Anwendung der Hochdurchsatz

September 2014, Band 16, Nr. 8
Anwendung der Hochdurchsatz-Sequenzierung bei fortgeschrittenem Krebs
P. Hutter, S, Myit, J. P. Rey, S. Arcioni, C. Girardet, Zentralinstitut (ZIWS), Spital Wallis, Sitten
Dank der Entdeckung von Genmutationen, die bei den an der
Tumorproliferation und der Metastasierung beteiligten zellulären
Signalwegen eine Rolle spielen, konnten neue Ansatzpunkte für eine
Therapie erarbeitet werden, insbesondere für solide Tumoren. Die gezielten
Therapien umfassen im Wesentlichen Tyrosinkinasehemmer oder
monoklonale Antikörper gegen Rezeptoren von Wachstumsfaktoren. Diese
neuen Therapien betreffen nur fortgeschrittene Tumoren, bei denen im
Allgemeinen eine Operation nicht angezeigt ist, und ihr therapeutisches
Ansprechen hängt vom genetischen Profil des Tumors ab. Somit erfolgt die
Stratifizierung von Patienten mit einem fortgeschrittenen Tumor und die
Prüfung des Infragekommmens für eine gezielte Therapie nach
Sequenzierung der Tumor-DNA.
In den letzten 40 Jahren erfolgte die Analyse mittels Sequenzierung von
Mutationen nach der Sanger-Technik. In den letzten Jahren wurde die
Durchführung mit der Einführung der Hochdurchsatz-Sequenzierung
(englisch NGS für Next Generation Sequencing oder MPS für Massive
Parallel Sequencing) revolutioniert [1]. Zu den zahlreichen Vorteilen der NGS
gehören eine grössere Sensitivität und die Praktizierbarkeit mit Biopsien oder
sogar mit zytologischen Präparaten. Ausserdem ist eine Analyse von
mehreren Genen gleichzeitig in mehreren Tumorproben möglich. Auch wenn
die Methode derzeit für die Analyse auf Punktmutationen oder kurze
Deletionen verwendet wird, kann sie zahlreiche andere
Chromosomenveränderungen nachweisen (Translokation, Amplifikation,
usw.). Allerdings wird mit dieser Technik eine Vielzahl von Informationen
generiert, die nur mittels Bioinformatik generiert wird. Daher wurden von
Bioinformatikern spezialisierte Softwareprogramme entwickelt, um die Daten
zu sortieren und die relevanten Mutationen im Tumor zu wählen.
Die wichtigsten anvisierten Tumore
1)
2)
3)
Für das nicht kleinzellige Lungenkarzinom im fortgeschrittenen Stadium
empfehlen die Onkologiegesellschaften die Beurteilung der EGFR- und
ALK-Gene. Tumore mit Mutationen, die den EGFR aktivieren, oder mit
einer Translokation des ALK-Gens sind empfänglicher für eine
Behandlung mit Tyrosinkinasehemmern (Erlotinib, Gefitinib für den
EGFR, und Crizotinib für ALK) [2] [3].
Für Adenokarzinome des Kolons mit Metastasen ist die Analyse der
KRAS-, BRAF- und NRAS-Gene anerkannt. Im Unterschied zu
Lungenkarzinomen ist das Vorhandensein der so genannten „DriverMutation“ in einem dieser Gene eine Kontraindikation für eine AntiEGFR-Therapie (z.B. Cetuximab), weil der Tumor resistent ist. Nur
Tumore ohne Mutationen sprechen auf eine Anti-EGFR-Therapie in
Kombination mit Chemotherapie an [4].
Für metastasierende Melanome kann die Mutation des BRAF-Gens eine
Indikation für eine Behandlung mit Vemurafenib sein [5].
Ablauf der Analyse
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Auswahl des Paraffinblocks, der den Tumor enthält, mit dem
Pathologen.
Sektion des Tumorgewebes und Extraktion der DNA. (Abb. 1)
Abb. 2: Chip und Sequenzierungsapparat und Etappen-Zusammenfassung
Verfügbare Panels
Panel 1: NRAS-, KRAS- und BRAF-Gen: Analyse der gesamten Sequenz,
die für das KRAS- und NRAS- Gen kodiert sind (Exone 2 bis 5). Für das
BRAF-Gen wird nur das Exon 15 analysiert. Bei diesen Genen finden sich im
Wesentlichen Punktmutationen, die sich meist gegenseitig ausschliessen.
Panel 2: EGFR-Gen: Die am häufigsten beobachteten Mutationen sind
Deletionen im Exon 19 und punktuelle Mutationen in den Exonen 18, 20 und
21.
Panel 3: KIT- und PDGFRA-Gen: Punktuelle Mutationen des KIT-Gens
(Exone 9, 11, 13 bis 17) für gastrointestinale Stromatumoren (GIST) und
Melanome. Punktuelle Mutationen des PDGFRA-Gens (Exone 8, 10, 12, 14
und 18) für GIST. Dieser Test wird im ersten Halbjahr 2015 verfügbar sein.
Diese Analysen werden im Rahmen einer Zusammenarbeit zwischen der
Abteilung für Pathologie und der Abteilung für medizinische Genetik des
ZIWS durchgeführt, die die Akkreditierungsnorm ISO15189 erfüllen. Die
bioinformatische Datenanalyse übernimmt die Firma Sophia Genetics
(EPFL), die die Normen ISO 13485:2003 und EN ISO 13485:2012 erfüllt.
Schlussfolgerung
Heutzutage wird für die onkologische Behandlung von fortgeschrittenen oder
metastasierten Tumoren neben der histologischen Diagnostik der
Mutationsstatus benötigt, der als prädiktiver Faktor für neue gezielte
Therapien anerkannt ist. Die NGS ist ein nicht mehr wegzudenkendes
Werkzeug für den therapeutischen Ansatz geworden. Auch wenn sie derzeit
auf fortgeschrittenen Tumoren beschränkt ist, wird sich ihr Einsatzbereich in
der Onkologie sicher in Zukunft erweitern.
Literatur Nr. 8
Abb. 1: Histologischer Schnitt eines Kolonkarzinoms
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Erstellen einer DNA-Bibliothek durch Anreicherung der zu
analysierenden Ziele und Fixieren der erhaltenen für jeden Patienten
spezifischen Barcode-Fragmente.
Fixieren der Fragmente an Kügelchen, dann Amplifikation mittels
Emulsions-PCR.
Multiparallelisierte Sequenzierung auf der PGM-Plattform (Ion
Torrent™, Life Technologies). (Abb. 2)
Gesicherte und anonymisierte Übertragung der Rohdaten an die
Schweizer Bioinformatikfirma Sophia Genetics SA (EPFL).
Bioinformatische Analyse, die die Auswahl der relevanten Mutationen
erlaubt.
Erstellen des molekularpathologischen Berichts.
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
Frampton GM et al. Nat. Biotechnol. 2013 Nov; 31(11): 1023-31.
Mok TS et al. N. Engl. J. Med. 2009 Sep 3; 361(10):947-57.
Shaw AT et al. N. Engl. J. Med. 2013 Jun 20; 368(25):2385-94.
Douillard JY et al. N. Engl. J. Med. 2013 Nov 28;369(22):2159-60.
Chapman PB et al. N. Engl. J. Med. 2011 Jun 30; 364(26):2507-16.
Kontaktpersonen
Dr. Pierre Hutter
Dr. med. Samir Myit
Dr. Jean-Philippe Rey
Séverine Arcioni
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