NMR (Kernmagnetische Resonanz, N l M ti R ) Nuclear Magnetic
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NMR (Kernmagnetische Resonanz, N l Nuclear M Magnetic ti R Resonance)) Horst Friebolin: Wiley, VCH, ISBN-10: 3527315713, 49,90 Euro 1 NMR historisch Isidor Isaac Rabi Nobelpreis 1944 Weist in Molekularstrahlexperiment den resonanten Übergang zwischen Kernspinzuständen nach 2 NMR historisch H2O Bloch EtOH "hochaufgelöst" Purcell Felix Bloch Edward Mills Purcell Nobelpreis Physik 1952 Erster Aufnahmen von NMR Spektren in kondensierter Materie 3 NMR historisch Richard R Ernst Nobelpreis Chemie 1991 Mehrdimensionale, hochaufgelöste NMR 4 NMR historisch Kurt Wüthrich Nobelpreis Chemie 2002 Strukturbestimmung von Biomakromolekülen in Lösung 5 NMR historisch Paul Lauterbur, Sir Peter Mansfield Nobelpreis Medizin 2003 Bildgebende Verfahren Verfahren, Kernspintomographie 6 NMR Grundlagen Die meisten Kerne haben Kerndrehimpuls Kreisel-Modell p des Kernspins 7 NMR Grundlagen Die meisten Kerne haben Kerndrehimpuls Kreisel-Modell des Kernspins. Mögliche Orientierungen für p und Spin-1 p Kerne in Magnetfeld. g Spin-1/2 Die Spins nehmen den Winkel Θ (54.73° bzw. 45°) gegenüber der Z-Achse ein. 8 NMR Grundlagen Tabelle 1 1.1 1 Friebolin 9 NMR Grundlagen Die magnetischen Momente präzisieren mit der Larmorfrequenz Öffnungswinkel 54,44° 10 NMR Grundlagen Im externen magnetischen Feld überwiegen die parallelen Spinzustände was zu einer makroskopischen Magnetisierung M0 führt 11 NMR Grundlagen Tabelle 1 1.1 1 Friebolin rel. Sensitivität: S Bei konst. B und gleicher Kernzahl abs. Sensitivität: rel. Sensitivität * Häufigkeit 12 NMR Grundlagen Die relevante Energie: γ-rays 10-10 B0 [Tesla] 2.35 2 35 5.87 9.4 11 75 11.75 18.97 X-rays UV VIS 10-8 IR μ-wave 10-6 10-4 10-2 wavelenght (cm) ( ) Resonanzfrequenz [MHz] 1H 100 250 400 500 800 100 radio 102 13C 25.15 25 15 62.90 100.61 125 76 125.76 201.16 19 T entspicht ca. 600.000 fachem des Erdmagenetfelds 13 NMR Grundlagen CW-Spektrometer N,S) Polschuhe von Magnet A) Sweepspulen (mit ihnen wird das Feld durchgefahren) B) Empfängerspule. Di S Die Spule l d des S Senders d mit it kkonstanter t t RF Frequenz ist orthogonal (entlang der xAchse) 14 Der Puls Graphische p Darstellung g des Pulses in der Zeitdomäne τp = Pulsdauer Frequenzkomponente q p des Pulses τp = Pulsdauer Bandbreite ca. ν1- τp-1 bis ν1+ τp-1 15 Der Puls Frequenzkomponente des Pulses τp = Pulsdauer B db it ca. ν1- τp-11 bis Bandbreite bi ν1+ τp-11 z.B. τp = 10-5 s regt Frequenzband von ca. 105 Hz H an. Hi Hinreichend, i h d um alle Kerne eines Isotops anzuregen. 16 Der Pulswinkel Nach 90° Puls sind beide Energieniveaus gleichbesetzt, aber die Magnetisieungsdipole in Phasenkoärenz. 17 Das rotierende Koordinatensystem Die dreidimensionale Darstellung wird jetzt in rotierendes Koordinatensystem überführt. 