten Blätter
sowie die frühen Zeitpunkte infizierter Blätter und Kontrollblätter bildeten den zweiten Hauptarm
(Abbildung 10). Zwölf hpi und 1 dpi befanden sich die Blätter noch im Blattkanal und waren
somit sink Gewebe. Ab 2 dpi traten die Blätter aus dem Blattkanal hervor und ergrünten, was
darauf hindeutet, dass die Blätter ab diesem Zeitpunkt
photosynthetisch aktiv waren.
Physiologisch stellen die beiden Hauptarme des Metabolitclusters also source- und sinkGewebe dar, wobei die infizierten Blätter metabolisch den jungen Blättern ähnelten.
47
ERGEBNISSE
Abbildung 10 Hierarchische Clusteranalyse der Metabolitgehalte von infizierten Blättern. Für die
Clusteranalyse wurden die Metabolitdaten der einzelnen Anzuchten (I bis III) infizierter (SG200) und
Wasser-behandelter Proben (mock) verwendet. Es bildeten sich zwei Hauptarme in denen sich jeweils
Proben Wasser-behandelter (source Gewebe, linker Arm) bzw. infizierter Blätter und frühe
Erntezeitpunkte (sink Gewebe, rechter Arm) wiederfanden. Asc: Ascorbat, E-4-P: Erythrose-4-phosphat,
F-1,6-BP: Fructose-1,6-bisphosphat, F-6-P: Fructose-6-phosphat, G-1-P: Glucose-1-phosphat, G-1,6-BP:
Glucose-1,6-bisphosphat, G-6-P: Glucose-6-phosphat, GSH: Glutathion, 2-OG: 2-Oxoglutarat, PEP:
Phosphoenolpyruvat,
6PG: 6-Phosphogluconat, 3-PG: 3-Phosphoglycerat, PPi: Pyrophosphat, red:
reduziert, Sacch: Saccharose, S-6-P: Saccharose-6-phosphat, Toc: Tocopherol, T-6-P: Trehalose-6phosphat, UDP-Glc: UDP-Glucose, UDP-NAG: UDP-N-Acetylglucosamin,
48
ERGEBNISSE
4.1.1.3 Hauptkomponentenanalyse (PCA) der Metabolitdaten
Da die hierarchische Clusteranalyse zeigte, dass eine hohe Reproduzierbarkeit der einzelnen
Anzuchten erreicht worden war, wurden die Mittelwerte der einzelnen Metabolitgehalte aller drei
Anzuchten für eine PCA verwendet. Dabei gruppierten die Proben, die 12 hpi und 1 dpi geerntet
worden waren, unabhängig davon, ob sie infiziert oder Kontroll-behandelt wurden. Desweiteren
gruppierten die infizierten Proben ab 4 dpi und eine weitere Gruppe wurde durch die nichtinfizierten Proben ab 4 dpi gebildet (Abbildung 11A). Die beiden Hauptkomponenten (PC1 und
PC2) der PCA, bei der alle beprobten Zeitpunkte berücksichtigt wurden, korrelierten mit der
Blattentwicklung Kontroll-behandelter Pflanzen (PC1,
40,7%) sowie mit der Infektion (PC2,
24,5%) (Abbildung 11A, B). Um die mit der Infektion überlappenden Effekte der
Blattentwicklung zu minimieren, wurde eine weitere PCA durchgeführt, welche nur die späten
Infektionszeitpunkte, bei der die Tumorentwicklung bereits eingesetzt hatte (4 dpi, 4,5 dpi,
8 dpi), umfasste (Abbildung 11C, D). Bei dieser PCA waren infizierte und Kontrollproben
deutlich voneinander getrennt und PC1 (54,3%) diskriminierte zwischen infizierten und Kontrollbehandelten Blättern, während PC2 mit dem Tageszeitpunkt korrelierte, zu dem die Proben
geerntet wurden (4 und 8 dpi abends, 4,5 dpi morgens). Dabei hatten die Gehalte an
Aminosäuren (insbesondere die Gehalte an Gln, Phe, Tyr und His) ein starkes Gewicht auf die
infizierten Proben, wohingegen Metabolite der Photosynthese und des C4-Zyklus (3-Phosphoglycerat, Malat, Pyruvat, Phosphoenolpyruvat) ein starkes Gewicht auf die Kontroll-behandelten
Proben hatten (Abbildung 11D). Der voll entwickelte Tumor (8 dpi) wurde insbesondere durch
den Gesamtgehalt an freien Aminosäuren, sowie den Gehalten an Asn, Val und
Kohlenhydraten (Glc, Frc, Saccharose) determiniert.
49
ERGEBNISSE
Abbildung 11 Hauptkomponentenanalyse der Metabolitdaten aus Tumoren und Kontrollblättern.
Metabolitgehalte wurden aus infizierten (inf) und Kontroll-behandelten (mock) Blättern zwischen 12 hpi
und 8 dpi bestimmt. Für die PCA wurden die Mittelwerte aller 3 Anzuchten verwendet und mit dem
MarkerView Programm wie in 3.2.7.3 beschrieben analysiert. A PCA der Metabolitdaten aller beprobter
Zeitpunkte (12 hpi bis 8 dpi). Hauptkomponente 2 (PC2, 24,5%) ist gegen Hauptkomponente 1 (PC1,
40,7%) aufgetragen. PC1 korreliert mit der photosynthetischen Entwicklung Kontroll-behandelter Blätter,
während PC2 zwischen infizierten und Kontroll-behandelten Blättern diskriminiert. B Gewichtung der
einzelnen Metabolite für PC1 und PC2 von allen analysierten Zeitpunkten. C PCA der Metabolitdaten
später Infektionszeitpunkte (4 dpi, 4,5 dpi, 8 dpi). PC1 (54,3%) korreliert mit Tumorentwicklung, PC2
(18,6%) mit der Tageszeit, zur der die Proben geerntet worden sind (4 und 8 dpi abends, 4,5 dpi
morgens). D Gewichtung der einzelnen Metabolite für PC1 und PC2 von späten Infektionszeitpunkten.
Für die Abkürzungen der Metabolite siehe Legende von Abbildung 10.
50
ERGEBNISSE
4.1.1.4 Metabolitgehalte in infizierten und in Kontroll-behandelten Blättern
Die Transkriptomanalyse und die PCA deuteten auf einen stark veränderten Wirtsmetabolismus
hin.
Daher
wurden
die
Gehalte
der
einzelnen
Metabolite
zu
den
verschiedenen
in
drei Gruppen
Infektionszeitpunkten näher betrachtet.
In
nicht
infizierten
Blättern
ließen
sich
die
einzelnen
Metabolite
zusammenfassen: 1. Metabolite, deren Gehalt sich mit der Blattentwicklung nicht veränderte
(Glu, Asp, Pro, Shikimat, Trehalose-6-phosphat, Saccharose, Frc, Fumarat, Isocitrat und der
Gehalt der Summe aller freien AS), 2. Metabolite, die im Verlauf der Blattentwicklung
akkumulierten
(Ala,
Cys,
Stärke,
Saccharose-6-phosphat,
Fructose-1,6-bisphosphat,
3-Phosphoglycerat, PEP, Pyruvat, Malat, Citrat, 2-Oxoglutarat) und 3. Metabolite, deren Gehalt
mit zunehmendem Blattalter abnahm (Asn, Gln, Val, Leu, Ile, His, Gly, Thr, Ser, Arg, Lys, Phe,
Tyr,
Glc,
6-Phosphogluconat,
UDP-Glucose,
Glucose-1-phosphat,
Glucose-6-phosphat,
Fructose-6-phosphat, Ribulose-1,5-bisphosphat, Succinat) (Abbildung 12, grüne Linien). Zu
Gruppe 2 gehören Metabolite, die eine zentrale Rolle in der C4-Photosynthese von Mais
spielen, insbesondere Malat, Pyruvat und PEP. Die starke Akkumulation dieser Metabolite mit
zunehmenden Blattalter korreliert mit der Entwicklung des Blattes zu einem source-Gewebe.
Die starke Abnahme der Gehalte fast aller Aminosäuren (Gruppe 3) wirkte sich nur in geringem
Maße auf den Gesamtgehalt an freien Aminosäuren aus, da Ala mit der Blattentwicklung stark
akkumulierte.
Durch die Infektion mit U. maydis veränderten sich die Gehalte der einzelnen Metabolite im
Verlauf der Tumorentwicklung im Vergleich zur Wasser-behandelten Kontrolle, mit Ausnahme
der Gehalte von Glu, Asp, Saccharose-6-phosphat, Fructose-1,6-bisphosphat und 2-Oxoglutarat (Abbildung 12, orange Linien). Diese Veränderungen gegenüber den Kontrollen ließen
sich in drei Gruppen zusammenfassen: 1. Metabolite die von Beginn der Infektion an im
Vergleich zur Kontrolle im Tumor akkumulierten, 2. Metabolite deren Gehalte im späten
Infektionsverlauf anstiegen und 3. Metabolite die in den Kontrollen mit der Blattentwicklung
akkumulierten, jedoch nicht in Tumoren. Abbildung 12 fasst die Gehalte der Metabolite im
Verlauf der Infektion zusammen, die oben genannten Gruppen sind farblich markiert.
Die Akkumulation von freien Aminosäuren, insbesondere die starke Anreicherung der N-reichen
Aminosäuren Asn, Gln und Arg, sowie die Akkumulation von Hexosen deutete darauf hin, dass
Tumore ein starkes sink für Stickstoff und Kohlenstoff darstellten.
51
ERGEBNISSE
Abbildung 12 Metabolitgehalte
von
U.
maydis-induzierten
Blatttumoren.
A-C
Zeitverlauf
der
Metabolitgehalte in sich entwickelnden Tumoren (orange Linien) und Wasser-behandelten Blättern (grüne
Linien) 1, 2, 4 und 8 dpi. Proben wurden 1 h vor Ende der Lichtperiode geerntet. Die farblichen
Umrandungen repräsentieren die im Text beschriebenen Gruppen (hellrot: Akkumulation von Beginn der
Infektion an, dunkelrot: Akkumulation zu späten Tumorentwicklungsstadien, grün: reduzierte Gehalte in
infizierten Blättern, grau: keine Veränderung durch Infektion). A Gehalte von Aminosäuren. B Gehalte
von Kohlenhydraten. C Gehalte von phosphorylierten Intermediaten und organischen Säuren. Die Daten
sind gemittelt aus allen Replikaten der drei Anzuchten. Die schattierten Bereiche zeigen den
Standardfehler (n=9-12).
52
ERGEBNISSE
4.1.2 Transkriptom- und Metabolitanalyse von symptomfreien Bereichen
infizierter Blätter
Blätter, welche U. maydis induzierte Tumore beherbergten, wiesen meistens auch Bereiche auf,
die keine sichtbaren Symptome zeigen, obwohl sie direkt an Tumore angrenzten. Wie in 3.2.5.1
beschrieben wurden diese Bereiche beprobt und ebenfalls einer Transkriptom- und
Metabolitanalyse unterzogen.
4.1.2.1 Transkriptionelle Veränderungen in symptomfreien Bereichen infizierter Blätter
Die Transkriptomanalyse der symptomfreien Bereiche infizierter Blätter erfolgte wie für die
Tumore beschrieben mit dem Affymetrix Genechip®. Die Genexpression in diesen Bereichen
wurde 8 dpi mit der Genexpression von Wasser-behandelten Blättern 8 dpi verglichen, und es
zeigte sich, dass 23 Gene signifikant (p<0,001) dereguliert waren. Von diesen waren 16
induziert und sieben reprimiert. Damit unterscheiden sich diese Blattbereiche transkriptionell
von Tumoren und ähneln nicht-infizierten Blättern. Aus diesem Grund wurde auf eine
Transkriptomanalyse dieser Blattbereiche 4 dpi verzichtet. Tabelle 2 fasst zusammen, in welche
Kategorien sich die differentiell exprimierten Gene gruppierten.
induziert
reprimiert
Abwehr
2
0
Photosynthese
0
2
Metabolismus
4
4
andere
10
1
Tabelle 2
In
symptomfreien
Bereichen
infizierter
Blätter (8 dpi) signifikant (p<0,001) gegenüber Wasserbehandelter Blätter (8 dpi) deregulierte Gene. Eine Liste
der deregulierten Gene ist im Anhang zu finden.
4.1.2.2 Veränderungen in Metabolitgehalten symptomfreier Bereiche infizierter Blätter
Trotz der geringen Veränderungen auf transkriptioneller Ebene wurde eine Metabolitanalyse der
symptomfreien Bereiche infizierter Blätter 8 dpi sowie 4 dpi durchgeführt. Metabolitgehalte in
symptomfreien Bereichen wurden den Gehalten in Tumoren und in Wasser-behandelten
Blättern gegenübergestellt.
Dabei zeigte sich, dass diese Bereiche metabolisch distinkt von Tumoren waren, aber auch
wenige deutliche Unterschiede im Vergleich zu Kontroll-behandelten Blättern aufwiesen
(Abbildung 13). Die Gehalte der meisten Aminosäuren waren im Vergleich zu Kontrollbehandelten Blättern spätestens 8 dpi reduziert, nur die Gehalte an Lys und Phe waren höher.
Im Gegensatz dazu akkumulierten Hexosen, phosphorylierte Intermediate und organische
Säuren. Die Gehalte an Saccharose-6-phosphat, 3-Phosphoglycerat, PEP, Pyruvat, 2-Oxoglutarat, Fumarat und Succinat überstiegen dabei zu mindestens einem Zeitpunkt die Gehalte,
die in Tumoren gemessen wurden.
53
ERGEBNISSE
Abbildung 13 Metabolitgehalte von symptomfreien Bereichen U. maydis-infizierter Blätter. A-C
Metabolitgehalte in Tumoren (orange), symptomfreien Bereichen (rot) und Wasser-behandelten Blättern
(grün) 4 und 8 dpi. Proben wurden 1 h vor Ende der Lichtperiode geerntet. A Gehalte von Aminosäuren.
B Gehalte von Kohlenhydraten. C Gehalte von phosphorylierten Intermediaten und organischen Säuren.
Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler (n=9-12). Statistisch signifikante Veränderungen sind mit
einem Stern markiert (Welch-Satterthwaite t-Test p<0,05).
4.1.3 Analyse oberer systemischer sink-Blätter
Da das verwendete Infektionsprotokoll dazu führte, dass U. maydis Infektionen lokal auf ein bis
zwei Blätter beschränkt waren, konnten junge systemische Blätter, welche selbst keine
54
ERGEBNISSE
Infektionssymptome aufwiesen, beprobt und bezüglich transkriptioneller und metabolischer
Veränderungen untersucht werden.
4.1.3.1 Transkriptionelle Veränderungen in oberen systemischen Blättern infizierter
Pflanzen
Die Affymetrix Mikroarrayhybridisierungen aus oberen systemischen Blättern ergaben, dass in
diesen Blättern infizierter Pflanzen nur drei Gene signifikant transkriptionell dereguliert waren,
wobei alle drei in systemischen Blättern infizierter Pflanzen reprimiert sind (2,5- bis 5-fach).
Zwei der Gene sind unbekannt, das dritte kodiert für ZRP4, eine O-Methyltransferase.
Trotz der geringen Auswirkung der Infektion auf die Transkription in oberen systemischen
Blättern wurde auch mit diesen Proben eine Metabolitanalyse durchgeführt, da selbst geringe
Veränderungen in der Transkriptmenge signifikante Auswirkungen auf den Metabolismus dieser
Blätter haben könnten.
4.1.3.2 Veränderungen in den Metabolitgehalten oberer systemischer Blätter infizierter
Pflanzen
Die Analyse der Metabolitgehalte wurde wie für die Tumore beschrieben durchgeführt.
Insgesamt wurden nur geringe Veränderungen in oberen systemischen Blättern von infizierten
Pflanzen beobachtet (siehe Anhang), jedoch wurde ein um 20% verringerter Gehalt an löslichen
Zuckern, sowie eine Reduktion in den Gehalten an Asn, Asp, Arg, Pro und Gln um 40-50%
festgestellt (Tabelle 3).
gesamt AS
.
!mol gFW
-1
Asn
.
nmol gFW
Asp
-1
.
!mol gFW
Gln
-1
.
nmol gFW
Glu
-1
.
!mol gFW
Zucker
-1
!mol.gFW-1
Kontrolle
13.8 ± 1.1
236 ± 26
1.5 ± 0.2
282 ± 21
3.0 ± 0.2
34.3 ± 2.8
infiziert
11.3 ± 0.7
134 ± 19*
0.8 ± 0.1*
156 ± 19*
2.8 ± 0.2
27.2 ± 1.6*
Tabelle 3
Gehalte an ausgewählten Aminosäuren und löslichen Zuckern in oberen systemischen sink-
Blättern, welche keine Infektionssymptome aufwiesen. Zucker umfassen Saccharose, Glc und Frc.
Standardfehler sind angegeben (n=10-12) und statistisch signifikante Veränderungen sind mit einem
Stern markiert (Welch-Satterthwaite t-Test, p<0.05).
Die Kombination aus Transkriptom- und Metabolitanalyse zeigte, dass in Tumoren
insbesondere die Photosynthese und damit der zentrale C-Stoffwechsel, sowie der N-Stoffwechsel betroffen waren. Insbesondere Hexosen und freie Aminosäuren, aber auch
Stoffwechselintermediate akkumulierten in Tumoren, was ein Indiz war, dass der Tumor ein
starkes sink für C und N darstellte. Aus diesem Grund sollte die Photosynthese, der zentrale
C-Stoffwechsel sowie der zentrale N-Stoffwechsel im Folgenden eingehender untersucht
werden.
55
ERGEBNISSE
4.2 Photosynthese
und
Kohlenstoffmetabolismus
U.
maydis-
infizierter Pflanzen
Der Infektionsphänotyp von U. maydis auf Maisblättern, also die frühe Ausbildung von
Chlorosen und später die Entwicklung von Tumoren, ließ bereits darauf schließen, dass die
Photosynthese in infizierten Blättern stark beeinträchtigt ist. Die Transkriptom- und
Metabolitanalysen deuteten ebenfalls eine Beeinträchtigung der Photosynthese in Tumoren an
(siehe 4.1). Um tieferen Einblick in die lokale Auswirkung der Infektion mit U. maydis auf die
Photosynthese von Maisblättern zu erlangen, wurde diese mit physiologischen Methoden
untersucht. Da der primäre Kohlenstoffmetabolismus unmittelbar mit der Photosynthese
zusammenhängt, wurde auch dieser eingehender analysiert. Für diese Analysen wurden die
Maispflanzen in Phytokammern bei 350 !E·m-2·s-1 Lichtintensität angezogen.
Im Rahmen dieser Untersuchungen wurde auch die Auswirkung der Infektion mit dem
apathogenen U. maydis Stamm SG200-!clp1, welcher durch einen Zellteilungsdefekt nach der
Penetration der ersten Wirtszelle arretiert ist (Scherer et al., 2006), untersucht. Die Infektion von
Maisblättern
mit dieser Mutante
führte
6
dpi zu
einer Akkumulation
von
Callose
(262 ± 35 !g·gFW-1) im Vergleich zur Infektion mit SG200 (190 ± 24 !g·gFW-1) bzw. zur
Kontroll-Infektion (127 ± 8 !g·gFW-1), was auf eine nicht vollständig supprimierte basale
Abwehrantwort der Wirtspflanze schließen lässt. Auf diese Weise sollte die Frage adressiert
werden, ob Veränderungen im Kohlenstoffmetabolismus ausschließlich auf die Induktion von
Tumorwachstum zurückzuführen sind, oder auch auf eine Abwehrantwort der Pflanze.
4.2.1 Die (C4-)Photosynthese wird durch U. maydis stark beeinträchtigt
4.2.1.1 Gaswechselparameter von infizierten Blättern
Ustilago maydis-induzierte Tumore sind in frühen Entwicklungsstadien noch leicht grünlich,
jedoch ist der Gesamt-Chlorophyllgehalt 6 dpi mit 117 ± 60 !g·gFW-1 10-fach niedriger als in
Wasser-behandelten Blättern (1275 ± 190 !g·gFW-1). Um die maximale photosynthetische
Kapazität und die Aktivität des C4-Zyklus infizierter Blättern zu bestimmen, wurde 4 und 6 dpi
die CO2-Assimilationsrate (A) bei verschiedenen CO2-Konzentrationen bestimmt. Durch die
Auftragung von A gegen die interzelluläre CO2-Konzentration (ci) lässt sich so die in vivo
Aktivität von RubisCO und von C4-Phosphoenolpyruvat-Carboxylase (C4-PEPC) abschätzen
(von Caemmerer, 2000). Bereits ab 4 dpi war die maximale Photosyntheserate bei hohen CO2Konzentrationen in infizierten Blättern signifikant niedriger als in den Kontrollblättern (Abbildung
14 und Tabelle 4). Gleichzeitig war die Aktivität der plastidären Glycerinaldehyd-3-phosphat
Dehydrogenase
in
Tumoren
4-fach
geringer
als
in
Kontrollblättern
(Tabelle
4).
14
CO2-
Konsequenterweise war dadurch die Inkorporation von CO2, welche über ein
Markierungsexperiment bestimmt wurde, von 1352 ± 61 cpm·gFW-1 in Wasser-behandelten
Blättern auf 181 ± 12 cpm·gFW-1 in sechs Tage alten Tumoren reduziert.
56
ERGEBNISSE
Die initiale Steigung der A/ci Kurve, welche als Maß für die C4-PEPC Aktivität gilt, war in
Tumoren deutlich geringer als in Kontrollblättern (Abbildung 14). Dieser Effekt der Infektion auf
die Photosyntheseleistung war auch 6 dpi zu beobachten.
Die !clp1-Mutante verursachte trotz des ausbleibenden Tumorwachstums ebenfalls eine
Verringerung der maximalen Assimilationsrate, die jedoch nicht so stark beeinträchtigt war wie
nach der Infektion mit SG200 (Abbildung 14). Die initiale Steigung der A/ci Kurve war nach
!clp1-Infektion ähnlich stark verringert wie nach SG200-Infektion.
Abbildung 14 Gaswechselanalyse
von
U. maydis-infizierten Blättern. Die maximale
CO2-Assimilationsrate
verschiedenen
(A)
wurde
interzellulären
Konzentrationen
(ci)
bei
CO2-
bei
einer
-2
Photonenflussdichte von 1500 !E·m ·s
-1
und
10000 ppm absoluter Luftfeuchte bestimmt.
A/ci
Kurven
(dunkelgraue
von
Dreiecke),
SG200-infizierten
!clp1-infizierten
(hellgraue Kreise) und Wasser-behandelten
Blättern (schwarze Kreise) wurden A 4 dpi und
B 6 dpi aufgezeichnet. Fehlerbalken zeigen
den Standardfehler (n=4).
Die Reduktion in der apparenten C4-PEPC Aktivität in Tumoren war begleitet von einer 4-fachen
Reduktion der extrahierbaren PEPC-Aktivität und eine 6-fachen Reduktion der NADPMalatenzym-Aktivität (Tabelle 4). Der apparente CO2-Kompensationspunkt (%), also die CO2Konzentration bei der CO2-Erzeugung und Verbrauch gleich hoch sind, war in infizierten
Blättern höher als in Kontrollblättern gleichen Alters (Tabelle 4). Die Reduktion der
Photosyntheserate war von einer Reduktion der stomatären Leitfähigkeit für CO2 begleitet
(Tabelle 4) und SG200-infizierte Blätter wiesen aberrante Stomata und eine ungleichmäßige
Verteilung von Spaltöffnungen auf der Blattoberfläche auf (Abbildung 15).
57
ERGEBNISSE
Wasser-behandelt
Tumor
!clp1
13 ± 1
24 ± 2*
25 ± 2*
15,9 ± 0,6
7,4 ± 0,4*
12 ± 2
214 ± 11
92 ± 9*
95 ± 5
9±1
19 ± 8
24 ± 3*
16,7 ± 0,9
7,0 ± 0,3*
13,7 ± 0,9*
199 ± 9
91 ± 3*
94 ± 13*
24 ± 2
5,8 ± 0,9*
23 ± 2
16 ± 2
2,5 ± 0,4*
13 ± 1
8,6 ± 0,9
2,0 ± 0,3*
6,8 ± 0,6
4 dpi
% (ppm)
Amax (!mol·m-2·s-1)
-2
-1
gCO2 (mmol·m ·s )
6 dpi
% (ppm)
-2
-1
Amax (!mol·m ·s )
-2
-1
gCO2 (mmol·m ·s )
PEPC (U·mgProtein-1)
-1
NADP-ME (U·mgProtein )
plast. GAPDH (U·mgProtein-1)
Tabelle 4
Gaswechselcharakteristik und photosynthetische Markerenzymaktivitäten von Wasser-
behandelten und SG200 bzw. !clp1 infizierten Blättern. Gaswechselparameter wurden 4 und 6 dpi bei
-2
einer Photonenflussdichte von 1500 !E·m ·s
-1
bestimmt. Der apparente CO2-Kompensationspunkt (%)
wurde anhand von A/ci Kurven berechnet, die maximale Assimilationsrate (Amax) entspricht der
maximalen CO2-Assimilation. gCO2: stomatäre Leitfähigkeit für CO2. Der Standardfehler ist angegeben
(n=3-4) Maximal extrahierbare Enzymaktivitäten (PEPC: Phosphoenolpyruvat-Carboxylase, NADP-ME:
NADP-abhängiges Malatenzym, plast. GAPDH: plastidäre Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase)
wurden 6 dpi von Wasser-behandelten Blättern und Tumoren bestimmt. Der Standardfehler (n=6) ist
angegeben. Statistisch signifikante Unterschiede zur Wasser-Kontrolle sind mit einem Stern markiert
(Welch-Satterthwaite t-Test, p<0,05).
Abbildung 15 Zellwand-Epifluoreszenz
der
abaxialen
Maisepidermis
nach
Anregung durch UV-Licht. Gezeigt sind
A, B Wasser-behandelte Blätter und C,
D SG200-infizierte Blätter 4 dpi. A und C
zeigen 100-fache Vergrößerung, B und D
200-fache
Vergrößerung.
Pfeilköpfe
zeigen auf Stomata.
58
ERGEBNISSE
Die Infektion von Maisblättern mit der apathogenen Mutante SG200-!clp1 führte ebenfalls zu
einer Reduktion der maximalen Assimilationsrate und zu einer Erhöhung des CO2Kompensationspunktes, obwohl keine Tumore ausgebildet wurden und das Gewebe nur leicht
chlorotisch war. Insbesondere die stomatäre Leitfähigkeit war genauso stark reduziert wie bei
SG200 Infektion (Tabelle 4). Die Aktivitäten der drei gemessenen Markerenzyme waren im
Vergleich zur Wasser-Kontrolle nicht signifikant reduziert (Tabelle 4).
4.2.1.2 Chlorophyllfluoreszenz-Parameter infizierter Blätter
Im Gegensatz zu den Gaswechselanalysen können durch Chlorophyllfluoreszenz-Imaging
tumorisierte und symptomfreie Bereiche infizierter Blätter separat analysiert werden. Dabei
konnten Tumore und symptomfreie Bereiche aufgrund ihrer Absorptivität, welche mit dem
Gehalt an photosynthetischen Pigmentkomplexen korreliert, und anhand der maximalen
Quantenausbeute im Licht (Fv/Fm), welche ein Maß für die Integrität von Photosystem II ist,
diskriminiert werden (siehe Abbildung 16).
59
ERGEBNISSE
Abbildung 16 Repräsentative Bilder von Chlorophyllfluoreszenz-Parametern von Maisblättern 6 dpi.
Gezeigt sind falschfarben Bilder der Absorptivität (obere Zeile), Fv.Fm (mittlere Zeile) und unkontrollierter
Energieverstrahlung (Y(NO), untere Zeile) Wasser-behandelter (links), SG200-infizierter (mitte) und
SG200-!clp1-infizierter Blätter (rechts). Der falschfarben Kode von 0 (schwarz) bis 1 (violett) ist am
unteren Bildrand angegeben. Tumorisierte (schwarz bis grün) und symptomfreie Bereiche (blau bis
violett) SG200 infizierter Blätter sind in der Absorptivitätsmessung deutlich zu erkennen.
Im Vergleich zu Wasser-behandelten Blättern wiesen Tumore bereits ab 4 dpi eine deutlich
verringerte
Photosystem
Elektronentransportrate
Energielöschung
(NPQ)
II-Integrität
(ETR)
war
auf,
was
widerspiegelte
in
Tumoren
sich
(Tabelle
verringert,
auch
5).
in
Die
jedoch
einer
verringerten
nicht-photochemische
war
die
unkontrollierte
Energieverstrahlung (Y(NO)) erhöht. Sechs dpi waren diese Effekte noch deutlicher. Im
Gegensatz zu den Tumoren ließen sich symptomfreie Bereiche SG200-infizierter Blätter durch
ihre Chlorophyllfluoreszenz-Parameter nicht von Wasser-behandelten Blättern unterscheiden
(Tabelle 5). Eine Infektion mit der !clp1-Mutante hatte auch keinen signifikanten Einfluss auf die
ETR, Fv/Fm oder Y(NO) (Tabelle 5), obwohl zu diesen Infektionszeitpunkten bereits eine
deutliche Reduktion der Assimilationsrate festzustellen war (siehe Tabelle 4 zum Vergleich).
60
ERGEBNISSE
Lediglich 6 dpi war eine signifikante Verringerung von NPQ im Vergleich zu gesunden Blättern
zu beobachten.
Wasser-behandelt
4 dpi
SG200
!clp1
Tumor
symptomfrei
Fv/Fm
0,78 ± 0,01
0,56 ± 0,01*
0,77 ± 0,06
0,77 ± 0,01
NPQ
3,8 ± 0,2
2,7 ± 0,2*
3,1 ± 0,3
3,2 ± 0,2
0,21 ± 0,01
0,28 ± 0,02
0,23 ± 0,01
0,24 ± 0,01
63 ± 2
20 ± 5*
47 ± 10
66 ± 3
Fv/Fm
0,77 ± 0,01
0,52 ± 0,01*
0,73 ± 0,06
0,77 ± 0,02
NPQ
3,4 ± 0,3
2,1 ± 0,3*
2,8 ± 0,2
2,0 ± 0,7*
0,23 ± 0,01
0,33 ± 0,02*
0,26 ± 0,02
0,26 ± 0,01
68 ± 5
n.d.
44 ± 4
66 ± 4
Y(NO)
ETR (!mol·m-2·s-1)
6 dpi
Y(NO)
-2
-1
ETR (!mol·m ·s )
Tabelle 5
Chlorophyllfluoreszenz-Parameter in Wasser-behandelten und SG200- bzw. !clp1-infizierten
Blättern. Chlorophyllfluoreszenz-Parameter wurden 4 und 6 dpi bei einer Photonenflussdichte von
-2
-1
1500 !E·m ·s bestimmt. Bei SG200-infizierten Blättern wurde zwischen infizierten und symptomfreien
Bereichen diskriminiert. Der Standardfehler ist angegeben (n=3-4) und statistisch signifikante
Veränderungen gegenüber Wasser-behandelten Blättern sind mit einem Stern markiert (WelchSatterthwaite t-Test, p<0,05). Fv/Fm: maximale Quantenausbeute dunkeladaptierter Blätter, NPQ: nichtphotochemische Energielöschung, Y(NO): Quantenausbeute der nicht-kontrollierten Energieverstrahlung,
ETR: Elektronentransportrate, n.d.: nicht detektierbar.
4.2.2 Lösliche Kohlenhydrate akkumulieren in Tumoren
Da die Photosynthese in Tumoren stark beeinträchtigt war, sollte dies auch Auswirkungen auf
die Gehalte an Kohlenhydraten haben. Tatsächlich wurden im Rahmen der Metabolitanalyse
stark erhöhte Gehalte an Hexosen in Tumoren gemessen (siehe Abbildung 12B). In einem
Zeitverlauf, der 6 dpi begann, wurden die diurnalen Schwankungen der Gehalte an löslichen
Zuckern (Glc, Frc, Saccharose) und Stärke 7 und 12 h nach Beginn der Lichtperiode, sowie 4
und 9 h nach Beginn der Dunkelperiode bestimmt (Abbildung 17A-C). Für diese Analysen
wurden die Pflanzen bei 350 !E.m-2.s-1 PFD angezogen.
Die Zuckergehalte und die Akkumulation von Stärke in Wasser-behandelten Blättern zeigten
eine diurnale Oszillation und erreichten das Maximum am Ende der Licht- und das Minimum am
Ende der Dunkelperiode. In Tumoren war die maximale Akkumulation von transitorischer Stärke
in der Lichtperiode verringert, jedoch wurde die Stärke während der Dunkelperiode nicht
vollständig abgebaut. Dadurch war der Durchsatz an Kohlenhydraten durch transitorische
Stärke 3,2-fach reduziert im Vergleich zu gesunden Blättern. Der Gehalt an löslichen Zuckern
war hingegen 8 (Mitte der Lichtphase) bis 20-fach (Ende der Dunkelphase) erhöht. Diese
61
ERGEBNISSE
Erhöhung war auf eine Akkumulation von Hexosen (Glc + Frc) zurückzuführen, welche in der
Mitte der Lichtperiode (13 Uhr) ihr Maximum erreichten und deren Gehalt in der zweiten Hälfte
der Dunkelperiode wieder anstieg. Da die Gehalte an Saccharose sich nicht durch die Infektion
veränderten stieg somit das Hexose / Saccharose Verhältnis in Tumoren im Vergleich zur den
Wasser-behandelten Blättern. In SG200-!clp1 infizierten Blättern war keine Veränderung der
Zuckergehalte festzustellen, lediglich eine geringere Akkumulation an Stärke während der
Lichtphase wurde beobachtet (Abbildung 17A-C).
Abbildung 17 Kohlenhydratgehalte in infizierten Maisblättern. A-C Gehalte an Kohlenhydraten im
Tagesverlauf beginnend 6 Tage nach Kontroll-Behandlung (schwarze Linien und Dreiecke), SG200Infektion (dunkelgraue Linien und Rauten) und SG200-!clp1 Infektion (hellgraue Linien und Quadrate).
D-F Gehalte an Kohlenhydraten in der Mitte der Lichtphase 2, 4 und 6 Tage nach Kontroll-Behandlung
(schwarze Balken), SG200 Infektion (dunkelgraue Balken) und SG200-!clp1 Infektion (hellgraue Balken).
Fehlerbalken zeigen den Standardfehler (n=6).
62
ERGEBNISSE
Um herauszufinden, ab welchem Zeitpunkt im Infektionsverlauf Hexosen im Tumor
akkumulierten, wurde der Gehalt an löslichen Zuckern und an Stärke in der Mitte der Lichtphase
2, 4 und 6 dpi analysiert (Abbildung 17D-F). Zwei dpi war der Gehalt an Hexosen in Wasserbehandelten Blättern hoch, während kaum Stärke akkumulierte. Zwei Tage später blieben die
Hexosegehalte hoch und Stärke akkumulierte ebenfalls, während 6 dpi die Hexosegehalte stark
sanken und stattdessen Saccharose akkumulierte. In SG200-infizierten Blättern blieben die
Hexosegehalte über den gesamten analysierten Zeitraum konstant hoch, auch die Gehalte an
Saccharose waren stabil, während Stärke, wie im Zeitverlauf bereits beobachtet, weniger stark
akkumulierte als in Kontrollblättern.
