Institut für Mikrobiologie und Molekularbiologie - OPUS
Werbung
Tth-IM60 eine Membraninsertase aus Thermus thermophilus Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) Fakultät Naturwissenschaften Universität Hohenheim Institut für Mikrobiologie vorgelegt von Susanne Hilke Meyer aus Leonberg 2011 Dekan: Prof. Dr. Heinz Breer 1. berichtende Person: Prof. Dr. Andreas Kuhn 2. berichtende Person: Prof. Dr. Anette Preiß Eingereicht am: 24.03.2011 Mündliche Prüfung am: 29.04.2011 Die vorliegende Arbeit wurde am 21.04.2011 von der Fakultät Naturwissenschaften der Universität Hohenheim als „Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften“ angenommen. © Verlag Dr. Hut, München 2011 Sternstr. 18, 80538 München Tel.: 08966060798 www.dr.hut-verlag.de Danksagung Mein allererster Dank gilt meinem Doktorvater Prof. Dr. Andreas Kuhn für die Unterstützung, den hilfreichen Ideen und Diskussionen während meiner Promotion. Frau Prof. Dr. Anette Preiß danke ich für freundliche Bereitschaft die Zweitkorrektur zu übernehmen. Mein besonderer Dank gilt Frau Dr. Dorothee Kiefer, ohne ihre Betreuung wäre diese Arbeit in dieser Weise nicht möglich gewesen. Vor allem danke ich ihr, dass sie immer ein offenes Ohr für mich hatte und sich bei Problemen viel Zeit nahm, sie mit mir zu lösen. Meinen Laborkollegen Ines Seitl, Marina Kossmann, Dr. Sven Kreutel und Sandra Grenz danke ich für eine tolle Zeit. Es hat nie ein besseres Labor gegeben. Außerdem möchte ich mich bei meinen Mädels, Ines Seitl, Julia Gottschalk und Katja Maier bedanken. Für die vielen konstruktiven Gespräche und Diskussionen, sowie das gemeinsame durchleben von allen Höhen und Tiefen. Vielen Dank an Stefan Ernst vom 3. Physikalischen Institut der Universität Stuttgart, für die sachkundige Hilfe bei den Einzelmolekülmessungen. In diesem Zuge auch ein Dank an Sophie Winterfeld und Anika Schönbauer für ihre Unterstützung und Bereitstellung der gelabelten Pf3 Mutanten. Großer Dank auch an Sabrina Polzin für die Bereitstellung von SecF und der Hilfe bei den Pulldown Assays, sowie Dr. Uwe Gerken für die Einführung in die Welt der CDSpektroskopie. Der Forschungsgruppe um Prof. Dr. Irmgard Sinning, insbesondere Dr. Domenico Lupo möchte ich für die Kooperation hinsichtlich der Kristallisation von Tth-IM60 und der Durchführung der Diffraktionstests danken. Danken möchte ich auch allen Mitarbeitern des Instituts für Mikrobiologie und Molekularbiologie der Universität Hohenheim für ihre Unterstützung, vor allem bei praktischen Aufgaben. Außerdem möchte ich mich bei Conny Protzer, Nora Imhof, Sabrina Kugler und Steffi Niedermaier für die Begleitung vom Anfang bis zum Ende bedanken. Und natürlich danke ich meinen Eltern sowohl für ihre psychologische Unterstützung als auch für die Zeit, die sie in das Korrekturlesen der Arbeit investiert haben. Ich danke meinem Mann Dennis, dass er als mein persönlicher Administrator alle auftretenden Computerprobleme lösen konnte. Aber vor allem danke ich ihm für seine Geduld, Motivation und den Glauben an mich. Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Danksagung .................................................................................................................... I Inhaltsverzeichnis........................................................................................................... I Abbildungsverzeichnis ................................................................................................ V Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................. VII Einheiten ....................................................................................................................... X Präfixe............................................................................................................................ X 1. Einleitung .................................................................................................................. 1 1.1 Die thermophilen Bakterien Thermus thermophilus und Aquifex aeolicus ............ 1 1.1.1 Thermus thermophilus ..................................................................................1 1.1.2 Aquifex aeolicus ............................................................................................2 1.2 Biologische Membranen ....................................................................................... 3 1.2.1 Membranaufbau thermophiler Bakterien .......................................................6 1.3 Proteintranslokation in Eu- und Prokaryonten mittels des SecTranslokasekomplexes ......................................................................................... 7 1.3.1 Proteintranslokation durch die Membran des Endoplasmatischen Retikulums ....................................................................................................8 1.3.2 Proteintranslokation in Escherichia coli .......................................................13 1.4 YidC – die Membraninsertase aus E. coli ........................................................... 18 1.4.1 Die YidC/Oxa1/Alb3-Familie .......................................................................21 1.4.2 YidC Homologe aus den thermophilen Bakterien T. thermophilus und A aeolicus ...................................................................................................22 1.5 Ziele der Arbeit.................................................................................................... 24 2. Material und Methoden .......................................................................................... 25 2.1 Materialien .......................................................................................................... 25 2.1.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien ....................................................25 2.1.2 Kits ..............................................................................................................26 2.1.3 Geräte .........................................................................................................26 2.1.4 Bakterienstämme ........................................................................................30 2.1.5 DNA ............................................................................................................31 2.1.6 DNA-Vektoren .............................................................................................31 2.1.7 Plasmide .....................................................................................................32 2.1.8 Primer .........................................................................................................32 2.1.9 Enzyme .......................................................................................................33 2.1.10 Antikörper ...................................................................................................34 2.1.11 Marker .........................................................................................................34 2.1.12 Kulturmedien ...............................................................................................35 2.2 Molekularbiologische Methoden.......................................................................... 36 2.2.1 PCR (polymerase chain reaction) ...............................................................36 2.2.2 Agarosegelelektrophorese ..........................................................................36 2.2.3 DNA-Isolierung............................................................................................37 2.2.4 DNA-Konzentrationsbestimmung ................................................................38 2.2.5 DNA-Klonierung ..........................................................................................38 2.2.6 DNA-Sequenzierung nach Sanger (Sanger et al., 1977) ............................43 2.2.7 Ortsspezifische Mutagenese in Plasmiden mittels QuikChange .................44 2.3 Proteinbiochemische Methoden .......................................................................... 45 I Inhaltsverzeichnis 2.3.1 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-Page) (Laemmli, 1970)..........45 2.3.2 Blue-Native Page (Schägger & von Jagow, 1991) ......................................46 2.3.3 Proteinfärbung in Gelen ..............................................................................47 2.3.4 Proteinnachweis..........................................................................................47 2.3.5 Proteinkonzentrationsbestimmung ..............................................................49 2.3.6 Proteinreinigung ..........................................................................................51 2.3.7 Gelfiltration ..................................................................................................55 2.3.8 Rekonstitution .............................................................................................57 2.4 Bindungs- und Funktionsstudien ......................................................................... 60 2.4.1 Pulldown-Assay mit SecF ...........................................................................60 2.4.2 Einzelmolekülspektroskopie mit NC-Pf3 .....................................................61 2.4.3 Komplementation ........................................................................................63 2.5 Zirkulardichroismus (CD) .................................................................................... 64 2.5.1 Sekundärstrukturbestimmung .....................................................................64 2.5.2 Schmelztemperaturbestimmung .................................................................65 3. Ergebnisse .............................................................................................................. 67 3.1 Sequenzvergleiche zwischen YidC, TRAM, Tth-IM60 und Aq-YidC ................... 67 3.2 Optimierung der heterologen Expression in E. coli ............................................. 69 3.2.1 Heterologe Expression von TRAM in C 43 Zellen durch die Coexpression der in E. coli seltenen tRNAs ...............................................69 3.2.2 Heterologe Expression von Tth-IM60 in C 43 Zellen...................................72 3.3 Reinigung der Proteine TRAM, Tth-IM60 und Aq-YidC ....................................... 75 3.3.1 Reinigung von TRAM ..................................................................................75 3.3.2 Reinigung von Aq-YidC ...............................................................................78 3.3.3 Reinigung von Tth-IM60 ..............................................................................81 3.4 In vivo Funktionsanalyse von TRAM und Tth-IM60............................................. 90 3.5 Rekonstitution von TRAM und Tth-IM60 in Liposomen ....................................... 92 3.5.1 Rekonstitution von MBP-TRAM in Liposomen mittels Bio-Beads ...............93 3.5.2 Rekonstitution von Tth-IM60 in Liposomen mittels Extruder .......................94 3.6 Strukturanalyse der YidC Homologe Tth-IM60 und Aq-YidC .............................. 96 3.6.1 Bestimmung der Sekundärstrukturen mittels Zirkulardichroismus (CD) ............................................................................................................96 3.6.2 Bestimmung der Schmelztemperaturen von Tth-IM60 und Aq-YidC...........98 3.7 Interaktion von Tth-IM60 mit Translokasekomponenten ..................................... 99 3.7.1 Bindung von Tth-IM60 an SecF ..................................................................99 3.7.2 Bindung von Tth-IM60 an das ribosomale L2 Protein ...............................102 3.8 Translokation von Pf3 coat in rekonstituierten Systemen ................................. 103 3.9 Kristallisation von Tth-IM60 ............................................................................... 108 4. Diskussion ............................................................................................................ 109 4.1 Das TRAM Protein ............................................................................................ 109 4.1.1 Heterologe Expression von TRAM als Fusionsprotein ..............................109 4.1.2 Reinigung von MBP-TRAM über zwei verschiedene Affinitätsmatrizen: Amylose und Ni-Sepharose .........................................111 4.1.3 Einbau von MBP-TRAM in Liposomen mittels Bio-Beads .........................112 4.1.4 TRAM kann die Funktion von YidC nicht in vivo ersetzen .........................115 4.2 Tth-IM60 ist ein YidC Homolog aus T. thermophilus ......................................... 116 4.2.1 Heterologe Expression und Reinigung von Tth-IM60 als Dimer................117 4.2.2 Bindet Tth-IM60 an das Ribosom?............................................................122 4.2.3 Tth-IM60 besitzt sowohl in vivo als auch in vitro die gleichen Funktionen wie YidC .................................................................................123 II Inhaltsverzeichnis 4.2.4 4.2.5 Strukturvergleich der Proteine YidC, Aq-YidC und Tth-IM60 mittels CD.............................................................................................................127 Kristallisation von Tth-IM60 .......................................................................130 5. Zusammenfassung............................................................................................... 133 6. Summary ............................................................................................................... 135 7. Literaturverzeichnis ............................................................................................. 137 8. Anhang .................................................................................................................. 153 8.1 DNA und Aminosäure Sequenzen .................................................................... 153 8.1.1 Tram 1 X.l. mit His-tag ..............................................................................153 8.1.2 Tth-IM60 mit His-tag .................................................................................154 8.2 Daten der CD-Spektroskopie ............................................................................ 155 8.2.1 CD-Spektrum von Tth-IM60, Aq-YidC und YidC .......................................155 8.2.2 Strukturanalyse mittels DichroWeb ...........................................................157 8.2.3 Schmelzkurven von Aq-YidC, Tth-IM60 und YidC ....................................157 8.3 Einteilung der Aminosäuren nach ClustalX ....................................................... 159 8.4 PMF-Analyse .................................................................................................... 159 Eidesstattliche Erklärung .......................................................................................... 162 Lebenslauf.................................................................................................................. 163 III IV Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abbildung 1.1: Flüssig-Mosaik-Modell (Engelman, 2005) ................................................ 4 Abbildung 1.2: Temperaturauswirkungen auf Lipiddoppelschichten (nach Hazel, 1995)..................................................................................................... 5 Abbildung 1.3: Struktur des SecYE-Komplex aus Methanococcus jannaschii (Rapoport, 2007) ................................................................................... 8 Abbildung 1.4: Schematische Darstellung der Signalsequenz ......................................... 9 Abbildung 1.5: Model des kotranslationalen Transports in Eukaryonten (Rapoport, 2007) ................................................................................. 11 Abbildung 1.6: Model des posttranslationalen Transports in Eukaryonten (Rapoport, 2007) ................................................................................. 12 Abbildung 1.7: Schematischer Überblick der Sec-abhängigen und unabhängigen Translokation in Bakterien (Facey & Kuhn, 2010) ............................... 13 Abbildung 1.8: schematische Darstellung von YidC ...................................................... 19 Abbildung 1.9: Hydrophobizitätsanalyse nach Kyte & Doolittle (Kyte & Doolittle, 1982)................................................................................................... 23 Abbildung 2.1: Gelfiltration von Standardproteinen ....................................................... 57 Abbildung 2.2: schematische Darstellung der Rekonstitution von Tth-IM60 in Liposomen .......................................................................................... 59 Abbildung 2.3: schematischer Aufbau der Einzelmolekülspektroskopie-Messung ........ 61 Abbildung 2.4: Schematische Darstellung von Bindung und Einbau von Pf3 in Proteoliposomen ................................................................................. 63 Abbildung 3.1: Sequenzvergleich zwischen YidC und TRAM ........................................ 68 Abbildung 3.2: Sequenzvergleich zwischen den YidC Proteinen aus E. coli, A. aeolicus (Aq-YidC) und T. thermophilus (Tth-IM60) ............................ 69 Abbildung 3.3: Optimierung der Expressionsbedingungen von TRAM .......................... 71 Abbildung 3.4: Optimierung der Expressionsbedingungen von Tth-IM60 ...................... 74 Abbildung 3.5: Flussdiagramm der Reinigung von TRAM als Fusionsprotein mit MBP .................................................................................................... 76 Abbildung 3.6: Reinigung von TRAM über Ni-Sepharose .............................................. 77 Abbildung 3.7: Reinigung von TRAM über Amylose ...................................................... 78 Abbildung 3.8: Flussdiagramm der Reinigung von Aq-YidC .......................................... 79 Abbildung 3.9: Reinigung von Aq-YidC.......................................................................... 80 Abbildung 3.10: Vergleich der Reinigung von Tth-IM60 mit DDM und ASB14 ............... 82 Abbildung 3.11: Homogenität und Größenbestimmung mit Blue-Native Page und Gelfiltration .......................................................................................... 84 Abbildung 3.12: Detergenzscreen.................................................................................. 86 Abbildung 3.13: Flussdiagramm der Reinigung von Tth-IM60 ....................................... 87 Abbildung 3.14: Reinigung von Tth-IM60 in LDAO ........................................................ 89 Abbildung 3.15: Stabilität von Tth-IM60 bei verschiedenen pH-Werten ......................... 90 Abbildung 3.16: Komplementation von YidC durch TRAM und Tth-IM60 ...................... 92 Abbildung 3.17: Rekonstitution von TRAM in Liposomen .............................................. 93 Abbildung 3.18: Proteaseverdau der MBP-TRAM Proteoliposomen ............................. 94 Abbildung 3.19: Rekonstitution von Tth-IM60 in Liposomen .......................................... 96 Abbildung 3.20: Zirkulardichroismus Spektrum von YidC, Tth-IM60 und Aq-YidC ........ 97 Abbildung 3.21: Schmelzkurven von Aq-YidC, Tth-IM60 und YidC ............................... 99 Abbildung 3.22: Interaktion von SecF100 mit Tth-IM60 ................................................. 101 Abbildung 3.23: Sequenzvergleich SecF aus E. coli und SecDF aus T. thermophilus ..................................................................................... 102 Abbildung 3.24: Bindung von Pf3 an Proteoliposomen ................................................ 105 V Abbildungsverzeichnis Abbildung 3.25: Einbau von Pf3 in Proteoliposomen ................................................... 107 Abbildung 3.26: Kristallisation und Diffraktion von Tth-IM60........................................ 108 Abbildung 4.1: Sequenzvergleich zwischen TMD1 und TMD2 von YidC und TRAM................................................................................................ 114 Abbildung 4.2: Entwicklung der Aufklärung von 3D Strukturen bei Membranproteinen ............................................................................ 130 VI Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis anti A Adenin A. aeolicus Aquifex aeolicus Abb. Abbildung AB-Mix Acrylamid-Bisacrylamid Mix ADP Adenosin-Dphosphat Amp Ampicillin APS Ammoniumpersulfat Aq-YidC YidC Homolog in Aquifex aeolicus Ara Arabinose AS Aminosäuren ASB-14 Amidosulfobetain 14 ATP Adenosin-Triphosphat BCA Bicinchoninsäure BiP immunoglobulin heavy chain binding protein BN Blue Native bp Basenpaare BSA Rinderserumalbumin C Cytosin C12E8 Dodecyloctaoxyethylene CaCl2 Calciumchlorid CAP Chloramphenicol CD Zirkulardichroismus C-His-tag Carboxy-terminales His-tag CMC kritische Micellenkonzentration CO2 Kohlenstoffdioxid C-terminal Carboxy-terminal CuSO4 Kupfersulfat DDM Dodecylmaltosid DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyriblonukleinsäure dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat DOPC 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine VII Abkürzungsverzeichnis DTT Dithiothreitol DYT double yeast tryptone E. coli Escherichia coli EACA 6-Aminocapronsäure ECL Enhanced Chemiluminescence EDTA Ethylendiamintetraacetat ER Endoplasmatisches Retikulum Ffh fifty-four homolog FPLC fast protein liquid chromatography G Guanin Glc Glucose GTP Guanosintriphosphat HCl Chlorwasserstoffsäure His-tag Histidintag HRP Meerrettichperoxidase Hsp Hitzeschockprotein IM Innenmembran IM60 Innenmembranprotein 60 kDa IMAC immobilisierte Metall Affinitätschromatographie IPTG Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid KAc KaliumAcetat KCl Kaliumchlorid KOH Kaliumhydroxid KPP Kaliumphosphat Puffer LB Luria-Bertani broth LDAO Lauryl Dimethylaminoxid MBP Maltosebindeprotein MCS Multipleklonierungsstelle MgCl2 Magnesiumchlorid MnCl2 Manganchlorid MOPS 3-(N-Morpholino)-Propansulfonsäure NaCl Natriumchlorid NaOAc Natriumacetat NaOH Natriumhydroxid VIII Abkürzungsverzeichnis NaPP Natriumphosphat Puffer NBD Nukleotid Binderegion NMR Kernspinresonanzspektroskopie NTA Nitrilotriacetat OD optische Dichte OG N-Octyl--Glucopyranosid ORF offenes Leseraster PBS Phosphate-buffered saline PCR Polymerasekettenreaktion PEG Polyethylenglycol PMF Peptid-Massen-Fingerprint-Analyse RbCl Rubidiumchlorid rbs Ribosomenbindestelle RNC ribosom-nascent chain RNA Ribonukleinsäure RT Raumtemperatur SDS Natriumdodecylsulfat SEC Größenausschlusschromatographien SRP signal recognition particle/ Signalerkennungspartikel T Thymin TAT Twin-Arginin-Translokation TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer TBS Tris-buffered saline TCA Trichloressigsäure Temed N,N,N‟,N‟-Tetramethylethylendiamin Tet Tetracyclin TMD Transmembrandomäne TRAM translocating chain-associated membrane protein Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan6 TSS transformation and storage solution Tth Thermus thermophilus Tth-IM60 YidC Homolog in Thermus thermophilus UZ Ultrazentrifuge X-Gal 5- Bromo4-Chlor-indoxyl-ß-D-galactosid IX Einheiten Einheiten A Ampere °C Celsius Da Dalton g Gramm h Stunde l Liter m Meter M Molar min Minute mol Mol Pa Pascal psi pound per square inch (Pfund pro Quadratzoll) s Sekunde V Volt xg Gewichtskraft/ relative Zentrifugalkraft Präfixe c Zenti k Kilo M Mega m Milli µ Mikro n Nano p Piko X 1. Einleitung 1. Einleitung 1.1 Die thermophilen Bakterien Thermus thermophilus und Aquifex aeolicus 1.1.1 Thermus thermophilus T. thermophilus ist ein Gram-negatives Bakterium, das aus einer heißen Quelle in Japan isoliert und 1971 noch unter dem Namen Flavobacterium thermophilum beschrieben wurde (Oshima & Imahori, 1971). Die unbeweglichen, stäbchenförmigen Bakterien leben strikt aerob, bilden keine Sporen aus und besitzen unlösliche gelbliche Pigmente, ähnlich derer von T. aquaticus. Das Bakterium ist obligat thermophil mit einer optimalen Wachstumstemperatur zwischen 65 und 72 °C, wobei das Minimum bei 47 °C und das Maximum bei 85 °C liegen (Oshima & Imahori, 1974). Thermus spp ist eine weitverbreitete Gattung mit zur Zeit 15 Arten, die sowohl in natürlichen heißen Quellen als auch in industriellen Heizsystemen überall in der Welt vorkommen (Brock & Freeze, 1969) (Cava et al., 2009). Durch 16S rRNA Untersuchungen und Vergleiche konservierter Proteine wurde bewiesen, dass Thermus eng mit der Gattung Deinococcus verwandt ist und zusammen eine unabhängige Abteilung im Reich der Bakterien bilden, obwohl sie sehr unterschiedliche Phänotypen ausweisen (Weisburg et al., 1989). Deinococcus ist, im Gegensatz zu Thermus, sehr resistent gegen UV- und Röntgenstrahlung, Austrocknung und oxidativem Stress. Inzwischen wurden die Genome der Stämme Deinococcus radiodurans und T. thermophilus HB27 bzw. HB8 sequenziert; dadurch ergaben sich neue Einblicke in die phylogenetische Entwicklung dieser beiden Arten (Henne et al., 2004; Omelchenko et al., 2005; White et al., 1999). Es wird davon ausgegangen, dass sich die Gattungen aus einem mesophilen Vorfahren durch horizontalen Gentransfer und Genverlusten so unterschiedlich entwickelt haben (Omelchenko et al., 2005). Der horizontale Gentransfer wird sowohl durch die natürliche Kompetenz von T. thermophilus als auch durch Konjugation ermöglicht. Die Analyse der natürlichen Kompetenz von Bakterien hat ergeben, dass der Prozess von zweiwertigen Kationen und dem pH Wert abhängig ist und mindestens 16 Gene daran beteiligt sind (Friedrich et al., 2001; Friedrich et al., 2002; Hidaka et al., 1994). Das System ist energieabhängig, aber höchst effizient mit einer DNA-Binde- und Aufnahmerate von 40 kb/s pro 1 1. Einleitung Zelle, außerdem sind die Bakterien in der Lage sowohl Bakterien-DNA als auch DNA von Archaeen und Eukaryonten aufzunehmen (Schwarzenlander & Averhoff, 2006). Aufgrund der hohen Wachstumsrate, der einfachen Wachstumsbedingungen und der natürlichen Kompetenz ist T. thermophilus zu einem extremophilen Modellorganismus geworden. Dabei wurden viele genetische Werkzeuge und Methoden für dessen genetische Manipulation entwickelt. Vor allem für biokatalytische Prozesse werden häufig Enzyme und Proteine aus der Gattung Thermus verwendet. Diese sind nicht nur hitzestabiler sondern auch resistenter gegen chemische Substanzen als die homologen Proteine aus mesophilen Bakterien (Lasa & Berenguer, 1993). T. thermophilus wird dabei vermehrt für die Expression verwendet (Pantazaki et al., 2002). Ein weiterer Aspekt der Forschung an T. thermophilus ist das seit Ende der 90er Jahre gesteigerte Interesse an den Strukturen von Proteinen, die sogenannte „Structural genomics“. Das Ziel dieser Forschung ist die Lücke zwischen Sequenz und Struktur zu schließen, in dem die 3D Struktur von repräsentativen Proteinen von allen bekannten Proteinfamilien bestimmt wird (Jenney & Adams, 2008). Proteine von thermophilen Organismen sind die idealen Ziele für diese Forschung, da sie deutlich stabiler sind als die mesophiler Bakterien (Sadeghi et al., 2006). Deshalb sind sie oft leichter zu reinigen und bleiben auch während der Zeit der Kristallisation stabil. 1.1.2 Aquifex aeolicus A aeolicus, isoliert von R. Huber und K.O. Stetter, ist ein Gram-negatives, stäbchenförmiges hyperthermophiles Eubakterium und bildet zusammen mit A. pyrophilus die Gattung Aquifex. Beide Stämme wurden bislang nur aus marinen hydrothermalen Systemen isoliert und besitzen ein Temperaturoptimum von 85 °C, wobei das Maximum bei 95 °C und das Minimum bei 67 °C liegen (Garrity et al., 2001; Huber et al., 1992). Die sehr beweglichen Zellen sind 2 - 6 µm lang, 0,5 µm breit, bilden keine Sporen aus und besitzen eine polytrich-monopolare Begeißelung (Garrity et al., 2001). Außerdem sind die Zellen in der Lage bei einem Salzgehalt von 1 - 5 % (opt.: 3 %) und einem pH-Wert von pH 5,4 – 7,5 (opt.: pH 6,8) zu wachsen (Huber et al., 1992). A. aeolicus ist strikt chemolithoautotroph und bindet CO2 über den reduktiven Citratzyklus. Wasserstoff (H2), Schwefel (S0) und Thiosulfat (S2O32-) dienen als Elektronendonoren und O2 als Elektronenakzeptor. Die Zellen sind mikroaerophil und wachsen bei einer Sauerstoffkonzentration von unter 7,5 p.p.m. Obwohl ein Gen für 2 1. Einleitung eine vermeintliche Nitratreduktase im Genom vorliegt, konnte bislang, im Gegensatz zu A. pyrophilus, keine Nitratatmung nachgewiesen werden (Deckert et al., 1998). Die Kultivierung der Zellen erfolgt in einem Medium, das nur anorganische Komponenten enthält und zwar in einer H2/CO2/O2 Atmosphäre. Auf organischen Substanzen, wie Zuckern, Aminosäuren, Hefeextrakt oder Fleischextrakt können die Zellen nicht wachsen. Der G+C-Gehalt der rRNA liegt bei 65 %, dieser relativ hohe Wert ist charakteristisch für thermophile Bakterien (Weisburg et al., 1989). Basierend auf den Ergebnissen von 16S rRNA Untersuchungen gehört die Gattung Aquifex, bestehend aus den Stämmen A. pyrophilus und A. aeolicus, zu dem Phylum Aquificae und zur phylogenetisch ältesten Familie der Eubacteria, den Aquificaceae. Zu dieser Familie zählen auch die Gattungen Calerobacterium, Hydrogenobacter und Thermocrinis (Huber et al., 1998; Kawasumi et al., 1984; Kryukov et al., 1983). Das gesamte Genom von A. aeolicus hat eine Größe von 1 551 335 bp und wurde 1998 von Deckert und Kollegen vollständig sequenziert, dabei wurde auch der G+C Gehalt der DNA auf 43,4 % bestimmt. Die Größe entspricht ungefähr einem Drittel des Genoms von Escherichia coli (~ 4,64 Mbp) und es konnten 1 512 offene Leseraster (ORFs) identifiziert werden (E. coli: ~ 4 300). Die relativ geringe Größe des Genoms ist auf die dicht gepackten Gene zurückzuführen, die meisten werden dabei in polycistronischen Operons exprimiert und überlappen sogar leicht. Auffällig ist jedoch, dass viele Gene, die eigentlich funktionell zusammengehören, wie die Proteine der Tryptophan-Biosynthese, nicht wie in anderen Organismen in Operons gruppiert sind, sondern über das gesamte Genom von A. aeolicus verteilt sind. Sogar Untereinheiten desselben Enzyms sind oft im Genom verteilt (Deckert et al., 1998). 1.2 Biologische Membranen Biologische Membranen gehören zu den lebenswichtigsten Zellstrukturen und sind die Grenzschichten einer Zelle zu Kompartimenten und nach außen zur Umgebung. Als semipermeable Membranen sind sie hochselektive Barrieren, durch die nur wenige apolare Moleküle diffundieren können. Über verschiedene Transportsysteme werden gezielt Ionen, Nährstoffe und Proteine durch die Membranen geschleust. Biomembranen bestehen aus einer Lipiddoppelschicht, die aus Phospholipiden, Glycolipiden und Cholesterol aufgebaut ist, und in die verschiedene Proteine eingelagert sind. Dieser Aufbau der Biomembranen ist in allen Bereichen des Lebens 3 1. Einleitung sehr ähnlich, ob es sich um die Cytoplasmamembran der Bakterien oder um die Membranen der Zellkompartimente, wie dem Endoplasmatische Retikulum (ER), innerhalb einer Zelle handelt. Die Phospholipide, die aus einem Fettsäureanteil und einem Glycerinanteil aufgebaut sind und über eine Esterbindung verknüpft sind, aggregieren aufgrund des amphiphilen Charakters in wässrigen Lösungen. Sie bilden spontan Lipiddoppelschichten aus, indem sich die hydrophoben Fettsäuren nach innen und die hydrophilen Glycerinanteile nach außen richten. Dadurch ist die Permeabilität für polare Moleküle sehr gering und gelöste Substanzen wie Ionen, Aminosäuren, Zucker oder Proteine werden an der Diffusion gehindert und können nur gezielt über Poren und Transporter durch die Membran geschleust werden. Eine der wichtigsten Funktionen ist dabei der Aufbau der protonenmotorischen Kraft, die für die ATPSynthese durch die membranständige ATP-Synthase benötigt wird (von Ballmoos et al., 2009). Singer und Nicolson entwickelten 1972 das Flüssig-Mosaik-Modell und postulierten, dass es sich bei Membranen nicht um eine starre Lipiddoppelschicht handelt, sondern dass sich die Lipidschichten gegeneinander bewegen, wodurch sich die Proteine wie in einer Flüssigkeit bewegen können (Singer & Nicolson, 1972) (Abbildung 1.1). Abbildung 1.1: Flüssig-Mosaik-Modell (Engelman, 2005) Flüssig-Mosaik-Modell von Singer und Nicolson verändert nach Engelman. Schematische 3-dimensionale Lipiddoppelschicht mit integrierten Proteinen. Die Struktur einer Membran wird hauptsächlich über hydrophobe Wechselwirkungen, aber auch durch Wasserstoffbrücken stabilisiert, zusätzlich stabilisieren Sterine in Eukaryonten bzw. Hopanoide in Bakterien die Membranen. Die Fettsäuren in Membranen besitzen meist zwischen 16 und 20 C-Atome, wobei eine gerade Anzahl typisch ist. Die Fettsäuren können dabei in gesättigter oder ungesättigter Form vorliegen, wobei die Länge und der Grad an ungesättigten Fettsäuren einen Einfluss auf 4 1. Einleitung die Fluidität der Membran hat. Ungesättigte Fettsäuren führen zu einem „Knick“, wodurch Lipide nicht mehr so dicht gepackt werden können. Dies führt zu einer Erhöhung der Fluidität und damit zu einer Verringerung der Schmelztemperatur. Die Fluidität ist für die Funktion der Membranen von hoher Bedeutung, nur so können Proteine innerhalb der Membran diffundieren. Der optimale Zustand für die Zelle ist die flüssige oder auch „liquid-crystalline“ Phase. Bei niedrigen Temperaturen verfestigt sich die Lipiddoppelschicht zur Gelphase, während hohe Temperaturen zu Membranfusionen bzw. zu einer „inverted hexagonal“ Phase führen (s. Abbildung 1.2). Die Eigenschaft von Bakterien die Fluidität der Lipidschicht durch die Zusammensetzung der Lipide zu regulieren wird homeoviscose Adaptation genannt (Hazel, 1995). So konnte bei E. coli gezeigt werden, dass mit einer Erhöhung der Wachstumstemperatur auch der Anteil von gesättigten und längeren Fettsäuren in den Phospholipiden zunimmt und damit eine homeoviscose Adaptation stattfindet (Sinensky, 1974). Abbildung 1.2: Temperaturauswirkungen auf Lipiddoppelschichten (nach Hazel, 1995) Die Grafik zeigt die Veränderung der Lipidstruktur bei einer Erhöhung bzw. einer Erniedrigung der Temperatur. 5 1. Einleitung 1.2.1 Membranaufbau thermophiler Bakterien Der Aufbau der Membranen von thermophilen Bakterien ähnelt vom Prinzip her dem anderer Bakterien. Es wird allgemein davon ausgegangen, dass sie eine wichtige Rolle bei der Temperaturstabilität spielt (Brock, 1978). Daher ist es nicht überraschend, dass es Unterschiede in der Zusammensetzung der Lipide und der Fettsäuren, sowie der Bindung zwischen den Fettsäuren und dem Glycerin gibt. Bei dem hyperthermophilen Bakterium Aquifex besteht die Membran hauptsächlich aus Glycerin-Ether Phospholipiden mit langen Fettsäuren (C18:0, n-C(20:1) und cy-C(21)) (Jahnke et al., 2001). Die Ether-Bindung zwischen dem Glycerin und den Seitenketten findet man auch bei den Archaeen, wobei hier die Seitenketten nicht aus Fettsäuren sondern aus sich wiederholenden Isoprenen bestehen. Durch eine kovalente Bindung zwischen den Phytanylseitenketten kann eine einlagige Lipidschicht entstehen, die eine hohe Stabilität erreicht. In T. thermophilus, obwohl auch ein thermophiles Bakterium, konnten bislang keine Ether-Bindungen in Lipiden nachgewiesen werden. Typisch für Thermus sind zwei Lipide: ein stamm-spezifisches Glycolipid in der Außenmembran (Tetrasaccharid gebunden an ein Glycerin oder ein langkettiges Diol) und ein konserviertes Glycophospholipid bestehend aus einem N-Acylglucosamin und einem Nglyceroyl-heptadecaneamine (Leone et al., 2006). Wahrscheinlich ist das langkettige Diol in Glycolipiden eine Adaptation an die Umgebung, die auf der größeren chemischen Stärke der Alkylkette im Vergleich zur schwächeren Ester-Bindung des Acylglycerin beruht. 6 1. Einleitung 1.3 Proteintranslokation in Eu- und Prokaryonten mittels des SecTranslokasekomplexes Ein wichtiger Schritt in der Biosynthese vieler Proteine ist die Translokation durch bzw. in die Membran des eukaryontischen Endoplasmatische Retikulums (ER) und der prokaryontischen Cytoplasmamembran. Die meisten Proteine werden über den Hauptsekretionsweg transloziert, der aus einem konservierten heterotrimeren Proteinkomplex besteht und in Eukaryonten Sec61-, in Prokaryonten und Archaeen SecY-Komplex genannt wird. Der Komplex bildet den Translokationskanal aus, durch den die Proteine an ihren jeweiligen Bestimmungsort transportiert werden und ist damit in allen Organismen die Schlüsselkomponente für die Translokationsmaschinerie (Hartmann et al., 1994). Insbesondere die Untereinheiten (Y) und (E) zeigen eine signifikante konservierte Sequenz und sind essentiell für die Funktion des Kanals sowie für das Überleben der Zellen (Brundage et al., 1990). Im Gegensatz dazu sind die Untereinheiten nicht essentiell. Sie sind zwar in Eukaryonten und Archaeen ähnlich, zeigen aber keine Homologie zu Bakterien. Die Arbeitsgruppe um T. Rapoport veröffentlichte 2004 die erste Kristallstruktur eines SecY-Komplex aus Methanococcus jannaschii, bestehend aus den Untereinheiten Y,E und (Berg et al., 2004). Sie zeigten, dass der Kanal lediglich aus einem Heterotrimer besteht, wobei die Y-Untereinheit die eigentliche Translokationspore bildet (s. Abbildung 1.3). Die Y-Untereinheit besteht aus zwei gebunden Hälften, den Transmembrandomänen (TMD) 1 - 5 und 6 - 10. Der Loop an der Hinterseite zwischen der TMD 5 und 6 dient vermutlich als Scharnier und ermöglicht es der Pore, sich als sogenanntes laterales Tor nach vorne in die Lipiddoppelschicht zu öffnen. Die beiden Hälften von SecY werden dabei durch SecE an der Hinterseite zusammen gehalten. Die Pore besitzt eine Sanduhr ähnliche Form. Die trichterförmigen Öffnungen in Richtung Cytound Periplasma verengen sich in der Mitte zu einem Ring, der aus 6 hydrophoben Aminosäuren geformt ist und der wahrscheinlich an der Erkennung von Signalsequenzen beteiligt ist (s. Abbildung 1.3 b). Nach außen ist die Pore durch eine kurze Helix verschlossen (Plug). Durch Konformationsänderungen kommt es vermutlich zu einer Verlagerung der Helix, wodurch der Kanal geöffnet wird. Die -Untereinheit bindet nur im äußeren Bereich an die Y-Untereinheit, das könnte erklären, warum diese für die Funktion des Komplexes überflüssig ist. 7 1. Einleitung Abbildung 1.3: Struktur des SecYE-Komplex aus Methanococcus jannaschii (Rapoport, 2007) a: Sicht aus dem Cytoplasma auf den SecYE Komplex aus M. jannaschii. SecY bildet den Translokationskanal und besteht aus zwei Hälften mit den Transmembrandomänen 1-5 (rot) und 6-10 (blau). In grau sind die Untereinheiten und (SecE) und in grün die Aminosäurereste des Porenrings (Pore ring) dargestellt. Der Kanal kann sich lateral (lila Pfeil) zur Lipiddoppelschicht öffnen. Im geschlossenen Zustand befindet sich der sogenannte Plug (gelb) in der Mitte von SecY. Durch die Bewegung nach hinten (schwarzer Pfeil) öffnet sich der Kanal durch die Membran. b: Querschnitt des Translokationskanals von der Seite (Rapoport, 2007). Der Translokationskanal erscheint als eine passive Pore; daher müssen andere Komponenten die Energie für die Translokation bereitstellen. Der Transport im ER und in der Cytoplasmamembran sowie die daran beteiligten Proteine werden im Folgenden näher beschrieben. 