18 Der Pulswinkel Die Magnetisierung in xy Richtung ist jetzt einfach darstellbar 19 Der Pulswinkel Die Magnetisierung in xy Richtung ist jetzt einfach darstellbar 20 Der Pulswinkel Schematische Darstellung eines NMR Experiments mit 90° Puls 21 Der Pulswinkel 90° 180° Signal von Wasser mit unterschiedlichen Pulslängen aufgenommen 22 Relaxation: Spin Gitter Wechselwirkungen Z-Komponente der Magnetisierung geht nach 1...100 s wieder in Gleichgewichtszustand über 23 Messung der Spin Gitter Relaxation IRFT Experiment 180° 90° Detektion Z-Komponente der Magnetisierung ist nicht direkt beobachtbar aber: Inversion Recovery Fourier Transformation Methode möglich 24 Messung der Spin Gitter Relaxation IRFT Experiment Detektion Detektion Z-Komponente der Magnetisierung ist nicht direkt beobachtbar aber: Inversion Recovery Fourier Transformation Methode möglich 25 Messung der Spin Gitter Relaxation IRFT Experiment Detektion Z-Komponente der Magnetisierung ist nicht direkt beobachtbar aber: Inversion Recovery Fourier Transformation Methode möglich 26 Messung der Spin Gitter Relaxation IRFT Experiment 27 Messung der Spin Gitter Relaxation IRFT Experiment ln (M0-Mτ) 28 Relaxation: Spin Spin Wechselwirkungen XY-Komponente der Magnetisierung geht in 10-500 ms verloren 29 Bestimmung von T2: Spin Echo Experiment 30 Der Pulswinkel Das Signal g Die Magentisierung im rotierenden Koordinatensystem entspricht einem pulsierenden magnetischen Vektor in X und Y-Richtung Die resultierende elektromagenetische Welle kann mit Detektor nachgewiesen werden 31 Fourier Transformation XY-Komponente der Magnetisierung geht in 10-500 ms verloren 32 Fourier Transformation XY-Komponente der Magnetisierung geht in 10-500 ms verloren 33 Das klassische PFT-Experiment XY-Komponente der Magnetisierung geht in 10-500 ms verloren 34 Fourier Transformation Free Induction Decay FID 1H-NMR von CHI3 35 Fourier Transformation 36 Fourier Transformation 13C-NMR 13CH von 3OH 37 Fourier Transformation 38 Phasenkorrektur Spektrum ohne Phasenkorrektur Mit Phasenkorrektur 39 Spektrenakkumulation 75 Scans 7500 Scans 15N-NMR Schnelle Erfassung von labilen Intermediaten möglich Niedriges Signal / Rauschverhältnis von BSA mit oxoperoxonitrat / CO2 Addukt 40 NMR Probenvorbereitung Lösungsmittel: zur 1H-NMR deuterierte Lösungsmittel einsetzbar 41 NMR Probenvorbereitung 42 Fourier Transformation Bei schneller Relaxation werden die Linien verbreitert (z.B. Eisensalze in der Probe) 43 NMR Spektrometer Erschütterungsfreie, stabile Aufstellung von Grossgerät 44 NMR Spektrometer Starkes Magnetfeld erfordert hohen technischen Aufwand 45 NMR Spektrometer B0 Probenkopf 46 LC NMR 47 Integration 3 Gruppen von Protonen 3 : 4.5 : 4.5 Als Zusammensetzung 2:3:3 4:6:6 etc Erfassung von genügend Punkten nötig g Ethylacetat 48 Chemische Verschiebung 90 MHz Spektrum Tieffeld e ed Hochfeld TMS (Si(CH3)4) bei 90.000.000 Hz, CH3Br bei 90.000.237Hz... 49 Chemische Verschiebung Chemische Verschiebung δ = ν Substanz - ν Referenz ν Referenz Angabe in ppm (Korrektur um Faktor 106) da Δν im Hz Bereich und ν im MHz Bereich Dimensionslos, unabhängig von B0 50 Chemische Verschiebung Einfluss der Ladungsdichte: Der diamagnetische Abschirmungsterm σdia Magnetfeld induziert in Elektronenhülle Strom der am Kernort Gegenfeld induziert CH3F 1H δ(ppm) EN CH3OCH3 CH3I CH3CH3 CH3Li 4.26 3.24 2.16 0.88 -1.9 F 4.1 O 3.5 I 2.1 C 2.5 Li 0.97 Trotz EN Unterschied Platztausch wegen freien Elektronenpaaren im I "Wenige e-" tiefes Feld "Viele e-" hohes Feld 51 Chemische Verschiebung 52 Chemische Verschiebung Zusätzlich σpara Paramagnetischer Abschirmungsterm Berücksichtigt, dass Ladungsverteilung nicht kugelsymmetrisch sein muss 53 Chemische Verschiebung Zusätzlich