In Maisblättern, welche mit der !clp1-Mutante infiziert worden waren, sank der Hexosegehalt
bereits 4 dpi stark ab, während die Saccharosegehalte 2 und 4 dpi höher waren als in
Kontrollen.
4.2.3 Invertaseaktivität ist in Tumoren stark induziert
Da Hexosen in Tumoren akkumulierten, sollte untersucht werden, ob dies auf die Aktivität von
Invertase zurückzuführen ist. Zu diesem Zweck wurde die Aktivität von zellwandgebundener
Invertase (zwInv) und löslicher saurer Invertase (lösInv) in der Mitte der Lichtperiode 2, 4 und 6
dpi bestimmt. Es zeigte sich, dass die Aktivitäten von zwInv und lösInv im Vergleich zur
Wasser-behandelten Kontrolle in Tumoren bereits 2 dpi 2 bis 3-fach höher waren (Abbildung
18). Vier und 6 dpi waren die Aktivitäten beider Enzymklassen mehr als 10-fach höher als in
Kontrollblättern, wobei zwInv ihre maximale Aktivität 4 dpi erreichte, während lösInv konstant
über den beobachteten Zeitraum anstieg. Im Vergleich dazu sanken die Invertaseaktivitäten mit
zunehmendem Alter in Kontrollblättern. Durch die Infektion mit der apathogenen !clp1 Mutante
stieg lediglich die Aktivität der Zellwandinvertase, jedoch nicht die der löslichen Invertase
(Abbildung 18).
Abbildung 18 Invertaseaktivitäten in U. maydis infiziertem Blattgewebe 2, 4 und 6 dpi. A Zellwandinvertase-Aktivität. B Aktivität von löslicher saurer Invertase. Schwarze Balken: Wasser-behandelte
Blätter, dunkelgraue Balken: SG200 infizierte Blätter, hellgraue Balken: SG200-!clp1 infizierte Blätter.
Fehlerbalken zeigen den Standardfehler (n=5-6).
63
ERGEBNISSE
Bisher sind vier zwInv (Incw1 bis Incw4) und zwei lösInv (Ivr1, Ivr2) aus Mais charakterisiert.
Mikroarray-Analysen zeigten, dass Ivr2 in Tumoren 8 dpi 57-fach induziert war. Da jedoch nicht
alle bekannten Mais-Invertasen auf dem Affymetrix Genechip® vertreten waren, wurde eine
semiquantitative RT-PCR Analyse durchgeführt um die Expression der fehlenden Invertasen zu
überprüfen. In Wasser-behandelten Kontrollen war Ivr1 konstitutiv exprimiert, während
Transkripte von Incw1 2 und 6 dpi und Transkripte von Incw2 nur 2 dpi detektierbar waren
(Abbildung 19). Durch Infektion mit U. maydis SG200 wurde die Transkriptmenge von Ivr1 nicht
verändert, während Incw1 und Incw2 im gesamten analysierten Zeitrahmen in infizierten
Blättern schwach exprimiert waren (Abbildung 19). Die Infektion mit dem apathogenen Stamm
!clp1 hatte keine Auswirkung auf die Expression von Ivr1 und Incw2, während Incw1 wie in
SG200-infizierten Blättern exprimiert war (Abbildung 19). Für Incw3 und Incw4 konnten unter
keinen getesteten Bedingungen Transkripte detektiert werden.
Da die Expression der pflanzlichen Invertasen nur mäßig durch die Infektion beeinflusst war,
wurde auch die Expression der pilzlichen Invertase (UmSUC2) analysiert. Diese wurde in
SG200-infizierten Blättern stark, und in !clp1 infizierten Blättern etwas schwächer exprimiert
(Abbildung 19), was vermutlich auf den, im Vergleich zu SG200, geringeren Anteil an pilzlicher
Biomasse zurückzuführen war. Um zu testen, ob diese pilzliche Invertase in planta im
pathogenen Stamm SG200 induziert ist, wurde deren Expression 2, 4 und 6 dpi im Vergleich
zur Expression in Sporidien verglichen, welche in Minimalmedium mit Glucose als
Kohlenstoffquelle angezogen worden waren. UmSUC2 Transkript war in Sporidien kaum
detektierbar, während dieses Gen in planta induziert war (Abbildung 19B).
Abbildung 19 Semiquantitative RT-PCR Analyse von Invertase-Transkriptmengen. A Expression der
Maisinvertasen Ivr1 (lösInv), Incw1 und Incw2 (beide zwInv) sowie der pilzlichen Invertase UmSUC2 2, 4
und 6 Tage nach Kontroll-Behandlung (K) oder nach Infektion mit SG200 bzw. SG200-!clp1. Als
Ladekontrolle diente Mais Actin 1 (ZmAct1). B Expression von UmSUC2 in SG200 in planta im Vergleich
zur Expression in Sporidien (S), welche in Flüssigkultur mit Glucose als Kohlenstoffquelle kultiviert
worden waren. Als Ladekontrolle diente U. maydis Actin (UmActin).
4.2.4 Untersuchung des Stärke- und Saccharosemetabolismus in Tumoren
Wie die ersten Analysen zeigten war die Photosyntheserate in Tumoren stark reduziert und
lösliche Kohlenhydrate, insbesondere Hexosen, akkumulierten. Um die Auswirkung der
Infektion auf den Stärke- und den Saccharosemetabolismus zu beleuchten, wurden daher die
Transkriptom- und Metabolitdaten auf die entsprechenden Stoffwechselwege abgebildet
(Abbildung 20).
64
ERGEBNISSE
Schlüsselenzyme der Stärkebiosynthese waren transkriptionell in Tumoren reprimiert: Die
plastidäre Isoform der Fructose-1,6-bisphosphatase (Zm.18297.1), sowie ADP-GlucosePyrophosphorylase (Zm.12201.1, AGPase) waren bereits 4 dpi 4,4 bzw. 2,5-fach und 8 dpi
7,5 bzw. 5-fach herunterreguliert. Eine Stärkesynthase (Zm.8277.1) war ebenfalls 4,5 (4 dpi)
bzw. 6,6-fach (8 dpi) herunterreguliert. Jedoch war auch der Stärkeabbau transkriptionell
beeinträchtigt, da das R1-Protein (Zm.2784.1), eine Stärke-Wasser-Dikinase, welche für den
Abbau von Stärke essentiell ist (Yu et al., 2001), 3,5 bzw. 11-fach reprimiert war. Der
Triosephosphat
/
Phosphat-Translokator,
welcher
photosynthetisch
hergestellte
Triosephosphate aus dem Plastiden ins Cytosol transportiert, war 8 dpi 3,5-fach induziert.
Im
Cytosol
war
die
Saccharose-6-phosphat
Synthase,
welche
den
geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Saccharosebiosynthese katalysiert, 2, 4 und 8 dpi
2,9,
3
bzw.
16,8-fach
Saccharosebiosynthese,
reprimiert.
insbesondere
Parallel
dazu
UDP-Glucose.
akkumulierten
Der
Intermediate
Saccharosetransporter
der
SUT1
(Zm.199.1), welcher für das Beladen des Phloems verantwortlich ist (Slewinski et al., 2009), war
8 dpi transkriptionell 5-fach reprimiert. Trotz dieser Beobachtungen akkumulierte Saccharose in
Tumoren, was vermutlich auf einen erhöhten Import an Saccharose (beschrieben von Billet und
Burnett, 1978) und auch auf einen verringerten Export an vorhandener Saccharose
zurückzuführen ist. Die Spaltung der Saccharose, welche zur Akkumulation von Hexosen im
Tumor führt, könnte durch die pilzliche Invertase und lösliche Wirtsinvertase
(siehe 4.2.3),
sowie einer Mais Saccharose-Synthase 1 (Zm.3550.1), welche 4 und 8 dpi 6-fach induziert war,
vermittelt werden.
65
ERGEBNISSE
Abbildung 20 Abbildung der Transkript- und Metabolitdaten von Tumoren und Kontroll-behandelten
Blättern auf den Stärke- und Saccharosemetabolismus. Der Verlauf der Metabolitgehalte während der
Infektion sind für 1, 2, 4 und 8 dpi aus Tumoren (orange) und Kontroll-behandelten Blättern (grün)
gezeigt. Die Umrandungen der Metabolitgehaltgrafiken geben die Veränderung im Tumor gegenüber den
Wasser-behandelten Blättern 8 dpi wider (rot: erhöht, grün: verringert, siehe Legende). Blau umrandete
Metabolite wurden nicht bestimmt. Die 8 dpi differentiell exprimierten Gene sind angegeben und ebenfalls
farblich gekennzeichnet. Die genauen Expressionswerte sind im Text zu finden.
4.2.5 Glyoxylatzyklus und Gluconeogenese in symptomfreien Bereichen
infizierter Blätter und in Tumoren
Wie die Analyse des C-Metabolismus von Tumoren ergab, akkumulierten dort lösliche Zucker.
Dennoch
waren
Metabolitebene
die
symptomfreien
vergleichsweise
Bereiche
minimal
infizierter
verändert
Blätter
(siehe
auf
4.1.2).
TranskriptEine
und
eingehende
Untersuchung der 23 differentiell regulierten Gene in diesen Blattbereichen zeigte, dass das am
66
ERGEBNISSE
stärksten induzierte Gen (138-fach) eine potentielle Isocitratlyase (Zm.18305.1) war, welches
ein Schlüsselenzym des Glyoxylatzyklus ist (Heldt und Piechulla, 2008). Das zweite
Schlüsselenzym dieses Stoffwechselweges ist die Malatsynthase, welche ebenfalls induziert ist
(Malatsynthase 1, Zm.299.1, 8-fach induziert). In Tumoren waren diese Gene hingegen nicht
dereguliert, was auf eine spezifisch erhöhte Aktivität des Glyoxylatzyklus in symptomfreien
Blattbereichen hindeutete. Um dies zu visualisieren wurden die Transkript- und die
Metabolitdaten auf die Stoffwechselwege des Glyoxylatzyklus und der Gluconeogenese, welche
durch den Glyoxylatzyklus gespeist wird, abgebildet (Abbildung 21). Das unmittelbare Produkt
des Glyoxylatzyklus, Succinat, sowie Intermediate der Gluconeogenese (wie PEP und
3-Phosphoglycerat) akkumulierten in symptomfreien Bereichen 8 dpi, jedoch nicht im Tumor
selbst, was die erhöhte Aktivität dieses Stoffwechselweges in diesem Gewebe unterstreicht.
67
ERGEBNISSE
Abbildung 21 Abbildung der Transkript- und Metabolitdaten von symptomfreien Bereichen infizierter
Blätter auf den Glyoxylatzyklus, den Citratzuklus und die Gluconeogenese. Gezeigt sind die 8 dpi
signifikant
regulierten
Gene
(p<0,001)
symptomfreier
Bereiche
infizierter
Blätter
sowie
die
Metabolitgehalte der relevanten Stoffwechselintermediate 4 und 8 dpi von Wasser-behandelten Blättern
(grün), infizierten Blättern (orange) und symptomfreien Bereichen infizierter Blätter (rot). Die Fehlerbalken
der Metabolitwerte zeigen den Standardfehler (n=9-12) und statistisch signifikante Veränderungen in den
Metabolitgehalten im Vergleich zu Wasser-behandelten Blättern sind mit einem Stern markiert (WelchSatterthwaite t-Test, p<0,05).
68
ERGEBNISSE
4.2.6 Kohlenstoff-Flüsse in U. maydis induzierten Tumoren
Wie
die
Untersuchung
der
Metabolitgehalte
von
Citratzyklus-Intermediaten
zeigte,
akkumulierten in Tumoren 8 dpi insbesondere Citrat und Isocitrat (siehe Abbildung 21).
Gleichzeitig ergab die Mikroarrayanalyse (siehe 4.1.1), dass in Tumoren eine als Wurzelisoform
annotierte PEPC (Zm.800.1) 4 dpi 16-fach und 8 dpi 13-fach induziert war. Dieses Enzym ist in
der Lage CO2 in den Citratzyklus einzubringen, wenn Kohlenstoffgerüste für die Biosynthese
anderer Metabolite, zum Beispiel Aminosäuren abgezweigt werden. Aus diesem Grund sollten
die Kohlenstoff-Flüsse in Tumoren anhand eines Fütterungsexperiments mit
14
CO2 genauer
untersucht werden.
Sechs Tage nach Infektion mit U. maydis bzw. nach Kontroll-Behandlung wurden
Blattsegmente mit radioaktivem
12
14
CO2 markiert, gefolgt von einem Puls von 180 min Dauer mit
CO2. Tumore besaßen zu diesem Infektionszeitpunkt noch photosynthetische Aktivität (siehe
4.2.1), so dass die Menge an assimiliertem
14
CO2 für eine Wiederfindungsanalyse hinreichend
sein sollte.
Nach dem
14
CO2-Puls war in gesunden Blattsegmenten der größte Anteil (52%) der
aufgenommenen Radioaktivität in der neutralen Fraktion zu finden, in der vorwiegend Zucker
verbleiben, während je ca. 10% in der Stärke sowie in der kationischen Fraktion wiederzufinden
waren (Tabelle 6). Die kationische Fraktion enthält überwiegend Aminosäuren, da diese unter
den Auftrennungsbedingungen positiv geladen sind. Nur ein geringer Anteil der Radioaktivität
wurde in den anionischen Fraktionen (vorwiegend phosphorylierte Intermediate bzw.
organische Säuren) wiedergefunden. In Tumoren war nach dem Puls weniger Radioaktivität in
der neutralen Fraktion, jedoch proportional mehr in der Fraktion der phosphorylierten
Intermediate und den organischen Säuren als in den Kontrollpflanzen (Tabelle 6). Nach 180 min
Verfolgung war in gesunden Blättern viermal weniger Radioaktivität in der kationischen Fraktion
als nach dem Puls, während mehr
14
CO2 in der neutralen und der Stärkefraktion zu finden war.
In Tumoren hingegen verblieb die Radioaktivität selbst nach 180 min Verfolgung in der
kationischen und den anionischen Fraktionen (Tabelle 6).
69
ERGEBNISSE
Kontrolle
nach Puls
Tumor
nach 180 min
nach Puls
Verfolgung
nach 180 min
Verfolgung
Stärke
12 ± 1
15 ± 2
11 ± 2
22 ± 6
neutral
52 ± 4
56 ± 4
37 ± 10
29 ± 7
kationisch
11 ± 3
2,1 ± 0,1
12 ± 2
9,2 ± 0,7
3,1 ± 0,4
3,8 ± 0,1
11,4 ± 0,3
8,1 ± 0,6
1,6 ± 0,1
0,90 ± 0,02
4,0 ± 0,6
3,4 ± 0,2
phosph.
Intermediate
org. Säuren
Tabelle 6
radioaktivem
Wiederfindung von
14
14
CO2 in unterschiedlichen Metabolitfraktionen nach Markierung mit
CO2 und anschließender Verfolgung mit
12
CO2 in % der Gesamt-CO2-Inkorporation.
Ethanolische Extrakte wurden eingetrocknet, in ddH2O aufgenommen und über Kationen- /
Anionenaustauscherharz fraktioniert. Dabei verblieben rund 20% der Gesamtradioaktivität auf den
Austauschern. Stärke wurde aus der ethanolunlöslichen Fraktion isoliert. Der Standardfehler (n=4) ist
angegeben.
4.3 Stickstoffmetabolismus U. maydis-infizierter Pflanzen
Die Analyse des Transkriptoms und der Metabolite deutete darauf hin, dass die Infektion von
Maisblättern mit U. maydis nicht nur den primären C-Stoffwechsel veränderte, sondern auch
erhebliche Auswirkungen auf den N-Metabolismus von Tumoren hatte, weshalb dieser
eingehender untersucht werden sollte.
4.3.1 Die primäre Stickstoffassimilation ist in Tumoren herunterreguliert
Zunächst wurde anhand der erhobenen Transkriptom- und Metabolitdaten untersucht, ob die
primäre N-Assimilation in Tumoren betroffen war. Dazu wurden die Metabolitgehalte auf die
Transkriptdaten projiziert (Abbildung 22A). Alle Enzyme der N-Assimilation waren in Tumoren (8
dpi) zwischen 4 und 13-fach transkriptionell reprimiert. Mit Ausnahme der Nitratreduktase waren
diese auch schon 4 dpi herunterreguliert. Die reduzierte Transkriptabundanz korreliert mit einer
Reduktion der extrahierbaren Aktivität der beiden Schlüsselenzyme Nitratreduktase und
Glutaminsynthetase (Abbildung 22B). Dabei zeigte sich, dass trotz geringerer Gesamtaktivität
der Aktivierungsstatus der Nitratreduktase in Tumoren (98 ± 21%) bereits 4 dpi höher war als in
Kontroll-behandelten Blättern gleichen Blattalters (62 ± 5%). Dies war auch 8 dpi der Fall
(110 ± 41% in Tumoren, 57 ± 7% in Kontrollblättern). Die Reduktion der extrahierbaren
Glutaminsynthetase-Aktivität in Tumoren ist vermutlich auf die plastidäre Isoform GS2
zurückzuführen, welche 4 und 8 dpi im Tumoren 4,1 bzw. 3,7-fach reprimiert war. Alle vier
cytosolischen Isoformen, die auf dem Mais Genechip® vorhanden waren (gs1-1, gs1-2, gs1-4
und gs1-5), waren nicht transkriptionell reguliert. Die Gehalte an Nitrat und Ammonium in
Tumoren waren ebenfalls reduziert.
70
ERGEBNISSE
Abbildung 22 Darstellung
der primären N-Assimilation in
Blatt-Tumoren auf Transkript-,
Metabolit und Enzymebene. A
Übersicht des primären NAssimilationsweges. Metabolitgehalte
sind
für
Wasser-
behandelte (schwarze Balken)
und infizierte Blätter (weiße
Balken) 4 und 8 dpi gezeigt.
Die Fehlerbalken zeigen den
Standardfehler (n=9-12) und
statistisch
signifikante
Veränderungen sind mit einem
Stern
markiert
(Welch-
Satterthwaite t-Test, p<0,05).
Die relative Veränderung der
Transkriptmengen
der
einzelnen Gene in infizierten
Blättern
relativ
zu
Kontrollblättern wurden dem
Mikroarray-Experiment
ent-
nommen (siehe 4.1.1) und ist
für 4 und 8 dpi jeweils über
bzw. unter den Pfeilen, welche
die
Metabolite
verbinden,
angegeben.
Nrt1.1:
Nitrattransporter,
NAR1S:
Nitratreduktase,
Fd-NiR:
Nitritreduktase,
GS2:
plas-
tidäre Glutaminsynthetase, FdGOGAT:
Ferredoxin-abhän-
gige Glutamatsynthase, AspAT:
Aspartat
Aminotrans-
ferase; AsnS2/S3: Asparaginsynthetase
Isoform
2/3.
B
Aktivitäten der Schlüsselenzyme der primären N-Assimilation. Links: Maximale Nitratreduktase-Aktivität
(in vivo inhibitorische Proteine sind durch Zugabe von EDTA zum Reaktionspuffer inaktiviert). Mitte:
Selektive Nitratreduktase-Aktivität (ist ein Maß für die in vivo aktive Nitratreduktase). Rechts:
Glutaminsynthetase-Aktivität. Fehlerbalken zeigen den Standardfehler (n=6) und statistisch signifikante
Veränderungen sind mit einem Stern markiert (Welch-Satterthwaite t-Test, p<0.05).
71
ERGEBNISSE
Trotz der verringerten Aktivität der primären N-Assimilation im Tumorgewebe, waren AspartatAminotransferase und zwei Isoformen von Asparaginsynthetase (AsnS2, AsnS3) transkriptionell
induziert und Gln und Asn akkumulierten in Tumorgewebe, während die Gehalte an Glu und
Asp unverändert blieben.
Glutamat stellt den zentralen Metabolit des Aminosäurestoffwechsels dar und Glu-Gehalte
bleiben unter den meisten Bedingungen stabil (Stitt et al., 2002, Forde und Lea, 2007). In
U. maydis-infizierten Blättern war die Biosynthese sowie der Katabolismus von Aminosäuren
größtenteils
transkriptionell
induziert
Aminosäureumsatzes vermuten ließ. Das
(siehe
14
Abbildung
9),
was
eine
Erhöhung
des
C-Markierungsexperiment bestätigte dies, da selbst
nach 180 min Verfolgung die Radioaktivität in der kationischen Aminosäurefraktion verblieb
(siehe 4.2.6). Eine erhöhte Interkonversion der einzelnen Aminosäuren könnte daher der
Stabilisierung der Glu-Gehalte dienen.
Tumore wiesen erhöhte Gesamtgehalte an freien Aminosäuren auf (13,6 ± 0,6 !mol·gFW-1
(8 dpi) und 10,4 ± 0,04 !mol·gFW-1 in Wasser-behandelten Blättern gleichen Alters). Ein
Vergleich der Zusammensetzung der freien Aminosäuren in Tumoren mit der in voll
entwickelten
source-Blättern
und
in
jungen
sink-Blättern
zeigte
zudem,
dass
die
Zusammensetzung der Aminosäuren im Tumor eher der im sink-Blatt entsprach und sich
deutlich von der Zusammensetzung im source-Blatt unterschied (Abbildung 23).
Abbildung 23 Vergleich
der
Aminosäure-
Zusammensetzung in sink Blättern (entspricht
1 dpi der Wasser-behandelten Blätter), sourceBlättern (8 dpi Wasser-Behandlung) und voll
entwickelten Tumoren (8 dpi).
Insbesondere der verringerte Anteil an Ala und Ser und die Anreicherung der N-reichen
Aminosäuren Asn, Gln und Arg in Tumoren und in sink-Blättern deutete darauf hin, dass der
Tumor als Stickstoff-sink determiniert war. Dadurch ergab sich die Frage, ob der Tumor
72
ERGEBNISSE
Stickstoff in Form von Aminosäuren importiert, oder ob er seinen N-Bedarf über die primäre
Assimilation von anorganischem Stickstoff deckt.
Die Transkriptom- und Metabolitanalysen, sowie das
14
C-Markierungsexperiment zeigten, dass
in Tumoren ein Ungleichgewicht zwischen verminderter Assimilation anorganischen Stickstoffs
und erhöhter Metabolisierung von Aminosäuren vorherrschte. In den folgenden Experimenten
sollte daher getestet werden, ob die primäre N-Asssimilation ausreicht, um den N-Bedarf von
Tumoren zu decken.
4.3.2 Aufnahme von Nitrat aus der Erde und Allokation im Spross
Die Nitratassimilation in jungen Maispflanzen findet hauptsächlich in den Blättern statt (Oaks,
1992, 1994). Da in Tumoren eine Reduktion der primären N-Assimilation auf transkriptioneller,
metabolischer und enzymatischer Ebene festgestellt wurde (siehe 4.3.1), sollte die Aufnahme,
Assimilation und Allokation von Nitrat durch Markierungsexperimente mit dem stabilen
Stickstoffisotop
15
N direkt bestimmt werden. Infizierte Pflanzen, welche Tumore am 4. Blatt
aufwiesen, und Wasser-behandelte Pflanzen wurden dazu 8 dpi mit K15NO3 gegossen. In einem
48-stündigen Zeitverlauf wurde die Aufnahme von 15N in das Tumorgewebe überwacht.
Da durch das Gießen mit Nitrat die Versorgung der Pflanze mit Stickstoff kurzfristig verändert
wurde, wurde zunächst die Poolgröße der einzelnen Aminosäuren bestimmt. Dazu wurde nicht
zwischen schweren und leichten Aminosäuren diskriminiert. Durch die Düngung der
Kontrollpflanzen mit Nitrat stieg der Gesamtpool an freien Aminosäuren im 4. Blatt transient
stark an (Abbildung 24). Dieser Verlauf war in den Kontrollen für alle Hauptaminosäuren (mit
Ausahme von Asp) zu beobachten. In Tumoren, welche bei den infizierten Pflanzen auf Blatt 4
ausgebildet waren, war diese Akkumulation an freien Aminosäuren verzögert und schwächer
ausgeprägt (Abbildung 24). Die Gehalte an Asn hingegen stiegen ab 24 h nach der Applikation
von Nitrat in Tumoren an, ein Effekt, der nicht in den Kontrollpflanzen beobachtet wurde.
73
ERGEBNISSE
Abbildung 24 Gehalt an freien Aminosäuren in Tumoren und den korrespondierenden Blättern Kontroll15
behandelter Pflanzen nach Düngung mit K NO3. Zeitverlauf der Poolgröße aller freien Aminosäuren und
der 9 Hauptaminosäuren in Tumoren (grau) und entsprechenden Kontrollblättern (schwarz) nach Zugabe
15
von K NO3 zur Erde 8 Tage nach Infektion mit U. maydis bzw. nach Kontroll-Infektion. Die schattierten
Bereiche entsprechen dem Standardfehler (n=3-4).
Bei Betrachtung des
15
N-Markierungsgrades des gesamten Stickstoffpools zeigte sich, dass
15
N
in Tumorgewebe langsamer akkumulierte als in Kontrollblättern (Abbildung 25A), jedoch wurde
auch in den Kontrollblättern keine Sättigung des N-Pools erreicht. Im Gegensatz dazu war der
Markierungsgrad des freien Aminosäurepools in den Kontrollen bereits nach 10 h gesättigt,
wohingegen die freien Aminosäuren im Tumorgewebe weniger stark markiert waren und im
Verlauf des überwachten Zeitraums keine Sättigung des Pools erreichten (Abbildung 25B). Die
Inkorporation von
15
N in Proteine erscheint in Kontrollblättern und in Tumoren linear, jedoch war
der Einbau in die Proteinfraktion in Tumoren geringer (Abbildung 25C), was auf die geringere
Markierung des freien Aminosäurepools in Tumoren zurückzuführen sein könnte.
Die Analyse des
15
N-Markierungsgrades des restlichen Sprosses (Gesamtspross minus
infiziertes Blatt / korrespondierendes Kontrollblatt) zeigte, dass nach 48 h Markierung bei
infizierten Pflanzen der Markierungsgrad der nicht-infizierten Sprossteile bei 7,5 ± 0,4% lag,
wohingegen in den gleichen Sprossteilen von nicht-infizierten Pflanzen 10,4 ± 0,4% des
Stickstoffs markiert war. Dies korreliert mit den Beobachtungen der Metabolitanalyse oberer
systemischer Blätter, in denen die Gehalte an N-reichen Aminosäuren und an löslichen Zuckern
verringert waren (siehe 4.1.3).
Unter den gegebenen Infektionsbedingungen machte der Tumor 9 dpi etwa 40% des
Gesamtgewichtes des Sprosses aus, während das korrespondierende Blatt einer Wasserbehandelten
Pflanze
maximal
15%
ausmachte.
Darüber
hinaus
wogen
tumorisierte
Blattsegmente in diesem Infektionsstadium vier- bis fünfmal mehr als ein gleich langes
Blattsegment nicht-infizierter Blätter. Basierend auf diesen Biomassedaten wurde die Allokation
des neu aufgenommenen Stickstoffs nach Zugabe von K15NO3 berechnet. Dabei ergab sich,
74
ERGEBNISSE
dass in Tumore zwei- bis dreimal mehr Stickstoff importiert wurde, als in das korrespondierende
Blatt nicht-infizierter Pflanzen (Abbildung 25D).
Abbildung 25 Kinetik der
15
N-Inkorporation in
verschiedene Stickstoff-Pools nach Fütterung
15
der Wurzeln mit
-
NO3 . Pflanzen wurden 8 dpi
mit 40 mL 20 mM KNO3 (angereichert mit 20%
15
-
NO3 ) gegossen, und zu den angegebenen
Zeitpunkten nach Markierungsbeginn wurden
Tumore
(graue
Linien)
bzw.
das
korrespondierende Blatt von Kontrollpflanzen
(schwarze
Linien)
beprobt.
Der
Tag-
Nachtrhythmus ist jeweils über den Graphen A
bis
C
angezeigt.
A
Anteil
von
15
N
am
Gesamtstickstoff-Pool, B am Pool der freien
Aminosäuren
und
C
proteingebundener
Aminosäuren in %. Die schattierten Bereiche
zeigen den Standardfehler (n=4). D Prozentuale
Allokation von
15
N in Tumore infizierter Pflanzen
(rechts) und in das korresdondierende Blatt
Kontroll-behandelter Pflanzen (links) 48 h nach
Markierung mit
15
-
NO3 , relativ zur Wiederfindung
im gesamten Spross. Fehlerbalken zeigen den
Standardfehler (n=4).
75
ERGEBNISSE
4.3.3 Der Import von organischem Stickstoff aus systemischen sourceBlättern ist in Tumoren erhöht
Da Tumore trotz der verringerten primären N-Assimilation mehr Stickstoff importierten als
Kontrollblätter, sollte untersucht werden, ob in Tumoren der Import von organischem Stickstoff
aus systemischen source-Blättern erhöht ist. Zu diesem Zweck wurde das systemische Blatt
(Blatt 3) unterhalb des infizierten Blattes (Blatt 4) mit
15
15
N-Harnstoff markiert. Die Verteilung von
N im Spross wurde 30 h nach Markierung untersucht. Dazu wurden das markierte Blatt, das
infizierte bzw. korrespondierende Blatt von Kontroll-behandelten Pflanzen, die unteren
systemischen Blätter (Blatt 1 und 2) sowie die oberen systemischen Blätter (ab Blatt 5) separat
geerntet und aufbereitet.
In Tumoren fand sich absolut dreimal mehr
15
N als in Wasser-behandelten Blättern wieder
(Abbildung 26A). Gleichzeitig wurde in infizierten Pflanzen weniger Stickstoff in die jungen
systemischen Blätter transloziert, als dies bei nicht-infizierten Pflanzen der Fall war. Die
Allokation von Stickstoff vom markierten Blatt zu den älteren Blättern war hingegen nicht durch
die Infektion mit U. maydis betroffen (Abbildung 26A).
Zusätzlich zur Reallokation von organischem Stickstoff im Spross wurde auch der
Markierungsgrad der einzelnen Aminosäurepools in infizierten / Wasser-behandelten Blättern
bestimmt.
15
N reicherte sich in Tumoren fünfmal stärker in den freien Aminosäuren an als in
Kontroll-behandelten Blättern (Abbildung 26B). Während in nicht-infizierten Blättern
15
N
vorwiegend als Glu akkumulierte, war in Tumoren insbesondere Asn stark markiert. Darüber
hinaus war auch ein starker Anstieg des Markierungsgrades in Glu und Gln zu beobachten
(Abbildung 26B).
76
ERGEBNISSE
15
Abbildung 26 Verteilung von
von Maispflanzen nach
15
N im Spross
N-Harnstoff-Applikation
auf das untere systemische source-Blatt 8 dpi.
Blatt 3 (keine Infektionssymptome) wurde mit
100 !L 200 mM 95%
15
N-Harnstoff gleichmäßig
bestrichen. Dreißig Stunden nach Applikation
wurden
die
einzelnen
Blattetagen
der
behandelten Pflanzen separat geerntet (siehe
15
unten und Text) und die Allokation von
bestimmt.
A
exportierten
Sprosses.
Verteilung
Stickstoffs
Die
Werte
des
auf
aus
den
wurden
Blatt
N
3
Rest
des
gegen
den
Markierungsgrad von Blatt 3 korrigiert. Schwarz:
Infiziertes Blatt bzw. korrespondierendes Blatt
Wasser-behandelter
Pflanzen
(Blatt
4),
dunkelgrau: junge, obere systemische Blätter,
hellgrau: alte, untere systemische Blätter (Blatt 1
und 2). B Anreicherung von
15
N in Amino-
säurepools infizierter Blätter (grau) bzw. Kontrollbehandelter
Blätter
(schwarz)
30
h
nach
Markierung. Fehlerbalken zeigen den Standardfehler (n=4) und statistisch signifikante
Ver-
änderungen sind mit einem Stern markiert
(Welch-Satterthwaite t-Test, p<0,05).
Um
zu
zeigen,
dass
aus
infizierten
Blättern
nicht
auch
ein
erhöhter
Export
an
Stickstoffassimilaten zu verzeichnen ist, wurden Tumore am 4. Blatt bzw. Blatt 4 Wasserbehandelter Pflanzen 8 dpi mit
15
N-Harnstoff markiert und die Anreicherung von
15
N im
restlichen Spross 30 h nach der Applikation bestimmt. Weder das infizierte Blatt, noch das
Wasser-behandelte Blatt exportierten Stickstoffassimilate in großen Mengen. Die Anreicherung
an
15
15
N im restlichen Spross war in beiden Fällen nur knapp über der natürlichen Abundanz an
N und somit unter der Detektionsgrenze des Masseanalysators, weshalb die Ergebnisse hier
nicht gezeigt sind.
Zusammenfassend zeigten diese Daten, dass Tumore Stickstoff in organischer Form aus
systemischen source Blättern importieren. Dies wiederum impliziert, dass die systemischen
source-Blätter eine erhöhte Exportrate von Aminosäuren aufweisen müssen.
77
ERGEBNISSE
4.3.4 Export von Assimilaten systemischer source-Blätter nach U. maydis
Infektion
Assimilate wie z.B. Saccharose und Aminosäuren werden in Mais vorwiegend im Phloem
transportiert (Lohaus et al., 1998). Um die Hypothese, dass source-Blätter infizierter Pflanzen
mehr Stickstoff exportieren als source-Blätter gesunder Pflanzen, zu testen, wurden
Phloemexudate dieser Blätter gesammelt und auf ihren Aminosäuregehalt hin untersucht. Um
normale und hohe Stickstoffverfügbarkeit wie in den
15
N-Markierungsexperimenten zu
simulieren, wurden die Exudate von unbehandelten, sowie von Harnstoff-markierten Blättern
gesammelt. Die Harnstoffbehandlung erfolgte wie für die
Analyse
der
Phloemexudate.
Unter
beiden
15
N-Analyse beschrieben 30 h vor der
experimentellen
Bedingungen
war
die
Exudationsrate von Aminosäuren aus Blatt 3 infizierter Pflanzen zweimal höher als aus dem
gleichen Blatt Kontroll-behandelter Pflanzen (Tabelle 7). Die Behandlung mit Harnstoff führte
lediglich
zu
einem
proportionalen
Anstieg
der
Aminosäureexudation
unter
beiden
Infektionsbedingungen. Auch die Exudationsrate von Saccharose war durch die Infektion in
beiden Stickstoff-Regimes erhöht, wenn auch nicht statistisch signifikant (Tabelle 7). Allerdings
konnte dieses Experiment in einer unabhängigen Anzucht mit gleichen Ergebnissen wiederholt
werden (Daten nicht gezeigt).
normale N-Verfügbarkeit
Kontrollbehandelt
AS-Exudationsrate
-1
-1
(nmol!gFW !h )
Saccharoseexudations-1
-1
rate ("mol!gFW !h )
Tabelle 7
infiziert
hohe N-Verfügbarkeit
Kontrollbehandelt
infiziert
26 ± 5
47 ± 7*
36 ± 6
83 ± 17*
208 ± 43
252 ± 52
255 ± 41
307 ± 50
Phloemexudationsraten von Aminosäuren (AS) und Saccharose von Blatt 3 infizierter (Blatt
4 beherbergte Tumore) und Kontroll-behandelter Pflanzen 9 dpi. Phloemexudate wurden unter hoher
Stickstoffverfügbarkeit (Behandlung von Blatt 3 mit 100 !L 200 mM Harnstoff 30 h vor der Analyse der
Exudate) und normaler Stickstoffverfügbarkeit (keine Vorbehandlung des 3. Blattes) gesammelt. Gezeigt
ist der Standardfehler (n=6) und statistisch signifikante Veränderungen in infizierten Pflanzen sind mit
einem Stern markiert (Welch-Satterthwaite t-Test, p<0.05).