1.3.1 Proteintranslokation durch die Membran des Endoplasmatischen Retikulums Die Proteintranslokation in das ER ist der erste Schritt in der Biogenese der meisten extrazelluären und vieler löslicher Proteine in den Organellen (ER, Golgi-Apparat, Endosom und Lysosom) und gehört deshalb zu den wichtigsten Funktionen in einer Zelle (Palade, 1975). Sekretorische Proteine besitzen im Allgemeinen eine spezifische, spaltbare N-terminale Signalsequenz, die aus 15 bis 30 Aminosäuren besteht (s. Abbildung 1.4). Sie setzt sich zusammen aus einem zentralen hydrophoben Bereich (h-Domäne) bestehend aus 7-15 Aminosäuren (AS), der von einer positiv geladenen N-terminalen Region (n-Domäne) und einer polaren, aber ungeladenen C-terminalen Region (c-Domäne) flankiert wird (von Heijne, 1984). Im Gegensatz zu sekretorischen Proteinen dient bei Membranproteinen oft die 1. N-terminale Transmembrandomäne 8 1. Einleitung (TMD) als Signalsequenz. Diese wird in den meisten Fällen nicht abgespalten und wird auch als Signalankersequenz bezeichnet. Die Orientierung der Membranproteine wird durch die flankierenden Aminosäuren der TMD bestimmt. Sie richtet sich dabei nach der sogenannten „positive inside“ Regel, wonach sich positiv geladene Aminosäuren im Cytoplasma befinden (Andersson & von Heijne, 1994). Die Translokation erfolgt nach der Erkennung der Signalsequenz entweder kotranslational oder posttranslational. Abbildung 1.4: Schematische Darstellung der Signalsequenz a) kotranslationale Translokation Bei der kotranslationalen Translokation wird das Protein während der Translation durch bzw. in die Membran transportiert. In einem ersten Schritt erkennt das Signalerkennungspartikel (SRP) das naszierende Polypeptid, sobald die Signalsequenz am Ausgang des Ribosoms erscheint und bindet daran. Durch die Interaktion zwischen SRP und dem Ribosom wird die Proteinsynthese verlangsamt und es kommt zu einem sogenannten „elongation arrest“. Der gesamte Komplex aus SRP, naszierender Kette und Ribosom bindet erst über SRP und dessen membranständigen Rezeptor (SRPRezeptor) und anschließend über eine Interaktion zwischen Ribosom und dem Translokationskanal an die ER-Membran. In einer Guanosintriphosphat (GTP)abhängigen Reaktion wird die Signalsequenz vom SRP gelöst und bindet an den Sec61-Komplex. Daraufhin wird die Elongation fortgesetzt und das Polypeptid wird vom Tunnelausgang des Ribosoms in den Translokationskanal geschoben (Walter & Blobel, 1981a; Walter & Blobel, 1981b; Walter et al., 1981) (schematische Darstellung s. Abbildung 1.5). Die Translokationspore, die durch eine helikale Domäne (engl. plug) fest verschlossen ist, öffnet sich vermutlich in zwei Stufen. Durch die Bindung des Ribosoms an die Translokationspore wird diese Domäne aus der Mitte der Translokationspore verlagert. Im zweiten Schritt werden durch die Bindung der Signalsequenz an die Translokationspore die TMD 2b und 7 von SecY getrennt, wodurch die Destabilisierung weiter gefördert wird und der helikale „plug“ in eine Lücke nach hinten ins Molekül verlagert wird (Rapoport, 2007). Die Translokation wird durch 9 1. Einleitung die Elongation des Polypeptids am Ribosom und damit durch GTP Hydrolyse angetrieben. Sekretorische Proteine inserieren als Loop in die Translokationspore (Shaw et al., 1988). Der Aminoterminus (N-Terminus) der Signalsequenz interagiert mit der Translokationspore und durch die weitere Translation wird das Polypeptid durch die Pore geschoben. Sobald der Carboxyterminus (C-Terminus) der Signalsequenz im ERLumen erscheint wird die Spaltstelle durch den Signalpeptidase Komplex erkannt und gespalten (Dalbey & Von Heijne, 1992; Evans et al., 1986). Eine wichtige Rolle bei der Translokation besitzt außerdem das Hauptchaperon BiP (immunoglobulin heavy chain binding protein). Es gehört zur Familie der Hsp70Proteine (heat shock protein) und bindet vorübergehend im ER-Lumen an neusynthetisierte Polypeptidketten, so dass diese in einem faltungskompetenten Zustand bleiben (Nakatsukasa & Brodsky, 2007; Panzner et al., 1995). Vermutlich stellt BiP als ATPase auch die Energie für die Translokation des C-Terminus zur Verfügung, da nach Ende der Translation noch ca. 70 AS durch das Ribosom bzw. die Translokationspore transportiert werden müssen. Bei der Translokation von Membranproteinen bewegen sich die TMDs von der wässrigen Translokationspore durch das laterale Tor in die Lipiddoppelschicht. Wahrscheinlich öffnet und schließt sich das laterale Tor während einer Translokation ständig, so dass Polypeptidketten in der Pore mit der hydrophoben Lipidschicht in Kontakt kommen. Daher können Segmente mit einer gewissen hydrophoben Länge den Kanal durch dieses laterale Tor verlassen, da die Wechselwirkungen zu den Lipiden höher als zu der hydrophilen Pore sind. Dies wurde als „lipid-partitioning“ Modell beschrieben (Heinrich et al., 2000). 10 1. Einleitung Abbildung 1.5: Model des kotranslationalen Transports in Eukaryonten (Rapoport, 2007) Schema des kotranslationalen Transports in Eukaryonten. Die Signalsequenz erscheint am Ausgang des Ribosoms und wird von SRP erkannt. Der Komplex aus Ribosom, naszierender Kette und SRP bindet über den SRP-Rezeptor an die Cytoplasmamembran und interagiert dann mit dem Sec61-Komplex. Die naszierende Kette wird durch die weitergehende Elongation durch die Translokationspore geschoben, wobei die Signalsequenz an der Pore bindet und von der Signalpeptidase gespalten wird. Als weitere Proteinkomponente, die am kotranslationalen Transport beteiligt ist, konnte mittels Crosslinking- und Rekonstitutionsuntersuchungen das Translocating chainassociated membrane Protein (TRAM) identifiziert werden, das sich während der Translokation in unmittelbarer Nähe der Signalsequenzen befindet (Görlich et al., 1992; High et al., 1993). Das mehrspännige Membranprotein TRAM ist sowohl an der Translokation von sekretorischen Proteinen als auch an der Insertion von Membranproteinen beteiligt (Do et al., 1996; Görlich & Rapoport, 1993; Saksena et al., 2004; Sauri et al., 2007). Dabei determiniert die Signalsequenz eines Proteins dessen Abhängigkeit von TRAM. Proteine, deren Signalsequenz eine lange N-terminale Region und einen langen hydrophoben Kern besitzen, zeigen eine TRAM-Abhängigkeit (Voigt et al., 1996). Auch konnten Sauri und Kollegen zeigen, dass die Transmembrandomänen von viralen Proteinen erst mit Sec61 und dann mit TRAM interagieren (Sauri et al., 2007). Das TRAM Protein selber wird kotranslational in die ER-Membran eingebaut, wobei die 1. TMD als nicht spaltbarer Signalanker von SRP erkannt wird. Insgesamt besitzt das TRAM Protein acht TMDs, so dass beide Termini im Cytoplasma lokalisiert sind (Tamborero et al., 2011). b) posttranslationale Translokation Der posttranslationale Transport, schematisch dargestellt in Abbildung 1.6, findet nach der kompletten Synthese des Proteins statt. Dieser Weg wird meist von löslichen, 11 1. Einleitung sekretorischen Proteinen verwendet, die eine schwächere hydrophobe Signalsequenz besitzen und damit nicht vom SRP erkannt werden (Ng et al., 1996). Die komplett synthetisierten Proteine werden mit Hilfe von cytosolischen Chaperonen, die zur Hsp70 und Hsp40 Familie gehören, in einem löslichen und translokationskompetenten Zustand gehalten und an den Sec61-Komplex transportiert (Chirico et al., 1988; Deshaies et al., 1988). An der posttranslationalen Translokation sind außer dem Sec61-Komplex zusätzlich der tetramere Sec62/63–Komplex, sowie das luminale Chaperon BiP beteiligt (Deshaies et al., 1991; Panzner et al., 1995). Nach der Bindung der Signalsequenz des Proteins an die Translokationspore werden alle cytosolischen Chaperone frei gesetzt (Plath & Rapoport, 2000). Durch die Brownsche Molekularbewegung diffundiert das Polypeptid weiter in den Kanal. Die Translokation wird, wenn sich das Polypeptid im Kanal befindet, mittels des sogenannten „Rätsche“-Mechanismus (engl. ratchet) durch die Membran transportiert. Dabei binden mehrere BiP Moleküle an das Polypeptid, wodurch ein Zurückgleiten der Polypeptidkette verhindert wird und die Translokation in Richtung ER-Lumen verläuft (Matlack et al., 1999). Die Bindung von BiP ist dabei ATPabhängig. ATP-gebundenes BiP mit einer offenen Peptidbindetasche interagiert mit der J-Domäne von Sec63, wodurch es zur Hydrolyse von ATP kommt und sich die Bindetasche um das Polypeptid schließt (Matlack et al., 1997). Dieser Vorgang wiederholt sich, bis sich die gesamte Polypeptidkette im ER-Lumen befindet. Im Anschluss öffnet sich die Bindetasche von BiP durch den Austausch von ADP zu ATP und das Protein wird freigesetzt. Abbildung 1.6: Model des posttranslationalen Transports in Eukaryonten (Rapoport, 2007) Schema des posttranslationalen Transports in Eukaryonten. Das zu transportierende Protein wird vollständig im Cytoplasma synthetisiert und durch cytosolische Chaperone in einem translokationskompetenten Zustand gehalten. Die Signalsequenz wird vom Sec-Komplex, bestehend aus Sec61 und Sec62/63, erkannt und inseriert in die Translokationspore. Das luminale Chaperon BiP wird durch die DnaJ Domäne des Sec63 zur Bindung von Peptiden aktiviert und bindet an die Polypeptidkette, wodurch ein Zurückgleiten verhindert wird. Durch das stetige Binden neuer BiP-Moleküle wird das Protein in das ER-Lumen transportiert. 12 1. Einleitung 1.3.2 Proteintranslokation in Escherichia coli Auch in der Cytoplasmamembran von Prokaryonten werden die meisten Proteine mittels des Sec-Systems, dem Haupttransportweg transloziert (Sec-abhängige Translokation). Der Sec-Komplex ist sowohl für die Sekretion von Proteinen, als auch für die Insertion der meisten integralen Membranproteine verantwortlich. Die Translokation ähnelt dabei stark dem kotranslationalen Transport im ER (s. 1.3.1). Wurde bis Mitte der neunziger Jahre noch angenommen, dass Sec-unabhängige Proteine spontan oder aufgrund des Membranpotenzials translozieren (von Heijne, 1994), konnte von Samuelson und Kollegen mit YidC ein Membranprotein identifiziert werden, das Sec-unabhängig integrale Membranproteine inseriert (Samuelson et al., 2000). Ende der neunziger Jahre wurde als weiteres Transport-System, das Tat-System (twin-arginine translocation) entdeckt, das im Gegensatz zum Sec-System in der Lage ist, gefaltete Proteine durch die Membran zu transportieren. Dieser Transportweg wird hier nicht näher beschrieben; als Übersicht und als Vergleich zum Sec-Transportweg wird auf den Übersichtsartikel von (Natale et al., 2008) hingewiesen. Einen schematischen Überblick der Translokation in E. coli zeigt Abbildung 1.7 Abbildung 1.7: Schematischer Überblick der Sec-abhängigen und unabhängigen Translokation in Bakterien (Facey & Kuhn, 2010) Proteine, deren Lokalisation sich in oder jenseits der Innenmembran befindet, werden hauptsächlich über den Sec-Komplex transportiert. Der Komplex besteht aus den Proteinen SecYEG, die die Translokationspore bilden und der ATPase SecA. Neu synthetisierte Proteine werden entweder posttranslational über das tetramere SecB Chaperon zum Sec-Komplex transportiert oder durch den Signalerkennungspartikel (SRP) erkannt und dann über den Rezeptor FtsY zum Sec-Komplex an die Membran geleitet (Kotranslationale Translokation). Die Signalpeptidase (SPase) spaltet die Signalsequenz von Preproteinen an der Außenseite der Innenmembran ab. Einige wenige Innenmembranproteine werden Sec-unabhängig über YidC in die Membran inseriert. Zur besseren Übersicht wurde der Sec-Komplex ohne die dazugehörigen Proteine SecDFYajC und YidC dargestellt, pmf: proton motive force. 13 1. Einleitung 1.3.2.1 Sec-abhängige Translokation: In E. coli kann das Targeting beim Sec-abhängigen Transport von Proteinen wie im ER post- oder kotranslational ablaufen. Sekretorische Proteine, die als Präproteine mit einer N-terminalen Signalsequenz synthetisiert werden, werden meist posttranslational über das Chaperon SecB an die Cytoplasmamembran geleitet (Kumamoto, 1989). Die Signalsequenz ist wie in Eukaryonten in die drei Domänen n, h und c aufgebaut (s. Abbildung 1.4). Cytoplasmatischen Membranproteinen fehlt meist eine spaltbare Signalsequenz, stattdessen dient die erste TMD als internes Signal für das Targeting und die Insertion. Diese Membranproteine werden kotranslational über den SRP-Weg an die Membran geleitet (Review: (Herskovits et al., 2000)). Beide Wege treffen an der inneren Membran und zwar an der Sec-Translocase zusammen, die für den Proteintransport in das Periplasma und in die Cytoplasmamembran essentiell ist (Valent et al., 1998). Der Transport wird in drei Abschnitte unterteilt: Targeting, Translokation und Prozessierung. 1. Targeting: a) SecB abhängiges Targeting Polypeptidketten, die am Ausgang des Ribosoms erscheinen, sind verschiedenen molekularen Chaperonen wie z.B. dem Trigger Faktor (TF), DnaK oder SecB ausgesetzt. Diese unterstützen die Faltung und/oder das Targeting und vermeiden somit eine Aggregation und Missfaltung von Polypeptidketten (Nilsson & Anderson, 1991). Das homotetramere SecB Chaperon ist am Export von sekretorischen Proteinen beteiligt und besitzt dabei zwei spezifische Funktionen. Zum einen verhindert es die Aggregation durch eine anti-Faltungsaktivität zum anderen interagiert es mit SecA und besitzt daher eine Targetingfunktion (Bechtluft et al., 2010). SecB bindet bevorzugt an nicht gefaltete Strukturen der maturen Region eines Präproteins. Die Signalsequenz der sekretorischen Proteine verlangsamt vermutlich die Faltung der Proteine und unterstützt so die Erkennung zwischen SecB und Peptidsequenzen, die normalerweise in inneren Regionen eines Sequenzvergleiche gefalteten konnte Proteins ein vorkommen SecB (Liu Konsensusmotiv et mit al., eine 1989). Länge Durch von 9 Aminosäuren (AS) identifiziert werden, das mit aromatischen und basischen AS angereichert ist. Da dieses Motiv auch in SecB-unabhängigen Proteinen vorhanden ist, ist die Selektivität für das Substrat bislang nicht geklärt (Knoblauch et al., 1999). Der 14 1. Einleitung SecB-Präproteinkomplex interagiert dann mit SecA, wobei SecB an die carboxylterminale Region von SecA und die Signalsequenz des Präproteins mit SecA interagiert (Fekkes et al., 1998). SecA ist als ATPase eine zentrale Komponente der Translocase, das sowohl membrangebunden als auch im Cytoplasma vermutlich als Dimer vorliegt (Cabelli et al., 1991; Papanikolau et al., 2007). SecB dissoziiert nach der Präproteinbindung an SecA-ATP und somit zu Beginn der eigentlichen Translokation. b) SRP vermitteltes Targeting Der SRP-Weg in E. coli ist vergleichbar mit dem kotranslationalen Transport im ER (s. Kapitel 1.3.1). In E. coli wird die Mehrheit der integralen Membranproteine und einige sekretorische Proteine über den SRP-Weg transportiert. Ob SRP eine Signalsequenz erkennt liegt an der Hydrophobizität der h-Region. So können sekretorische Proteine durch Erhöhung der Hydrophobizität der Signalsequenz in den SRP-Weg umgeleitet werden (Lee & Bernstein, 2001; Valent et al., 1995). Das SRP in Bakterien besteht aus nur einem Protein, dem 48 kDa großen Ffh und der 4,5 S RNA. Das Ffh 48 steht für „fifty-four-homologue“ und ist also homolog zum SRP54 Protein aus Eukaryonten (Luirink et al., 1992). Der membranständige SRP-Rezeptor FtsY (filamentous temperature sensitive Y) besteht aus einem zur -Untereinheit des eukaryontischen SRP Rezeptors homologen Protein. FtsY interagiert über zwei Lipid-Bindestellen, die vermutlich eine -helikale Struktur besitzen, mit den Phospholipiden der Membran und zusätzlich über die konservierte NG-Domäne an SecY (Angelini et al., 2005; Braig et al., 2009). SRP bindet an die hydrophobe (meist nicht-prozessierbare) Signalsequenz von naszierender Polypeptiden. Der gesamte Komplex aus Ribosom, naszierender Kette (ribosome-nascent chain, RNC) und SRP bindet über SRP und FtsY an die Membran. Durch die Hydrolyse von zwei GTPs wird die naszierende Kette vom SRP gelöst und der RNC-Komplex wird auf das Translokon übertragen (Shan et al., 2007). 2. Translokation: Die bakterielle Translokase besteht aus dem SecYEG-Komplex und den zusätzlichen Komponenten SecA, SecDFYajC und YidC. Der SecYEG-Komplex bildet dabei die eigentliche Translokationspore und SecA dient als ATP-abhängiges Motorprotein. SecA ist die einzige ATPase, die an der Translokation von Präproteinen beteiligt ist und interagiert über SecY mit der Translokationspore. SecA transportiert die Signalsequenz 15 1. Einleitung und einen Teil der frühen maturen Region des Polypeptids in die Translokationspore mit Hilfe eines zwei-Helix Fingers, wobei das Polypeptid als Schlaufe inseriert wird (Facey & Kuhn, 2010). Durch Zyklen von Bindung und Hydrolyse von ATP an SecA wird die Translokation von Proteinen durch die Membran schrittweise angetrieben. (Economou & Wickner, 1994; Tomkiewicz et al., 2006). Biochemische und strukturelle Untersuchungen zeigen, dass der SecYEG-Komplex vermutlich als Dimer oder sogar als Tetramer vorliegt (Bessonneau et al., 2002; Tziatzios et al., 2004). Die Komponenten SecD, SecF und YajC bilden einen weiteren heterotrimeren Komplex, der mit der eigentlich Translokationspore assoziiert ist. SecD und SecF sind jeweils sechs-spännige Membranproteine, wohingegen YajC nur eine TMD besitzt. Der gesamte Komplex scheint den Prozess der Insertion und Deinsertion von SecA zu regulieren und den Export von Protein zu verbessern (Economou et al., 1995; Pogliano & Beckwith, 1994). Als weitere Komponente, die bei der Insertion von Membranproteinen beteiligt ist, wurde das YidC Protein beschrieben (s. Kapitel 1.4). 3. Prozessierung: Bei der Prozessierung wird die Signalsequenz des Präproteins spezifisch abgespalten. Die dafür verantwortliche Leaderpetidase LepB, ist ein zweispänniges Membranprotein mit einer großen C-terminalen Domäne, die eine katalytische Region besitzt. Die Leaderpetidase erkennt die Signalsequenz nach der Insertion und interagiert mit dieser (Dalbey, 1991). Nach der Abspaltung der Signalsequenz werden die Proteine entweder ins Periplasma oder in die Cytoplasmamembran entlassen. 1.3.2.2 Sec-unabhängige Translokation: Sekretorische Proteine, die bereits im Cytoplasma vollständig gefaltet sind, werden über das Twin-Arginin-Translokations-System (TAT-System) sekretiert. Meist handelt es sich dabei um cofaktorhaltige Enzyme. Den Substraten ist dabei eine N-terminale Signalsequenz mit einem Konsensus-Motiv aus zwei Arginin-Resten gemein (Berks et al., 2000). In E. coli ist die Tat-Translokase aus den drei strukturell und funktionell unterschiedlichen Membranproteinen TatA, TatB und TatC aufgebaut. TatC ist an der Erkennung der Substrate beteiligt, während TatA vermutlich die Translokationspore bildet (Müller, 2005). Auch für einige Membranproteine konnte eine Sec-unabhängige Insertion nachgewiesen werden. Dies ist der Fall bei den endogenen Proteinen MscL und F oc 16 1. Einleitung und den Phagenhüllproteine Pf3 coat und M13 Procoat. Für diese Proteine konnte gezeigt werden, dass sie abhängig von YidC in die Cytoplasmamembran eingebaut werden (Chen et al., 2002; Facey et al., 2007; Samuelson et al., 2000; van der Laan et al., 2004). Da die Struktur von YidC bislang noch nicht aufgeklärt wurde, ist über den genauen molekularen Mechanismus wenig bekannt. In Kapitel 1.4 wird die genaue Funktion und der Aufbau von YidC näher beschrieben. Wie in diesem Kapitel ausführlich beschrieben sind viele Komponenten der Translokationssysteme stark konserviert und weisen zahlreiche Homologien auf. Als Übersicht sind in Tabelle 1.1 nochmals die wichtigsten Komponenten des Proteintransports sortiert nach Targeting, Translokation und Modifizierung aufgelistet. Homologe Proteine befinden sich in der gleichen Reihe. Tabelle 1.1: Vergleich der wichtigsten Komponenten des Proteintransports in Säugern und Bakterien Homologe Proteine sind in einer Reihe vermerkt. Funktion Komponente Säuger Bakterien E. coli Targeting SRP 7S-RNA SRP9, 14, 19 SRP54 SRP68,72 SR SR 4,5S-RNA SRP-Rezeptor Translokation SecB Hitzeschockproteine Sec61-Komplex Ffh 48 FtsY SecB Hsp40, 70 Sec61 Sec61 Sec61 Sec62/63-Komplex TRAM SecDFYajC-Komplex SecY SecE SecG Sec62 (HTP1, TLOC1 Sec63 (ERj2) TRAMp YidC/Oxa1/Alb3Familie TRAP-Komplex Motor ATPase Oxa1 Signalpeptidase SPC12, SPC18, 21 SPC22/23, 25 SecD SecF YajC YidC TRAP,,, BiP SecA Modifizierung 17 LepB 1. Einleitung 1.4 YidC – die Membraninsertase aus E. coli Das Membranprotein YidC aus E. coli besteht aus 548 Aminosäuren (AS) und besitzt ein Molekulargewicht von 61 kDa. Es ist in der Innenmembran lokalisiert und besteht aus 6 TMD mit 4 cytoplasmatischen und 3 periplasmatischen (P1-3) Bereichen, wobei beide Termini im Cytoplasma lokalisiert sind (Abbildung 1.8) (Saaf et al., 1998). Die 5 C-terminalen Transmembrandomänen sind für die Funktion von YidC essentiell und bei allen Homologen sowohl in Bakterien als auch in Mitochondrien und Chloroplasten stark konserviert und charakterisieren die YidC/Oxa1/Alb3-Familie (Yen et al., 2001). Typisch für Gram-negative Bakterien ist die 1. große periplasmatische Domäne (P1) zwischen TMD 1 und 2. Durch Komplementationsstudien wurde gezeigt, dass der größte Teil der P1 Domäne nicht notwenig für die Aktivität von YidC ist, obwohl diese aus insgesamt 319 AS besteht und damit über 58 % des gesamten Proteins ausmacht (Jiang et al., 2003). Dies erklärt auch, dass einige YidC-Homologe aus Mitochondrien, Chloroplasten und Gram-positiven Bakterien die Funktion von YidC in E. coli ersetzen können, obwohl diesen die 1. TMD und der größte Teil der große P1 Domäne fehlen (Jiang et al., 2002; van Bloois et al., 2005; van Bloois et al., 2007). Weitere Untersuchungen der P1 Domäne haben gezeigt, dass der C-terminale Bereich der P1 Domäne (Aminosäure 324 – 342) für die Insertase-Funktion von YidC von Bedeutung ist (Xie et al., 2006). Die Struktur der P1 Domäne von YidC wurde 2008 von Ravaud et al. aufgeklärt (Abbildung 1.8) und besteht aus einem -Supersandwich und einer -helikalen Linkerregion am CTerminus. Das -Supersandwich wird häufig bei Proteinen gefunden, die Kohlehydrate binden. Im Widerspruch zu einer Bindung von Kohlehydraten bei YidC stehen die elektrostatischen Eigenschaften und molekularen Details der Bindetasche. Wahrscheinlicher ist eine Interaktion mit Peptiden oder Acylketten als natürliche Liganden (Ravaud et al., 2008a). 18 1. Einleitung Abbildung 1.8: schematische Darstellung von YidC Schematische Darstellung der Topologie von YidC in der Innenmembran. 1 – 6: Transmembrandomänen, P1 – P3: periplasmatische Bereiche, C2 – C3: cytoplasmatische Bereiche, N + C: N- bzw. C-terminales Ende. P1 als Kristallstruktur (Ravaud et al., 2008a) Die Funktion von YidC wurde im Jahr 2000 entschlüsselt. Es konnte sowohl eine Bindung mit naszierenden Membranproteinen über Photocrosslinking nachgewiesen werden als auch eine Bindung von YidC mit der Sec-Translocase durch Koreingungsexperimente (Scotti et al., 2000). Außerdem wurde gezeigt, dass YidC entscheidend für die Insertion des Sec-unabhängigen M13 procoat Proteins ist (Samuelson et al., 2000). YidC besitzt demnach sowohl für Sec-abhängige als auch für Sec-unabhängige Proteine eine wichtige Funktion (s. Abbildung 1.7). Bei der Sec-abhängigen Funktion ist YidC über den SecDFYajC-Komplex an die Translokationspore SecYEG gebunden (Nouwen & Driessen, 2002). Es konnte gezeigt werden, dass YidC an der Insertion von verschiedenen Membranproteinen, z.B. der ATP-Synthase Untereinheit a (Foa), der Untereinheit II des Cytochrom-bo3-OxidaseKomplexes (CyoA) oder der Untereinheit K der NADH-Ubichinon-Oxidoreduktase (NuoK) beteiligt ist (du Plessis et al., 2006; Price & Driessen, 2008; Price & Driessen, 2010; Yi et al., 2003). Außerdem wird davon ausgegangen, dass YidC die Funktion eines Chaperon besitzt und die Assemblierung und Faltung von Membranproteinen unterstützt. Photocrosslinking Studien zeigten die Interaktion der TMD des naszierenden FtsQ-Proteins zuerst mit der SecYEG Translokationspore und dann mit Fortschreiten der Elongation mit YidC und der Lipid-Doppelschicht. (Urbanus et al., 19 1. Einleitung 2001). Diese Daten weisen dabei auf die entscheidende Beteiligung von YidC beim lateralen Transfer Lipiddoppelschicht der hin. TMD Es ist von der daher SecYEG sehr Translokationspore wahrscheinlich, dass in die YidC die Transmembrandomänen, nachdem diese die Translokationspore SecYEG verlassen haben, stabilisiert. Auch zeigen Ergebnisse mit dem polytopischen Membranprotein Mannitolpermease (MtlA), dass YidC in der unmittelbaren Nähe zu SecYE als Assemblierungsstelle funktioniert und die Anordnung von Helixbündeln vermitteln könnte (Beck et al., 2001). Untersuchungen mit der Lactosepermease LacY haben gezeigt, dass YidC für dieses Protein erst bei der Faltung, aber nicht bei der Insertion eine wichtige Rolle spielt (Nagamori et al., 2004). Neuere Crosslinking Untersuchungen mit CyoA haben ergeben, dass YidC aber auch vor SecYEG wirken kann. So konnte gezeigt werden, dass die Translokation des N-terminale Bereichs von CyoA YidC benötigt, während die große C-terminale Domäne Sec-abhängig ist (Celebi et al., 2006; van Bloois et al., 2006). YidC vermittelt auch die Insertion von Sec-unabhängigen Membranproteinen. Sowohl die Phagenhüllproteine M13 procoat und Pf3 coat, aber auch die endogenen Proteine MscL (mechanosensitive channel of large conductance) und F0c (Untereinheit c der F1F0 ATP-Synthase) werden YidC-abhängig in die Cytoplasmamembran inseriert (Chen et al., 2002; Facey et al., 2007; Samuelson et al., 2000; van der Laan et al., 2004). Während die Proteine M13 procoat und Pf3 coat einzig YidC für die Insertion benötigen, werden MscL und vermutlich auch F0c mittels SRP an die Membran geleitet (Facey et al., 2007; van Bloois et al., 2004). Diesen bislang gefundenen Substraten ist eine relativ geringe Größe (maximal 2 TMD) und eine kurze hydrophobe periplasmatische Domäne gemein. Sowohl bei der Sec-abhängigen als auch bei der Sec-unabhängigen Funktion von YidC erfolgt die Bindung der naszierenden Membranproteine an die TMD 3 von YidC (Yu et al., 2008). Das Pf3 coat Protein kann außerdem mit der TMD 1 von YidC interagieren (Klenner et al., 2008). YidC selbst wird SRP-abhängig an die Membran transportiert und dort über SecYEG und YidC in die Membran inseriert. Außerdem wurde eine Interaktion mit SecA nachgewiesen, die wahrscheinlich für die Translokation der großen P1 Domäne verantwortlich ist (Koch et al., 2002; Urbanus et al., 2002). Über die genaue funktionelle Struktur von YidC in der Membran ist bislang nicht sehr viel bekannt. Erste Strukturen, die mit Cryo-Elektronen-Mikroskopie erhalten wurden, 20 1. Einleitung weisen darauf hin, dass YidC als Dimer in der Membran vorliegt (Kohler et al., 2009; Lotz et al., 2008). 1.4.1 Die YidC/Oxa1/Alb3-Familie Die YidC/Oxa1/Alb3 Proteine stellen eine konservierte Proteinfamilie dar, die essentiell bei der Insertion von Membranproteinen in Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten sind (Dalbey & Kuhn, 2004; Zhang et al., 2009). Diese, auch als IM60-Proteine bezeichnete Familie, wurde erst in den letzten Jahren näher beschrieben und widerlegte für einige Proteine (Pf3 coat, M13 Procoat) den bis dahin postulierten spontanen Proteintransport von Sec-unabhängigen Substraten (von Heijne, 1994). Die Proteine der YidC-Familie sind alle polytopische Membranproteine, wobei die Anzahl der Transmembranen zwischen 5 und 6 schwankt. Dies führt dazu, dass die Lokalisation ihrer N-Termini unterschiedlich ist. Generell besitzen alle Proteine vier hoch konservierte Transmembranen (TMD 2-5 von YidC), die auch die Familie charakterisieren (Yen et al., 2001). Die Sec-unabhängige Funktion von YidC ist evolutionär konserviert und scheint die für die Zelle essentielle Funktion zu sein. Darauf weisen in vivo Protease-Assays, in vitro Crosslinking- und Faltungs-Assays hin. Diese zeigen, dass Oxa1 in der Lage ist Zellwachstum von YidC-depletierten E. coli-Zellen wiederherzustellen, aber nur die Sec-unabhängige Funktion komplementiert (van Bloois et al., 2005). Daher wird davon ausgegangen, dass diese Funktion von YidC für die Zellen essentiell ist. Die Funktionen von YidC wurden bereits in Kapitel 1.4 ausführlich beschrieben. Deshalb wird hier nur noch auf die beiden anderen Proteine aus eukaryontischen Systemen eingegangen. Oxa1 aus Saccharomyces cerevisiae ist ein 36 kDa großes 5-spänniges Membranprotein und wurde als ein für die Assemblierung des Oxidasekomplexes essentielles Protein erstmals beschrieben (Bonnefoy et al., 1994). Es ist in der inneren mitochondrialen Membran lokalisiert und besitzt eine lange, stark positiv geladene C-terminale Domäne, die in der mitochondrialen Matrix lokalisiert ist (Herrmann et al., 1997). Es konnte gezeigt werde, dass diese C-terminale Domäne mit dem ribosomalen Protein mrp20 interagiert, was auf eine kotranslationale Funktion von Oxa1 hinweisen könnte (Jia et al., 2003). Oxa1 ist sowohl an der Insertion von kern-codierten Proteinen wie ATPase-su9, CoxII und Oxa1 als auch von mitochondrialen Proteinen wie Cox1p und Cox3p beteiligt (Bonnefoy et al., 1994; Hell et al., 1997; Hell et al., 2001). 21 1. Einleitung Alb3 ist in der Thylakoidmembran von Chloroplasten lokalisiert und ist wie Oxa1 ein 5-spänniges Membranprotein mit einer Größe von 40 kDa (Sundberg et al., 1997). Alb3 ist für das korrekte Assembly von Membranproteinen, insbesondere dem Lightharvesting-Komplex (LHCP) in den Thylakoiden wichtig (Bellafiore et al., 2002). Chloroplasten, denen das alb3-Gen fehlt generieren weiße Blätter, da keine Antennenkomplexe und somit keine Photosynthesepigmente in der Membran assemblieren können. Von dieser Mutation leitet sich auch der Name (Alb = Albino) ab. Obwohl inzwischen einige Funktionen und auch Substrate einzelner Proteine aus der YidC/Oxa1/Alb3 Familie untersucht wurden, ist über die Struktur oder den genauen molekularen Mechanismus der Funktionen sehr wenig bekannt. Lediglich die periplasmatische P1 Domäne von YidC, die jedoch nur in Gram-negativen Bakterien vorhanden ist, konnte genauer beschrieben werden (s. 1.4). Durch die Aufklärung von Strukturen können wertvolle Hinweise auf die Funktion eines Proteins und damit z.B. auf die Interaktionen mit verschiedenen Bindungspartnern, erhalten werden. Daher steht die Struktur in besonderem Fokus. Proteine aus thermophilen Organismen sind von besonderem Interesse, da diese oft stabiler als Proteine aus mesophilen Organismen sind und deshalb in den letzten Jahren bevorzugt für Strukturanalysen eingesetzt wurden. 1.4.2 YidC Homologe aus den thermophilen Bakterien T. thermophilus und A aeolicus Da die YidC/Oxa1/Alb3 Familie hoch konserviert ist, konnten auch in thermophilen Organismen homologe Proteine identifiziert werden. Dazu gehören die Proteine aus T. thermophilus und A. aeolicus. Das wahrscheinliche YidC-Homolog aus T. thermophilus besteht aus 430 AS und besitzt eine Größe von ca. 48 kDa und wird im Folgenden Tth-IM60 genannt. Das YidCHomolog aus A. aeolicus besteht dagegen aus 502 AS und besitzt eine Größe von ca. 58 kDa. Beide Proteine sind damit deutlich kleiner als YidC mit ca. 61 kDa. Beide Proteine wurden aufgrund von Homologien der YidC/Oxa1/Alb3 Familie zugeordnet. Eine Hydrophobizitätsanalyse nach Kyte & Doolittle zeigt, dass beide Proteine eine ähnliche Struktur aufweisen wie YidC (s. Abbildung 1.9). Tth-IM60 und Aq-YidC 22 1. Einleitung besitzen damit wahrscheinlich ebenfalls sechs TMDs mit einer großen periplasmatischen P1 Domäne. A C B 1 2 3 4 5 A: Tth-IM60 B: Aq-YidC C: YidC 6 1–6: TMD 1-6 von YidC Abbildung 1.9: Hydrophobizitätsanalyse nach Kyte & Doolittle (Kyte & Doolittle, 1982) Analyse der Hydrophobizität von Tth-IM60, Aq-YidC und YidC. Transmembrandomänen besitzen im Allgemeinen mehrere hydrophobe AS, so dass die Hydrophobizität steigt und in der Ansicht als positive Peaks identifiziert werden können. Das Aq-YidC Protein wurde von S. Grenz bereits in ihrer Diplomarbeit näher charakterisiert. Sie konnte Aq-YidC rekombinant in E. coli exprimieren und anschließend reinigen. Sie konnte zudem zeigen, dass das gesamte Protein nicht in der Lage ist, YidC in vivo zu ersetzen, im Gegensatz zu einem Hybridprotein bestehend aus der ersten TMD und dem ersten periplasmatischen Loop von YidC und den 5 C-terminalen TMDs von Aq-YidC. Zudem bestimmte sie für das Protein mittels CDSpektroskopie eine Schmelztemperatur von 87 °C und einen helikalen Anteil von 50 % (Grenz, 2008). 23 1. Einleitung 1.5 Ziele der Arbeit Die YidC/Oxa1/Alb3-Familie besteht aus konservierten und essentiellen Proteinen. Von besonderem Interesse ist es weitere Proteine, die zu dieser Familie gehören, zu identifizieren. Daher wurde das zu YidC homologe Tth-IM60 Protein aus T. thermophilus sowohl hinsichtlich seiner Funktion als auch seiner Struktur charakterisiert, um es diesbezüglich der YidC/Oxa1/Alb3 Familie zuzuordnen. Hauptaugenmerk lag dabei auf dem Vergleich zu den bereits bekannten Funktionen von YidC aus E. coli. Für die Durchführung von Funktionsanalysen, wie in vitro Translokations- und Bindungsstudien und in vivo Komplementationsversuche, musste das Tth-IM60 Protein heterolog in E. coli exprimiert und im Anschluss gereinigt werden. Die Expression sollte hinsichtlich Ausbeute und die Reinigung hinsichtlich Homogenität und Reinheit optimiert werden. Über die Struktur und den genauen molekularen Mechanismus der Funktion der YidC/Oxa1/Alb3-Familie ist wenig bekannt, daher ist die Kristallisation von Tth-IM60 als Protein dieser Familie von besonderem Interesse. Röntgenstrukturanalysen von diesen Proteinkristallen könnten Hinweise über die Struktur und damit über funktionelle Mechanismen erbringen. Die Stabilität bei einer hohen Proteinkonzentration ist für die Kristallisation von entscheidender Bedeutung, daher sollte die Stabilität von Tth-IM60 durch Untersuchungen von Detergenzien und Puffersystemen optimiert werden. Außerdem sollte mittels Zirkulardichroismus-Spektroskopie die prozentualen Anteile der Sekundärstruktur, sowie die Schmelztemperatur von Tth-IM60 ermittelt und mit den Proteinen YidC und Aq-YidC, einem weiteren homologen und thermophilen YidC Protein aus A. aeolicus, verglichen werden. Homologe konnten mit Ausnahme der ER-Membran, in allen eu- und prokaryontischen Membranen, durch die ein kotranslationaler Transport von Proteinen stattfindet, gefunden werden. Im Gegensatz dazu gibt es in ER-Membranen mit TRAM ein Protein, das wie YidC neben dem Sec-Translokationskomplex lokalisiert ist und mit naszierenden Polypeptidketten interagiert. Aufgrund dieser Ähnlichkeiten wurde das TRAM Protein auf die von YidC bekannte Sec-unabhängige Insertasefunktion hin untersucht. Diese Funktion wäre ein Hinweis auf eine Analogie der beiden Proteine. Dafür musste das TRAM Protein heterolog in E. coli exprimiert und gereinigt werden, um anschließend Rekonstitutions- und Translokationsuntersuchungen durchzuführen. 24 2. Material und Methoden 2. Material und Methoden 2.1 2.1.1 Materialien Chemikalien und Verbrauchsmaterialien AppliChem GmbH, Darmstadt Glycin Anatrace, Maumee,USA Fos-Cholin-14 ATTO-TEC GmbH, Siegen ATTO 520 Avanti® Polar Lipids, Inc., Alabaster, USA DOPC, E.coli Polar Lipid Extract BASF SE, Ludwigshafen Essigsäure 90 % Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA Trypton Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, USA Bio-Beads SM-2 Adsorbent Biozym Scientific GmbH, Oldenburg Agarose Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe Aceton, Acrylamid Rotiphorese Gel 30, Arabinose (L+), Na2HPO4, Na2S2O3, Dialyseschläuche Visking Typ 20/32, Rotilabo®-Spritzenfilter Fermentas Int. Inc., Burlington, CA dNTP-Mix, 6x DNA-LoadingDye FMC BioProducts, Rockland, USA Acrylamid Long Ranger GE Healthcare, USA Ni-Sepharose FF, Hybond ECL Nitrocellulose Membran, Sephadex G10 GERBU Biotechnik GmbH, Gaiberg DTT, DDM, IPTG Heirler Cenovis GmbH, Radolfzell Magermilchpulver Merk KGaA, Darmstadt AgNO3, APS, ATP, Bromphenolblau, CaCl2, Essigsäure 96 %, Ethanol, Glucose (D+), HCl, Isopropanol, Kaliumacetat, KH2PO4, Methanol, MgCl2, MgSO4 Na2CO3, NaH2PO4, NaHCO3, NaOH, PEG, TCA, Tween-20 Millipore Corporation, Bullerica, USA Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MoBiTec, Göttingen Mobicols, 2,5 ml Säulen MP Biomedicals LLC, Costa Mesa, USA X-Gal 25 2. Material und Methoden Oxoid LTD, Basingstoke, GB Hefeextrakt Profos AG, Regensburg Agar No.1 Schleicher & Schuell, Dassel Whatman Blotting Papers GB 004 Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg Coomassie blue, RbCl, SDS Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, USA 6-Aminocapronsäure, Ampicillin, Borsäure, BSA, Chloramphenicol, CuSO4, DMSO, Ethidiumbromid, EDTA, Glycerin, Harnstoff, Hepes, Formaldehyd (36,5 %), KCl, LDAO, MOPS, Natriumacetat, NaCl, Ni2SO4, Ponceau S, Temed, Tetracyclin, Tris Base, Tetenal AG & Co. KG., Norderstedt Eukobrom SW Entwickler, SuperFix Plus USB Corporation, Cleveland, USA Imidazol, Triton-X 100 Valmex®-GmbH, Augsburg Röntgenfilm VA711-B 2.1.2 Kits Axyprep Plasmid Maxiprep Kit Axygen Biosciences, Union City, USA BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific, Waltham USA E.Z.N.A.® Plasmid Miniprep Kit II peQLab Biotechnologie GmbH, Erlangen ECL Western blotting analysis system GE Healthcare, Buckinghamshire, UK ECL Immobilon Western HRP Substrate Millipore Corporation, Bullerica, USA GFX™ DNA and Gel Band Purifcation Kit GE Healthcare, Buckinghamshire, UK MWGF200 Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, USA pGEM®-T Easy Vector Systems I Promega Corporation, Madison, USA TaKaRa LA Taq™ PCR Kit TAKARA Bio Inc., Japan Thermo Sequenase Cycle USB Corporation, Cleveland, USA Sequencing Kit Zyppy™ Plasmid Miniprep Kit 2.1.3 Zymo Research Corp., Orange, USA Geräte Agarosegelelektrophorese-Kammer: Model B1A Electrophoresis System Owl Separation Systems, Inc, USA 26 2. Material und Methoden Autoklaven: H+P Varioklav Dampfsterilisator 75S H+P Labortechnik AG, Oberschleißheim H+P Varioklav Dampfsterilisator 135S H+P Labortechnik AG, Oberschleißheim Bilddokumentation: Image Scanner GE Healthcare, Buckinghamshire, UK Blotkammer: Thermo Scientific Owl HEP-1 Semi-Dry Owl Separation Systems, Inc., Portsmouth Blotkammer Trans-Blot Cell Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, USA Blotkammer Mini Trans-Blot Cell Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, USA FPLC: Äkta Purifier GE Healthcare, Buckinghamshire, UK Äkta basic GE Healthcare, Buckinghamshire, UK Electrophorese-Kammer: Vertical Dual Gel Mini Electrophoresis Sigma-Aldrich Corporate, St. Louis, USA Unit Feinwaage: Sartorius Competence CP224S Sartorius AG, Göttingen, Heizblock: Accu Block Digital Dry Bath Labnet International, Inc., Edison, USA Thriller peQLab Biotechnologie GmbH, Erlangen Inkubationsschüttler: HT Infors AG, Bottmingen, CH HT Aquatron Infors AG, Bottmingen, CH Mikroskop (speziell angepasst): IX71 Olympus Europa Holding GmbH, Hamburg 27 2. Material und Methoden Zubehör: Objektiv UPlanSApo 60x, n.A. 1.2 Olympus Europa Holding GmbH, Hamburg HC Dual Line Strahlenteiler 488/633-638 AHF Analysetechnik, Tübingen HQ 532/70 Filter, 630 DCXR AHF Analysetechnik, Tübingen TCSPC Device SPC-152 Becker & Hickl GmbH, Berlin Laser PicoTA490 Picoquant, Berlin APD SPCM-AQR-14 EG&G, Gaithersburg, USA Magnetrührer: Ikamag REO IKA Werke GmbH & Co. KG, Staufen Partikel Analyzer: Coulter® N4SD Sub-Micron Particle Coulter Electronics, Inc., Hialeah USA Analyzer pH-Meter: 620 pH-Meter Metrohm AG, Herisau, CH Schüttler: Polymax 1040 Heidolph Elektro GmbH Co. KG, Kelheim TM 25 Edmund Bühler GmbH, Hechingen Thermomixer 5436 Eppendorf AG, Hamburg Sequenziergerät: DNA Sequencer, Long ReadIR 4200 LI-COR Corporate, Lincoln, USA mit e-Seq 2.0 DNA Sequencing und Analysis Software SpeedVac: SpeedVac Concentrator mit Bachofer Laboratoriumsgeräte, Reutlingen Refrigerated Condensation Trap und High Vacuum Pump 28 2. Material und Methoden Spektrometer: Jasco FP-750 JASCO Inc., Easton, USA Novaspec Plus GE Healthcare, Buckinghamshire, UK UV/VIS Spectrometer, Lambda 12 PerkinElmer, Inc., Waltham, USA WPA biowave CO8000 WPA, Cambridge, England UK Cell Density Meter Thermocycler: Gene Amp PCR System 2400 PerkinElmer, Inc., Waltham, USA T3 Thermocycler Biometra GmbH, Göttingen T Gradient Biometra GmbH, Göttingen Waagen: Sartorius Basic Sartorius AG, Göttingen Sartorius 1264 MP Sartorius AG, Göttingen Wasseraufbereitung: Milli-Q Academic System, Q-Gard2 Millipore Corporation, Billerica, USA Zellaufschluss: French Pressure Cell Press American Instrument Company Silverspring, USA Zentrifugen: Avanti J25 High Performance Beckman Coulter Inc., Brea, USA Centrifuge 5415 D Eppendorf AG, Hamburg Centrifuge 5417R Eppendorf AG, Hamburg Hermle Z 233 MK Hermle Labortechnik GmbH, Wehingen Hermle ZK 630 Processor Berthold Hermle AG, Gosheim Hettich Rotanta A. Hettich GmbH & Co. KG., Tuttlingen Ultrazentrifugen: Beckman TL-100 Beckman Coulter Inc., Brea, USA Beckman Optima LE-80K Beckman Coulter Inc., Brea, USA 29 Inc., 2. Material und Methoden 2.1.4 Bakterienstämme Escherichia coli BL21 (DE3) (Studier & Moffatt, 1986) E. coli B F- dcm ompT hsdS (rB- mB-) gal (DE3) Escherichia coli C41 (DE3) (Miroux & Walker, 1996) E. coli B F-, dcm, ompT, hsdS, (rB- mB-), gal, (DE3) und eine nicht charakterisierte Mutation Escherichia coli C43 (DE3) (Miroux & Walker, 1996) E. coli B F- dcm ompT hsdS (rB- mB-) gal (DE3) und zwei nicht charakterisierte Mutationen Escherichia coli JS7131 (Samuelson et al., 2000) (codB-lac)3, galK16, galE15, - , relA1, rpsL150, spoT1, hsdR2, ara+, attB::R6Kori, ParaBAD -yidC+, (Specr) Dieser YidC Depletionsstamm wird für Komplementationsversuche verwendet. Das wt yidC Gen ist zum größten Teil deletiert und stattdessen befindet sich ein yidC Gen unter der Kontrolle eines AraBAD Promotors in der attB-site. Escherichia coli MK6S (Klenner et al., 2008) MC1061, (PYidC, araC-PBAD) Bei diesem Stamm wurde der YidC Promotor durch einen mit Arabinose induzierbaren araBAD Promotor ersetzt. Im Gegensatz zu JS7131 wurde der Genlocus nicht verändert, so dass eventuelle regulatorische Eigenschaften dieser Genregion nicht beeinflusst werden. Mit diesem Depletionsstamm können Komplementationsversuche durchgeführt werden. Escherichia coli MC1061 (Casadaban & Cohen, 1980) araD139, Δ(ara leu)7697, ΔlacX74, galK-, galU-, rpsL150(strR), hsr-, hsm+ Escherichia coli XL1 – blue (Bullock, 1987) sup44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA46 thi relA1 lac- F‟ [pro AB+ lacZM15 Tn10 (tetr)] 30 2. Material und Methoden Rosetta™ 2(DE3) F- ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm lacY1( DE3) pRARE (CmR) (Stratagene) 2.1.5 DNA Das mittels Sequenzvergleich gefundene homologe YidC Gen aus T. thermophilus (strain HB8/ATCC 27634/DSM 579) (NCBI: YP_143709) wurde über eine PCR aus genomischer DNA isoliert (s. 2.2.5.5). Diese wurde von Dr. C. Lengsfeld (Universität Konstanz) zur Verfügung gestellt. In dieser Arbeit wird das Gen tthIM60 genannt. 