σpara Paramagnetischer Abschirmungsterm Berücksichtigt, dass Ladungsverteilung nicht kugelsymmetrisch sein muss σN Magnetische Anisotropie von Nachbargruppen abgeschwächt b h ä ht verstärkt 54 Chemische Verschiebung Zusätzlich σpara Paramagnetischer Abschirmungsterm Berücksichtigt, dass Ladungsverteilung nicht kugelsymmetrisch sein muss σN Magnetische Anisotropie von Nachbargruppen z.B. 55 Chemische Verschiebung Zusätzlich σpara Paramagnetischer Abschirmungsterm Berücksichtigt, dass Ladungsverteilung nicht kugelsymmetrisch sein muss σN Magnetische Anisotropie von Nachbargruppen σR Ringstromeffekt z.B. Tieffeldverschiebung 56 Ringstromeffekt 57 Chemische Verschiebung Zusätzlich σpara Paramagnetischer Abschirmungsterm Berücksichtigt, dass Ladungsverteilung nicht kugelsymmetrisch sein muss σN Magnetische Anisotropie von Nachbargruppen σR Ringstromeffekt σe Elektrische Feldeffekte pH 58 Chemische Verschiebung Zusätzlich σpara Paramagnetischer Abschirmungsterm Berücksichtigt, dass Ladungsverteilung nicht kugelsymmetrisch sein muss σN Magnetische Anisotropie von Nachbargruppen σR Ringstromeffekt σe Elektrische Feldeffekte σ = σdia + σpara + σn + σR + σe +... 59 Tabellen für Chemische Shift 60 Inkrementenmethode Regel von Shoolery für X-CH2-Y δH = 0,23 + Ix + Iy δH = 7,27 , +ΣI 61 Inkrementenmethode 62 Chemische Verschiebung http://www.colby.edu/chemistry/PChem/scripts/MarvinWeb/smiBSmarv.html 63 Chemische Verschiebung Berechnet (Gemessen) 1: 47.1 (45) ppm: +sp3+nA+AO+nB+Csp2O+Me 3: 173.9 173 9 ppm (191): +C=O+nA+Asp3OR+nB+nA+nB +C O+nA+Asp3OR+nB+nA+nB 5: 31.0 ppm (34): +sp3+nA+nB+BCOO+C-MtNA+nB+nA+nB 6: 21.8 ppm (24): +sp3+nA+nB+CO+Csp2O+nA+nB 7: 30.0 30 0 ppm (33): +sp3+nA+nB+nA+nB 8: 129.0 ppm (145): +sp2+nA+nB++nA' 9: 127.0 ppm (129): +sp2++nA'+nA+nB+AC=C 10: 144 144.5 5 ppm (151): +sp2+nA+nB+AC=C++nA +sp2+nA+nB+AC=C++nA'+B'sp2O +B sp2O 11: 121.5 ppm (130): +sp2++nA'+nA+nB+BO 12: 191.7 (193) ppm: +C=O+nA+Asp2C+nB+Bsp2C http://www.colby.edu/chemistry/PChem/scripts/MarvinWeb/smiBSmarv.html 64 Chemische Verschiebung http://www.acdlabs.com/products/spec_lab/predict_nmr/ 65 Computer Assisted Structure Elucidation (CASE) Find the constitution of an unknown molecule upon evidence from spectroscopic data, in particular from NMR. A typical set of information used to prepare a structure elucidation run consists of: * the molecular formula (high-resolution mass spectrometry) * 1D carbon nmr data * 1JCH NMR correlation data, like CH COSY, HMQC, HSQC * long-range long range CH or NH correlation data from HMBC HMBC, NH HMBC * HH correlation data http://sourceforge.net/projects/seneca 66 Computer Assisted Structure Elucidation (CASE) http://sourceforge.net/projects/seneca 67 Computer Assisted Structure Elucidation (CASE) Genetic algorithms http://sourceforge.net/projects/seneca 68 Computer Assisted Structure Elucidation (CASE) Genetic algorithms: Cross over von vielversprechenden Strukturen http://sourceforge.net/projects/seneca 69 Verschiebungsreagenzien 70 Verschiebungsreagenzien 71 Verschiebungsreagenzien 72 Chirale Derivatisierungsreagenzien od. anderes Enantiomer Mosher Ester JACHS 1973, 95, 512 73 Spin Spin Kopplung H H R O Ethylacetat H R O O H H H H H R O H H C H H C H H R C H CH3CH2O H H H C H Multiplizitätsregel: M lti li ität l M = 2n 