Die Zusammensetzung des Aminosäure-Pools im Phloem von Blatt 3 war nach Infektion des 4.
Blattes mit U. maydis nur leicht verändert: Im Phloem infizierter Pflanzen war mehr Ala zu
finden, jedoch weniger der meisten nicht-zentralen Aminosäuren, sowie, unter normaler
Stickstoffverfügbarkeit, weniger Gly und mehr Gln als in Kontrollen (Abbildung 27 und Anhang).
Die Aminosäure-Zusammensetzung des Phloems systemischer source-Blätter war somit
deutlich anders als die Zusammensetzung in Tumoren oder in gesunden Blättern (siehe
Abbildung 23 und Abbildung 27 zum Vergleich), was darauf hindeutet, das die hier bestimmten
78
ERGEBNISSE
Aminosäuren
spezifisch
in
das
Phloem
geladen
werden
und
nicht
lediglich
die
Aminosäurezusammensetzung der Zellen widerspiegelten.
Abbildung 27 Aminosäurezusammen
setzung des Phloems, welches aus
dem unbehandelten systemischen Blatt
(Blatt 3) direkt unterhalb des infizierten
/
Wasser-behandelten
Blattes
gesammelt wurde. Im Anhang sind die
prozentualen
Anteile
der
einzelnen
Aminosäuren und die Standardfehler in
tabellarischer Form aufgeführt.
Eine erhöhte Exudationsrate von Assimilaten könnte darauf hindeuten, dass generell ein
erhöhter Phloemfluss in die infizierten Blätter vorherrscht. Aus diesem Grund wurde die
Akkumulation Phloem-mobiler Mineralien in Tumoren untersucht.
4.3.5 Phloem-mobile Mineralien akkumulieren in Tumoren
Der Ferntransport von Mineralien erfolgt in höheren Pflanzen entweder über das Phloem oder
das Xylem. Einige Mineralien können effektiv in beiden Gefäßsystemen transportiert werden,
während andere spezifisch im Phloem (z.B. Kalium, Magnesium oder Phosphor) bzw. Xylem
(z.B. Eisen und Calcium) transportiert werden (Marschner, 1997). Die Akkumulation dieser
spezifisch transportierten Mineralien in einem bestimmten Gewebe ist ein Anhaltspunkt für die
Flussrate der entsprechenden Langstrecken-Transportwege in dieses Organ (Marschner,
1997).
In Tumoren akkumulierten 8 dpi die Phloem-mobilen Mineralien K (1,8-fach) und P (3,1-fach),
während die Gehalte der Xylem-mobilen Mineralien Ca und Fe um 75% bzw. 40% geringer
waren als in Wasser-behandelten Blättern (Tabelle 8). Der Gehalt an Mg war, im Vergleich zu
Kontrollblättern, in Tumoren leicht reduziert.
mg.gDW-1
Fe
Ca
Mg
Kontroll-behandelt
0.060 ± 0.004
18.1 ± 0.8
Tumor
0.037 ± 0.004 *
2.7 ± 0.2 ** 1.4 ± 0.1 *
Tabelle 8
.
1.8 ± 0.1
P
K
3.8 ± 0.2
31 ± 1
11.8 ± 0.5 **
54 ± 3 **
-1
Gehalt (in mg gDW ) an Xylem-mobilen (Fe und Ca) sowie Phloem-mobilen (Mg, P und K)
Mineralien in Tumoren und Kontrollblättern 8 dpi. Der Standardfehler ist angegeben (n=4) und statistisch
signifikante Veränderungen sind mit Sternen markiert (Welch-Satterthwaite t-Test, * p<0,05; ** p<0,005).
79
ERGEBNISSE
4.4 Photosynthetische
Aktivität
systemischer
source-Blätter
infizierter Pflanzen
Die Assimilation von Kohlenstoff und Stickstoff ist ein energieverbrauchender Prozess. Diese
Energie wird in Blättern im Licht über die Photosynthese bereitgestellt. Eine erhöhte Exportrate
an Assimilaten sollte daher durch eine erhöhte photosynthetische Aktivität der source-Blätter
getrieben werden. Aus diesem Grund wurden die photosynthetische CO2-Assimilationsrate (A)
sowie die Elektronentransportrate (ETR) des 3. Maisblattes zu unterschiedlichen Zeitpunkten
nach Infektion mit U. maydis bestimmt, wenn sich Tumore auf dem 4. und 5. Blatt befanden.
Um die Photosyntheserate unter Anzuchtbedingungen und die maximale Photosyntheserate
(also die photosynthetische Kapazität) zu bestimmen, wurden A und ETR bei ambienter
(400 !E·m-2·s-1) und bei sättigender Lichtintensität (2200 !E·m-2·s-1) gemessen.
Insbesondere bei Betrachtung der maximalen Photosyntheserate zeigte sich, dass die
Photosynthesekapazität in systemischen source-Blättern infizierter Pflanzen signifikant höher
war als im korrespondierenden Blatt Kontroll-behandelter Pflanzen (Abbildung 28A). Die ETR
und A des 3. Blattes sanken in Kontrollpflanzen bereits zwischen 5 und 7 dpi, was 15
beziehungsweise
17
Tage
nach
der
Aussaat
entsprach.
Diese
Reduktion
in
der
photosynthetischen Kapazität war im korrespondierenden Blatt infizierter Pflanzen verzögert,
was dazu führte, dass sie ab 7 dpi im direkten Vergleich eine höhere Kapazität aufwiesen als
die Blätter nicht-infizierter Pflanzen (7 dpi: 20-25%, 8 dpi: 30%, 11 dpi: ~60% höher). Dieser
Effekt war auch bei ambienter Lichtintensität zu beobachten, wenn auch nicht so stark
ausgeprägt (Abbildung 28B).
Abbildung 28 Photosynthetische
Pa-
rameter in älteren systemischen Blättern
U. maydis-infizierter Maispflanzen. Die
CO2-Assimilationsrate (A) und Elektronentransportrate (ETR) des Blattes direkt
unterhalb der infizierten Blätter (Blatt 3,
Blatt 4 und 5 beherbergten Tumore)
wurden bei A sättigender Lichtintensität
-2
(2200
-1
!E·m ·s )
und
B
-2
ambienter
-1
Lichtintensität (400 !E·m ·s ) bestimmt.
Schwarze
Balken:
behandelter
Blatt
Pflanzen,
3
graue
WasserBalken:
Blatt 3 infizierter Pflanzen. Fehlerbalken
zeigen
den
Standardfehler
(n=6).
Statistisch signifikante Unterschiede sind
mit
einem
Satterthwaite
Stern
markiert
(Welch-
t-Test, p<0,05).
80
ERGEBNISSE
Da die Reduktion der photosynthetischen Aktivität in älteren systemischen Blättern von
Kontrollpflanzen vermutlich auf einsetzende Seneszenz zurückzuführen war, wurden aus
diesen
Blättern
(und
den
korrespondierenden
Blättern
infizierter
Pflanzen)
die
Transkriptmengen der Seneszenzmarker ZmSee1 und ZmSee2b in zwei biologischen
Replikaten über qRT-PCR bestimmt. Während die Expression beider Gene in Blatt 3 Kontrollbehandelter Pflanzen mit zunehmenden Blattalter stark anstieg, fiel die Induktion im gleichen
Blatt infizierter Pflanzen deutlich geringer aus (Abbildung 29A-D). Vierzehn dpi war auch der
Seneszenz-assoziierte Chlorophyllverlust dieser Blätter in infizierten Pflanzen deutlich geringer
(Abbildung 29E).
Abbildung 29 Expression von Seneszenzmarkern in älteren systemischen Blättern (Blatt 3) von
Pflanzen, die auf Blatt 4 und 5 Tumore ausbildeten. Die relative Expression der Seneszenzmarker
ZmSee1 (A, B) und ZmSee2b (C, D) wurde relativ zur Expression der cytosolischen Glycerinaldehyd-3phosphat Dehydrogenase in zwei biologischen Replikaten zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach
Infektion mit U. maydis (hellgrau) bzw. nach Kontrolll-Behandlung (dunkelgrau) bestimmt. E Jeweils zwei
repräsentative untere systemische Blätter (Blatt 3, 14 dpi) von Kontrollpflanzen (links) und U. maydis
infizierten Pflanzen (rechts).
Wie bereits gezeigt, ist die photosynthetische Kapazität in infizierten Blättern bereits früh im
Infektionsverlauf reduziert (siehe 4.2) und infizierte Pflanzen zeigen einen verringerten Wuchs
als nicht-infizierte Pflanzen. Das Signal für die verzögerte Seneszenz könnte also einerseits
durch die Etablierung des Tumors, oder durch die Verringerung der Biomasse von
photosynthetisch aktiven Organen hervorgehen. In beiden Fällen kommt es zu einer
Verschiebung der sink-source Verhältnisse der ganzen Pflanze. Um diese Frage zu
81
ERGEBNISSE
adressieren, wurden photosynthetische Parameter des 3. Blattes von Pflanzen, bei denen alle
jüngeren Blätter (ab Blatt 4) mit Aluminiumfolie abgedeckt wurden, bestimmt. Durch das
Abdecken sollte eine Verringerung der source-Biomasse simuliert werden. Es zeigte sich
jedoch, dass die abgedeckten Blätter weiterhin wuchsen und somit ein starkes sink-Organ
darstellten, da das Wachstum dieser abgedeckten Blätter nur durch den Import von Assimilaten
aus nicht-abgedeckten Blättern gespeist werden konnte.
So war auch in Blatt 3 dieser abgedeckten Pflanzen eine Verzögerung der Seneszenz zu
beobachten, was sich im
Vergleich zu unbehandelten Pflanzen in einer erhöhten
photosynthetischen Kapazität ausprägte (Tabelle 9). Tatsächlich führte das Abdecken der
jüngeren Blätter zu einer noch höheren Photosynthesekapazität unterer systemischer Blätter als
die Infektion mit U. maydis.
-1
-2
A (!mol·s m )
-1
-2
ETR (!mol·s m )
Tabelle 9
Wasser-behandelte Pflanzen
infizierte Pflanzen
abgedeckte Pflanzen
13 ± 1,4
20 ± 1,2*
21,0 ± 0,6*
39 ± 3
59 ± 6*
74 ± 6*
Photosynthetische Kapazität des 3. Blattes von Kontroll-behandelten, U. maydis infizierten
(Tumore an Blatt 4 und 5) und mit Alufolie abgedeckten Pflanzen (ab Blatt 4). Photosyntheseraten
-2
-1
wurden bei sättigender Lichtintensität (2200 !E·m ·s ) bestimmt. Der Standardfehler (n=6) ist
angegeben und statistisch signifikante Unterschiede zu Wasser-behandelten Pflanzen sind mit einem
Stern markiert (Welch-Satterthwaite t-Test, p<0,05).
Die Expression von Seneszenzmarkern wurde auch in Blatt 3 von Pflanzen bestimmt, welche
durch U. maydis-Mutanten mit verringerter Virulenz infiziert worden waren, um zu klären, ob die
Ausprägung des Tumors Einfluss auf die Seneszenz dieser Blätter hat. SG200-!19A-infizierte
Blätter wiesen trotz Pilzproliferation keine Tumorbildung auf und SG200-!nit2-infizierte Blätter
beherbergten nur kleine Tumore (Abbildung 41, siehe 4.6 für die detaillierte Charakterisierung
dieser Mutante).
Während die Seneszenzmarker ZmSee1 und ZmSee2b in SG200-infizierten Pflanzen 14 dpi
wie in der vorangegangenen Analysen weniger stark exprimiert waren als in Kontrollbehandelten Pflanzen, war die Expression dieser Marker nach Infektion mit beiden Mutanten
höher als in Kontrollpflanzen (Tabelle 10).
82
ERGEBNISSE
Wasser-behandelte Pflanzen
SG200
SG200-!19A
SG200-!nit2
ZmSee1
1,0 ± 0,1
0,39 ± 0,06
12 ± 7
3,7 ± 0,6
ZmSee2b
1,0 ± 0,1
0,58 ± 0,05
11 ± 7
2,1 ± 0,4
Tabelle 10 Expression von Seneszenzmarkern in älteren systemischen Blättern (Blatt 3) von Pflanzen,
deren
4.
Blatt
Seneszenzmarker
mit
Mutanten
ZmSee1
verringerter
und
ZmSee2b
Pathogenität
wurde
relativ
infiziert
zur
waren.
Die
Expression
Expression
der
der
cytosolischen
Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase 14 dpi bestimmt. Angegeben ist die Veränderung der
Transkriptmenge relativ zu Wasser-behandelten Pflanzen. Der Standardfehler von drei biologischen
Replikaten ist angezeigt.
4.4.1 Transkriptomanalyse von unteren systemischen Blättern
Da systemische source-Blätter infizierter Pflanzen einen erhöhten Export an Assimilaten
aufwiesen, sollten Transporter, die das Phloem beladen, in Leitbündeln stärker exprimiert sein.
Zu diesem Zweck wurden Leitbündel und Bündelscheidenzellen des 3. Blattes infizierter und
Kontroll-behandelter Blätter durch differenzielles Zerreiben der Blätter angereichert (siehe
3.2.5.2) und über Agilent-Mikroarrays untersucht. Von den 1070 differenziell exprimierten
Genen waren 767 in Leitbündeln infizierter Pflanzen induziert und 303 reprimiert.
Das mit 91-fach am stärksten induzierte Gen war ein Bowman-Birk Typ Trypsin Inhibitor-Protein
(ACG30455), das mit der Pathogenabwehr in Verbindung gebracht wird (Birk, 1985). Generell
waren neun der 27 Gene, welche mehr als 20-fach induziert waren, mit Abwehr in Verbindung
zu bringen (darunter PR-1-ähnliche, PR-5 (Thaumatin-ähnliche Proteine) und PR-6,
siehe
Tabelle 11 für eine Liste der über 20-fach induzierten Gene) und auch Chitinasen sowie 1,3Endoglucanasen waren induziert.
83
ERGEBNISSE
Expressionsänderung
Sonde
Annotation
Accession Nr.
infiziert / Kontrolle
P_OptiV1C06993
Bowman-Birk-Typ Trypsin Inhibitor
ACG30455
91,15
P_OptiV1S23249
LRR-Familien Protein
NP_001068098
90,83
P_OptiV1S19844
PR-5
NP_001105702
62,8
P_OptiV1N35520
hypothetisches Protein
EU960569
60,86
P_OptiV1N41548
mRNA Sequenz
EU942444
57,31
P_OptiV1S29207
hypothetisches Protein
EEE58977
51,23
P_OptiV1S32125
Braunfäule-assoziiertes Protein p12
ACG30415
44,8
P_OptiV1N38795
mRNA Sequenz
BG840124
44,56
P_OptiV1C09038
CBL-interagierende
ACF86984
42,84
Serin/Threonin-
Proteinkinase 15
P_OptiV1C09440
Lichenase 2
ACG31574
39,14
P_OptiV1C10663
hypothetisches Protein
NP_001136613
35,59
P_OptiV1S23420
unbekannt
ACN31524
28,56
P_OptiV1C00683
Thaumatin-ähnlich
ACF86163
28,52
P_OptiV1C15709
putative Flavonoid Glycosyltransferase
BAD09418
26,73
P_OptiV1N36523
mRNA Sequenz
FL464235
25,83
P_OptiV1S31060
Jasmonat-induziertes Protein
ACG39397
25,3
P_OptiV1S26565
Hydrolase
ACG42985
25,1
P_OptiV1C09616
LRR-Protein
AAS48163
24,39
P_OptiV1S23430
Lichenase-2
ACG38761
22,8
P_OptiV1S27128
PR Protein Klasse I
ACJ62486
22,41
P_OptiV1C08208
unbekannt
unbekannt
22,31
P_OptiV1S19080
PR-6
ABB04441
21,65
P_OptiV1S25007
Hydrolase
ACG42985
21,44
P_OptiV1C05850
hypothetisches Protein
NP_001130494
21,34
P_OptiV1C10868
unbekannt
ACF82996
20,95
P_OptiV1C12709
Polyaminoxidase 1
NP_001105106
20,75
P_OptiV1C03876
Thaumatin-ähnliches Protein
NP_001050832
20,5
Tabelle 11 Liste der in Blatt 3 infizierter Pflanzen über 20-fach induzierten Gene. Die Transkriptmengen
in Blatt 3 infizierter Pflanzen ist relativ zu den Transkriptmengen in Blatt 3 von Kontrollpflanzen
angegeben (x-fache Expressionsänderung).
Die Transkriptomanalyse ergab ebenfalls, dass Komponenten des Stickstoff-Anabolismus in
infizierten Pflanzen induziert waren. So war der Marker für die primäre N-Assimilation,
Nitratreduktase in systemischen source-Blättern infizierter Pflanzen 2,8-fach induziert.
Gleichzeitig waren Gene der Methionin- (O-Succinylhomoserine-Sulfhydrylase, 17,7-fach) und
der Prolinbiosynthese ($-1-Pyrroline-5-carboxylate-Synthetase, 11-fach), sowie eine AlaninAminotransferase (5,5-fach) induziert. Desweiteren sind in diesen Blättern ein hochaffiner
Nitrattransporter (NRT2.5) stark, sowie eine Aminosäurepermease und ein Lys/His Transporter
leicht induziert (Tabelle 12).
84
ERGEBNISSE
Weitere induzierte Transporter sind ein Kaliumtransporter, von dem bekannt ist, dass sein
Reishomolog unter Kaliummangel induziert ist, sowie ein Kohlenhydrattransporter, der
Homologie zu Mannitoltransportern aufweist. Desweiteren sind zwei ABC Transporter mit
unbekannter Substratspezifität und ein Nodulin-Familien-Protein, welches Homologie zu Nitrat /
Chlorid Transportern aufweist, transkriptionell induziert (Tabelle 12).
Sonde
Annotation
Accession
Expressionsänderung
P_OptiV1C16897
Kaliumtransporter-ähnlich
BAD87321
13,6
P_OptiV1C14902
Nitrat Transporter NRT2.5
ABG20828
9
P_OptiV1S31418
Mannitoltransporter-ähnlich
ACG42661
6,6
P_OptiV1C11952
MDR-ähnlicher ABC-Transporter
BAA96612
2,6
P_OptiV1S18125
Aminosäurepermease
ACG29947
2,5
P_OptiV1C17286
LHT1 (Lys/His Transporter)
ACG28821
2,4
P_OptiV1C14154
PDR-ähnlicher ABC-Transporter
CAD59574
2,3
P_OptiV1C09288
Nitrat und Chlorid Transporter
ACG45446
2,1
Tabelle 12 In systemischen source-Blättern infizierter Pflanzen induzierte Transporter. Die Expression
in Blatt 3 infizierter Pflanzen ist relativ zur Expression in Blatt 3 von Kontrollpflanzen angegeben (x-fache
Expressionsänderung).
Unter den in infizierten Pflanzen reprimierten Genen befanden sich eine große Anzahl von
Cellulosesynthasen sowie ein Cellulosesynthase-ähnliches Gen (Tabelle 13). Gleichzeitig ist
auch das Gen, welches für das Brittle-stalk2-Protein kodiert und in Zusammenhang mit dem
Aufbau der Sekundärzellwand in Leitbündeln steht (Ching et al., 2006), reprimiert.
Sonde
Annotation
Accession
Expressionsänderung
P_OptiV1C11370
Cellulosesynthase 11
NP_001105236
-6,8
P_OptiV1C00218
Brittle stalk2
NP_001105928
-5,5
P_OptiV1S21171
Cellulosesynthase 1
NP_001104954
-3,6
P_OptiV1S31852
Cellulosesynthase-ähnlich
ACG29149
-2,9
P_OptiV1C01171
Cellulosesynthase 8
NP_001104958
-2,8
P_OptiV1C12150
Cellulosesynthase 7
NP_001104957
-2,2
P_OptiV1C08927
Cellulosesynthase 9
NP_001104959
-2,1
Tabelle 13 Zellwand-assoziierte Gene, die in systemischen source-Blättern infizierter Pflanzen
transkriptionell herunterreguliert sind. Die Expression in Blatt 3 infizierter Pflanzen ist relativ zur
Expression in Blatt 3 von Kontrollpflanzen angegeben (x-fache Expressionsänderung).
85
ERGEBNISSE
Zusammengenommen zeigten diese Mikroarraydaten, dass die Expression N-metabolischer
Gene und die Expression von Transportern und Abwehr-assoziierten Genen erhöht war,
während Zellwand-assoziierte Gene reprimiert waren.
4.5 Verwertung der in den Tumor importierten Assimilate
Da gezeigt werden konnte, dass vermehrt Assimilate in den Tumor transportiert werden, stellte
sich die Frage, wie diese verwertet werden. Einerseits dienen sie der Proliferation des
Pathogens, andererseits müssen sie auch das hypertrophe Wachstum der Tumorzellen und
eine mögliche Abwehrantwort der Wirtspflanze speisen. Mit den folgenden Analysen sollte
daher untersucht werden, wie insbesondere der importierte Stickstoff im infizierten Gewebe
verwertet wurde (siehe 4.5.2) und ob eine Abwehrantwort der Wirtszellen detektierbar war und
somit auch für die Assimilatverwertung verantwortlich sein könnte (siehe 4.5.3)
4.5.1 Fütterungsexperimente mit 3H-Asn und 3H-Gln
Die Akkumulation von Asn und Gln war in voll entwickelten Tumoren besonders prägnant (siehe
Abbildung 12). Aus diesem Grund wurden diese Aminosäuren für ein Fütterungsexperiment
ausgewählt bei dem überprüft werden sollte, wie effizient diese Aminosäuren aufgenommen
und wie sie metabolisiert werden.
Es zeigte sich, dass die Aufnahme von radioaktiv markiertem Asn weder in Tumoren, noch in
symptomfreien Bereichen, die unmittelbar an Tumoren grenzten, im Vergleich zu gesunden
Blättern verändert war (Abbildung 30A). In Blättern Wasser-behandelter Pflanzen fanden sich
nach 2 h Markierung mit 3H-Asn etwa ein Drittel der Radioaktivität in der Stärkefraktion wieder,
in Tumoren und symptomfreien Bereichen war die Inkorporation in Stärke jedoch deutlich
geringer (Abbildung 30B). Bei der Auftrennung der ethanollöslichen Substanzen zeigte sich,
dass die Radioaktivität, die durch 3H-Asn aufgenommen wurde, in Tumoren und symptomfreien
Bereichen infizierter Blätter anders fraktionierte als in gesunden Blättern: Ein geringerer Anteil
verblieb in der kationischen Fraktion, welche Aminosäuren und damit auch Asn beherbergen
sollte, und es wurde mehr Radioaktivität in der Fraktion der phosphorylierten Intermediate und
der organischen Säuren wiedergefunden (Abbildung 30C).
Die Aufnahme von Gln in Tumore betrug nur 40% der Gln-Aufnahme in gesunde Blätter, wobei
symptomfreie Bereiche infizierter Blätter nicht von dieser Reduktion betroffen waren (Abbildung
30A). Auch bei der Fütterung mit 3H-Gln war eine Reduktion der Inkorporation der Radioaktivität
in die Stärkefraktion von Tumoren zu beobachten, welche mit der reduzierten Aufnahmerate
korrelierte (Abbildung 30B). Ebenso verblieb in den Tumorproben weniger Radioaktivität in der
Kationenfraktion und es fand sich mehr Radioaktivität in den phosphorylierten Intermediaten
und in der neutralen Fraktion als in den Kontrollblättern (Abbildung 30D). Die symptomfreien
Bereiche infizierter Blätter zeigten bei Gln Fütterung keine Unterschiede zu den Kontrollbehandelten Blättern.
86
ERGEBNISSE
3
3
Abbildung 30 Aufnahme und Metabolisierung von H-Asn und H-Gln nach zweistündiger Fütterung
infizierter Blätter. A Gesamtinkorporation von Radioaktivität nach Fütterung abgetrennter Blätter mit
3
3
H-Asn und H-Gln in Kontroll-behandelten Blättern (dunkelgrün), Tumoren (orange) und symptomfreien
Bereichen infizierter Blätter (dunkelrot). B Inkorporation von Radioaktivität in Stärke nach Fütterung
3
3
abgetrennter Blätter mit H-Asn und H-Gln. C Wiederfindung von Radioaktivität in der neutralen (Zucker,
grün) und der kationischen (Aminosäuren, gelb) Fraktion, sowie in den Fraktionen der phosphorylierten
3
Intermediate (blau) und der organischen Säuren (rot) nach Fütterung mit H-Asn. D Wiederfindung von
3
Radioaktivität in den beschriebenen Fraktionen nach Fütterung mit H-Gln. Die Fehlerbalken zeigen den
Standardfehler (n=4).
Zusammenfassend zeigten diese Daten, dass Asn von Tumoren effektiver aufgenommen wird
als Gln und dass beide Aminosäuren in Tumoren anders metabolisiert werden als in nichtinfizierten Blättern. Nach Fütterung von Tumoren mit beiden Aminosäuren zeigte sich, dass
weniger Radioaktivität in der Aminosäurefraktion (kationisch) verblieb und mehr Radioaktivität in
den Fraktionen wiedergefunden wurde, die Stoffwechselintermediate enthielten.
4.5.2 Proteinbiosynthese in Tumoren
Da gezeigt werden konnte, dass Tumore ein starkes sink für organischen Stickstoff darstellen,
stellte sich die Frage, wie die Aminosäuren, die in das infizierte Blatt geleitet werden, verwertet
werden.
87
ERGEBNISSE
Um direkt die Rate der Proteinbiosynthese in Tumoren bestimmen zu können, wurden infizierte
und Kontrollpflanzen mit
35
S-Methionin markiert und die Inkorporation von Radioaktivität in die
Proteinfraktion bestimmt. Das Verhältnis der
35
S-Wiederfindung in der Proteinfraktion relativ zu
der Wiederfindung im freien Aminosäurepool war in Kontroll-behandelten Blättern 3,6-mal
geringer als in Tumoren (Tabelle 14), was in Tumoren eine erhöhte Inkorporation von
Aminosäuren in Proteine vermuten lässt. Da in diesem Experiment jedoch das Pilzgewebe nicht
vom Wirtsgewebe getrennt werden konnte, kann nicht festgestellt werden, ob die erhöhte
Inkorporationsrate auf den Wirts- oder den Pilzmetabolismus zurückzuführen war.
Verhältnis
35
S Protein / freie AS
Tabelle 14 Inkorporation von
Kontrollpflanzen wurden mit
35
35
Kontrolle
Tumor
0,14 ± 0,04
0,5 ± 0,1
S in die Proteinfraktion nach
35
S-Methionin-Fütterung. Infizierte und
S-Methionin gefüttert und 8 dpi wurde die Inkorporation von
35
S in die
Proteinfraktion und in die freien Aminosäuren (AS) bestimmt. Gezeigt ist das Verhältnis der
Wiederfindung in Proteinen und freien Aminosäuren. Der Standardfehler ist angegeben (n=4).
Bei der Untersuchung des Proteingehaltes zeigte sich, dass dieser in Tumoren 8 dpi mit
5,1 ± 0,6 !g·gFW-1 im Vergleich zu gesunden Blättern gleichen Alters (6,4 ± 0,4 !g·gFW-1) nicht
signifikant verändert war (p=0,13, Welch-Satterthswaite t-Test). Auf einem Coomassiegefärbtem Proteingel sind bei Maisproteinextrakten deutliche Banden bei ~50 und 100 kDa zu
erkennen, welche der großen RubisCO Untereinheit (54 kDa) sowie den C4-Enzymen PyruvatOrthophosphat Dikinase und C4-Phosphoenolpyruvat Carboxylase (100 kDa) entsprechen.
Diese Banden sind in Extrakten Wasser-behandelter Pflanzen deutlich zu sehen, während sie in
Extrakten von 8 Tage alten Tumoren fast gänzlich fehlen (Abbildung 31).
Abbildung 31 Coomassie-gefärbtes Gel von Proteinextrakten aus (Wasser-)infizierten Blättern 8 dpi.
Jeweils aus zwei biologischen Replikaten wurden 50 !g Gesamtprotein geladen, über SDS-PAGE
aufgetrennt und mit Coomassie Brilliant Blau gefärbt. Die deutlichen Banden in Kontrollextrakten
(schwarze Pfeile) entsprechen der großen RubisCO Untereinheit (54 kDa) sowie Pyruvat-Orthophosphat
Dikinase und C4-Phosphoenolpyruvat Carboxylase (beide ~100 kDa).
88
ERGEBNISSE
Diese Reduktion des Gehaltes photosynthetischer Proteine in Tumoren war begleitet durch
geringere Transkriptmengen von Genen, die in der plastidären Proteinbiosynthese involviert
sind. Diese Gene waren in infizierten Blättern bereits ab 4 dpi größtenteils reprimiert und
blieben dies auch bis 8 dpi (Abbildung 32). Stattdessen war jedoch die cytosolische
Wirtsproteinbiosynthese in Tumoren transkriptionell induziert (Abbildung 32).
Abbildung 32 MapMan-Visualisierung deregulierter Gene der Proteinbiosynthese in infizierten Blättern.
Gezeigt sind signifikant regulierte (p<0,001) Gene die in sich entwicklenden (4 dpi, links) und in voll
entwickelten Tumoren (8 dpi, rechts) hoch (rot) bzw. herunterreguliert (blau) sind. Die Kategorisierung der
Affymetrix Genechip® probe sets erfolgte entsprechend den MapMan BINs. Der Grad der Deregulation
ist in log2-Skala zwischen -3 und 3-facher Veränderung der Trankriptmenge farblich angegeben (siehe
Legende). Eine Auflistung der hier dargestellten Gene ist im Anhang zu finden.
Zusammengenommen deuteten diese Daten darauf hin, dass in infizierten Blättern der
Durchsatz von Aminosäuren erhöht war und dass diese vermehrt für die Proteinbiosynthese
verwendet werden. Da die plastidäre Proteinbiosynthese der Wirtszellen stark reduziert war,
deutete
dies
auf
einen
hohen
Anteil
der
pilzlichen
Proteinbiosynthese
an
der
Gesamtbiosynthese hin.
4.5.3 Biosynthese aromatischer Sekundärmetabolite in Tumoren
Wie bereits mikroskopische Untersuchungen zeigten, akkumulierten Tumorzellen Substanzen,
die unter UV-Licht weiß fluoreszierten (siehe Abbildung 15) und die MapMan-Analyse der
Transkriptdaten deutete eine Induktion des Sekundärmetabolismus der Wirtszellen an (siehe
Abbildung 9). Aus diesem Grund wurden die Transkriptom- und Metabolitdaten von infizierten
Blättern
herangezogen,
um
die
Biosynthesewege
von
aromatischen
Substanzen
zu
untersuchen (zusammengefasst in Abbildung 33A). Bereits ab 2 dpi war eine transkriptionelle
89
ERGEBNISSE
Induktion des Shikimatweges in infizierten Blättern zu beobachten. Vier und 8 dpi waren dann
alle Enzyme dieses Biosyntheseweges, mit Ausnahme von 3-Dehydroquinat Synthase (3DQS)
und einer Shikimatkinase (SK) induziert. Letztere war 4 und 8 dpi in Tumoren transkriptionell
reprimiert, während eine andere Isoform in Tumoren stark induziert war. Die transkriptionelle
Induktion des Shikimatweges korrelierte mit einer etwa 8-fachen Akkumulation von Shikimat in
4 bzw. 8 Tage alten Tumoren (Abbildung 33D) und einem 4- bzw. 5-fach höherem Gehalt an
den aromatischen Aminosäuren Phe und Tyr (Abbildung 33B, C). Phenylalanin und Tyrosin
bilden das Substrat für das Enzym Phenylalanin-Ammonium-Lyase (PAL), welche die
Eingangsreaktion in den Phenylpropanstoffwechsel katalysiert (Hahlbrock und Scheel, 1989).
Dieses Enzym war in Tumoren ab 4 dpi sowohl transkriptionell als auch in seiner Aktivität stark
induziert (Abbildung 33A, E). Glutathion (GSH) spielt eine zentrale Rolle bei der Aktivierung des
Sekundärmetabolismus, insbesondere bei der Aktivierung von PAL (Gomez et al., 2004). Die
Erhöhte PAL-Aktivität war begleitet von einer Erhöhung des Gehaltes an Glutathion (GSH):
Acht dpi stieg der Gehalt von 552 ± 35 nmol.gFW-1 in Kontroll-behandelten Blättern auf 863 ± 80
nmol.gFW-1 in Tumoren.
Enzyme des Phenylpropanoid-, sowie des Flavonoid-Stoffwechsels waren in infizierten Blättern
ebenfalls transkriptionell induziert und es akkumulierten Hydroxyzimtsäure-Derivate (HZDs) und
Anthocyane in Tumoren (Abbildung 33F, G), jedoch wurde keine Veränderung im Gehalt von
Flavonolen festgestellt (nicht gezeigt).
90
ERGEBNISSE
Abbildung 33 Transkriptionelle
und
metabolische
Veränderungen
im
Shikimatweg
und
der
Phenylpropanoid-Biosynthese in infizierten Blättern. A Transkriptabundanz von Genen, welche in der
Biosynthese von aromatischen Sekundärmetaboliten involviert sind. Angezeigt ist die Veränderung der
Transkriptmenge relativ zur Wasser-behandelten Kontrolle (rot: induziert, blau: reprimiert, siehe
Legende). Isoformen des gleichen Enzyms sind mit Buchstaben (a-c) benannt. CM: Chorismat Mutase,
CS: Chorismate Synthase, DAHPS: 3-Deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphat-Synthase, 3DQD:
3-Dehydroquinat-Dehydratase, 3DQS: 3-Dehydroquinat Synthase, E4P: Erythrose-4-phosphat, EPSPS:
5-enolpyruvyl-shikimat-3-phosphat Synthase, PAL: Phenylalanin-Ammonium-Lyase, PD: Prephenat
Dehydratase, SDH: Shikimat-5-Dehydrogenase, SK: Shikimatkinase. Gen-Annotationen sind im Anhang
angegeben. Gehalte an B Phenylalanin, C Tyrosin und D Shikimat 4 und 8 dpi. E Aktivität von
Phenylalanin-Ammoniumlyase (PAL) 8 dpi. Gehalte an F Anthocyanen und G Hydroxyzimtsäurederivaten
(HZD) 4 und 8 dpi. Graue Balken repräsentieren U. maydis infizierte, schwarze Balken Wasserbehandelte Blätter. Der Standardfehler ist angegeben (n=6-12).
91
ERGEBNISSE
Diese Induktion des aromatischen Sekundärmetabolismus und die Akkumulation von löslichen
HZD deutet auf eine Abwehrreaktion der Wirtspflanze hin welche die Lignifizierung der Zellwand
speisen könnte (siehe Abbildung 15). Da gleichzeitig die transkriptionelle Induktion der
Zellwandbiosynthese in Tumoren überrepräsentiert war (siehe Abbildung 9 und Tabelle 1),
stellen diese Prozesse eine Kohlenstoff-intensive Reaktion dar, die über den Import von
Assimilaten aus anderen, nicht infizierten Pflanzenregionen gespeist werden kann.