2.1.6 DNA-Vektoren In der folgenden Liste sind alle in dieser Arbeit verwendeten Vektoren beschrieben. Diese besitzen ein Ampicillinresistenzgen, es sei denn es ist anders vermerkt. Name Größe Beschreibung Quelle pEH-1 ~5 kb Expressionsvektor mit lacUV5 Promotor speziell für niedrige Expression in Stämmen mit lacY, Kanamycin Resistenz (HashemzadehBonehi et al., 1998) pEH-1*Nde ~5 kb s. pEH-1, NdeI Schnittstelle an Pos. 333 ( NcoI) diese Arbeit pET-16b ~5,7 kb Expressionsvektor mit T7-Promotor, N-terminaler His-tag Sequenz Novagen pET-22b ~ 5,5 kb Expressionsvektor mit T7-Promotor, C-terminaler His-tag Sequenz, Nterminale pelB Signalsequenz Novagen pGEM®-T Easy ~3 kb T-overhang Klonierungsvektor für PCR-Produkte, lacZ-Gen in Polylinker (blau-weiß Screen) Promega ColD Replikon, CAP Resistenz (Lessl et al., 1992) Expressionsvektor, N-terminale malE Sequenz, die für das MaltoseBindeprotein (MBP) kodiert, ohne Signalsequenz, so dass das Fusionsprotein im Cytoplasma bleibt NEB, (di Guan et al., 1988) pGZ119he pMAL-c2x ~ 6,6 kb 31 2. Material und Methoden Name Größe Beschreibung Quelle pMS119 ~ 4 kb Expressionsvector mit Ptac (Balzer et al., 1992) pRARE ~ 4,7 kb Trägt die Gene der in E. coli seltenen t-RNAs für die Codons AGA, AGG, AUA, CUA, GGA und CCC Novagen pT7-7 ~ 2,5 kb Expressionsvektor, T7-Promotor Stanley Tabor pUC19 ~ 2,7 kb High copy Klonierungsvektor, lacZGen in Polylinker (YanischPerron et al., 1985) 2.1.7 Plasmide In der folgenden Liste sind alle Plasmide aufgeführt, die während dieser Arbeit hergestellt bzw. verwendet wurden. Wurden diese Plasmide von jemand anderem hergestellt ist die Quelle angegeben. Die Klonierung ist in 2.2.5.5 beschrieben. Plasmidkonstrukt Name pET16 - tthIM60-C-His-tag pSHN-14 Amp pGZ - tthIM60-C-His-tag pSHN-15 CAP pGZ - yidC Quelle Resistenz A. Kuhn CAP Dipl.-Arbeit S. Neefe Amp pMal - tramXl pSHN-06 pMal - tramXl-C-His-tag G318C G831C pSHN-07 Amp pMal - yidC pSHN-12 Amp pMS19 - tthIM60-C-His-tag pSHN-18 Amp pMS19 +rbs-Aq-YidC Dipl.-Arbeit S. Grenz pUC19 - tthIM60-C-His-tag 2.1.8 pSHN-19 Amp Amp Primer Nachstehend aufgeführte PCR-Primer wurden in der Arbeit verwendet. Alle Primer wurden von der Firma Biomers (Freiburg) bezogen. 32 2. Material und Methoden Die Primer wurden in ddH2O aufgenommen, so dass die Konzentration der Stocklösung 100 pmol/µl entspricht. Eingesetzt wurden die PCR-Primer in einer Konzentration von 10 pmol/µl. PCR-Primer Sequenz Thermus start 5‟ gaa ggt ccg ggg agg tgc gga atg aag agg ctc ctt 3‟ Tram 828-2a 5‟ ggc ttt gga ctt gca cgc gct gaa aat caa gag 3‟ Tram 828-2b 5‟ ctc ttg att ttc agc gcg tgc aag tcc aaa gcc 3‟ TramXl 317-2a 5‟ gat aaa atc aac cgc cgt atg cat 3‟ TramXl 317-2b 5‟ atg cat acg gcg gtt gat ttt atc 3‟ Tth start Nco 5‟ gaa ggt ccg ggg agg tgc gcc atg gag agg ctc ctt 3‟ Tth stop2 5‟ ctt gcg ctc gtt cat gcc ccc agt tta cgc ctt aag g 3‟ Tth Stopp hisEco 5‟ gcg aat tct act cat taa tga tga tga tga tga tga tga tga tga tga tgc gcc tta agg ggg gcc ag 3‟ Xeno-Eco 5‟ gta gaa ttc ctg ttc cat atg 3‟ Xeno-Pst 5‟ gcc ctg cag tta atg atg atg atg atg atg ttt ttc ttt acg gc 3‟ Primer für die Sequenzierung: Sequenzier-Primer Sequenz Verd. Ta (°C) (2 pmol/µl) c-malE 5‟ ggt cgt cag act gtc gat gaa gcc 3‟ 1:45 59 T7 Forward 5‟ tta tac gac tca cta tag gg 3‟ (IRD 700) 1:50 54 T7 reverse 5‟ cgc tga gat agg tgc ac 3‟ 1:150 58 T7 Terminator 5‟ gct agt tat tgc tca gcg g 3‟ 1:35 54 Tth-Yid375 5‟ ctc gtc ctt aag ctc tcc gcc 3‟ (IRD 700) 1:50 57 Tth-Yid755 5 „ cca tcc tct tcc tga ccc tgg 3‟ 1:50 57 Universal 5‟ gtt ttc cca gtc acg acg ttg ta 3‟ 1:27 58 2.1.9 Enzyme 2.1.9.1 Restriktionsendonucleasen Alle verwendeten Restriktionsenzyme wurden von der Firma Fermentas bezogen und nach Herstellerangaben verwendet. 33 2. Material und Methoden 2.1.9.2 DNA-Ligase Als DNA-Ligase wurde die T4 Ligase mit 2X Rapid Ligation Buffer von Promega für die Ligationen in pGEM-T easy und für alle anderen Ligationen die T4 Ligase mit 10X Ligase Puffer von Fermentas eingesetzt. 2.1.9.3 DNA-Polymerasen Enzym TaKaRa LA Taq Pfu Polymerase Pwo-Polymerase Thermosequenase 2.1.9.4 Organismus Thermus aquaticus Pyrococcus furiosus Pyrococcus woesei Puffer GC Buffer I +II Reaction Buffer Reaction Buffer Reaction Buffer Hersteller TaKaRa Bio Inc. Stratagene Stratagene GE DNase Als DNase wurde die DNase II von Sigma-Aldrich verwendet 2.1.9.5 Proteasen Protease Trypsin Faktor Xa 2.1.10 Antikörper gerichtet gegen Anti His-tag Anti MBP Anti Rabbit IgG Anti Maus IgG 2.1.11 Hersteller Sigma Biolabs Herkunft Maus monoklonal Kaninchen polyklonal Ziege polyklonal Ziege polyklonal Verdünnung 1 : 10000 1 : 10000 1 : 10000 1 . 12000 Hersteller Sigma Biolabs Sigma Sigma Marker DNA-Marker GeneRuler™ 100bp DNA Ladder Plus Fermentas, Deutschland GeneRuler™ 1kb DNA Ladder Fermentas, Deutschland 1 kb DNA Ladder NEB, USA Protein-Marker Prestained Protein Ladder Fermentas, Deutschland Protein Molecular Weight Marker Fermentas, Deutschland SpectraTM Multicolor Low Range Ladder Fermentas, Deutschland 34 2. Material und Methoden 2.1.12 Kulturmedien DYT-Medium 16 g Trypton, 10 g Hefeextract, 5 g NaCl in 1l ddH2O, pH 7,4 LB-Medium 10 g Trypton, 5 g Hefeextract, 5 g NaCl in 1l ddH2O, pH 7,4 LB Agarplatten 10 g Trypton, 5 g Hefeextract, 5 g NaCl, 15 g Agar in 1l ddH2O, pH 7,4 Alle Medien wurden autoklaviert und anschließend, wenn nötig, mit den folgenden Konzentrationen Antibiotika versetzt: Ampicillin 200 µg/ml Chloramphenicol 25 µg/ml Kanamycin 10 µg/ml Tetracyclin 5 µg/ml 35 2. Material und Methoden 2.2 2.2.1 Molekularbiologische Methoden PCR (polymerase chain reaction) Die PCR bezeichnet eine Technik, bei der bestimmte DNA-Abschnitte in vitro vervielfältigt werden können. Reaktionsansatz mit der in dieser Arbeit hauptsächlich verwendeten TaKaRa LA DNA Polymerase 2x PCR Puffer I dNTP Mix (2,5 mM each) Template DNA Forward Primer (10 pmol/µl) Reverse Primer (10 pmol/µl) TaKaRa LA Taq Polymerase mit H2O auffüllen auf Menge 25 µl 8 µl 2 µl 1 µl 1 µl 0,5 µl 50µl Endkonzentration 1x 400 µM < 1µg 200 nM 200 nM 0,05 units/µl PCR-Protokoll Reaktion 1. Denaturierung 2. Denaturierung 3. Annealing* 4. Elongation* 5. Final Elongation Temperatur 94°C 94°C X°C 72°C 72°C Zeit 1 min 30 s 30 s Xs 5 min 30 Zyklen Die Annealingtemperatur hängt von dem verwendeten Primer ab, die Elongationszeit von der Länge des zu amplifizierenden DNA-Fragments und der verwendeten Polymerase. Nach einer PCR wurde der Ansatz auf ein Agarosegel aufgetragen und das PCRProdukt mit dem GFX™ DNA and Gel Band Purification Kit isoliert (s. 2.2.3.2). 2.2.2 Agarosegelelektrophorese Mit der Agarosegelelektrophorese wurden DNA Fragmente aufgetrennt. Je nach Größe der Fragmente wurde die Konzentration der Agarose gewählt. In dieser Arbeit wurden 1 %ige Agarosegele hergestellt und verwendet. Die Agarose wurde in 1x TAE-Puffer (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA, pH 8,0) durch Aufkochen vollständig gelöst, nach 36 2. Material und Methoden dem Abkühlen wurden 2 µl Ethidiumbromid (10 mg/ml) dazugegeben. Das Gel wurde in einer Agarosegelkammer gegossen und in 1x TAE-Puffer laufen gelassen. Die Proben wurden mit 6 x Ladepuffer versetzt und aufgetragen. Je nach Größe des Fragments wurde ein entsprechender Größenstandard aufgetragen. Es wurde eine konstante Spannung von 80V angelegt. Die DNA-Banden wurden unter UV-Licht sichtbar gemacht. 2.2.3 DNA-Isolierung 2.2.3.1 Plasmid-Isolierung aus E. coli XL-1 blue Für alle Plasmidisolationen wurde das ZyppyTM Plasmid Miniprep Kit von Zymo Research nach Anleitung verwendet. 600 µl einer Übernachtkultur wurden in ein Eppendorf Gefäß überführt und 100 µl 7x „Lysis Buffer“ dazugegeben. Die Probe wurde 4-6 x vorsichtig invertiert und färbte sich blau. Danach wurden 350 µl eiskalter „Neutralization Buffer“ dazugegeben und sorgfältig gemischt. Dann wurde die Probe 4 min bei 16 000 x g zentrifugiert, der Überstand in eine Zymo-Spin™IIN Säule und diese in ein Collection Tube überführt. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt (30 s, 16 000 g) wurde der Durchlauf verworfen und die Säule einmal mit 200 µl Endo-Wash Buffer und einmal mit 400 µl Zyppy™-Wash Buffer gewaschen. Die Säule wurde dann in ein frisches Eppendorf Gefäß überführt und die DNA in 50 µl ddH2O eluiert. Die Plasmid-DNA konnte sofort weiter verwendet oder bei – 20 °C gelagert werden. 2.2.3.2 DNA-Isolierung aus Agarosegelen Die Isolierung erfolgte mit dem GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit von Amersham nach Anleitung. Unter UV-Licht wurden die gewünschten Banden mit einem Skalpell ausgeschnitten, in ein Eppendorfgefäß transferiert und das Gewicht bestimmt. Pro 10 mg Gel wurden 10 µl „Capture Buffer“ dazugegeben und die Proben gut gevortext. Die Proben wurden ca. 10 min bei 60 °C erhitzt, bis die Agarose geschmolzen war und dann kurz zentrifugiert. Die Proben wurden auf eine mit einer Silikamatrix befüllten Säule (GFX Column) gegeben, die sich in einem „Collection Tube“ befindet und 1 Minute inkubiert. Sie wurden mit der maximalen Geschwindigkeit (16 000 g) 30 s in der Tischzentrifuge zentrifugiert. Die DNA blieb an der Säule hängen und der Durchlauf wurde verworfen. Die Säule wurde mit 500 µl „Wash Buffer“ (enthält Ethanol) versetzt, wieder zentrifugiert 37 2. Material und Methoden und in ein frisches Eppendorfgefäß überführt. Die DNA wurde jetzt mit 50 µl Elutionspuffer eluiert. Dafür eignet sich, je nach der weiteren Verwendung sowohl steriles ddH2O oder auch TE-Puffer (10 mM TrisHCl pH 7,4, 1 mM EDTA pH 8,0, pH 7,4). Vor der Elution wurde der Puffer auf 65 °C erhitzt, dadurch wurden DNAsen zerstört und die DNA besser von der Säule gelöst. Wurde die DNA für eine Ligation verwendet, wurde sie über eine Sephadex-Säule noch zusätzlich gereinigt. 2.2.3.3 DNA-Reinigung und Entsalzung über eine Sephadex-Säule DNA-Proben konnten über eine G10 Sephadex-Säule entweder gereinigt oder auch entsalzt werden. Das Säulenmaterial G10 wurde in TE-Puffer gequollen, 500 µl wurden in ein 0,5 ml Eppendorf Gefäß, in das mit einer dünnen Nadel ein Loch gestochen wurde, pipettiert, 2 min bei 2 000 x g abzentrifugiert und 2 x mit ddH2O gewaschen. Die Säule wurde in ein steriles Eppendorf Gefäß gestellt und die DNA dazugegeben. Der Ansatz wurde 3 min bei 2 000 – 3 000 x g zentrifugiert. Niedermolekulare Verunreinigungen und Salze bleiben dabei in der G10-Matrix zurück, während die DNA eluiert und dadurch gereinigt bzw. entsalzt wurde. 2.2.4 DNA-Konzentrationsbestimmung Die Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren kann auf verschiedene Arten durchgeführt werden. Eine einfache, aber nicht sehr genaue Methode ist das Abschätzen über ein Agarosegel mit Vergleichsmengen. Genauer ist die photometrische Bestimmung. Dabei entspricht eine OD260 von 1 bei doppelsträngiger DNA einer Menge von 50 µg/ml. Der DNA-Gehalt wurde nach der folgenden Formel berechnet: c [µg/ml] = E260 * 50 * VF c = DNA Konzentration; E260 = Extinktion; VF = Verdünnungsfaktor 2.2.5 DNA-Klonierung 2.2.5.1 Restriktionsverdau Bei einem Restriktionsverdau wurde gereinigte DNA mit Restriktionsendonukleasen geschnitten. Diese Enzyme können die DNA-Moleküle sequenzspezifisch aufschneiden. Die Restriktionsansätze wurden in einem möglichst geringen Volumen (10 - 20 µl) durchgeführt. Die Menge an Enzym richtet sich nach der Zeit und der Menge an DNA (1 U pro µg DNA). Außerdem wurde die entsprechende Menge an 10 x Puffer zu den 38 2. Material und Methoden Ansätzen gegeben. Die Restriktion fand für ca. 2 Stunden bei der für das Enzym spezifischen Temperatur statt. Sollte mit einem zweiten Enzym, das einen anderen Restriktionspuffer benötigt, geschnitten werden, so wurde der Ansatz über eine Sephadex-Säule entsalzt (s. 2.2.3.3), bevor der zweite Restriktionsverdau durchgeführt wurde. Im Anschluss an eine DNA-Restriktion wurden die Ansätze in einem Agarosegel aufgetrennt und die entsprechenden Fragmente analysiert bzw. eluiert (s. 2.2.3.2). 2.2.5.2 Ligation Bei einer Ligation werden DNA-Fragmente mit Hilfe einer DNA-Ligase verknüpft. Diese katalysiert die Bildung neuer Phosphodiesterbrücken mit Hilfe von ATP. Bei einer Ligation eines Vektors mit einem DNA-Fragment wurde ein molare Verhältnis zwischen 1:3 und 3:1 gewählt. Die Menge der eingesetzten DNA wurde wie folgt berechnet: ng Vektor Größe des Inserts in kb Verhältnis Insert : Vektor ng Insert Größe des Vektors in kb Ligationsansätze mit einem PCR-Produkt wurden mit dem pGEM-T easy Vektor System von Promega durchgeführt: pGEM-T easy Vektor 2x Rapid Ligation Buffer PCR Produkt Kontroll Insert DNA T4 DNA Ligase auffüllen mit H2O auf Reaktion 1 µl 5 µl 50 -150 ng 1 µl 10 µl Positivkontrolle 1 µl 5 µl Negativkontrolle 1µl 5 µl 2 µl 1 µl 10 µl 1 µl 10 µl Ligationsansatz mit geschnittenem Insert: Vektor 10x Ligase Puffer Insert T4 DNA Ligase auffüllen mit H2O auf Reaktion 50 ng 1 µl ~ 100 ng 1 µl 10 µl Negativ Kontrolle 50 ng 1 µl 1 µl 10 µl Die Ligation wurde über Nacht bei 4 °C oder für 1 h bei 22 °C durchgeführt. Im Anschluss wurde der Ansatz in kompetente E. coli XL1 blue Zellen transformiert. 39 2. Material und Methoden 2.2.5.3 Transformation mit kompetenten Zellen Die kompetenten Zellen wurden langsam auf Eis aufgetaut. Zu 100 µl Zellen wurden 25-50 ng DNA gegeben, das ca. 1-2 µl einer Miniprep-DNA entspricht. Wurde DNA aus einer vorangegangen Ligation eingesetzt, wurden 10 µl DNA verwendet. Der Ansatz wurde 20 min auf Eis inkubiert und anschließend bei 42 °C für 90 s ein Hitzeschock durchgeführt. Die Zellen wurden nochmals 5 min auf Eis inkubiert und dann mit 450 µl LB-Medium versetzt. Der Ansatz wurde ca. 1 h bei 37 °C geschüttelt. Im Anschluss daran wurden die Zellen auf einer entsprechend selektiven Agarplatte ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. 2.2.5.3.1. Herstellung kompetenter Zellen mit Rubidiumchlorid Von dem benötigten Stamm wurden 100 ml LB-Medium mit 1 ml Übernachtkultur angeimpft und bei 37 °C in einem Schüttler bis zu einer Zelldichte von ca. 2 *108 Zellen/ml inkubiert. Besaß der Stamm eine Antibiotika Resistenz, wurde dem LBMedium das entsprechende Antibiotikum zugesetzt. Die Zellen wurden in einem sterilen Zentrifugenbecher mit 3 000 x g 15 min bei 4 °C geerntet. Wichtig war, dass absolut steril und auf Eis gearbeitet wurde. Der Überstand wurde abgegossen und das Bakterienpellet in 20 ml eiskaltem TFB1 Puffer (100 mM RbCl, 50 mM MnCl2, 30 mM KAc, 10 mM CaCl2, 15 % Glycerin, pH 5,8) resuspendiert. Die Zellen wurden 90 min auf Eis inkubiert und in ein steriles JA 20 Röhrchen überführt. Danach wurden die Zellen wieder bei 3 000 x g 10 min. zentrifugiert und der Überstand abgegossen. Die Zellen wurden vorsichtig in 2,5 ml TFB2 Puffer (10 mM MOPS, 10 mM RbCl, 75 mM CaCl2, 15 % Glycerin, pH 8,0) aufgenommen und waren kompetent. Zellen, die nicht sofort für eine Transformation verwendet wurden, wurden aliquotiert, sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80 °C gelagert. 2.2.5.4 TSS Transformation (transformation and storage solution) (Chung et al., 1989) Die TSS Transformation ist eine schnelle und zuverlässige Transformationsmethode. Dabei werden E. coli Zellen in einem Schritt kompetent gemacht, um sie sofort für eine Transformation zu verwenden. Allerdings ist diese Methode relativ ineffizient und daher nur für die Transformation von gereinigter Plasmid-DNA brauchbar, nicht jedoch für eine Ligation. 40 2. Material und Methoden 2 ml LB-Medium wurden 1:100 mit einer Übernachtkultur angeimpft und bis in die exponentielle Phase wachsen gelassen. Die Zellen wurden auf Eis abgekühlt und 1:1 mit eiskaltem 2x TSS-Puffer (5 % DMSO, 10 % PEG 6000, 50 mM MgSO4, in LBMedium) gut gemischt. Die Zellen waren sofort kompetent. In einem vorgekühlten Eppendorf Gefäß wurden 100 µl Zellen und 2 µl DNA gemischt und 15-30 min auf Eis inkubiert. Danach wurden die Zellen auf LB-Agarplatten mit entsprechendem Antibiotikum ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. 2.2.5.5 Klonierung der verwendeten Plasmide pSHN-07: pMal – tramXl-C-His-tag G318C G831C: Tram-Protein aus Xenopus laevis als MBP-Fusionsprotein mit C-terminalem His-tag und Austausch der seltenen Arginincodons. Zuerst wurde an das pMal – tramXl ein His-tag kloniert. Dafür wurde das Plasmid mit EcoRI und PstI verdaut und auf einem 1 % Agarosegel aufgetrennt. Das 500 bp große Eco/Pst-Fragment entspricht dem C-terminalen Ende von tramXl. Auf diesem Fragment wurde eine PCR mit den Primern Xeno-Pst und Xeno-Eco durchgeführt und dadurch ein His-tag an das C-terminale Ende von tramXl angehängt. Das PCR-Produkt wurde auf einem Agarosegel aufgetragen, eluiert, wiederum mit EcoRI und PstI geschnitten und dann in das Ursprungsplasmid ligiert. Zur Überprüfung des His-tags wurde das Plasmid mit dem Universal Primer sequenziert. Um die in E. coli seltenen Arginin Codons CGG in CGC zu ändern, wurde eine QuikChange Mutagenese durchgeführt. Da der pMal Vektor jedoch zu groß für eine verlässliche QuikChange ist, wurde das tramXl Gen mit den Restriktionsenzymen AvaI und PstI aus dem Vektor geschnitten und in pT7-7 kloniert. Auf diesem Plasmid wurden dann nacheinander die beiden Mutagenesen mit folgenden Primern durchgeführt: 1: TramXl 317-2a und TramXl 317-2b 2: Tram 828-2a und Tram 828-2b. Zur Überprüfung der Mutationen wurde das Insert mit den Primern T7 Forward und T7 reverse sequenziert. Abschließend wurde das Gen wieder mit den Enzymen AvaI und PstI in das pMal Ursprungsplasmid kloniert. pSHN-12: pMal – YidC: YidC als Fusionsprotein mit MBP Bei einer Klonierung in den pMal-Vektor muss auf das Leseraster der DNA geachtet werden, da die Expression des YidC als Fusionsprotein mit MBP erfolgt. Daher wurde das Plasmid pGZ – yidC, aus dem das yidC-Gen isoliert wurde, erst mit NdeI und der pMal Vektor mit EcoRI geschnitten. Der Verdau wurde mit 65 °C gestoppt und die 41 2. Material und Methoden Proben über eine G10 –Säule entsalzt. Im Anschluss wurden die DNA-Überhänge mit dem Klenow-Fragment aufgefüllt und beide Ansätze mit dem GFX™ DNA and Gel Band Purification Kit gereinigt. Beide DNAs wurden mit HindIII ein zweites Mal verdaut, über ein Agarosegel aufgetrennt und die entsprechenden Banden in H2O eluiert. Die Ligation erfolgte bei 20 °C für 2 h. pSHN-14: pET16 – tthIM60-C-His-tag: IM60-Homolog TthIM60 aus T. thermophilus mit C-terminalem His-tag Das Gen tthIM60 wurde mittels PCR mit den Primern Thermus start und Tth stop2 aus der genomischen DNA von T. thermophilus isoliert. Dabei wurde die Pfu Polymerase von Stratagene nach Herstellerangaben verwendet. Die Annealing-temperatur betrug 65 °C. Die DNA wurde auf einem 1 % Agarosegel aufgetragen und in 50 µl H2O eluiert. Für die Klonierung eines C-terminalen His-tags an das tthIM60 wurde mit dem isolierten DNA-Fragment eine zweite PCR mit den Primern Tth start Nco und Tth Stopp hisEco durchgeführt. Die Primer wurden so gewählt, dass zusätzlich zu dem His-tag die Schnittstellen NcoI und EcoRI in die DNA eingefügt wurden. Das PCR-Produkt wurde nach der Elution aus einem Agarosegel mit den Enzymen NcoI und EcoRI verdaut und in den Vektor pET-16b kloniert, der mit den gleichen Restriktionsenzymen geschnitten wurde. Zur Überprüfung der Sequenz wurde das Plasmid mit den Sequenzier-Primern Tth-Yid375, Tth-Yid755 und T7 Forward sequenziert. pSHN-15: pGZ – tthIM60-C-His-tag Das tthIM60 Gen wurde zusammen mit der Ribosomenbindestelle (rbs) aus pSHN-14 mit den Enzymen XbaI und EcoRI in pGZ119 he kloniert. pSHN-18: pMS – tthIM60-C-His-tag Das tthIM60 Gen wurde aus pSHN-14 mit den Enzymen XbaI und EcoRI in pMS119 kloniert. pSHN-19: pUC – tthIM60-C-His-tag Das tthIM60 Gen wurde aus pSHN-14 mit den Enzymen XbaI und EcoRI in pUC19 kloniert. 42 2. Material und Methoden 2.2.6 DNA-Sequenzierung nach Sanger (Sanger et al., 1977) Für die Sequenzierung wurde das Thermo Sequenase™ Cycle Sequencing Kit von USB verwendet. Reaktionsansatz: Mastermix Template DNA Reaktion Buffer Primer (2 pmol/µl) Thermosequenase Menge 13 µl 2 µl 1 µl 1,5 µl Der Mastermix wurde gut gemischt und je 4 µl in vorbereitete PCR-Röhrchen pipettiert. Diese enthielten je 4 µl des ‚Termination mix‟ (alle 4 dNTPs und ein ddNTP). Die Röhrchen wurden kurz zentrifugiert und die Amplifizierung gestartet. Amplifizierungsprotokoll: Reaktion 1. Denaturierung 2. Denaturierung 3. Annealing 4. Elongation 5. Final Elongation 6. Kühlung Temperatur 95°C 95°C X°C 72°C 72°C 4°C Zeit 30 s 30 s 30 s 60 s 120 s 40 Zyklen Die Annealingtemperatur ist von dem jeweiligen Primer abhängig. Die Amplifizierungsreaktion wurde mit 2 µl einer Stopplösung beendet. Die Proben wurden 2 min bei 75 °C erhitzt und je 1,7 µl in der Reihenfolge A, C, G, T auf das Gel geladen. Bei der Herstellung des Gels wurde darauf geachtet, dass ausschließlich Chemikalien ohne Eigenfluoreszenz verwendet wurden. 21 g Harnstoff, 6 ml Acrylamidlösung (Long Ranger), 6 ml 10x TBE (0,89 M Borsäure, 0,89 M TrisHCl, 20 mM EDTA pH 8,0) wurden in ddH2O bei 37 °C gelöst (Endvolumen 50 ml) und 10 min entgast. Für das Vorgel wurden 3 ml entnommen, mit 32 µl 10 %igem APS und 4 µl TEMED vermischt und gleichmäßig in den unteren Rand zwischen die Glasplatten gespritzt. Der Rest wurde mit 250 µl APS und 25 µl TEMED vermischt und mit einer Spritze luftblasenfrei zwischen die Glasplatten gegossen. Nach 1,5 h war das Gel auspolymerisiert, wurde in 43 2. Material und Methoden den Licor Sequenzierer gebaut und der Vorlauf gestartet. Anschließend wurden je 2,2 µl der Proben auf das Gel geladen. 2.2.7 Ortsspezifische Mutagenese in Plasmiden mittels QuikChange Bei der ortsspezifischen Mutagenese wurde mit einem Primer eine gewünschte Mutation an eine beliebige Stelle im Gen eingeführt. Die Primer wurden so gewählt, dass sich die Mutation genau in der Mitte befindet und sie komplementär zueinander sind. Bei einer QuikChange wurde zwischen 5-50 ng Plasmid-Template eingesetzt. Als Polymerase wurde die PfuUltra-DNA Polymerase eingesetzt. Reaktionsansatz: 10x Reaktionspuffer dNTP Mix (2,5 mM each) Template DNA Forward Primer (5 pmol/µl) Reverse Primer (5 pmol/µl) PfuUltra-DNA Polymerase H2O Menge 5 µl 1 µl 1 µl 1 µl 1 µl 1 µl 40µl Endkonzentration 1x 50 µM 5-50 ng 100 nM 100 nM 0,05 units/µl Die DNA wurde so verdünnt, dass 1 µl eingesetzt wurden. PCR-Programm: Reaktion 1. Denaturierung 2. Denaturierung 3. Annealing 4. Elongation 5. Final Elongation Temperatur 95°C 95°C X°C 72°C 72°C Zeit 2 min 30 s 1 min Xs 7 min 18 Zyklen Die Elongationszeit hängt von der Größe des Plasmids ab (< 1kb/min). Nach der PCR wurde die Template DNA durch einen Restriktionsverdau mit 1 µl Dpn I abgebaut. Anschließend wurde eine Transformation (s. 2.2.5.3) durchgeführt. 44 2. Material und Methoden 2.3 2.3.1 Mit Proteinbiochemische Methoden SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-Page) (Laemmli, 1970) dieser denaturierenden Gelelektrophorese werden Proteine nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Zusammensetzung der in dieser Arbeit verwendeten Gele, die angegeben Mengen reichen je für 4 Minigele (8 x 10 cm) oder 2 große Gele (10 x 15 cm): Für Proteine mit einem Molekulargewicht von mind. 20 kDa 12 % Polyacrylamidgel 2 M TrisHCl pH 8,8 1 M TrisHCl pH 6,8 Acrylamid (Gel30) H2O 25 % SDS APS TEMED Trenngel 30 ml 5,62 ml Sammelgel 10 ml 1,25 ml 1,7 ml 7 ml 40 µl 50 µl 5 µl 12 ml 12,1 ml 120 µl 150 µl 10 µl Für Proteine mit kleinem Molekulargewicht ( < 15 kDa) 19 % Harnstoffgel Harnstoff 3,3 M TrisHCl pH 8,7* 1 M TrisHCl pH 6,8 45 % Acrylamid 2 % Bisacrylamid H2O 25 % SDS APS TEMED Trenngel 10,8 g 3,75 ml 12,75 ml 1,2 ml 1,95 ml 150 µl 105 µl 15 µl Sammelgel 20 ml 3,6 g 1,1 ml 3,4 ml 0,65 ml 4,85 ml 400 µl 100 µl 8 µl * zum vollständigen Lösen: Titration mit HCl auf pH 8,3 und dann mit NaOH auf pH 8,7 Für die Minigele wurde die Vertical Dual Gel Mini Electrophoresis Unit von SigmaAldrich verwendet. Die Gele wurden mit SDS-Laufpuffer (25 mM Trisbase, 192 mM Glycin, 0,05 % SDS) in den Laufkammern überschichtet. Bei Polyacrylamidgelen wurde eine konstante Stromstärke von 10-15 mA/Gel bei Minigelen und 20-30 mA/Gel bei großen Gelen angelegt. 45 2. Material und Methoden Zur Aufbereitung der Proben wurden diese mit 10 % Trichloressigsäure (TCA) mindestens für eine Stunde, meistens jedoch über Nacht, auf Eis gefällt. Die Proteine wurden in einer Kühlzentrifuge bei 4 °C und 10 000 x g zentrifugiert. Das Proteinpellet wurde zweimal gut mit Aceton gewaschen und wieder zentrifugiert. Danach wurden die Proben bei 37 °C getrocknet, anschließend in SDS-Probenpuffer aufgenommen und bei 95 °C 5 min denaturiert. SDS-Probenpuffer: Lösung 1 (0,2 M Trisbase, 20 mM EDTA, pH 7), Lösung 2 (80 mM Trisbase, 8 % SDS, 30 % Glycerin, 0,15 % Bromphenolblau) und Lösung 3 (1M DTT) wurden im Verhältnis 5 : 4 : 1 (v/v) kurz vor Gebrauch gemischt. 2.3.2 Blue-Native Page (Schägger & von Jagow, 1991) Blue Native (BN) Gelelektrophorese ist ein natives Gelsystem, bei dem Proteine nicht denaturiert werden. Komplexe und oligomere Zustände der Proteine bleiben erhalten und können nach ihrer Größe aufgetrennt werden. In dieser Arbeit wurde die BN-Page eingesetzt, um zu analysieren, ob das untersuchte Protein als Monomer oder Oligomer vorliegt. Zusammensetzung der in dieser Arbeit verwendeten Gele 4 % - 13 % Gradientengel AB-Mix Acrylamid (Gel 30) Gelpuffer (3x) Glycerin APS (10 %) Temed Endvolumen Trenngel 4% 0,75 ml 3 ml 38 µl 3,8 µl 9 ml 13 % 2,35 ml 3 ml 1,8 g 30 µl 3 µl 9 ml Sammelgel 4% 1 ml 2,5 ml 50 µl 10 µl 7,5 ml Die Lösungen für das Trenngel wurden mit Hilfe eines Gradientenmischers während des Gießens gemischt, so dass ein Gradient von 4 % - 13 % entstanden ist. Die Proben wurden mit 10 x Probenpuffer (500 mM EACA, 100 mM BisTris, 5 % Serva Blue G, pH 7,0) versetzt und sofort aufgetragen. Die Gele wurden gekühlt (1 °C) und diskontinuierlich über Nacht laufen gelassen: 1. 90 min bei 200 V, 2. 30 min bei 500 V, 3. üN bei 50 V, 4. bis Ende bei 100V 46 2. Material und Methoden Kathodenpuffer: 50 mM Tricin, 15 mM BisTris, 0,02 % Serva Blue G, pH 7,0 (4 °C) Anodenpuffer: 50 mM BisTris, pH 7,0 (4 °C) AB-Mix (Acrylamid-Bisacrylamid-Mix): 49,5 % Acrylamid, 1,5 % Bisacrylamid 3x Gelpuffer: 1,5 M 6-Aminocapronsäure (EACA), 150 mM BisTris, pH 7,0 (4 °C) 2.3.3 Proteinfärbung in Gelen 2.3.3.1 Coomassie Brilliant blue Färbung (Neuhoff et al., 1988) Das Gel wurde in der Färbelösung (0,25 % Coomassie R250, 45 % MeOH, 10 % HOAc) 1h bei Raumtemperatur (RT) geschüttelt. Danach wurde es in eine Entfärbelösung (45 % MeOH, 10 % HOAc) überführt und solange entfärbt, bis die blauen Proteinbanden deutlich zu sehen waren. Der ganze Vorgang konnte durch Erhitzen der Lösungen verkürzt werden. 2.3.3.2 Silberfärbung (Merril et al., 1981) Das Gel wurde erst 30 min in Fixierlösung (40 % EtOH, 10 % HOAc) und dann in Sensitivierungslösung (30 % EtOH, 0,125 % Glutardialdehyd, 0,2 % Na-Thiosulfat, 6,8 % NaAc) für weitere 30 min geschüttelt. Anschließend wird das Gel 3 x 5 min in H2O gewaschen und 20 min in der Silberlösung (0,125 % AgNO3, 0,015 % Formaldehyd) gefärbt. Das Gel wurde 2 x 1 min in H2O gewaschen und im Entwickler (2,5 % Na2CO3, 0,008 % Formaldehyd) bis zur gewünschten Bandenstärke geschüttelt. Die Reaktion wurde mit der Stopplösung (1,5 % EDTA) beendet. 2.3.4 Proteinnachweis Um Proteine eindeutig zu identifizieren, wurde ein immunologischer Nachweis mit spezifischen Antikörpern durchgeführt. 2.3.4.1 Transfer von Proteinen auf Nitrozellulosemembran (Western Blot) Beim Western-Blot werden die Proteine, die zuvor in einer Gelelektrophorese aufgetrennt wurden, mittels eines elektrophoretischen Verfahrens auf eine Nitrocellulose Membran übertragen. In dieser Arbeit wurden sowohl das Nassblot- als auch das Semidry-Verfahren angewendet. 47 2. Material und Methoden 2.3.4.1.1. Western Blot (Nassblot) Bei einem Nassblot ist die Blottingeffizienz, insbesondere bei sehr hydrophoben Proteinen, meist besser als bei einem Semidry Blot und wurde deshalb bei sehr geringen Proteinkonzentrationen und bestimmten Proteinen durchgeführt. Das Gel, die Membran und die Filter wurden vor dem Zusammenbau für 10-30 min im Nassblot Puffer A (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 2,5 % SDS, 20 % MeOH) äquilibriert und wie folgt zusammengebaut: Der Zusammenbau wurde in Puffer A durchgeführt und es wurde darauf geachtet, dass keine Luftblasen zwischen den einzelnen Schichten entstanden. Das Gel wurde auf zwei dünne Filterpapiere gelegt, dann die Membran und nochmals zwei Filterpapiere geschichtet. Alles wurde so in die Gelapparatur (Blotkammer Trans-Blot Cell von BioRad) gelegt, dass die Proteine Richtung Anode auf die Membran transferieren. Die Blotkammer wurde mit eiskaltem Puffer A aufgefüllt, so dass das komplette Sandwich unter Puffer stand. Während des Laufes musste weiterhin gekühlt werden, bei der Minigel Apparatur wurde mit einem Kühlelement gekühlt, bei großen Gelen erfolgt die Kühlung mit einer Kühlspirale. Minigele wurden bei 100 V und maximal 350 mA für 80 min und große Gele bei 125 V und maximal 1,5 A für 180 min geblottet. 2.3.4.1.2. Western Blot (Semidry) Der Blot wurde mit der Thermo Scientific Owl HEP-1 Semi-Dry Kammer von Thermo Scientific durchgeführt. Es wurden 4 dicke Whatman Filterpapiere, das Gel und die Nitrocellulosemembran in Transferpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin) kurz äquilibriert und wie folgt luftblasenfrei auf die Kathode geschichtet: 2 Filter, Gel, Membran, 2 Filter. Danach wurde die Anodenplatte aufgesetzt und fest verschlossen. Der Transfer erfolgte bei konstanter Stromstärke von 125 mA pro Minigel (1,5 mA/cm2) bzw. 250 mA pro großem Gel (1,7 mA/cm2) für 90 min. 2.3.4.2 Immundetektion der Proteinbanden Die Membran wurde im Anschluss an den Western Blot ca. 5 min mit 0,1 % Ponceau-S (in 5 % Essigsäure) gefärbt und mit Wasser gespült, dadurch wurden alle Proteine auf der Membran angefärbt und so der Western-Blot überprüft. Danach wurde die Membran mit H2O gewaschen bis keine Banden mehr sichtbar waren. Um unspezifische Bindungen und Signale zu vermeiden wurde die Membran mit 5 % Magermilchpulver in TBS (25 mM TrisHCl, 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 7,4) oder PBS-T (137 mM NaCl, 48 2. Material und Methoden 2,7 mM KCl 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4 + 0,05 % Tween) 2 h bei RT oder über Nacht bei 4 °C geblockt. Im Anschluss wurde die Membran 3 x 5 min mit TBS/PBS-T gewaschen und der 1. Antikörper auf die Membran gegeben. Dieser inkubierte bei Raumtemperatur (RT) auf einem Wippschüttler 1-2 h und konnte mehrfach verwendet werden. Die Membran wurde 3 x 5 min mit TBS/PBS-T gewaschen und der 2. Antikörper, der sich gegen den 1. richtet, wurde für 1 h dazugegeben. An diesen zweiten Antikörper ist die Meerrettich-Peroxidase gekoppelt. Die Membran wurde nach der Inkubation nochmals 3 x 5 min mit Puffer gewaschen. Das Protein wurde dann mittels ECL (Enhanced chemiluminescence) nachgewiesen. 2.3.4.3 ECL „Enhanced chemiluminescence“ Für die Detektion wurde das ECL-Kit Immobilon Western HRP Substrate von Millipore oder das ECL Western Blotting Detection Reagents von Amersham verwendet. Die Lösungen 1 (Luminol) und 2 (Peroxidlösung) wurden im Verhältnis 1:1 gemischt und für drei Minuten auf die Membran gegeben. Dabei wurde das Luminol angeregt. Auf die mit einer Folie abgedeckten Membran wurde ein Röntgenfilm von der Firma Valmex (VA711B) gelegt und in einer Fotokammer belichtet. Die Belichtungszeit hing von der Menge des Proteins und der Spezifität der Antikörper ab (1-60 min). Der Film wurde nach der Belichtung direkt in den Entwickler (Firma Tetenal) gegeben bis Banden erschienen. Danach wurde der Film kurz in die Stopplösung (H2O + HOAc) gelegt und dann im Fixierer (Firma Tetenal) kurz geschüttelt. Der Film wurde gut in Wasser gewaschen und im Anschluss ausgewertet. 2.3.5 Proteinkonzentrationsbestimmung Um die Proteinkonzentration nach einer Reinigung zu bestimmen gibt es verschiedene Möglichkeiten. In dieser Arbeit wurden drei Verfahren angewendet. 2.3.5.1 BCA Assay In alkalischer Lösung bilden Proteine und Cu2+-Ionen einen Komplex (Biuret-Reaktion). Die dabei reduzierten Cu+-Ionen bilden zusammen mit Bicinchoninsäure (BCA) einen violetten Farbkomplex, der photometrisch bestimmt werden kann. In dieser Arbeit wurde das BCA Protein Assay Kit von Thermo Scientific verwendet. Es wurde ein BSA-Standard (5 µg/ml – 2mg/ml) in dem Puffer hergestellt, in dem sich das Protein befindet. Je nach erwarteter Proteinkonzentration wurden 8 Standardproben für die Eichkurve ausgewählt und mitgeführt. Das Working Reagent 49 2. Material und Methoden (WR) wurde aus 50 Teilen Lösung A und 1 Teil Lösung B hergestellt. 50 µl Standard bzw. Proteinlösung wurden mit 1 ml WR versetzt und für 30 min bei 37 °C in einem Wasserbad inkubiert. Danach wurden die Proben auf RT abgekühlt und bei 562 nm gemessen. Die Konzentration wurde dann anhand der Eichkurve ermittelt. 2.3.5.2 Photometrische Bestimmung: Extinktion 280 nm Die Konzentration eines Proteins lässt sich auch über seine Extinktion bei 280 nm bestimmen die durch die Aminosäuren (AS) Tyrosin (Y), Tryptophan (W) und Cystein (C) hervorgerufen wird. Das bedeutet, dass jedes Protein einen eigenen Extinktionskoeffizienten (ε) besitzt. Dieser wurde wie folgt berechnet: ε = (nW * 5500) + (nY * 1490) + (nC * 125) n: Anzahl der jeweiligen AS Zur Konzentrationsbestimmung wurde die Probe in eine 1 cm Quarz-Küvette gegeben und in einem UV-Spektrometer ein Absorptionsspektrum von 250 nm bis 300 nm aufgenommen. Das Absorptionmaxium (A) sollte bei 280 nm liegen. Mit diesem Wert wurde die Konzentration wie folgt bestimmt. A / εmolar = molare Konzentration Um die Konzentration in mg/ml zu erhalten, wurde der Extinktionskoeffizient umgerechnet: (εmolar) * 10 = (εprozent) * (MW des Proteins) (A / εprozent) * 10 = Konzentration in g/l Extinktionskoeffizient: Tth-IM60: εmolar = 84340, εprozent = 17,06 Abs 0,1 % = 1,706 MBP-TRAM: εmolar = 119430, εprozent = 14,82 Abs 0,1 % = 1,482 2.3.5.3 Lowry-Petersen Test (Peterson, 1977) Dieser Test ist besonders bei niedrigen Proteinkonzentrationen sehr genau. Es handelt sich hierbei um eine Variante des weit verbreiteten Lowry Assays (Lowry et al., 1951). Die Proteinlösung und Eichlösungen (10 – 100 µg) wurden in je 1 ml H2O gegeben, mit 0,1 ml Na-Deoxcholat (0,15 %) versetzt und 10 min bei RT inkubiert. Dann wurden die Proteine mit 0,1 ml 72 % TCA bei RT 1 h gefällt, abzentrifugiert (20 min, 16 000 g) und der Überstand sofort abgenommen. Das trockene Proteinpellet wurde in 0,5 ml H2O aufgenommen und 0,5 ml Lösung A (s.u.) dazugegeben und gevortext. Nach einer 50 2. Material und Methoden Inkubation von 10 min bei RT wurde 0,5 ml Lösung B (s.u.) dazugegeben, sofort gevortext und 30 - 60 min bei RT inkubiert. Die Absorption wurde in einer 1 cm Sparküvette bei 750 nm gemessen. Aus den Ansätzen der Eichlösung wurde eine Eichgerade erstellt, aus dieser wurde dann die Proteinkonzentration berechnet. Lösungen: 1. 0,2 % (w/v) CuSO4, 0,4 % (w/v) Na-Tartrat in H2O 2: 20 % (w/v) Na2CO3 3. CTC: 1 und 2 langsam unter Rühren 1:1 mischen 4. 0,8 M NaOH 5. 10 % (w/v) SDS Lösung A: Mischen gleicher Volumen: 3,4,5 und H2O Lösung B: 1 ml 2 N Folin-Ciocalteu-Phenol-Reagenz + 5 ml H2O 2.3.6 Proteinreinigung 2.3.6.1 TRAM Reinigung als Fusion mit MBP Das TRAM Protein wurde in dem E. coli C43 Stamm exprimiert. Als Plasmid wurde pSHN-07 (pMal-tramXL-C-His-tag) verwendet und zur besseren Expression zusätzlich das pRARE Plasmid in die Zellen eingebracht. Es wurden 1 l DYT (+ 100 µg/ml Amp + 25 µg/ml CAP) mit 10 ml einer Übernachtkultur (LB Medium 200 µg/ml Amp + 25 µg/ml CAP) angeimpft. Die Zellen wurden bis zu einer Dichte von 2 x 108 Zellen bei 37 °C wachsen gelassen. Anschließend für eine weitere halbe Stunde bei 18 °C geschüttelt und mit 1 mM IPTG induziert. Die Induktion erfolgte für 5 h bei 18 °C. Die Zellen wurden bei 5 000 x g und 4 °C für 15 min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in Puffer A (25 mM Tris HCl pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 % Glycerin) resuspendiert (1 ml Puffer/1g Zellen), mit 1 mM PMSF, 1 mM MgCl2 und 10 Units DNase versetzt und direkt im Anschluss mit einer French Press bei 8 000 psi (3 Durchgänge) aufgeschlossen. Das Lysat wurde bei 4 °C und 5 000 x g für 15 min zentrifugiert, um größere Zelltrümmer und nicht aufgeschlossene Zellen zu entfernen. Der Überstand wurde mit 1 % DDM (Dodecylmaltosid) versetzt und für 1 h bei 4 °C auf einem Drehrad sanft gedreht. Danach wurde die Probe bei 14 000 x g und 4 °C für 15 min zentrifugiert. Der erste Reinigungsschritt wurde über eine Ni-Matrix durchgeführt, da das MBP-TRAM Fusionsprotein zusätzlich einen C-terminalen His-tag besitzt. Der Überstand wurde 1 : 10 mit Puffer B (25 mM Tris HCl pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 % Glycerin, 0,1 % DDM, 51 2. Material und Methoden 10 mM Imidazol) verdünnt und zu 200 µl in Puffer B äquilibrierter Ni-Sepharose Matrix gegeben. Die Bindung des Proteins an die Matrix erfolgte bei 4 °C und sanftem Drehen über Nacht. Die gesamte Probe wurde am nächsten Tag bei 2 000 x g für 5 min zentrifugiert, dabei wurde die Ni-Sepharose sedimentiert. Der Überstand wurde verworfen und die Matrix in ein 0,5 ml Säulchen überführt. Die Matrix wurde dann mit verschiedenen Imidazolkonzentrationen (10 mM, 50 mM, 150 mM) in Puffer B jeweils 2 x mit 500 µl gewaschen. Das TRAM Protein wurde mit 2 x 500 µl Puffer C (25 mM Tris HCl pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 % Glycerin, 0,1 % DDM, 500 mM Imidazol) eluiert. Die Elutionsfraktionen wurden gepoolt und eine zweite Reinigung über eine Amylosematrix angeschlossen. An diese Amylosematrix konnte der MBP-Teil des Fusionsproteins binden. 500 µl Amylosematrix wurden in Puffer A* (Puffer A + 0,1 % DDM) äquilibriert und mit den Elutionsfraktionen gemischt. Die Bindung erfolgte auf einem Drehrad, bei 4 °C über Nacht. Die Probe wurde im Anschluss daran mit 2 000 x g 5 min abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Matrix wurde auf ein Säulchen überführt und 2 x mit 0,5 ml Puffer A* gewaschen. Das MBP-TRAM Protein wurde mit 10 mM Maltose in Puffer A* eluiert. MBP-TRAM Protein, das im Anschluss für die Rekonstitution mittels Extruder eingesetzt wurde, wurde in mit Aktivkohle gereinigtem Puffer (20 mM TrisHCl pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM Maltose, 0,03 % DDM) eluiert. Das Glycerin wurde weggelassen, da es bei der Einzelmolekülspektroskopie stören kann. Außerdem wurde die Detergenzkonzentration verringert, da Detergenzien bei der Extrudermethode nicht entfernt werden und in zu hoher Konzentration die Liposomen solubilisieren. Dadurch kann die Translokation beeinflusst werden. Aliqouts der Fraktionen aller Reinigungsschritte wurden im Anschluss auf einem SDSGel aufgetragen (s. 2.3.1) und entweder eine Immundetektion (s. 2.3.4) oder eine Silberfärbung (s. 2.3.3.2) durchgeführt. 2.3.6.2 Reinigung von Aq-YidC Das Plasmid pMS + rbs-Aq-YidC wurde in C43 Zellen transformiert (s. 2.2.5.4), für eine 100 ml LB-Amp (200 µg/ml) Übernachtkultur wurden mehrere Einzelkolonien gepickt. 6 l LB-Amp Medium wurden mit 75 ml dieser Übernachtkultur angeimpft und bei 37 °C bis zu einer OD600 0,6 gezüchtet. Die Induktion erfolgte für 3 h mit 1 mM IPTG. Die Zellen wurden bei 4 °C mit 5 000 x g 15 min zentrifugiert und das Bakterienpellet in Puffer H (20 mM NaPP pH7,4, 500 mM NaCl) resuspendiert (1 ml Puffer/ 1 g Zellen). Die Zellen wurden direkt im Anschluss daran mit der French Press bei 8 000 psi in drei 52 2. Material und Methoden Durchgängen aufgeschlossen und dann 15 min bei 8 000 x g und 4 °C zentrifugiert, wodurch nicht aufgeschlossene Zellen entfernt wurden. Der Überstand wurde in flüssigem N2 eingefroren und bei – 80 °C gelagert. Zur Weiterverarbeitung wurde der Überstand auf Eis aufgetaut und in der UZ (Ti60 Rotor) bei 140 000 x g und 4 °C für 1 h zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und das Membranpellet wurde in 5 ml Puffer H resuspendiert und mit 2 % DDM versetzt. Danach wurde die Probe 10 min mit einem Potter Elvehjem homogenisiert und die Proteine wurden solubilisiert, indem die Probe mind. 2 h bei 4 °C auf dem Drehrad inkubiert wurde. Zellreste und nicht solubilisierte Proteine wurden bei 140 000 x g (TL-100) und 4 °C in 1h pelletiert. Der Überstand (Load) wurde abgenommen und mit 1,5 ml zuvor in Puffer HA (Puffer H, 0,2 % DDM, 10 mM Imidazol) äquilibrierter Ni-Sepharose Fast Flow (GE) versetzt. Die Bindung erfolgte für 1,5 h bei 4 °C auf einem Drehrad. Die Probe wurde auf ein 2,5 ml Säulchen überführt und der Durchlauf verworfen. Die Matrix wurde jetzt mehrmals mit verschiedenen Imidazol Konzentrationen gewaschen: dreimal mit je 10 ml Puffer HA (10 mM Imidazol) und zweimal mit je 10 ml Puffer HB (50 mM Imidazol). Im Anschluss wurde das Aq-YidC in 3 ml Puffer HC (500 mM Imidazol) eluiert. Die Elutionsfraktionen E1+2 wurden gepoolt und eine Gelfiltration zur Homogenisierung und weiteren Reinigung durchgeführt (s. 2.3.7), dabei wurde die HiLoad 16/60 Superdex 200 Säule und Puffer H mit 0,02 % DDM verwendet. Die entsprechenden Fraktionen wurden gepoolt und mit einer Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit (30 kDa) von Millipore auf ein Zehntel konzentriert (1 500 g). Aliquots der Fraktionen aller Reinigungsschritte wurden im Anschluss auf ein SDS-Gel aufgetragen (s. 2.3.1) und entweder eine Immundetektion (s. 2.3.4) oder eine Coomassie Färbung (s. 2.3.3.1) durchgeführt. 