2 I+1 n = Zahl Z hl d der ä äquivalenten i l t N Nachbarn hb Intensitäten mit Pascalschem Dreieck 74 H Spin Spin Kopplung 500 MHz 60 MHz 75 Spin Spin Kopplung 76 Spin Spin Kopplung 15x 5 Vergrössert e g össe t 77 Spin Spin Kopplung 78 Selektive Spinentkopplung CH3CH2O Ethylacetat 79 Selektive Spinentkopplung CH3CH2O Ethylacetat 80 Selektive Spinentkopplung 81 Selektive Signalunterdrückung Lösungsmittelunterdrückung z.B. z B bei HPLC NMR (Signal HDO bei 4 4.05 05 und Acetonitril bei 1.93 unterdrückt). Damit auch mit nichtdeuterierten Lösungsmitteln HPLC-NMR möglich 82 Breitbandentkopplung A)) Normale o a e Messung essu g B) Entkopplung der y g pp Methylgruppe C) Breitbandentkopplung J CC tritt aufgrund der Isotopenhäufigkeit nicht dominant auf 83 Breitbandentkopplung A)) Normale o a e Messung essu g B) Entkopplung der y g pp Methylgruppe C) Breitbandentkopplung J CC tritt aufgrund der Isotopenhäufigkeit nicht dominant auf 84 Breitbandentkopplung A)) Normale o a e Messung essu g B) Entkopplung der y g pp Methylgruppe C) Breitbandentkopplung J CC tritt aufgrund der Isotopenhäufigkeit nicht dominant auf 85 Breitbandentkopplung Höherer Empfindlichkeitsgewinn durch Entkopplung als aus Zusammenlegung der Linien zu erwarten wäre wäre. 86 Kern Overhauser Effekt (NOE) E z.B. A = 1H; X = 13C 87 Kern Overhauser Effekt (NOE) 88 Kern Overhauser Effekt (NOE) Offene Balken: Besetzung im Gleichgewicht 89 Kern Overhauser Effekt (NOE) Schwarze Balken: Anteile, die bei Sättigung der A Übergänge von N1 und N2 g werden übertragen 90 Kern Overhauser Effekt (NOE) Situation bei Einstrahlung 91 Kern Overhauser Effekt (NOE) Jetzt: Durch W0 und W2 Übergänge (erlaubt bei Relaxation) neues Gleichgewicht 92 Kern Overhauser Effekt (NOE) Relevanter Unterschied für Detektion von X wird durch W2 Vergrössert 93 Kern Overhauser Effekt (NOE) Relevanter Unterschied für Detektion von X wird durch W0 Verkleinert 94 Kern Overhauser Effekt (NOE) 95 Kern Overhauser Effekt (NOE) 96 Kern Overhauser Effekt (NOE) eingestrahlt erhöht 97 Kern Overhauser Effekt (NOE) stark erhöht eingestrahlt 18 11 15 nicht erhöht erhöht, also H unter der Ringebene 17 13 98 Kern Overhauser Effekt (NOE) erhöht eingestrahlt erhöht Somit beide Protonen an C20 zuzuordnen 99 Der Pulswinkel Nach 90° Puls sind beide Energieniveaus gleichbesetzt, aber die Magnetisieungsdipole in Phasenkoärenz. 100 Eindimensionale NMR mit komplexen Pulsfolgen Nomenklatur der Pulse im rotierenden Koordinatensystem 101 Eindimensionale NMR mit komplexen Pulsfolgen Einfluss der Pulse auf einen magnetischen Vektor der in y' Richtung liegt 102 Eindimensionale NMR mit komplexen Pulsfolgen Einfluss von x' und y' Pulsen auf beliebige magnetische Vektoren A und B B. 103 Eindimensionale NMR mit komplexen Pulsfolgen Einfluss von x' und y' Pulsen auf beliebige magnetische Vektoren A und B B. 104 Eindimensionale NMR mit komplexen Pulsfolgen Einfluss von x' und y' Pulsen auf beliebige magnetische Vektoren A und B B. 105 Eindimensionale NMR mit komplexen Pulsfolgen Einfluss von 180° Pulsen auf magnetische Vektoren A und B. B 106 Bestimmung von T2: Spin Echo Experiment Beispiel: Zwei Kerne A und B im inhomogenen Magnetfeld 107 Bestimmung von T2: Spin Echo Experiment Θ von Magnetfeldinhomogenität abhängig Beispiel: Zwei Kerne A und B im