4.6 Charakterisierung einer U. maydis NCR-Mutante
Um die Notwendigkeit der Aufnahme und Verwertung von Aminosäuren durch U. maydis für die
erfolgreiche Kolonisierung der Wirtspflanze zu demonstrieren, sollte untersucht werden, ob
U. maydis ein funktionelles NiT2 / AreA Homolog besitzt (siehe 2.4). Dazu sollten
bioinformatische Analysen durchgeführt und knock-out Mutanten charakterisiert werden.
4.6.1 Charakterisierung eines U. maydis NiT2 / AreA Homologs
Über eine BLAST-Suche wurde nach einem NiT2 / AreA Homolog in U. maydis gesucht, wobei
N. crassa NiT2 und A. nidulans AreA als Suchanfrage verwendet wurden. Das beste Homolog
war Um10417, welches als „verwandt mit Transkriptionsfaktor ScGATA-6“ annotiert ist und, wie
NiT2 / AreA eine C-terminale GATA-Zn-Finger Domäne besitzt. Ein multiples Protein-Alignment
mit bereits beschriebenen NiT2 / AreA Transkriptionsfaktoren aus Ascomyceten und mit
Homologen aus Basidiomyceten zeigte, dass um10417 das für NiT2 / AreA typische
RMENLTWRMM-Motiv, sowie ein konserviertes GATA-Zn-Finger-Motiv (CXXC-17X-CXXC)
besitzt. Während diese Motive auch in den Homologen der Basidiomyceten C. neoformans und
Schyzophyllum commune vorhanden waren, fehlte den Basidiomyceten das C-terminale Motiv
EWEWLTMSL, welches in Ascomyceten konserviert ist (siehe Anhang für ein vollständiges
Alignment) und eine wichtige Regulationsdomäne darstellt (Pan et al., 1997). Die Struktur von
Um10417 deutete also darauf hin, dass es sich tatsächlich um ein funktionelles NiT2 / AreA
Homolog handeln könnte, jedoch möglicherweise anderen Regulationsmechanismen unterliegt
als die Homologe aus Ascomyceten. Über eine RT-PCR war in Sporidien sowohl auf Nitrat- und
Ammonium-Medium Um10417-Transkript detektierbar und die Untersuchung von U. maydisTranskriptdaten zeigte, dass Um10417 (im Folgenden UmNiT2) unter verschiedenen
Bedingungen nicht auf transkriptioneller Ebene reguliert war (Jörg Kämper, persönliche
Kommunikation), was ebenfalls auf einen anderen Mechanismus der NiT2 Regulation in
U. maydis im Vergleich zu Ascomyceten hindeutete.
Abbildung 34 Expression von UmNiT2. U. maydis SG200 Sporidien wurden
über Nacht in Nitrat- (NMM) oder Ammonium-Minimalmedium (AMM)
angezogen. Über RT-PCR mit den Primern RH81 und RH82 wurde in 35
Zyklen die Expression von UmNiT2 getestet. L: DNA-Leiter
92
ERGEBNISSE
Wie BLAST-Analysen und das multiple Alignment zeigten, besaß der N-Terminus von UmNiT2
keinerlei Sequenzhomologie zu anderen Proteinen. Aus diesem Grund wurde eine 5’-RACE
durchgeführt, um das 5’-Ende der UmNiT2 mRNA zu charakterisieren. Drei 5’-RACE Klone
wurden sequenziert und gegen die annotierte Um10417 Sequenz ausgerichtet. Alle drei Klone
endeten etwa 1000 bp abwärts des als Startkodon annotierten ATGs (Abbildung 35).
Abbildung 35 5’ RACE der UmNiT2 mRNA. RNA wurde aus U. maydis Sporidien isoliert und die
Qualität über ein denaturierendes RNA Gel überprüft. Die 5’-RACE cDNA Synthese wurde wie unter
3.2.4.15 beschrieben durchgeführt. Drei Klone wurden sequenziert und an der annotierten Um10417
cDNA ausgerichtet.
Da in diesem Bereich mehrere potentielle Startkodons liegen, ließ sich nicht mit Gewissheit
feststellen, welches dieser ATGs das tatsächliche Startkodon ist, jedoch besitzt das ATG an
Position +1396 (relativ zum bisherigen Um10417 Genmodell) die stärkste Kozak-Sequenz
(GCAACATGG). In diesem Bereich beginnt auch die Proteinsequenzhomologie zu NiT2Proteinen aus Ascomyceten (siehe Anhang).
4.6.2 Generierung von U. maydis NiT2 knock-out Mutanten
Knock-out Mutanten von UmNiT2 wurden wie unter 3.2.2.4 und 3.2.4.13 beschrieben hergestellt
und anschließend genetisch charakterisiert (siehe 3.2.4.14). Da durch die 5’-RACE das
tatsächliche Startkodon nicht eindeutig ermittelt werden konnte, wurde die gesamte kodierende
Sequenz des bisherigen Genmodells gelöscht.
Die PCR mit insertionsspezifischen Primern zeigte, dass das Deletionskonstrukt, welches die
ersten 3476 Basen von Um10417 durch die Hygromycinresistenz-Kassette ersetzte, in je drei
Klonen im richtigen Gen integriert war, während die PCR mit genspezifischen Primern zeigte,
dass nach der Vereinzelung der Transformanden (siehe 3.2.2.4) keine Verunreinigung der
Mutanten durch den Wildtyp (SG200) vorlag (Abbildung 36).
93
ERGEBNISSE
Abbildung 36 Molekulargenetische Überprüfung der homologen Integration der Deletionskonstrukte für
UmNiT2. LBx- bzw. RBx-Reaktionen wurden mit einem für die Hygromycin-Kassette spezifischen und
mit einem Primer, der außerhalb der für die Rekombination verwendeten homologen Region band,
durchgeführt (siehe 3.2.4.14). Das Wildtyp (WT) Fragment wurde mit spezifischen Primerpaaren
amplifiziert, die innerhalb der deletierten Region lokalisiert waren. Drei Transformanden wurden
analysiert. Als Kontrolle diente SG200-DNA (WT). H: Wasserkontrolle. Die Größe der einzelnen
Fragmente ist angegeben.
Über eine Southernblot-Analyse, bei der eine für die Hygromycin-Kassette spezifische Sonde
eingesetzt wurde, sollte anschließend überprüft werden, ob das NiT2-Deletionskonstrukt
mehrfach in das U. maydis Genom integriert hatte, was bei illegitimer Rekombination auftreten
könnte. Bei den beiden überprüften unabhängigen !nit2 Transformanden war die HygromycinResistenzkassette nur einmal integriert (Abbildung 37).
Abbildung 37 Southernblot-Analyse
von
U.
maydis
!nit2-
Mutanten. DNA wurde aus SG200 (WT) und zwei unabhängigen
SG200-!nit2 Transformanden (5.2 und 11.1) isoliert, vollständig mit
EcoRI verdaut und mit einer Hygromycinresistenz-spezifischen
Sonde hybridisiert (siehe 3.2.4.9). Als positive Kontrolle (+) diente
pGEM-T®
easy
Vektor,
der
das
NiT2-Deletionskonstrukt
beherbergte.
4.6.3 Charakterisierung der Stickstoffverwertung von #nit2-Mutanten
Um zu testen, ob das U. maydis UmNiT2 Gen tatsächlich ein funktionelles Homolog von NiT2 /
AreA ist, wurde das Wachstum von !nit2 auf verschiedenen Stickstoffquellen getestet. Die
94
ERGEBNISSE
Analysen zeigten, dass die Mutante lediglich Ammonium, Harnstoff, die Aminosäuren Asp, Glu,
Gln, Asn und Arg, sowie Allontoin und die Polyamine Putrescin und Spermidin wie der Wildtyp
(SG200) verwerten konnte (Tabelle 15 und Anhang). Formamid, Lys und Guanin konnten
ebenfalls verwertet werden, jedoch war das Wachstum im Vergleich zu SG200 geringfügig
langsamer. Auf allen weiteren getesteten N-Quellen war nur minimales Wachstum von !nit2 zu
beobachten.
N-Quelle
SG200 !nit2
N-Quelle
SG200
!nit2
Ammonium (0,3%)
+
+
Ser
+
-
Nitrat (0,3%)
+
-
Thr
+
-
Nitrit (2 mM)
+
-
Pro
+
-
Harnstoff
+
+
Ala
+
-
Formamid (2 mM)
+
+/-
Gly
+
-
Asp
+
+
Leu
+
-
Glu
+
+
Ile
+
-
Asn
+
+
Val
+
-
Gln
+
+
GABA
+
-
Arg
+
+
Putrescin
+
+
Citrullin
+
-
Spermidin (2 mM)
+
+
Lys
+
+/-
Spermin (2 mM)
-
-
Ornithin
+
-
Allantoin
+
+
His
+
-
Cytosin
+
-
Phe
+
-
Uracil
+
-
Tyr
+
-
Guanin (5 mM)
+
+/-
Trp
+
-
Adenin
+
-
Tabelle 15 Wachstum
von
U.
maydis
SG200
und
SG200-!nit2
auf
Minimalmediumplatten mit Glucose als Kohlenstoffquelle und verschiedenen
Stickstoffquellen. Während SG200 alle getesteten N-Quellen (bis auf Spermin)
verwerten konnte (+) war das Wachstum von SG200-!nit2 auf vielen N-Quellen
stark (-) oder geringfügig (+/-) verringert. Cytosin, Uracil, Guanin, Adenin und
Allantoin wurden direkt mit dem Minimalmedium autoklaviert, während alle anderen
organischen N-Quellen nach dem Autoklavieren steril zum Medium gegeben
wurden. Soweit nicht anders angegeben, wurden N-Quellen in 10 mM
Endkonzentration eingesetzt.
Diese Ergebnisse zeigten, dass UmNiT2 tatsächlich in die Regulation der Stickstoffverwertung
eingebunden ist. Daher können, in Analogie zu den Untersuchungen in filamentösen Pilzen,
Ammonium, Harnstoff, Asp, Asn, Glu, Gln, Arg, Putrescin, Spermidin und Allantoin als von
U. maydis favorisierte N-Quellen bezeichnet werden.
95
ERGEBNISSE
Die Komplementation von SG200-!nit2 mit Um10417 stellte das Wachstum mit Nitrat und Valin
als nicht-favorisierte N-Quellen wieder her (Abbildung 38), was darauf schließen lässt, dass der
beobachtete Phänotyp von SG200-!nit2 tatsächlich auf das Fehlen von NiT2 beruhte und nicht
auf potentiellen Sekundärmutationen.
Abbildung 38 Wachstum
der
mit
Um10417 komplementierten SG200!nit2
Mutante
N-Quellen.
auf
Die
verschiedenen
entsprechenden
Kulturen wurden in unterschiedlichen
Konzentrationen auf Minimalmediumplatten
mit
Glc
als
C-Quelle
und
verschiedenen N-Quellen gestempelt.
A Ammonium, B Nitrat, C Glutamin und
D Valin. Die Komplementation stellte
das Wachstum auf den unfavorisierten
N-Quellen Nitrat und Valin wieder her.
4.6.4 Regulation der Nitratverwertung in #nit2
Da gezeigt worden war, dass in A. nidulans areA-, sowie in N. crassa nit2-Mutanten keine
Nitratreduktase-Aktivität mehr nachweisbar war (zusammengefasst in Marzluf, (1997)), wurde
untersucht, ob Nitratreduktase auch in der U. maydis !nit2-Mutante deaktiviert war. Dazu
wurden Sporidien auf Prolin-Chlorat Platten ausgebracht. Chlorat wird unter nicht-repressiven
Bedingungen durch die Aktivität von Nitratreduktase zu toxischem Chlorit umgewandelt und
kann somit als Marker für Nitratreduktaseaktivität angesehen werden. Während SG200
Sporidien abstarben, waren !nit2 Sporidien resistent gegen Chlorat (Abbildung 39), was darauf
hindeutete, das keine Nitratreduktaseaktivität mehr vorhanden war.
Abbildung 39 Wachstum von SG200 und %nit2 auf ProlinChlorat Medium. Die entsprechenden Kulturen wurden in
unterschiedlichen
Konzentrationen
auf
Minimalmedium
gestempelt, welches Prolin als nicht-favorisierte N-Quelle, sowie
250 mM Kaliumchlorat enthielt. Da Prolin von %nit2 nur schlecht
verwertet werden konnte (siehe Tabelle 15) wurden das
Wachstum erst eine Woche nach Ausplattieren der Zellen
dokumentiert.
Bereits zuvor war nachgewiesen worden, dass die Nitratreduktase in U. maydis transkriptionell
reguliert wird (Banks et al., 1993) und dass Nitrat- und Nitritreduktase, sowie der
Nitrattransporter (Nrt, um11105) in einem Gencluster vorliegen (McCann und Snetselaar, 2008).
Daher wurde die Expression von Nar1 und Nrt über Northernblot-Analysen im Wildtyp und in
96
ERGEBNISSE
!nit2-Mutanten auf verschiedenen N-Quellen untersucht, um zu testen, ob diese Gene durch
NiT2 koreguliert werden.
Es konnte gezeigt werden, dass die Abundanz der Nar1 und der Nitrattransporter (Nrt)
Transkripte in !nit2 Sporidien, welche auf Nitrat-Minimalmedium angezogen worden waren,
gegenüber SG200 deutlich reduziert, jedoch detektierbar waren (Abbildung 40). Auf
Stickstoffmangel-Medium waren beide Gene in SG200 stark exprimiert, während auch hier die
Expression in !nit2 geringer war.
Im Zuge dieser Analyse wurde auch untersucht, ob Nitrat-verwertende Proteine unter
repressiven Bedingungen exprimiert waren. Dazu wurden Sporidien mit Ammonium, sowie mit
Ammonium plus Nitrat als N-Quelle angezogen und die Expression von Nar1 und Nrt geprüft.
Es zeigte sich, dass in SG200 und in !nit2 für beide mRNAs kein Signal detektiert werden
konnte (Abbildung 40).
Abbildung 40 Northernblot-Analyse von Nitratreduktase (Nar1) und Nitrattransporter (Nrt) in SG200
und %nit2 Sproridien auf unterschiedlichen N-Quellen. Sporidien beider Stämme wurden auf AmmoniumMinimalmedium angezogen, in ddH2O gewaschen und auf Minimalmedium mit der entsprechenden
N-Quelle transferiert. Sporidien wurden 1, 2, 3, 4, 6, 24 und 48 h nach Transfer in das neue Medium
geerntet. Als Kontrolle dienten Sporidien aus der Vorkultur (0 h). Für die Kontrolle der Beladung des RNA
Gels diente die 18S rRNA.
4.6.5 Phänotyp von #nit2 in planta
Da durch die Deletion von NiT2 die Verwertung der Mehrzahl der Stickstoffquellen gestört war,
wurde hypothetisiert, dass dies die Pathogenität beeinträchtigen würde. Um dies zu testen,
wurden Maiskeimlinge mit dem %nit2-Stamm infiziert und ein Krankheitsindex erstellt, welcher
die Stärke der Infektionssymptome quantifizierbar machte.
Während eine SG200-Infektion zumeist starke Tumorbildung hervorrief, verursachte die
Infektion mit %nit2 nur die Induktion vorwiegend kleiner Tumore, was mit einer reduzierten
Proliferation in planta einherging (Abbildung 41).
97
ERGEBNISSE
Abbildung 41 Infektionsphänotyp von SG200-%nit2 auf Maisblättern. A Maisblätter infiziert mit SG200
beziehungsweise %nit2-Mutanten 10 dpi. B Krankheitsindex infizierter Pflanzen. Zehn dpi wurden je U.
maydis Stamm die Infektionssymptome von 22 Pflanzen bestimmt. C Chlorazolschwarz E Färbung von
Pilzhyphen in sich entwickelnden Tumoren. Die Proliferation von %nit2 ist im Vergleich zu SG200 bereits
4 dpi deutlich reduziert.
Der Infektionsphänotyp von SG200-%nit2 ließ sich durch die Komplementation der knock-out
Mutante mit dem volllängen-Klon von UmNiT2 revertieren (Abbildung 42), was zeigte, dass die
reduzierte Virulenz tatsächlich auf das Fehlen von NiT2 zurückzuführen war.
Abbildung 42 Komplementation von
SG200-%nit2
mit
um10417,
dem
volllängen Klon von UmNiT2. Gezeigt
sind infizierte Blätter 14 dpi. Links:
SG200, Mitte: SG200-%nit2, rechts:
SG200-%nit2-p123_NiT2.
98
ERGEBNISSE
4.6.6 Untersuchung des filamentösen Wachstums von #nit2 Sporidien
Der solopathogene Stamm SG200 ist auch ohne Paarungpartner in der Lage, filamentös
auszuwachsen. Es wurde beobachtet, dass dieser Stamm in Flüssigmedium, welches
ausschließlich Nitrat als N-Quelle enthielt, bereits nach 24 h filamentös zu wachsen begann
(Abbildung 43). In Medium mit Ammonium oder in Medium ohne N-Quelle war dies erst nach
zwei bis drei Tagen zu beobachten (Abbildung 43). Die %nit2 Mutante wies besonders auf
nitrathaltigem Medium ein deutlich geringeres filamentöses Wachstum als SG200 auf
(Abbildung 43).
Abbildung 43 Filamentöses
U.
maydis-Sporidien
Wachstum
von
Medium
mit
in
unterschiedlichen N-Quellen. Sporidien von SG200
und %nit2 wurden drei Tage in Flüssigmedium
kultiviert
und
anschließend
mikroskopisch
untersucht. Schwarze Pfeile zeigen auf Filamente,
weiße Pfeilspitzen auf Kristalle von Ustilaginsäure,
welche unter N-Mangel von U. maydis sekretiert
wird (Hewald et al., 2005). In Nitratmedium konnten
weder
bei
SG200
noch
bei
%nit2
Ustilaginsäurekristalle gefunden werden.
Da eine Störung in der Initiierung von filamentösem Wachstum den beobachteten
Infektionsphänotyp von %nit2 teilweise erklären könnte, wurde dieses zunächst in vitro auf einer
hydrophoben Oberfläche (Parafilm) und anschließend on planta untersucht.
Sechzehn Stunden nachdem die Sporidien in ddH2O gewaschen und auf Parafilm ausgebracht
wurden, waren weniger %nit2-Sprodien als SG200-Sporidien ausgekeimt (Tabelle 16). Nach
21 h hatten ~ 20% der Sporidien beider Stämme Filamente ausgebildet, jedoch waren SG200
Filamente länger als %nit2 Filamente (Abbildung 44).
99
ERGEBNISSE
SG200
%nit2
16 h auf Parafilm
12,1 ± 0,1 %
7,3 ± 0,3 %
21 h auf Parafilm
20 ± 0 %
22 ± 4 %
Tabelle 16 Keimungsrate von SG200- und %nit2-Sporidien auf Parafilm. Sporidien wurden in ddH2O
geweschen und auf Parafilm gesprüht. Nach 16 bzw. 21 h Inkubation in einer feuchten Kammer bei 28°C
wurde der Anteil der gekeimten Sporidien gezählt. Der Standardfehler von drei unabhängigen
Experimenten, von denen jeweils 70-100 Sporidien ausgezählt wurden, ist angegeben.
Abbildung 44 Filamentöses Wachstum von U. maydis Sporidien auf Parafilm. A SG200- und B %nit2Sporidien wurden in ddH2O gewaschen, mit ddH2O auf eine OD600 von 0,1 eingestellt und auf Parafilm
gesprüht. Die Photos wurden nach 21 h Inkubation in einer feuchten Kammer bei 28°C mikroskopisch
aufgezeichnet. Pfeilköpfe zeigen auf pilzliche Filamente, welche bei %nit2 kürzer als bei SG200 sind.
Auch on planta war für %nit2 eine deutliche Reduktion des filamentösen Wachstums zu
beobachten. SG200 war 2 dpi stark filamentös gewachsen, %nit2 hingegen wies zu diesem
Zeitpunkt nur geringes hyphales Wachstum auf (Abbildung 45).
100
ERGEBNISSE
Abbildung 45 Filamentöses Wachstum von
U. maydis SG200 (oben) und %nit2 (unten)
2 dpi auf der Blattoberfläche. Pilzzellen
wurden mit Calcofluor gefärbt und unter UVLicht bei 200-facher Vergrößerung betrachtet.
Schwarze Pfeile zeigen auf %nit2 Sprodien,
die nicht ausgewachsen sind, weiße Pfeile
auf %nit2 Filamente.
Das verzögerte bzw. gestörte filamentöse Auswachsen der %nit2 Sporidien könnte also zu der
Reduktion der Infektionssymptome dieser Mutante beitragen, jedoch lässt sich durch diese
Analyse nicht ausschließen, dass auch noch andere Faktoren, wie beispielsweise die gestörte
Aminosäureverwertung nach der Wirtspenetration eine Rolle spielen.
Um die Frage zu klären, ob verringerte Stickstoffreserven in %nit2 Sporidien zu dem gestörten
filamentösen Wachtum beitragen, wurden die freien Aminosäuren aus Sporidien bestimmt,
welche in YEPSlight Medium angezogen worden waren. Obwohl in %nit2 Sporidien eine
Reduktion in den Gehalten fast aller Aminosäuren zu beobachten war (nicht gezeigt), war der
Gesamtgehalt mit 236 ± 4 nmol.mL-1.OD1 nur geringfügig niedriger als in SG200 Sporidien
(296 ± 19 nmol.mL-1.OD1, p=0,08, Welch-Satterthwaite t-Test, n=3), so dass mangelnde
Stickstoffreserven als Ursache für den beobachteten Keimungsphänotyp unwahrscheinlich sind.
Ein Defekt in der Mobilisierung der vorhandenen Stickstoffreserven kann jedoch durch diese
Untersuchung nicht ausgeschlossen werden.
101
DISKUSSION
5 Diskussion
Der Befall von Kulturpflanzen durch pilzliche und andere Pathogene hat einen erheblichen
Einfluss auf den Ertrag dieser Pflanzen und wirkt sich somit negativ auf die Agrarwirtschaft aus
(Oerke und Dehne, 2004). Obwohl biotrophe Pathogene ihren Wirt generell nicht töten, haben
auch sie einen negativen Einfluss auf den Ertrag der Wirtspflanze. So wurden Einbußen von bis
zu 45% bei Befall von Gerste durch Mehltau (Blumeria graminis sp. hordei) oder durch den
Rostpilz Puccinia hordei verzeichnet (Lim und Gaunt, 1986). Der Brandpilz Ustilago maydis
verursacht in den USA Verluste von mehreren 100 Millionen US Dollar pro Jahr, da im
Durchschnitt 2% aller Maispflanzen pro Feld befallen sind (Martinez-Espinoza et al., 2002).
Die Reduktion des Ertrages infizierter Pflanzen geht dabei meist mit einer Reduktion der
photosynthetisch aktiven Biomasse einher, was auch für Maispflanzen, welche mit U. maydis
infiziert waren, gezeigt werden konnte (Billett und Burnett, 1978a). Da biotrophe Pathogene ein
sink für Assimilate darstellen (Pageau et al., 2006), kompetitieren infizierte Pflanzenteile mit den
natürlichen sink-Organen der Pflanzen (Biemelt und Sonnewald, 2006). Dies führt dazu, dass
weniger Nährstoffe in die für den Menschen interessanten Pflanzenorgane (insbesondere
Samen, Knollen) gelangen und somit der Ertrag vermindert wird.
5.1 Globale Transkriptom- und Metabolitanalyse von Tumoren
Globale Transkriptanalysen in Pflanzen-Pathogen Interaktionen fokussierten sich größtenteils
auf inkompatible Interaktionen und erlaubten Einblicke in die Mechanismen der basalen Abwehr
(Wise et al., 2007, Tan et al., 2009). Transkriptomstudien kompatibler Pflanzen-Pathogen
Interaktionen wurden bisher weniger konsequent durchgeführt (Parker et al., 2008), während
aber
zahlreiche
intensive
physiologische
Studien
und
Metabolomanalysen
von
Pilz-
Pflanzeninteraktionen vorliegen, die zeigten, dass infizierte Blätter eine source zu sink
Umprogrammierung erfahren (Solomon und Oliver, 2001, 2002, Fotopoulos et al., 2003,
Swarbrick et al., 2006, Parker et al., 2009). Jede der genannten globalen Analysemethoden für
sich genommen erlaubt Einblicke in Mechanismen der Pflanzen-Pathogeninteraktion, jedoch
besteht bei Metabolitanalysen in Pflanzen-Pathogen Interaktionen das Problem, dass nicht
überprüft werden kann, ob sich die gemessenen Substanzen im Wirtsgewebe oder im Pathogen
befinden. Durch mikroskopische Analysen wurde gezeigt, dass U. maydis in 8 Tage alten
Tumoren weniger als 3% des Tumorvolumens ausmacht, so dass davon ausgegangen werden
kann, dass der Großteil der Metabolite im Wirtsgewebe vorliegen. Dennoch weist insbesondere
die Kombination von Transkriptom- (welche Wirts- bzw. Pathogen-spezifisch ist), Metabolomund physiologischen Analysen ein hohes Potential auf, Infektionsmechanismen weiter zu
entschlüsseln (Tan et al., 2009).
In dieser Arbeit wurde daher die Auswirkung einer kompatiblen Interaktion von U. maydis und
Mais auf die sink-source Balance der Wirtspflanze durch eine Kombination aus Transkriptom-,
Metabolit- und physiologischen Analysen charakterisiert.
102
DISKUSSION
Eine Transkriptomanalyse von Mais durch Mikroarrays kann sich problematisch gestalten, da
zwischen einzelnen Maiskultivaren erhebliche Sequenzunterschiede bestehen, die eine
verlässliche Hybridisierung mit den Sonden erschweren können. Da über alle Mikroarrayhybridisierungen, die in dieser Arbeit mit dem Affymetrix Genechip® durchgeführt wurden, mehr
als 50% der Gene ein signifikantes Signal gaben, war die Hybridisierung reproduzierbar
durchführbar. Die erhalten Daten stellen jedoch nur einen Bruchteil der tatsächlichen
transkriptionellen
Veränderungen
dar,
da
zusätzlich
zu
den
probe
sets
die
kein
reproduzierbares Signal gaben (knapp 50%) auch nur 13339 Gene auf dem Mikroarray
repräsentiert waren, was weniger als 50% der 32540 in Mais identifizierten Gene darstellt
(Schnable et al., 2009).
Die
globale
Transkriptomanalyse
U.
maydis-infizierter
Maisblätter
zeigte,
dass
mit
fortschreitendem Infektionsverlauf eine zunehmende Anzahl an Wirtsgenen dereguliert wurde.
Während der initialen Infektionsphase (bis zu 1 dpi) waren Gene der Wirtsabwehr und der
Redoxregulation unter den deregulierten Genen statistisch signifikant angereichert, was auf
eine Induktion der Wirtsabwehr durch die Infektion hindeutet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde
der Aspekt der lokalen Wirtsabwehr in der U. maydis-Mais Interaktion nicht näher untersucht.
Die generierten Transkriptom- und Metabolit-Datensätze dienten jedoch als Ausgangspunkt für
eine eingehende Charakterisierung der Auswirkung der U. maydis Infektion auf die Wirtsabwehr
(Doehlemann et al., 2008a, Wahl, 2009).
Ab 2 dpi war eine signifikante Anreicherung deregulierter Metabolismus-assoziierter Gene zu
beobachten. Insbesondere der Sekundär- und Zellwandmetabolismus waren transkriptionell
stark induziert. In späteren Infektionsphasen (4 bis 8 dpi) waren auch der zentrale KohlenstoffStoffwechsel sowie der Aminosäuremetabolismus induziert, obwohl die photosynthetische
Genexpression im Vergleich zu Kontrollblättern stark reprimiert war.
Die zu der Transkriptomanalyse komplementäre Untersuchung der Metabolitgehalte in
U. maydis-infizierten Maisblättern wurde zunächst wie die Transkriptomdaten global durch
statistische
Methoden
analysiert.
Über
eine
hierarchische
Clusteranalyse
wurde
die
Reproduzierbarkeit der Metabolitanalysen bestätigt. Diese hierarchische Cluster- und die
Hauptkomponentenanalyse (PCA) ergaben, dass während der initialen Infektionsphase keine
deutlichen Veränderungen in den Metabolitgehalten von infizierten und von Kontrollblättern
auftraten, dass sich die Metabolitmuster infizierter Blätter ab 2 dpi deutlich von nicht-infizierten
Blättern unterschieden. Diese metabolischen Unterschiede traten zu dem Zeitpunkt auf, als die
Blätter aus dem Blattkanal traten, also wenn die nicht-infizierten Blätter beginnen,
Photosynthese zu betreiben und sich zu einem source-Blatt entwickeln. Die Metabolitgehalte in
infizierten Blättern ähnelten denen in sehr jungen, nicht-infizierten Blättern, was darauf
hindeutet dass die Entwicklung zu einem source-Blatt aufgrund der Infektion mit U. maydis
gestört ist.
Im Gegensatz zu U. maydis, welcher über das Blattmeristem Zutritt zu seinem Wirt erlangt
(Wenzler und Meins, 1987) und somit direkt ein sink-Gewebe kolonisiert, sind andere biotrophe
103
DISKUSSION
Pilze in der Lage, voll entwickelte source-Blätter zu infizieren. Wie beispielsweise für die
Interaktion von Gerste mit dem Mehltau Blumeria graminis beschrieben, verursacht die Infektion
eine Verminderung der Photosyntheserate, was dazu führt, dass das infizierte Blatt einen
source-zu-sink Übergang erfährt (Scholes et al., 1994, Swarbrick et al., 2006). Ustilago maydis
hingegen bewirkt eine Retention des sink-Status, was im Folgenden anhand der Ergebnisse der
eingehenderen Analysen diskutiert werden soll.
5.2 sink-Metabolismus U. maydis-induzierter Tumoren
5.2.1 Zentraler Kohlen- und Energiestoffwechsel
5.2.1.1 Tumore führen aberrante Photosynthese aus
Durch die Kombination von Chlorophyllfluoreszenz-Imaging und Gaswechselanalysen wurde
die Photosynthesekapazität U. maydis-infizierter Blätter charakterisiert. Im Vergleich zu
bisherigen Studien dieser Art an C3-Pflanzen ist diese Arbeit mit Mais komplexer, da Mais eine
C4-Pflanze mit Kranz-Anatomie
ist und zwei Typen photosynthetischer Zellen besitzt. Die
Differenzierung in C4-Mesophyll- (MZ) und C4-Bündelscheidenzellen (BSZ) manifestiert sich
dabei früh in der Blattentwicklung (Nelson und Dengler, 1992).
Die Gaswechselanalysen zeigten, dass infizierte Maisblätter reduzierte Photosyntheseraten
aufweisen und keine C4-Photosynthese betreiben, was durch die Erhöhung des CO2Kompensationspunktes und durch die reduzierte Aktivität der C4-Enzyme PEP-Carboxylase
(PEPC) und NADP-Malatenzym (NADP-ME) evident wurde. Gleichzeitig wiesen infizierte Blätter
reduzierte Gehalte an den C4-Zyklus-assoziierten Metaboliten Malat, PEP und Pyruvat auf.
Stattdessen
akkumulierte
Ribulose-1,5-bisphosphat
in
infizierten
Blättern.
Da
in
voll
entwickelten C4-Blättern lediglich BSZ RubisCO enthalten und den Calvin-Zyklus ausführen
(Heldt und Piechulla, 2008), lässt diese Beobachtung vermuten, dass durch die Infektion die
Differenzierung in MZ und BSZ gestört ist und stattdessen der Großteil der Zellen C3-Photosynthese betreibt. Die Determinierung der beiden Zelltypen geschieht im Blattmeristem (Nelson
und Dengler, 1992) und frei diffundierende Signale scheinen eine zentrale Rolle bei der
Differenzierung beider Zelltypen zu spielen (Langdale und Nelson, 1991). Da U. maydis
zunächst das Blattmeristem befällt (Wenzler und Meins, 1987), lässt sich folgern, dass die
Infektion mit U. maydis die Entwicklung der C4-Photosynthese von Beginn an stört.
Die Analyse der Photosynthesecharakteristik nach Infektion mit dem apathogenen Stamm !clp1
(Scherer et al., 2006) sollte Aufschluss darüber geben, ob der negative Einfluss der U. maydisInfektion auf die C4-Photosynthese spezifisch ist, oder lediglich einen Nebeneffekt einer
misslungenen Abwehrreaktion der Pflanze darstellt. Trotz der fehlenden Tumorinduktion war die
C4-Photosynthese auch in der !clp1-Mais Interaktion beeinträchtigt. Die Reduktion des CO2Kompensationspunktes war jedoch nicht auf eine reduzierte Aktivität von PEPC und NADP-ME
zurückzuführen, was vermuten lässt, dass hier die Differenzierung zu MZ und BSZ
möglicherweise nicht gestört war. Stattdessen könnte die Infektion mit !clp1, welche eine
leichte basale Abwehrantwort induziert und die Akkumulation von Callose bewirkt (siehe 4.2)
104
DISKUSSION
dazu führen, dass die Leckage von CO2 aus den BSZ erhöht ist, was den CO2-konzentrierenden
Mechanismus des C4-Zyklus stören würde (von Caemmerer, 2000). Die CO2-Leckage wird
dabei durch die Zellwanddicke, Membranzusammensetzung und die Position der Organellen in
BSZ beeinflusst (von Caemmerer, 2000). Da !clp1-infizierte Maisblätter leicht chlorotisch
waren, könnten daher einer oder mehrere dieser Faktoren den beobachteten Effekt auf die
C4-Photosynthese auslösen.
Auch die maximale CO2-Assimilationsrate war in SG200-infizierten Blättern stark reduziert, was
mit einer Reduktion der plastidären Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase (GAPDH)Aktivität und einem reduzierten Gehalt an 3-Phosphoglycerat, dem Produkt des Calvin-Zyklus,
einherging. Diese Beobachtung scheint eine Folge der allgemeinen Repression der
photosynthetischen Genexpression zu sein, welche in der Transkriptomanalyse beobachtet
wurde. In Tumoren war auch die Integrität von Photosystem II stark beeinträchtigt, was mit einer
Reduktion der Elektronentransportrate (ETR) und einer Erhöhung der nicht-regulierten
Energieverstrahlung einherging.
Die Infektion mit !clp1 bewirkte ebenfalls eine Reduktion der maximalen Assimilationsrate, die
jedoch nicht so stark ausgeprägt war wie in der kompatiblen Interaktion. Die ETR war hingegen
nicht beeinträchtigt. Sechs dpi war jedoch eine Reduktion der nicht-photochemischen
Energielöschung (NPQ) zu beobachten. Bei inkompatiblen Interaktionen zwischen Mehltau und
resistenten Gerste-Kultivaren wurde ebenfalls eine Reduktion von NPQ beobachtet und so
interpretiert, dass in einer inkompatiblen Interaktion ein erhöhter ATP-Bedarf besteht, um die
Abwehrreaktion zu treiben (Swarbrick et al., 2006), während ein erhöhter ATP-Bedarf in
symptomatischen Bereichen kompatibler Interaktionen durch den erhöhten Assimilatbedarf
durch das Pathogen zu erklären ist (Scholes und Rolfe, 1996). Eine erhöhte ATP-Synthese
bewirkt durch die Verringerung des Protonengradienten über die Thylakoidmembran eine
Verringerung der Aktivität des Zeaxanthin-Zyklus, was sich in niedrigeren NPQ-Werten äußert
(Müller et al., 2001).