2.3.6.3 Reinigung von Tth-IM60 Das Tth-IM60 Protein wurde in dem E. coli Stamm C43 exprimiert und als Plasmid pSHN18 (pMS-tthIM60-C-His-tag) verwendet. Es wurden 10 l LB-Amp (50 µg/ml) Medium mit 150 ml einer Übernachtkultur angeimpft, zur besseren Belüftung der Zellen wurden 5 l Schikanekolben mit je 2 l Medium verwendet. Die Zellen wurden bei 37 °C bis zu einer OD600 von 0,6 wachsen gelassen und dann mit 0,2 mM IPTG induziert. Nach 4 h wurden die Zellen in einem Eisbad abgekühlt bei 5 000 g, 4 °C in 10 min pelletiert. Das Zellpellet wurde in 45 ml Puffer H (20 mM NaPP pH 7,4, 500 mM NaCl) aufgenommen und resuspendiert. Direkt im Anschluss daran wurden die Zellen dreimal 53 2. Material und Methoden mit einer French Press bei 8 000 psi aufgeschlossen. Um nicht aufgeschlossene Zellen und große Zellfragmente zu entfernen, wurde der Zellextrakt bei 8 000 g, 4°C für 15 min zentrifugiert. Der Überstand wurde in Stickstoff eingefroren und konnte auch für mehrere Wochen bei – 80 °C gelagert werden. Für die weitere Reinigung wurde der Überstand auf Eis aufgetaut und in einer UZ (Ti60 Rotor, 140 000 g, 4 °C, 1 h) zentrifugiert. Dabei wurden die Innenmembranen pelletiert. Das Membranpellet wurde in 50 ml Puffer P (20 mM TrisHCl pH 8,5, 500 mM NaCl, 10 % Glycerin) + 1 % LDAO (Lauryl Dimethylaminoxid) resuspendiert und mit einem Potter Elvehjem homogenisiert. Der Ansatz wurde für 2,5 h auf einem Drehrad bei 4 °C inkubiert, wodurch die Proteine solubilisiert wurden. Im Anschluss daran wurde der Ansatz wiederum in einer UZ (Ti60 Rotor, 140 000 g, 4 °C, 45 min) zentrifugiert, die solubilisierten Proteinen befanden sich im Überstand (Load). Das Protein enthält ein His10Tag und konnte daher mittels IMAC gereinigt werden. Für die Reinigung wurde ein Äkta-System mit einer 1 ml HisTrap HP Säule verwendet. Der Load wurde mit 10 mM Imidazol versetzt, filtriert und manuell direkt über Pumpe A auf die Säule geladen. Die Säule wurde nach dem Laden mit 30 ml Puffer PA (20 mM TrisHCl pH 8,5, 500 mM NaCl, 10 % Glycerin + 0,05 % LDAO + 10 mM Imidazol) gewaschen. Im Anschluss wurde das Tth-IM60 Protein über einen 40 ml Imidazol Gradienten (10-500 mM) eluiert. Die Fraktionen in denen sich das Protein befindet wurden vereinigt und 2 h gegen Puffer P + 0,05 % LDAO bei RT dialysiert (s. 2.3.6.4). Die Probe wurde dann über Nacht bei 4 °C gelagert. Am nächsten Tag wurde ein zweiter Reinigungsschritt über eine Ni-Sepharose FastFlow Matrix (GE) durchgeführt. Die Probe wurde mit 2 ml Ni-Sepharose, die zuvor in Puffer PA äquilibriert wurde, versetzt und 2,5 h auf einem Drehrad langsam inkubiert. Die gesamte Probe wurde in ein 2,5 ml Säulchen überführt und der Durchlauf verworfen. Die Matrix wurde 2 x mit 10 ml Puffer PA und 3 x mit 10 ml Puffer PA + 60 mM Imidazol gewaschen. Im Anschluss wurde das Protein eluiert, indem die Matrix 3 x mit 1 ml Puffer PB (20 mM TrisHCl pH 8,5, 500 mM NaCl, 10 % Glycerin + 0,05 % LDAO + 500 mM Imidazol) für je 15 min inkubiert wurde. Dabei wurde die Säule verschlossen und die Matrix immer wieder aufgeschlemmt. Die Elutionsfraktionen wurden gepoolt, filtriert und über eine Gelfiltrationssäule (Superdex 200 10/300 GL) getrennt (s. 2.3.7). Die entsprechenden Fraktionen wurden im Anschluss gepoolt und je nach Verwendung mit einer Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit (30 kDa) auf die gewünschte Konzentration eingeengt. 54 2. Material und Methoden Aliquots der Fraktionen aller Reinigungsschritte wurden im Anschluss auf einem SDSGel aufgetragen (s. 2.3.1) und es wurde entweder eine Immundetektion (s. 2.3.4) oder eine Coomassie Färbung (s. 2.3.3.1) durchgeführt. 2.3.6.4 Dialyse Dialyseschläuche von der Firma Carl Roth GmbH mit entsprechendem Ausschlussmolekulargewicht (14 KDa) wurden für die Dialyse vorbereitet, indem sie 2x gekocht wurden. Das erste Mal wurden sie 10 min in 2 % NaHCO3 und 1 mM EDTA gekocht. Danach mehrmals mit ddH2O gewaschen und nochmals für 10 min in ddH2O aufgekocht. Die Dialyseschläuche konnten so für eine längere Zeit in H2O bei 4°C gelagert werden. Die Probe wurde in den Schlauch gegeben, mit Clips verschlossen und je nach Anwendung 1-3-mal gegen das 100fache Volumen des gewünschten Puffers unter Rühren dialysiert. 2.3.7 Gelfiltration Eine Gelfiltration ist ein Chromatographie-Verfahren bei dem Proteine nach ihrer Größe getrennt werden. Daher dient die Gelfiltration sowohl zur Reinigung als auch zur Untersuchung der Homogenität und Größe eines Proteins. Abhängig von der verwendeten Matrix können Proteine von 0,1 bis 6 000 kDa getrennt werden. In dieser Arbeit wurde mit Superdex 200 prep grade von GE gearbeitet, das einen molekularen Trennbereich von 10 – 600 kDa besitzt. Als Chromatographie-System wurde das Äkta™ System von GE mit verschiedenen Säulen verwendet (s. u.). Säule Empfohlenes Max. Flussrate Probenvolumen Max. Druck Ausschlussvolumen (Vo) Superdex 200 10/300 GL 25 µl - 250 µl 0,5 ml/min 1,5 MPa 8 ml XK 16/40 Superdex 200 bis 2 ml 0,5 ml/min 0,5 MPa 21,6 ml HiLoad 16/60 Superdex 200 bis 5 ml 2 ml/min 0,5 MPa 46 ml 55 2. Material und Methoden Vor der Gelfiltration wurden alle verwendeten Puffer filtriert und entgast und die Säule äquilibriert. Die Proben wurden vor dem Laden auf die Säule filtriert (0,22 µm) oder bei kleinen Mengen zentrifugiert (10 min, 4 °C, 16 000 g). Dadurch wurden Verunreinigungen und Aggregate entfernt. Das maximale Probenvolumen, die Laufgeschwindigkeit und der Druck richteten sich nach der verwendeten Säule. Um die Größe der Proteine nach der Gelfiltration mit den Säulen Superdex 200 10/300 GL und XK 16/40 Superdex 200 bestimmen zu können, wurden zunächst ein Proteinstandard der Firma Sigma-Aldrich (MW-GF-200 Kit) aufgetragen und daraus nach Herstellerangaben die Standardkurven erstellt (Abbildung 2.1). Aus den Standardkurven konnten dann die Eichgeraden und damit die Funktionen ermitteln werden. Es handelt sich dabei jeweils um eine logarithmische Funktion: y a * exp(b * x) Superdex 200 10/300 GL: y 46502,69 * exp( 3,717 * x) XK 16/40 Superdex 200: y 24694,68 * exp( 3,549 * x) HiLoad 16/60 Superdex 200: y 79287,09 * exp( 4,073 * x) x = V e / Vo y = Molekulargewicht [kDa] Ve = Elutionsvolumen [ml] Vo = Ausschlussvolumen [ml] 56 2. Material und Methoden Abbildung 2.1: Gelfiltration von Standardproteinen a) + b): Elutionschromatogramme der Standardproteine c): aus den Elutionschromatogrammen ermittelte Eichgeraden der Säulen Superdex 200 10/300Gl (rot) und XK 16/40 Superdex (schwarz) 2.3.8 Rekonstitution Bei der Rekonstitution wurde das gereinigte Protein in vitro in Liposomen eingebaut und es entstanden Proteoliposomen. Mit diesen Proteoliposomen wurden in vitro Bindungsund Translokationsstudien durchgeführt. 2.3.8.1 Herstellung multilamellarer Lipidvesikel (MLV) Um Liposomen bzw. Proteoliposomen herzustellen wurden zuerst multilamellare Vesikel (MLV) benötigt. 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) bzw. E. coli Polar Lipid Extract (Anti Polar Lipids) wurden in einem Rundkolben abgewogen (100 mg) und in 3 ml Dichlormethan (DCM) und 5 Tropfen Methanol gelöst. Die Lösungsmittel wurden an einem Rotationsverdampfer entfernt (10 min bei RT), so dass sich eine dünne Lipidschicht bildete. Zum vollständigen Trocknen des Lipidfilms wurde der Kolben für mind. 6 h an eine Vakuumpumpe gehängt (Kühlfalle immer wieder mit fl. Stickstoff kühlen). Der trockene Lipidfilm wurde dann entweder in 10 ml Puffer R (20 57 2. Material und Methoden mM TrisHCl pH 7,5, 100 mM NaSO4) (DOPC) oder 5 ml H2O (E. coli Polar Lipid Extract) gelöst und mit zwei Glaskügelchen resuspendiert. Wurden die Lipide für die Einzelmolekülspektroskopie verwendet, musste der Puffer vorher mit Aktivkohle gereinigt und entgast werden. Die Lipide konnten sofort verwendet oder aber aliquotiert und bei -80 °C eingefroren werden. Während der Herstellung der Lipidvesikel war das ständige Begasen mit Stickstoff erforderlich, um die Oxidation der Lipide zu vermeiden. 2.3.8.2 Phosphatbestimmung nach Ames (Ames, 1966) Mit einer Phosphatbestimmung wurde die genaue Lipidkonzentration bestimmt. Es wurde nur mit Glaswaren gearbeitet, die mind. 1 Tag in 2 M HCl eingelegt waren, um sämtliche Phosphatreste zu entfernen. Die Lipidlösung wurde 1:10 verdünnt, so dass die Werte in der Eichgerade (0 – 70 nmol) liegen. Als Standard wurde 1 mM KH2PO4 verwendet (0-70 µl). Die Proben wurden in Pyrex-Reagenzgläser vorgelegt und mit 30 µl Lösung 1 (s. u.) gemischt und langsam unter einem Abzug über einem Bunsenbrenner verascht. Nach dem Abkühlen wurde 300 µl Lösung 2 dazugegeben. Alle Reagenzgläser wurden mit Glasmurmeln verschlossen, 15 min in kochendes Wasser gestellt und wieder abgekühlt. 700 µl Lösung 5 (s. u.) wurden dazugegeben und für 20 min bei 45 °C inkubiert. Die Absorptionsmessung wurde bei 820 nm durchgeführt und die Konzentration aus der Eichgerade berechnet. Lösungen: 1. 10 % Mg(NO)3 x 6 H2O in 95 % Ethanol 2. 0,5 M HCl 3. 10 % Ascorbinsäure 4. 0,42 % Ammoniummolybdat x 4 H2O in 0,5 M H2SO4 5. 1 Vol. Lsg.3 + 6 Vol. Lsg.4 2.3.8.3 Extrudermethode (Kuhn et al., 2010) Bei der Extrudermethode wurde gereinigtes Protein zusammen mit MLVs mehrmals durch eine Membran mit einer Porengröße von 0,4 µm gedrückt. Dadurch entstanden unilamellare Vesikel mit einer Größe von ca. 250 – 300 nm, in denen das Protein eingebaut ist, so genannte Proteoliposomen. Als Kontrolle wurden auch immer reine Liposomen (unilamellare Vesikel ohne Protein) hergestellt. 1 µl gereinigtes Tth-IM60 Protein (s. 2.3.6.2) mit einer Konzentration von 2,4 mg/ml (≙ 50 µM) wurde mit 200 µl DOPC-MLVs (5 mg/ml ≙ 6,3 mM) (s. 2.3.8.1) versetzt und kurz gevortext. Die Probe wurde 30 x mit einem Mini-Extruder von Avanti® Polar Lipids, 58 2. Material und Methoden Inc. luftblasenfrei extrudiert. Die Konzentration entsprach einem molaren Verhältnis von 1 : 25 000 (Protein : Lipid). Die Größe der Liposomen bzw. Proteoliposomen wurde in dem Particle Analyzer Coulter N4SD ermittelt. 10 µl Liposomen/Proteoliposomen wurden in 1 ml Puffer verdünnt und in einer 1 cm Glasküvette gemessen. Zur Überprüfung des Einbaus wurden die Proteoliposomen mit Puffer R auf 1 ml aufgefüllt und auf ein 60 % Saccharosekissen in Puffer R (1 ml) geladen (s. Abbildung 2.2). Die Probe wurde in der TableTop UZ (Beckmann TL-100 Rotor) bei 4 °C und 95 000 x g für 20 min zentrifugiert. Der Lipidfilm auf der Saccharoseschicht wurde vorsichtig abgenommen, genauso wie das Pellet und der Überstand. Die Proben wurden mit TCA gefällt und mittels SDS-Page und Western-Blot mit anschließender Immundetektion ausgewertet. Bei der Herstellung von Proteoliposomen, die bei der Einzelmolekülspektroskopie verwendet wurden, wurden 0,3 µl Tth-IM60 Protein (2,4 mg/ml ≙ 50 µM) bzw. 5 µl MBP-TRAM (0,5 mg/ml ≙ 6,25 µM) eingesetzt. Tth-IM60 MLVs Zentrifugation Extrusion Saccharose aggregiertes Protein Proteoliposomen Abbildung 2.2: schematische Darstellung der Rekonstitution von Tth-IM60 in Liposomen 2.3.8.4 Bio-Beads Methode (Lambert et al., 1998; Rigaud et al., 1995) Bei der Rekonstitution von MBP-TRAM mit Bio-Beads wurden die mit Detergenz gequollenen Lipide mit Protein versetzt. Das Detergenz wurde durch die Zugabe von den Bio-Beads entfernt, wodurch das Protein in die Liposomen eingebaut wurde. 60 µl E. coli Lipide (20 mg/ml) wurden mit 60 µl 4 x Puffer T (25 mM TrisHCl pH 8,0, 100 mM NaCl) und 120 µl H2O gemischt. (Lipidkonz. 5 mg/ml = 10 mM). Der Ansatz wurde im Mini-Extruder 30 x extrudiert. Die Liposomengröße wurde bestimmt (s. 2.3.8.3), um sicher zu gehen, dass die Liposomen eine einheitliche Größe haben 59 2. Material und Methoden (260-280 nm). 200 µl der restl. Liposomen wurden 1:1 mit Puffer T verdünnt (Konz. 5 mM) und mit 6 mM DDM versetzt (400 µl Liposomen + 6,12 µl DDM (20 %)). Die Liposomen wurden 3 h bei RT solubilisiert. Zur Hälfte der Liposomen (200 µl) wurde Protein im Verhältnis 20 000 : 1 dazugegeben: 1 µMol Lipid (500 µg) : 50 pMol (4,35 µg) MBP-TRAM Protein. Die andere Hälfte wurde als Kontrolle mitgeführt. Zu den Ansätzen wurden 50 mg Bio-Beads (entgast und in Puffer T gewaschen) gegeben und insgesamt 24 h durch sanftes Rühren das Detergenz entfernt, wobei die Bio-Beads nach 3 h ausgetauscht wurden. Die Ansätze wurden kurz in der Tischzentrifuge abzentrifugiert, der Überstand abgenommen und dieser mit 5 Volumenteilen eiskaltem H2O vermischt. Die Proteoliposomen/Liposomen wurden dann in der TableTop UZ (TL-100 Rotor) bei 75 000 g, 4 °C und 15 min pelletiert. Der Überstand wurde abgenommen und die Proteoliposomen/Liposomen vorsichtig in 100 µl Puffer T resuspendiert. Zur Untersuchung der Orientierung wurden je 100 µl Proteoliposomen mit 2 µl Faktor Xa bzw. 0,1 % Trypsin versetzt und 1 h bei 23 °C inkubiert. Als Kontrolle wurden 100 µl Proteoliposomen + 0,1 % Trypsin + 5 % Triton ebenfalls für 1 h bei 23 °C inkubiert. Die Proben wurden gefällt und auf einem SDS-Gel mit anschließenden Western-Blot und Immundetektion analysiert. 2.4 2.4.1 Bindungs- und Funktionsstudien Pulldown-Assay mit SecF Die gereinigten Proteine Tth-IM60 und MBP-SecF100 (zur Verfügung gestellt von Frau Dipl.-Biol. Sabrina Polzin) wurden in einem Verhältnis von 3:1 (Tth-IM60:SecF) in 1,2 ml Puffer PA (20 mM NaPP pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 Glycerin, 0,05 % DDM, 10 mM Imidazol) bei RT auf einem Drehrad 2 h inkubiert. Als Kontrollen wurden entsprechende Mengen der einzelnen Proteine mitgeführt und genauso behandelt. Nach der Inkubation wurde die Hälfte des Ansatzes entnommen (Load). Zu dem Rest wurde 75 µl in Puffer PA äquilibrierter Ni-Sepharose FastFlow gegeben und für weitere 3 h inkubiert. Der Ansatz wurde auf eine 1 ml Mobicol-Säule der Firma MoBiTec geladen und abzentrifugiert (1 000 g, 2 min, RT). Die Matrix wurde 7 x mit 500 µl Puffer PA gewaschen und abzentrifugiert (200 g, 2 min, RT). Im Anschluss wurden die gebundenen Proteine in 3 x 500 µl Puffer PA + 500 mM Imidazol eluiert. Um die Bindung von SecF100 an Tth-IM60 nachzuweisen, wurden die Proben auf einem SDSGel aufgetrennt (s. 2.3.1) und aufgrund der fast identischen Größe der beiden Proteine eine Immundetektion (s. 2.3.4) durchgeführt. 60 2. Material und Methoden 2.4.2 Einzelmolekülspektroskopie mit NC-Pf3 Die Messungen wurden an der Universität Vaihingen im 3. Physikalischen Institut durchgeführt und von Dipl.-Phys. Stefan Ernst betreut. Mit Hilfe der Einzelmolekülspektroskopie wurde die Bindung und der Einbau eines mit dem membrandurchgängigen Farbstoff ATTO 520 gelabelten Pf3 Proteins an Proteoliposomen untersucht. Der Versuch basiert dabei auf den zeitlichen Differenzen, die freie bzw. an Proteoliposomen gebundene Pf3-Moleküle benötigen, um durch ein konfokales Volumen zu diffundieren. Dadurch variiert die Länge der detektierten Photonen-Bursts und die an Proteoliposomen gebundenen Pf3-Moleküle können von freiem Pf3 unterschieden werden. Durch Zugabe von Kaliumiodid (KI) wurde außerdem jede zugängliche Fluoreszenz gequencht. Das bedeutet nur in Proteoliposomen eingebaute und dadurch geschützte Pf3-Moleküle können fluoreszieren (schematische Darstellung s. Abbildung 2.4). Für die Messung wurde ein speziell angefertigter konfokaler Versuchsaufbau verwendet, der schematisch in Abbildung 2.3 dargestellt ist (Duser et al., 2009). Abbildung 2.3: schematischer Aufbau der Einzelmolekülspektroskopie-Messung Die Probe auf dem Objektträger wird durch einen Laserpuls mit einer Wellenlänge von 488 nm (PicoTA490) in einem konfokalen Volumen angeregt. Der Laserstrahl wurde an der Blende des Objektivs (UPlanSApo 60x, n.A. 1.2) auf 100 µW abgeschwächt. Die Fluoreszenz der Pf3-Moleküle wird durch einen Strahlenteiler (488/633-638) von dem Laserlicht getrennt. Über einen dichroitischen Spiegel (630DXCR) wird das Licht unter einer Wellenlänge von 630 nm reflektiert und durch eine Lochblende und einen weiteren Filter (HQ 532/70) auf eine avalanche photo diode (APD) geleitet. Diese Diode detektiert einzelne Photonen und verstärkt diese, so dass sie über eine TCSPC Karte gezählt werden können. 61 2. Material und Methoden 2.4.2.1 Bindungsstudie Bei der Bindungsstudie wurde untersucht, ob das Pf3-Protein an Proteoliposomen, die Tth-IM60 enthalten, bindet. 30 µl Puffer R (20 mM TrisHCl pH 7,5, 100 mM NaSO 4) wurden mit 10 µl Proteoliposomen (30 – 50 µg) (s. 2.3.8.3) gemischt und mit 10 µl Fluoreszenz markiertem NC-Pf3 versetzt. Das Protein wurde von Dipl.-Biol. Ann-Kathrin Schönbauer zu Verfügung gestellt. Über eine Maleimid-Bindung ist der Farbstoff ATTO 520 an singuläre Cysteinreste im Pf3-Protein gekoppelt. Die Probe wurde sofort für 390 s analysiert. Die erhaltenen Daten wurden mit dem Programm Burst Analyzer automatisch analysiert. Folgende Parameter für die Bursts wurden für die Analyse verwendet: mind. 30 counts per ms und 50 – 200 ms Länge. Mit einem weiteren Programm (Matlap 7.1) wurden die 390 s Messzeit in 30 s Abschnitte unterteilt und die Anzahl der Bursts in den Abschnitten aus insgesamt 10 Messungen addiert. 2.4.2.2 Einbaustudie Um nicht nur die Bindung, sondern auch den vollständigen und vor allem korrekten Einbau von Pf3 coat in die Proteoliposomen zu untersuchen (Nin/Cout), wurde der gleiche Versuchsaufbau wie bei der Bindungsstudie (s. 2.4.2.1) gewählt. Durch die Zugabe von Kaliumiodid wurde die Fluoreszenz gelöscht und nur eingebaute Pf3 coat Moleküle, bei denen der N-Terminus und damit der Farbstoff in den Proteoliposomen geschützt ist, fluoreszieren. 20 µl Puffer R (20 mM TrisHCl pH 7,5, 100 mM NaSO 4) wurden mit 10 µl 1 M KI und 10 µl Proteoliposomen (30 – 50 µg) (s. 2.3.8.3) gemischt und mit 10 µl fluoreszenzmarkiertem NC-Pf3 versetzt. Die Messung erfolgte wiederum für 390 s und wurde wie bei der Bindungsstudie durchgeführt und die Daten analysiert. Bei den Messungen ist darauf zu achten, dass keine der eingesetzten Lösungen eine Eigenfluoreszenz hat, deshalb wurden diese vorher mit Aktivkohle gereinigt und vor dem Gebrauch filtriert. 62 2. Material und Methoden Abbildung 2.4: Schematische Darstellung von Bindung und Einbau von Pf3 in Proteoliposomen Die Proteoliposomen wurden mit gelabeltem Pf3 coat gemischt. Wurde kein KI dazugegeben konnte die Bindung von Pf3 coat an die Proteoliposomen untersucht werden, da sowohl eingebautes als auch gebundenes Protein fluoreszieren und sogenannte Photon-Bursts detektiert werden konnten (B). Durch Zugabe von KI wurde die Fluoreszenz gelöscht und nur richtig eingebaute Pf3-Moleküle (Nin) konnten fluoreszieren. 2.4.3 Komplementation Bei der Komplementation wurde in vivo untersucht, ob ein Protein die Funktion eines anderen ersetzen kann. In dieser Arbeit konnte die Funktion durch einen Wachstumstest untersucht werden, da YidC für die Zelle essentiell ist. Das wt yidC-Gen auf dem Genom steht dabei unter der Kontrolle eines araBAD-Promotors. Durch Zugabe von Arabinose (Ara) wurde YidC exprimiert und die Zellen konnten wachsen, bei Glucose (Glc) wurde YidC reprimiert und das Wachstum wurde eingestellt. Die verschiedenen Plasmide wurden in den YidC Depletionsstamm MK6S transformiert und auf LB-Ara-Platten + Antibiotikum ausgestrichen. Es wurden Einzelkolonien gepickt 63 2. Material und Methoden und in 2,5 ml LB-Medium + 0,2 % Ara bei 37°C bis zu einer OD von 0,5 inkubiert. Es wurde darauf geachtet, dass alle Ansätze die exakt gleiche OD besitzen, damit später das Wachstum verglichen werden konnte. Von diesen Kulturen wurden Verdünnungen von 10-2 bis 10-5 in LB-Medium hergestellt. Jeweils 3 µl dieser Verdünnungen wurden auf 0,2 % Ara, 0,2 % Glc, 0,2 % Ara + 1mM IPTG und 0,2 % Glc + 1mM IPTG LB Platten + Antibiotikum aufgetropft und über Nacht bei 37 °C inkubiert. 2.5 Zirkulardichroismus (CD) 2.5.1 Sekundärstrukturbestimmung Gereinigte Proteine (Konzentration ~ 0,1 mg/ml) wurden direkt vor der Messung 1,5 h bei RT gegen 20 mM Na–Phosphat-Puffer pH 7,4 mit 0,008 % DDM dialysiert (s. 2.3.6.4). Der Dialysepuffer wurde später bei den Messungen verwendet um die Baseline zu bestimmen. 200 µl Protein wurden in eine 0,5 mm Quartzküvette gegeben und anschließend mit dem CD-Spektrometer Jasco J-715 in einem Wellenlängenbereich von 185 – 260 nm und einer Schrittweite von 1 nm gemessen. Es wurden immer 10 Messungen gemittelt. Um die erhaltenen Spektren zu glätten wurden sie mit dem Savitzky-Golay-Filter bearbeitet. Die Berechnung der Sekundärstruktur erfolgte über den DichroWeb Online-Server im Internet (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk), dafür musste die Elliptizität (Θmdeg) in die mittlere molare Elliptizität pro Aminosäure-Rest (Θ()MRW) wie folgt umgerechnet werden: ( ) MRW M * ( ) m deg n * c * *10000 Θ()mdeg = Elliptizität [mdeg] Θ()MRW = mittlere molare Elliptizität pro AS-Rest [deg cm2/dmol] c = Protein Konzentration [g/ml] M = Molekulargewicht χ = Küvettenlänge [cm] n = Anzahl AS-Reste Die Konzentration des Proteins musste für die Berechnung sehr genau bestimmt werden, daher wurde der Proteingehalt der Probe nach der Messung mit dem LowryPetersen Test bestimmt (s. 2.3.5.3). 64 2. Material und Methoden Als Analyseprogramme wurden CONTINLL mit den Referenzdatensets 3, 4, 6 und 7 und CDSSTR mit dem Referenzdatenset 3 verwendet (Provencher & Glockner, 1981; Sreerama & Woody, 2000). 2.5.2 Schmelztemperaturbestimmung Gereinigte Proteine wurden wie bei der Sekundärstrukturbestimmung (s. 2.5.1) behandelt. Es wurde eine Schmelzkurve im Bereich von 10 – 95 °C mit einer Schrittweite von 1 °C bei einer Wellenlänge von 222 nm aufgenommen. Um den Schmelzpunkt f(Tm) = 0,5 bestimmen zu können wurde die Schmelzkurve f(T) wie folgt berechnet: f (T ) (T ) min max min Θ(T) = Elliptizität bei X °C [mdeg] Θmax = maximale Elliptizität Θmin = minimale Elliptizität 65 66 3. Ergebnisse 3. Ergebnisse 3.1 Sequenzvergleiche zwischen YidC, TRAM, Tth-IM60 und Aq-YidC Diese Arbeit befasste sich mit der Expression, Funktion und Struktur potenzieller Membraninsertasen aus T. thermophilus (Tth-IM60), A aeolicus (Aq-YidC) und X. laevis (TRAM) im Vergleich zu der essentiellen Membraninsertase YidC aus E. coli. Zunächst wurden die Aminosäuresequenzen dieser Proteine mit der Sequenz von YidC aus E. coli verglichen, um vorhandene homologe Bereiche zu identifizieren (s. Abbildung 3.1 + Abbildung 3.2). Der Vergleich zeigt, dass es zwischen TRAM und YidC nur wenige homologe Cluster gibt. Insgesamt sind ca. 15 % der Aminosäuren identisch (rot) und 29 % der Aminosäuren besitzen eine hohe Ähnlichkeit, die über das gesamte Protein verteilt sind. Der für die Funktion von YidC essentielle Bereich der Transmembranen 2-6 (354-548 AS) zeigt mit Ausnahme der 8 C-terminalen Aminosäuren nur eine geringe Ähnlichkeit. Im Gegensatz dazu ist gerade dieser Bereich bei den Proteinen Tth-IM60 und Aq-YidC im Vergleich zu YidC und auch untereinander stark konserviert. Da die 5 C-terminalen Transmembrandomänen die YidC/Oxa1/Alb3-Familie charakterisieren, können die Proteine Tth-IM60 und Aq-YidC in diese Familie eingeordnet werden. Auffällig ist, dass beide Proteine im Bereich des P1-Loops von YidC nur sehr geringe Ähnlichkeiten mit diesem und auch untereinander aufweisen. Da der größte Teil des P1-Loops jedoch für die Funktion von YidC nicht essentiell ist, sollten diese Unterschiede nur wenig Einfluss auf die Funktion haben. Durch diesen Bereich der geringen Homologie erklärt sich auch, dass die prozentualen Anteile, die keine Ähnlichkeit aufweisen, bei den Proteinen Tth-IM60 (38,1 %) und Aq-YidC (33,8 %) relativ hoch sind, aber trotzdem noch deutlich unter dem des TRAM Proteins (45,8 %) liegen (Tabelle 3.1). ______TMD1_______[_____________________________P1 Loop____________________ ::..:. * .: . * :. * * *:.*: *: :*:: . YidC_E.coli MDSQRNLLVIALLFVSFMIWQAWEQDKNPQPQAQQTTQTTTTAAGSAADQGVPASGQGKLISVKTDVLDLTINTRGGDVE 80 TRAM_X.l. -------------------MGIRKKSSKTPPVLSHEFIIQNHADIVSCLAMVFLLGLMFEITAKAAVMFVTLQYN----V 57 1.......10........20........30........40........50........60........70........80 ________________________________P1 Loop_________________________________________ : . * * : : : :. *:* : : :. : *:* : :: * ::.: .. YidC_E.coli QALLPAYPKELNSTQPFQLLETSPQFIYQAQSGLTGRDGPDNPANGPRPLYNVEKDAYVLAEGQNELQVPMTYTDAAGNT 160 TRAM_X.l. TIPVEGVLGEQASLYHYGIKDMATVFFYMLVA----------------IILHAVIQEYILDK----INRRMHFSKTKHSK 117 ........90.......100.......110.......120.......130.......140.......150.......160 ________________________________P1 Loop_________________________________________ 67 3. Ergebnisse *.:: *. . * .. :... * : . :.:.*:* * :: * : : . : : *:. . YidC_E.coli FTKTFVLKRGDYAVNVNYNVQNAGEKPLEISTFGQLKQSITLPPHLDTGSSNFALHTFRGAAYSTPDEKYEKYKFDTIAD 240 TRAM_X.l. FNESGQLS-AFYLFSCIWGAS-------IIVSENYFSDPISLWKGYPHTYFPFQMKFFYISQLAYWFHAFPELYFQKTKK 189 .......170.......180.......190.......200.......210.......220.......230.......240 ________________________________P1 Loop_________________________________________ :: *. : ::.: :: *:: : : .** : .: * YidC_E.coli NENLNISSKGGWVAMLQQYFATAWIPHNDGTNNFYTANLGNGIAAIGYKSQPVLVQPGQTGAMNSTLWVGPEIQDKMAAV 320 TRAM_X.l. ED---IPRQLVYIGLYLFHILGAYVLNLN--------RLGLVLLVLHY-------------------------------- 226 .......250.......260.......270.......280.......290.......300.......310.......320 _____P1 Loop_____________________]______TMD2______ .::: .. . *:::*: : : **:: : *:: *:* : .: :* YidC_E.coli APHLDLTVDYGWLWFISQPLFKLLKWIHSFVGNWGFSIIIITFIVRGIMYPLTKAQYTSMAKMRMLQPKIQAMRERLGDD 400 TRAM_X.l. --FVEFLFHMSRLFYFSNEKY-----------QKGFTVWALLFVLG-----------------RLLTLILCVLTVGFG-- 274 .......330.......340.......350.......360.......370.......380.......390.......400 _________TMD3___________ ______TMD4_____ :* : :::: .* * :**: ::.*: : ** * :* . * ::: YidC_E.coli KQRISQEMMALYKAEKVNPLGGCFPLLIQMPIFLALYYMLMGSVELRQAPFALWIHDLSAQDPYYILPILMGVTMFFIQK 480 TRAM_X.l. --------LARAENQELDLSNGNFN-------ILAIRISVLASICITQA-FMMWKFIN-----------------FQLRR 321 .......410.......420.......430.......440.......450.......460.......470.......480 ______TMD5______ _____TMD6_____ : .:* .*: * ..* . . . :: : .* :. :**::*:* YidC_E.coli MSPTTVTDPMQQKIMTFMPVIFTVFFLWFPSGLVLYYIVSNLVTIIQQQLIYRGLEKRGLHSREKKKS 548 TRAM_X.l. WREHSSPQPSSQRKKTTS-----------AKGKASRKEKE---NGVNGTVTSNGADSP--RSRKEKHS 373 .......490.......500.......510.......520.......530.......540........ Abbildung 3.1: Sequenzvergleich zwischen YidC und TRAM Vergleich der Aminosäuresequenzen YidC_E.coli (Uniprot: P25714) und TRAM_X.l. (Uniprot: Q6DED0) mit ClustalX. Die Zeichen oberhalb der Sequenz bedeuten: * identische AS (rot), : AS mit starker Ähnlichkeit, . AS mit schwacher Ähnlichkeit (genaue Einteilung s. 8.3). P1 Loop von YidC (24 – 354 AS). YidC: TMD1 (7 – 23 AS), TMD2 (355 – 372 AS), TMD3 (422 – 444 AS), TMD4 (464 – 478), TMD5 (494 – 509 AS) und TMD6 (513 – 526 AS) (Klenner et al., 2008). Fett: Transmembrandomänen von TRAM (Tamborero et al., 2011) ______TMD1_______[__________________________P1 Loop_________________ YidC_E.coli Aq-YidC Tth-IM60 YidC_E.coli Aq-YidC Tth-IM60 YidC_E.coli Aq-YidC Tth-IM60 YidC_E.coli Aq-YidC Tth-IM60 YidC_E.coli Aq-YidC Tth-IM60 : *: *::: : : . : -MDS-----QRNLLVIALLFVSFMIWQAWEQDKNPQPQAQQTTQTTTTAAGSAADQGVPASGQGKLISVKTDVLDLTINT 74 MMDNDNQFWKRFLIFTILMFLFITAYELFYIYYVKPSQPQKTEKKEVVKKEEFKNVNLPQLMLG----------TFREKQ 70 ---------MKRLLAAFLFLLPALALEVGFKDADVNGDGTPEKVAVTNLMDLAFDEAGQVVG-----------------W 54 1.......10........20........30........40........50........60........70........80 ________________________________P1 Loop_________________________________________ : . : *. . :. .: :: RGGDVEQALLPAYPKELNSTQPFQLLETSPQFIYQAQSGLTGRDGPDNPANGPRPLYNVEKDAYVLAEGQNELQVPMTYT 154 EYKNTKTVKLGIYSLELSEKGGKILRFIDQKYGFDLIS---------------KAERELKIFPLEIFTGNPDLDQKLNFG 135 YVKAYKGTAFGDYARAPNLAAN---------------------------------GPVLSPVGFRPLEAEFAVEDGHLLA 101 ........90.......100.......110.......120.......130.......140.......150.......160 ________________________________P1 Loop_________________________________________ : . : : : .: . *.:.. : .. : * DAAGNTFTKTFVLKRGDYAVNVNYNVQNAGEKPLEISSFGQLKQSITLPPHLDTGSSNFALHTFRGAAYSTPDEKYEKYK 234 EYEIKEGKNSVELIHKELKVKKILSYKN-GAIHLSVEGLKPPFWVFVGSPPDDE-----AFYTHVGPVLKING---EVVR 206 RFRGEEGTLTYRIPKERYTAEVTADFPL----VLKLSAQGNPKALLEGAAEPAP--------SGEGRLVYLAWQTRPKAG 169 .......170.......180.......190.......200.......210.......220.......230.......240 ________________________________P1 Loop_________________________________________ . ..** . : *:. : . FDTIADNENLNISSKGGWVAMLQQYFATAWIPHNDGTNNFYTANLGNGIAAIGYKSQPVLVQPGQTGAMNSTLWVGPEIQ 314 LDVDDLKGINEFEGNIEFGGEESRYFFKGAKDYQK--HIVYKVKLGD-----KFVSLSTFLYDGEK-----TIYLGAKDY 274 YALVAFGEGPLEGRLVGREGE---------------------VRLGP--------GEILRVYGGQN------ELVRFHVE 214 .......250.......260.......270.......280.......290.......300.......310.......320 _______________________________________]______TMD2______ : . * . :* * : *: :: : ..*.* ::*:.:*::** :::** . ** ::: * * :: :. DKMAAVAPHLDLTVDYGWLWFISQPLFKLLKWIHSFVGNWGFSIIIITFIVRGIMYPLTKAQYTSMAKMRMLQPKIQAMR 394 ARLRELG--LVDTLDWGTLKIIVKPLFLFLYWIYEHTGSWVLSILVLTFIVRIFLFPLGYKSVVSMQKLQELAPKMEKIK 352 GLLSFPG--LFSPNLWGQLSLG---LLWIMEAAYRFTGNWGLAILFLTLVVRLLLWPLMHQQFKSMAEIQRLQPLIQKIN 289 .......330.......340.......350.......360.......370.......380.......390.......400 __________TMD3__________ 68 ______TMD4_ 3. Ergebnisse YidC_E.coli Aq-YidC Tth-IM60 YidC_E.coli Aq-YidC Tth-IM60 :: ** : : * ** .** .**:*:*:*:**:: *: :: . . *** .*: *******:: : ERLGDDKQRISQEMMALYKAEKVNPLGGCFPLLIQMPIFLALYYMLMGSVELRQAPFALWIHDLSAQDPYYILPILMGVT 474 QKYKDDPVKMQEEMMKLYAETGFNPMAGCLPILLQIPIFFALYKVLIITVDLKVSSF-LWIPSLADKDPYYILPVIMGLT 431 EKYKDDPNKRAEATMKLYQEHRVNPAAGCLPLLIQMPILFILWKVIAN---YEFGQGFLWIPDLALPDPYYILPVLYVAS 366 .......410.......420.......430.......440.......450.......460.......470.......480 ____ ______TMD5______ _____TMD6_____ :: ::. : : : *..:.: **:*:.**: :..:. ::*: ** . * MFFIQKMSPTTVTDPMQQKIMTFMPVIFTVFFLWFPSGLVLYYIVSNLVTIIQQQLIYRGLEKRGLHSREKKKS 548 MILQQKMTPS--PDPKQALVGYITSVAFTLLFINFPAGLVLYWTLNNVFNIIQNYLIKEVLLKDKSKGGSKKK- 502 TFLSTWLSAHG--NRDLIRQSLFMNLIFVFLVLQFPSGVTLYWVLSTLIGLVQQWLINKSLAPLKA-------- 430 .......490.......500.......510.......520.......530.......540.......550.... Abbildung 3.2: Sequenzvergleich zwischen den YidC Proteinen aus E. coli, A. aeolicus (Aq-YidC) und T. thermophilus (Tth-IM60) Vergleich der Aminosäuresequenzen YidC_E.coli (Uniprot: P25714), Aq-YidC (Uniprot: O66561) und TthIM60 (Uniprot: Q5SL50) mit ClustalX. Die Zeichen oberhalb der Sequenz bedeuten: *: identische AS, : AS mit starker Ähnlichkeit, . AS mit schwacher Ähnlichkeit (genaue Einteilung s. 8.3).rot: identische AS, blau: identische AS zwischen YidC und Aq-YidC, grün: identische AS zwischen YidC und Tth-IM60. P1 Loop von YidC (24 – 354 AS). TMD1 (7 – 23 AS), TMD2 (355 – 372 AS), TMD3 (422 – 444 AS), TMD4 (464 – 478), TMD5 (494 – 509 AS) und TMD6 (513 – 526 AS). Tabelle 3.1: Zusammenfassung des Vergleichs der Aminosäuresequenzen Angegeben ist der prozentuale Anteil der identischen bzw. ähnlichen Aminosäuren zwischen YidC und den Proteinen TRAM, Aq-YidC und Tth-IM60. Berechnet aus dem Sequenzvergleich mit ClustalX (Abbildung 3.1 Abbildung 3.2 ) Protein identisch TRAM Aq-YidC Tth-IM60 15,3 % 27,3 % 26,5 % 3.2 große Ähnlichkeit 26,9 % 25,1 % 22,8 % geringe Ähnlichkeit 11,9 % 13,8 % 12,5 % keine Ähnlichkeit 45,8 % 33,8 % 38,1 % Optimierung der heterologen Expression in E. coli Um die Funktion der Proteine TRAM und Tth-IM60 zu analysieren, wurden sie exprimiert und gereinigt. Die Expression wurde in E. coli durchgeführt, da es eine breite Auswahl an Stämmen und Vektoren gibt und die Proteine für spätere Komplementationsversuche ohnehin in E. coli exprimiert werden mussten. Da dies in beiden Fällen eine heterologe Expression ist und beide Proteine bislang noch nicht in E. coli exprimiert wurden, musste als erstes die Expression optimiert werden. 3.2.1 Heterologe Expression von TRAM in C 43 Zellen durch die Coexpression der in E. coli seltenen tRNAs Bislang wurden TRAM-Proteine immer direkt aus Pankreaszellen von Säugern gereinigt (Görlich et al., 1992). Da dies eine zeit- und kostenintensive Reinigung ist, wurde versucht TRAM in E. coli zu exprimieren. Die Expression von TRAM-Proteinen aus einer humanen Zelllinie (TRAMp) und dem Organismus X. laevis (TRAM) wurde im Rahmen meiner Diplomarbeit (Neefe, 2004) in E. coli untersucht; keines der Proteine 69 3. Ergebnisse konnte jedoch zufriedenstellend nachgewiesen werden. Der einzige Nachweis einer TRAM-Expression gelang mit dem Protein aus X. laevis als Fusionsprotein mit MBP (Maltosebindeprotein). Basierend auf diesem Ergebnis wurden die weiteren Versuche aufgebaut und nur noch mit dem TRAM Protein aus X. laevis gearbeitet. Da unter anderem von Robinson und Kollegen festgestellt wurde, dass die Codon Usage ein wichtiger limitierender Faktor für die Expression sein kann (Robinson et al., 1984), wurde das tram-Gen dahingehend untersucht. Bei der Codon Usage handelt es sich um die unterschiedliche Häufigkeit der Codons zwischen verschiedenen Spezies, d.h. bestimmte Codons werden bevorzugt verwendet. Dies spiegelt sich auch in der Konzentration der vorhanden tRNAs wieder (Ikemura, 1981) und beeinflusst deshalb die Proteinsynthese. Die Codon Usage von E. coli B wurde mittels der Codon Usage Database (http://www.kazusa.or.jp/codon/) analysiert und ein Vergleich mit den im tramGen verwendeten Codons durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass knapp 7 % der Basentripletts (25 von 373) zu den in E. coli seltenen Codons gehören (s. Tabelle 3.2), wobei insbesondere die Codons für Arginin betroffen sind. Da das Phänomen der Codon Usage bei der heterologen Genexpression in E. coli ein häufiges Problem darstellt, wurde von Novagen der Rosetta Stamm entwickelt, der das pRARE Plasmid enthält. Dieses Plasmid besitzt, mit Ausnahme von CGG und CGA, die Gene für die in E. coli seltenen tRNAs (Novy et al., 2001). Das Plasmid wurde aus Rosetta isoliert und zusätzlich zu dem Expressionsvektor pMal - tramXl in C43 Zellen transformiert. Trotz der zusätzlichen t-RNAs konnte nur eine schwache Expression nachgewiesen werden (Neefe, 2004). Tabelle 3.2: Vergleich der Frequenz der in E. coli seltenen Codons mit dem tram-Gen Aminosäure Codon Glycin Isoleucin Leucin Prolin Arginin GGA ATA CTA CCC AGG AGA CGG CGA Frequenz ‰ in E. coli 8,2 5,0 3,4 2,4 2,1 2,4 5,0 2,4 Anzahl im tram-Gen 6 4 3 3 2 4 2 1 Frequenz ‰ tram-Gen 16,1 10,7 8,0 8,0 5,3 10,7 5,3 2,7 Um eine eventuelle Limitierung der Proteinexpression aufgrund der jetzt noch fehlenden tRNAs weiter zu reduzieren wurden die zwei verbliebenen CGG Codons für Arginin 70 3. Ergebnisse mittels QuikChange (s. 2.2.7) durch CGC ersetzt. Mit diesem Konstrukt (pSHN-07) wurden die Expressionsbedingungen hinsichtlich Wachstumstemperatur und -zeit in C43 optimiert. Die Plasmide pSHN-07 und pRARE wurden zusammen in kompetente C43 Zellen transformiert. Mit mehreren Einzelkolonien wurde je eine Vorkultur in LB + 200 µg/ml Amp + 25 µg/ml Cap hergestellt und damit am folgenden Tag die Expressionskulturen (DYT + 100 µg/ml Amp + 25 µg/ml Cap) 1:100 angeimpft. Alle Kulturen wurden erst bei 37 °C bis zu einer OD600 von 0,4 herangezogen und dann bei der entsprechenden Temperatur (18 °C, 25 °C, 37 °C) bis zu einer OD600 0,6 inkubiert und mit 1 mM IPTG induziert. Nach 1 h, 2 h, 3 h und 5 h wurde je 1 ml Kultur entnommen und 200 µl davon auf einem 12 % SDS-Gel mit anschließender Immundetektion analysiert (s. 2.3.1 und 2.3.4). Für die Immundetektion wurde der monoklonale -MBP Antikörper verwendet. Zur Kontrolle wurde der leere pMal Vektor bei 25 °C und 5 h Induktion sowie nicht induzierte Proben nach 5 h mitgeführt. Aus dem Ergebnis (s. Abbildung 3.3) ist eindeutig zu erkennen, dass die Expression bei 18 °C und 5 h Induktion am stärksten war. Weitere Untersuchungen ergaben keine Verbesserung der Expression, so dass für die weiteren Versuche folgende Parameter gewählt wurden: DYT + 100 µg/ml Amp + 25 µg/ml Cap, Zellwachstum bei 37 °C bis zu einer OD600 von 0,5, Shift auf 18 °C, Induktion bei 0,6 mit 1 mM IPTG für 5 h. Von dem Klon mit der besten Expression wurde eine 7 % DMSO-Kultur aus der Übernachtkultur hergestellt und diese in 100 µl Aliquots bei -80 °C gelagert. Für die Reinigung wurde 20 ml Vorkultur mit einem Aliquot direkt angeimpft. Abbildung 3.3: Optimierung der Expressionsbedingungen von TRAM Expression von TRAM als Fusionsprotein mit MBP bei 18 °C, 25 °C und 37 °C für 1 h, 2 h, 3 h und 5 h in C43 + pSHN 07 + pRARE. Zur Kontrolle wurde C43 + pMal, 5 h Induktion bei 25 °C (K) und die nicht induzierten Proben mitgeführt. Je 20 µl der gefällten Proben (entspricht 200 µl Zellen) wurden auf einem 12 % SDS-Gel aufgetrennt und anschließend ein Nassblot und Immundetektion mit -MBP Antikörper (1:2500 in TBS) und -Maus HRP-gekoppelter Antikörper (1:10000 in TBS) durchgeführt. Der Nachweis erfolgte über ECL, Belichtung: 1 min. 71 3. Ergebnisse 3.2.2 Heterologe Expression von Tth-IM60 in C 43 Zellen Um die Expression für das Tth-IM60 Protein zu optimieren, wurden folgende Parameter getestet: Expressionsvektor, Bakterienstamm, Temperatur, Induktionszeit und IPTGKonzentration. Für den Nachweis und eine spätere Reinigung wurde an das tthIM60Gen ein C-terminaler His10Tag kloniert. Alle Expressionsuntersuchungen wurden wie folgt durchgeführt. Die Plasmide wurden mittels TSS-Transformation in die verschiedenen Stämme transformiert. Am nächsten Tag wurden jeweils 2,5 ml LB als Vorkultur mit mehreren Einzelkolonien angeimpft und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Hauptkultur wurde 1:100 mit der Vorkultur angeimpft und bei einer OD600 von 0,6 mit IPTG induziert. Je 1ml Probe wurde nach den verschiedenen Induktionszeiten entnommen, TCA gefällt, mit Aceton gewaschen und in 100 µl SDS-Probenpuffer aufgenommen. Die Proben wurden 5 min bei 95 °C erhitzt und je 10 µl auf ein 12 % SDS-Gel aufgetragen und die Proteine aufgetrennt. Anschließend wurde ein Semidry Western Blot mit nachfolgender Immundetektion mittels eines -His-tag Antikörpers durchgeführt und die Proteinbanden über ECL auf einem Film sichtbar gemacht (s. 2.3.1 und 2.3.4). Als erstes wurde die Expression in den Stämmen BL21, C41 und C43 mit den Plasmiden pSHN-14 (pET-tthIM60) und pSHN-18 (pMS-tthIM60) untersucht (Abbildung 3.4 A). Es wurden die Proben nach 4 h Induktion mit 1 mM IPTG aufgetragen, als Kontrolle dienen die nicht induzierten Proben, die zur gleichen Zeit entnommen wurden. Es konnte eine schwache Proteinbande nach Induktion in allen drei Bakterienstämmen, allerdings nur mit pSHN-18 detektiert werden. Das war unerwartet, da pET-16b einen T7-Promotor besitzt, der für eine starke Expression in den verwendeten Stämmen entwickelt wurde, im Gegensatz zu dem eher schwächeren tac-Promotor in pMS. Daher ist anzunehmen, dass die starke Expression zu einem Translationsproblem in der Zelle führt. Dies könnte wie bei TRAM auf die Codon Usage zurückzuführen sein. Die Analyse der verwendeten Codons bei tthIM60 ergab auch hier eine Häufung von in E. coli seltenen Codons. Vor allem die beiden Tripletts CCC (25) und CGG (8) kommen verhältnismäßig oft vor. Daher wurde die Expression in Rosetta und als Vergleich in C43 mit 1 mM IPTG bei verschiedenen Temperaturen und Induktionszeiten mit pSHN18 getestet (Abbildung 3.4. B). Als Negativkontrolle wurde der leere pMS Vektor in Rosetta bei 37 °C und 4 h Induktion mitgeführt. Das Ergebnis zeigt, dass die beste Expression bei 37 °C und 4 h in C43 Zellen vorhanden war, aber auch in Rosetta wurde die Expression von Tth-IM60 72 3. Ergebnisse nachgewiesen. Daher könnte die Coexpression der pRARE tRNAs in den Stämmen C41 und C43 zu einer besseren Tth-IM60 Expression führen. Außerdem könnten die zusätzlichen tRNAs die Expression von Tth-IM60 im pET Vektor ermöglichen. Deshalb wurde das isolierte pRARE zusammen mit pSHN-14 bzw. pSHN-18 in die C41 und C43 Zellen transformiert. Die Zellen wurden mit 1mM IPTG bei 37 °C induziert und für weitere 4 h inkubiert. Zur Kontrolle wurden C43 + pSHN-18 ohne pRARE und nicht induzierte Zellen mitgeführt. Die Coexpression von pRARE in den Stämmen C41 und C43 führte zu keiner Verbesserung. Es bewirkte stattdessen, dass überhaupt keine Expression nachgewiesen werden konnte (Abbildung 3.4 C). Als nächstes wurde die Expression in den Vektoren pUC19 (pSHN-19) und pGZ119 (pSHN-15) in C43 Zellen getestet (Abbildung 3.4 D). Die Zellen wurden mit 1 mM IPTG bei 37 °C induziert und die Proben nach 4 h entnommen. Als Vergleich wurde pSHN-18 und jeweils die nicht induzierten Proben mitgeführt. Es konnte bei den induzierten Proben mit pSHN-18 und pSHN-15 eine Proteinexpression nachgewiesen werden. Die Proteinbande bei pSHN-18 war jedoch deutlich stärker als die mit pSHN-15. Da die Expression jedoch auch hier gering war, wurde zusätzlich versucht, mit der Veränderung der IPTG-Konzentration eine Verbesserung zu erreichen. Die Zellen C43 + pSHN-18 wurden bei 37 °C für 4 h mit verschiedenen IPTGKonzentrationen induziert. Das Ergebnis zeigt, dass auch die IPTG-Konzentration nur geringe Auswirkungen auf die Expression hat (Abbildung 3.4 E), wobei die Expression mit 0,2 und 0,8 mM IPTG am stärksten ist. Zusammengefasst zeigen die Versuchsergebnisse, dass die beste Expression für TthIM60 in den C43 Zellen mit dem Plasmid pSHN-18 bei 37 °C für 4 h mit 0,2 mM IPTG erreicht wurde. Um immer eine konstante Expression zu erhalten, wurde von den Zellen mit der besten Expression eine 7 % DMSO-Kultur hergestellt und bei - 80 °C gelagert. Vor jedem Versuch wurden die Zellen auf eine LB-Platte mit Ampicillin ausgestrichen und von dieser die Vorkultur angeimpft. 73 3. Ergebnisse Abbildung 3.4: Optimierung der Expressionsbedingungen von Tth-IM60 Je 10 µl der gefällten Proben (entspricht 100 µl Zellen) wurden auf einem 12 % SDS-Gel aufgetrennt und anschließend ein Semidry Western Blot und ECL Immundetektion mit -His-tag Antikörper (1:7500 in TBS) und -Maus HRP-gekoppelter Antiköper (1:12000 in TBS) durchgeführt. die Belichtung variierte je nach ECL-Kit zw. 5 min (Millipore) und 60 min (GE). Der Marker ist jeweils links in kDa angegeben A: Expression in den Stämmen BL21, C41 und C43 mit den Plasmiden pSHN-14 (pET-tthIM60) und pSHN18 (pMS-tthIM60) bei 37 °C. Proben nach 4 h Induktion mit 1 mM IPTG oder uninduziert. B: Expression in den Stämmen Rosetta und C43 mit pSHN-18 bei 37, 30 und 4 °C für 4 h bzw. 20 h mit 1mM IPTG. Als Kontrolle wurde der leere pMS Vektor in Rosetta 4 h bei 37 °C exprimiert. C: Expression in den Stämmen C41 und C43 mit pRARE + pSHN-18 bzw. pSHN-14 bei 37 °C für 4 h mit 1 mM IPTG. Als Kontrolle wurde C43 + pSHN-18 mitgeführt. D: Expression in C43 mit den Plasmiden pSHN-18, pSHN-19 (pUCtthIM60 und pSHN-15 (pGZ-tthIM60) bei 37 °C nach 4 h Induktion mit 1 mM IPTG. Als Kontrollen wurden uninduziert Proben mitgeführt. E: Expression in C43 + pSHN-18 bei 37 °C für 4 h bei verschiedenen IPTG-Konzentrationen (0,1 - 2 mM). 