inhomogenen Magnetfeld 108 Bestimmung von T2: Spin Echo Experiment Beispiel: Zwei Kerne A und B im inhomogenen Magnetfeld 109 Bestimmung von T2: Spin Echo Experiment Beispiel: Zwei Kerne A und B im inhomogenen Magnetfeld 110 Bestimmung von T2: Spin Echo Experiment Beispiel: Zwei Kerne A und B im inhomogenen Magnetfeld t= h Signale unabhängig von Blokal refokussiert 111 J-moduliertes Spin Echo Experiment Cquartär S Spezialfall f t=1/J(C,H) / (C ) 112 J-moduliertes Spin Echo Experiment Cquartär CH S Spezialfall f t=1/J(C,H) / (C ) 113 J-moduliertes Spin Echo Experiment Cquartär CH CH2 S Spezialfall f t=1/J(C,H) / (C ) 114 J-moduliertes Spin Echo Experiment S Spezialfall f t=1/J(C,H) / (C ) 115 J-moduliertes Spin Echo Experiment (APT) COOH 1H 2 9 3 BB entkoppeltes 13C NMR 116 J-moduliertes Spin Echo Experiment Situation nach 90°X' Puls 117 J-moduliertes Spin Echo Experiment Situation nach 90°X' Puls 118 J-moduliertes Spin Echo Experiment Situation nach 90°X' Puls 119 J-moduliertes Spin Echo Experiment Situation nach 90°X' Puls 120 J-moduliertes Spin Echo Experiment Situation nach 90°X' Puls z.B. B CHCl3 121 J-moduliertes Spin Echo Experiment Koordinatensystem rotiert mit γl I Situation dreier Kerne mit unterschiedlichen chemischen Verschiebungen und unterschiedlichen J(CH) nach 90°x' τ Dann BB Entkopplung 122 J-moduliertes Spin Echo Experiment Signalintensität von Kopplungskonstante abhängig 123 Gepulste Feldgradienten 124 Gepulste Feldgradienten a,c ) Nach 90°x' b,d) Im linearen Feldgradienten füh t A führt Auffächerung ffä h zu Ab Abnahme h der Quermagnetisierung 125 Spin-Echo Experiment mit gepulstem Feldgradienten y! y'! Keine Veränderung, da rotierendes Koordinatiensystem y'! 126 Spin-Echo Experiment mit gepulstem Feldgradienten Int. Int Diffusion in isotropischer / anisotropischer Phase von g Flüssigkristallen Oligoparabenzamid Flüssigkristalle G di Gradient 127 Selective Population Inversion (SPI) z.B. AX-Zweispinsystem (13CHCl3) A-Übergänge im 1H beobachtbar, X Übergänge im 13C X-Übergänge Normal Dublett J(CH) = 209 Hz 15x Vergrössert Nach 180° A2 Puls Nach N h 180° A1 Puls 128 INEPT Experiment 1H Richtungsänderung g g 13C 129 INEPT Experiment Besetzungszahlen nach 1H 90°y' Puls Vergleich mit SPI ohne Einstrahlung A2 Einstrahlung A1 Einstrahlung identisch 130 INEPT Experiment 1H MHCα MHCβ CHCl3 MHCα MHCβ MHCα MHCβ MH MHCβ MHCα MHCα MHCβ MHCβ MHCα 13C Cα MHCβ 131 INEPT Experiment N Normal l INEPT CH CH2 CH3 Verstärkte Signale mit positiver und negativer p g Amplitude Ideal: Mittlere Linie wird 0 die anderen um Faktor 2γ(1H)/γ(13C) verstärkt Ideal: Vier Signale um γ(1H)/γ( ) γ(13C)) Faktor 3γ( verstärkt Quartäre C geben kein Signal 132 INEPT Experiment INEPT Mit CH Kopplungen 1H-BB-Entkoppelt pp C2 C3 CH3COO 133 Refokussiertes INEPT Experiment τ τ CH: Δ= 1/(4J(CH)) CH2 CH2: Δ= 1/(8J(CH)) CH2: Δ~ 1/(8J(CH)) Immer Kompromiss erforderlich f d li h 134 INEPT Experiment Refokusiertes INEPT mit 1H-BB-Entkopplung Refokusiertes INEPT INEPT Mit CH Kopplungen 1H-BB-Entkoppelt C2 C3 CH3COO 135 DEPT Experiment Subspektrum Subspektrum p Subspektrum BB entkoppeltes 13C 136 DEPT Experiment 90°x' 180°x' Θy' 1H BB 90°xx' 180°xx' 13C 137 DEPT Experiment 138 DEPT Experiment DEPT 135 139 Selektives TOCSY Experiment 140 INADEQUATE Experiment 141