5.2.1.2 Tumore stellen ein sink für Kohlenhydrate dar
Biotrophe Pathogene sind auf die Verfügbarkeit von löslichen Kohlenhydraten angewiesen, da
sie im Gegensatz zu nekrotrophen Pathogenen nicht die Wirtszellwand oder die plastidäre
Stärke
direkt als
Kohlenstoffquelle
nutzen
können. Aus
diesem
Grund
wurde
der
Zuckermetabolismus U. maydis-infizierter Blätter eingehender untersucht.
Trotz der verringerten Photosyntheserate akkumulierten lösliche Zucker in infizierten Blättern,
insbesondere Hexosen. Das Schlüsselenzym der Saccharose-Biosynthese, Saccharose-6phosphat Synthase, war ab 2 dpi transkriptionell reprimiert, dennoch war der Saccharosegehalt
in Tumoren höher als in Kontrollblättern. Dies kann darauf zurückzuführen sein, dass der
Saccharosetransporter ZmSUT1, welcher für die Beladung des Phloems verantwortlich ist
(Slewinski et al., 2009), ebenfalls reprimiert ist, was zu einem reduzierten Export der in
Tumorgewebe verbliebenen Saccharose führen könnte (Burkle et al., 1998).
105
DISKUSSION
Junge nicht-infizierte Maisblätter wiesen ebenfalls hohe Hexose-Gehalte und ein hohes
Hexose-zu-Saccharose Verhältnis auf, was charakteristisch für sink-Blätter ist (Sonnewald et
al., 1991, Herbers und Sonnewald, 1998). Nach dem Austreten der Blätter aus dem Blattkanal
sank der Gehalt an Hexosen, während Saccharose und Stärke in der Lichtphase akkumulierten,
was den Übergang dieser Blätter zu einem source-Organ widerspiegelt. Die im Infektionsverlauf
konstant hohen Hexosegehalte infizierter Blätter deuteten an, dass U. maydis eine Retention
des sink-Status bewirkt, anstatt eine Umprogrammierung von source zu sink zu induzieren, wie
dies für andere Phytopathosysteme gezeigt wurde (Swarbrick et al., 2006, Berger et al., 2007,
Engelsdorf, 2008).
Insbesondere der Aktivität von Wirts-Zellwandinvertase und pilzlicher Invertase wird eine
entscheidende Rolle bei der Etablierung des sink-Status infizierter Blätter zugeschrieben
(zusammengefasst in Panstruga, 2003, Hückelhoven, 2005 und Biemelt und Sonnewald, 2006),
da die Spaltung von Saccharose zu Hexosen im Apoplasten den Saccharose-Export reduziert
und die Entladung von Saccharose aus dem Phloem begünstigt (Tetlow und Farrar, 1992, Tang
et al., 1999). Invertase stellt also für biotrophe Pathogene eine effiziente Möglichkeit dar, die
Versorgung des infizierten Organs mit löslichen Kohlenhydraten aufrecht zu erhalten. Darüber
hinaus wurde postuliert, dass Hexosen -und nicht Saccharose- biotrophen Pilzen als
Kohlenstoff-Quelle dienen, da alle bisher studierten pilzlichen Blattpathogene in planta
sekretierte Invertasen und Hexosetransporter exprimieren (Sutton et al., 1999, Voegele et al.,
2001, Voegele et al., 2006). Apoplastische Hexosen signalisieren der Pflanze jedoch den Befall
durch Pathogene, was zu der Induktion einer Abwehrantwort führen kann, welche mit der
Induktion von PR-Genen (pathogenesis related genes) einhergeht (Herbers et al., 1996a,
Herbers et al., 1996b, Kocal et al., 2008). Pilzliche Hexosetransporter müssen also mit den
pflanzlichen Transportern um die durch Invertase freigesetzten Hexosen konkurrieren, um eine
Abwehrantwort zu vermeiden (Voegele et al., 2001).
In U. maydis-infizierten Blättern geht die Akkumulation von Hexosen mit der Induktion von
Invertaseaktivität einher. Im Infektionsverlauf wird sowohl Zellwandinvertase- als auch
vakuoläre Invertaseaktivität erhöht, was mit einer transkriptionellen Induktion der pilzlichen
Invertase und einigen Wirtsinvertasen korreliert. Da die pilzliche Invertase die höchste
Transkriptabundanz aufwies, kann ihr vermutlich der größte Anteil an der gemessenen
Invertaseaktivität zugeschrieben werden. Dies steht im Gegensatz zu bisherigen Berichten, in
denen der Hauptanteil der Invertaseaktivität den Maisinvertasen zugeordnet wurde (Billett et al.,
1977). Die transkriptionelle Induktion von ZmIvr2 in voll entwickelten Tumoren weist auf eine
hohe Verfügbarkeit von Saccharose in diesem Gewebe hin. ZmIvr2 ist Saccharose-induziert
und dient der Speicherung von Kohlenhydraten in der Vakuole (Xu et al., 1996, Sturm und
Tang, 1999). Die hohe Expression dieses klassischen sink-Markers unterstreicht den Status der
infizierten Blätter.
Die Infektion mit !clp1 bewirkte keine Retention des sink-Status, da keine Hexosen in den
betroffenen
Bereichen
akkumulierten.
Tatsächlich
sanken
die
Hexosegehalte
in
der
106
DISKUSSION
Blattentwicklung schneller als in den Kontrollpflanzen, was darauf schließen lässt, das der
source-Status schneller erreicht wurde als in gesunden Blättern. Dies könnte eine Reaktion auf
den Befall eines nicht-adaptierten Pathogens darstellen und als eine Art Fluchtreaktion
angesehen werden: Anstatt weiterhin Kohlenhydrate zu importieren, welche dem Pathogen als
Kohlenstoffquelle dienen können, wird die Photosynthese schnell etabliert. Dies verringert die
Verfügbarkeit von Zuckern im Apoplasten und könnte somit eine Infektion des jungen Gewebes
verhindern. Von den Wirtsinvertasen war nach !clp1-Infektion lediglich Incw1 transkriptionell
induziert, was mit einer leichten Erhöhung der Zellwandinvertase-Aktivität einherging. Das
Ausbleiben der Induktion löslicher Invertasen (insbesondere von Ivr2) deutet darauf hin, dass
die Wirtszellen keine Kohlenhydrate importieren und die Saccharoseverfügbarkeit gering ist.
Welche Rolle spielt die Verfügbarkeit von Saccharose und Hexosen in Tumoren für die
Ernährung von U. maydis? Obwohl der Hexosetransporter Hxt1 und eine sekretierte Invertase
des Rostpilzes Uromyces fabae in planta induziert werden (Voegele et al., 2001, Voegele et al.,
2006), konnte nie gezeigt werden, das die Aufnahme von Hexosen essentiell für das Pathogen
ist, da Rostpilze für reverse Genetik unzugänglich sind (Voegele et al., 2001). Für U. maydis
wurde ein Hexosetransporter (UmHxt1) charakterisiert, welcher spezifisch für Glucose,
Fructose, Mannose und Xylose ist (Wahl, R, Wippel, K, Goos, S, Vranes, M, Sauer N, Kämper,
J, eingereicht; Wahl 2009). hxt1-Mutanten wiesen leicht verringerte Virulenz auf Maisblättern
auf. Gleichzeitig wurde jedoch auch ein hoch-affiner Saccharosetransporter (UmSrt1)
charakterisiert (Wahl R, Wippel K, Kämper J und Sauer N, eingereicht; Wahl, 2009), welcher für
die volle Pathogenität unerlässlich ist. srt1-Mutanten wiesen dabei noch stärker verringerte
Virulenz auf als hxt1-Mutanten, waren jedoch -wie hxt1- in der Lage, das Wirtsgewebe zu
kolonisieren. Doppelmutanten zeigten einen additiven Effekt, was zeigte, dass die Nutzung von
Saccharose und Hexosen essentiell für die volle Virulenz von U. maydis ist. Die Rolle der
pilzlichen Invertase konnte bisher nicht geklärt werden, da suc2-Mutanten voll virulent waren
(Wahl R, Kämper J, unveröffentliche Daten). Möglicherweise übernehmen bei Fehlen der
Pilzinvertase die Wirtsinvertasen (z.B. Incw2) die Spaltung der Saccharose im Apoplasten
(Wahl, 2009).
Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass U. maydis Saccharose und
Hexosen als favorisierte Kohlenstoffquellen in planta nutzt und diese durch die Retention und
Verstärkung des sink-Status infizierter Blätter bereitgestellt werden. Die direkte Aufnahme von
Saccharose könnte dabei die Hexosen-vermittelte Abwehrreaktion verhindern und einen
entscheidenden Beitrag zur Virulenz von U. maydis darstellen.
5.2.1.3 Die Zellwandbiosynthese und der Phenylpropanstoffwechsel sind in Tumoren
induziert
Die Transkriptomanalyse zeigte, dass Gene der Zellwandbiosynthese in Tumoren bereits früh
transkriptionell induziert sind. Die erhöhte Expression zellwandbiosynthetischer Gene wurde
107
DISKUSSION
auch in Agrobacterium tumafaciens-induzierten Tumoren an Arabidopsis-Stängeln beobachtet
und ist vermutlich eine Folge der Zellvergrößerung der Tumorzellen, die eine vermehrte
Depositon von Zellwandmaterial bedingt (Deeken et al., 2006). In dieser Studie wurde auch
beobachtet, dass die Stärkebiosynthese in Agrobacterium-induzierten Tumoren transkriptionell
reprimiert
war.
In
U.
maydis-induzierten
Tumoren
auf
Maisblättern
waren
Stärke-
biosynthesegene und -abbaugene transkriptionell reprimiert, was mit einem verringerten
Tagesumsatz von Stärke in Tumoren korrelierte. Stattdessen scheinen die Triosephosphate, die
in Tumorplastiden synthetisiert werden, über den Triosephosphat / Phosphat-Transporter ins
Cytosol verlagert zu werden. Parallel dazu akkumulierten Hexosephosphate und insbesondere
UDP-Glucose, wobei UDP-Glucose unter anderem das Substrat für Cellulosesynthasen
darstellt. Die Cellulose-Synthese wird in den meisten Pflanzenarten jedoch durch importierte
Kohlenstoffgerüste gespeist (Hardin et al., 2006). Dabei spielen Membran-assoziierte
Saccharose Synthase (Susy)-Isoformen eine entscheidende Rolle in der Kanalisierung von
Saccharose in die Cellulosesynthese (Amor et al., 1995, Haigler et al., 2001). Saccharose wird
von Susy in Fructose und UDP-Glucose gespalten, wobei letzteres direkt in die
Cellulosesynthese einfließen kann. In U. maydis-induzierten Tumoren war Saccharose
Synthase 1 (Sus1) transkriptionell induziert. Diese Isoform kann mit der Membran assoziieren
und ist deshalb vermutlich in die Zellwandbiosynthese eingebunden (Hardin et al., 2006). Ein
weiterer Hinweis darauf, dass Sus1 in Tumoren tatsächlich das Substrat für die CelluloseBiosynthese liefert liegt darin, dass die antisense-Repression von Susy in transgenen Karotten
zu einer verringerten Akkumulation von UDP-Glucose und Cellulose führte (Tang und Sturm,
1999), während die erhöhte Sus1-Expression in U. maydis-induzierten Tumoren mit einer
Akkumulation von UDP-Glucose einherging.
Die vermehrte Deposition von Zellwandmaterial stellt einen Kohlenstoff-intensiven Prozess dar,
so dass hypothetisiert werden kann, dass der durch Billet und Burnett, (1978b) beobachtete
erhöhte Import von Kohlenstoff-Assimilaten in Tumore den Bedarf an Kohlenstoff für die
Zellwandbiosynthese decken muss.
Ustilago maydis-induzierte Tumorzellen wiesen eine erhöhte Zellwand-Epifluoreszenz auf, was
auf eine verstärkte Einlagerung von Lignin in die Zellwand hindeutet. Die Verstärkung der
Zellwand durch Lignin ist Teil einer Abwehrantwort, die das Eindringen von Pathogenen
verhindern soll (zusammengefasst in Nicholson und Hammerschmidt, 1992). Gleichzeitig war
bereits ab 2 dpi eine transkriptionelle Induktion des Shikimatweges festzustellen, was eine
Akkumulation des Stoffwechselintermediats Shikimat und der Endprodukte Phenylalanin und
Tyrosin bewirkte. Diese Aminosäuren stellen in Mais das Substrat für Phenylalanin-AmmoniumLyase (PAL) dar (Rösler et al., 1997), welche in Tumoren transkriptionell induziert war und eine
20-fach höhere Aktivität als in Kontrollblättern aufwies. Die Expression von PAL wird unter
anderem durch das Antioxidanz Glutathion (GSH) induziert (Gomez et al., 2004) und begleitend
zur PAL-Induktion wurden in Tumoren erhöhte Gehalte an GSH gemessen. PAL katalysiert die
108
DISKUSSION
Eintrittsreaktion in den Phenylpropanstoffwechsel (Rohde et al., 2004), welcher in Tumoren
ebenfalls auf Transkriptebene induziert war. Parallel akkumulierten Hydroxyzimtsäure-Derivate
in Tumoren, welche die Bausteine für die Ligninbiosynthese liefern.
Der Shikimatweg stellt jedoch nicht nur das aromatische Grundgerüst für Phenylpropane bereit,
sondern
speist
auch
die
Anthocyan-
und
die
Tryptophan-Biosynthese.
Anthocyane
akkumulieren als Antwort auf viele biotische und abiotische Stresssituationen in der Vakuole
(Chalker-Scott, 1999) und ihnen konnten antimikrobielle Eigenschaften nachgewiesen werden
(Puupponen-Pimia et al., 2001). Da U. maydis jedoch nicht mit der Vakuole in Kontakt kommt,
scheint die Akkumulation in Tumoren eher eine generelle, als eine spezifische Stressantwort zu
sein.
Tryptophan dient als Substrat für die Synthese von DIMBOA, einem von Mais synthetisierten
Phytoalexin. Das erste Gen der DIMBOA-Biosynthese ist durch U. maydis-Infektion
transkriptionell induziert (Basse, 2005), so dass die Induktion des Shikimatwegs auch der
Phytoalexin-Produktion dienen könnte.
Die Lignifizierung der Zellwand und Produktion von Phytoalexinen ist also nach U. maydisInfektion induziert, jedoch scheinen diese Abwehrreaktionen keine effetive Wirkung auf das
Pathogen zu zeigen, weshalb sie vermutlich nicht durch U. maydis supprimiert werden.
5.2.1.4 Der Kohlenstoff-Fluss durch Stoffwechselintermediate ist in Tumoren erhöht
Der Citratzyklus ist ein zentraler Stoffwechselweg, der für den Großteil der Kohlenhydrat-,
Aminosäure- und Fettsäureoxidation verantwortlich ist, sowie C-Gerüste für anabolische
Prozesse liefert (Fernie et al., 2004). Für inkompatible Pflanzen-Pathogen Interaktionen wird
vermutet, dass eine Erhöhung des Kohlenstoff-Flusses durch den Citratzyklus den erhöhten
Energiebedarf der induzierten Abwehrantwort deckt (Bolton und Thomma, 2008, Bolton, 2009).
Über die MapMan-Visualisierung der transkriptionellen Veränderungen nach U. maydisInfektion wurde deutlich, dass Gene des Citratzyklus in Tumoren induziert sind, obwohl es sich
hierbei um eine kompatible Interaktion handelt. Gleichzeitig akkumulierten Intermediate dieses
Stoffwechselweges. Diese Akkumulation von Citratzyklus-Intermediaten wurde ebenfalls in der
frühen kompatiblen Interaktion von Magnaporthe grisea mit drei verschiedenen Wirtspflanzen
(Reis, Gerste und Brachypodium distachyon) beobachtet (Parker et al., 2009) und scheint somit
eine generelle Antwort auf Pathogenbefall darzustellen.
Um den Fluss von Kohlenstoff durch verschiedene Metabolitfraktionen in U. maydis-infizierten
Blättern zu charakterisieren, wurde daher ein
14
C-Puls-Verfolgungsexperiment durchgeführt.
Nach dem Puls zeigte sich, dass in Tumoren mehr
14
C in den anionischen Fraktionen
(Carbonsäuren und phosphorylierte Intermediate) wiedergefunden wurde als in gesunden
Blättern, in denen
14
C hauptsächlich in der neutralen Fraktion (Zucker) akkumulierte. In
Tabakpflanzen wurde ebenfalls eine verringerte Allokation von
14
C in der neutralen Fraktion in
sink- im Vergleich zu source-Blättern beobachtet (Voll, 1998). Daher scheint dies ein generelles
Merkmal für sink-Gewebe darzustellen. Die höhere Markierung der Carbonsäurefraktion
109
DISKUSSION
korreliert mit der Beobachtung, dass eine C3-PEPC, welche in der Lage ist, CO2 in den
Citratzyklus zu leiten (Heldt und Piechulla, 2008), in Tumoren transkriptionell induziert ist. Bei
genauerer Betrachtung der netto Kohlenstoff-Flüsse in der
14
C-Puls-Verfolgung wurde deutlich,
dass in gesunden Blattsegmenten nach 180 Minuten Verfolgung Kohlenstoff aus den
anionischen Fraktionen und der kationischen Fraktion in die neutrale (Zucker-) und die
Stärkefraktion floss. In Tumoren hingegen wurde Kohlenstoff netto aus der neutralen und der
Phosphointermediat-Fraktion in die Stärkefraktion geleitet, während kein Kohlenstoff aus der
kationischen Fraktion und der Fraktion der organischen Säuren floss (siehe Abbildung 46). Dies
lässt sich so interpretieren, dass im Tumor Zucker vermehrt metabolisiert werden, während
Zucker in den von der Pflanze abgetrennten Segmenten gesunder source-Blätter als
Kohlenstoffspeicher dienen. Der Verbleib der Radioaktivität in der Aminosäure- und der
Carbonsäurefraktion in Tumoren deutet darauf hin, dass die Kohlenstoffgerüste des Citratzyklus
für die Biosynthese von Aminosäuren herangezogen werden, welche nach Deaminierung
wieder zurück in den Citratzyklus fließen. Eine Entnahme von Kohlenstoff aus dem Citratzyklus
bewirkt einen erhöhten Fluss durch diesen und setzt eine Erhöhung der NAD+-Regeneration
voraus (Fernie et al., 2004). Dazu werden Elektronen an die alternative Oxidase (AOX)
weitergeleitet, welche keine Protonen transportiert, jedoch zur Regeneration von NAD+ beiträgt
(Vanlerberghe und McIntosh, 1997). In U. maydis induzierten Tumoren ist 8 dpi Aox1
transkriptionell 5,5-fach induziert, was für einen erhöhten Fluss an Kohlenstoff durch den
Citratzyklus spricht.
Diese Daten charakterisieren den hochaktiven Aminosäuremetabolismus in Tumoren und
unterstreichen die Beobachtungen der Transkriptomanalyse, die zeigte, dass sowohl der
Aminosäureanabolismus und -katabolismus transkriptionell induziert ist. Abbildung 46 zeigt ein
Modell der beobachteten Kohlenstoff-Flüsse.
Abbildung 46 Modell der netto Kohlenstoff-Flüsse in der Verfolgung nach
Blattsegmente A gesunder und B tumorisierter Pflanzen wurden 6 dpi mit
180 min Verfolgung mit
12
14
14
CO2-Markierung.
CO2 markiert und einer
CO2 ausgesetzt. Die Pfeile zeigen den netto Kohlenstoff-Fluss bestimmter
Fraktionen in andere Fraktionen an. In gesunden source-Blättern fließt Kohlenstoff vermehrt in Stärke
und wird für die Synthese von Zuckern verwendet, welche in abgetrennten source-Blattsegmenten als
Kohlenstoff-Speicher dienen. In Tumoren hingegen wird Kohlenstoff aus Zuckern und phosphorylierten
Intermediaten für die Biosynthese von Stärke verwendet, während die Kohlenstoff-Pools der
Carbonsäure- und Aminosäurefraktionen ineinander überführt werden.
110
DISKUSSION
5.2.2 Stickstoff-Metabolismus U. maydis-induzierter Tumore
5.2.2.1 Tumore stellen ein sink für Stickstoff dar
In Tumoren war die primäre Stickstoffassimilation ab 4 dpi reduziert, was sich auf Transkript-,
Metabolit- und Enzymaktivitätsebene widerspiegelte. Eine Reduktion der primären N-Assimilation wurde auch in A. tumefaciens-induzierten Tumoren an Arabidopsis- und Ricinus
communis Stängeln beobachtet (Mistrik et al., 2000, Deeken et al., 2006), obwohl in diesen
Tumoren bis zu 8-fach höhere Aminosäuregehalte gemessen wurden als in Kontrollstängeln.
Auch U. maydis-induzierte Tumore akkumulierten mehr freie Aminosäuren als gesunde Blätter.
Gleichzeitig war die Expression von Asparagin Synthetase und Aspartat-Aminotransferase
induziert, was trotz der verringerten N-Assimilation auf eine hohe N-Verfügbarkeit hindeutet
(Lam et al., 1996).
Die Untersuchung der Gehalte einzelner Aminosäuren ergab, dass die Aminosäurezusammensetzung in Tumoren dem von sink-Blättern ähnelt und sich deutlich von der
Zusammensetzung in source-Blättern unterscheidet. Insbesondere N-reiche Aminosäuren, wie
Gln, Asn und Arg akkumulierten im Vergleich zu nicht-infizierten Kontrollblättern und hatten in
der PCA ein starkes Gewicht auf die Hauptkomponente, welche mit der Infektion korrelierte.
Gln- und Arg-, sowie der Gesamt-Aminosäuregehalt blieben dabei über den gesamten
Infektionsverlauf konstant hoch, während sie in Kontrollblättern mit dem Austreten aus dem
Blattkanal (entspricht 2 dpi) absanken. Diese Beobachtung korrelierte mit der Hypothese der
sink-Retention in Tumoren, welche bereits aufgrund der Betrachtung des KohlenstoffMetabolismus aufgestellt wurde. Asparagin akkumuliert in Pflanzen in der Regel unter
Kohlenstoff-limiterten Bedingungen und dient beispielsweise in Arabidopsis dem StickstoffExport während der Dunkelphase (Coruzzi, 2003), da diese Aminosäure ein hohes N/CVerhältnis aufweist (Lam et al., 1996). Da die Infektion von Mais mit U. maydis durch die
Induktion des Zellwandmetabolismus und die Versorgung des Pilzes mit Kohlenhydraten mit
einem erhöhten C-Bedarf einhergeht (Snoeijers et al., 2000), könnte die Akkumulation von Asn
durch C-Limitation erklärt werden. Da aber gezeigt werden konnte, dass Kohlenhydrate in
Tumoren in hohem Ausmaß verfügbar sind, scheint Asn als N-Speicher zu dienen, was die
hohe sink-Stärke des Tumors für Stickstoff widerspiegelt (Lea et al., 2007).
Eine transiente Akkumulation von N-reichen Aminosäuren wurde ebenfalls während der ersten
24 bis 48 h der Infektion von Kartoffel-, Mais- und Gerstenblättern mit Phytophthora infestans
(Grenville-Briggs et al., 2005), Colletotrichum graminicola (Anna-Maria Koszucka, FAU
Erlangen-Nürnberg, unveröffentliche Daten) bzw. Blumeria graminis f.sp. hordei (Doreen Zajic,
FAU Erlangen-Nürnberg, unveröffentliche Daten) beobachtet. Da diese Akkumulation während
der frühen biotrophen Phase der Infektionen auftrat, könnte Stickstoff für die Wirtsabwehr
benötigt werden oder den Bedarf des Pathogens an organischem Stickstoff widerspiegeln.
Stickstoff-reiche Aminosäuren akkumulierten auch während des späten nekrotrophen
Wachstums von P. syringae auf Tomate (Olea et al., 2004) und C. lindemuthianum in
Phaseolus vulgaris Blättern (Tavernier et al., 2007). In beiden Studien wurde ebenfalls eine
111
DISKUSSION
Reduktion der primären N-Assimilation, sowie eine Induktion in der Expression von
cytosolischer Glutamin Synthetase (GS) und Glutamat Dehydrogenase (GDH) beobachtet.
Beide Gene sind typische Seneszenzmarker, welche in der Remobilisierung von Ammonium
involviert sind, welches während des Proteinabbaus, der mit Beginn der Seneszenz einsetzt,
freigesetzt wird (Kamachi et al., 1991, Masclaux et al., 2000). In U. maydis-induzierten Tumoren
war keine der cytosolischen GS-Isoformen differentiell reguliert, und nur eine GDH (Zm.17860)
war
transkriptionell
leicht
induziert.
Desweiteren
waren
keine
der
klassischen
Seneszenzmarker, wie ZmSee1 und ZmSee2 (Smart et al., 1995) in Tumoren induziert. Dieser
Vergleich zeigt, dass sich der N-Metabolismus in Tumoren deutlich vom N-Metabolismus in
anderen Pflanzen-Pathogen-Interaktionen unterscheidet.
5.2.2.2 Organischer Stickstoff wird aus systemischen source-Blättern in Tumore geleitet
Nach Düngung mit
15
NO3- stiegen die Gehalte aller getesteten Aminosäuren in gesunden
Pflanzen transient an. Diese transiente Akkumulation war in Tumoren nur schwach ausgeprägt
und stattdessen stieg der Gehalt an Asn über den analysierten Zeitraum stetig, während AsnGehalte in gesunden Blättern selbst nach Nitratdüngung niedrig blieben. Gleichzeitig war auch
die Inkorporation von
15
N in allen getesteten Fraktionen (Gesamt-N, freie Aminosäuren,
Proteine) im Tumorgewebe verringert. Diese Daten deuteten wie schon die Transkript-,
Metabolit- und Aktivitätsdaten eine geringere Kapazität der Nitratassimilation in Tumoren an.
Obwohl die Tumorausbildung also mit einer Reduktion der primären N-Assimilation einherging
akkumulierte nach Düngung infizierter Pflanzen mit
15
NO3- mehr
15
N in Tumoren als in
korrespondierenden Blättern nicht-infizierter Pflanzen. Dies erscheint zunächst widersprüchlich,
kann jedoch dadurch erklärt werden, dass Tumore einen größeren Anteil an der Biomasse der
gesamten Pflanze ausmachen als das korrespondierende Blatt nicht-infizierter Pflanzen.
Gleichzeitig war der Import organischen Stickstoffs aus systemischen source-Blättern in
Tumoren deutlich höher als in gesunden Pflanzen. Zusammengenommen deutet dies darauf
hin, dass aus dem Boden aufgenommenes Nitrat zunächst in systemischen source-Blättern
assimiliert und dann in organischer Form in den Tumor geleitet wird (Abbildung 48). Da
gleichzeitig der Export organischen Stickstoffs aus Tumoren nicht höher ist als der Export aus
korrespondierenden Blättern gesunder Pflanzen, weisen Tumore einen netto Import von
Aminosäuren auf, wie es auch schon für Kohlenstoff gezeigt werden konnte (Billett und Burnett,
1978b), was sie nach klassischer Definition als sink-Organe determiniert.
Der erhöhte Import von organischem Stickstoff in Tumore führt insbesondere zu einer
Akkumulation N-reicher Aminosäuren. Über die Analyse der Aminosäuregehalte im Gewebe
lässt sich generell keine Aussage darüber treffen, wie hoch die Konzentration an der biotrophen
Grenzfläche ist. Da U. maydis jedoch präferentiell entlang der Leitbündel wächst (Doehlemann
et al., 2008b, Doehlemann et al., 2009), welche sehr hohe Konzentrationen an Assimilaten
aufweisen (Lohaus et al., 1998, Lohaus et al., 2000), ist es unwahrscheinlich, dass U. maydis in
planta Stickstoff-limitiert ist.
112
DISKUSSION
Glutamin wird im Maiskultivar B73 eine entscheidende Rolle bei der Stickstoffmobilisierung
während der Kornbeladung zugeschrieben, da Maismutanten, denen bestimmte Glutamin
Synthetase (GS)-Isoformen fehlen, weniger und kleinere Körner aufweisen (Martin et al., 2006).
Obwohl organischer Stickstoff in Tumoren bevorzugt als Asn oder Gln akkumulierte, machen
diese Aminosäuren nur einen geringen Anteil im Phloem systemischer source-Blätter aus. Im
Zusammenhang mit der Induktion der Asn-Biosynthese in Tumoren zeigt dies, dass diese
Aminosäuren spezifisch im Tumor syntetisiert und nicht direkt über das Phloem angeliefert
werden. Die Akkumulation von Gln, einem entscheidenden Stickstoffdonor (Coruzzi, 2003),
spiegelt die hohe Aktivität des Aminosäureumbaus in Tumoren wider, während die
Akkumulation von Asn, welches als Stickstoffspeicher dienen kann (Coruzzi, 2003), eine
Stickstoffsättigung im Tumor vermuten lässt.
Die erhöhte Versorgung des Tumors mit Stickstoff steht wiederum im Gegensatz zu
Beobachtungen,
die
während
des
nekrotrophen
Wachstums
von
P.
syringae
und
C. lindemuthianum auf ihren Wirten gemacht wurden. Dort wurde hypothetisiert, dass Stickstoff
in
infizierten
Blättern
durch
Asparagin
Synthetase,
cytosolische
GS
und
Glutamat
Dehydrogenase mobilisiert und in uninfizierte Blätter exportiert wird (Olea et al., 2004, Tavernier
et al., 2007). Desweiteren wurde beobachtet, dass nach Befall von gefleckten Flockenblumen
(Centaurea maculosa) mit dem Wurzelherbivor Agapeta zoegana die Stickstoffaufnahme
reduziert war und Stickstoff von der Wurzel in den Spross transloziert wurde (Newingham et al.,
2007). Diese Beispiele aus völlig unterschiedlichen Pathosystemen zeigen, dass Pflanzen eine
Strategie entwickelt haben, um die Stickstoffverfügbarkeit infizierter Pflanzenteile zu verringern.
Ustilago maydis scheint diese Wirtsantwort zu überwinden, indem hypertrophe Tumore induziert
werden, die stärker sind als natürliche sink-Organe, was daran deutlich wird, dass N-reiche
Aminosäuren in jungen systemischen sink-Blättern infizierter Pflanzen weniger stark
akkumulieren als in sink-Blättern gesunder Pflanzen (Abbildung 48).
5.2.2.3 Verwertung von Stickstoff im Tumor
Wie die
14
C-Markierungsexperimente zeigten, trat in Tumoren ein hoher Fluss von Kohlenstoff
durch den Citratzyklus auf. Da gleichzeitig Aminosäuren akkumulierten und Gene des
Aminosäuremetabolismus induziert waren, wurden Fütterungsexperimente mit radioaktiv
markierten Aminosäuren durchgeführt. Die Fütterungen wurden mit Asn und Gln durchgeführt,
da
Asn
in
Pflanzen
als
N-Speicher
dient
und
Gln
ein
Stickstoffdonor
in
vielen
Transaminierungsreaktionen ist (Coruzzi, 2003). Die Aufnahme von Asn war im Vergleich zu
Kontrollblättern in Tumoren nicht verändert, Gln wurde jedoch schlechter von Tumoren als von
Kontrollblättern aufgenommen. Während das Kohlenstoff-Gerüst von Asn in Kontrollblättern in
die Stärkefraktion floss und ein Großteil der Markierung in der Kationenfraktion verblieb, wurde
das Kohlenstoff-Gerüst in Tumoren nur in geringem Ausmaß für die Stärkebiosynthese
verwendet. Stattdessen wurde Asn durch Deaminierungsreaktionen in Stoffwechselintermediate
überführt, was die hohe Aktivität des Aminosäureumbaus in Tumoren widerspiegelt. Diese
113
DISKUSSION
erhöhte Metabolisierung wurde im Tumor auch nach Gln-Fütterung beobachtet, was zeigte,
dass Asn und Gln zwar unterschiedlich effizient im Tumor aufgenommen werden, jedoch
ähnlich metabolisiert werden. Inwiefern U. maydis an der beobachteten Metabolisierung von
Aminosäuren beteiligt ist, lässt sich aufgrund des geringen Volumenanteils an Pilzgewebe im
Tumor nicht abschätzen. Verglichen mit Sporidien, welche direkt nach der Ernte von Peptonhaltigem Medium und kurzem Verweilen auf der Blattoberfläche geerntet wurden, waren von
U. maydis in planta 9 dpi lediglich drei Gene der Tryptophanbiosynthese differentiell reguliert,
während andere Gene des N-Stoffwechsels keine veränderte Expression aufwiesen (Jörg
Kämper, unveröffentliche Daten). Dies lässt vermuten, dass die Stickstoffversorgung von
U. maydis in Flüssigkultur und in voll entwickelten Tumoren ähnlich ist. Da die Sporidien in
diesen Experimenten in Pepton-haltigem Medium angezogen wurden, also alle proteinogenen
Aminosäuren direkt verfügbar waren, deutet dies darauf hin, dass auch im Tumor die gesamte
Bandbreite an Aminosäuren (eventuell mit der Ausnahme von Trp) verfügbar ist. Unter
Berücksichtigung dieser Annahme und der erhobenen Mais-Transkriptomanalyse wird daher
gefolgert, dass der Umbau der Aminosäuren hauptsächlich im Wirtsgewebe stattfindet.
Parallel zur Akkumulationen einzelner Aminosäuren und zum erhöhten Aminosäureumbau in
Tumoren wurde nach U. maydis-Infektion eine erhöhte Inkorporation von
35
S-Methionin in
Proteine festgestellt. Die Transkriptdaten zeigten, dass die cytosolische Proteinbiosynthese in
Tumorzellen induziert ist. Die cytosolischen Ribosomen produzieren nach Pathogenbefall große
Mengen an PR-Proteinen (Stintzi et al., 1993), welche auch nach U. maydis-Befall induziert
waren (beschrieben in Doehlemann et al., 2008a). Gleichzeitig war jedoch die plastidäre
Proteinbiosynthese in Tumoren transkriptionell reprimiert, was dazu führte, dass Proteine der
Photosynthese in Tumoren weniger stark akkumulierten als in gesunden Blättern. Unabhängig
von der Induktion der cytosolischen Proteinbiosynthese kann angenommen werden, dass die
gesamte Wirts-Proteinbiosynthese in Tumoren reduziert ist, da im gesunden Blatt der
Photosyntheseapparat den Großteil des zellulären Proteins ausmacht, wobei RubisCO bis zu
50% des Gesamtproteins ausmachen kann (Leegood et al., 2000). Zusammengenommen
deutet dies darauf hin, dass die Erhöhung der
35
S-Methionin-Inkorporation in Tumoren auf die
pilzliche Proteinbiosynthese zurückzuführen ist.
5.2.2.4 Modell der Assimilatverwertung in Tumoren
Basierend auf den aus Tumoren gewonnen Daten kann ein Modell aufgestellt werden, welches
die Verwertung von Kohlenstoff- und Stickstoff-Assimilaten im Tumorgewebe schematisch
darstellt. Abbildung 47 fasst die Transkript- und Metabolitdaten, sowie die Erkenntnisse aus den
physiologischen Experimenten zusammen.