74 3. Ergebnisse 3.3 Reinigung der Proteine TRAM, Tth-IM60 und Aq-YidC Für spätere funktionelle und strukturelle Untersuchungen war die Reinigung der Proteine TRAM, Tth-IM60 und Aq-YidC erforderlich. 3.3.1 Reinigung von TRAM Das TRAM Protein wurde als Fusionsprotein mit einem C-terminalen His6Tag von pMalc2x in C43 + pRARE bei 18 °C für 5 h exprimiert. Dadurch ergab sich die Möglichkeit, das Protein mittels Affinitätschromatographie über zwei verschiedene Materialien nämlich Ni-Sepharose und Amylose zu reinigen. Der Ablauf der Reinigung ist in Abbildung 3.5 schematisch als Flussdiagramm dargestellt. Das Protein wurde in Puffer A (25 mM Tris HCl pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 % Glycerin) mit 1 % DDM solubilisiert und im ersten Schritt über die Ni-Sepharose Fastflow Matrix von GE gereinigt (Abbildung 3.6). Dabei wurde das Fusionsprotein über den His-tag an die Ni2+-Ionen gebunden und mittels Imidazol eluiert. Die Abbildung 3.6 A zeigt das mit Coomassie blue gefärbte 12 % SDS-Gel der einzelnen Reinigungsschritte. MBP-TRAM hat eine Größe von 82 kDa. Auf ungefähr dieser Höhe wurde ein Protein in den Elutionsfraktionen 1 + 2 (Spur 13 + 14) detektiert. Zur Verifizierung des Fusionsproteins, zur Überprüfung der Solubilisierungseffizienz und Bindung an die Ni-Matrix wurde ein Semidry Western Blot mit anschließender ECL-Immundetektion durchgeführt. Das Ergebnis in Abbildung 3.6 B zeigt, dass ein erheblicher Teil des MBP-TRAM Fusionsproteins nicht solubilisiert wurde, sondern sich nach der anschließenden Zentrifugation im Pellet befand (Abbildung 3.6 B, Spur 4). Auch die Bindung an die NiMatrix war nicht optimal, da ein Teil des Fusionsproteins nicht gebunden hat und sich im Durchlauf befand (Spur 6). Es konnte aber im Immunoblot (Abbildung 3.6 B) verifiziert werden, dass es sich bei der im SDS-Gel detektierten Bande (Abbildung 3.6 A, Pfeil) um das MBP-TRAM Protein handelt. Außerdem konnten die vermeintlichen Abbaubanden (Abbildung 3.6 B, Spuren 1 – 6, detektierte Banden unterhalb von MBPTRAM) durch diese 1. Reinigung entfernt werden. 75 3. Ergebnisse Expression und Zellaufschluss Überstand 1 l Kultur (E. coli C43 + pSHN-07 + pRARE) Induktion: 1 mM IPTG, 18 °C, 5 h 1. Zentrifugation: 5 000 x g, 4 °C, 15 min Probe 1 Pellet Resuspendierung des Zellpellets in Puffer A (1 ml / 1 g Zellen) Zellaufschluss: French Press, 8 000 psi, 3x Probe 3 Überstand Solubilisierung Probe 5 Überstand 2. Zentrifugation: 5 000 x g, 4 °C, 15 min Pellet Probe 2 Pellet Probe 4 Solubilisierung: 1 % DDM, 4 °C, 1 h 3. Zentrifugation: 5 000 x g, 4 °C, 15 min Verdünnung des Überstandes 1:10 mit Puffer B 1. Reinigung Probe 6 Überstand 1. Reinigung: Inkubation mit 200 µl NiSepharose, 4 °C, 14 h Zentrifugation: 2 000 x g, RT, 5 min Pellet Waschen: je 2 x 1 ml Puffer mit 10, 50, 150 mM Imidazol Probe 7-12 Elution: 2 x 2 ml Puffer C (500 mM Imidazol) Probe 13-14 2. Reinigung 2. Reinigung: Inkubation mit 500 µl Amylose, 4 °C, 14 h Probe 15 Überstand Zentrifugation: 2 000 x g, RT, 5 min Pellet Waschen: 2 x 0,5 ml Puffer A* Probe 16+17 Elution: 2 x 0,5 ml Puffer A* + 10 mM Maltose Probe 18+19 Abbildung 3.5: Flussdiagramm der Reinigung von TRAM als Fusionsprotein mit MBP Es ist der schematische Ablauf der Reinigung von TRAM inklusive Probenentnahme dargestellt. Die Menge der Proben wurde jeweils so gewählt und für die Analyse vorbereitet, dass die Proben 1 – 6 jeweils 100 µl Zellen, die Proben 7 – 14 jeweils 1 ml Zellen auf einem Gel entsprechen. 76 3. Ergebnisse Abbildung 3.6: Reinigung von TRAM über Ni-Sepharose Reinigungsschritte der ersten Reinigung über Ni-Affinitätschromatographie. Das Fusionsprotein MBPTRAM hat eine Größe von ~ 82 kDa Die Spuren 1 - 14 entsprechen den in Abbildung 3.5 bezeichneten Proben 1 - 14 A: Coomassie gefärbtes 12 % SDS-Gel B: Semidry Western Blot und Immundetektion mit -MBP Antikörper (1:2500 in PBS-T) und -Maus HRP-gekoppelter Antiköper (1:10000 in PBS-T), Belichtung: 1 min. M: Protein Molecular Weight Marker Spur 1: Zellen nach 5 h Expression bei 18 °C, Spur 2: Pellet nach French Press Spur 3: Überstand nach French Press, Spur 4: Pellet nach Solubilisierung Spur 5: Überstand nach Solubilisierung/ Load Spur 6: Überstand nach Bindung an NiSepharose Spur 7-12: 1.-6. Waschen mit 1 ml Puffer je zweimal mit 10 mM. 50 mM und 150 mM Imidazol Spur 13 + 14: Elutionsfraktionen 1 + 2 Elution mit 500 mM Imidazol. Für die weitere Reinigung wurden die Elutionsfraktionen vereinigt und mit der Amylose Matrix (NEB) gemischt, dabei bindet nun der N-terminale MBP-Teil des Fusionsproteins an die Amylose. Das Protein wurde mittels 10 mM Maltose eluiert. Die Abbildung 3.7 zeigt das mit Silber gefärbte 12 % SDS-Gel, auf das je 10 µl der Fraktionen aufgetragen wurde. Es ist zu sehen, dass diese zweite Reinigung eine deutliche Verbesserung des Reinigungsergebnisses brachte und die Verunreinigung durch Fremdproteine deutlich reduziert werden konnte (Vergleich Spur 1 + 5). Allerdings erfolgte auch hier keine vollständige Bindung an die Matrix (Spur 2 + 3), was dazu führt, dass die Menge und Konzentration an gereinigtem Protein relativ gering war (0,3 mg/ml). Trotzdem wurden mit diesem Protein Rekonstitutionsversuche durchgeführt, da hier zunächst der Einbau des Proteins in Liposomen untersucht wurde. 77 3. Ergebnisse Abbildung 3.7: Reinigung von TRAM über Amylose Reinigungsschritte der zweiten Reinigung über eine Amylose-Matrix auf einem Silber gefärbten 12 % SDS-Gel. Es wurden je 10 µl der Fraktionen aufgetragen. Spur 1: Load, Spur 2: Durchlauf, Spur 3 + 4: 1. + 2. Waschen mit 1 ml Puffer A + 0,02 % DDM Spur 5 + 6: 1. + 2. Elution mit 10 mM Maltose. 3.3.2 Das Reinigung von Aq-YidC Aq-YidC Protein wurde wie in 2.3.6.2 beschrieben gereinigt. Das Reinigungsprotokoll von Aq-YidC wurde von Dipl. Biol. S. Grenz entwickelt (Grenz, 2008) und ist zur besseren Übersicht schematisch als Flussdiagramm in Abbildung 3.8 dargestellt Um ausreichend Protein zu erhalten, wurden für eine Reinigung 6 l C43 Zellen gezüchtet, die das Plasmid pMS+rbs-Aq-YidC enthalten. Dieses Plasmid enthält das aq-yidC Gen mit einem C-terminalen His10Tag hinter einem IPTG induzierbaren tac-Promotor. Die Induktion mit 1 mM IPTG erfolgte bei einer OD von 0,6 bei 37 °C für 3 h. Die Reinigung wurde in zwei Schritten in Natriumphosphat Puffer (NaPP) pH 7,4 durchgeführt. Als erster Reinigungsschritt wurde eine Ni-Affinitätschromatographie durchgeführt. Das in DDM solubilisierte Aq-YidC Protein wurde im Batch Verfahren an eine Ni-Sepharose Matrix (GE) gebunden, die anschließend in eine Leersäule gegeben wurde. Das Aq-YidC Protein wurde dann mit 500 mM Imidazol eluiert. Die verschiedenen Wasch- und Elutionsfraktionen der 1. Reinigung wurden auf einem Coomassie gefärbten 12 % SDS-Gel analysiert (s. Abbildung 3.9 A). Da das Protein nach diesem ersten Reinigungsschritt noch nicht sauber genug war (Spur 7 - 9), wurden die Elutionsfraktionen 1 und 2 vereinigt und eine Gelfiltration mit der HiLoad 16/60 Superdex 200 Säule durchgeführt. Dabei wurde das Protein nicht nur weiter gereinigt sondern auch entsalzt und die Größe und Homogenität untersucht. Das Chromatogramm ist in Abbildung 3.9 B abgebildet, die Elutionsfraktionen 27 – 41 78 3. Ergebnisse wurden auf einem 12 % SDS-Gel aufgetragen und dieses mit Silber gefärbt (Abbildung 3.9 C). Expression und Zellaufschluss Überstand 6 l Kultur (E. coli C43 + pMS+rbs-Aq-YidC) Induktion: 1 mM IPTG, 37 °C, 3 h 1. Zentrifugation: 5 000 x g, 4 °C, 15 min Pellet Resuspendierung des Zellpellets in Puffer H (1 ml / 1 g Zellen) Zellaufschluss: French Press, 8 000 psi, 3x Überstand Solubilisierung Überstand 1. Reinigung 2. Zentrifugation: 8 000 x g, 4 °C, 15 min Pellet 1. Ultrazentrifugation: 140 000 x g, 4 °C, 1 h Pellet Solubilisierung des Membranpellets in 5 ml Puffer H + 2 % DDM, 4 °C, 2 h 2. Ultrazentrifugation: 140 000 x g, 4 °C, 1h Pellet 1. Reinigung: Inkubation mit 1,5 ml NiSepharose, 4 °C, 1,5 h Überführung der Probe auf eine 2,5 ml Säule Probe 1 Waschen: 3 x 10 ml Puffer HA (10 mM Imidazol) Probe 2-4 Waschen: 2 x 10 ml Puffer HB (50 mM Imidazol) Probe 5+6 Elution: 3 x 1 ml Puffer HC (500 mM Imidazol) Probe E1-3 2. Reinigung: vereinigen der Elutionsfraktionen 1 + 2, Gelfiltration (HiLoad 16/60 Superdex 200) Probe 1-60 2. Reinigung Konzentration der vereinigten Elutionsfraktionen auf 1/10 des Ausgangsvolumen mit Amicon Ultra-15, 1 500 x g, RT Abbildung 3.8: Flussdiagramm der Reinigung von Aq-YidC Das Diagramm zeigt schematisch den Ablauf der verschiedenen Reinigungsschritte von Aq-YidC und die entnommenen und analysierten Proben. 79 3. Ergebnisse Bei dem Chromatogramm sind zwei dominante homogene Peaks zu erkennen. Der vordere Peak (1) ist der Aq-YidC Proteinpeak, dieser befindet sich bei 76,9 ml. Der zweite Peak wurde durch das Imidazol hervorgerufen. Zur Bestimmung des Molekulargewichts wurde die Funktion y 79287,09 * exp( 4,073 * x) , die aus der Eichgerade der Standardproteine ermittelt wurde, verwendet (s. 2.3.7). Das Molekulargewicht des bei 76,9 ml eluierten Proteins entspricht danach ~88 kDa. Das tatsächliche Molekulargewicht von Aq-YidC beträgt 58 kDa. Wurde die DDM-Micelle, die eine Durchschnittsgröße von 50 kDa besitzt, mit einbezogen, ist davon auszugehen, dass das Protein als Monomer vorliegt. Durch die Gelfiltration konnten auch die meisten Verunreinigungen entfernt, bzw. deutlich verringert werden (s. Abbildung 3.9 C). Abbildung 3.9: Reinigung von Aq-YidC Die Abbildungen zeigen das Ergebnis nach den verschiedenen Reinigungsschritten. Die Aq-YidC Proteinbande ist jeweils mit einem Pfeil markiert. A: Fraktionen nach 1. Reinigung über eine NiSepharose FF Matrix auf einem Coomassie gefärbten 12 % SDS-Gel. Spur 1: Durchlauf (6,8 µl), Spur 2 - 4: 1. - 3. Waschen mit 10 mM Imidazol (16 µl), Spur 5 + 6: 4. + 5. Waschen mit 59 mM Imidazol (16 µl), Spur 7 – 9: Elutionsfraktionen 1 – 3 (5 µl). B: Chromatogramm der Gelfiltration, der Elutionsfraktionen 1+2 (Spuren 7+8, A), Säule: HiLoad 16/60 Superdex 200, Flussrate: 1 ml/min, Load: 2 ml E1+2. Peak 1: Aq-YidC (Ve = 76,9 ml) Peak 2: Imidazol C: silbergefärbtes 12 % SDS-Gel der Gelfiltrationsfraktionen Spur 1 -15: Elutionsfraktionen 27 – 41, je 10 µl von 2 ml. 80 3. Ergebnisse 3.3.3 Reinigung von Tth-IM60 Während bei den Reinigungen von Aq-YidC und TRAM zum Teil auf Ergebnisse von früheren Arbeiten zurückgegriffen werden konnte (Grenz, 2008; Neefe, 2004), musste das Reinigungsprotokoll für Tth-IM60 neu erarbeitet werden. Dabei wurde nicht nur auf die Reinheit, sondern auch auf die Homogenität und Ausbeute besonderen Wert gelegt, da insbesondere für die Kristallstrukturanalysen eine hohe Konzentration (10 mg/ml) von homogenem Tth-IM60 vorliegen muss. Besonders wichtig in diesem Zusammenhang ist, dass das Protein nicht während oder nach der Reinigung aggregiert. Da die Optimierung der Reinigung aufwendig und sehr zeitintensiv war, wird sie in diesem Kapitel ausführlicher dargestellt. Für die ersten Reinigungen wurden 250 ml Zellen gezüchtet und das Protein mit 2 % ASB14 bzw. 2 % DDM aus der Membranfraktion solubilisiert. Das Tth-IM60 Protein wurde im Batch an Ni-Sepharose FF (GE) gebunden und mit Imidazol eluiert. Die Reinigungsschritte wurden auf einem mit Coomassie gefärbten SDS-Gel analysiert (Abbildung 3.10. A + B). Bei beiden Reinigungen hat das Protein an die Matrix gebunden und konnte mit 500 mM Imidazol eluiert werden, allerdings sind in den Elutionsfraktionen (A + B, Spur 11) noch weitere Proteinbanden zu erkennen. Das Bandenmuster der mit Coomassie gefärbten Gele ist bei beiden Reinigungen mit den verschiedenen Detergenzien sehr ähnlich und auch die Menge an isoliertem Tth-IM60 ist vergleichbar (vgl. Abbildung 3.10 A, Spuren 8-11 und B, Spuren 8-11). Die Immundetektion (Abbildung 3.10 C + D) bestätigt bei beiden Reinigungen die Bindung an die Matrix, da im Durchlauf (Spur 8) und in den Waschschritten (Spur 9 + 10) kein Protein detektiert werden konnte. Allerdings war die Solubilisierung mit ASB14 (Abb. D, Spur 7) effizienter als mit DDM (Abb. C) und auch die Elutionsbande (Spur 11) war bei der Reinigung mit ASB14 etwas intensiver. Da das Reinigungsergebnis jedoch nicht zufriedenstellend war, wurde versucht dieses zu optimieren. Eine Möglichkeit, die Reinigung von Proteinen aus thermophilen Organismen zu verbessern, besteht in der Eigenschaft der Hitzestabilität dieser Proteine. Durch Erhitzen des Gesamtextrakts auf 60 - 70 °C werden die meisten E. coli Proteine denaturiert und können als Aggregate abzentrifugiert werden, während die hitzestabilen Proteine löslich bleiben. Doch weder das Erhitzen direkt nach der Solubilisierung noch nach der Reinigung haben das Ergebnis deutlich verändert. Eine weitere Möglichkeit war, die Reinigung nicht im Batch durchzuführen sondern über eine FPLC. Als FPLC wurde das Äkta System mit einer HisTrap Säule verwendet und 81 3. Ergebnisse die Reinigung wie in Kapitel 2.3.6.2 beschrieben durchgeführt. Durch die Kombination der beiden Reinigungen konnte eine deutliche Verbesserung (s. Abbildung 3.10 E) erzielt werden. Spur 1 zeigt das Protein nach der ersten Reinigung mit dem Äkta System und Spur 2 die Elutionsfraktion nach der 2. Reinigung. Abbildung 3.10: Vergleich der Reinigung von Tth-IM60 mit DDM und ASB14 250 ml C43 Zellen mit pSHN-18 gezüchtet und bei 37 °C für 4 h mit 0,2 mM IPTG induziert. Nach dem Ernten (5 000 g, 15 min, 4 °C) wurden die Zellen in Puffer H (20 mM NaH 2PO4 pH 7,4, 500 mM NaCl) resuspendiert und mit der French Press bei 8 000 psi aufgeschlossen. Die Proben wurden erst für 15 min mit 8 000x g und dann für 1 h mit 140 000 g, bei 4 °C zentrifugiert. Das Membranpellet wurden in 1 ml Puffer H resuspendiert, je 500 µl wurden mit 2 % ASB14 bzw. 2 % DDM für 1h bei RT solubilisiert. Die Proben wurden in der UZ bei 140 000 g, 1h und 4 °C zentrifugiert und der Überstand erst 1:10 mit Puffer H verdünnt und mit 200 µl Ni-Sepharose Matrix versetzt. Die Matrix wurde nach der Inkubation (3 h) 2 x mit 500 µl Puffer H + 10 mM Imidazol und 2 x mit 500 µl Puffer H + 50 mM Imidazol gewaschen. Das Protein wurde dann mit 500 mM Imidazol eluiert. Es wurden, wenn nicht anders erwähnt je 100 µl Zellen der einzelnen Reinigungsschritte auf 12 % SDS-Gele aufgetrennt und mit Coomassie gefärbt A: Solubilisierung und Reinigung mit DDM B: Solubilisierung und Reinigung mit ASB14. C + D: Nassblot und Immundetektion mit -His-tag Antikörper (1 : 10 000 in TBS) und -Maus Antikörper (1 : 5 000), 45 min Belichtungszeit. C: Solubilisierung und Reinigung mit DDM D: Solubilisierung und Reinigung mit ASB14. Spur 1: ganze Zellen Spur 2: Pellet nach French Press (FP) (≙ 50 µl Zellen) Spur 3: Überstand nach FP Spur 4: Pellet nach 1. UZ (≙ 50 µl Zellen) Spur 5: Überstand nach 1. UZ Spur 6: Pellet nach 2. UZ (≙ 1,25 ml Zellen) Spur 7: Überstand 2. UZ (≙ 1,25 ml Zellen) Spur 8: Durchlauf (≙ 5 ml Zellen) Spur 9: 1. Waschen (≙ 1,25 ml Zellen) Spur 10: 3. Waschen (≙ 1,25 ml Zellen) Spur 11: 1. Elution (≙ 1,25 ml Zellen) E: Reinigung über das Äkta System mit anschließender Batch Reinigung mit ASB14, silbergefärbtes 12 % SDS-Gel Spur 1: Elutionsfraktion 17 nach 1. Reinigung (5 µl) Spur 2: Elution 1 nach Batch Reinigung. Die Pfeile markieren das Tth-IM60 Protein 82 3. Ergebnisse 3.3.3.1 Die Homogenitätsuntersuchung nach der Reinigung Homogenität von Tth-IM60 wurde mittels Gelfiltration und Blue-Native Gelelektrophorese untersucht. Anhand dieser Methoden lassen sich auch die tatsächliche Größe der Proteine und damit der monomere oder oligomere Zustand bestimmen. Das Tth-IM60 Protein wurde sowohl mit ASB14 als auch mit DDM in 20 mM Na2HPO4 pH 7,4 gereinigt und je 90 µl auf einem Blue-Native Gel aufgetragen (s. 2.3.2). Das Gel ist in Abbildung 3.11 A abgebildet. Das in ASB14 gereinigte Protein wurde in mehrere Banden (60, 190 und > 440 kDa) aufgetrennt (Spur 1). Das deutet daraufhin, dass das Protein nicht homogen, sondern in mehreren oligomeren Zuständen vorliegt. Anders sieht es bei dem in DDM gereinigten Protein aus (Spur 2). Hier ist nur eine deutliche Bande bei ca. 180 kDa zu sehen. Diese Größe könnte durch die Bindung von zwei bis drei Proteinmolekülen in einer DDM Micelle, die eine Größe von 50 – 70 kDa besitzt, entstehen. Um dieses Ergebnis zu bestätigen, wurde eine Gelfiltration durchgeführt. Als Säule wurde die XK 16/40 Superdex 200 verwendet und mit je 1 ml Proteinlösung geladen. Die Chromatogramme wurden übereinander gelegt und zeigen, dass das Protein sowohl in ASB14 (rot), als auch in DDM (blau) homogen vorliegt (Abbildung 3.11). Allerdings eluieren sie bereits bei 23,67 ml (DDM) bzw. 24,63 ml (ASB14), das entspricht laut Standardkurve einem Molekulargewicht von 500 kDa bzw. 430 kDa. Da eine Auftrennung mit der verwendeten Superdex 200 Matrix in diesem hohen Molekulargewichtsbereich nur bedingt möglich ist, ist das errechnete Molekulargewicht nicht sehr aussagekräftig. Definitiv lässt sich sagen, dass das Protein sowohl in DDM als auch in ASB14 nicht als Mono- bzw. Dimer vorliegt, sondern während oder nach der Reinigung aggregiert. Allerdings können große Aggregate aufgrund ihrer Größe abzentrifugiert werden, dies ist hier jedoch nicht der Fall. Weitere Gelfiltrationen haben gezeigt, dass dieser Zustand sich auch bei längerer Lagerung bei 4 °C nicht verändert und daher sehr stabil ist. Für Kristallisationsansätze sollte das Protein in erster Linie homogen und wenn möglich im gleichen oligomeren Zustand wie in der Membran vorliegen, deshalb wurde versucht die heterogene Verteilung von Mono- und Oligomeren des Proteins mit weiteren Gelfiltrationen zu untersuchen. 83 3. Ergebnisse Abbildung 3.11: Homogenität und Größenbestimmung mit Blue-Native Page und Gelfiltration A: Blue-Native Page (4 -13 %) mit gereinigtem Tth-IM60 Protein in den Detergenzien ASB14 und DDM. M1: 15 µl Marker 1 (5 mg/ml BSA + 5 mg/ml Apoferritin), M2: 15 µl Marker 2 (5 mg/ml -Amylase), Spur 1: 27 µg Tth-IM60 in Puffer H + 0,004 % ASB14, Spur 2: 27 µl Tth-IM60 in Puffer H + 0,05 % DDM. B: Gelfiltration mit gereinigtem Tth-IM60 (je 1ml ≙ 0,25 mg Protein) in Puffer H (20 mM NaPP pH 7,4, 500 mM NaCl) und 0,004 % ASB14 (rot) bzw. 0,05 % DDM (blau). Säule: XK-16/40 Superdex 200, Fließgeschwindigkeit: 0,35 ml/min. 1 und 2 markieren die Elutionspeaks von Tth-IM60. Beide liegen bei 24 ml und damit nur knapp über dem Ausschlussvolumen der Säule von 21,6 ml. 3.3.3.2 Detergenz- und Pufferanalyse mittels Gelfiltration Die Gelfiltration des Tth-IM60 Proteins hat eindeutig gezeigt, dass das Protein nach der Reinigung in Natrium-Phosphat Puffer pH 7,4 (NaPP) und den Detergenzien ASB-14 und DDM oligomer vorliegt. Eine Aggregation konnte ausgeschlossen werden, da das Protein nicht pelletierbar war. Da das Ergebnis der Blue-Native Gelelektrophorese darauf hinweist, dass das Tth-IM60 in DDM zumindest zum Teil als Di- oder Trimer vorhanden ist, musste überprüft werden, wann das Protein oligomerisiert. Die Aggregate können bereits beim Solubilisieren oder während der Reinigung entstehen. Um zu untersuchen, in welcher Form das Protein nach dem Solubilisieren vorliegt und ob es Unterschiede zwischen verschiedenen Puffern und Detergenzien gibt, wurde eine Gelfiltration sofort nach dem Solubilisieren durchgeführt. Es wurden die Puffer 20 mM NaPP pH 7,4, 20 mM TrisHCl pH 7,4 und 8,5 und NaOAc pH 5,2 verwendet. Als Detergenzien wurden DDM, LDAO, Fos-Cholin-14, C8E5 und SDS getestet. SDS wurde mitgeführt um einen Anhaltspunkt für das Elutionsverhalten zu erhalten, wenn das 84 3. Ergebnisse Protein denaturiert vorliegt. Auf ASB-14 wurde verzichtet, da das Tth-IM60 weder mit der Gelfiltration noch der Blue-Native Page als Monomer bzw. Dimer vorlag. Um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten, wurde der Überstand nach dem Zellaufschluss aus insg. 20 l Zellen in 2,5 ml Aliquots (≙ 800 ml Zellen) aufgeteilt und bei -80 °C gelagert. Je ein Aliquot wurde aufgetaut und bei 140 000 x g für 1 h und 4 °C zentrifugiert. Das Membranpellet wurde dann in je 2 ml der verschiedenen Puffer aufgenommen, resuspendiert und die Proteine bei 4 °C und 2 h unter sanftem Drehen solubilisiert. Danach wurde die Probe ein weiteres Mal bei 140 000 x g für 45 min und 4 °C zentrifugiert und 500 µl des Überstandes direkt auf die Superdex 200 10/300 GL Säule geladen und aufgetrennt. Die Elutionsfraktionen (0,5 ml) wurden gesammelt und die Fraktionen 6-25 (≙ 7,5 – 15,5 ml Elutionsvolumen) mit TCA gefällt und auf einem 12 % SDS-Gel aufgetrennt. Das Tth-IM60 wurde mittels Western-Blot und Immundetektion nachgewiesen (s. Abbildung 3.12). Das Ergebnis zeigt, dass sowohl der pH-Wert als auch das Detergenz einen starken Einfluss auf das Protein haben. Auffällig dabei ist, dass nach der Solubilisierung mit DDM das Protein über viele Fraktionen und damit über einen weiten Molekulargewichtsbereich verteilt eluiert (A - C) wird. Wird Tth-IM60 jedoch mit den Detergenzien LDAO (E), Fos-Cholin-14 (F), C8E5 (G) und SDS (H) solubilisiert, eluiert es deutlich definierter. Die Fraktionen 11 – 18, in denen sich das Tth-IM60 nach der Solubilisierung mit DDM befindet, entsprechen einer molekularen Größe von 70 – 450 kDa. Der Peak befindet sich vermutlich in Fraktion 14/15 und würde einem Molekulargewicht von ca. 180 kDa entsprechen. Durch den weiten Grössenbereich ist es jedoch sehr wahrscheinlich dass das Protein in mehreren oligomeren Zuständen vorkommt. Bei den Detergenzien LDAO (70 – 180 kDa), Fos-Cholin-14 (60 – 180 kDa) und C8E5 (90 – 180 kDa) ist der Größenbereich viel geringer und da es jeweils einen klaren Peak gibt, kann davon ausgegangen werden, dass das Protein in diesen Fällen homogen vorliegt. Als Detergenz für die Reinigung wurde in der Folge LDAO verwendet, da dieses Detergenz außerdem zu den am häufigsten eingesetzten Detergenzien bei Kristallisationen von Membranproteinen gehört (http://www.mpdb.tcd.ie). Als Puffer wurde TrisHCl pH 8,5 ausgewählt, da aufgrund der Ergebnisse mit DDM gezeigt werden konnte, dass das Protein in diesem zu niedrigen Oligomerenzuständen tendiert (Vergleich C mit A, B und D). 85 3. Ergebnisse Abbildung 3.12: Detergenzscreen Die Membranfraktion aus 800 ml Zellen wurde in 2 ml der verschiedenen Puffer homogenisiert und für 2 h bei 4 °C solubilisiert (DDM 1 %, LDAO 1 %, Fos-Cholin-14 1 %, C8E5 2 %, SDS 1 %). 500 µl des Überstandes nach der UZ wurde über eine Gelfiltration Sephadex 10/300 Säule aufgetrennt und in 0,5 ml Fraktionen gesammelt. Die kompletten Fraktionen 6 - 25 wurden mit TCA gefällt, in 100 µl Probenpuffer aufgenommen und je 10 µl auf ein 12 % SDS-Gel geladen. Im Anschluss wurde ein Semidry Western Blot mit Immundetektion (-His-tag Antikörper) durchgeführt. 6 – 25: Elutionsfraktionen A: Puffer: 20 mM NaPPh pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,05 % DDM. B: Puffer: 20 mM TrisHCl pH 7,4, 300 mM NaCl, 10 % Glycerin, 0,05 % DDM. C: Puffer: 20 mM TrisHCl pH 8,5, 500 mM NaCl, 0,05 % DDM. D: Puffer:20 mM NaAc pH 5,2, 500 mM NaCl, 0,05 % DDM. E: Puffer: 20 mM TrisHCl pH 8,5, 500 mM NaCl, 0,05 % LDAO. F: Puffer: 20 mM TrisHCl pH 8,5, 500 mM NaCl, 0,05 % Fos-Cholin-14. G: Puffer: 20 mM TrisHCl pH 8,5, 500 mM NaCl, 0,5 % C8E5. H: Puffer: 20 mM TrisHCl pH 8,5, 500 mM NaCl, 0,3 % SDS. 3.3.3.3 Reinigung von Tth-IM60 mit LDAO als Dimer Da die Expression von Tth-IM60, trotz Optimierung, relativ gering war, mussten für eine Reinigung 10 – 30 l Zellen gezüchtet werden, um ausreichend Protein zu erhalten (s. 3.2.2). Die endgültige Reinigung von Tth-IM60 wurde wie in Kapitel 2.3.6.2 beschrieben durchgeführt und ist als Schema in Abbildung 3.13 zusammengefasst. Als Detergenz wurde aufgrund der Ergebnisse des Detergenzscreens LDAO und als Puffer 20 mM TrisHCl pH 8,5 mit 500 mM NaCl verwendet (s. 3.3.3.2). 86 3. Ergebnisse Expression und Zellaufschluss 10 l Kultur (E. coli C43 + pSHN18) Induktion: 0,2 mM IPTG, 37 °C, 4 h 1. Zentrifugation: 5 000 x g, 4 °C, 10 min Pellet Resuspendierung des Zellpellets in Puffer H (1 ml / 1,5 g Zellen) Zellaufschluss: French Press, 8 000 psi, 3x Überstand 2. Zentrifugation: 8 000 x g, 4 °C, 15 min 1. Ultrazentrifugation: 140 000 x g, 4 °C, 1 h Solubilisierung Überstand 1. Reinigung Solubilisierung des Membranpellets in 50 ml Puffer P + 1 % LDAO, 4 °C, 2,5 h 2. Ultrazentrifugation: 140 000 x g, 4 °C, 45 min 1. Reinigung: Äkta-System: HisTrap 1 ml, 40 ml Imidazol Gradient (10 - 500 mM) Elutionsfraktionen vereinigen Dialyse: 1 l Puffer P + 0,05 % LDAO, 1x, 2 h 2. Reinigung 2. Reinigung: Inkubation mit 2 ml Ni-Sepharose, 4 °C, 2,5 h Waschen: 2 x 10 ml Puffer PA (10 mM Imidazol) 3 x 10 ml Puffer PB (60 mM Imidazol) Elution: 3 x 1 ml Puffer PC (500 mM Imidazol) 3. Reinigung 3. Reinigung: Gelfiltration (Superdex 200 10/300 GL), Puffer P + 0,05 % LDAO Konzentrierung der Elutionsfraktionen (Amicon Ultra-15, 1 500 g, RT) Abbildung 3.13: Flussdiagramm der Reinigung von Tth-IM60 87 Pellet 3. Ergebnisse Das Protein wurde aus dem Membranpellet mit 1 % LDAO solubilisiert und als erstes über eine Metallaffinitätschromatographie mit dem Äkta System gereinigt. Als Säule wurde eine 1 ml HisTrap HP von GE verwendet. Die Elutionsfraktionen (8 - 12 ml) wurden sofort für 2 h dialysiert, um das Imidazol zu entfernen. Als zweiter Reinigungsschritt wird das Protein im Batch wiederum an eine Ni-Matrix gebunden und in insgesamt 3 ml Puffer eluiert. Dieser Schritt dient der Konzentrierung des Proteins, so dass die gesamte Menge direkt im Anschluss auf eine Gelfiltrationssäule geladen werden konnte. Das Ziel war, dass das Tth-IM60 Protein auch nach der Reinigung noch als Dimer vorhanden ist und sich im Vergleich zur Solubilisierung nicht verändert. Es wurden Proben nach der 1. und 2. Reinigung und das konzentrierte Protein nach der Gelfiltration auf einem 12 % SDS-Gel analysiert. Das Ergebnis zeigt, dass die Reinigung mit LDAO sehr gut funktioniert und dass nach der Gelfiltration keine Verunreinigungen mehr sichtbar sind (Abbildung 3.14 A). Diente die 2. Reinigung vor allem der Konzentrierung, wurde auch ein deutlicher Reinigungseffekt erzielt, obwohl bei beiden Reinigungen mit einer Ni-Matrix gearbeitet wurde. Das Chromatogramm der Gelfiltration zeigt eindeutig, dass der größte Teil des Proteins mit LDAO auch nach der Reinigung nicht aggregiert (Abbildung 3.14 B, Pfeil). Aber auch mit LDAO liegt ein Teil des Tth-IM60 Proteins in einem oligomeren Zustand vor (Peaks 1+2). Durch die Gelfiltration können die Oligomere jedoch abgetrennt und es konnte mit dem homogenen Protein weitergearbeitet werden. Der Elutionspeak (Pfeil) liegt bei 13,05 ml, das entspricht einer molekularen Größe von ca. 110 kDa. Daraus lässt sich schließen, dass das Protein mit einer Größe von 48 kDa als Dimer vorliegen muss, da die LDAOMicelle eine mittlere Größe von 17 kDa hat. Auffällig bei allen Reinigungen war eine weitere Proteinbande bei ca. 30 kDa (Abb. A: Stern). Das Protein wurde durch Peptid-Massen-Fingerprint-Analyse (PMF) als L2 Protein identifiziert (s. 3.7.2) 88 3. Ergebnisse Abbildung 3.14: Reinigung von Tth-IM60 in LDAO A: Coomassie gefärbte 12 % SDS-PAGE verschiedener Reinigungsschritte aus 20 l Zellen. Es wurden je 5 µl aufgetragen Spur 1: Elutionsfraktion der 1. Reinigung über eine 1 ml HisTrap-Säule, Spur 2: Elutionsfraktion E1 nach der 2. Reinigung über Ni-Sepharose FF, Spur 3: vereinigte und konzentrierte Fraktionen E16-20 nach der Gelfiltration B: Chromatogramm der Gelfiltration (Superdex 200 10/300 GL). Der Elutionspeak (Pfeil) liegt bei 13,05 ml Weitere Untersuchungen haben ergeben, dass bei längerer Lagerung des Proteins bei 4 °C nach der zweiten Reinigung, der Anteil an oligomerem Protein steigt (Abbildung 3.15 A). Das Protein eluiert dann verstärkt bei 8,9 ml, das entspricht einem Molekulargewicht von ca. 740 kDa (Peak 1). Interessant ist dabei, dass das Protein ansonsten sehr stabil ist, nicht weiter aggregiert und daher nicht durch Zentrifugation pelletierbar ist. Außerdem bilden sich auch nach mehreren Wochen keine Abbaubanden (Abbildung 3.15 B). Wird das Protein dagegen in saurem Puffer (pH 5,5 – 6,5) gelagert, verschwindet der Peak bei 8,9 ml und auch der Dimer Peak wird mit sinkendem pH-Wert immer niedriger (Abbildung 3.15 A). Bei der Zentrifugation vor der Gelfiltration dieser Proben entsteht auch ein deutliches Proteinpellet. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Protein sehr stabil bei 4 °C und in TrisHCl pH 8,5 vorliegt und insbesondere der oligomere Zustand des Proteins bei pH 8,5 nicht zu weiteren Aggregationen führt. Die Lagerung bei niedrigen pH-Werten dagegen führt dazu, dass das Protein sehr schnell aggregiert. 89 3. Ergebnisse Abbildung 3.15: Stabilität von Tth-IM60 bei verschiedenen pH-Werten A: Gelfiltrationen von gereinigtem Tth-IM60 (200 µl ≙ 90 µg) nach der Lagerung bei 4 °C in verschiedenen pH Werten. Das in LDAO und TrisHCl pH 8,5 gereinigte Protein wurde nach der 2. Reinigung in je 250 µl Aliquots aufgeteilt und mittels NaOAc verschiedene pH Werte eingestellt. Als Säule wurde die Superdex 200 10/300 GL verwendet und Puffer P (20 mM TrisHCL pH8,5, 500 mM NaCl, 0,05 % LDAO) als Laufpuffer. Chromatogramme: rot: pH 8,5 direkt nach 2. Reinigung blau: pH 8,5 Tag 4 grün: pH 7.0, Tag 4 hellblau: pH 6,5 Tag 4 rosa: pH 6,0 Tag 4 schwarz: pH 5,5 Tag 4 B: Coomassie gefärbte 12 % SDS-Gele von in Puffer P gereinigtem Tth-IM60 (5 µl) nach einem und nach 50 Tagen. 3.4 In vivo Funktionsanalyse von TRAM und Tth-IM60 Um zu untersuchen, ob die beiden Proteine TRAM und Tth-IM60 die gleiche Funktion wie YidC besitzen, wird ein in vivo Komplementationsversuch durchgeführt, der auf der Eigenschaft beruht, dass YidC essentiell für die Viabilität von E. coli ist (Samuelson et al., 2000). Dabei wird untersucht, ob die Proteine in der Lage sind, YidC vollständig oder teilweise in der Bakterienzelle zu ersetzen. Die Komplementation wird im E. coli Stamm MK6S (s. 2.1.4) durchgeführt. Dieser ist ein YidC-Depletionsstamm, bei dem das wt-yidC Gen durch einen araBAD Promotor reguliert wird. Dadurch lässt sich das YidC gezielt durch Arabinose (Ara) induzieren oder durch Glucose (Glc) reprimieren. Die zu testenden Gene werden mittels Plasmid in die Bakterienzelle transformiert und mit IPTG induziert. Das Wachstum der Zellen wird dann auf verschiedenen LB-Agar Platten getestet. Sind die Proteine TRAM und Tth-IM60 in der Lage YidC zu ersetzen, sollten die Zellen auf Glucose mit IPTG wachsen, da auf diesem Medium zwar das chromosomale yidC durch Glucose reprimiert wird, aber die Gene auf den Plasmiden durch IPTG induziert werden. 90 3. Ergebnisse Für die Komplementation wurden die Plasmide pSHN-15 (pGZ-tthIM60) und pSHN-07 (pMal-tram) mittels TSS-Transformation (s. 2.2.5.4) in den MK6S Stamm transformiert. Die entsprechenden Vektoren mit wt-yidC bzw. ohne Insert dienen als Positiv- bzw. Negativkontrolle (s. Tabelle 3.3). Verdünnungsreihen der verschiedenen Kulturen wurden auf entsprechenden Selektivplatten aufgetropft und bei 37 °C inkubiert (Abbildung 3.16). Tabelle 3.3: Übersicht der verwendeten Plasmidkonstrukte Ansatz Plasmidkonstrukt Ansatz Plasmidkonstrukt 1 pGZ-tthIM60 4 pMal-tram 2 pGZ-yidC 5 pMal-yidC 3 pGZ 6 pMal-c2x Auf den LB-Ara Platten (Abbildung 3.16, oberste Reihe) ist in allen Ansätzen gleichmäßiges Zellwachstum zu beobachten. Dies dient als Vergleich der eingesetzten Zellzahl zwischen den einzelnen Ansätzen. Auf den LB-Glc-IPTG Platten (unterste Reihe) ist eindeutiges Zellwachstum bei den Ansätzen 1 (pGZ-tthIM60) und 2 (pGZyidC) zu beobachten, nicht jedoch bei der entsprechenden Negativkontrolle (Ansatz 3, pGZ). Da auf LB-Glc-IPTG nur das plasmidkodierte Gen exprimiert wird, während das chromosomale yidC-Gen reprimiert ist, bedeutet das, dass Tth-IM60 in der Lage ist, YidC in E. coli vollständig zu ersetzen und somit die gleichen essentiellen Funktionen besitzt. Anders sieht es dagegen bei der Komplementation mit pMal als Vektorsystem (Ansätze 4 – 6) aus. Hier ist auf den LB-Glc-IPTG Platten kein Wachstum zu beobachten, auch nicht bei der Positivkontrolle pMal-yidC (Ansatz 5). Die Tatsache, dass in diesen Fällen auch auf den LB-Ara-IPTG Platten kein Wachstum vorhanden ist, lässt darauf schließen, dass allein die Expression der Vektorgene (MBP), für die Zellen bereits letal ist. Die Komplementation lässt sich aufgrund des Zellwachstums der Positivkontrolle (Ansatz 5) auf den glucosehaltigen Platten (dritte Reihe) trotzdem mit pMal als Vektor überprüfen. Das Wachstum zeigt, dass der Promotor eine Basisaktivität besitzt und bereits uninduziert ausreichende Mengen an YidC Protein für das Zellwachstum exprimiert und zum anderen, dass das Fusionsprotein funktionell sein muss. Da bei Ansatz 4 (pMal-tram) auch auf LB+Glc kein Zellwachstum zu erkennen ist, lässt sich keine Komplementation von TRAM nachweisen. Dies bedeutet, dass TRAM YidC in E. 91 3. Ergebnisse coli nicht ersetzen kann. Es ist jedoch möglich, dass TRAM einzelne Funktionen von YidC übernehmen kann. Abbildung 3.16: Komplementation von YidC durch TRAM und Tth-IM60 -3 Die Abbildung zeigt jeweils die 10 -Verdünnung auf den einzelnen LB-Agar Platten. Es wurden je 3 µl auf die verschiedenen LB-Platten aufgetropft und über Nacht bei 37°C inkubiert. Spur 1: pGZ-tthIM60, Spur 2: pGZ-yidC, Spur 3: pGZ, Spur 4: pMal-tram, Spur 5: pMal-yidC, Spur 6: pMal-c2x 3.5 Rekonstitution von TRAM und Tth-IM60 in Liposomen Funktionelle Untersuchungen von Membranproteinen in ihrer natürlichen Umgebung bzw. in lebenden Zellen erweisen sich aufgrund der vielen verschiedenen Interaktionen mit anderen Proteinen als schwierig und die Interpretationen der Ergebnisse sind sehr komplex. Als sehr gute experimentelle Alternative hat sich der Einbau gereinigter Membranproteine in Phospholipid-Vesikel erwiesen. Diese sogenannten Proteoliposomen können für die Untersuchung spezieller Funktionen, insbesondere für den Transport, Insertionsprozesse oder Translokationen von Proteinen verwendet werden. Auch die Insertase-Funktion von YidC wurde unter anderem in Proteoliposomen nachgewiesen (du Plessis et al., 2006; Serek et al., 2004; Stiegler et al., 2010; Winterfeld et al., 2009). Um diese Translokationsstudien auch mit den Membranproteinen TRAM und Tth-IM60 durchzuführen, mussten diese zunächst in Liposomen rekonstituiert werden. Für die Rekonstitution der Proteine TRAM und Tth-IM60 wurden zwei verschiedene Methoden angewandt. 92 3. Ergebnisse 3.5.1 Rekonstitution von MBP-TRAM in Liposomen mittels Bio-Beads Die Rekonstitution von TRAM wurde mit der Bio-Beads Methode durchgeführt (s. 2.3.8.4), da die Konzentration des gereinigten Fusionsproteins MBP-TRAM (0,3 mg/ml) für die Extruder Methode zu gering war. Es wurden zwei Rekonstitutionsansätze mit den Verhältnissen 1 : 10 000 und 1 : 20 000 (Protein : Lipid) durchgeführt. Als Detergenz wurde DDM und als Lipidsystem der E. coli Polar Lipid Extrakt (Avanti Polar Lipids) verwendet. Um den Einbau des Fusionsproteins in die Liposomen zu verfolgen, wurden während der Rekonstitution verschiedene Proben entnommen, gefällt und auf einem 12 % SDS-Gel durch eine Silberfärbung analysiert (Abbildung 3.17). Das MBP-TRAM wurde in die Liposomen eingebaut (s. Spur 4 und 7), allerdings gab es während der Rekonstitution einen hohen Verlust an Protein (Vergleich mit Spur 1). Das liegt wahrscheinlich an den Bio-Beads, die durch hydrophobe Wechselwirkungen auch Proteine binden können. Überraschend ist auch die Tatsache, dass das Verhältnis Protein zu Lipid die Rekonstitution zu beeinflussen scheint. Bei der doppelten Menge Protein im Ansatz 1 (1 : 10 000, Spur 4) wurde insgesamt eher weniger eingebaut als in Ansatz 2 (1 : 20 000, Spur 7). Abbildung 3.17: Rekonstitution von TRAM in Liposomen Silbergefärbtes 12 % SDS Gel. Spur 1: eingesetzte Menge MBP-TRAM Spuren 2 - 4: Ansatz 1 (Molekulares Verhältnis Protein : Lipid: 1 : 10 000) Spuren 5 – 7: Ansatz 2 (1 : 20 000) Spur 2 + 5: Probe nach dem Einbau (25 µl ≙ 1/12 des Ansatzes) Spur 3 + 6: Überstand nach Zentrifugation Spur 4 + 7: Proteoliposomenpellet nach Zentrifugation Für die Verwendung dieser Proteoliposomen ist nicht nur der Einbau, sondern auch die Orientierung des Proteins im Lipidlayer wichtig. Um diese zu testen, wurde die Rekonstitution im Verhältnis 1 : 20 000 wiederholt und die Proteoliposomen mit den Proteasen Faktor Xa und Trypsin versetzt. Das Fusionsprotein besitzt vor dem TRAM Protein eine Faktor Xa Schnittstelle, wodurch der MBP Teil des Fusionsproteins abgespalten werden kann. Das native TRAM Protein besitzt 8 Transmembrandomänen und beide Termini sind im Cytoplasma lokalisiert. Bei Proteoliposomen gilt, dass das Lumen das Periplasma darstellt, da Proteine von der cytoplasmatischen Seite (außen) 93 3. Ergebnisse ins Periplasma (innen) transloziert werden. Das bedeutet, dass der N-terminale MBPAnteil des Fusionsproteins bei korrekter Membrantopologie nach außen gerichtet ist und nicht vor einem Proteaseverdau durch Trypsin geschützt ist. Die Faktor Xa Schnittstelle ist ebenfalls zugänglich und der Faktor Xa kann dadurch den MBP-Teil von TRAM abspalten (Abbildung 3.18 A). Der Einbau konnte nur über einen Western-Blot mit anschließender ECL- Immundetektion mit -MBP Antikörper analysiert werden, da die Proteinmengen für eine Detektion mit Silber nicht ausreichend waren und kein Antikörper gegen das TRAM Protein zur Verfügung stand. Das Ergebnis zeigt, dass das Fusionsprotein in beiden Orientierungen vorliegt, da es mit Faktor Xa geschnitten wurde, aber gleichzeitig der MBP-Teil vor dem Trypsin Verdau geschützt war (Abbildung 3.18 B). Der Vergleich der MBP-Banden zeigt eindeutig, dass mehr Protein vor Trypsin geschützt ist, als durch den Faktor Xa geschnitten wird. Daher wurde die falsche Orientierung bei der Rekonstitution bevorzugt. Weitere Rekonstitutionsversuche haben keine Verbesserung gebracht. Abbildung 3.18: Proteaseverdau der MBP-TRAM Proteoliposomen Proteaseverdau der Proteoliposomen zur Überprüfung der Orientierung von MBP-TRAM in den Proteoliposomen. A: schematische Darstellung der beiden möglichen Orientierungen B: Proteaseverdau von je 100 µl Proteoliposomen für 1 h bei 23 °C mit 0,1 % Trypsin , 2 µl Faktor Xa, und 0,1 % Trypsin + 5 % Triton. Kontrolle ohne Protease wurde genauso behandelt. Die gesamten Ansätze wurden mit 10 % TCA gefällt, in 40 µl Probenpuffer aufgenommen und je 20 µl geladen. 12 % SDS-Gel mit anschließenden Nassblot und ECL-Immundetektion mit -MBP Antikörper (1:2500 in PBS-T) und -Maus Antikörper (1:10000 in PBS-T), Belichtung: 1 min. 3.5.2 Rekonstitution von Tth-IM60 in Liposomen mittels Extruder Die Rekonstitution von Tth-IM60 wurde mit der Extrudertechnik durchgeführt, da mit dieser bereits die Rekonstitution von E. coli YidC in Liposomen durchgeführt und funktionelle Proteoliposomen hergestellt werden konnten (Kuhn et al., 2010). Die Rekonstitution wurde wie in Kapitel 2.3.8.3 beschrieben, mit gereinigtem Tth-IM60 und DOPC-Lipiden, durchgeführt. Um den Einbau von Tth-IM60 in die Lipidlayer zu 94 3. Ergebnisse überprüfen, wurde die Probe nach dem Extrudieren mit 800 µl Puffer R (20 mM TrisHCl pH 7,5, 100 mM NaSO4) versetzt, auf ein Saccharosekissen (60 %) gegeben und zentrifugiert. Dadurch werden Proteoliposomen, die sich nach der Zentrifugation auf der Grenzschicht zur Saccharose befinden, von eventuell aggregiertem Protein (Pellet) und freiem Protein (Überstand), getrennt. Um außerdem eine Aussage über die Effizienz der Rekonstitution machen zu können, wurden als Vergleich verschiedene Proben vor und nach der Rekonstitution und der Zentrifugation entnommen und auf einem 12 % SDSGel mit anschließendem Western-Blot analysiert. Das Ergebnis zeigt die erfolgreiche Rekonstitution von Tth-IM60 in die DOPCLipidvesikel (Abbildung 3.19). Es wurde sowohl in der Spur 1 (eingesetzte Menge an Tth-IM60), Spur 2 (Probe nach der Extrusion) und Spur 5 (Proteoliposomen) Tth-IM60 Protein detektiert, aber nicht in den Spuren 3 und 4 (Pellet und Überstand). Allerdings ist ein deutlicher Verlust des Proteins bereits nach der Extrusion auffällig (Vergleich der Proteinbanden in Spur 1 und 2). Zwar wurde in Spur 2 nur 50 % der Menge aus Probe 1 aufgetragen, allerdings ist die Proteinbande trotzdem deutlich schwächer. Der Verlust wurde während der Zentrifugation noch höher (Vergleich Proteinbande in Spur 2 und 5). Der große Unterschied vor und nach der Zentrifugation kann jedoch durch ein Problem beim Entnehmen der Proteoliposomen erklärt werden. Die Lipidschicht ließ sich nur unvollständig pipettieren, da sie an der Wand der Zentrifugenröhrchen haften blieb. Deshalb wurde besonderen Wert auf das saubere und vollständige Abnehmen des Überstandes (4) und des Pellets (3) gelegt. Da in diesen beiden Proben keine Proteinbande (Spur 3 und 4) detektiert wurde, ist trotz der Proteinabnahme davon auszugehen, dass das nach der Extrusion vorhandene Tth-IM60 vollständig in die Liposomen eingebaut wurde. 