114
DISKUSSION
Abbildung 47 Modell der Assimilatverwertung in Tumorgewebe. Die Photosynthese (PS) der
Calvinzyklus, der Stärkeumsatz, die plastidäre Proteinbiosynthese (BS) und die Saccharose- (S)
Biosynthese sind reprimiert. Aminosäuren (AS) und Saccharose werden vermehrt in den Tumor
importiert, während die Versorung durch Xylem-mobile Minerialien verringert ist. Saccharose wird direkt
über Srt1 in das Pilzgewebe aufgenommen oder durch Zellwand-gebundene Invertasen (zwInv) im
Apoplasten zu Hexosen (Hex) umgesetzt, welche von U. maydis über Hxt1 aufgenommen werden. In die
Tumorzellen importierte Saccharose wird in der Vakuole durch Ivr2 zu Hexosen umgesetzt oder durch
Sus1 für die Zellwandbiosynthese bereitgestellt. Aminosäuren werden entweder direkt von U. maydis
durch bisher unbekannte Transporter aufgenommen oder in der Tumorzelle durch Asparagin Synthetase
(AsnS) umgesetzt und als Asn gespeichert bzw. in den Citratzyklus eingespeist. Der damit verbundene
Umbau der AS speist die cytosolische Proteinbiosynthese. Ein Teil der umgebauten AS wird zurück in
den Apoplasten transportiert und kann durch U. maydis aufgenommen werden, um die pilzliche
Proteinbiosynthese treiben. Der Citratzyklus liefert zusätzlich die Kohlenstoff-Gerüste für die Biosynthese
von Sekundärmetaboliten. Violette Pfeile beschreiben die Verwertung von Saccharose, grüne Pfeile die
Verwertung von AS und deren C-Gerüste. Schwarze Pfeile neben zellulären Prozessen weisen auf deren
Aktivität in Tumorzellen im Vergleich zu gesunden Zellen hin (hoch: induziert, runter: reprimiert).
115
DISKUSSION
5.3 Die Ausbildung von Tumoren beeinflusst den Metabolismus
der ganzen Pflanze
Durch die Etablierung eines starken sink-Gewebes an der Infektionsstelle wird die sink-source
Balance der gesamten Wirtspflanze durch die Tumorinduktion verändert. Um diesen Effekt zu
charakterisieren
wurden
systemische,
nicht-infizierte
Bereiche
infizierter
Pflanzen
auf
Transkript- und Metabolitebene analysiert.
5.3.1 U. maydis-Infektion induziert Abwehr-assoziierte Genexpression in
systemischen source-Blättern
Die Transkriptanalyse der oberen systemischen Blätter, die mit dem Affymetrix Maize
Genechip® durchgeführt wurden, ergaben, dass im Vergleich zu den gleichen Blättern nichtinfizierter Pflanzen lediglich drei Gene differentiell reguliert waren.
Bei der Untersuchung der transkriptionellen Veränderungen in Leitbündeln unterer systemischer
Blätter wurde ein Agilent Mikroarray-Chip verwendet. Dabei zeigte sich, dass 1070 Gene in
Tumoren dereguliert waren. Die Diskrepanz zwischen den Daten aus oberen und unteren
systemischen Blättern lässt sich daher vermutlich auf das Arraydesign zurückführen,
insbesondere da für Affymetrix Mikroarrays lediglich 20-mere als Sonden dienten und die
Abdeckung
von
PR-Genen
auf
dem
Affymetrix
Genechip®
schlecht
ist
(siehe
http://www.affymetrix.com/products_services/ arrays/specific/maize.affx#1_1 für eine Liste der
repräsentierten Gene). Jedoch kann nicht ausgeschlossen werden, dass eine Anreicherung der
Leitbündel in oberen systemischen Blättern ebenfalls eine höhere Anzahl an deregulierten
Genen zu Tage geführt hätte, oder dass generell Unterschiede in der transkriptionellen Antwort
auf U. maydis-Infektion oberer und unterer systemischer Blätter auftreten.
Dreizehn der 27 am stärksten durch U. maydis-Infektion induzierten Gene konnten mit einer
Abwehrreaktion assoziiert werden. Unter ihnen befanden sich ein Bowman-Birk-Typ
Trypsininhibitor (ACG30455), PR-5 (NP_001105702), PR-6 (ABB04441) und Polyaminoxidase1
(NP_001105106). Für Polyaminoxidase wurde gezeigt, dass es in Tabak (Nicotiana tabacum)
eine entscheidende Rolle in der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) während der
hypersensitiven Antwort (HR) gegen Pathogenbefall spielt (Yoda et al., 2003, Yoda et al., 2006,
Yoda et al., 2009). Die HR ist eine besondere Form des programmierten Zelltods und wird in
inkompatiblen biotrophen Interaktionen ausgelöst (Greenberg, 1997). PR-5 ist ein Thaumatinähnliches Protein, welches pilzliche Membranen durchdringen kann (Anzlovar und Dermastia,
2003) und dessen Überexpression in Weizen zu erhöhter Resistenz gegenüber Fusarium
graminearum führte (Chen et al., 1999), während PR-6, ein Proteinaseinhibitor, Wirkung gegen
Nematoden und Herbivoren zeigte (van Loon et al., 2006). Bowman-Birk-Typ Trypsininhibitoren
sind auch im infizierten Maisblatt durch U. maydis induziert (Doehlemann et al., 2009) und sind
in Reis durch Jasmonsäure induzierbar (Rakwal et al., 2001).
Die Induktion eines breiten Repertoires an Abwehrgenen in systemischen Blättern nach
U. maydis-Infektion zeigt, dass diese Blätter aufgrund der Infektion ein Signal erhalten, eine
116
DISKUSSION
Abwehrantwort in nicht-befallenen Organen zu induzieren. In Mais konnte nach Behandlung von
Blättern mit Salicylsäure und Salicylsäure-Analoga eine erhöhte Expression von PR-1 und PR-5
festgestellt werden (Morris et al., 1998). Der Befall von Maispflanzen durch die Mottenlarve
Spodoptera littoralis bewirkte die Produktion flüchtiger organischer Substanzen, welche in der
Lage waren, in benachbarten, nicht-infizierten Maispflanzen, die Expression von Abwehrgenen
zu induzieren (Ton et al., 2007), und der Wurzelbefall durch die Larve des westlichen
Maiswurzelbohrers (Diabrotica virgifera) induzierte eine Abwehrantwort im Spross, die auf eine
spezifische Rolle von Abszisinsäure schließen lässt (Erb et al., 2009). Das U. maydis-Mais
Pathosystem
könnte
also
ein
attraktives
Modell
darstellen,
um
die
systemische
Signaltransduktion nach Pathogenbefall in Mais zu untersuchen.
In unteren systemischen Blättern war die Expression von Brittle-stalk2 (Bk2) durch U. maydisInfektion reprimiert. Das Bk2-Gen kodiert für ein COBRA-ähnliches Protein welches
insbesondere in jungen Maisblättern exprimiert wird (Sindhu et al., 2007). Natürliche Mais bk2Mutanten weisen brüchige oberirdische Organe (Langham, 1940) und reduzierte Gehalte an
Cellulose in der Zellwand auf, was mit einer Veränderung der Struktur der sekundären Zellwand
einhergeht (Ching et al., 2006, Sindhu et al., 2007). Die gleichzeitige Repression von sechs
Cellulosesynthasen in unteren systemischen Blättern könnte daher eine Folge der Bk2Repression sein. In bk2-Maisstängeln geht die Reduktion des Cellulosegehaltes mit einer
erhöhten Deposition von Lignin einher (Sindhu et al., 2007), welches eine andere
Zusammensetzung aufwies als in Wildtyp-Maispflanzen. Die pflanzliche Zellwand stellt eine
effektive Barriere gegen die meisten Mikroorganismen dar (Cantu et al., 2008), weshalb sich
eine Schwächung der sekundären Zellwandstruktur, wie sie in bk2-Pflanzen beobachtet wurde,
negativ auf die Resistenz gegenüber Pathogenen auswirken sollte. Eine erhöhte Lignifizierung
hingegen könnte die Zellwand für Pathogene impermeabel machen (Nicholson und
Hammerschmidt, 1992).
Cellulosesynthasen können auch eine Rolle in der Signaltransduktion spielen. In Arabidopsis
wurde eine Mutante (cev1) charakterisiert, welche einen Defekt in der Cellulosesynthase
CeSA3 aufweist und eine konstitutive Expression Stress-responsiver Gene zeigt (Ellis et al.,
2002a). Cev1 wird in Wurzeln exprimiert und cev1-Mutanten weisen trotz verringerter
Cellulosegehalte eine erhöhte Resistenz gegenüber biotrophen pilzlichen und bakteriellen
Pathogenen auf (Ellis et al., 2002b). Auch andere Arabidopsis Cellulosesynthase-Mutanten
weisen erhöhte Resistenz gegenüber bakteriellen und pilzlichen Pathogenen auf, was zeigt,
dass Veränderungen in der Zusammensetzung der sekundären Zellwand spezifische
Abwehrreaktionen hervorrufen können (Hernandez-Blanco et al., 2007).
Die Rolle von Bk2 in globalen Entwicklungsprogrammen wurde bisher noch nicht studiert, so
dass über die Funktion von Bk2 in der Integration von Entwicklungssignalen keine Aussage
getroffen werden kann (Sindhu et al., 2007). Die hier beobachtete Induktion der Abwehrantwort
117
DISKUSSION
und gleichzeitige Repression von Bk2 und mehreren Cellulosesynthasen deutet jedoch auf eine
Rolle von Bk2 und Mais Cellulosesynthasen in der systemischen Abwehrantwort von Mais hin.
5.3.2 Symptomfreie Bereiche infizierter Blätter betreiben Photosynthese und
weisen erhöhte Glyoxylatzyklus-Aktivität auf
Unter Laborinfektionsbedingungen weisen U. maydis-infizierte Blätter Blattbereiche auf, die
weder tumorisiert, noch chlorotisch sind. Obwohl diese Bereiche direkt an Tumore angrenzen
die ein starkes sink für Kohlenstoff und Stickstoff darstellen, waren 8 dpi lediglich 23 Gene im
Vergleich zu Wasser-behandelten Blättern differentiell exprimiert. Die geringe Anzahl an
deregulierten Genen basiert vermutlich auf Sequenzunterschieden zwischen einzelnen
Maiskultivaren, die eine verlässliche Affymetrix-Mikroarrayhybridisierung erschweren (siehe
5.1). Da die Transkriptomdaten jedoch mit Metabolit- und physiologischen Analysen kombiniert
worden sind, sollen die Ergebnisse hier diskutiert werden.
Weder Abwehr-, noch Photosynthese-assoziierte Gene waren in diesen Blattregionen stark
dereguliert und tatsächlich war die Photosynthese in diesen Regionen nicht beeinträchtigt. Dies
steht im Gegensatz zu Untersuchungen an anderen Interaktionen von (hemi-)biotrophen
Pathogenen und Pflanzen: So war die Photosyntheseleistung in der Nähe von sichtbaren
Mehltau-Infektionsstellen auf Gerstenblättern (Swarbrick et al., 2006), von Albugo candida
(Weißer Rost) auf Arabidopsisblättern (Chou et al., 2000) und nach Einsetzen der nekrotrophen
Phase von Pseudomonas syringae auf Arabidopsisblättern (Berger et al., 2007) stark
beeinträchtigt. Auch bei Infektion von Arabidopsisblättern mit dem hemibiotrophen Pilz
Colletotrichum higginsianum war nach Einsetzen der nektrotrophen Phase eine Reduktion der
ETR unmittelbar um Nekrosen herum zu beobachten. In der biotrophen Phase war jedoch keine
Auswirkung auf die Photosyntheseleistung der infizierten Blätter festzustellen (Engelsdorf,
2008).
Zwei der vier Metabolismus-assoziierten Gene, die in symptomfreien Bereichen induziert waren,
sind Schlüsselenzyme des Glyoxylatzyklus, der in Pflanzen die Umwandlung von Fettsäuren in
Carbonsäuren bewerkstelligt und netto aus zwei Molekülen Acetyl-CoA Succinat bereitstellt,
welches für die Gluconeogenese oder andere anabolische Prozesse verwendet werden kann
(Eastmond und Graham, 2001, Heldt und Piechulla, 2008). Da gleichzeitig Succinat,
Intermediate der Gluconeogenese und dessen Produkt, Hexosen, in diesen Blattbereichen im
Vergleich zu gesunden Blättern akkumulierten, scheint neben der Aktivität der beiden
Schlüsselenzyme auch die Aktivität des gesamten Zyklus erhöht zu sein. Da die Gehalte an
Succinat, PEP und 3-Phosphoglycerat auch über den Gehalten lagen, die in Tumoren
gemessen wurden, und Isocitratlyase (ICL) und Malatsynthase (MS) in Tumoren nicht induziert
waren,
kann
eine
Verunreinigung
des
geernteten
Materials
durch
Tumorgewebe
ausgeschlossen werden.
Die Rolle des Glyoxylatzyklus in pilzlichen Pathogenen bei der Mobilisierung von Lipidreserven
für die Penetration der Wirtspflanze oder für die Nutzung von C2-Körpern wurde in vielen
118
DISKUSSION
Pathogenen ausführlich dokumentiert (zusammengefasst in (Dunn et al., 2009). Ob und welche
Rolle der Glyoxylatzyklus der Wirtspflanze in der Kompatibilität einer Pflanzen-Pathogen
Interaktion spielt, wurde bisher jedoch nur rudimentär beleuchtet. So konnte nach Befall von
Sojapflanzen (Glycine max) durch den nekrotrophen Pilz Botrytis cinerea ebenfalls eine
Induktion von ICL und MS beobachtet werden. Da es der Glyoxylatzyklus ermöglicht,
Kohlenstoff aus Lipidreserven in Kohlenhydrate zu überführen, könnte die Induktion dieses
Stoffwechselweges bedeuten, dass symptomfreie Bereiche infizierter Blätter ihre Lipidreserven
aufbrauchen,
um
den
eigenen
Bedarf
an
Kohlenhydraten
zu
decken,
was
auf
Kohlenstoffmangel in diesen Bereichen hindeutet - ICL und MS waren beispielsweise unter
Kohlenstoffmangel in Gurkenzellsuspensionen induziert (Graham et al., 1994). Eine andere
Möglichkeit ist, dass der benachbarte Tumor solch ein starkes Kohlenstoff-sink darstellt, dass
über
die
Lipidmobilisierung
der
benachbarten
symptomfreien
Bereiche
eine
weitere
Kohlenstoffquelle durch den Tumor genutzt wird. Blätter weisen generell nur wenige
Lipidreserven auf (Bresinsky et al., 2008), jedoch werden unter Seneszenzbedingungen auch
Strukturlipide abgebaut (Gut und Matile, 1988), so dass für die Bestätigung dieser Beobachtung
eine detallierte Analyse der Lipidgehalte in symptomfreien Bereichen infizierter Blätter nötig ist,
die im Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht durchgeführt worden ist.
5.3.3 Die Produktivität systemischer source-Blätter wird durch U. maydisInfektion erhöht
Da gezeigt werden konnte, dass Tumore vermehrt Kohlenhydrate (Billett und Burnett, 1978b)
und organischen Stickstoff importieren und dementsprechend lösliche Zucker und Aminosäuren
akkumulieren, wurde überprüft, ob dadurch die Produktivität systemischer source-Blätter
beeinflusst wird.
5.3.3.1 Der Assimilat-Export systemischer source-Blätter ist durch U. maydis-Infektion
erhöht
Die Untersuchung junger, systemischer Blätter U. maydis-infizierter Pflanzen zeigte, dass kaum
Veränderungen im Transkriptom und im Metabolom auftraten. Junge Blätter akkumulierten
lediglich weniger Kohlenhydrate und N-reiche Aminosäuren, was durch die starke sinkKonkurrenz durch den Tumor zu erklären ist. Die Analyse der Phloemexudate unterer
systemischer source-Blätter zeigte jedoch, dass diese erhöhte Aminosäure- und SaccharoseExudationsraten aufweisen als die gleichen Blätter nicht-infizierter Pflanzen, obwohl auf
transkriptioneller Ebene eine Induktion von Abwehr-assoziierten Genen festgestellt wurde
(siehe 5.3.1). Zusammen mit dem erhöhten Import an Assmiliaten in Tumore implizieren diese
Beobachtungen einen erhöhten Phloemfluss in das infizierte Blatt. Da ebenfalls Phloem-mobile
Mineralien in Tumoren akkumulierten, scheint die Tumorinduktion ein effizientes Mittel zu sein,
alle Phloem-mobilen Substanzen in den Tumor zu leiten. Andererseits wiesen Tumore
119
DISKUSSION
reduzierte Gehalte Xylem-mobiler Mineralien auf, was durch die verringerte Transpirationsrate
der infizierten Blätter erklärt wird, da der Xylemstrom, im Gegensatz zum Phloemstrom, durch
den Transpirationssog getrieben wird (Bresinsky et al., 2008). Dies bedeutet, dass Xylemmobile Mineralien (z.B. Eisen) eher limitierend für U. maydis sind als Phloem-mobile Mineralien
und Assimilate. Diese Hypothese wird dadurch unterstrichen, dass U. maydis ein hoch-affines
Eisen-Aufnahmesystem
aufweist,
welches
ihm
erlaubt,
selbst
unter
Eisen-limitierten
Bedingungen in planta zu proliferieren (Eichhorn et al., 2006).
5.3.3.2 Systemische Blätter betreiben nach U. maydis-Infektion erhöhte Photosynthese
Der erhöhte Export an Assimilaten systemischer source-Blätter infizierter Pflanzen geht mit
einer höheren Photosyntheseleistung dieser Blätter einher, welche mit einer reduzierten
Expression von Seneszenzmarkern und einem verzögertem Chlorophyllabbau korreliert. Die
Infektion durch U. maydis verzögert demnach die Seneszenz älterer Blätter. Da das Abdecken
von jungen, wachsenden Blättern den gleichen Effekt auf die Photosynthese von älteren
source-Blättern hatte, scheint die Verschiebung der sink-source Balance der ganzen Pflanze für
die verzögerte Seneszenz verantwortlich zu sein. Dies wird durch die Beobachtung
unterstrichen, dass nach Infektion mit U. maydis-Mutanten, welche trotz pilzlicher Proliferation
keine oder nur stark verringerte Tumorbildung am infizierten Blatt bewirkten, keine Verzögerung
der Seneszenz älterer source-Blätter verursacht wurde. Diese Beobachtungen zeigen, dass die
Verzögerung der Seneszenz nicht direkt durch ein U. maydis-generiertes Signal verursacht,
sondern durch die Induktion eines starken sinks, dem Tumor, erreicht wird. Diese sink-Wirkung
ähnelt damit der Wirkung A. tumefaciens-induzierter Tumore (Malsy et al., 1992, Mistrik et al.,
2000, Deeken et al., 2006).
Eine Verzögerung der Seneszenzinduktion wurde auch nach Infektion von R. communis durch
den pflanzlichen Parasiten Cuscuta reflexa beobachtet, welcher Assimilate direkt aus dem
Phloem der Wirtspflanze bezieht (Jeschke und Hilpert, 1997). In diesem System lassen sich
Wirts- und Parasitgewebe einfach voneinander trennen, so dass in der gleichen Studie gezeigt
werden konnte, dass die Aufnahme und Assimilation von Nitrat in der Wirtspflanze durch die
Infektion erhöht ist. Da nachgewiesen werden konnte, dass in den Leitbündeln systemischer
source-Blätter U. maydis-infizierter Pflanzen ein Nitrattransporter, Nitratreduktase und zwei
potentielle Aminosäuretransporter transkriptionell induziert waren, scheint die N-Assimilation in
systemischen Maisblättern wie in C. reflexa-befallenen R. communis Pflanzen erhöht zu sein.
Dass die sink-source Balance der Pflanze Einfluss auf den Beginn des Seneszenzprogramms
hat, ist bekannt (Nooden und Guiamet, 1989), und es wurde vermutet, dass eine Reduktion der
Photosyntheserate unter einen bestimmten Schwellenwert Seneszenz auslösen kann (Smart,
1994,
Bleecker
und
Patterson,
1997).
In
U.
maydis-infizierten
Maispflanzen
stimuliert der erhöhte Bedarf an Stickstoff und Kohlenstoff durch den Tumor den Export an
Kohlenstoff- und Stickstoff-Assimilaten aus systemischen source-Blättern, was eine erhöhte
Assimilation von Kohlenstoff und Stickstoff bedingt. Dies könnte bewirken, dass die
120
DISKUSSION
Photosyntheserate älterer source-Blättern länger über dem kritischen Schwellenwert bleibt als
in korrespondierenden Blättern nicht-infizierter Pflanzen, was die Seneszenz verzögern würde
(siehe Abbildung 48). Über die Bedeutung von Veränderungen im Hexosegehalt auf die
Seneszenz gibt es widersprüchliche Berichte (Dai et al., 1999, Lara et al., 2004, Kocal et al.,
2008). Da sich die Hexosegehalte in unteren systemischen source-Blättern infizierter Pflanzen
jedoch nicht vor Beginn der Seneszenz veränderten (Daten nicht gezeigt), scheint die Hexosenvermittelte Modulation der Seneszenz in diesem System keine, oder eine untergeordnete Rolle
zu spielen. Stattdessen könnte die erhöhte Exportrate selbst die Seneszenz verzögern.
Abbildung 48 Modell zur Veränderung von Stickstoff-Flüssen in U. maydis-infizierten Planzen. Die
Flüsse von anorganischem N (rote Pfeile) und Aminosäuren (grüne Pfeile) ist für gesunde (links) und U.
maydis-infizierte Pflanzen, welche Tumore beherbergen, (rechts) gezeigt. Die Dicke der Pfeile
korrespondiert mit der Flussrate. Zusätzlich ist die Verzögerung der Seneszenz unterer systemsicher
source-Blätter durch die Infektion angezeigt.
In der Vergangenheit wurde durch die Erzeugung transgener Pflanzen gezeigt, dass die
Biomasseproduktion und der Ertrag vieler Kulturpflanzen nicht source-limitiert, sondern durch
die sink-Stärke des Zielorgans für Kohlenstoff und Stickstoff limitiert sind (Herbers und
Sonnewald, 1998, Okita et al., 2001). So führte die Expression einer Rückkoppelungsinsensitiven PEPC in Erbsensamen zu erhöhten Carbonsäure- und Speicherprotein-Gehalten,
was andeutete, dass der anaplerotische Kohlenstoff-Fluss limitierend für die Proteinbiosynthese
in Erbsensamen ist (Rolletschek et al., 2004). In U. maydis-induzierten Tumoren wurde
ebenfalls ein Anstieg in den Gehalten von Citratzyklus-Intermediaten (Isocitrat, Citrat, Succinat)
beobachtet. Die Erhöhung der sink-Stärke durch die Organ-spezifische Überexpression einer
Aminosäurepermease in Erbsensamen resultierte in bis zu 25% erhöhter Akkumulation von
Speicherproteinen und in höheren Gehalten an Stickstoff-reichen Aminosäuren (Asn, Gln, Arg)
(Rolletschek et al., 2005). In diesen transgenen Pflanzen waren auch das vegetative
Wachstum, sowie die Aufnahme von Ammonium aus dem Boden erhöht. Die Stimulation des
121
DISKUSSION
Stickstoff-Metabolismus der gesamten Pflanze durch die Erhöhung der sink-Stärke im Zielorgan
ähnelt dabei dem von U. maydis-induzierten Tumoren ausgelösten Effekt.
Diese Ergebnisse verbinden die Seneszenzinduktion und source-Blattproduktivität mit der
erhöhten sink-Stärke infizierter Pflanzen. Das U. maydis-Mais Pathosystem stellt somit ein
attraktives System dar, um die Rolle der source-sink Balance auf die Seneszenz und den
Einfluss der sink-Stärke auf den source-Metabolismus zu studieren.
5.4 Stickstoffverwertung in U. maydis unterliegt der Kontrolle von
NiT2
In filamentösen Pilzen unterliegt die Verwertung von nicht-favorisierten N-Quellen der
Stickstoffkatabolitrepression
(NCR),
deren
zentraler
Regulator
ein
GATA-Zn-Finger
Transkriptionsfaktor (NiT2 / AreA) ist (zusammengefasst in Marzluf, 1993 und Marzluf, 1997).
NiT2-Homologe aus phytopathogenen Ascomyceten haben neben der Regulation der StickstoffVerwertung auch meist eine Rolle in der Virulenz (zusammengefasst in Bolton und Thomma,
2008). Da das Genom des Basidiomyceten U. maydis ein NiT2-Homolog beherbergt (Ho et al.,
2007), wurde dessen Funktion in der NCR und der Virulenz von U. maydis charakterisiert.
5.4.1 um10417 kodiert für ein NiT2-Homolog
In Ho et al., 2007 wurde um10417 als potentielles NiT2-Homolog erwähnt und eigene
bioinformatische Recherchen bestätigten, dass dieses Protein die höchste Homologie zu NiT2
aus filamentösen Pilzen hat und ein GATA-Zn-Finger-Motiv sowie das NiT2-typische
RMENLTWRMM-Motiv aufweist. Der N-Terminus des U. maydis NiT2-Homologs wies jedoch
weder Sequenzhomologie zu bisher beschriebenen NiT2-Transkriptionsfaktoren, noch zu
anderen Proteinen auf. Eine 5’-RACE-Analyse zeigte zudem, dass das 5’-Ende der UmNiT2mRNA
in
dem
Bereich
des
als
Um10417
annotierten
Proteins
lag,
in
dem
die
Sequenzhomologie zu anderen NiT2-Proteinen begann. Da jedoch mehrere potentielle
Startkodons mit Kozak-Sequenzen in diesem Bereich liegen, konnte das tatsächliche
Startkodon durch die 5’-RACE nicht ermittelt werden. Für Aspergillus nidulans wurden
unterschiedlich lange AreA-Transkripte nachgewiesen, die auf unterschiedlich lange 5’-UTRs
zurückzuführen, jedoch funktionell redundant sind (Marzluf, 1997). Desweiteren werden für
Neurospora crassa NiT2 und Penicillum chrysogenum NiT2 alternative TranslationsStartkodons vermutet (Marzluf, 1993, Haas et al., 1995), weshalb durch die 5’-RACE nicht
ausgeschlossen werden kann, dass unter bestimmten Bedingungen der N-Terminus von
UmNiT2 transkribiert und translatiert wird und möglicherweise regulatorische Eigenschaften
aufweist.
Der C-Terminus von UmNiT2 ist im Vergleich zu charakterisierten NiT2-Homologen verkürzt
und weist nicht das unter Ascomyceten konservierte EWEWLTMSL-Motiv auf (Divon et al.,
2006). Dieses Motiv ist entscheidend für die Interaktion von NiT2 mit dem Repressor Nmr1, so
122
DISKUSSION
dass N. crassa-Mutanten, deren NiT2 C-Terminus deletiert ist, keine NCR mehr aufweisen (Pan
et al., 1997). Bisherige bioinformatische Untersuchungen besagen, dass U. maydis kein Nmr1Homolog aufweist (Wong et al., 2008), jedoch konnte nach eingehenderen Analysen ein Protein
mit geringer Sequenzhomologie zu Nmr1 gefunden werden (Um11107, Christine Zeh,
Diplomarbeit, FAU Erlangen-Nürnberg, in Vorbereitung), welches eine NmrA-Multidomäne
aufweist (NCBI Conserved Domain Database, E-Wert: 2e-43). Um11107 weist 35%
Sequenzidentität mit Tar1 auf, einem funktionellen Nmr1-Homolog des Basidiomyceten
Cryptococcus neoformans (Jiang et al., 2009). Da N. crassa Nmr1 auch direkt an den Zn-Finger
von NiT2 binden kann (Pan et al., 1997), könnte Um11107 die NCR in U. maydis vermitteln,
was bisher jedoch noch nicht bestätigt werden konnte (Christine Zeh, Diplomarbeit, FAU
Erlangen-Nürnberg, in Vorbereitung).
5.4.2 UmNiT2 ist ein zentraler Regulator der NCR in U. maydis
Die Charakterisierung von !nit2-Mutanten ergab, dass UmNiT2 benötigt wird, um die meisten
komplexen Stickstoff-Quellen zu verwerten und lediglich die Verwertung von Ammonium,
Harnstoff, Formamid, Asp, Glu, Asn, Gln, Arg, Lys, Putrescin, Spermidin, Allantoin und Guanin
unabhängig von NiT2 sind. In Analogie zu der Situation in filamentösen Pilzen sind diese
Stickstoff-Quellen daher in U. maydis als favorisiert zu bezeichnen. Die Untersuchungen
zeigten, dass UmNiT2 eine ähnlich zentrale Rolle in der NCR einnimmt, wie NiT2 in N. crassa
oder AreA in A. nidulans, wobei in diesen Systemen lediglich Gln, Ammonium und Glu (nur
N. crassa) NiT2-unabhängig verwertet werden (Griffin, 1994). Knock-out Mutanten der
C. lindemuthianum, M. grisea und C. fulvum NiT2-Homologe, können wie U. maydis !nit2 noch
mehrere komplexe N-Quellen nutzen (Froeliger und Carpenter, 1996, Perez-Garcia et al., 2001,
Pellier et al., 2003), weshalb hypothetisiert wird, dass die NiT2-unabhängige Verwertung
bestimmter Stickstoff-Quellen spezifisch für Phytopathogene und als Folge der StickstoffVerfügbarkeit in planta entstanden sein könnte.
Am Beispiel der Nitratverwertung konnte gezeigt werden, dass die Nitratreduktase (Nar1) und
ein Nitrattransporter (Nrt) in SG200-Sporidien bei Anwesenheit der favorisierten StickstoffQuelle Ammonium nicht transkribiert werden. Steht Nitrat als einzige N-Quelle zur Verfügung,
werden Nar1 und Nrt in SG200-Zellen transient stark exprimiert. Sechs Stunden nach Transfer
auf Nitrat-haltiges Medium nahm die Expression beider Proteine ab, um nach 24 h wieder
anzusteigen. Die transiente Induktion von Nar1 und Nrt war in !nit2-Sporidien geringer und die
späte Induktion blieb vollständig aus. Da !nit2-Sporidien jedoch trotz der geringen Nar1
Expression resistent gegen Chlorat waren, scheint keine signifikante Aktivität von Nar1
vorhanden zu sein. Das Nar1-Protein wird unter favorisierten Bedingungen schnell abgebaut
(Lewis und Fincham, 1970), so dass die geringe Transkription von Nar1 in !nit2 auf Nitrat
möglicherweise nicht ausreicht, um Nar1-Aktivität zu induzieren.
Trotz des fehlenden NiT2-Proteins war in !nit2 nach Transfer der Sporidien auf Nitratmedium
eine leichte Induktion von Transkripten für nitratverwertende Enzyme zu beobachten. Da in
123
DISKUSSION
Anwesenheit von Ammonium eine vollständige Repression dieser Gene beobachtet wurde,
muss davon ausgegangen werden, dass noch weitere Proteine neben NiT2 in der Aufhebung
der NCR beteiligt sind. Da im Rahmen dieser Arbeit lediglich die Expression Nitratverwertender
Proteine getestet wurde, lässt sich nicht eindeutig sagen, ob diese(r) zusätzliche(n) Faktor(en)
Nitrat-spezifisch oder global sind. In der Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisae) sind zwei
GATA-Transkriptionsfaktoren an der Lösung der NCR beteiligt. Gln3 aktiviert Gat1 und beide
gemeinsam heben die Repression NCR-regulierter Gene auf. Der Grad der Interaktion ist
jedoch je nach Zielgen verschieden, so dass einige Zielgene allein durch Gln3 oder Gat1
dereprimiert werden können (Cooper, 2002). Desweiteren konnte durch Mikroarray-Analysen
gezeigt werden, dass in dem Phytopathogen Fusarium fujikuroi nur 20% der N-reprimierten
Gene durch AreA reguliert werden, was auch in diesem Ascomyceten zusätzliche Regulatoren
der N-Verwertung vermuten lässt (Schönig et al., 2008). Das U. maydis Genom beherbergt kein
Gln3-Homolog (Wong et al., 2008), jedoch mindestens zehn GATA-Typ Transkriptionsfaktoren
(InterPro-ID IPR000679), von denen bisher lediglich zweien eine Funktion zugeordnet werden
konnte (Um10417 / NiT2 und Um01050 / Urbs1, (Voisard et al., 1993)). Die weiteren acht
GATA-Transkriptionsfaktoren sind daher gute Kandidaten für eine Funktion in der Regulation
der N-Verwertung.
Die Aktivität von NiT2-Homologen kann über verschiedene Mechanismen gesteuert werden.
Generell scheint die Bindung von Nmr1-Homologen an NiT2 negative Eigenschaften auf die
DNA-Bindung von NiT2 zu besitzen (zusammengefasst in Wong et al., 2008 und Marzluf,
1997). In A. nidulans weist AreA zudem autoregulatorische Eigenschaften auf: Bei Abwesenheit
favorisierter Stickstoff-Quellen akkumuliert die AreA mRNA und AreA aktiviert die eigene
Transkription (Langdon et al., 1995). Im Gegensatz dazu wird die AreA mRNA unter
favorisierten Stickstoff-Bedingungen durch eine regulatorische Domäne in der 3’-UTR instabil
und abgebaut (Platt et al., 1996, Morozov et al., 2000, Morozov et al., 2001). Die Regulation
von NiT2 auf Transkriptebene ist in N. crassa nur geringfügig ausgeprägt, so dass
angenommen wird, dass in diesem Pilz die Regulation von NiT2 durch Nmr1 stärker ausgeprägt
ist als in A. nidulans (Tao und Marzluf, 1999). In S. cerevisae wird die Aktivität der zentralen
NCR-Regulatoren Gln3 und Gat1 über die subzelluläre Lokalisation gesteuert. Unter
N-favorisierten Bedinungen residieren diese Transkriptionsfaktoren im Cytosol und wandern nur
unter unfavorisierten Bedingungen in den Kern, wo sie die NCR lösen (Cooper, 2002). Kürzlich
wurde dieser zusätzliche Regulationsmechanismus der Sequestrierung auch für A. nidulans
AreA gezeigt, der jedoch nur in der N-Mangelantwort eine Rolle spielt (Todd et al., 2005). Bei
der Sequestrierung von Gln3 im Cytosol spielt die TOR-Kinase (target of rapamycin) eine
Schlüsselrolle. So konnte gezeigt werden, dass nach Rapamycinbehandlung Gln3 in den Kern
wanderte (Beck und Hall, 1999). Eine ähnliche Rolle der TOR-Kinase wurde auch in dem
opportunistischen Humanpathogen Candida albicans nachgewiesen (Liao et al., 2008).
124
DISKUSSION
UmNiT2 wird sowohl in Anwesenheit von favorisierten als auch von unfavorisierten N-Quellen
exprimiert, weshalb die Regulation der NiT2-Aktivität auf transkriptioneller Ebene, wie sie in
A. nidulans auftritt, unwahrscheinlich ist. Da erste Analysen an !um11107-Mutanten (Nmr1Homolog) jedoch ebenfalls keinen Effekt auf die NCR zeigten (Christine Zeh, Diplomarbeit,
FAU-Erlangen-Nürnberg, in Vorbereitung), könnten andere Faktoren, wie beispielsweise die in
Bäckerhefe beobachte subzelluläre Lokalisation, die Aktivität von UmNiT2 regulieren. Die
Expression von GFP-markiertem NiT2 in U. maydis könnte Aufschluss über diesen potentiellen
Regulationsmechanismus geben und würde auch nutzbar sein, um eine mögliche Rolle der
TOR-Kinase in der NCR zu ermitteln.
5.4.3 Die Stickstoffmangel-Antwort ist in !nit2-Mutanten attenuiert
Nach dem Transfer von U. maydis-Sporidien von Vollmedium auf Minimalmedium ohne
Stickstoff-Quelle war bereits nach einer Stunde eine starke Induktion von Nar1 und Nrt
festzustellen, was eine Stickstoff-Mangelantwort darstellt. Stickstoff-verwertende Proteine
waren unter Stickstoff-Mangel auch in den phytopathogenen Ascomyceten F. fujikuroi,
Fusarium oxysporum und M. grisea, sowie in dem Mykorrhizapilz Tuber borchii induziert (Divon
et al., 2005, Donofrio et al., 2006, Montanini et al., 2006, Schönig et al., 2008). In U. maydis
wurde die Induktion von Nar1 und Nrt nach etwa acht Stunden auf Stickstoff-Mangelmedium
beschrieben (Ho et al., 2007), jedoch konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass
nach Transfer auf Medium ohne N-Quelle die Mangelantwort unmittelbar einsetzte. In N. crassa
wird die Nitratreduktase auschließlich bei Anwesenheit von Nitrat induziert, wobei dieser
Prozess von NiT2 und dem Nitrat-spezifischen Aktivator NiT4 abhängt (Griffin, 1994, Feng und
Marzluf, 1998). Dies könnte darauf hindeuten, dass in U. maydis zumindest für die Verwertung
von Nitrat kein transkriptioneller Aktivator notwendig ist, wie es auch schon für den
symbiotischen Basidiomyceten Hebeloma cylindrosporum gezeigt werden konnte (Jargeat et
al., 2000, Jargeat et al., 2003). Dies wird durch die Beobachtung unterstrichen, dass knock-out
Mutanten des potentiellen U. maydis NiT4-Homologs (um02808, Ho et al., 2007) Nitrat
verwerten konnten (Christine Zeh, Diplomarbeit, FAU-Erlangen-Nürnberg,in Vorbereitung). Es
kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass andere unbekannte Transkriptionsfaktoren die
Funktion von NiT4 in U. maydis übernehmen.
Die transkriptionelle Stickstoff-Mangelantwort war in !nit2-Mutanten deutlich reduziert, jedoch
nicht vollständig unterbunden. Gleichzeitig setzte die Induktion von Nar1 und Nrt erst zwei
Stunden nach Transfer auf Mangelmedium ein. Dass die Stickstoff-Mangelantwort in !nit2 nicht
vollständig abgeschaltet ist wird auch dadurch deutlich, dass !nit2 Sporidien in der Lage sind,
Ustilaginsäure zu produzieren, was eine typische Antwort von U. maydis auf Stickstoff-Mangel
in in vitro Kulturen ist (Hewald et al., 2005, Hewald et al., 2006). UmNiT2 ist somit zwar ein
zentraler Bestandteil der Stickstoff-Mangelantwort, jedoch müssen auch hier analog zu der
Nar1-Expression auf Nitrat, weitere regulatorische Faktoren involviert sein.
125
DISKUSSION
5.4.4 UmNiT2 wird für die volle Pathogenität benötigt
Über die Rolle von NiT2 / AreA-Homologen in der Virulenz phytopathogener Pilze gibt es
unterschiedliche Berichte. In C. lindemuthianium und Fusarium oxysporum konnte eine
verringerte Virulenz der entsprechenden knock-out Mutanten ermittelt werden (Pellier et al.,
2003, Divon et al., 2006), während M. grisea und C. fulvum !nit2 Mutanten nicht in ihrer
Virulenz beeinträchtigt waren (Froeliger und Carpenter, 1996, Perez-Garcia et al., 2001).
Ustilago maydis !nit2-infizierte Maisblätter zeigten eine geringere Tumorisierung und die
pilzliche Proliferation war in planta deutlich reduziert. Gleichzeitig war auch das filamentöse
Auswachsen der !nit2-Sporidien auf der Blattoberfläche weniger stark ausgeprägt als das der
SG200-Sporidien, und Untersuchungen in vitro zeigten, dass die Initiierung des filamentösen
Wachstums durch die nit2-Mutation verzögert ist. Dies könnte die reduzierte Virulenz der !nit2Mutanten erklären.
Unter Stickstoff-Mangelbedingungen wurde pseudohyphales Wachstum von Hefezellen
(S. cerevisae) beobachtet, welches durch polare Zellteilungen charakterisiert ist (Gimeno et al.,
1992). Auch für U. maydis wurde unter Mangelbedingungen filamentöses Wachstum
beschrieben (Kernkamp, 1939) und der solopathogene Stamm SG200 zeigte dieses auch in
Anwesenheit von Nitrat als einziger Stickstoff-Quelle. !nit2-Sprodien wuchsen unter beiden
Bedingungen
nur
geringfügig
filamentös,
weshalb
NiT2
an
der
Initiierung
der
Filamentausbildung beteiligt zu sein scheint. Eine ähnliche Störung der Filamentausbildung in
Anwesenheit bestimmter N-Quellen wurde auch in C. albicans !gln3- und !gat1-Mutanten
beobachtet (Liao et al., 2008), so dass den zentralen Regulatoren der Stickstoff-Verwertung in
bestimmten Pilzen eine Funktion in der Filamentausbildung zugeschrieben werden kann. Ob
dabei NiT2 direkt wirkt, oder der Effekt auf das filamentöse Wachstum durch die Attenuierung
der Stickstoff-Mangelantwort zurückzuführen ist, bleibt zu klären.
In mehreren phytopathogenen Pilzen konnte gezeigt werden, dass einige Gene, die unter
Stickstoff-Mangelbedingungen exprimiert werden auch in planta exprimiert sind, was die
Hypothese aufbrachte, dass Stickstoff-Mangel ein Signal für das Pathogen darstellen könnte,
Virulenzfaktoren zu exprimieren (Snoeijers et al., 2000, Divon et al., 2005, Donofrio et al., 2006,
Schönig et al., 2008). Für M. grisea und C. fulvum wurde darüber hinaus gezeigt, dass einige
der bereits bekannten Effektoren unter Stickstoff-Mangel transkribiert werden (Talbot et al.,
1993, Van den Ackerveken et al., 1994) und dass C. fulvum Avr9 unter der Kontrolle von NiT2
steht (Perez-Garcia et al., 2001). Nach der Ausbildung des Tumors herrscht für U. maydis kein
Stickstoff-Mangel, jedoch könnte vor der Penetration auf der Blattoberfläche die StickstoffVerfügbarkeit begrenzt sein. In dieser Situation könnte daher eine N-Mangelantwort, die über
NiT2 verläuft, auch in U. maydis Teil einer Signalkette sein, welche das Infektionsprogramm
initiiert, welches im solopathogenen Stamm SG200 mit dem filamentösen Auswachsen der
Sporidien beginnt. Die Attenuierung der Stickstoff-Mangelantwort könnte daher die reduzierte
Virulenz von !nit2 im SG200-Hintergrund erklären. Ob NiT2 dabei mit bereits beschriebenen
126
DISKUSSION
Signaltransduktionswegen des U. maydis Infektionsprogramms interagiert, und ob möglicherweise Effektoren direkt unter der Kontrolle von NiT2 stehen, bleibt zu klären.
Abbildung 49 fasst die Einbindung von NiT2 in Regulation der NCR und der Pathogenität nach
dem jetzigen Kenntnisstand in einem Modell zusammen.
Abbildung 49 Modell zur Einbindung von NiT2 in die Regulation der Stickstoff-Verwertung und der
Virulenz. NiT2 dereprimiert in Abwesenheit favorisierter Stickstoff-Quellen Stickstoff-metabolisierende
Gene und ist Bestandteil der Regulationskette, die das filamentöse Wachstum von Sporidien initiiert.
Unter favorisierten N-Bedingungen ist die Wirkung von NiT2 unterbunden. Ein bisher unbekannter Faktor
(?) kann zum Teil die Derepression von NiT2-Zielgenen bewirken. Inwiefern das Nmr1-Homolog auf die
Hemmung von NiT2 eine Rolle spielt, ist unbekannt, auch, ob die Expression von Virulenzgenen direkt
unter der Kontrolle von NiT2 oder des unbekannten Faktors stehen. Schwarze Linien bezeichnen in
dieser Arbeit beobachtete Interaktionen, graue gestrichelte Linien zeigen hypothetische Interaktionen an.
127
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143
LITERATURVERZEICHNIS
144
ANHANG
7 Anhang
7.1 Nummerierung von Maisblättern
Nummerierung der Maisblätter. Die Nummerierung von Maisblättern erfolgte ausgehend vom
ältesten Blatt (Nummer 1), wobei die Koleoptile nicht mitgezählt wird.
I
ANHANG
7.2 Oligonukleotide
In dieser Arbeit verwendete Oligonukleotide (in 5’ zu 3’ Orientierung)
RH12
ATCTGTACAAGCCGACTCTCGC
RH162
TAAGCCACGTTGTCACAAGC
RH13
TCAGGCCGGACACCGTGAC
RH163
TTTCAGCCTTGTCTTCTGTGC
RH14
CGACACGGACATCTCGAACGG
RH164
CACGGCCTGAGTGGCCGAAAGAATCGCAAGACGGAG
RH15
CACGCGGTGAGACGGGACAC
RH165
CGAGTCTTTTCAGTCTTGTCTTTC
RH16
GACGATCGCGCTGAGGACAC
RH191
GCTCAACTTTCATCGTGCCCAG
RH17
TAGCTACTGCGCCGGCACG
RH192
GCCTCTCGAAGAAACAGTGG
RH18
TGCGGGGAGAAGGGCG
RH193
AGAACGGGATCGACTGACAC
RH19
CGTCTCCGCGTGCTCAGG
RH212
GCCTGACCTATTGCATCTCC
RH20
GCATCCAAGGCGAACGATCTG
RH213
CGTCTGCTGCTCCATACAAG
RH21
GAGTCGTAGATGGCTCGTGTGG
RH228
TTCCTCGATCCCAAGAAATG
RH22
CACCAACTCCACCGACCTCAGC
RH229
CTGGATGGGGTCTAAAGCAG
RH23
CTCGTCCTGGCAGAAGTGCGTG
RH230
CTTCGGCATTGTTGAGGGTTTG
RH24
GCTCCAAGTTCACCCCTCGC
RH231
TCCTTGGCTGAGGGTCCGTC
RH25
TTGCGCTGTTGCCATTGTCAG
RH259
GGGAAGGAGTTGACCGGATTC
RH46
ATCACCATTGGGTCAGAAAGG
RH260
ACTTCGGAACCCCAACTGACA
RH47
GTGCTGAGAGAAGCCAAAATAGAG
RH261
GGTTCTGAAAGCCGTCCGTGC
RH58
CGGGTATTCACGAGACGACG
RH262
GCCAACGACCCACATTGCG
RH59
TCTCGTCGTACTCCTGCTTCG
RH263
CACAAGCTTCGCTCGGTCCTCCTACTCGT
RH81
ACCGCCGAGCCGCCCACAGTA
RH264
CACGCGGCCGCACAAAACCTCACTTGCGCTGTC
RH82
CGAGGAGCCAGCGCCGTTCTTG
RH265
CGCACTGCCGACAACGAAA
RH87
ACTAGATCCGATGATAAGCTG
RH266
GCAGGGATACCGTAGTTGGCA
RH160
GTGGGCCATCTAGGCCTTCGGGGTCCGCATCTTC
RH267
CAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAG
RH161
GCAACAAAGCCGTAATATCACC
RH268
CATCCTTGGCAAATGCTTTCGCAGTTGTTCG
II
ANHANG
7.3 Ionenübergänge der MS/MS-Detektion
Ionenübergänge für die Detektion und Quantifizierung von Metaboliten durch IC-MS/MS
Metabolit
m/z Mutterion / m/z Tochterion
Shikimat
173 / 93
6-Phosphogluconat
276 / 97
UDP-Glucose
565 / 323
Glucose-1-phosphat
259 / 79
Fructose-6-phosphat
259 / 97
Trehalose-6-phosphat
421 / 241
Saccharose-6-phosphat
421 / 97
Glucose-6-phosphat
259 / 97
Gructose-1,6-bisphosphat
339 / 159
3-Phosphoglycerat
185 / 97
Phosphoenolpyruvat
167 / 79
Pyruvat
87 / 59
Malat
133 / 71
Ribulose-1,5-bisphosphat
310 / 97
Citrat
191 / 87
Isocitrat
191 / 111
2-Oxoglutarat
145 / 101
Fumara
115 / 71
Succinat
117 / 73
III
ANHANG
Ionenübergänge für die Detektion und Quantifizierung von unmarkierten und
15
N markierten
Aminosäuren durch LC-MS/MS
Aminosäure
unmarkierte Aminosäure
markierte Aminosäure
m/z Mutterion / m/z Tochterion
m/z Mutterion / m/z Tochterion
Serin
106 / 60
107 / 60
Asparagin
133 / 116
134 / 117
Alanin
90 / 44
91 / 45
Threonin
120 / 74
121 / 75
Glutamin
147 / 130
148 / 131
Glutamat
148 / 102
149 / 103
Prolin
116 / 70
117 / 71
Valin
118 / 72
119 / 73
Methionin
150 / 104
151 / 105
Isoleucin
132 / 86
133 / 87
Leucin
132 / 86
133 / 87
Tyrosin
182 / 136
183 / 137
Phenylalanin
166 / 120
167 / 121
Aspartat
134 / 88
135 / 89
IV
ANHANG
7.4 Vektorkarten
Vektorkarte
von
Integration
des
p123.
Die
gesamten
Plasmids in das U. maydis
Genom erfolgt über die den
cbx-Locus
umfassende
homologe Region, wobei der
endogene cbx-Locus durch den
auf
diesem
Plasmid
enthaltenen cbx-Locus ersetzt
wird,
welcher
resistenz
Carboxin-
vermittelt.
Zur
Komplementation
der
um10417-Deletionsmutanten
mit um10417 wurde die Po2tefeGFP
Region
anhand
der
HindIII und NotI Schnittstellen
durch
den
genomischen
um10417-Locus
ersetzt.
Ampicillinresistenz,
bla:
Po2tef:
Promoter, Tnos:Terminator.
Vektorkarte
von
pBS-hhn.
Die
Hygromycinresistenz-Kasssette umfasste
den U. maydis hsp70 Promoter, das hph
Gen
sowie
den
nos-Terminator.
Die
gesamte Kassette konnte mit dem Enzym
SfiI herausgeschnitten werden.
V
ANHANG
7.5 Deregulierte Gene in symptomfreien Bereichen infizierter
Blätter
Liste der in symptomfreien Bereichen infizierter Blätter im Vergleich zu Wasser-behandelten
Blättern signifikant (p<0,001) deregulierten Gene 8 Tage nach Infektion. Die Expression in
symptomfreien Bereichen ist relativ zur Expression in Wasser-behandelten Blättern angegeben
(x-fache Expressionsänderung).
Deregulation
probe set
Gen
Accession
x-fach
Kategorie
Zm.18305.1.A1_at
Isocitratlyase
CO533683
Zm.9636.1.A1_at
unbekannt
BM349325
7,77 andere
Zm.299.1.S1_a_at
Malatsynthase 1
L35914.1
7,62 Metabolismus
Zm.11586.1.A1_at
PVR3-ähnliches Protein
BM379136
6,34 andere
Zm.9601.1.A1_at
unbekannt
BM339800
4,7 andere
Zm.10103.1.A1_at
unbekannt
AI947611
4,66 andere
Zm.16805.3.S1_x_at
basische Endochitinase C
BM381902
4,35 Abwehr
Zm.13583.1.S1_at
unbekannt
AY108161.1
3,92 andere
Zm.13137.2.S1_a_at
Abwehr-verwandtes Protein
CO518420
3,78 Abwehr
Zm.12035.1.A1_at
unbekannt
BM382802
3,64 andere
Zm.9754.1.A1_at
Cytokininoxidase 2
AJ606942.1
3,53 Metabolismus
Zm.7411.1.A1_at
unbekannt
BM072807
3,05 andere
Zm.7882.1.A1_at
unbekannt
CF637822
2,93 andere
Zm.2823.1.A1_at
Ankyrin Proteinkinase-ähnlich
BI097694
2,8 andere
Zm.14320.1.S1_at
unbekannt
BQ619478
2,65 andere
Zm.4033.1.A1_at
putative Alkoholdehydrogenase
CF636055
2,55 Metabolismus
Zm.16971.1.A1_at
Cytokininoxidase 3
AJ606944.1
-2,68 Metabolismus
Zm.1691.1.A1_at
Ferrochelatase II
AY108152.1
-2,78 Metabolismus
ZmAffx.1206.1.A1_at unbekannt
BE130052
-2,94 andere
Zm.4909.1.A1_at
Terpensynthase 8
AY111633.1
-2,97 Metabolismus
Zm.3219.3.A1_at
Thiaminbiosynthese Protein thiC AY109877.1
-3,09 Metabolismus
137,79 Metabolismus
ZmAffx.1435.1.S1_at PSII 32 kDa Protein
CAA60265.1
-3,31 Photosynthese
ZmAffx.1441.1.S1_at PSII D2 Protein
CAA60270.1
-3,63 Photosynthese
VI
ANHANG
7.6 Metabolitanalyse oberer systemischer sink-Blätter
Metabolitanalyse von oberen systemischen, symptomlosen sink-Blättern 8 dpi. A-C Metabolitgehalte in
oberen systemischen Blättern von infizierten (grau) und Kontroll-behandelten (schwarz) Pflanzen. A
Gehalte an Aminosäuren. B Gehalte an Kohlenhydraten. C Gehalte an phosphorylierten Intermediaten
und organischen Säuren. Die Fehlerbalken repräsentieren den Standardfehler (n=9-12). Statistisch
signifikante Veränderungen zwischen infizierten und Kontrollpflanzen sind mit einem Stern markiert
(Welch-Satterthwaite t-Test, p<0,05).
VII
ANHANG
7.7 Aminosäurezusammensetzung
im
Phloem
systemischer
source-Blätter
Prozentualer Anteil einzelner Aminosäuren am Gesamt-Aminosäurepool von Phloemexudaten
des systemischen source-Blattes (Blatt 3) infizierter und Kontroll-behandelter Maispflanzen.
Phloemexudate wurden unter hoher Stickstoffverfügbarkeit (Behandlung von Blatt 3 mit 100 !L
200 mM Harnstoff 30 h vor der Analyse der Exudate) und normaler Stickstoffverfügbarkeit
(keine Vorbehandlung des 3. Blattes) gesammelt. Gezeigt ist der Standardfehler (n=6) und
statistisch signifikante Veränderungen in infizierten Pflanzen sind mit einem Stern markiert und
fett hinterlegt (Welch-Satterthwaite t-Test, p<0.05).
normale N-Verfügbarkeit
Kontrollbehandelt
infiziert
hohe N-Verfügbarkeit
Kontrollbehandelt
infiziert
% aller AS
% aller AS
% aller AS
% aller AS
Asp
9.5 ± 0.5
8.2 ± 0.5
9 ± 0.4
9±2
Glu
20 ± 2
19 ± 2
13 ± 1
16 ± 1
Asn
0.9 ± 0.1
1.2 ± 0.1
0.9 ± 0.1
1.1 ± 0.1
Ser
11± 1
11 ± 1
15.6 ± 0.8
14 ± 1
Gln
2.1 ± 0.2
4.4 ± 0.9*
3.5 ± 0.3
4.9 ± 0.8
Gly
14 ± 1
8.9 ± 0.5*
13 ± 1
11.1 ± 0.9
His
0.7 ± 0.1
0.7 ± 0.2
0.9 ± 0.1
0.5 ± 0.1*
Thr
2.6 ± 0.4
4.3 ± 0.7
2.8 ± 0.3
2.4 ± 0.4
Arg
5 ± 0.3
3.5 ± 0.5*
5.4 ± 0.2
3.1 ± 0.3*
Ala
12 ± 2
24 ± 2*
10 ± 2
25 ± 3*
Pro
1.7 ± 0.2
1 ± 0.1*
1.4 ± 0.2
0.9 ± 0.1*
Tyr
2.1 ± 0.2
1.4 ± 0.1*
2.6 ± 0.2
1.2 ± 0.2*
Val
5 ± 0.6
2.5 ± 0.3*
5.2 ± 0.3
2.2 ± 0.3*
Met
0.7 ± 0.2
0.34 ± 0.05
1 ± 0.1
0.27 ± 0.02*
Ile
3.5 ± 0.6
1.7 ± 0.3*
3.9 ± 0.3
1.3 ± 0.3*
Lys
3.4 ± 0.4
3.9 ± 0.9
4.3 ± 0.2
2.7 ± 0.5*
Leu
3.8 ± 0.5
2.1 ± 0.3*
4.4 ± 0.4
2 ± 0.5*
Phe
2.1 ± 0.3
1.4 ± 0.2
2.1 ± 0.2
1.1 ± 0.2*
VIII
ANHANG
7.8 Wachstum von !nit2 auf verschiedenen N-Quellen
Repräsentative Aufnahmen des Wachstums von U. maydis SG200 und zwei unabhängigen
Transformanden von SG200-!nit2 auf Minimalmediumplatten mit unterschiedlichen Stickstoffquellen. Mit
einem Stempel wurden Verdünnungen der Kulturen (OD600 1, 0,1, 0,01, 0,001) auf die entsprechenden
Medien gebracht. Während SG200 alle getesteten N-Quellen verwerten konnte, war das Wachstum der
Mutanten auf vielen N-Quellen nicht möglich (hier gezeigt: Nitrat und Prolin), während andere N-Quellen
auch von der Mutante verwertet werden konnten (hier gezeigt: Ammonium und Glutamin).
IX
ANHANG
7.9 Protein-Alignment von UmNiT2 mit anderen NiT2-Homologen
X
ANHANG
Protein-Alignment von um10417 mit beschriebenen NiT2-AreA Transkriptionsfaktoren aus A. nidulans
(AnAreA), C. lindemuthianum (ClClnr1), F. oxysporum (FoFnr1), Gibberella fujikuroi (GfAreA) und N.
crassa (NcNiT2), sowie homologen Proteinen aus den Basidiomyceten Schizophyllum commune
(ScGATA-6) und C. neoformans (CnGATA-Typ). Die NiT2 / AreA-typische Domäne ist rot umrandet, der
Zn-Finger grün umrandet und das C-terminale Sequenzmotiv, welches für die Bindung von NMR1
verantwortlich ist, ist blau markiert. Das Alignment wurde mit dem MUSCLE-Algorithmus durchgeführt
(Edgar, 2004).
XI
ANHANG
7.10 Annotationen von Genen des Shikimatwegs und des sekundären Metabolismus
Enzym
DAHPS
Probeset
Accession
Annotation
Zm.4468.3.S1_at
CF627497
Phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase 2, chloroplast precursor (DAHP synthetase 2) sp|Q75W16|AROG_ORYSJ 1
Zm.7929.1.A1_a_at
CO531689
dehydroquinate synthase [Lycopersicon esculentum] gb|AAL77575.1|L46847_1
Zm.6257.1.A1_at
AY110132.1
putative dehydroquinate dehydratase [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] dbj|BAD61388.1|
Zm.6257.1.A1_at
AY110132.1
putative dehydroquinate dehydratase [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] dbj|BAD61388.1|
Zm.10310.1.A1_at
Zm.4535.1.A1_at
CF629249
AY105920.1
OSJNBb0079B02.2 [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] (Shikimate kinase) emb|CAE02970.2|
Os01g0102600 [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] Shikimate kinase domain containing protein ref|NP_001041750.1|
Zm.98.1.S1_at
AY106729.1
3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase; EPSP-synthase [Zea mays] emb|CAA44974.1|
Zm.18081.1.S1_at
BM268388
chorismate synthase, chloroplast precursor (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate phospholyase) sp|P27793|AROC_CORSE
Zm.5976.1.S1_at
AI673851
hypothetical protein OsI_003779 [Oryza sativa (indica cultivar-group)] chorismate mutase activity gb|EAY75932.1|
Zm.18271.1.A1_at
Zm.3256.2.A1_at
CO531473
AY110936.1
hypothetical protein OsI_015236 [Oryza sativa (indica cultivar-group)] Prephenate dehydratase gb|EAY94003.1|
hypothetical protein OsI_015236 [Oryza sativa (indica cultivar-group)] Prephenate dehydratase gb|EAY94003.1|
1 Zm.15903.1.S1_at
2 Zm.15903.3.A1_at
Phenylpropan Biosynthese
1a Zm.3098.1.A1_at
1b Zm.1502.1.A1_at
1c Zm.233.1.S1_s_at
2 Zm.3406.1.S1_at
3 Zm.7134.1.S1_at
4 Zm.11845.1.A1_at
Chalconsynthase
L77912.1
AY104679.1
phenylalanine ammonia-lyase [Zea mays] gb|AAL40137.1|L77912_1
Phenylalanine ammonia-lyase sp|Q43210|PALY_WHEAT
BM379893
CF637870
BG837909
AY566301.1
CF634276
CO532590
Caffeoyl-CoA O-methyltransferase 1 (Trans-caffeoyl-CoA 3-O-methyltransferase 1) (CCoAMT-1) (CCoAOMT-1) sp|Q9XGD6|CAMT1_MAIZE 1
Caffeic acid 3-O-methyltransferase (S-adenosysl-L-methionine:caffeic acid 3-O-methyltransferase) sp|Q06509|COMT1_MAIZE 5
caffeoyl CoA 3-O-methyltransferase [Zea mays] gb|AAP37879.1| 6
4-coumarate coenzyme A ligase [Zea mays] gb|AAS67644.1| 2
cinnamic acid 4-hydroxylase [Sorghum bicolor] gb|AAK54447.1| 3
4-coumarate--CoA ligase 4CL1 [Lolium perenne] gb|AAF37732.1|AF052221_1 4
Zm.14384.1.A1_at
CK144440
Os09g0360500 [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] Chalcone and stilbene synthase ref|NP_001062978.1|
Flavonoid Biosynthese
1 Zm.391.1.S1_at
2 Zm.4213.1.A1_at
3 Zm.15885.1.S1_at
4 Zm.7144.1.A1_at
5 Zm.19108.1.S1_at
6 Zm.62.1.S1_at
U33318.1
BG841480
U04434.1
CD437816
CO520889
X55314.1
sp|P52580|IFRH_MAIZE Isoflavone reductase homolog IRL 1
Os12g0115700 [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] Chalcone-flavanone isomerase ref|NP_001065990.1| 2
Naringenin,2-oxoglutarate 3-dioxygenase (Flavonone-3-hydroxylase) (F3H) (FHT) sp|P28038|FL3H_HORVU 3
Os02g0320300 [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] Chalcone-flavanone isomerase ref|NP_001046684.1| 4
Flavonoid 3',5'-hydroxylase 1, putative, expressed [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gb|ABF96137.1| 5
Leucoanthocyanidin dioxygenase (LDOX) (Leucocyanidin oxygenase) (Leucoanthocyanidin hydroxylase) sp|P41213|LDOX_MAIZE 6
3DQS
3DQD
SDH
SK
1
2
EPSPS
CS
CM
PD
1
2
PAL
Annotationen der in Abbildung 33 gezeigten Gene. Angegeben sind die Probeset-IDs des Affymetrix Genechips®, die Genebank Accession von der die
Probesets generiert wurden sowie die Annotation des Gens mit der höchsten Sequenzhomologie, welche über Blast (Altschul et al., 1990) bestimmt wurde.
XII
ANHANG
7.11 Annotationen der in Tumoren deregulierten Genen der Proteinbiosynthese
MapMan-Annotationen der in die Proteinbiosynthese involvierten Gene, welche in Tumoren 8 dpi mehr als zweifach dereguliert sind.