95 3. Ergebnisse A 1 2 3 4 B 5 Tth-IM60 4 5 3 Abbildung 3.19: Rekonstitution von Tth-IM60 in Liposomen A: Verschiedene Proben nach der Rekonstitution von gereinigtem Tth-IM60 in DOPC-Lipidvesikel. Auftrennung auf einem 12 %igen SDS-Gel mit anschließendem Semidry Western Blot und ECLImmundetektion mit -His-tag Antikörper (1:10000 in TBS) und -Maus Antikörper (1:12500 in TBS), Belichtung: 5 min. Spur 1: eingesetzte Menge Tth-IM60 (50 µM) Spur 2: Probe nach der Extrusion Spur 3: Pellet nach UZ Spur 4: Überstand nach UZ Spur 5: Proteoliposomen B: schematische Darstellung der entnommenen Proben nach der Zentrifugation: 3: Pellet, 4: Überstand, 5: Proteoliposomen 3.6 3.6.1 Strukturanalyse der YidC Homologe Tth-IM60 und Aq-YidC Bestimmung der Sekundärstrukturen mittels Zirkulardichroismus (CD) Um mehr über die Struktur der Proteine Tth-IM60 und Aq-YidC zu erfahren und diese vor allem mit YidC zu vergleichen wurde eine CD-Spektroskopie durchgeführt (2.5). Da die Spektren miteinander vergleichbar sein sollen, wurden die Proteine Aq-YidC und Tth-IM60 in DDM solubilisiert und gereinigt. Das Spektrum von YidC, das als Vergleich verwendet wurde, wurde von Dr. U. Gerken erstellt (Winterfeld et al., 2009). Die erhaltenen Werte wurden wie in 2.5.1 beschrieben in die mittlere molare Elliptizität pro AS-Rest (ΘMRW) umgerechnet und die Schaubilder übereinander gelegt (s. Abbildung 3.20 A). Bei dem Vergleich der Spektren miteinander sind einige Unterschiede zwischen den thermophilen Proteinen und YidC erkennbar. Die Spektren von Tth-IM60 (rot) und Aq-YidC (blau) haben einen deutlich höheren ersten Peak bei 193 nm, während der Peak von YidC (schwarz) bei 194 nm liegt. Auch der Bereich zwischen 205 und 225 nm zeigt bei den thermophilen Proteinen einen deutlich negativeren Peak. Durch den Vergleich mit Spektren von -Helix- und -Faltblattstrukturen (Abbildung 3.20 B) deuten die Spektren darauf hin, dass die Proteine Tth-IM60 und Aq-YidC einen höheren Anteil an -helikalen Strukturen enthalten als YidC. 96 3. Ergebnisse Abbildung 3.20: Zirkulardichroismus Spektrum von YidC, Tth-IM60 und Aq-YidC Schwarz: YidC in 10 mM KPP pH 7,4 + 0,008 % DDM Rot: Tth-IM60 in 20 mM NaPP pH 7,4 + 0,008 % DDM blau: Aq-YidC in 20 mM NaPP pH 7,4 + 0,008 % DDM Die Sekundärstruktur lässt sich mit verschiedenen Programmen berechnen. In dieser Arbeit wurden die Berechnungen auf dem DichroWeb Onlineserver durchgeführt und die Programme Contin-LL und CDSSTR verwendet. In Tabelle 3.4 sind die Ergebnisse der Berechung zusammengefasst. Der berechnete helikale Anteil liegt für Tth-IM60 zwischen 46 % und 55 %, für AqYidC zwischen 50 % und 57 % und für YidC zwischen 35 % und 38 %. Das Ergebnis bestätigt die Annahme, dass die Proteine Tth-IM60 und Aq-YidC einen deutlich höheren helikalen Anteil besitzen als E. coli YidC. Der Anteil von Faltblatt Strukturen ist bei Aq-YidC mit 8 % bis 11 % am geringsten, bei Tth-IM60 liegt er zwischen 11 % und 16 % und der höchste Anteil konnte bei YidC mit 14 % bis 20 % berechnet werden. Der Anteil an Schleifen ist bei den Proteinen Tth-IM60 (14 % – 18 %) und Aq-YidC (15 % – 18 %) vergleichbar, bei YidC ist der Anteil mit 19 % – 24 % etwas höher. Der Rest wird als unordered oder random coil bezeichnet und hat einen Anteil von 18 % – 22 % (Tth-IM60), 20 % - 23 % (Aq-YidC) bzw. 25 % - 28 %(YidC). 97 3. Ergebnisse Tabelle 3.4: Sekundärstruktur von Tth-IM60, Aq-YidC und YidC Sekundärstrukturgehalt der Proteine Tth-IM60, Aq-YidC und YidC in Prozent. Berechnung mit den Programmen Contin-LL und CDSSTR auf dem DichroWeb Onlineserver. Zur besseren Übersicht wurden nur die Durchschnittswerte angeben. Das vollständige Ergebnis ist im Anhang (8.2.2) dargestellt. Protein Programm Contin Set3 Contin Set4 Contin Set6 Contin Set7 CDSSTR Set3 Contin Set3 Contin Set4 Contin Set6 Contin Set7 CDSSTR Set3 Contin Set3 Contin Set4 Contin Set6 Contin Set7 CDSSTR Set3 Tth-IM60 Aq-YidC YidC 3.6.2 Helix 46 % 50 % 49 % 52 % 55 % 50 % 52 % 51 % 52 % 57 % 36 % 37 % 35 % 37 % 38 % Faltblatt 16 % 11 % 16 % 11 % 13 % 11 % 9% 11 % 8% 9% 15 % 14 % 15 % 14 % 20 % Schleife 17 % 17 % 18 % 17 % 14 % 18 % 17 % 18 % 17 % 15 % 24 % 22 % 22 % 21 % 19 % unordered 21 % 22 % 18 % 21 % 18 % 21 % 23 % 20 % 23 % 20 % 26 % 27 % 28 % 28 % 25 % Bestimmung der Schmelztemperaturen von Tth-IM60 und Aq-YidC Mit CD-Messungen können nicht nur Sekundärstrukturen ermittelt werden, sondern auch die Faltungsstabilität von Proteinen in verschiedenen Puffern oder bei verschiedenen Temperaturen. Die Stabilität wird überprüft, indem die Elliptizität bei 222 nm gemessen wird. Bei dieser Wellenlänge besitzt die -Helix ihr Maximum. Kommt es zu Veränderungen der Struktur ändert sich damit die Elliptizität und die Entfaltung des Proteins kann somit verfolgt werden. Da die Proteine Tth-IM60 und AqYidC aus thermophilen Bakterien stammen, ist die Temperaturstabilität dieser Proteine von großem Interesse. Deshalb wurden die Schmelzkurven und damit die Schmelztemperaturen dieser beiden Proteine bestimmt. Die Schmelzkurven der Proteine Aq-YidC (blau) und Tth-IM60 (rot) wurden wie in 2.5.2 beschrieben erstellt und sind zusammen mit der Schmelzkurve von YidC (schwarz) in Abbildung 3.21 dargestellt. Die Messungen mit YidC wurden von Dr. U. Gerken durchgeführt. Bei beiden thermophilen Proteinen findet der Übergang zwischen dem nativen und denaturierten Zustand sehr schnell statt, bei Aq-YidC zwischen 85 °C und 94 °C und bei Tth-IM60 zwischen 63 °C und 75 °C. Davor kommt es zwar bei beiden Proteinen zu kleineren Strukturänderungen, aber insgesamt sind sie stabil. Im 98 3. Ergebnisse Gegensatz dazu ist bei YidC der Übergang zwischen nativen und denaturiertem Zustand sehr langsam. Bereits bei 35 °C kommt es zu Veränderungen der Sekundärstruktur, die erst am Ende der Messung (90 °C) abgeschlossen sind. Aus den Schmelzkurven lässt sich die Schmelztemperatur der Proteine (f(T) = 0,5) bestimmen. Aq-YidC besitzt demnach eine Schmelztemperatur von 87 °C, Tth-IM60 von 68 °C und die Schmelztemperatur von YidC ist mit 58 °C am niedrigsten. Abbildung 3.21: Schmelzkurven von Aq-YidC, Tth-IM60 und YidC Schmelzkurven der Proteine Aq-YidC (blau) und Tth-IM60 (rot) gemessen in 20 mM NaPP pH 7,4 + 0,008 % DDM, YidC (schwarz) gemessen in 20 mM KPP pH 8,0 + 0,008 % DDM. Die Schmelztemperatur (f(T) = 0,5) von Aq-YidC liegt bei 87 °C, von Tth-IM60 bei 68 °C und von YidC bei 58 °C. 3.7 3.7.1 Interaktion von Tth-IM60 mit Translokasekomponenten Bindung von Tth-IM60 an SecF Die Proteine der YidC/Oxa1/Alb3-Familie interagieren mit verschiedenen Translokasekomponenten. In Koreinigungsexperimenten konnte nachgewiesen werden, dass die E. coli Proteine SecDFyaiC zusammen mit YidC einen heterotetrameren Komplex bilden (Nouwen & Driessen, 2002). Weitere Analysen haben ergeben, dass die Bindung 99 3. Ergebnisse über die Aminosäuren 215 – 265 des P1 Loops von YidC an SecF erfolgt (Xie et al., 2006). Pulldown-Assays, durchgeführt an unserem Institut, weisen außerdem darauf hin, dass bei SecF die 1. periplasmatische Domäne (42-148 AS) für die Interaktion ausreichend ist (Polzin, 2008). Um die Interaktion von Tth-IM60 mit E. coli SecF zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit analoge Pulldown-Assays durchgeführt. Dies ist eine in vitro Methode, um Bindungspartner eines Proteins, das als ‚bait‟ bezeichnet wird, zu identifizieren. Das bait Protein besitzt dabei die Fähigkeit, an eine Matrix zu binden. Bindungspartner (prey), die an das bait Protein binden, können gemeinsam mit diesem eluiert werden. Als bait Protein wurde hier das gereinigte Tth-IM60 Protein verwendet, das einen C-terminalen His-tag besitzt und als Matrix die Ni-Sepharose FastFlow. Das SecF Protein wurde mir von S. Polzin als gereinigtes Fusionsprotein MBP-SecF100 zur Verfügung gestellt. Dieses Fusionsprotein besteht nur aus dem 1. periplasmatischen Loop (42 -148) von SecF und dem Maltosebindeprotein (MBP) (Polzin, 2008). Für den Versuch wurden 6 µg Tth-IM60 und 2 µg MBP-SecF100 gemeinsam in Anwesenheit von Detergenz 2 h bei RT inkubiert und nach der Zugabe von 75 µl NiSepharose eine weitere Stunde inkubiert (s. 2.4.1). Die Matrix wurde in ein Säulchen überführt, 7 x gewaschen und dann die Proteine mit 500 mM Imidazol eluiert. Alle Proben wurden gesammelt und mit TCA gefällt. Da beide Proteine eine ähnliche Größe haben, wurde zur Detektion eine Immundetektion mit verschiedenen Antikörpern durchgeführt. Als Kontrolle wurden die beiden Proteine einzeln mitgeführt. Das Ergebnis des Pulldown-Assay ist in Abbildung 3.22. dargestellt und zeigt eine Bindung von MBP-SecF100 an Tth-IM60 (Abb. B: Spur E1 + E2). Allerdings ist die Bindung eher schwach, da sich die größte Menge an MBP-SecF100 im Durchlauf und im ersten Waschschritt befindet (Abb. B: Spur D und 1). Die Kontrolle mit Tth-IM60 zeigt, dass das gesamte Protein an die Matrix gebunden hat (Abb. A: Spur E1) während die Negativkontrolle von MBP-SecF100 ohne Tth-IM60 keine Bindung an die Matrix aufweist (Abb. C: Spur E1). Da die Negativkontrolle eindeutig ist, lässt sich auch mit Sicherheit sagen, dass das Fusionsprotein MBP-SecF100 an Tth-IM60 und nicht an die Matrix gebunden hat. Obwohl ein Drittel weniger MBP-SecF100 Protein im Vergleich zu TthIM60 für den Versuch eingesetzt wurde, war die Proteinbande im Load aufgrund der unterschiedlichen Antikörper deutlich stärker. Da die Proteine über eine Immundetektion mit ECL detektiert wurden, ließ sich eine genaue Quantifizierung nicht durchführen. 100 3. Ergebnisse Aufgrund der Stärke der Banden ist jedoch davon auszugehen, dass weniger als 1 % MBP-SecF100 gebunden hat. Abbildung 3.22: Interaktion von SecF100 mit Tth-IM60 Pulldown-Assay mit Tth-IM60 und MBP-SecF100. Es wurde 6 µg Tth-IM60 und 2 µg MBP-SecF100 eingesetzt. Die Proben wurden auf einem 8 % SDS-Gel aufgetrennt und ein Semidry Western Blot durchgeführt. L: eingesetzte Menge an Protein, D: nicht gebundene Proteine, 1-7: Waschschritte, E1-3: Elutionsfraktionen A: Immundetektion mit -His-tag Antikörper (1 : 7500) B: Immundetektion mit -MBP Antikörper (1 : 10 000) C: Negativkontrolle Pulldown-Assay ohne Tth-IM60, Immundetektion mit -MBP Antikörper (1 : 10 000). 3.7.1.1 Homologien zwischen T. thermophilus TSecDF und E. coli SecF Da eine Interaktion zwischen SecF100 und Tth-IM60 nachgewiesen werden konnte (s. 3.7.1), wurde ein Sequenzvergleich zwischen E. coli SecF und T. thermophilus TSecDF durchgeführt. Es ist bekannt, dass das in T. thermophilus vorkommende homologe SecF Protein, auch Sequenzähnlichkeiten zu E. coli SecD aufweist und daher als TSecDF bezeichnet wird. Es ist mit 735 AS deutlich größer als die beiden einzelnen Proteine aus E. coli (SecF: 323 AS, SecD: 615 AS) und hat vermutlich 12 Transmembrandomänen. Der Vergleich wurde mit dem Programm ClustalX durchgeführt und ist in Abbildung 3.23 dargestellt, in rot sind gleiche Aminosäuren hervorgehoben. Von besonderem Interesse ist der Bereich der 1. periplasmatischen Domäne von SecF (fett hervorgehoben), da nur dieser für den Bindungsassay eingesetzt wurde. Auffällig ist hier, dass vor allem der Nund C-terminale Bereich (471 – 481 und 563 – 573) des Loops eine hohe Sequenzähnlichkeit aufzeigt. Weitere hoch konservierte Bereiche befinden sich zwischen 588 – 589, 606 – 613, 639 – 655, 674 – 693 und 715 – 726, wobei insgesamt 35 % der Aminosäuren, bezogen auf SecF, identisch sind. 101 3. Ergebnisse SECF_ECOLI -------------------------------------------------------------------------------TSECDF_Tth MNRKNLTSLFLLGVFLLALLFVWKPWAPEEPKVRLGLDLKGGLRIVLEADVENPTLDDLEKARTVLENRINALGVAEPLI 80 1.......10........20........30........40........50........60........70........80 SECF_ECOLI -------------------------------------------------------------------------------TSECDF_Tth QIQGQKRIVVELPGLSQADQDRALKLIGQRAVLEFRIVKEGATGTTVAQINQALRENPRLNREELEKDLIKPEDLGPPLL 160 ........90.......100.......110.......120.......130.......140.......150.......160 SECF_ECOLI -------------------------------------------------------------------------------TSECDF_Tth TGADLADARAVFDQFGRPQVSLTFTPEGAKKFEEVTRQNIGKRLAIVLDGRVYTAPVIRQAITGGQAVIEGLSSVEEASE 240 .......170.......180.......190.......200.......210.......220.......230.......240 SECF_ECOLI -------------------------------------------------------------------------------TSECDF_Tth IALVLRSGSLPVPLKVAEIRAIGPTLGQDAIQAGIRSALIGTLAIFLLIFAYYGPHLGLVASLGLLYTSALILGLLSGLG 320 .......250.......260.......270.......280.......290.......300.......310.......320 :: * *:*. *:*: SECF_ECOLI -----------------------MAQEYTVEQLNHGRKV----------------------------------------- 16 TSECDF_Tth ATLTLPGIAGLVLTLGAAVDGNVLSFERIKEELRAGKKLRQAIPEGFRHSTLTIMDVNIAHLLAAAALYQYATGPVRGFA 400 .......330.......340.......350.......360.......370.......380.......390.......400 _________TMD1________ ::** :. . : ** * :: .:***:.:***** SECF_ECOLI -----------------------------------------YDFMRWDYWAFGISGLLLIAAIVIMGVRGFNWGLDFTGG 55 TSECDF_Tth VILAIGVVASVFSNLVFSRHLLERLADRGEIRPPMWLVDPRFNFMGPARYVTAATLLLAALAAGVVFAKGFNYSIDFTGG 480 .......410.......420.......430.......440.......450.......460.......470.......480 *. : * .*::.:* *:: ** : .: ::::*::** ..* :: ::: :*:* SECF_ECOLI TVIEITLEKPAEIDVMRDALQKAGFEEP------MLQNFGSSHDIMVRMPPAEGETGGQVLGSQVLKVINESTNQNAAVK 129 TSECDF_Tth TAYTLRAEPNVEVETLRRFLEEKGFPGKEAVITQVQAPTAAYREFLVKLPPLSDER-------RLELERLFASELKATVL 553 .......490.......500.......510.......520.......530.......540.......550.......560 _________TMD2________ ________TMD3_________ ______TMD4__ * ***::* :* :...**::..* **:**.***:* :... ::*:**** *. *: **: :*:.:. :*:*::::** SECF_ECOLI RIEFVGPSVGADLAQTGAMALMAALLSILVYVGFRFEWRLAAGVVIALAHDVIITLGILSLFHIEIDLTIVASLMSVIGY 209 TSECDF_Tth ASETVGPAIGEELRRNAVMAVLVGLGLILLYVAFRFDWTFGVASILAVAHDVAIVAGMYSLLGLEFSIPTIAALLTIVGY 633 .......570.......580.......590.......600.......610.......620.......630.......640 ________ ______TMD5_______ ______TMD6_______ *:************* : :*: . *:.* *:.*** **::** ***: ** * ::**.**..*:*::::*: :** *** SECF_ECOLI SLNDSIVVSDRIRENFRKIRRGTPYEIFNVSLTQTLHRTLITSGTTLMVILMLYLFGGPVLEGFSLTMLIGVSIGTASSI 289 TSECDF_Tth SINDSIVVSDRIRENQKLLRHLPYAELVNRSINQTLSRTVMTSLTTLLPILALLFLGGSVLRDFALAIFVGIFVGTYSSI 713 .......650.......660.......670.......680.......690.......700.......710.......720 ________ **.***.: :*: .*. SECF_ECOLI YVASALALKLGMKREHMLQQKVEKEGADQPSILP 323 TSECDF_Tth YVVSALVVAWKNRRKAQEASKA------------ 735 .......730.......740.......750.... Abbildung 3.23: Sequenzvergleich SecF aus E. coli und SecDF aus T. thermophilus Vergleich der Aminosäuresequenzen SecF_Ecoli (Uniprot: P0AG93) und TSecDF_Tth (Uniprot: Q5SKE6) mit ClustalX. Die Zeichen oberhalb der Sequenz bedeuten: *: identische AS (rot), : AS mit starker Ähnlichkeit, . AS mit schwacher Ähnlichkeit (genaue Einteilung s. 8.3). Die 1. periplasmatische Domäne von SecF (44-142 AS) ist fett hervorgehoben. TMD1 (23 – 43 AS), TMD2 (143 – 163 AS), TMD3 (171 – 191), TMD4 (197 – 217), TMD5 (249 – 265 AS) und TMD6 (273 – 297 AS) (http://www.uniprot.org/uniprot/P0AG93). 3.7.2 Bindung von Tth-IM60 an das ribosomale L2 Protein Während der Reinigung von Tth-IM60 war auffällig, dass eine zweite Proteinbande bei ca. 30 kDa immer wieder mit gereinigt wurde (Abbildung 3.14 A, Stern). Interessant war dabei vor allem, dass das Protein oft weder durch die Affinitätschromatographie noch durch die Gelfiltration von Tth-IM60 vollständig entfernt werden konnte, obwohl mit einer hohen Salzkonzentration (500 mM) 102 gearbeitet wurde, um unspezifische 3. Ergebnisse Wechselwirkungen zu vermeiden. Das unbekannte Protein beginnt zwar während der Affinitätschromatographie vor Tth-IM60 an zu eluieren, ein Teil eluiert jedoch erst mit Tth-IM60. Auch eine Verlängerung der Waschschritte konnte das unbekannte Protein nicht von Tth-IM60 trennen. Dies lässt darauf schließen, dass das Protein eventuell spezifisch an das Tth-IM60 bindet. Deshalb wurde die Proteinbande mittels PeptidMassen-Fingerprint-Analyse (PMF) untersucht. Die Analyse mittels MALDI-TOF und die Auswertung mittels der Software MASCOT wurden vom Life Science Center an der Universität Hohenheim von I. Klaiber durchgeführt (s. Anhang 8.4.). Die Bande wurde eindeutig als L2 Protein von E. coli identifiziert. Bei diesem Protein handelt es sich um ein rRNA Bindeprotein in der 50S Untereinheit des Ribosoms. Mit einem Molekulargewicht von ca. 30 kDa ist es das größte Protein dieser ribosomalen Untereinheit. 3.8 Translokation von Pf3 coat in rekonstituierten Systemen Nachdem eine Interaktion zwischen der E. coli Translokasekomponente SecF und TthIM60 nachgewiesen werden konnte, wurde mittels in vitro Translokationsstudien die Insertasefunktion von Tth-IM60 und MBP-TRAM untersucht. Es ist bekannt, dass YidC allein die endogenen Proteine MscL und Foc sowie die Phagenhüllproteine Pf3 coat und M13 Procoat in die Innenmembran transloziert (Chen et al., 2002; Facey et al., 2007; Samuelson et al., 2000; van der Laan et al., 2004). Von A. Schönbauer konnte kürzlich die Membraninsertion des Pf3 coat Proteins mit einer neuen Methode gezeigt werden, der Einzelmolekülspektroskopie. Mit dieser Methode konnten sowohl die Bindung und der Einbau von Pf3 coat in YidC-DOPC-Proteoliposomen nachgewiesen und darüber hinaus wichtige Hinweise über die Geschwindigkeit der Translokation ermittelt werden. Die Einzelmolekülspektroskopie wurde auch in dieser Arbeit angewandt, um die Bindung und Translokation von Pf3 coat an bzw. in Tth-IM60-DOPC-Proteoliposomen und MBP-TRAM-DOPC-Proteoliposomen zu untersuchen. Als Substrat wurde NC-Pf3 coat verwendet. Diese Pf3 coat Mutante enthält an Position 3 des N-Terminus ein Cystein, an dem über eine Maleimid-Bindung der membrandurchgängige ATTO 520 Fluoreszenzfarbstoff gebunden ist (Kuhn et al., 2010). Pf3 coat besitzt in der Zelle eine Nout/Cin Orientierung. Dadurch wird der N-Terminus während der in vitro Translokation in das Innere der Proteoliposomen transportiert und ist nach vollständiger Translokation vor Quenchermolekülen geschützt. Für die Versuche wurden Proteoliposomen mit 103 3. Ergebnisse gereinigtem und fluoreszenz-markiertem NC-Pf3 coat Protein versetzt und sofort analysiert (s. 2.4.2). Das Ergebnis der Bindung von NC-Pf3 coat an die verschiedenen DOPCProteoliposomen bzw. Liposomen ist in Abbildung 3.24 dargestellt. Die Abbildungen A bis C zeigen jeweils einen Ausschnitt von 1,5 s der gemessenen Signale mit einem einzelnen Photonen-Burst (Pfeil). Die Abbildungen D bis E zeigen die Summe an detektierten Photonen-Bursts (50-200 ms, > 30 counts) aus 10 Messungen in 30 s Abschnitten. Bei der Messung mit Tth-IM60-Proteoliposomen stieg die Anzahl der detektierten Bursts je 30 s Abschnitt an und damit die Anzahl an Vesikeln (Proteoliposomen) an denen Pf3 Moleküle gebunden sind. In den ersten 240 s stieg die Anzahl der Bursts kontinuierlich auf insg. 8 an und nahm dann wieder ab (Abbildung D). Im Vergleich dazu waren an Proteoliposomen, in denen MBP-TRAM rekonstituiert wurde, deutlich weniger Pf3 Moleküle gebunden (Abbildung E). Der Verlauf der Bindung von Pf3 an die MBP-TRAM-Proteoliposomen zeigt, dass in den ersten 240 s maximal 4 Photonen-Bursts pro 30 s detektiert wurden, während bei Tth-IM60 Proteoliposomen zu diesem Zeitpunkt doppelt so viele Pf3 coat Moleküle gebunden hatten. Ein Anstieg an gebundenen Pf3 coat Molekülen an MBP-TRAM-Proteoliposomen fand zwischen 240 und 360 s statt und steht damit im Gegensatz zum Abfall bei den Messungen mit TthIM60-Proteoliposomen. Die Messungen mit Liposomen zeigen außerdem, dass Pf3 coat auch ohne rekonstituiertes Protein binden konnte (Abbildung F), allerdings wurden pro 30 s maximal 5 Photonen-Bursts detektiert (zwischen 90 und 120 s). Der Verlauf der Messung zeigt, dass in den ersten 120 s ein Anstieg zu sehen ist, dann die Anzahl der Bindungen konstant bleibt und schließlich wieder sinkt. 104 3. Ergebnisse Abbildung 3.24: Bindung von Pf3 an Proteoliposomen blau: Tth-IM60-DOPC Proteoliposomen grün: MBP-TRAM-Proteoliposomen rot: Liposomen A - C: 1,5 s Abschnitt von gemessenen Photonen-Bursts D - F: Summe von Photonen-Bursts aus 10 Messungen mit einer Länge von 50 -200 ms und > 30 counts/ms in 30 s und damit die Anzahl an NC-Pf3 Molekülen, die an Proteoliposomen bzw. Liposomen gebunden haben. 105 3. Ergebnisse Die Bindungsstudie hat gezeigt, dass NC-Pf3 coat Moleküle sowohl an Tth-IM60- als auch an MBP-TRAM-Proteoliposomen binden können. Allerdings gibt sie keine Hinweise, ob die Moleküle tatsächlich in die Proteoliposomen eingebaut wurden oder nur aufgrund der starken Hydrophobizität an die Lipiddoppelschicht gebunden hatten. Der vollständige Einbau wurde durch die Zugabe von Kaliumiodid (KI), einem Quencher, untersucht. Dieser löscht die Fluoreszenz von ATTO 520. Wird NC-Pf3 coat korrekt in die Proteoliposomen eingebaut, befindet sich der N-Terminus und der daran gebundene Farbstoff in den Proteoliposomen und ist dadurch vor KI geschützt. Das Ergebnis zeigt, dass NC-Pf3 coat in die Tth-IM60 Proteoliposomen eingebaut wird. Es lässt sich ableiten, dass die Translokation bereits nach 210 s abgeschlossen ist, da die Anzahl der detektierten NC-Pf3 coat Moleküle nicht mehr ansteigt (Abbildung 3.25 D). Auffällig ist, dass auch bei dieser Messung nach 360 s weniger Photonen-Bursts detektiert wurden und keine Proteoliposomen mit eingebauten Pf3 mehr durch das konfokale Volumen diffundieren. Dagegen wurden in MBP-TRAM-Proteoliposomen deutlich weniger NC-Pf3 Moleküle eingebaut (Abbildung E). Die Anzahl der detektierten NC-Pf3 Moleküle variiert über die gesamte Messung zwischen 0 und 4. Ein leichter Anstieg ist wiederum ab 240 s zu erkennen, wobei bei dieser geringen Anzahl von detektierten Bursts eine Insertase Aktivität von TRAM zweifelhaft ist. Der Vergleich mit Liposomen zeigt, dass auch hier eine geringe Anzahl an Bursts zu beobachten war (Abbildung 3.25 F), wobei maximal 1 Insertionsereignis pro 30 s detektiert werden konnte. 106 3. Ergebnisse Abbildung 3.25: Einbau von Pf3 in Proteoliposomen blau: Tth-IM60-DOPC Proteoliposomen grün: MBP-TRAM-Proteoliposomen rot: Liposomen A - C: 1,5 s Abschnitt von gemessenen Photonen-Bursts D - F: Summe von Photonen-Bursts aus 10 Messungen (D + E) bzw. 3 Messungen (F) mit einer Länge von 50 -200 ms und > 30 counts/ms in 30 s und damit die Anzahl an NC-Pf3 Molekülen, die an Proteoliposomen bzw. Liposomen gebunden haben. 107 3. Ergebnisse 3.9 Kristallisation von Tth-IM60 Um weitere Hinweise über die Struktur von Tth-IM60 zu bekommen, muss das Protein kristallisiert werden. Die Kristallisation wurde von Dr. D. Lupo im Labor von Prof. Dr. Sinning durchgeführt. Für die Kristallisationsansätze wurden jeweils 30 l Zellen gezüchtet und daraus das Protein gereinigt. Wichtig hierbei war, dass die Reinigung innerhalb von zwei Tagen durchgeführt wurde und direkt anschließend die Kristallisation angesetzt wurde. Für die Kristallisation wurde das Protein auf eine Konzentration von 10 mg/ml gebracht und das Screening wie für den YidC P1-Loop angesetzt (Ravaud et al., 2008b). Im Ansatz mit 0,2 M NaCl, 0,1 M Bis-Tris, pH 5,5 und 25 % PEG3350 waren nach 40 Tagen Kristalle sichtbar (s. Abbildung 3.26 A). Durch Untersuchungen dieser Kristalle konnte eindeutig bewiesen werden, dass es sich dabei um Proteinkristalle handelt. Mit diesen Kristallen wurden am European Synchroton Radiation Facility (ESRF) in Grenoble Diffraktionstests durchgeführt. Es konnte dabei eine Auflösung von 10 Å erreicht werden (Abbildung 3.26 B). Diese ist jedoch nicht ausreichend für Berechnungen zur Analyse der Struktur von Tth-IM60. Trotzdem zeigen diese Ergebnisse, dass Tth-IM60 mit der vorliegenden Reinigungsmethode kristallisiert werden kann. Abbildung 3.26: Kristallisation und Diffraktion von Tth-IM60 A: Kristalle von Tth-IM60. Konzentration: 10 mg/ml Kristallisationsbedingungen: 0,2 M NaCl, 0,1 M BisTris, pH 5,5, 25 % PEG3350; Screen: Index Protein:Screenlösung 2:1 B: Diffraktionsbild von Tth-IM60, Expositionszeit = 2 s, Drehwinkel = 5°, Detektorabstand = 176,67 mm 108 4. Diskussion 4. Diskussion Der Transport von Proteinen gehört zu den wichtigsten Funktionen in einer Zelle. In E. coli sind 25 bis 30 % aller Proteine Membranproteine. Die meisten davon haben ihren Bestimmungsort in der Innenmembran und sind dort an lebensnotwendigen Funktionen, wie der ATP-Synthese, der Zellatmung, der Photosynthese sowie der Aufnahme von Nährstoffen beteiligt. Der Transport von Proteinen durch bzw. in die Cytoplasmamembran von Bakterien ähnelt dabei stark dem Transport im Endoplasmatischen Retikulum in Eukaryonten. Der Translokationskanal wird von einem stark konservierten heterotrimeren Membranproteinkomplex, dem Sec61- bzw. SecYEG-Komplex, gebildet (Rapoport, 2007). Die Funktion dieses Sekretionssystems wurde in den letzten Jahren ausführlich beschrieben und durch die Aufklärung der Kristallstruktur des SecY aus Methanococcus jannaschii konnte der Aufbau der eigentlichen Translokationspore entschlüsselt werden (Berg et al., 2004). Neben dem eigentlichen Sec-Komplex wurden weitere an der Translokation beteiligte Membranproteine identifiziert und beschrieben. Dazu gehören unter anderem der SecDFyajC-Komplex und YidC in Bakterien sowie Sec62/63 und TRAM in Eukaryonten. Es ist sowohl über YidC, als auch TRAM bekannt, dass sie an Transmembrandomänen von translozierenden Proteinen binden (Klenner et al., 2008; Sauri et al., 2007). Trotz dieser vergleichbaren Funktion, besteht zwischen den Proteinen keine offensichtliche Homologie (Abbildung 3.1). 4.1 Das TRAM Protein 4.1.1 Heterologe Expression von TRAM als Fusionsprotein Ein Teil dieser Arbeit umfasste die Aufgabe, das TRAM Protein aus X. laevis heterolog in E. coli zu exprimieren und anschließend zu reinigen, um in vitro Translokationsstudien durchführen zu können. Dadurch sollte die funktionelle Ähnlichkeit zwischen TRAM und YidC untersucht werden. Bislang wurden TRAM Proteine direkt aus dem rauen ER gereinigt, das aus tierischem Pankreas isoliert wird (Görlich & Rapoport, 1993). Diese Reinigung ist jedoch zeitaufwendig, aufgrund der verwendeten Chemikalien teuer und die Proteinausbeute eher gering. Als Alternative zu dieser nativen Proteingewinnung gilt die rekombinante Herstellung von Proteinen. Die heterologe Expression von eukaryontischen 109 Proteinen, insbesondere von 4. Diskussion Membranproteinen wird jedoch oft durch wirtseigene proteolytische Prozesse gestört, die zum Abbau und Instabilität der Proteine führen können. Außerdem ist bei Membranproteinen oft eine geringe Expression zu beobachten. In den letzten Jahren wurden aufgrund dieser Probleme unterschiedliche Expressionssysteme entwickelt. Als besonders erfolgreich gilt vor allem die Expression in E. coli und in der Hefe Pichia pastoris (Freigassner et al., 2009). Aufgrund von Verfügbarkeit, aber auch im Hinblick auf in vivo Komplementationsstudien wurde in dieser Arbeit E. coli als Expressionsstamm gewählt. Im Rahmen meiner Diplomarbeit konnte bereits gezeigt werden, dass nur das tram-Gen aus X. laevis mit pMal als Vektor zusammen mit pRARE in C43 Zellen in geringem Maß exprimiert werden konnte (Neefe, 2004). Aufbauend auf den Ergebnissen der Diplomarbeit sollte die Expression verbessert werden. Der pMal Vektor wurde speziell für die heterologe Expression in E. coli entwickelt und so konstruiert, dass Fusionsproteine mit N-terminalem MBP (Maltose bindendes Protein) entstehen (di Guan et al., 1988). Vorteile bei der Expression mit MBP als Fusionsprotein sind sowohl das sehr hohe Expressionslevel (bis zu 2 % der gesamten zellulären Proteine) als auch die einfache und hochwertige Reinigung unter unterschiedlichen Bedingungen (Pryor & Leiting, 1997). Außerdem wurde von Kapust und Waugh gezeigt, dass MBP die Stabilität, die Löslichkeit und auch die Faltung von Proteinen verbessern kann (Kapust & Waugh, 1999). Der pMal Vektor wurde so gewählt, dass das N-terminale MBP im Cytoplasma verbleibt. Dies entspricht der Lokalisation des N-Terminus von TRAM und sollte daher die natürliche Konformation unterstützen. Durch das N-terminale Fusionsprotein können auch eventuelle Probleme bei der Initiation der Translation ausgeschlossen werden. Aus diesen Gründen wurde das Vektor-Wirtsystem (pMal - E. coli C43) beibehalten. Weitere Untersuchungen während meiner Diplomarbeit ergaben, dass die Expression vermutlich von der Codon Usage beeinflusst wird. Unter Codon Usage versteht man das Phänomen, dass die verschiedenen Codons für dieselbe Aminosäure in verschiedenen Organismen in ihrer Frequenz variieren. Bestimmte Codons werden dementsprechend bevorzugt verwendet, wohingegen andere seltener vorkommen. Es wird allgemein angenommen, dass das Vorkommen von seltenen Codons in einem Gen, die Überexpression von Proteinen beeinflussen kann. So konnten Robinson und Kollegen am Beispiel der Chloramphenicol Acetyltransferase zeigen, dass bei starker Expression das Einbringen von ungünstigen Codons die Translation reduzieren kann 110 4. Diskussion (Robinson et al., 1984). Die Überprüfung der Codons des tram-Gens zeigte, dass das Gen insgesamt 25 dieser in E. coli selten vorkommenden Codons enthält (s. Tabelle 3.2). Dies entspricht knapp 7 % des gesamten TRAM Proteins, das insgesamt aus 373 AS besteht. Da ein Austausch der Codons sehr aufwendig ist, wurde das pRARE Plasmid in den C43 + pMAL-tramXl Zellen coexprimiert, wodurch eine schwache Expression nachgewiesen werden konnte (Neefe, 2004). Das pRARE Plasmid enthält die Gene der meisten in E. coli seltenen tRNAs, Ausnahmen sind die tRNAs für die beiden Codons CGG und CGA (Novy et al., 2001). Um auszuschließen, dass die beiden im Gen enthaltenen CGG Codons einen negativen Einfluss auf die Expression haben, wurden diese zunächst mittels QuikChange in CGC umgewandelt (s. 2.2.5.5.). Mit diesem Konstrukt (pSHN-07) konnte die Expression in C43 Zellen hinsichtlich der Induktionszeit und –temperatur optimiert werden (s. 3.2.1). Die beste Expression konnte schließlich in C43 Zellen zusammen mit pRARE nach 5 h Induktion mit 1 mM IPTG und bei 18 °C nachgewiesen werden (Abbildung 3.3). Allerdings konnte die Expression lediglich mittels MBP-Antikörper nachgewiesen werden, ein Expressionslevel von 2 % bezogen auf den Gesamtgehalt an zellulärem Protein konnte nicht erreicht werden. Trotzdem wurde bei der optimierten Expression ausreichend Protein gebildet um dieses reinigen zu können. 4.1.2 Reinigung von MBP-TRAM über zwei verschiedene Affinitätsmatrizen: Amylose und Ni-Sepharose Die Reinigung von MBP-TRAM wurde in zwei Schritten durchgeführt und ist in Kapitel 3.3.1 dargestellt. Da das Fusionsprotein zusätzlich ein C-terminalen His6tag besitzt, konnten zwei verschiedene Affinitätsmaterialien verwendet werden. Als Matrix für die Reinigung mittels His-tag wurde die Ni-Sepharose FastFlow eingesetzt, während für die Reinigung mittels MBP eine Amylosematrix verwendet wurde. Das Fusionsprotein wurde nach der Solubilisierung mit 1 % DDM über eine Ni-Sepharose FastFlow gereinigt, dabei konnten bereits fast alle Fremdproteine entfernt werden (s. Abbildung 3.6). Außerdem wurden auch sämtliche Proteine, die mit dem MBP-Antikörper nachgewiesen wurden, entfernt. Es ist wahrscheinlich, dass es sich bei diesen Banden um MBP-TRAM-Fragmente handelt. Diese sind entweder durch den Abbau des Fusionsproteins entstanden oder durch unvollständige Translation. Durch die anschließende Reinigung über eine Amylosematrix konnten weitere Fremdproteine abgetrennt werden. Für die folgenden Versuche zur Rekonstitution war der 111 4. Diskussion Reinigungsgrad zufriedenstellend. Die Ausbeute der Reinigung ist jedoch noch optimierbar. Die während der Reinigung analysierten Proben zeigen, dass die Solubilisierung mit 1 % DDM für 1 h nicht ausreichend war. Allerdings könnte eine Verlängerung der Solubilisierung zu noch mehr Abbauprodukten führen und damit zu noch weniger Protein. Auffällig ist auch, dass bei beiden Reinigungen ein Teil des Fusionsproteins nicht an die jeweilige Affinitätsmatrix bindet. Beide Reinigungen erfolgten im Batch-Verfahren und die Bindung an die Matrix erfolgte jeweils über Nacht. Dies sollte für eine effiziente Bindung mehr als ausreichend sein. Eventuell könnte durch Verringerung der Salzkonzentration im Puffer die Bindung verbessert werden. Eine Erklärung für die ineffiziente Bindung könnte auch die Faltung oder Aggregation des Proteins sein, so dass es nicht in der Lage war richtig an die Matrix zu binden. 4.1.3 Einbau von MBP-TRAM in Liposomen mittels Bio-Beads Durch den Einbau gereinigter Translokationskomponenten in Phospholipid-Vesikel können die Funktionen der einzelnen Komponenten gezielt untersucht werden. Die Funktion von YidC als Insertase wurde unter anderem in Translokationsstudien mit Proteoliposomen nachgewiesen (du Plessis et al., 2006; Serek et al., 2004; Stiegler et al., 2010; Winterfeld et al., 2009). Daher sollten Translokationsstudien mit Pf3 coat für den Vergleich zwischen YidC und TRAM verwendet werden. In einem ersten Schritt wurde das gereinigte Fusionsprotein MBP-TRAM in die Phospholipid-Vesikel mittels SM2 Bio-Beads eingebaut (s. 2.3.8.4). Diese Methode zur Rekonstitution wurde aufgrund der relativ geringen Proteinkonzentration von 0,3 mg/ml gewählt. Die Rekonstitution des Proteins erfolgte sowohl mit einem molekularen Verhältnis von Protein : Lipid von 1 : 10 000 als auch von 1 : 20 000 (s. 3.5.1). Die SDS-PAGE der einzelnen Fraktionen vor und nach der Rekonstitution zeigt, dass es währenddessen zu einem sehr hohen Proteinverlust kam (s. Abbildung 3.17). Obwohl die Mengen an BioBeads so gewählt wurden, dass sie mit Detergenz gesättigt sein sollten, ist es wahrscheinlich, dass sich die TRAM Moleküle aufgrund hydrophober Wechselwirkungen an die Bio-Beads angelagert haben und es dadurch zu diesem hohen Verlust kam. Beim Einbau der Proteine ist deren Orientierung zu beachten. Bei Proteoliposomen gilt dabei, dass das Lumen der Proteoliposomen dem Periplasma und die Umgebung dem Cytoplasma entsprechen sollte („inside out“). Das TRAM Protein besteht aus 8 TMD, wobei beide Termini im Cytoplasma lokalisiert sind (Görlich et al., 1992; Tamborero et 112 4. Diskussion al., 2011). Die Orientierung nach der Rekonstitution wurde mittels eines Proteaseverdaus überprüft. Das Ergebnis zeigt, dass das Fusionsprotein in beiden Orientierungen vorliegt (s. Abbildung 3.18). MBP konnte nach dem Verdau mit FaktorXa nachgewiesen werden, was bedeutet, dass die Spaltstelle zugänglich war und damit der C-Terminus nach außen orientiert sein muss. Allerdings konnte auch eine MBP Bande nach dem Verdau mit Trypsin nachgewiesen werden, die nur detektiert werden kann, wenn MBP in den Proteoliposomen vor dem Proteaseverdau geschützt ist. Aufgrund der verwendeten Detektionsmethode war es nicht möglich, die Banden quantitativ miteinander zu vergleichen. Es ist davon auszugehen, das der kleinere Teil des Proteins in „inside out“ Orientierung vorlag, also mit den cytoplasmatischen Bereichen nach außen zeigte. Die Orientierung von rekonstituierten Proteinen kann durch die Zusammensetzung der Lipide oder durch die verwendeten Detergenzien beeinflusst werden (Knol et al., 1998; Rigaud et al., 1995). Daher könnte eine Veränderung dieser Parameter den Anteil der „inside out“ Orientierung erhöhen. Dies wurde jedoch nicht weiter untersucht, da sich die Rekonstitution mittels Bio-Beads für die nachfolgende Translokation von Pf3 coat Protein und der Einzelmolekülspektroskopie als Nachweismethode aufgrund zu hoher Hintergrundstrahlung als nicht praktikabel erwies. Als Alternative wurde daher die Rekonstitution mittels Extrudertechnik durchgeführt und die Insertasefunktion wie bei Tth-IM60 über Einzelmolekülspektroskopie untersucht (s. 4.2.3). Als Substrat wurde das am N-Terminus markierte NC-Pf3 coat Protein verwendet. Das Ergebnis zeigt, dass NC-Pf3 coat an MBP-TRAM-Proteoliposomen bindet, jedoch auch in vergleichbarer Menge wie an Liposomen, die kein Protein enthalten (s. 3.8, Abbildung 3.24). Auffällig ist jedoch, dass die Bindung im Gegensatz zu Tth-IM60-Proteoliposomen und Liposomen in der zweiten Hälfte der Messung zunimmt. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass Pf3 coat an MBP-TRAM bindet, die Bindung jedoch langsamer verläuft als zwischen Tth-IM60 und Pf3 coat. Diese Annahme wird durch das Ergebnis des Einbaus bestätigt (s. 3.8, Abbildung 3.25 E). Insgesamt werden im Vergleich zu Tth-IM60 nur sehr wenige Pf3 coat Moleküle in MBP-TRAM-Proteoliposomen eingebaut, wobei die Anzahl der eingebauten Pf3 coat Moleküle ab 240 s etwas zunimmt und damit der Einbau ähnlich wie die Bindung verläuft. Da im Abschnitt 12 (330 s– 360 s) kein eingebautes Pf3 coat Protein detektiert wurde und auch bei der Translokation mit Liposomen vereinzelt Signale detektiert wurden, lässt sich auf eine Insertasefunktion von MBP-TRAM nicht zweifelsfrei 113 4. Diskussion schließen. Diese Signale können auch durch unvollständiges Quenchen mit Kaliumjodid entstehen. Es ist bekannt dass Pf3 coat während der Translokation an die TMD 1 und 3 von YidC bindet (Klenner et al., 2008), daher würde eine Homologie zwischen diesen Transmembrandomänen die Möglichkeit der Insertasefunktion von TRAM bezogen auf Pf3 coat stützen. Der Sequenzvergleich zwischen YidC und TRAM zeigt zwar eine hohe Ähnlichkeit bei TMD 1, aber genau wie bei TMD 3 nur zwei konservierte Aminosäuren (s. Abbildung 4.1). Da die Ähnlichkeit zwischen Transmembrandomänen aufgrund der starken Hydrophobizität der enthaltenen Aminosäuren allgemein höher ist, zeigt der Vergleich keine erhöhte Homologie und damit auch keinen weiteren Hinweis auf eine funktionelle Ähnlichkeit. TMD1 YidC_E.coli TMD1 TRAM_X.l. ::: :*::*: :::: -NLL-VIALLFVSFMIWQAWADIVSCLAMVFLLGLMFEITA TMD3 YidC_E.coli TMD3 TRAM_X.l. * : :* .:: :::. GGCFPLLIQMPIFLALY--YMLMGSV -----QLSAFYLFSCIWGASIIVS— Abbildung 4.1: Sequenzvergleich zwischen TMD1 und TMD2 von YidC und TRAM Sequenzvergleich der TMD 1 und TMD 3 mit ClustalX. Die Zeichen oberhalb der Sequenz bedeuten: * identische AS (rot), : AS mit starker Ähnlichkeit, . AS mit schwacher Ähnlichkeit (genaue Einteilung s. 8.3) Aufgrund der geringen Konzentration von MBP-TRAM (0,5 mg/ml) konnte das Protein, indem es in geringeren Detergenzkonzentrationen eluiert wurde, zwar für die Einzelmolekülspektroskopie eingesetzt werden, nicht aber für die Untersuchung der Orientierung. Für die Untersuchung der Orientierung wird das dreifache Volumen benötigt, wodurch die Detergenzkonzentration knapp die CMC von DDM (0,008 %) erreicht und zur Solubilisierung der Proteoliposomen geführt hätte. Daher kann nicht ausgeschlossen werden, dass die geringe Insertionsrate von Pf3 coat durch die falsche Orientierung von MBP-TRAM hervorgerufen wurde. Außerdem wurde das gesamte Fusionsprotein MBP-TRAM für die Rekonstitution eingesetzt. Da der MBP-Teil ungefähr der Größe von TRAM entspricht (MBP: 38 kDa, TRAM 43 kDa), könnte dieser die Translokation beeinflussen. Insgesamt lässt sich vermuten, dass MBP-TRAM die Bindung und den Einbau von Pf3 coat nicht oder nur in sehr geringem Maße unterstützen könnte. Eine mögliche Interaktion würde erst nach ca. 4 Minuten erfolgen und damit deutlich langsamer als bei Tth-IM60 verlaufen (s. 4.2.3). 114 4. Diskussion 4.1.4 TRAM kann die Funktion von YidC nicht in vivo ersetzen Ein weitere Möglichkeit die Funktion zwischen YidC und TRAM zu vergleichen sind in vivo Komplementationsversuche. Bei diesen wird direkt in der Zelle untersucht, ob TRAM die Funktion von YidC ersetzen kann. Da YidC für das Überleben der Zelle essentiell ist, konnte die Komplementation über das Zellwachstum untersucht werden (Samuelson et al., 2000). Für die Komplementation wurde der E. coli Depletionsstamm MK6S verwendet. Bei diesem Stamm steht das chromosomale wt-yidC Gen unter der Kontrolle eines araBAD-Promotors und kann dadurch mit Arabinose und Glucose gezielt induziert bzw. reprimiert werden. Wird das wt-yidC Gen mit Arabinose induziert sind die MK6S-Zellen in der Lage zu wachsen, wohingegen die Expression von wt-yidC mit Glucose reprimiert wird und die Zellen nicht mehr auf LB-Agarplatten wachsen können. Durch das Einbringen von plasmidkodierten und gezielt mit IPTG induzierbaren Proteinen können diese auf die Funktionalität von YidC getestet werden, da bei gleicher Funktion ein Zellwachstum auf Glucose + IPTG wieder möglich ist. Da bislang nur mit dem Vektor pMal eine Expression von TRAM nachgewiesen werden konnte, wurde dieser für die Komplementation eingesetzt. Zur Kontrolle wurden der leere pMal Vektor und pMal-yidC mitgeführt. Das Ergebnis der Komplementation zeigt, dass MBP-TRAM die Funktion von YidC nicht bzw. nicht vollständig ersetzen kann, da weder auf Glucose, auf Glucose + IPTG noch auf Arabinose + IPTG ein Wachstum festgestellt werden konnte (s. 3.4). Beim Vergleich mit den Kontrollen ist jedoch auffällig, dass auch bei den Kontrollen (pMal und pMal-yidC) weder ein Wachstum auf Glucose + IPTG noch auf Arabinose + IPTG festgestellt werden konnte. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die Überexpression des MBP-Proteins für die Zellen toxisch sein muss. Ein ähnliches Phänomen konnte bereits bei anderen Komplementationen beobachtet werden. So zeigte S. Grenz in ihrer Diplomarbeit, dass bei der Komplementation mit dem Plasmid pGZ-yidC das Vorhandensein einer Ribosomenbindestelle (rbs) vor dem Gen Auswirkungen auf das Zellwachstum hat (Grenz, 2008). Enthielt das Plasmid eine rbs, konnten die Zellen nach der Induktion mit IPTG nicht mehr wachsen. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine starke Expression von unterschiedlichen Proteinen wie YidC, MBP oder MBP-YidC für die MK6S Zellen letal ist. Bislang wurde davon ausgegangen, dass die Toxizität aufgrund der Störung des Translokationsapparates kommen kann, da durch die Veränderung des wt-yidC Promotors eine Regulation von yidC durch die Zelle selber nicht mehr möglich ist. Das Fehlen von YidC führt dann 115 4. Diskussion vermutlich zur Missfaltung von Proteinen in der Membran, wodurch die Stressantwort in der Zelle induziert wird (Shimohata et al., 2007). Allerdings erklärt das nicht, warum die Induktion eines cytoplasmatischen Proteins (MBP ohne Signalsequenz) für die MK6S Zellen toxisch ist. Wahrscheinlich ist jedoch auch hier, dass die Expression zu erheblichen Missfaltungen in der Zelle kommt, die dadurch die Biosynthese anderer Proteine beeinflusst und dadurch zum Zelltod führt. Die Komplementation kann trotzdem mit pMal als Vektor untersucht werden, da Zellen mit pMal-yidC auf glucosehaltigen Platten wachsen. Dieses Wachstum kommt zustande, da der Vektor „undicht“ ist, also auch ohne IPTG eine geringe Expression aufweist und dadurch MBP-YidC in der Zelle vorhanden ist. Das Ergebnis bedeutet zum einen, dass YidC auch als Fusionsprotein funktionsfähig ist, zum anderen, dass geringe Mengen an Protein ausreichend für eine Komplementation sind. Da keine Komplementation in den Zellen festgestellt wurde, kann davon ausgegangen werden, dass TRAM eine andere Funktionsweise besitzt als YidC, obwohl beide an Transmembrandomänen translozierender Proteine binden. Es ist jedoch zu beachten, dass TRAM ein Glykoprotein ist und daher in der eukaryontischen Zelle glykosyliert vorliegt (Görlich et al., 1992). Da in prokaryontischen Zellen keine Glykosylierungen an Proteinen vorgenommen werden, könnte es auch sein, dass das Protein aufgrund dessen nicht funktionsfähig ist. Dies ließe sich jedoch nur überprüfen, wenn parallel Bindungsstudien mit dem rekombinanten und dem nativen Protein durchgeführt werden würden, so dass die Ergebnisse miteinander vergleichbar sind. Da das native TRAM Protein aus X. laevis bisher noch nie gereinigt wurde, konnte dieser Vergleich nicht durchgeführt werden. 4.2 Tth-IM60 ist ein YidC Homolog aus T. thermophilus Die Membraninsertase YidC aus E. coli gehört zu der in Eu- und Prokaryonten stark konservierten YidC/Oxa1/Alb3-Familie (Zhang et al., 2009). Es konnte in den letzten Jahren gezeigt werden, dass YidC sowohl zusammen mit SecYEG, als auch allein für die Insertion von Membranproteinen verantwortlich ist (Wang & Dalbey, 2010). Aufgrund der essentiellen Rolle von YidC ist nicht nur die Funktion sondern auch die Struktur von Interesse, um genauer zu verstehen, wie die Substrate in die Membran inserieren und wie sie von der Insertase dissoziieren und in die Lipiddoppelschicht entlassen werden. In den letzten Jahren konnten im Bereich der Strukturaufklärung bedeutende Fortschritte gemacht werden und von immer mehr Membranproteinen 116 4. Diskussion konnte die Struktur aufgeklärt werden, wie z.B. der SecYEG Translokationspore (Berg et al., 2004). Auffällig ist, dass der größte Teil der kristallisierten Membranproteine aus dem natürlichen Organismus stammen und nicht rekombinant hergestellt wurden. So wurden lediglich 94 der rund 250 kristallisierten Membranproteine heterolog exprimiert (http://blanco.biomol.uci.edu/Membrane_Proteins_xtal.htm Stand 2010). Dieses Ergebnis steht im starken Kontrast zu löslichen Proteinen, hier werden geschätzt über 90 % der neu kristallisierten Proteine rekombinant hergestellt (Loll, 2003). Dies spiegelt vor allem die Schwierigkeiten bei der rekombinaten Expression von Membranproteinen wieder und zeigt, dass die üblichen Strategien zur Überexpression bei Membranproteinen nicht unbedingt Erfolg bringen (Grisshammer & Tate, 1995). Daher muss die Expression und die anschließende Reinigung für jedes Membranprotein individuell getestet und optimiert werden. Generell stammen die meisten Proteine, die kristallisiert wurden aus thermophilen Bakterien oder Archaeen, da diese oft stabiler sind als deren Homologe aus mesophilen Bakterien (Sadeghi et al., 2006). Eine Eigenschaft, die bei der Kristallisation unersetzlich ist, da diese meist über mehrere Tage oder auch Wochen abläuft. Da YidC in allen Bakterien hoch konserviert ist, konnten auch in den vollständig sequenzierten Organismen T. thermophilus und A. aeolicus vermeintliche Homologe identifiziert werden. Ziel dieser Arbeit war es, das als YidC Homolog identifizierte Protein aus T. thermophilus (Tth-IM60) zu charakterisieren und dessen Funktion mit YidC zu vergleichen. Außerdem sollte die Reinigung für die nachfolgende Kristallisation optimiert werden und Strukturvergleiche mittels Zirkulardichroismus zwischen Tth-IM60, Aq-YidC und YidC durchgeführt werden. 4.2.1 Heterologe Expression und Reinigung von Tth-IM60 als Dimer Da das Tth-IM60 Protein bislang noch nicht beschrieben wurde, wurde das Gen aus der genomischen DNA von T. thermophilus isoliert und mit einem C-terminalen His10tag in verschiedene Vektoren kloniert (s. 2.2.5.5). Der His-tag wurde sowohl für die spätere Reinigung als auch zum Nachweis des Proteins mittels Antikörper verwendet. Um ausreichende Mengen des Proteins zu erhalten, wurde es heterolog in E. coli exprimiert. E. coli wurde für die heterologe Expression aufgrund von geplanten in vivo Komplementationsstudien und der großen Verfügbarkeit von verschiedenen Stämmen und Expressionsvektoren ausgewählt. Außerdem konnten bereits in E. coli exprimierte thermophile Membranproteine erfolgreich kristallisiert werden. Dazu gehören z.B. das 117 4. Diskussion Peptidoglycan Glycosyltransferase Penicillinbinde Protein 1a aus A. aeolicus (Yuan et al., 2007), der MgtE Mg2+ Transporter aus T. thermophilus (Hattori et al., 2007) und SecYE aus T. thermophilus (Tsukazaki et al., 2008). Da für die Funktionsstudien und insbesondere der Strukturanalyse hohe Konzentrationen und auch große Proteinmengen nötig sind, musste die Expression so weit wie möglich optimiert werden. Die beste Expression wurde in C43 Zellen mit pSHN- 18 als Plasmid (pMS-tthIM60) und einer Induktion bei 37 °C für 4 h mit 0,2 mM IPTG hervorgerufen (s. 3.2.2, Abbildung 3.4). Auffällig war, dass in allen anderen getesteten Vektoren, die aufgrund stärkerer Promotoren wie T7 (pET16b) oder einer höheren Kopienzahl (pUC19) eigentlich eine stärkere Überexpression zeigen sollten, kein Protein detektiert werden konnte. Dies könnte damit zusammenhängen, dass eine Überexpression den Sekretionsweg überfordert und dadurch das Protein sofort wieder abgebaut wird. Auch längere Expressionszeiten, Änderungen der Temperatur oder der Einsatz anderer Stämme brachten keine Verbesserung der Expression (s. Abbildung 3.4). Erstaunlich war auch, dass die Coexpression von pRARE dazu führt, dass kein Protein mehr gebildet wurde. Es hat den Anschein, als ob ein gewisses Expressionslevel nicht überschritten werden darf, da das Protein ansonsten sofort degradiert wird. Aufgrund der eher schwächeren Expression musste für die späteren Reinigungen entsprechend viel Zellmaterial eingesetzt werden. Da die Reinigung hinsichtlich der Kristallisation von großer Bedeutung ist, wurde sie in einzelnen Schritten optimiert. Bei der Reinigung wurde besonderer Wert auf Homogenität und Reinheit gelegt. In einem ersten Schritt wurde Tth-IM60 in dem nicht-ionischen Detergenz DDM und dem zwitterionischen Detergenz ASB-14 solubilisiert und im Batch-Verfahren über eine NiSepharose gereinigt (s. 3.3.3). Es konnte gezeigt werden, dass das Tth-IM60 unabhängig der gewählten Detergenzien an die Ni-Sepharose bindet. Allerdings war die Solubilisierung mit DDM ineffizienter als mit ASB-14. ASB-14 wurde ursprünglich für die Solubilisierung für die isoelektrische Fokussierung entwickelt und kann als zwitterionisches Detergenz im Gegensatz zu DDM auch Protein-Protein Bindungen lösen (Rabilloud et al., 1990). Das könnte zu der besseren Solubilisierung beigetragen haben. Die Reinigung zeigte allerdings, dass nicht alle Fremdproteine entfernt werden konnten. 118 4. Diskussion Als Alternative zur Reinigung im Batch gilt die Affinitätschromatographie mittels FPLC (fast protein liquid chromatography). Da die Reinigung mittels FPLC im Gegensatz zum Batch-Verfahren unter leichtem Druck (0,3 MPa) durchgeführt wird, kann das die Bindung der Fremdproteine an die Ni-Matrix abschwächen. Die Reinigung über eine HisTrap Säule zeigte, dass auch hier Fremdproteine vorhanden waren (s. Abbildung 3.10 E). Eine Möglichkeit die Reinigung von thermophilen Proteinen zu verbessern, besteht darin den Proteinrohextrakt zu erhitzen. Dadurch werden die meisten E. coli Proteine denaturiert und können durch eine Zentrifugation abgetrennt werden (Koma et al., 2006). Der Reinigungseffekt mittels Hitzedenaturierung wurde sowohl vor der FPLC als auch danach untersucht. Es konnte jedoch keine Verbesserung erzielt werden. Auch mehrere Waschschritte oder veränderte Imidazolkonzentrationen konnten keine Verbesserung erwirken. Erst durch die Kopplung der FPLC und dem Batch-Verfahren konnte die Reinheit deutlich verbessert werden (s. Abbildung 3.10 E). Da beide Reinigungen auf dem gleichen Prinzip der immobilisierten Metall Affinitätschromatographie (IMAC) basieren und auch das gleiche Metallion (Ni2+) verwendet wurde, war es überraschend, dass das Protein auf diese Weise weiter gereinigt wurde. Der Reinigungseffekt verstärkte sich, wenn die Elutionsfraktionen zwischen dem 1. Reinigungsschritt mit der FPLC und dem 2. Reinigungsschritt im Batch für mehrere Tage bei 4 °C gelagert wurden. Es ist bekannt, dass sowohl Metallbindeproteine wie YodA (Metal-binding lipocalin) oder Fur (ferric uptake regulator), aber auch Proteine mit Histidinclustern auf der Oberfläche wie SlyD (Peptidoylproline cis-trans Isomerase) bei einer IMAC mitgereinigt werden (Bolanos-Garcia & Davies, 2006). Die Vermutung liegt daher nahe, dass die Fremdproteine deutlich instabiler sind als Tth-IM60 und vermutlich aufgrund von Konformationsänderungen nicht mehr an Metallionen wie Ni2+ binden können. Die zweite Reinigung diente gleichzeitig auch der Proteinkonzentrierung, so konnte TthIM60 direkt für eine Gelfiltration zur Überprüfung der Homogenität eingesetzt werden. Für Strukturanalysen ist es unerlässlich, dass das Protein in einem homogenen Zustand vorliegt. Dies kann unter anderem mit einer Größenausschlusschromatgraphie (SEC) oder einer nativen Gelelektrophorese (Blue-Native Page) überprüft werden. Tth-IM60 eluiert sowohl in DDM als auch in ASB-14 bei der Gelfiltration mit einer berechneten Größe von ca. 500 kDa und damit knapp hinter dem Leervolumen der Säule (s. Abbildung 3.11 B). Das monomere Tth-IM60 besitzt eigentlich eine Größe von 48 kDa. 119 4. Diskussion Da die Konzentration der Detergenzien über der CMC (kritische Micellen-Konzentration) liegt, muss die Micellengröße der Detergenzien dazugerechnet werden. DDM formt Micellen mit einer Größe zwischen 50 und 70 kDa, also würde ein Monomer bei 100 – 120 kDa liegen und ein Dimer bei 150 - 170 kDa. Die Micellengröße von ASB-14 ist bislang noch nicht bekannt. Das Ergebnis der SEC besagt daher, dass das Tth-IM60 Protein einen hohen oligomeren Zustand angenommen hat. Im Gegensatz dazu konnte bei der nativen Gelelektrophorese mit DDM eine Proteinbande bei 180 kDa detektiert werden (s. Abbildung 3.11 A). Dies würde wiederum auf ein Di- oder Trimer des TthIM60 Proteins hinweisen. Das Ergebnis mit ASB-14 zeigt mehrere Proteinbanden, so dass davon ausgegangen werden kann, dass das Protein nicht homogen vorliegt. Erstaunlicherweise ist das Protein in diesem Oligomerenzustand sehr stabil und lässt sich nicht, wie es bei Aggregaten der Fall ist, abzentrifugieren. Erst bei Versuchen das Protein zu konzentrieren, bildeten sich Aggregate. Das Problem der Aggregation bei höheren Konzentrationen ist auch von YidC bekannt. Der Arbeitsgruppe um D. Martinez Molina ist es durch Absenkung des pH-Wertes und die Einstellung der idealen Salzkonzentration gelungen eine Konzentration von 10 mg/ml zu erreichen (Martinez Molina et al., 2008). Das YidC Protein wurde direkt nach der Reinigung gegen verschiedene Puffer dialysiert und dann die Homogenität über eine Gelfiltrations-chromatographie analysiert. Als optimal konnte für YidC ein Puffer mit 20 mM Na-Acetat pH 5,2 und 100 mM NaCl definiert werden und die Konzentration von YidC auf über 10 mg/ml gesteigert werden. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde versucht, auch für Tth-IM60 den Puffer zu optimieren. Gleichzeitig stellte sich die Frage, ob das Protein bereits in diesem oligomeren Zustand solubilisiert wird oder diesen erst während der Reinigung annimmt. Mittels Gelfiltration und Immundetektion konnte gezeigt werden, dass das Protein direkt nach der Solubilisierung mit DDM zwar nicht homogen (70 – 450 kDa), dafür aber auch in niedrigeren oligomeren Zuständen vorliegt (s. Abbildung 3.12). Außerdem konnte gezeigt werden, dass bereits bei der Solubilisierung der Puffer eine entscheidende Rolle spielen kann. Bei pH 5,2 aggregierte Tth-IM60 sofort, dagegen verschob sich bei pH 8,5 die Elution in Richtung Monomer. Da DDM für die Solubilisierung von Tth-IM60 nicht optimal erscheint, wurde die Solubilisierung mit anderen Detergenzien (LDAO, Fos-Cholin-14, C8E5) in Puffer mit 20 mM TrisHCl pH 8,5 und 500 mM NaCl durchgeführt. Dieser Detergenzwechsel brachte eine deutliche Verbesserung der Homogenität. So eluiert das Tth-IM60 Protein nach der Solubilisierung bei allen drei 120 4. Diskussion Detergenzien zwischen 60 und 180 kDa (s. Abbildung 3.12). Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass Tth-IM60 in der Membran als Monomer oder Dimer vorkommt. Für eine dimere Konformation würde sprechen, dass das Protein nach der Solubilisierung mit SDS, welches zu einer Denaturierung des Proteins führt, bereits zwischen 12 - 30 kDa eluiert. Für die weitere Reinigung wurde mit LDAO gearbeitet, da dies in der Strukturbiologie ein weit verbreitetes Detergenz ist. So wurde LDAO bislang 126 mal erfolgreich bei Strukturanalysen eingesetzt und ist damit hinter OG (158) und DDM (144) das am häufigsten eingesetzte Detergenz (Raman et al., 2006) (http://www.mpdb.tcd.ie/ index.asp). LDAO ist wie ASB-14 ein zwitterionisches Detergenz mit einer CMC von 1 2 mM und besitzt eine durchschnittliche Micellengröße von 17 kDa. Als Puffer wurde TrisHCl pH 8,5 und 500 mM NaCl verwendet. Die bereits mit DDM entwickelte Reinigung in zwei Schritten erwies sich auch mit LDAO als sehr gut. Eine direkt im Anschluss durchgeführte Gelfiltration konnte außerdem zeigen, dass das Tth-IM60 Protein in LDAO hauptsächlich bei einer berechneten Größe von 110 kDa eluiert. Wird die Micellen Größe von 17 kDa mit eingerechnet, handelt es sich wahrscheinlich um ein Dimer (s. Abbildung 3.14). Auch für YidC wurde von Kohler und Kollegen durch Electronen-Cryo-Mikroskopie gezeigt, das YidC vermutlich als Dimer in der Membran vorkommt (Kohler et al., 2009). Dies könnte ein Hinweis auf eine ähnliche Struktur und Funktionsweise sein. Allerdings zeigte sich auch mit LDAO, dass das Protein bei längerer Lagerung in den oligomeren Zustand übergeht. Da das Chromatogramm der Gelfiltration immer zwei voneinander getrennte Peaks zeigt, scheint es aber keine weiteren „Zwischenzustände“ zu geben. Erstaunlich ist dabei, dass dieser Zustand sehr stabil ist und das Protein nicht weiter aggregiert. So wurde auch nach 50 Tagen Lagerung bei 4 °C weder eine Aggregation noch ein Abbau des Proteins festgestellt (s. Abbildung 3.15 B). Die Stabilität des Dimers konnte auch in anderen Puffern mit niedrigeren pH-Werten nicht verbessert werden (s. Abbildung 3.15 A). Auch eine Verringerung der Salzkonzentration auf 100 mM NaCl führte noch während der Dialyse zur Aggregation des Proteins. Um das Protein für die Kristallisationsversuche einzusetzen, wurde eine Gelfiltration als dritter Reinigungsschritt angefügt. Dieser Schritt war aus zwei Gründen notwendig. Zum einen musste die Reinigung für die Kristallisation in zwei Tagen durchgeführt werden, da ansonsten das Protein nicht mehr als Dimer sondern als Oligomer vorlag. Dadurch verschlechterte sich jedoch die Reinigung und ein dritter Reinigungsschritt wurde nötig. 121 4. Diskussion Zum anderen soll das Protein für die Kristallisation homogen vorliegen, dies konnte nur durch die Gelfiltration, bei der das Oligomer vom Dimer getrennt wurde, erfüllt werden. Das gereinigte Protein konnte am Ende auf eine Konzentration von 10 mg/ml eingeengt werden. Diese Konzentration ist für Kristallisationen oft bereits ausreichend. Für einen Kristallisationsscreen musste Protein aus 30 l Zellen gereinigt werden. Für weitere Screens oder Ansätze wäre zu überlegen, ob eine Fermentation dem Schüttelkolben vorzuziehen ist. So könnte mehr Zellmasse erhalten werden. Allerdings ist zu bedenken, dass die Aufarbeitung von 30 l bereits logistisch an die Laborgrenzen stößt. Deshalb muss die Expression weiter gesteigert werden. Wagner und Kollegen haben z.B. einen Stamm entwickeln (Lemo21(DE3)), in dem die Aktivität der T7 RNA Polymerase durch ihren natürlichen Inhibitor T7 Lysozym genau gesteuert werden kann. Dadurch kann die Expression nach Belieben verändert und kontrolliert werden (Wagner et al., 2008). Eine weitere Lösung könnte sein, den Wirtsorganismus zu wechseln. So entwickelten Turner und Kollegen ein System für die heterologe Expression von Membranproteinen in Halobacterium salinarum, welches das molekulare System des Bakterienrhodopsin nutzt (Turner et al., 1999). 4.2.2 Bindet Tth-IM60 an das Ribosom? Bei der Reinigung von Tth-IM60 war auffällig, dass auf den SDS-Gelen eine Bande bei ca. 30 kDa bei den verschiedenen Ansätzen immer wieder auftauchte (s. Abbildung 3.14, Stern). Deshalb wurde diese mittels Peptid-Massen-Fingerprint-Analyse (PMF) analysiert. Das Protein wurde eindeutig als L2 Protein aus E. coli identifiziert. L2 ist ein 50 S ribosomales Protein mit einer Größe von 30 kDa. Es ist hoch konserviert und an der Assoziation der 30 S und 50 S Untereinheit beteiligt. Außerdem spielt es eine große Rolle bei der tRNA Bindung sowohl an der A als auch der P Stelle. Der konservierte Histidyl-Rest an Position 229 ist zusätzlich für die Peptidyltransferase Aktivität von hoher Bedeutung (Diedrich et al., 2000). Bislang wurde für das L2 Protein keine Bindung an Ni-Ionen festgestellt, außerdem besitzt es keine Histidincluster, über die das Protein an die Ni-Ionen binden könnte. Allerdings bindet mit S15 ein anderes ribosomales Protein an IMAC-Säulen (Bolanos-Garcia & Davies, 2006; Diedrich et al., 2000). S15 ist in der 30S Untereinheit lokalisiert und bindet direkt an die 16S rRNA. Da beide Proteine jedoch nicht direkt interagieren, kann eine Bindung von L2 über S15 vermutlich ausgeschlossen werden. Eine Möglichkeit wäre, dass Tth-IM60 an L2 bindet und dieses so coeluiert wird. Da im Puffer hohe Salzkonzentrationen enthalten sind, 122 4. Diskussion können unspezifische Wechselwirkungen ausgeschlossen werden. Es ist jedoch nicht ersichtlich warum diese beiden Proteine interagieren sollten. Es ist bekannt dass Grampositive YidC Homologe sowie Oxa1 aus den Mitochondrien einen verlängerten C-Terminus besitzen mit dem sie an Ribosomen binden können (Funes et al., 2009). Dieser verlängerte C-Terminus ist in Tth-IM60 jedoch nicht vorhanden. Kohler und Kollegen konnten jedoch zeigen, dass die Bindung am ribosomalen L23 erfolgt (Kohler et al., 2009). Dieses ist in der 50 S Untereinheit am Polypeptid-Ausgangskanal lokalisiert und bindet sowohl an den Triggerfaktor, an Ffh und an naszierende Ketten. Um die Bindung zwischen L2 und Tth-IM60 zu verifizieren, müssen weitere Interaktionsstudien durchgeführt werden. Außerdem sollten auch die anderen Fremdproteine, die nach der 1. Reinigung noch vorhanden sind, identifiziert werden. So könnten mehrere ribosomale Proteine darauf hinweisen, dass Tth-IM60 wirklich an Ribosomen bindet. 4.2.3 Tth-IM60 besitzt sowohl in vivo als auch in vitro die gleichen Funktionen wie YidC Die Funktionen von YidC wurden bereits im Jahr 2000 beschrieben und können in zwei verschiedene Bereiche eingeteilt werden. Zum einen besitzt YidC eine Sec-abhängige Funktion und ist dabei über den SecDFYajC-Komplex an die Translokationspore gebunden (Nouwen & Driessen, 2002). Es wird davon ausgegangen, dass YidC in diesem Zusammenhang als Chaperon wirkt und die Assemblierung und Faltung von Membranproteinen unterstützt. Andererseits vermittelt YidC Sec-unabhängig die Insertion von meist einspännigen Membranproteinen (Samuelson et al., 2000). Bislang konnten für die endogenen Proteine MscL (mechanosensitive channel of large conductance) und F0c (Untereinheit c der F1F0 ATP-Synthase) sowie die Phagenhüllproteine M13 procoat und Pf3 coat eine Sec-unabhängige Insertion mit YidC gezeigt werden (Chen et al., 2002; Facey et al., 2007; Samuelson et al., 2000; van der Laan et al., 2004). Die Arbeitsgruppe um van Bloois konnte außerdem nachweisen, dass diese Sec-unabhängige Insertasefunktion evolutionär konserviert und für das Zellwachstum essentiell ist (van Bloois et al., 2005). 123 4. Diskussion Um beide Funktionen mit Tth-IM60 zu testen wurden drei verschiedene Methoden durchgeführt: - Komplementationsversuche, um zu zeigen, dass Tth-IM60 die Funktion von YidC in vivo ersetzten kann - Bindungsstudien mit SecF, um Hinweise auf eine Sec-abhängige Funktion zu erhalten - Translokationsstudien mit Pf3, zur Überprüfung der Sec-unabhängigen Funktion. Die Komplementationsversuche wurden wie in Kapitel 2.4.3 beschrieben durchgeführt. Als Stamm wurde, wie bei der Komplementation mit TRAM, MK6S und als Plasmide pGZ-tthIM60, pGZ-yidC (Positivkontrolle) und pGZ (Negativkontrolle) verwendet. Das Wachstum der MK6S Zellen mit pGZ-tthIM60 auf Glucose + IPTG zeigt, dass Tth-IM60 die essentiellen Funktionen von YidC in der Zelle übernehmen kann (s. Abbildung 3.16). Gleichzeitig bedeutet das Ergebnis auch, dass das Protein in E. coli funktionell exprimiert werden kann. Als Bindungsstudie zum Nachweis einer Interaktion zwischen Tth-IM60 und SecF wurde ein Pulldown-Assay durchgeführt (s. 2.4.1). Dieser Assay beruht darauf, dass ein Protein über ein Affinitätstag an eine Matrix immobilisiert wird und dort mit anderen Proteinen interagieren kann. Kommt es zu einer Interaktion können die Proteine gemeinsam eluiert werden. Mit dieser Methode konnte S. Polzin in ihrer Diplomarbeit eine Interaktion zwischen YidC und der 1. periplasmatischen Domäne von SecF nachweisen (Polzin, 2008). Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurde lediglich der 1. periplasmatische Loop von SecF (42-148 AS) für die Bindung eingesetzt. Dieses Protein wurde als MBP-SecF100 Fusionsprotein gereinigt und mir freundlicherweise von S. Polzin zur Verfügung gestellt. Da beide Proteine eine ähnliche Größe von ca. 48 kDa aufweisen, musste die Interaktion mittels Immunoblot und ECL detektiert werden. Beide Proteine konnten in der Elutionsfraktion detektiert werden womit eine Interaktion zwischen den beiden Proteinen stattgefunden haben muss (s. 3.7.1, Abbildung 3.22). Tth-IM60 konnte über seinen C-terminalen His-tag komplett an die Ni-Matrix binden, wohingegen MBP-SecF100 nur über die Bindung an Tth-IM60 an die Ni-Matrix binden konnte. Allerdings hat nur ein geringer Teil von MBP-SecF100 gebunden, das meiste Protein wurde im Durchlauf detektiert. Auffällig ist auch, dass obwohl mehr Tth-IM60 eingesetzt wurde, die Banden von MBP-SecF100 deutlich stärker auf dem Blot detektiert 124 4. Diskussion wurden. Dieser Unterschied kommt daher, dass unterschiedliche Antikörper für die Detektion eingesetzt werden mussten (-His-tag für Tth-IM60 und -MBP für MBPSecF100). Aufgrund der gewählten Detektionsmethode und dem deutlichen Sensitivitätsunterschied der Antikörper war eine quantitative Bestimmung der Bindung nicht möglich. Da bei der Negativkontrolle ohne Tth-IM60 keine Bande in der Elutionsfraktion detektiert werden konnte, deutet das Ergebnis auf eine, wenn auch schwache Bindung von SecF und Tth-IM60 hin. Diese schwache Bindung kann mehrere Gründe haben. Für den Versuch wurde das SecF Protein aus E. coli verwendet und nicht der natürliche Bindungspartner aus T. thermophilus. Zwar besitzt auch T. thermophilus ein SecF Homolog, allerdings bildet es zusammen mit SecD ein Fusionsprotein (TSecDF). Der Vergleich der Aminosäuresequenz von SecF und TSecDF zeigt im Bereich der 1. periplasmatischen Domäne lediglich an den beiden Enden (44 – 57 AS und 125 – 142 AS) eine hohe Übereinstimmung (s. Abbildung 3.23). Wenn davon ausgegangen wird, dass nur die homologen Bereiche für die Bindung essentiell sein können, könnte das eine Bindung zwischen SecF und Tth-IM60 erklären. Diese Annahme wird durch die Ergebnisse weiterer Pulldown-Assays gestützt, in denen S. Polzin zeigen konnte, dass bereits die Aminosäuren 42 – 73 von SecF für eine Bindung an YidC ausreichend sind. Auf Seiten von YidC konnten Xie und Kollegen durch Deletionsmutanten einen Bereich der für die Interaktion zu SecF verantwortlich ist den Aminosäuren 215 – 265 zuordnen (Xie et al., 2006). Beim Vergleich zwischen YidC und Tth-IM60 ist dieser Bereich jedoch sehr unterschiedlich und weist nahezu keine Ähnlichkeit auf (s. Abbildung 3.2). Dies würde die schwache Bindung zwischen SecF und Tth-IM60 erklären, wobei es dann überrascht, dass es überhaupt zu einer Interaktion kommen konnte. Allerdings konnten bei neueren Untersuchungen mittels NMR keine Interaktionen zwischen P1 und SecF nachgewiesen werden (Ravaud et al., 2008a). Durch die Kristallisation des P1 Loops konnte gleichzeitig gezeigt werden, dass die vermeintliche Binderegion für die Faltung des gesamten P1 Loops wichtig ist (Ravaud et al., 2008a). Es ist daher möglich, dass die Bindung doch an anderer Stelle im Protein erfolgt. Es ist jedoch auch möglich, dass SecF aufgrund hydrophober Wechselwirkungen an Tth-IM60 binden konnte. Um eine Bindung und damit eine Sec-abhängige Funktion zweifelsfrei festzustellen, wird empfohlen in nachfolgenden Arbeiten TSecDF als Bindungspartner einzusetzen. 125 4. Diskussion Zur Überprüfung der Insertasefunktion von Tth-IM60 wurde als Substrat das Phagenhüllprotein des Pseudomonas aeruginosa Phagen Pf3 verwendet. Pf3 coat ist mit 4,6 kDa ein relativ kleines einzelspänniges Membranprotein und besteht aus 44 Aminosäuren. Das Protein wird YidC-abhängig mit der NoutCin-Orientierung in die Innenmembran inseriert (Chen et al., 2002). Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass Pf3 coat während der Translokation mit den Transmembranen 1 und 3 von YidC interagiert (Klenner et al., 2008). Eine neuere Methode, um die Translokation in Echtzeit zu verfolgen, ist die Einzelmolekülspektroskopie, die auch in dieser Doktorarbeit verwendet wurde. Diese Methode wurde von A. Schönbauer und S. Ernst für die Translokation von Fluoreszenz-gelabelten Pf3 coat Molekülen in YidC-Proteoliposomen entwickelt. Sie konnten mit dieser Methode den Einbau von Pf3 coat zeigen und auch, dass die Translokation in vitro bereits nach 5 min abgeschlossen ist. Die Methode basiert auf der zeitlichen Differenz, die freie bzw. an Proteoliposomen gebundene Pf3Moleküle benötigen, um durch ein konfokales Volumen zu diffundieren. An Proteoliposomen gebundene Pf3-Moleküle verursachen beim Diffundieren sogenannte Bursts. Diese werden für die Auswertung analysiert, aus je 10 Messungen addiert und gegen die Zeit aufgetragen (s. 2.4.2). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Pf3 coat an Tth-IM60 Proteoliposomen binden kann und auch in diese eingebaut wird (s. 3.8, Abbildung 3.24 und Abbildung 3.25). Die Auswertung zeigt, dass bereits die Bindung an Proteoliposomen effizienter war, als an reine Liposomen. Während bei der Bindung an die Proteoliposomen bis zu 8 Bursts/30 sec detektiert wurden, waren es bei den Liposomen maximal 5. Auch ist bei der Bindung an Liposomen kein kontinuierlicher Anstieg zu erkennen, der bei gezielter Bindung erwartet wird. Dieser Anstieg ist besonders gut bei dem Einbau von Pf3 in Proteoliposomen zu erkennen. So nimmt die Zahl der Bursts/30 sec von 2 auf 14 in den ersten 210 sec kontinuierlich zu und bleibt dann konstant bei 14 +/-1 Bursts/30 sec. Im Gegensatz dazu wird in reine Liposomen nahezu kein Pf3 eingebaut, wobei zu beachten ist, dass hier die Werte nur aus 3 Messungen addiert wurden. Die Auswertung zeigt jedoch auch, dass mehr Protein eingebaut wurde, als eigentlich gebunden hat. Diese Diskrepanz ist auf verschiedene Lipidbatches zurückzuführen. Deshalb war es besonders wichtig, alle zusammengehörigen Versuche mit dem gleichen Lipidbatch durchzuführen. Ein weiteres Phänomen ist, dass die Anzahl der Bursts bei allen Messungen zum Ende hin abnehmen. Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass der Fluoreszenz-Farbstoff durch 126 4. Diskussion den Laser oder den Puffer ausbleicht. Bei vergleichbaren Messung mit YidC konnte dieses Phänomen jedoch nicht festgestellt werden. Zusammengefasst haben alle drei Methoden zur Funktionsanalyse gezeigt, dass TthIM60 die gleichen Funktionen wie YidC besitzt. Damit wurde bewiesen, dass es sich um ein Homolog von YidC handelt. Eindeutig konnte die essentielle Sec-unabhängigen Funktion nachgewiesen werden. Ob Tth-IM60 wirklich an SecF bindet muss in nachfolgenden Arbeiten geklärt werden. 4.2.4 Strukturvergleich der Proteine YidC, Aq-YidC und Tth-IM60 mittels CD Eine Möglichkeit auch mit geringen Proteinkonzentrationen Strukturen zu untersuchen bietet die CD-Spektroskopie. Mit dieser Methode können nur die relativen Anteile der verschiedenen Sekundärstrukturen, nicht aber die Tertiär- oder Quartärstrukturen berechnet werden. In dieser Arbeit wurde die CD-Spektroskopie verwendet, um die Strukturen von YidC, Tth-IM60 und Aq-YidC miteinander zu vergleichen und insbesondere Hinweise zur Temperaturstabilität zu erlangen. Aq-YidC ist das homologe YidC Protein aus dem hyperthermophilen Bakterium A aeolicus und wurde in der Diplomarbeit von S. Grenz als temperaturstabiles Protein beschrieben. Die Messungen mit Tth-IM60 und Aq-YidC wurden im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt. Die Daten von YidC wurden mir freundlicherweise von Dr. U. Gerken zur Verfügung gestellt (Winterfeld et al., 2009). Die CD-Spektren wurden in einem Wellenlängenbereich von = 185 - 260 nm aufgenommen. Winterfeld und Kollegen haben gezeigt, dass Detergenzien einen Einfluss auf die Struktur von YidC haben können (Winterfeld et al., 2009). Daher wurden alle Proteine in Dodecylmaltosid (DDM) gereinigt und gemessen (s. 3.6.1). Die Berechnung der prozentualen Anteile erfolgte mit den Programmen Contin-LL und CDSSTR mit dem DichroWeb Onlineserver (s. 3.6.1, Tabelle 4.1 und Tabelle 4.2). Tabelle 4.1: Übersicht der prozentualen Sekundärstrukturanteile von Tth-IM60, Aq-YidC und YidC Angegeben sind die Mittelwerte für die Berechnung mit Contin-LL und CDSSTR Protein Tth-IM60 Aq-YidC YidC Programm Contin CDSSTR Contin CDSSTR Contin CDSSTR Helix 49 % 55 % 51 % 57 % 36 % 38 % Faltblatt 14 % 13 % 10 % 9% 15 % 20 % 127 Schleife 17 % 14 % 18 % 15 % 22 % 19 % Unordered 21 % 18 % 22 % 20 % 27 % 25 % 4. Diskussion Tabelle 4.2: Übersicht zur Anzahl an Aminosäurereste der untersuchten Proteine MW: Molekulargewicht, AS: Aminosäuren, P1: 1. periplasmatische Loop, TMD: Transmembrandomäne Protein Tth-IM60 Aq-YidC YidC MW (AS) 48 kDa (430 AS) 55 kDa (502 AS) 61 kDa (548 AS) Anzahl AS P1 (% bezogen auf das Gesamtprotein) 227 AS (52 %) 282 AS (56 %) 332 AS (60 %) Anzahl AS TMD 2-6 195 AS 203 AS 205 AS Die Auswertung der -helikalen Anteile ergab für die Proteine Tth-IM60 (bis zu 55 %) und Aq-YidC (bis zu 57 %) einen deutlich höheren prozentualen Anteil als für YidC (bis zu 38 %). Dementsprechend ist der Gehalt an Faltblattstrukturen bei YidC (~ 20 %) deutlich höher als bei den thermophilen Homologen Tth-IM60 (~ 14 %) und Aq-YidC (~ 10 %). Ähnliches gilt für Strukturen von -Schleifen, wobei hier der Gehalt in YidC bei ca. 20 % und damit um 4 - 5 % Punkte höher liegt als bei Tth-IM60 und Aq-YidC. Durch die Aufklärung der Struktur von P1 aus YidC ist bekannt, dass dieser hauptsächlich aus Faltblattstrukturen besteht und nur wenig -Helices darin vorkommen (Ravaud et al., 2008a). Die berechneten Werte bestätigen daher die Annahme, dass aufgrund des kürzeren 1. periplasmatischen Loops (P1) auch der Anteil an Faltblattstrukturen bei Tth-IM60 und Aq-YidC niedriger ist als bei YidC. Der deutlich höhere -helikale Anteil in den Proteinen Tth-IM60 und Aq-YidC ist auch ein Hinweis darauf, dass es sich um Proteine aus thermophilen Organismen handelt. So konnte gezeigt werden, dass in homologen Proteinen aus thermophilen Organismen mehr Aminosäuren eine -helikale Konformation annehmen als in mesophilen Organismen (Kumar et al., 2000). Das würde auch erklären, dass das Aq-YidC Protein aus dem Organismus mit der höchsten Wachstumstemperatur den höchsten -helikalen Anteil aufweist. Es muss jedoch darauf hingewiesen werden, dass die CDSpektroskopie nur mit Einschränkungen für Membranproteine genutzt werden kann. Untersuchungen von Membranproteinen, deren Strukturen bereits bekannt waren, haben eine hohe Diskrepanz zu den CD Werten gezeigt (Wallace et al., 2003). Mögliche Ursachen können sein, dass die Sekundärstruktur mit Hilfe von Datenbanken bekannter Strukturen berechnet wird. Bislang gibt es aber nur sehr wenige bekannte Strukturen von Membranproteinen. Außerdem erzeugen Detergenzien einen sogenannten „solvent shift“, der Spektren zu längeren Wellenlängen hin verschiebt. Da 128 4. Diskussion jedoch bei allen das gleiche Detergenz verwendet wurde, sollten die Werte untereinander vergleichbar sein. Die tatsächliche Struktur kann nur mittels NMR (nuclear magnetic resonance) oder durch Kristallstrukturanalyse ermittelt werden. Für die Ermittlung der Faltungsstabilität wurde eine Schmelzkurve bei konstanter Wellenlänge von = 222 nm mittels CD-Spektroskopie mit einem gleichmäßigen Temperaturanstieg von 1 °C/min aufgenommen. Der Verlauf der Schmelzkurve zeigt die Veränderung der -helikalen Strukturen und damit die Denaturierung. Bei der Denaturierung kommt es aufgrund von äußeren Einflüssen zu einer Zerstörung der Sekundär- bzw. Tertiärstruktur, da nichtkovalente Bindungen wie Wasserstoffbrücken oder hydrophobe Wechselwirkungen innerhalb des Proteins gespalten werden. Die verschiedenen Bindungsarten sorgen für die Stabilität eines Proteins. Proteine aus thermophilen Organismen besitzen oft eine höhere Stabilität und dadurch einen erhöhten Schmelzpunkt im Vergleich zu ihren mesophilen Homologen. Die Berechung der Schmelztemperatur ergab 68 °C für Tth-IM60 und für Aq-YidC 87 °C. Damit liegen diese beiden Temperaturen relativ weit auseinander obwohl beide Proteine aus thermophilen Organismen stammen. Allerdings besitzt Aquifex mit 85 °C auch eine deutlich höhere optimale Wachstumstemperatur als T. thermophilus mit 72 °C. Als Schmelzpunkt für YidC wurde von Dr. U. Gerken eine Temperatur von 58 °C ermittelt. Diese ist um weitere 10 °C niedriger als die Schmelztemperatur von Tth-IM60 und bestätigt damit die Annahme, dass Proteine aus thermophilen Organismen eine höhere Temperaturstabilität auch außerhalb des Organismus aufweisen als Proteine aus mesophilen Organismen. Außerdem zeigt die Schmelzkurve von YidC einen langen Übergang zwischen nativem und denaturiertem Zustand und damit eine hohe Instabilität bereits bei niedrigeren Temperatur (35 °C). Das stabilste der drei untersuchten Proteine ist unter den getesteten Bedingungen das Aq-YidC Protein aus dem Organismus mit der höchsten Wachstumstemperatur. Der Schmelzpunkt ist jedoch stark abhängig von den äußeren Bedingungen. Deshalb ist zu vermuten, dass besonders in T. thermophilus die Membran das Protein zusätzlich stabilisiert und vor einer Denaturierung schützt, da die Schmelztemperatur mit 68 °C unter der optimalen Wachstumstemperatur (72 °C) des Organismus liegt. 129 4. Diskussion 4.2.5 Kristallisation von Tth-IM60 Nachdem ganze Genome sequenziert und die Gene mit den dazugehörigen Proteinen entschlüsselt wurden, steht nun die Proteinstruktur im Fokus der Wissenschaft. Durch die Aufklärung der Sekundär- und Tertiärstrukturen von Proteinen können die Funktionsweisen biochemisch verstanden und analysiert werden. Als erste Kristallstruktur wurde 1960 das Myoglobin von Kendrew und Kollegen veröffentlicht (Kendrew et al., 1960). Jedoch erst 1985 gelang es der Arbeitsgruppe um Deisenhofer das erste Membranprotein zu kristallisieren (Deisenhofer et al., 1985). Die Zahl der aufgeklärten Strukturen wächst inzwischen exponentiell an, wobei die löslichen Proteine die Mehrheit darstellen (s. Abbildung 4.2). Inzwischen sind mehr als 66 000 Strukturen veröffentlicht worden und können in der „protein data bank“ abgerufen werden. Unter diesen Strukturen befinden sich allerdings nur 263 verschiedene Membranproteine. Dies hängt vor allem mit der oft zu geringen Expression von funktionell aktivem Protein und der ungleichmäßigen Kristallisation zusammen. Abbildung 4.2: Entwicklung der Aufklärung von 3D Strukturen bei Membranproteinen A: Vergleich der Anzahl an Strukturen von löslichen Proteinen und Membranproteinen in den ersten 15 Jahren nach der 1. beschriebenen Kristallstruktur B: Entwicklung der aufgeklärten Membranproteinstrukturen von 1985 bis heute. Quelle: http://blanco.biomol.uci.edu/Membrane_Proteins_xtal.html (White, 2009) Zur Aufklärung von Proteinstrukturen gibt es prinzipiell drei Möglichkeiten: die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR), die Elektronenkristallographie mit 2D Kristallen und die Röntgenstrukturanalyse. Der Vorteil bei NMR besteht darin, dass sich das Protein während der Messung in wässriger Lösung, also bei löslichen Proteinen in der 130 4. Diskussion natürlichen Umgebung befindet. Diese Umgebung ist für Membranproteine jedoch nicht von Vorteil und daher ist die normale NMR nicht unbedingt für Membranproteine geeignet. Auch aus diesem Grund wurde die Struktur von den meisten Membranproteinen bislang über die Kristallstruktur analysiert. Die Analyse dieser Kristalle kann über Elektronenbeugung (2D Kristalle) oder Röntgenbeugung (3D Kristalle) erfolgen. Wobei die Röntgenstrukturanalyse die genaueren Ergebnisse liefert. Diese Methode wurde auch für die Kristallisation von Tth-IM60 angewandt, die in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. I. Sinning am BZH in Heidelberg durchgeführt wurde. Um gleichmäßige Kristalle zu bekommen ist in erster Linie ein gereinigtes, homogenes Protein mit hoher Konzentration nötig. Wie bereits gezeigt wurde, konnte Tth-IM60 in der benötigten Reinheit und Konzentration hergestellt werden (s. 4.2.1). Außerdem müssen die Kristallisations-Bedingungen und -Parameter für jedes Protein individuell bestimmt werden. Dies wurde in automatisierten Screens durchgeführt (Ravaud et al., 2008b). So konnten nach 40 Tagen erste Tth-IM60 Kristalle detektiert werden (s. Abbildung 3.26). Diese sind mit 0,2 M NaCl, 0,1 M Bis-Tris, pH 5,5 und 25 % PEG3350 gewachsen und konnten auch als Proteinkristalle verifiziert werden. Mit den Kristallen konnte in Diffraktionstests eine Auflösung von 10 Å erreicht werden. Diese Auflösung ist jedoch für eine Strukturanalyse zu gering. Daher ist es erforderlich größere Mengen an Protein für die Kristallisation einzusetzen und die Bedingungen weiter zu verbessern. Im Rahmen dieser Arbeit war dies jedoch nicht mehr möglich. Eine Alternative zur Röntgenstrukturanalyse wäre auch die Elektronenkristallographie, bei der nur ein geringes Volumen eingesetzt werden müsste. Aufgrund der guten Stabilität nach der Reinigung und der Eigenschaft auch nach längerer Lagerzeit nicht zu aggregieren, erfüllt das Tth-IM60 Protein die wichtigsten Voraussetzungen für eine erfolgreiche Kristallisation. 131 132 5. Zusammenfassung 5. Zusammenfassung Die Proteine der evolutionär konservierten YidC/Oxa1/Alb3-Familie sind an der Insertion von integralen Membranproteinen in Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten beteiligt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Protein Tth-IM60 aus Thermus thermophilus als Mitglied dieser Familie identifiziert, sowie funktionell und strukturell näher charakterisiert. So konnte mit Komplementationsstudien, die in vivo mit einem Escherichia coli YidCDepletionsstamm durchgeführt wurden, gezeigt werden, dass Tth-IM60 das YidC Protein funktionell ersetzen kann. Außerdem konnte Tth-IM60 heterolog in E. coli C43 Zellen im pMS-Vektor mit einem C-terminalen His-tag exprimiert werden. Bei der Solubilisierung zeigte sich, dass das Protein in der Zelle vermutlich als Dimer vorliegt, allerdings nach der Reinigung dazu tendiert in einen höheren Oligomerzustand überzugehen, der nicht spezifiziert werden konnte. In diesem Zustand ist das Protein jedoch für mindestens 50 Tage sehr stabil. Mit Hilfe von Größenausschlusschromatographien konnten das zwitterionische Detergenz LDAO und der Puffer aus 20 mM TrisHCl pH 8,5, 500 mM NaCl und 10 % Glyzerin als optimal für die Stabilität und Reinigung identifiziert werden. In diesem Puffer gelang es, das Protein über zwei Affinitäts- und eine Gelfiltrationschromatographie als Dimer zu reinigen und eine Konzentration von 10 mg/ml Protein als Voraussetzung für projektierte Kristallisationsversuche zu erreichen. Mit in vitro Pulldown-Assays konnte eine schwache Bindung zwischen Tth-IM60 und der ersten periplasmatischen Domäne von SecF nachgewiesen werden, die auf eine Secabhängige Funktion von Tth-IM60 schließen lässt. Des Weiteren konnte die als essentiell beschriebene Sec-unabhängige YidC-Funktion durch die Translokation des YidC-Substratproteins Pf3 coat in Tth-IM60 Proteoliposomen mittels Einzelmolekülspektroskopie nachgewiesen werden. Kinetische Versuche ließen darauf schließen, dass die Translokation von Pf3 coat Protein innerhalb von fünf Minuten abgeschlossen ist. Strukturanalysen von Tth-IM60 mittels Zirkulardichroismusspektroskopie zeigten einen Anteil von 49 – 55 % -Helix, 13 - 14 % -Faltblatt, 14 – 17 % -Schleife und 18 - 21% ungeordnete Sekundärstruktur. Im Vergleich zu YidC besitzt Tth-IM60 einen deutlich höheren -helikalen und einen niedrigeren -Faltblatt Anteil, der mit dem deutlich kürzeren periplasmatischen Loop erklärbar ist. Der Schmelzpunkt von Tth-IM60 liegt bei 133 5. Zusammenfassung 68 °C und ist damit um 10 °C höher als der von YidC. Außerdem gelang es, das Tth-IM60 Protein zu kristallisieren und erste Diffraktionstests durchzuführen. Aufgrund der bislang zu geringen Auflösung konnte die Struktur jedoch noch nicht abschließend aufgeklärt werden. In einem zweiten Teil dieser Arbeit konnte auch das „translocating chain-associated membrane“ (TRAM) Protein aus X. laevis in E. coli C43 als Fusionsprotein mit Nterminalem MBP (Maltosebindeprotein) und C-terminalem His-tag heterolog exprimiert werden. Dieses Protein ist zusammen mit dem Sec61-Komplex an der Insertion von integralen Membranproteinen im Endoplasmatischen Retikulum (ER) beteiligt. Im Gegensatz zu den Sec-Komponenten gibt es im ER jedoch kein homologes YidC Protein. Daher könnten funktionelle Ähnlichkeiten zwischen TRAM und YidC existieren. Das TRAM Protein konnte mittels zweier verschiedener Affinitätschromatographien (IMAC und Amylose) gereinigt und anschließend in Liposomen rekonstituiert werden. Translokationsstudien mit Pf3 zeigten eine sehr schwache Bindung und sehr geringe Einbausignale, vergleichbar mit Liposomen. Auch in vivo Komplementationsstudien zeigten keine funktionelle Aktivität von TRAM, die YidC in E. coli ersetzen kann. Nach diesen Ergebnissen konnte dem TRAM Protein keine YidC vergleichbare zelluläre Funktion zugewiesen werden. 