log2
Tumor /
Kontrolle
MapMan BinCode
Affymetrix-ID
cytosolische ribosomale Proteine
Beschreibung
29.2.2
zm.1084.1.s1_at
NOTHING | 60S ribosomal protein L30 (RPL30B),//called_in_inparanoid
2,768
29.2.2
zm.13188.1.a1_at
zm.2021.1.a1_at
29.2.2
zm.1056.2.a1_at
29.2.2
zm.4770.1.a1_at
Zm#S11528999|PCO070432 mRNA sequence BLAST:RS5_CICAR (O65731) 40S ribosomal protein S5 (Fragment)//
Zm#S16357577|CL1835_1 mRNA sequence BLAST:RL30_MAIZE (O48558) 60S ribosomal protein
L30/called_in_both_way/called_in_inparanoid
Zm#S25106407|Ribosomal protein S10p/S20e BLAST:RS20_ORYSA (P35686) 40S ribosomal protein
S20/called_in_both_way/
Zm#S11523249|CL457_2 mRNA sequence BLAST:RL5A_ORYSA (P49625) 60S ribosomal protein L51//called_in_inparanoid
2,321
29.2.2
29.2.2
zm.16346.1.a1_at
1,882
29.2.2
zm.6182.1.s1_at
29.2.2
zm.16349.1.s1_at
Zm#S27929042|PCO068393 mRNA sequence BLAST:RS30_ARATH (P49689) 40S ribosomal protein S30//
Zm#S25101842|Transcribed locus, strongly similar to NP_914175.1 P0475H04.11 [Oryza sativa (japonica cultivargroup)] BLAST:RL29_RAT (P25886) 60S ribosomal protein L29 (P23)/called_in_both_way/called_in_inparanoid
Zm#S25123946|PCO086968 mRNA sequence BLAST:RL132_BRANA (P41129) 60S ribosomal protein L13-2 (Coldinduced protein C24B)/called_in_both_way/
29.2.2
zm.7072.1.s1_at
Zm#S22335711|PCO086432 mRNA sequence BLAST:RS9_RAT (P29314) 40S ribosomal protein S9//
29.2.2
zm.4002.1.a1_at
1,618
29.2.2
zm.5139.1.s1_at
NOTHING | 60S ribosomal protein L31 (RPL31A)//
Zm#S11527590|PCO130341 mRNA sequence BLAST:RSSA_SOYBN (O22518) 40S ribosomal protein SA
(p40)//called_in_inparanoid
29.2.2
zm.465.1.a1_at
1,569
29.2.2
zm.3213.1.a1_at
NOTHING | 60S acidic ribosomal protein P2 (RP/called_in_both_way/called_in_inparanoid
Zm#S25110395|PCO108152 mRNA sequence BLAST:RS25A_ARATH (Q9SIK2) 40S ribosomal protein S251//called_in_inparanoid
29.2.2
zm.7139.1.a1_at
Zm#S25112138|PCO108550 mRNA sequence BLAST:RL34_PEA (P40590) 60S ribosomal protein L34//
1,458
29.2.2
zm.6763.2.a1_at
1,442
29.2.2
zm.16104.1.a1_at
Zm#S11527604|PCO098402 mRNA sequence BLAST:RL21_ARATH (Q43291) 60S ribosomal protein L21//
Zm#S11522703|CL187_21 mRNA sequence BLAST:RL132_BRANA (P41129) 60S ribosomal protein L13-2 (Coldinduced protein C24B)/called_in_both_way/
29.2.2
zm.466.1.s1_at
1,423
29.2.2
zm.7165.1.a1_at
NOTHING | 60S acidic ribosomal protein P2 (RP//
Zm#S15889768|Clone Contig276 mRNA sequence BLAST:RL19B_ARATH (Q9LUQ6) 60S ribosomal protein L192//called_in_inparanoid
29.2.2
zm.9735.1.a1_at
Zm#S23905148|Transcribed locus BLAST://
1,395
29.2.2
zm.6207.5.s1_at
1,354
29.2.2
zm.3195.1.s1_at
29.2.2
zm.16177.1.s1_at
29.2.2
zm.6625.1.a1_at
29.2.2
zm.5930.1.s1_at
Zm#S22336099|Clone Contig321 mRNA sequence BLAST:RL15_ARATH (O23515) 60S ribosomal protein L15//
Zm#S11523502|PCO066751 mRNA sequence BLAST:RL38_ARATH (O22860) 60S ribosomal protein
L38//called_in_inparanoid
Zm#S22336086|Clone Contig334 mRNA sequence BLAST:RS10_ORYSA (Q9AYP4) 40S ribosomal protein
S10//called_in_inparanoid
Zm#S11528077|PCO073390 mRNA sequence BLAST:RL9_ORYSA (P49210) 60S ribosomal protein
L9/called_in_both_way/
Zm#S16379469|CL4004_2 mRNA sequence BLAST:RL37A_PSEMZ (Q9ZRS8) 60S ribosomal protein
L37a/called_in_both_way/
2,28
2,024
2,022
1,642
1,634
1,62
1,59
1,524
1,426
1,407
1,352
1,349
1,307
1,306
XIII
ANHANG
29.2.2
zm.12737.2.s1_at
Zm#S11523555|PCO128954 mRNA sequence BLAST:RS12_HORVU (Q9XHS0) 40S ribosomal protein
S12//called_in_inparanoid
Zm#S25112932|PCO097022 mRNA sequence BLAST:RL11_MEDSA (P46287) 60S ribosomal protein L11
(L5)//called_in_inparanoid
Zm#S16360170|Transcribed locus, strongly similar to XP_463833.1 putative 60S ribosomal protein L37 [Oryza sativa
(japonica cultivar-group)] BLAST:RL37_ARATH (Q43292) 60S ribosomal protein L37//
29.2.2
zm.13812.1.a1_at
29.2.2
zm.15837.1.s1_at
29.2.2
zm.17271.9.a1_at
NOTHING | 40S ribosomal protein S10 (RPS10A),/called_in_both_way/called_in_inparanoid
1,272
29.2.2
zm.14283.1.a1_at
1,258
29.2.2
zm.15891.1.s1_at
Zm#S11528986|Hypothetical LOC542284 BLAST:RL19A_ARATH (Q9SRX2) 60S ribosomal protein L19-1//
Zm#S25123946|PCO086968 mRNA sequence BLAST:RL132_BRANA (P41129) 60S ribosomal protein L13-2 (Coldinduced protein C24B)//
29.2.2
zm.13713.1.a1_at
Zm#S26194442|PCO097110 mRNA sequence BLAST:RS25_LYCES (P46301) 40S ribosomal protein S25//
1,238
29.2.2
zm.7300.1.s1_at
1,221
29.2.2
zm.9690.1.a1_at
NOTHING | 60S acidic ribosomal protein P2 (RP//
Zm#S11446670|Transcribed locus, strongly similar to XP_328215.1 60S RIBOSOMAL PROTEIN L15 [Neurospora
crassa] BLAST:RL15_NEUCR (Q8X034) 60S ribosomal protein L15//
29.2.2
zm.6840.1.s1_at
Zm#S11526383|PCO086893 mRNA sequence BLAST:RS26_ORYSA (P49216) 40S ribosomal protein S26 (S31)//
1,181
29.2.2
zm.16508.1.s1_at
NOTHING | 60S ribosomal protein L39 (RPL39C)//
1,175
29.2.2
zm.7080.2.a1_at
NOTHING | 60S ribosomal protein L21 (RPL21E),//
1,158
29.2.2
zm.16024.1.s1_at
29.2.2
zm.16501.1.s1_at
29.2.2
zm.16848.1.a1_at
29.2.2
zm.7140.1.a1_at
29.2.2
zm.7050.1.a1_at
29.2.2
zm.7012.2.a1_at
29.2.2
zm.17856.2.a1_at
NOTHING | 40S ribosomal protein S24 (RPS24A),//
Zm#S11524058|PCO071038 mRNA sequence BLAST:RM16_MAIZE (P27927) Mitochondrial 60S ribosomal protein
L16//
Zm#S11446206|Clone EL01N0450E09.c mRNA sequence BLAST:RL27_ARATH (P51419) 60S ribosomal protein
L27//called_in_inparanoid
Zm#S22336367|PCO131882 mRNA sequence BLAST:RS2_ARATH (P49688) 40S ribosomal protein
S2/called_in_both_way/called_in_inparanoid
Zm#S25105832|CL4437_2 mRNA sequence BLAST:RL35A_ARATH (P51422) 60S ribosomal protein
L35a/called_in_both_way/
Zm#S11527059|PCO103958 mRNA sequence BLAST:RS8_MAIZE (Q08069) 40S ribosomal protein
S8/called_in_both_way/
Zm#S25123946|PCO086968 mRNA sequence BLAST:RL132_BRANA (P41129) 60S ribosomal protein L13-2 (Coldinduced protein C24B)//
29.2.2
zm.6052.1.a1_at
29.2.2
zm.6748.1.a1_at
29.2.2
zm.6123.1.s1_at
29.2.2
zm.6207.4.a1_at
29.2.2
zm.4824.4.a1_at
29.2.2
zm.6207.2.a1_at
29.2.2
1,296
1,289
1,283
1,249
1,208
1,15
1,136
1,114
1,102
1,098
1,09
1,085
Zm#S11527207|PCO109699 mRNA sequence BLAST:RL7A_ORYSA (P35685) 60S ribosomal protein L7a//
Zm#S25129756|Ribosomal protein L26 BLAST:RL26A_ARATH (P51414) 60S ribosomal protein L261//called_in_inparanoid
Zm#S22334175|Clone EL01N0327F07.d mRNA sequence BLAST:RS15_XYLFA (Q9PGR0) 30S ribosomal protein
S15/called_in_both_way/called_in_inparanoid
1,054
NOTHING | similar to 40S ribosomal protein S1/called_in_both_way/
Zm#S11523241|CL7224_1 mRNA sequence BLAST:RS3A_ORYSA (P49397) 40S ribosomal protein S3a (CYC07
protein)//called_in_inparanoid
Zm#S11523290|Clone cho1c.pk002.b21, mRNA sequence BLAST:RL15_ARATH (O23515) 60S ribosomal protein
L15//
1,049
zm.536.1.s1_at
NOTHING | 40S ribosomal protein S10, mitochon/called_in_both_way/
1,017
29.2.2
zm.12634.5.s1_at
Zm#S30404485|CL4092_-2 mRNA sequence BLAST:RL23_TOBAC (Q07760) 60S ribosomal protein L23//
1,016
29.2.2
zm.1724.1.s1_at
1,001
29.2.2
zm.6588.1.a1_at
Zm#S11522818|CL21852_1 mRNA sequence BLAST:RL4_PRUAR (Q9XF97) 60S ribosomal protein L4 (L1)//
Zm#S11524365|PCO074633 mRNA sequence BLAST:RK13_SPIOL (P12629) 50S ribosomal protein L13, chloroplast
precursor (CL13)/called_in_both_way/
1,052
1,05
1,034
1,021
-1,011
XIV
ANHANG
29.2.2
zm.19028.1.a1_at
Zm#S27931466|PCO071007 mRNA sequence BLAST:RL71_ARATH (P60040) 60S ribosomal protein L71//called_in_inparanoid
29.2.2
zm.478.1.a1_at
29.2.2
zm.12596.1.s1_at
29.2.2
zm.598.1.a1_at
29.2.2
zm.1375.1.s1_at
29.2.2
zm.9080.1.a1_at
29.2.2
zm.7351.1.a1_at
29.2.2
zm.19016.1.s1_at
29.2.2
zm.7347.1.a1_at
NOTHING | peptidyl-tRNA hydrolase family prot/called_in_both_way/called_in_inparanoid
Zm#S11325216|Transcribed locus, strongly similar to XP_467815.1 putative NTGP5 [Oryza sativa (japonica cultivargroup)] BLAST:Y3105_ARATH (Q9MAB9) Protein At3g01050//called_in_inparanoid
Zm#S11418762|9S ribosomal protein (lem1) mRNA, complete cds; nuclear gene for chloroplast product
BLAST:RR9_ARATH (Q9XJ27) 30S ribosomal protein S9, chloroplast
precursor/called_in_both_way/called_in_inparanoid
Zm#S27945068|Transcribed locus, moderately similar to NP_524687.1 CG10652-PA, isoform A [Drosophila
melanogaster] BLAST:RL30_BRABE (P58374) 60S ribosomal protein L30//
Zm#S11431675|Transcribed locus, moderately similar to XP_365965.1 hypothetical protein MG10185.4 [Magnaporthe
grisea 70-15] BLAST:RL25_PUCGR (P51997) 60S ribosomal protein L25//
Zm#S26657501|Transcribed locus, strongly similar to XP_470648.1 Putative 50S ribosomal protein L10 [Oryza sativa
(japonica cultivar-group)] BLAST:RL10_PROMP (Q7V383) 50S ribosomal protein L10/called_in_both_way/
Zm#S30248883|PCO080208 mRNA sequence BLAST:RL34_TOBAC (P41098) 60S ribosomal protein
L34/called_in_both_way/called_in_inparanoid
Zm#S25102831|Transcribed locus, weakly similar to NP_190915.1 unknown protein [Arabidopsis thaliana]
BLAST:/called_in_both_way/called_in_inparanoid
-1,154
-1,178
-1,329
-1,337
-1,436
-1,531
-1,565
-1,955
-3,393
AS Aktivierung (Cytosol und Organellen)
29.1
zm.2255.1.s1_at
Zm#S17031145|Transcribed locus, weakly similar to NP_922876.1 putative retinoblastoma binding protein [Oryza
sativa (japonica cultivar-group)] BLAST:R1AB_PEDV7 (Q91AV2) Replicase polyprotein 1ab (pp1ab) (ORF1ab
polyprotein) [Includes: Replicase polyprotei//
Zm#S11327706|Transcribed locus, weakly similar to NP_193114.1 ATP binding / methionine-tRNA ligase/ tRNA
binding / tRNA ligase [Arabidopsis thaliana] BLAST:SYM_ORYSA (Q9ZTS1) Probable methionyl-tRNA synthetase (EC
6.1.1.10) (Methionine--tRNA ligase) (MetR//
29.1
zm.2572.1.a1_at
29.1
zm.6478.1.s1_at
NOTHING | tRNA pseudouridine synthase famil/called_in_both_way/called_in_inparanoid
29.1
zm.10847.1.a1_at
-1,045
29.1
zm.10287.1.s1_at
29.1
zm.17816.2.a1_at
NOTHING | seryl-tRNA synthetase, putative / s/called_in_both_way/called_in_inparanoid
Zm#S27926907|Transcribed locus, strongly similar to XP_470597.1 Putative methionyl-tRNA synthetase [Oryza sativa
(japonica cultivar-group)] BLAST:SYM_SYNY3 (Q55729) Methionyl-tRNA synthetase (EC 6.1.1.10) (Methionine--tRNA
ligase) (MetRS)//
Zm#S11520333|PCO148352 mRNA sequence BLAST:TRUA_MOUSE (Q9WU56) tRNA pseudouridine synthase A (EC
5.4.99.12) (tRNA-uridine isomerase I) (tRNA pseudouridylate synthase I)//
29.1
zm.4638.1.a1_at
-1,142
29.1
zm.3192.1.a1_at
NOTHING | tRNA-binding region domain-containi/called_in_both_way/called_in_inparanoid
Zm#S11425675|Transcribed locus, moderately similar to NP_922744.1 putative palmitoyl-protein thioesterase [Oryza
sativa (japonica cultivar-group)] BLAST:PACC_ASPGI (Q5XL24) pH-response transcription factor pacC/RIM101//
29.1
zm.4112.1.a1_at
-1,245
29.1
zm.13982.1.s1_at
29.1
zm.15382.1.a1_at
29.1
zm.10591.1.s1_at
29.1
zm.5463.1.a1_at
Zm#S27903247|PCO075242 mRNA sequence BLAST:IF2_PROAC (Q6A7M5) Translation initiation factor IF-2//
Zm#S11527898|PCO069460 mRNA sequence BLAST:SYW_SYNEL (Q8DHG3) Tryptophanyl-tRNA synthetase (EC
6.1.1.2) (Tryptophan--tRNA ligase) (TrpRS)/called_in_both_way/called_in_inparanoid
Zm#S11525460|PCO074648 mRNA sequence BLAST:SYFM_MOUSE (Q99M01) Phenylalanyl-tRNA synthetase,
mitochondrial precursor (EC 6.1.1.20) (Phenylalanine--tRNA ligase) (PheRS)//called_in_inparanoid
Zm#S11525460|PCO074648 mRNA sequence BLAST:SYFM_MOUSE (Q99M01) Phenylalanyl-tRNA synthetase,
mitochondrial precursor (EC 6.1.1.20) (Phenylalanine--tRNA ligase) (PheRS)/called_in_both_way/called_in_inparanoid
Zm#S11528356|PCO142257 mRNA sequence BLAST:SYP_CLOST (Q9L4Q8) Prolyl-tRNA synthetase (EC 6.1.1.15)
(Proline--tRNA ligase) (ProRS)/called_in_both_way/called_in_inparanoid
1,429
1,073
1,071
-1,054
-1,142
-1,157
-1,255
-1,365
-1,506
-1,576
XV
ANHANG
29.1
zm.13724.1.s1_at
29.1
zm.17289.1.s1_at
29.1
zm.3927.1.a1_at
Zm#S11526325|PCO117271 mRNA sequence BLAST:SYY_BACST (P00952) Tyrosyl-tRNA synthetase (EC 6.1.1.1)
(Tyrosine--tRNA ligase) (TyrRS)/called_in_both_way/called_in_inparanoid
Zm#S27570649|Transcribed locus, strongly similar to XP_467858.1 putative histidine-tRNA ligase [Oryza sativa
(japonica cultivar-group)] BLAST:SYH_PYRFU (Q8U431) Histidyl-tRNA synthetase (EC 6.1.1.21) (Histidine--tRNA
ligase) (HisRS)/called_in_both_way/
Zm#S22333706|CL5132_1 mRNA sequence BLAST:SYK_ORYSA (Q6F2U9) Lysyl-tRNA synthetase (EC 6.1.1.6)
(Lysine--tRNA ligase) (LysRS)/called_in_both_way/called_in_inparanoid
-1,581
-1,989
-2,193
Initiierung (Cytosol und Organellen)
29.2.3
zm.12387.1.s1_at
Zm#S11529068|Translation initiation factor 5A BLAST:IF5A_MAIZE (P80639) Eukaryotic translation initiation factor 5A
(eIF-5A) (eIF-4D)//called_in_inparanoid
Zm#S11529068|Translation initiation factor 5A BLAST:IF5A_MAIZE (P80639) Eukaryotic translation initiation factor 5A
(eIF-5A) (eIF-4D)//called_in_inparanoid
Zm#S18249799|Transcribed locus, weakly similar to XP_493847.1 unknown protein [Oryza sativa (japonica cultivargroup)] BLAST:HPS6_HUMAN (Q86YV9) Hermansky-Pudlak syndrome 6 protein (Ruby-eye protein homolog) (Ru)//
Zm#S31094912|Transcribed locus, strongly similar to NP_199194.1 ZLL (ZWILLE) [Arabidopsis thaliana]
BLAST:PINH_ARATH (Q9XGW1) PINHEAD protein (ZWILLE protein)//
Zm#S11528543|PCO086223 mRNA sequence BLAST:IF3C_ORYSA (Q94HF1) Eukaryotic translation initiation factor 3
subunit 12 (eIF-3 p25) (eIF3k)//called_in_inparanoid
29.2.3
zm.4164.3.a1_at
29.2.3
zm.17280.1.s1_at
29.2.3
zm.2610.1.a1_at
29.2.3
zm.16783.2.a1_at
29.2.3
zm.10042.1.s1_at
Zm#S11521927|CL54685_1 mRNA sequence BLAST:PINH_ARATH (Q9XGW1) PINHEAD protein (ZWILLE protein)//
1,663
29.2.3
zm.17314.1.s1_at
zm.12617.1.a1_at
29.2.3
zm.16783.1.a1_at
29.2.3
zm.4164.2.a1_at
29.2.3
zm.16289.1.a1_at
29.2.3
zm.15445.1.a1_at
29.2.3
zm.16316.1.a1_at
Zm#S18249126|Transcribed locus BLAST://
Zm#S22334458|Clone EL01N0554D04.c mRNA sequence BLAST:IF4A9_TOBAC (Q40471) Eukaryotic initiation factor
4A-9 (EC 3.6.1.-) (ATP-dependent RNA helicase eIF4A-9) (eIF-4A-9)//
Zm#S11528543|PCO086223 mRNA sequence BLAST:IF3C_ORYSA (Q94HF1) Eukaryotic translation initiation factor 3
subunit 12 (eIF-3 p25) (eIF3k)/called_in_both_way/called_in_inparanoid
Zm#S11529068|Translation initiation factor 5A BLAST:IF5A_MAIZE (P80639) Eukaryotic translation initiation factor 5A
(eIF-5A) (eIF-4D)//called_in_inparanoid
Zm#S11529059|PCO100006 mRNA sequence BLAST:YG1F_YEAST (P53214) Hypothetical 57.5 kDa protein in
VMA7-RPS25A intergenic region//called_in_inparanoid
Zm#S22334167|PCO126000 mRNA sequence BLAST:IF36_MOUSE (P60229) Eukaryotic translation initiation factor 3
subunit 6 (eIF-3 p48) (eIF3e) (Mammary tumor-associated protein INT-6) (Viral integration site protein INT-6) (MMTV
integration site 6)/called_in_both_way/
Zm#S32295207|Transcribed locus, weakly similar to NP_197422.2 ATP binding / ATP-dependent helicase/ helicase/
nucleic acid binding [Arabidopsis thaliana] BLAST:VASA_DROME (P09052) ATP-dependent RNA helicase vasa (EC
3.6.1.-) (Antigen Mab46F11)/called_in_both_way/called_in_inparanoid
1,523
29.2.3
29.2.3
zm.10294.1.s1_at
29.2.3
zm.7391.1.a1_at
29.2.3
zm.13959.1.s1_at
29.2.3
zm.6732.5.s1_at
29.2.3
zm.9596.1.a1_at
Zm#S31095194|Transcribed locus BLAST:PRA1_USTHO (Q99063) Pheromone receptor 1//
Zm#S27940702|CL24029_1 mRNA sequence BLAST:EFP_SYNP7 (Q54760) Elongation factor P (EFP)/called_in_both_way/
Zm#S11527703|PCO111346 mRNA sequence BLAST:IF3C_EUGGR (P36177) Translation initiation factor IF-3,
chloroplast precursor (IF-3chl)/called_in_both_way/
Zm#S11528963|HMG-like nucleosome/chromatin assembly factor D BLAST:IF2C_ARATH (Q9SHI1) Translation
initiation factor IF-2, chloroplast precursor/called_in_both_way/
Zm#S11439616|Transcribed locus BLAST:HUTG_VIBVY (P60111) Formimidoylglutamase (EC 3.5.3.8)
(Formiminoglutamase) (Formiminoglutamate hydrolase)//
4,404
2,332
2,048
1,967
1,75
1,177
1,135
-1,191
-1,198
-1,23
-1,303
-1,55
-1,552
-1,787
-2,328
-2,423
XVI
ANHANG
Elongation (Cytosol und Organellen)
29.2.4
zm.5796.2.s1_at
29.2.4
zm.12357.1.a1_at
29.2.4
zm.5796.2.a1_at
29.2.4
zm.2063.1.s1_at
29.2.4
zm.5327.1.a1_at
29.2.4
zm.2135.1.s1_at
29.2.4
zm.16070.1.a1_at
29.2.4
zm.5796.1.s1_at
29.2.4
zm.5796.1.a1_at
29.2.4
zm.6033.1.a1_at
29.2.4
zm.18400.1.s1_at
Zm#S11527299|PCO106588 mRNA sequence BLAST:EFGC_SOYBN (P34811) Elongation factor G, chloroplast
precursor (EF-G)//
Zm#S26201097|Transcribed locus, weakly similar to NP_915494.1 putative homeodomain protein [Oryza sativa
(japonica cultivar-group)] BLAST:YHW2_YEAST (P38857) Hypothetical UPF0041 protein YHR162w//
Zm#S11527299|PCO106588 mRNA sequence BLAST:EFGC_SOYBN (P34811) Elongation factor G, chloroplast
precursor (EF-G)/called_in_both_way/
Zm#S22335759|CL2727_-4 mRNA sequence BLAST:EF2_BETVU (O23755) Elongation factor 2 (EF-2)//
Zm#S11527580|PCO103788 mRNA sequence BLAST:EFTS_BARHE (Q6G5C8) Elongation factor Ts (EFTs)/called_in_both_way/
Zm#S22336112|Clone Contig308 mRNA sequence BLAST:NACA1_ARATH (Q9LHG9) Nascent polypeptideassociated complex alpha subunit-like protein 1 (NAC-alpha-like protein 1) (Alpha-NAC-like protein
1)/called_in_both_way/called_in_inparanoid
Zm#S16365438|Transcribed locus BLAST:SUI1_SPOST (Q9SM41) Protein translation factor SUI1 homolog//
Zm#S11527299|PCO106588 mRNA sequence BLAST:EFGC_SOYBN (P34811) Elongation factor G, chloroplast
precursor (EF-G)/called_in_both_way/
Zm#S11527299|PCO106588 mRNA sequence BLAST:EFGC_SOYBN (P34811) Elongation factor G, chloroplast
precursor (EF-G)//
Zm#S11527115|Ribosomal protein L25 BLAST:EFTU1_SOYBN (Q43467) Elongation factor Tu, chloroplast precursor
(EF-Tu)//
Zm#S11527115|Ribosomal protein L25 BLAST:EFTU1_SOYBN (Q43467) Elongation factor Tu, chloroplast precursor
(EF-Tu)//
1,804
1,77
1,167
1,166
1,11
1,027
-1,333
-1,549
-1,656
-1,963
-1,967
Termination (Cytosol und Organellen)
29.2.5
zm.9041.1.a1_at
29.2.5
zm.13318.1.s1_at
Zm#S22333721|PCO101864 mRNA sequence BLAST:ERF1Z_ARATH (P35614) Eukaryotic peptide chain release
factor subunit 1-3 (eRF1-3) (Eukaryotic release factor 1-3) (Omnipotent suppressor protein 1 homolog 3) (SUP1
homolog 3)//
Zm#S22334208|Clone EL01N0307H02.d mRNA sequence BLAST:ERF1Z_ARATH (P35614) Eukaryotic peptide chain
release factor subunit 1-3 (eRF1-3) (Eukaryotic release factor 1-3) (Omnipotent suppressor protein 1 homolog 3) (SUP1
homolog 3)//
1,787
1,524
Plastidäre / mitochondriale Ribosom-assoziierte Proteine
29.2.1.2
zm.12235.1.a1_at
29.2.1.99
zm.7289.1.s1_at
29.2.1.99
zm.6652.1.a1_at
29.2.1.99
zm.7289.1.a1_at
29.2.1.1
zm.7636.1.a1_at
29.2.1.1
zm.5449.1.a1_at
29.2.1.99
zm.457.1.s1_at
29.2.1.1
zm.8875.1.s1_at
Zm#S22334814|Clone EL01N0502G03.c mRNA sequence BLAST:RM24_YEAST (P36525) 60S ribosomal protein L24,
mitochondrial precursor (YmL14/YmL24)/called_in_both_way/called_in_inparanoid
Zm#S25100523|PCO139549 mRNA sequence BLAST:RR10_PORPU (P51286) Chloroplast 30S ribosomal protein
S10//called_in_inparanoid
Zm#S11526409|PCO086004 mRNA sequence BLAST:RS20_PROMM (Q7TUR7) 30S ribosomal protein
S20/called_in_both_way/
Zm#S25100523|PCO139549 mRNA sequence BLAST:RR10_PORPU (P51286) Chloroplast 30S ribosomal protein
S10/called_in_both_way/called_in_inparanoid
1,419
-1,117
-1,129
-1,129
NOTHING | ribosomal protein L35 family prote/called_in_both_way/
Zm#S17032538|CL9367_1 mRNA sequence BLAST:RK24_ARATH (P92959) 50S ribosomal protein L24, chloroplast
precursor/called_in_both_way/
-1,205
NOTHING | ribosomal protein L29 family protei/called_in_both_way/
Zm#S11527695|PCO073953 mRNA sequence BLAST:RR13_ARATH (P42732) 30S ribosomal protein S13, chloroplast
precursor (CS13)/called_in_both_way/called_in_inparanoid
-1,268
-1,213
-1,296
XVII
ANHANG
29.2.1.99
zm.3991.1.a1_at
29.2.1.99
zm.7004.1.a1_at
29.2.1.1
zm.3417.1.a1_at
29.2.1.1
zm.8900.2.s1_at
29.2.1.1
zm.18438.1.s1_at
29.2.1.1
zm.8241.1.a1_at
29.2.1.99
zm.1923.1.s1_at
29.2.1.1
zm.9179.1.s1_at
29.2.1.1
zm.8900.2.a1_at
29.2.1.99
zm.5786.1.a1_at
29.2.1.1
zm.15067.1.s1_at
29.2.1.99
zm.9038.1.s1_at
29.2.1.1
zm.3982.1.a1_at
29.2.1.1
zm.9118.1.a1_at
29.2.1.1
zm.5434.1.s1_at
29.2.1.1
zm.5414.1.a1_at
29.2.1.1
zm.7288.1.a1_at
29.2.1.99
zm.1661.1.a1_at
29.2.1.1
zm.10072.1.a1_at
29.2.1.1
zm.10145.1.s1_at
29.2.1.1
zm.3316.1.a1_at
29.2.1.1
zm.1899.1.a1_at
Zm#S27897055|PCO116928 mRNA sequence BLAST:/called_in_both_way/called_in_inparanoid
Zm#S27921283|PCO103582 mRNA sequence BLAST:RS5_ANAVT (Q3MFA5) 30S ribosomal protein
S5/called_in_both_way/called_in_inparanoid
Zm#S25117528|Transcribed locus, strongly similar to XP_469777.1 putative ribosomal protein L6 [Oryza sativa
(japonica cultivar-group)] BLAST:RL6_SYNP6 (O24703) 50S ribosomal protein L6//
Zm#S22334527|Clone EL01N0532F02.c mRNA sequence BLAST:RK9_ARATH (P25864) 50S ribosomal protein L9,
chloroplast precursor (CL9)//called_in_inparanoid
Zm#S25130135|Transcribed locus, strongly similar to XP_468577.1 Putative plastid ribosomal protein L11 [Oryza
sativa (japonica cultivar-group)] BLAST:RK11_ARATH (Q9MAP3) 50S ribosomal protein L11, chloroplast precursor
(CL11)/called_in_both_way/called_in_inparanoid
Zm#S27931067|PCO108633 mRNA sequence BLAST:RS21_SYNEL (Q8DMS3) 30S ribosomal protein
S21/called_in_both_way/
Zm#S11423569|Transcribed locus, moderately similar to XP_475769.1 putative 30S ribosomal protein S1 [Oryza sativa
(japonica cultivar-group)] BLAST:RR1_SPIOL (P29344) 30S ribosomal protein S1, chloroplast precursor
(CS1)/called_in_both_way/
Zm#S11322439|PCO085040 mRNA sequence BLAST:RRP3_HORVU (O48609) Plastid-specific 30S ribosomal protein
3, chloroplast precursor (PSRP-3)/called_in_both_way/
Zm#S22334527|Clone EL01N0532F02.c mRNA sequence BLAST:RK9_ARATH (P25864) 50S ribosomal protein L9,
chloroplast precursor (CL9)//called_in_inparanoid
Zm#S11526669|PCO121693 mRNA sequence BLAST:RL19_LACLA (Q9CH65) 50S ribosomal protein
L19/called_in_both_way/called_in_inparanoid
Zm#S11523961|PCO106609 mRNA sequence BLAST:RL17_SYNY3 (P73296) 50S ribosomal protein
L17/called_in_both_way/called_in_inparanoid
Zm#S11433581|Transcribed locus, strongly similar to NP_917384.1 putative ribosomal protein L12 [Oryza sativa
(japonica cultivar-group)] BLAST:RK121_SECCE (Q06030) 50S ribosomal protein L12-1, chloroplast precursor (CL121)/called_in_both_way/
Zm#S11528320|PCO077438 mRNA sequence BLAST:RK21_ARATH (P51412) 50S ribosomal protein L21, chloroplast
precursor (CL21)/called_in_both_way/called_in_inparanoid
Zm#S11334656|Transcribed locus, moderately similar to NP_189221.1 RPL15 [Arabidopsis thaliana]
BLAST:RK15_PEA (P31165) 50S ribosomal protein L15, chloroplast precursor (CL15) (Fragment)/called_in_both_way/
Zm#S11521187|CL4755_1 mRNA sequence BLAST:RL6_SYNP6 (O24703) 50S ribosomal protein
L6/called_in_both_way/
Zm#S11527220|PCO138567 mRNA sequence BLAST:RR1_SPIOL (P29344) 30S ribosomal protein S1, chloroplast
precursor (CS1)/called_in_both_way/called_in_inparanoid
Zm#S11446794|PCO079200 mRNA sequence BLAST:RK28_ARATH (O22795) 50S ribosomal protein L28, chloroplast
precursor/called_in_both_way/called_in_inparanoid
Zm#S11520586|CL12353_1 mRNA sequence BLAST:RK27_ORYSA (O65037) 50S ribosomal protein L27, chloroplast
precursor/called_in_both_way/
Zm#S11520284|Clone E04912701C01.c mRNA sequence BLAST:RK1_PORPU (P51338) Chloroplast 50S ribosomal
protein L1/called_in_both_way/called_in_inparanoid
Zm#S11333303|Transcribed locus, moderately similar to NP_915866.1 putative 50S ribosomal protein L34 [Oryza
sativa (japonica cultivar-group)] BLAST:RK34_SPIOL (P82244) 50S ribosomal protein L34, chloroplast
precursor/called_in_both_way/
Zm#S27570460|Transcribed locus, moderately similar to XP_464397.1 ribosomal protein S21-like protein [Oryza sativa
(japonica cultivar-group)] BLAST:RS21_SYNEL (Q8DMS3) 30S ribosomal protein S21//
Zm#S11522084|CL3870_1 mRNA sequence BLAST:RL31_ANASP (Q8YPK8) 50S ribosomal protein
L31/called_in_both_way/called_in_inparanoid
-1,305
-1,442
-1,447
-1,459
-1,462
-1,464
-1,566
-1,584
-1,599
-1,6
-1,609
-1,634
-1,666
-1,78
-1,822
-1,986
-2,006
-2,105
-2,124
-2,16
-2,325
-2,433
XVIII
ANHANG
29.2.1.99
zm.1938.1.a1_at
Zm#S11345125|Transcribed locus BLAST:PTPRU_HUMAN (Q92729) Receptor-type tyrosine-protein phosphatase U
precursor (EC 3.1.3.48) (R-PTP-U) (Protein-tyrosine phosphatase J) (PTP-J) (Pancreatic carcinoma phosphatase 2)
(PCP-2)//
29.2.1.1
zm.11708.1.a1_at
Zm#S11451718|Transcribed locus BLAST:T2_MOUSE (Q06666) Octapeptide-repeat protein T2//
-2,462
-2,52
XIX
DANKSAGUNG
8 Danksagung
Ich danke Prof. Uwe Sonnewald für die Überlassung und Finanzierung des bearbeiteten
Projekts, für die fachliche Unterstützung, für die vielen konstruktiven Diskussionen und für die
Möglichkeit, spannende Tagungen zu besuchen und dort Daten zu präsentieren.
Mein besonderer Dank gilt Dr. Lars Voll für die einmalig gute Betreuung während der letzten
dreieinhalb Jahre und die Zeit, die er sich jederzeit zur Datenbesprechung genommen hat.
Ohne seine offenbar unerschöpflichen Kenntnisse der Pflanzenphysiologie und ohne seine
Geduld und Ruhe während der obligatorischen Durststrecken wäre diese Arbeit nicht möglich
gewesen. Und sie hätte ohne Eischörnschen, Wolf mit großen Augen und T-Shirts nur halb
soviel Spaß gemacht.
Vielen Dank an Prof. Andreas Burkovski und Prof. Ralph Hückelhoven für die Bereitschaft, das
Zweit- und Drittgutachten zu übernehmen, sowie an Prof. Norbert Sauer für die Übernahme des
Prüfungskommissionsvorsitzes.
Besonders Danken möchte ich Christine („Ustilagine“) Zeh und Timo („Timann“) Engelsdorf, die
während ihrer Diplomarbeiten hervorragende Arbeit geleistet haben und deren Daten teilweise
in dieser Arbeit wiederzufinden sind. Vielen Dank auch an Gunther Döhlemann und Ramon
Wahl für die Durchführung des ominösen Zentralexperiments in dreifacher Ausführung und die
Affymetrix-Arrayhybridisierung und deren statistische Auswertung, sowie Prof. Regine
Kahmann, Prof. Jörg Kämper und Dr. Thomas Brefort für die Überlassung von UstilagoStämmen und Vektoren zur Transformation von Ustilago, sowie hilfreichen Diskussionen.
Besten Dank auch dem Analytikteam, bestehend aus Dr. Jörg Hofmann und Alfred Schmiedl für
die Etablierung der MS/MS-Methoden und für die Pflege und Wartung der HPLCs. An dieser
Stelle auch noch danke an Ali, mit dem ich die ersten Aminosäure- und Tocopherolmessungen
durchgeführt habe und an Hartmut Wieland für die Durchführung der CNS- und ICPMessungen. Danke an Dr. Uwe Scholz für die Annotation des Agilent Mikroarrays.
Mein Dank gilt natürlich allen Kollegen am Lehrstuhl, insbesondere Melli, Stephen und Sophia
für die Hilfe bei den Agilent-Mikroarrays und die Einführung in die qPCR, Marlis für wertvolle
Hilfe bei der Transformation und Handhabung von Ustilago, Ricky für hilfreiche Tipps bezüglich
der Molekularbiologie, Sabine Karpeles für die Durchführung von screening-PCRs an
Arabidopsen (!!), Alexandra für die Durchführung diverser Metabolitmessungen, Christine Hösl
für die Pflege der Gewächshauspflanzen und (natürlich viel wichtiger!) der Kaffeemaschine,
Sabine Albert für den Spüldienst und dem Sekretariatsteam bestehend aus Gaby, Iris und Ulla.
Danke an das gesamte Labor 01.368, denn: Voll gewesen, toll gewesen!
Vielen Dank auch an Frau Bartschat für die Überlassung eines Bibliotheksplatzes während der
Schreibphase und für die Bestellung diverser Paper und Bücher.
An dieser Stelle möchte ich meinen Freunden danken für den alltäglichen Ausgleich vom
Arbeitsleben, insbesondere Flo für das Probelesen meiner Dissertation und einigen
abenteuerlichen Fahrradfahrten, Doreen („krass“, „aber Hallo“) für das Aufpeppen des
DANKSAGUNG
Laboralltags, Kletterausflüge und einen Frankreichurlaub, und beiden für diverse gemeinsame
und dringend benötigte Frustbierchen. Danke auch allen weiteren regelmäßigen Teilnehmern
der allsommerlichen Grillrunden: Im Alleingang haben wir durch Fleischkonsum den
Treibhauseffekt ausgelöst! Vielen Dank an Andrea und Kathi für die Korrektur meiner
Dissertation und für den regelmäßigen Austausch von Schlauigkeiten.
Zuletzt möchte ich meiner Familie danken, für die Unterstützung während der letzten Jahre, für
die aufmunternden Gespräche während der Durststrecken und für viele fachliche sowie
unfachliche Diskussionen, und natürlich Wiebke. Vielen Dank für alles! Ich freue mich darauf,
kein Zug mehr fahren zu müssen!
Verflixt swêr is shcreiben mir tuon schon alle finger wê
XXI
Curriculum vitae
Robin Horst
Nationalität:
Geburtsdatum:
Familienstand:
deutsch und französisch
15. Dezember 1980 in Nürtingen
ledig
Bildungsweg
1987-1991
1991-1993
1993
1994
1994-2000
2001-2006
2006-2010
Grundschule Bennigsen, Niedersachsen
Orientierungsstufe Nord in Springe, Niedersachsen
Kenmore South State School in Brisbane, Australien
Kenmore State High School in Brisbane, Australien
Bismarckschule Hannover, Niedersachsen
Biologiestudium an der Universität zu Köln, NRW
Doktorarbeit am Lehrstuhl für Biochemie, Universität
Erlangen-Nürnberg, Bayern
Wehrdienst
2000-2001
Heeresfliegerwaffenschule in Bückeburg, NRW
Forschungsvorträge und Posterpräsentationen
Ustilago maydis vs. Zea mays – Insights into the physiology of a
biotrophic interaction by combined metabolome and transcriptome
analysis; Posterpräsentation; Gordon Research Conference “Plant
Molecular Biology”; Holderness, NH, USA; Juli 2008
Einblicke in die Physiologie der Mais - Ustilago maydis Interaktion
durch die Kombination von Metabolom- und Transkriptomanalysen;
Posterpräsentation; 21. Tagung Molekularbiologie der Pflanzen;
Dabringhausen; Feburar 2008
Ustilago maydis verhindert die Entwicklung des C4-Syndroms und die
Etablierung von source-Gewebe; Vortrag; 24. Wallenfelser
Rundgespräch Zur Pflanzenbiochemie; Wallenfels; Mai 2007
(Re)programming of photosynthesis and sink-metabolism in maize
infected with pathogenic and apathogenic Ustilago maydis; Vortrag;
Communication in Plants and their Response to the Environment;
Halle (Saale); Mai 2007
Reprogramming of photosynthesis and source-to-sink transition in
maize infected with pathogenic and non-pathogenic Ustilago maydis;
Posterpräsentation; 3rd International Rauischholzhausen
Conference; Rauischholzhausen; März 2007
Preise
Reinhold-von-Sengbusch-Posterpreis; 21. Tagung Molekularbiologie
der Pflanzen; Dabringhausen; Februar 2008
Publikationsliste
R Pratelli, LM Voll, RJ Horst, WB Frommer, G Pilot. Stimulation of
non-selective amino acid export by Glutamine Dumper proteins. Plant
Physiology, 152, 762-773
RJ Horst, G Doehlemann, R Wahl, J Hofmann, A Schmiedl, R
Kahmann, J Kämper, U Sonnewald, LM Voll. (November 18, 2009).
Ustilago maydis infection strongly alters organic nitrogen allocation in
maize and stimulates productivity of systemic source leaves. Plant
Physiology, 152, 293-308
G Doehlemann, R Wahl, RJ Horst, LM Voll, B Usadel, F Poree, M
Stitt, J Pons-Kuehnemann, U Sonnewald, R Kahmann, J Kaemper.
(2008). Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic
changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis. The Plant
Journal, 56, 181-195
RJ Horst, T Engelsdorf, U Sonnewald, LM Voll. (2008). Infection of
maize leaves with Ustilago maydis prevents establishment of C-4
photosynthesis. Journal of Plant Physiology, 165, 19-28
APM Weber, RJ Horst, GG Barbier, C Oesterhelt. (2007).
Metabolism and metabolomics of eukaryotes living under extreme
conditions. In: International Review of Cytology – a Survey of Cell
Biology, Vol 256, pp. 1-34
Weitere wissenschaftliche Abhandlungen
Changes in carbohydrate metabolism of Galdieria sulphuraria in
response to salt stress; Diplomarbeit; März 2006; Universität zu Köln
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