134 6. Summary 6. Summary The evolutionarily conserved YidC/Oxa1/Alb3 family of proteins catalyzes the insertion of integral membrane proteins in bacteria, mitochondria, and chloroplasts. In this work Tth-IM60 from Thermus thermophilus was identified as a member of this family. The function and structure of the protein was analysed in detail. Complementation studies in a Escherichia coli YidC-depletion strain show a functional replacement of the essential YidC by Tth-IM60 in vivo. A heterologous expression of the his-tagged Tth-IM60 protein was achieved in the E. coli strain C43 and pMS as a plasmid vector. It was shown that Tth-IM60 protein is located in the inner membrane probably in a dimeric state. After purification the protein tends to oligomerize in a higher, but very stable oligomeric state. The Tth-IM60 oligomeric protein was stable for 50 days at least. By size-exclusion chromatography the zwitterionic detergent LDAO and a buffer containing 20 mM TrisHCl pH 8,5, 500 mM NaCl and 10 % glycerol were identified as the best conditions for purification and stability. With this buffer, Tth-IM60 was purified as a dimer via its C-terminal histag by two Ni-IMACs (immobilized metal affinity chromatography) and a size-exclusion chromatography. A final protein concentration up to 10 mg/ml was feasible. The purified Tth-IM60 protein was used for functional and structural studies. A weak binding of Tth-IM60 to the first periplasmic loop of SecF as shown by pulldown assays, suggests a Sec-dependent function of Tth-IM60. In addition, the essential Sec-independent function of Tth-IM60 was demonstrated by the translocation of the YidC substrate Pf3 coat into Tth-IM60 proteoliposomes. Moreover, the results of the single molecule spectroscopy measurements implicate that the translocation of Pf3 coat proteins occurs with a fast kinetics within 5 minutes. The secondary structure of the Tth-IM60 protein was analysed by circular dichroism spectroscopy: 49 – 55 % -helical, 13 - 14 % -sheet, 14 – 17 % -turns and 18 - 21% unordered structures were calculated. Tth-IM60 comprises more -helical structures, but less -sheets than YidC, probably because of the first periplasmic loop of Tth-IM60 being shorter. The melting point of Tth-IM60 was determined to 68 °C, which is 10 degrees higher than the melting point of YidC. Furthermore, the Tth-IM60 protein was crystallized and X-ray analysis was performed. However, due to the low resolution the structure of the Tth-IM60 protein could not be determined so far. The second part of this thesis concerns the “translocating chain-associated membrane” (TRAM) protein. The TRAM protein is involved in the insertion of integral membrane 135 6. Summary proteins of the endoplasmic reticulum (ER) together with the Sec61-complex. In contrast to the Sec-components, no homologous YidC protein exists in the ER-membrane. Therefore, it was postulated that TRAM and YidC could have functional similarities. For functional studies the TRAM protein from X. laevis was expressed in E. coli as a fusion protein with a N-terminal MBP (maltose-binding protein) and a C-terminal histag. TRAM was purified via two different affinity matrices: Ni sepharose and an amylose resin. It was possible to reconstitute the fusion protein into liposomes. However a translocation of the YidC-substrate Pf3 coat into these proteoliposomes was not detectable. In addition, complementation studies with a YidC-depletion strain did not show that the essential YidC function can be replaced by TRAM in vivo. 136 7. Literaturverzeichnis 7. Literaturverzeichnis Ames, B. N. (1966). [10] Assay of inorganic phosphate, total phosphate and phosphatases. In Methods in Enzymology, pp. 115-118: Academic Press. Andersson, H. & von Heijne, G. (1994). Membrane protein topology: effects of delta mu H+ on the translocation of charged residues explain the 'positive inside' rule. Embo J 13, 2267-2272. Angelini, S., Deitermann, S. & Koch, H. G. (2005). FtsY, the bacterial signalrecognition particle receptor, interacts functionally and physically with the SecYEG translocon. EMBO Rep 6, 476-481. Balzer, D., Ziegelin, G., Pansegrau, W., Kruft, V. & Lanka, E. (1992). KorB protein of promiscuous plasmid RP4 recognizes inverted sequence repetitions in regions essential for conjugative plasmid transfer. Nucleic Acids Res 20, 1851-1858. Bechtluft, P., Nouwen, N., Tans, S. J. & Driessen, A. J. (2010). SecB--a chaperone dedicated to protein translocation. Mol Biosyst 6, 620-627. Beck, K., Eisner, G., Trescher, D., Dalbey, R. E., Brunner, J. & Muller, M. (2001). YidC, an assembly site for polytopic Escherichia coli membrane proteins located in immediate proximity to the SecYE translocon and lipids. EMBO Rep 2, 709-714. Bellafiore, S., Ferris, P., Naver, H., Gohre, V. & Rochaix, J. D. (2002). Loss of Albino3 leads to the specific depletion of the light-harvesting system. Plant Cell 14, 2303-2314. Berg, B. v. d., Clemons, W. M., Collinson, I., Modis, Y., Hartmann, E., Harrison, S. C. & Rapoport, T. A. (2004). X-ray structure of a protein-conducting channel. Nature 427, 36-44. Berks, B. C., Sargent, F. & Palmer, T. (2000). The Tat protein export pathway. Mol Microbiol 35, 260-274. Bessonneau, P., Besson, V., Collinson, I. & Duong, F. (2002). The SecYEG preprotein translocation channel is a conformationally dynamic and dimeric structure. EMBO J 21, 995-1003. Bolanos-Garcia, V. M. & Davies, O. R. (2006). Structural analysis and classification of native proteins from E. coli commonly co-purified by immobilised metal affinity chromatography. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects 1760, 13041313. Bonnefoy, N., Chalvet, F., Hamel, P., Slonimski, P. P. & Dujardin, G. (1994). OXA1, a Saccharomyces cerevisiae nuclear gene whose sequence is conserved from prokaryotes to eukaryotes controls cytochrome oxidase biogenesis. J Mol Biol 239, 201212. 137 7. Literaturverzeichnis Braig, D., Bar, C., Thumfart, J. O. & Koch, H. G. (2009). Two cooperating helices constitute the lipid-binding domain of the bacterial SRP receptor. J Mol Biol 390, 401413. Brock, T. D. & Freeze, H. (1969). Thermus aquaticus gen. n. and sp. n., a nonsporulating extreme thermophile. J Bacteriol 98, 289-297. Brock, T. D. (1978). Thermophilic Microorganisms and Life at High Temperatures: Springer-Verlag. Brundage, L., Hendrick, J. P., Schiebel, E., Driessen, A. J. & Wickner, W. (1990). The purified E. coli integral membrane protein SecY/E is sufficient for reconstitution of SecA-dependent precursor protein translocation. Cell 62, 649-657. Bullock, W. O., Fernandez, J.M. and Short, J.M. (1987). XL1-Blue: A high efficiency plasmid transforming recA Escherichia coli strain with beta-galactosidase selection. Bio Techniques 5, 376. Cabelli, R. J., Dolan, K. M., Qian, L. P. & Oliver, D. B. (1991). Characterization of membrane-associated and soluble states of SecA protein from wild-type and SecA51(TS) mutant strains of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry 266, 24420-24427. Casadaban, M. J. & Cohen, S. N. (1980). Analysis of gene control signals by DNA fusion and cloning in Escherichia coli. J Mol Biol 138, 179-207. Cava, F., Hidalgo, A. & Berenguer, J. (2009). Thermus thermophilus as biological model. Extremophiles 13, 213-231. Celebi, N., Yi, L., Facey, S. J., Kuhn, A. & Dalbey, R. E. (2006). Membrane biogenesis of subunit II of cytochrome bo oxidase: contrasting requirements for insertion of N-terminal and C-terminal domains. J Mol Biol 357, 1428-1436. Chen, M., Samuelson, J. C., Jiang, F., Muller, M., Kuhn, A. & Dalbey, R. E. (2002). Direct interaction of YidC with the Sec-independent Pf3 coat protein during its membrane protein insertion. J Biol Chem 277, 7670-7675. Chirico, W. J., Waters, M. G. & Blobel, G. (1988). 70K heat shock related proteins stimulate protein translocation into microsomes. Nature 332, 805-810. Chung, C. T., Niemela, S. L. & Miller, R. H. (1989). One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc Natl Acad Sci U S A 86, 2172-2175. Dalbey, R. E. (1991). Leader peptidase. Mol Microbiol 5, 2855-2860. Dalbey, R. E. & Von Heijne, G. (1992). Signal peptidases in prokaryotes and eukaryotes--a new protease family [published erratum appears in Trends Biochem Sci 1993 Jan;18(1):25]. Trends Biochem Sci 17, 474-478. 138 7. Literaturverzeichnis Dalbey, R. E. & Kuhn, A. (2004). YidC family members are involved in the membrane insertion, lateral integration, folding, and assembly of membrane proteins. J Cell Biol 166, 769-774. Deckert, G., Warren, P. V., Gaasterland, T. & other authors (1998). The complete genome of the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus. Nature 392, 353-358. Deisenhofer, J., Epp, O., Miki, K., Huber, R. & Michel, H. (1985). Structure of the protein subunits in the photosynthetic reaction centre of Rhodopseudomonas viridis at 3[angst] resolution. Nature 318, 618-624. Deshaies, R. J., Koch, B. D., Werner-Washburne, M., Craig, E. A. & Schekman, R. (1988). A subfamily of stress proteins facilitates translocation of secretory and mitochondrial precursor polypeptides. Nature 332, 800-805. Deshaies, R. J., Sanders, S. L., Feldheim, D. A. & Schekman, R. (1991). Assembly of yeast Sec proteins involved in translocation into the endoplasmic reticulum into a membrane-bound multisubunit complex. Nature 349, 806-808. di Guan, C., Li, P., Riggs, P. D. & Inouye, H. (1988). Vectors that facilitate the expression and purification of foreign peptides in Escherichia coli by fusion to maltosebinding protein. Gene 67, 21-30. Diedrich, G., Spahn, C. M. T., Stelzl, U., Schafer, M. A., Wooten, T., Bochkariov, D. E., Cooperman, B. S., Traut, R. R. & Nierhaus, K. H. (2000). Ribosomal protein L2 is involved in the association of the ribosomal subunits, tRNA binding to A and P sites and peptidyl transfer. EMBO J 19, 5241-5250. Do, H., Falcone, D., Lin, J., Andrews, D. W. & Johnson, A. E. (1996). The cotranslational integration of membrane proteins into the phospholipid bilayer is a multistep process. Cell 85, 369-378. du Plessis, D. J., Nouwen, N. & Driessen, A. J. (2006). Subunit a of cytochrome o oxidase requires both YidC and SecYEG for membrane insertion. J Biol Chem 281, 12248-12252. Duser, M. G., Zarrabi, N., Cipriano, D. J., Ernst, S., Glick, G. D., Dunn, S. D. & Borsch, M. (2009). 36 degrees step size of proton-driven c-ring rotation in FoF1-ATP synthase. EMBO J 28, 2689-2696. Economou, A. & Wickner, W. (1994). SecA promotes preprotein translocation by undergoing ATP-driven cycles of membrane insertion and deinsertion. Cell 78, 835-843. Economou, A., Pogliano, J. A., Beckwith, J., Oliver, D. B. & Wickner, W. (1995). SecA membrane cycling at SecYEG is driven by distinct ATP binding and hydrolysis events and is regulated by SecD and SecF. Cell 83, 1171-1181. Engelman, D. M. (2005). Membranes are more mosaic than fluid. Nature 438, 578-580. Evans, E. A., Gilmore, R. & Blobel, G. (1986). Purification of microsomal signal peptidase as a complex. Proc Natl Acad Sci U S A 83, 581-585. 139 7. Literaturverzeichnis Facey, S. J., Neugebauer, S. A., Krauss, S. & Kuhn, A. (2007). The mechanosensitive channel protein MscL is targeted by the SRP to the novel YidC membrane insertion pathway of Escherichia coli. J Mol Biol 365, 995-1004. Facey, S. J. & Kuhn, A. (2010). Biogenesis of bacterial inner-membrane proteins. Cell Mol Life Sci. Fekkes, P., de Wit, J. G., van der Wolk, J. P., Kimsey, H. H., Kumamoto, C. A. & Driessen, A. J. (1998). Preprotein transfer to the Escherichia coli translocase requires the co-operative binding of SecB and the signal sequence to SecA. Mol Microbiol 29, 1179-1190. Freigassner, M., Pichler, H. & Glieder, A. (2009). Tuning microbial hosts for membrane protein production. Microb Cell Fact 8, 69. Friedrich, A., Hartsch, T. & Averhoff, B. (2001). Natural transformation in mesophilic and thermophilic bacteria: identification and characterization of novel, closely related competence genes in Acinetobacter sp. strain BD413 and Thermus thermophilus HB27. Appl Environ Microbiol 67, 3140-3148. Friedrich, A., Prust, C., Hartsch, T., Henne, A. & Averhoff, B. (2002). Molecular analyses of the natural transformation machinery and identification of pilus structures in the extremely thermophilic bacterium Thermus thermophilus strain HB27. Appl Environ Microbiol 68, 745-755. Funes, S., Hasona, A., Bauerschmitt, H. & other authors (2009). Independent gene duplications of the YidC/Oxa/Alb3 family enabled a specialized cotranslational function. Proceedings of the National Academy of Sciences 106, 6656-6661. Garrity, G. M., Boone, D. R. & Castenholz, R. W. (2001). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd edn. Görlich, D., Hartmann, E., Prehn, S. & Rapoport, T. A. (1992). A protein of the endoplasmic reticulum involved early in polypeptide translocation. Nature 357, 47-52. Görlich, D. & Rapoport, T. A. (1993). Protein translocation into proteoliposomes reconstituted from purified components of the endoplasmic reticulum membrane. Cell 75, 615-630. Grenz, S. (2008).Funktionelle und strukturelle Analyse des YidC-Homologs Aq-175 in Aquifex aeolicus. In Institut für Mikrobiologie, pp. 194. Stuttgart: Universität Hohenheim. Grisshammer, R. & Tate, C. G. (1995). Overexpression of integral membrane proteins for structural studies. Q Rev Biophys 28, 315-422. Hartmann, E., Sommer, T., Prehn, S., Gorlich, D., Jentsch, S. & Rapoport, T. A. (1994). Evolutionary conservation of components of the protein translocation complex. Nature 367, 654-657. 140 7. Literaturverzeichnis Hashemzadeh-Bonehi, L., Mehraein-Ghomi, F., Mitsopoulos, C., Jacob, J. P., Hennessey, E. S. & Broome-Smith, J. K. (1998). Importance of using lac rather than ara promoter vectors for modulating the levels of toxic gene products in Escherichia coli. Molecular Microbiology 30, 676-678. Hattori, M., Tanaka, Y., Fukai, S., Ishitani, R. & Nureki, O. (2007). Crystal structure of the MgtE Mg2+ transporter. Nature 448, 1072-1075. Hazel, J. R. (1995). Thermal adaptation in biological membranes: is homeoviscous adaptation the explanation? Annu Rev Physiol 57, 19-42. Heinrich, S. U., Mothes, W., Brunner, J. & Rapoport, T. A. (2000). The Sec61p complex mediates the integration of a membrane protein by allowing lipid partitioning of the transmembrane domain. Cell 102, 233-244. Hell, K., Herrmann, J., Pratje, E., Neupert, W. & Stuart, R. A. (1997). Oxa1p mediates the export of the N- and C-termini of pCoxII from the mitochondrial matrix to the intermembrane space. FEBS Lett 418, 367-370. Hell, K., Neupert, W. & Stuart, R. A. (2001). Oxa1p acts as a general membrane insertion machinery for proteins encoded by mitochondrial DNA. EMBO J 20, 12811288. Henne, A., Bruggemann, H., Raasch, C. & other authors (2004). The genome sequence of the extreme thermophile Thermus thermophilus. Nat Biotechnol 22, 547553. Herrmann, J. M., Neupert, W. & Stuart, R. A. (1997). Insertion into the mitochondrial inner membrane of a polytopic protein, the nuclear-encoded Oxa1p. Embo J 16, 22172226. Herskovits, A. A., Bochkareva, E. S. & Bibi, E. (2000). New prospects in studying the bacterial signal recognition particle pathway. Molecular Microbiology 38, 927-939. Hidaka, Y., Hasegawa, M., Nakahara, T. & Hoshino, T. (1994). The entire population of Thermus thermophilus cells is always competent at any growth phase. Biosci Biotechnol Biochem 58, 1338-1339. High, S., Martoglio, B., Gorlich, D. & other authors (1993). Site-specific photocrosslinking reveals that Sec61p and TRAM contact different regions of a membrane-inserted signal sequence. J Biol Chem 268, 26745-26751. Huber, R., Wilharm, T., Huber, D. & other authors (1992). Aquifex pyrophilus gen.nov. sp.nov., represents a novel group of marine hyperthermophilic hydrogenoxidizing bacteria. . Syst Appl Microbiol 15, 340-351. Huber, R., Eder, W., Heldwein, S., Wanner, G., Huber, H., Rachel, R. & Stetter, K. O. (1998). Thermocrinis ruber gen. nov., sp. nov., a Pink-Filament-Forming Hyperthermophilic Bacterium Isolated from Yellowstone National Park. Appl Environ Microbiol 64, 3576-3583. 141 7. Literaturverzeichnis Ikemura, T. (1981). Correlation between the abundance of Escherichia coli transfer RNAs and the occurrence of the respective codons in its protein genes. J Mol Biol 146, 1-21. Jahnke, L. L., Eder, W., Huber, R., Hope, J. M., Hinrichs, K.-U., Hayes, J. M., Des Marais, D. J., Cady, S. L. & Summons, R. E. (2001). Signature Lipids and Stable Carbon Isotope Analyses of Octopus Spring Hyperthermophilic Communities Compared with Those of Aquificales Representatives. Appl Environ Microbiol 67, 5179-5189. Jenney, F. E., Jr. & Adams, M. W. (2008). The impact of extremophiles on structural genomics (and vice versa). Extremophiles 12, 39-50. Jia, L., Dienhart, M., Schramp, M., McCauley, M., Hell, K. & Stuart, R. A. (2003). Yeast Oxa1 interacts with mitochondrial ribosomes: the importance of the C-terminal region of Oxa1. EMBO J 22, 6438-6447. Jiang, F., Yi, L., Moore, M., Chen, M., Rohl, T., Van Wijk, K. J., De Gier, J. W., Henry, R. & Dalbey, R. E. (2002). Chloroplast YidC homolog Albino3 can functionally complement the bacterial YidC depletion strain and promote membrane insertion of both bacterial and chloroplast thylakoid proteins. J Biol Chem 277, 19281-19288. Jiang, F., Chen, M., Yi, L., de Gier, J. W., Kuhn, A. & Dalbey, R. E. (2003). Defining the regions of Escherichia coli YidC that contribute to activity. J Biol Chem 278, 4896548972. Kapust, R. B. & Waugh, D. S. (1999). Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused. Protein Sci 8, 1668-1674. Kawasumi, T., Igarashi, Y., Kodama, T. & Minoda, Y. (1984). Hydrogenobacter thermophilus gen. nov., sp. nov., an Extremely Thermophilic, Aerobic, HydrogenOxidizing Bacterium. Int J Syst Bacteriol 34, 5-10. Kendrew, J. C., Dickerson, R. E., Strandberg, B. E., Hart, R. G., Davies, D. R., Phillips, D. C. & Shore, V. C. (1960). Structure of myoglobin: A three-dimensional Fourier synthesis at 2 A. resolution. Nature 185, 422-427. Klenner, C., Yuan, J., Dalbey, R. E. & Kuhn, A. (2008). The Pf3 coat protein contacts TM1 and TM3 of YidC during membrane biogenesis. FEBS Lett 582, 3967-3972. Knoblauch, N. T., Rudiger, S., Schonfeld, H. J., Driessen, A. J., SchneiderMergener, J. & Bukau, B. (1999). Substrate specificity of the SecB chaperone. J Biol Chem 274, 34219-34225. Knol, J., Sjollema, K. & Poolman, B. (1998). Detergent-mediated reconstitution of membrane proteins. Biochemistry 37, 16410-16415. Koch, H. G., Moser, M., Schimz, K. L. & Muller, M. (2002). The integration of YidC into the cytoplasmic membrane of Escherichia coli requires the signal recognition particle, SecA and SecYEG. J Biol Chem 277, 5715-5718. 142 7. Literaturverzeichnis Kohler, R., Boehringer, D., Greber, B., Bingel-Erlenmeyer, R., Collinson, I., Schaffitzel, C. & Ban, N. (2009). YidC and Oxa1 Form Dimeric Insertion Pores on the Translating Ribosome. Molecular Cell 34, 344-353. Koma, D., Sawai, T., Harayama, S. & Kino, K. (2006). Overexpression of the genes from thermophiles in Escherichia coli by high-temperature cultivation. Appl Microbiol Biotechnol 73, 172-180. Kryukov, V. R., N.D.Savelyeva & M.A.Pusheva (1983). Calderobacterium hydrogenophilum nov. gen., nov. sp., an extreme thermophilic hydrogen bacterium, and its hydrogenase activity. Mikrobiologiya 52, 781-788. Kuhn, A., Stiegler, N. & Schubert, A. K. (2010). Membrane insertion of small proteins. Methods Mol Biol 619, 39-62. Kumamoto, C. A. (1989). Escherichia coli SecB protein associates with exported protein precursors in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 86, 5320-5324. Kumar, S., Tsai, C.-J. & Nussinov, R. (2000). Factors enhancing protein thermostability. Protein Engineering 13, 179-191. Kyte, J. & Doolittle, R. F. (1982). A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J Mol Biol 157, 105-132. Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685. Lambert, O., Levy, D., Ranck, J. L., Leblanc, G. & Rigaud, J. L. (1998). A new "gellike" phase in dodecyl maltoside-lipid mixtures: implications in solubilization and reconstitution studies. Biophys J 74, 918-930. Lasa, I. & Berenguer, J. (1993). Thermophilic enzymes and their biotechnological potential. Microbiologia 9, 77-89. Lee, H. C. & Bernstein, H. D. (2001). The targeting pathway of Escherichia coli presecretory and integral membrane proteins is specified by the hydrophobicity of the targeting signal. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 3471-3476. Leone, S., Molinaro, A., Lindner, B., Romano, I., Nicolaus, B., Parrilli, M., Lanzetta, R. & Holst, O. (2006). The structures of glycolipids isolated from the highly thermophilic bacterium Thermus thermophilus Samu-SA1. Glycobiology 16, 766-775. Lessl, M., Balzer, D., Lurz, R., Waters, V. L., Guiney, D. G. & Lanka, E. (1992). Dissection of IncP conjugative plasmid transfer: definition of the transfer region Tra2 by mobilization of the Tra1 region in trans. J Bacteriol 174, 2493-2500. Liu, G., Topping, T. B. & Randall, L. L. (1989). Physiological role during export for the retardation of folding by the leader peptide of maltose-binding protein. Proc Natl Acad Sci U S A 86, 9213-9217. 143 7. Literaturverzeichnis Loll, P. J. (2003). Membrane protein structural biology: the high throughput challenge. J Struct Biol 142, 144-153. Lotz, M., Haase, W., Kuhlbrandt, W. & Collinson, I. (2008). Projection structure of yidC: a conserved mediator of membrane protein assembly. J Mol Biol 375, 901-907. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. & Randall, R. J. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 193, 265-275. Luirink, J., High, S., Wood, H., Giner, A., Tollervey, D. & Dobberstein, B. (1992). Signal-sequence recognition by an Escherichia coli ribonucleoprotein complex. Nature 359, 741-743. Martinez Molina, D., Lundback, A. K., Niegowski, D. & Eshaghi, S. (2008). Expression and purification of the recombinant membrane protein YidC: a case study for increased stability and solubility. Protein Expr Purif 62, 49-52. Matlack, K. E., Plath, K., Misselwitz, B. & Rapoport, T. A. (1997). Protein transport by purified yeast Sec complex and Kar2p without membranes. Science 277, 938-941. Matlack, K. E., Misselwitz, B., Plath, K. & Rapoport, T. A. (1999). BiP acts as a molecular ratchet during posttranslational transport of prepro-alpha factor across the ER membrane. Cell 97, 553-564. Merril, C. R., Dunau, M. L. & Goldman, D. (1981). A rapid sensitive silver stain for polypeptides in polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry 110, 201-207. Miroux, B. & Walker, J. E. (1996). Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J Mol Biol 260, 289-298. Müller, M. (2005). Twin-arginine-specific protein export in Escherichia coli. Research in Microbiology 156, 131-136. Nagamori, S., Smirnova, I. N. & Kaback, H. R. (2004). Role of YidC in folding of polytopic membrane proteins. J Cell Biol 165, 53-62. Nakatsukasa, K. & Brodsky, J. L. (2007). The Role of BiP/Kar2p in the Translocation of Proteins Across the ER Membrane. In The Enzymes, pp. 245-273. Edited by C. M. K. Ross E. Dalbey & T. Fuyuhiko: Academic Press. Natale, P., Bruser, T. & Driessen, A. J. (2008). Sec- and Tat-mediated protein secretion across the bacterial cytoplasmic membrane--distinct translocases and mechanisms. Biochim Biophys Acta 1778, 1735-1756. Neefe, S. (2004).Klonierung, heterologe Expression und Rekonstitution der TramProteine aus Xenopus und humanen Zelllinien. In Institut für Mikrobiologie, pp. 130. Stuttgart: Universität Hohenheim. Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D. & Ehrhardt, W. (1988). Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at 144 7. Literaturverzeichnis nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis 9, 255-262. Ng, D. T., Brown, J. D. & Walter, P. (1996). Signal sequences specify the targeting route to the endoplasmic reticulum membrane. J Cell Biol 134, 269-278. Nilsson, B. & Anderson, S. (1991). Proper and Improper Folding of Proteins in the Cellular Environment. Annual Review of Microbiology 45, 607-635. Nouwen, N. & Driessen, A. J. (2002). SecDFyajC forms a heterotetrameric complex with YidC. Mol Microbiol 44, 1397-1405. Novy, R., Drott, D., Yaeger, K. & Mierendorf, R. (2001). Overcoming the codon bias of E. coli for enhanced protein expression. inNovations 12, 1-3. Omelchenko, M. V., Wolf, Y. I., Gaidamakova, E. K., Matrosova, V. Y., Vasilenko, A., Zhai, M., Daly, M. J., Koonin, E. V. & Makarova, K. S. (2005). Comparative genomics of Thermus thermophilus and Deinococcus radiodurans: divergent routes of adaptation to thermophily and radiation resistance. BMC Evol Biol 5, 57. Oshima, T. & Imahori, K. (1971). Isolation of an extreme thermophile and thermostability of its transfer ribonucleic acid and ribosomes. The Journal of General and Applied Microbiology 17, 513-517. Oshima, T. & Imahori, K. (1974). Description of Thermus thermophilus (Yoshida and Oshima) comb. nov., a Nonsporulating Thermophilic Bacterium from a Japanese Thermal Spa. Int J Syst Bacteriol 24, 102-112. Palade, G. (1975). Intracellular aspects of the process of protein synthesis. Science 189, 347-358. Pantazaki, A. A., Pritsa, A. A. & Kyriakidis, D. A. (2002). Biotechnologically relevant enzymes from Thermus thermophilus. Appl Microbiol Biotechnol 58, 1-12. Panzner, S., Dreier, L., Hartmann, E., Kostka, S. & Rapoport, T. A. (1995). Posttranslational protein transport in yeast reconstituted with a purified complex of Sec proteins and Kar2p. Cell 81, 561-570. Papanikolau, Y., Papadovasilaki, M., Ravelli, R. B. G., McCarthy, A. A., Cusack, S., Economou, A. & Petratos, K. (2007). Structure of Dimeric SecA, the Escherichia coli Preprotein Translocase Motor. Journal of Molecular Biology 366, 1545-1557. Peterson, G. L. (1977). A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Anal Biochem 83, 346-356. Plath, K. & Rapoport, T. A. (2000). Spontaneous release of cytosolic proteins from posttranslational substrates before their transport into the endoplasmic reticulum. J Cell Biol 151, 167-178. Pogliano, J. A. & Beckwith, J. (1994). SecD and SecF facilitate protein export in Escherichia coli. Embo J 13, 554-561. 145 7. Literaturverzeichnis Polzin, S. (2008).Untersuchung zur Interaktion des periplasmatischen Loops von SecF mit der Membraninsterase YidC aus Escherichia coli. In Institut für Mikrobiologie, pp. 105. Stuttgart: Universität Hohenheim. Price, C. E. & Driessen, A. J. M. (2008). YidC is involved in the biogenesis of anaerobic respiratory complexes in the inner membrane of Escherichia coli. J Biol Chem, M804490200. Price, C. E. & Driessen, A. J. M. (2010). Conserved Negative Charges in the Transmembrane Segments of Subunit K of the NADH:Ubiquinone Oxidoreductase Determine Its Dependence on YidC for Membrane Insertion. Journal of Biological Chemistry 285, 3575-3581. Provencher, S. W. & Glockner, J. (1981). Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism. Biochemistry 20, 33-37. Pryor, K. D. & Leiting, B. (1997). High-level expression of soluble protein in Escherichia coli using a His6-tag and maltose-binding-protein double-affinity fusion system. Protein Expr Purif 10, 309-319. Rabilloud, T., Gianazza, E., Catto, N. & Righetti, P. G. (1990). Amidosulfobetaines, a family of detergents with improved solubilization properties: application for isoelectric focusing under denaturing conditions. Anal Biochem 185, 94-102. Raman, P., Cherezov, V. & Caffrey, M. (2006). The Membrane Protein Data Bank. Cell Mol Life Sci 63, 36-51. Rapoport, T. A. (2007). Protein translocation across the eukaryotic endoplasmic reticulum and bacterial plasma membranes. Nature 450, 663-669. Ravaud, S., Stjepanovic, G., Wild, K. & Sinning, I. (2008a). The crystal structure of the periplasmic domain of the Escherichia coli membrane protein insertase YidC contains a substrate binding cleft. J Biol Chem 283, 9350-9358. Ravaud, S., Wild, K. & Sinning, I. (2008b). Purification, crystallization and preliminary structural characterization of the periplasmic domain P1 of the Escherichia coli membrane-protein insertase YidC. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 64, 144-148. Rigaud, J. L., Pitard, B. & Levy, D. (1995). Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochim Biophys Acta 1231, 223-246. Robinson, M., Lilley, R., Little, S., Emtage, J. S., Yarranton, G., Stephens, P., Millican, A., Eaton, M. & Humphreys, G. (1984). Codon usage can affect efficiency of translation of genes in Escherichia coli. Nucleic Acids Res 12, 6663-6671. Saaf, A., Monne, M., de Gier, J.-W. & von Heijne, G. (1998). Membrane Topology of the 60-kDa Oxa1p Homologue from Escherichia coli. J Biol Chem 273, 30415-30418. 146 7. Literaturverzeichnis Sadeghi, M., Naderi-Manesh, H., Zarrabi, M. & Ranjbar, B. (2006). Effective factors in thermostability of thermophilic proteins. Biophys Chem 119, 256-270. Saksena, S., Shao, Y., Braunagel, S. C., Summers, M. D. & Johnson, A. E. (2004). Cotranslational integration and initial sorting at the endoplasmic reticulum translocon of proteins destined for the inner nuclear membrane. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 12537-12542. Samuelson, J. C., Chen, M., Jiang, F., Moller, I., Wiedmann, M., Kuhn, A., Phillips, G. J. & Dalbey, R. E. (2000). YidC mediates membrane protein insertion in bacteria. Nature 406, 637-641. Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A. R. (1977). DNA sequencing with chainterminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A 74, 5463-5467. Sauri, A., McCormick, P. J., Johnson, A. E. & Mingarro, I. (2007). Sec61alpha and TRAM are sequentially adjacent to a nascent viral membrane protein during its ER integration. J Mol Biol 366, 366-374. Schägger, H. & von Jagow, G. (1991). Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry 199, 223-231. Schwarzenlander, C. & Averhoff, B. (2006). Characterization of DNA transport in the thermophilic bacterium <i>Thermus thermophilus</i> HB27. FEBS Journal 273, 42104218. Scotti, P. A., Urbanus, M. L., Brunner, J., de Gier, J. W., von Heijne, G., van Der Does, C., Driessen, A. J., Oudega, B. & Luirink, J. (2000). YidC, the Escherichia coli homologue of mitochondrial Oxa1p, is a component of the Sec translocase. Embo 19, 542-549. Serek, J., Bauer-Manz, G., Struhalla, G., van den Berg, L., Kiefer, D., Dalbey, R. & Kuhn, A. (2004). Escherichia coli YidC is a membrane insertase for Sec-independent proteins. EMBO J 23, 294-301. Shan, S. O., Chandrasekar, S. & Walter, P. (2007). Conformational changes in the GTPase modules of the signal reception particle and its receptor drive initiation of protein translocation. J Cell Biol 178, 611-620. Shaw, A. S., Rottier, P. J. & Rose, J. K. (1988). Evidence for the loop model of signalsequence insertion into the endoplasmic reticulum. Proc Natl Acad Sci U S A 85, 75927596. Shimohata, N., Nagamori, S., Akiyama, Y., Kaback, H. R. & Ito, K. (2007). SecY alterations that impair membrane protein folding and generate a membrane stress. J Cell Biol 176, 307-317. Sinensky, M. (1974). Homeoviscous adaptation--a homeostatic process that regulates the viscosity of membrane lipids in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 71, 522525. 147 7. Literaturverzeichnis Singer, S. J. & Nicolson, G. L. (1972). The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science 175, 720-731. Sreerama, N. & Woody, R. W. (2000). Estimation of protein secondary structure from circular dichroism spectra: comparison of CONTIN, SELCON, and CDSSTR methods with an expanded reference set. Anal Biochem 287, 252-260. Stiegler, N., Dalbey, R. E. & Kuhn, A. (2010). M13 Procoat Protein Insertion into YidC and SecYEG Proteoliposomes and Liposomes. J Mol Biol. Studier, F. W. & Moffatt, B. A. (1986). Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol 189, 113-130. Sundberg, E., Slagter, J. G., Fridborg, I., Cleary, S. P., Robinson, C. & Coupland, G. (1997). ALBINO3, an Arabidopsis nuclear gene essential for chloroplast differentiation, encodes a chloroplast protein that shows homology to proteins present in bacterial membranes and yeast mitochondria. Plant Cell 9, 717-730. Tamborero, S., Vilar, M., Martinez-Gil, L., Johnson, A. E. & Mingarro, I. (2011). Membrane Insertion and Topology of the Translocating Chain-Associating Membrane Protein (TRAM). J Mol Biol. Tomkiewicz, D., Nouwen, N., van Leeuwen, R., Tans, S. & Driessen, A. J. M. (2006). SecA Supports a Constant Rate of Preprotein Translocation. Journal of Biological Chemistry 281, 15709-15713. Tsukazaki, T., Mori, H., Fukai, S. & other authors (2008). Conformational transition of Sec machinery inferred from bacterial SecYE structures. Nature 455, 988-991. Turner, G. J., Reusch, R., Winter-Vann, A. M., Martinez, L. & Betlach, M. C. (1999). Heterologous gene expression in a membrane-protein-specific system. Protein Expr Purif 17, 312-323. Tziatzios, C., Schubert, D., Lotz, M., Gundogan, D., Betz, H., Schägger, H., Haase, W., Duong, F. & Collinson, I. (2004). The Bacterial Protein-Translocation Complex: SecYEG Dimers Associate with One or Two SecA Molecules. Journal of Molecular Biology 340, 513-524. Urbanus, M. L., Scotti, P. A., Froderberg, L. & other authors (2001). Sec-dependent membrane protein insertion: sequential interaction of nascent FtsQ with SecY and YidC. EMBO Rep 2, 524-529. Urbanus, M. L., Froderberg, L., Drew, D., Bjork, P., de Gier, J. W., Brunner, J., Oudega, B. & Luirink, J. (2002). Targeting, insertion, and localization of Escherichia coli YidC. J Biol Chem 277, 12718-12723. Valent, Q. A., Kendall, D. A., High, S., Kusters, R., Oudega, B. & Luirink, J. (1995). Early events in preprotein recognition in E. coli: interaction of SRP and trigger factor with nascent polypeptides. EMBO J 14, 5494-5505. 148 7. Literaturverzeichnis Valent, Q. A., Scotti, P. A., High, S., de Gier, J.-W. L., von Heijne, G., Lentzen, G., Wintermeyer, W., Oudega, B. & Luirink, J. (1998). The Escherichia coli SRP and SecB targeting pathways converge at the translocon. EMBO J 17, 2504-2512. van Bloois, E., Jan Haan, G., de Gier, J. W., Oudega, B. & Luirink, J. (2004). F(1)F(0) ATP synthase subunit c is targeted by the SRP to YidC in the E. coli inner membrane. FEBS Lett 576, 97-100. van Bloois, E., Nagamori, S., Koningstein, G. & other authors (2005). The Secindependent function of Escherichia coli YidC is evolutionary-conserved and essential. J Biol Chem 280, 12996-13003. van Bloois, E., Haan, G. J., de Gier, J. W., Oudega, B. & Luirink, J. (2006). Distinct requirements for translocation of the N-tail and C-tail of the Escherichia coli inner membrane protein CyoA. J Biol Chem 281, 10002-10009. van Bloois, E., Koningstein, G., Bauerschmitt, H., Herrmann, J. M. & Luirink, J. (2007). Saccharomyces cerevisiae Cox18 complements the essential Sec-independent function of Escherichia coli YidC. FEBS J 274, 5704-5713. van der Laan, M., Bechtluft, P., Kol, S., Nouwen, N. & Driessen, A. J. M. (2004). F1F0 ATP synthase subunit c is a substrate of the novel YidC pathway for membrane protein biogenesis. J Cell Biol 165, 213-222. Voigt, S., Jungnickel, B., Hartmann, E. & Rapoport, T. A. (1996). Signal sequencedependent function of the TRAM protein during early phases of protein transport across the endoplasmic reticulum membrane. J Cell Biol 134, 25-35. von Ballmoos, C., Wiedenmann, A. & Dimroth, P. (2009). Essentials for ATP synthesis by F1F0 ATP synthases. Annu Rev Biochem 78, 649-672. von Heijne, G. (1984). Analysis of the distribution of charged residues in the N-terminal region of signal sequences: implications for protein export in prokaryotic and eukaryotic cells. Embo J 3, 2315-2318. von Heijne, G. (1994). Sec-independent protein insertion into the inner E. coli membrane A phenomenon in search of an explanation. FEBS Letters 346, 69-72. Wagner, S., Klepsch, M. M., Schlegel, S. & other authors (2008). Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression. Proceedings of the National Academy of Sciences 105, 14371-14376. Wallace, B. A., Lees, J. G., Orry, A. J., Lobley, A. & Janes, R. W. (2003). Analyses of circular dichroism spectra of membrane proteins. Protein Sci 12, 875-884. Walter, P. & Blobel, G. (1981a). Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum III. Signal recognition protein (SRP) causes signal sequence-dependent and site-specific arrest of chain elongation that is released by microsomal membranes. J Cell Biol 91, 557-561. 149 7. Literaturverzeichnis Walter, P. & Blobel, G. (1981b). Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. II. Signal recognition protein (SRP) mediates the selective binding to microsomal membranes of in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J Cell Biol 91, 551-556. Walter, P., Ibrahimi, I. & Blobel, G. (1981). Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J Cell Biol 91, 545-550. Wang, P. & Dalbey, R. E. (2010). Inserting membrane proteins: The YidC/Oxa1/Alb3 machinery in bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Biochim Biophys Acta. Weisburg, W. G., Giovannoni, S. J. & Woese, C. R. (1989). The DeinococcusThermus phylum and the effect of rRNA composition on phylogenetic tree construction. Syst Appl Microbiol 11, 128-134. White, O., Eisen, J. A., Heidelberg, J. F. & other authors (1999). Genome sequence of the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans R1. Science 286, 1571-1577. White, S. H. (2009). Biophysical dissection of membrane proteins. Nature 459, 344346. Winterfeld, S., Imhof, N., Roos, T., Bar, G., Kuhn, A. & Gerken, U. (2009). SubstrateInduced Conformational Change of the Escherichia coli Membrane Insertase YidC. Biochemistry. Xie, K., Kiefer, D., Nagler, G., Dalbey, R. E. & Kuhn, A. (2006). Different regions of the nonconserved large periplasmic domain of Escherichia coli YidC are involved in the SecF interaction and membrane insertase activity. Biochemistry 45, 13401-13408. Yanisch-Perron, C., Vieira, J. & Messing, J. (1985). Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene 33, 103-119. Yen, M. R., Harley, K. T., Tseng, Y. H. & Saier, M. H., Jr. (2001). Phylogenetic and structural analyses of the oxa1 family of protein translocases. FEMS Microbiol Lett 204, 223-231. Yi, L., Jiang, F., Chen, M., Cain, B., Bolhuis, A. & Dalbey, R. E. (2003). YidC is strictly required for membrane insertion of subunits a and c of the F(1)F(0)ATP synthase and SecE of the SecYEG translocase. Biochemistry 42, 10537-10544. Yu, Z., Koningstein, G., Pop, A. & Luirink, J. (2008). The conserved third transmembrane segment of YidC contacts nascent Escherichia coli inner membrane proteins. J Biol Chem, M804344200. Yuan, Y., Barrett, D., Zhang, Y., Kahne, D., Sliz, P. & Walker, S. (2007). Crystal structure of a peptidoglycan glycosyltransferase suggests a model for processive glycan chain synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences 104, 5348-5353. 150 7. Literaturverzeichnis Zhang, Y.-J., Tian, H.-F. & Wen, J.-F. (2009). The evolution of YidC/Oxa/Alb3 family in the three domains of life: a phylogenomic analysis. BMC Evolutionary Biology 9, 137. 151 152 8. Anhang 8. Anhang 8.1 8.1.1 DNA und Aminosäure Sequenzen Tram 1 X.l. mit His-tag Q M G I R K K N S K T P P V L S H E F I 1 CAGATGGGCA TCCGTAAGAA GAACAGCAAG ACCCCGCCGG TGCTCAGCCA CGAGTTCATT I Q N H A D I V S C L A M V F L L G L M 61 ATCCAGAACC ATGCGGACAT CGTCTCCTGC CTGGCCATGG TCTTCCTGCT CGGCCTTATG F E I T A K V A V M F V T L Q Y N V T I 121 TTCGAGATTA CAGCAAAGGT GGCTGTCATG TTTGTCACAC TCCAGTACAA TGTCACCATT P V E G V L G E P T S L Y H Y G I K D M 181 CCAGTAGAAG GGGTGCTTGG AGAACCCACT TCGCTGTACC ATTATGGCAT CAAAGATATG A T V F F Y M L V A I I L H A V I Q E Y 241 GCCACTGTAT TTTTTTACAT GCTGGTGGCA ATAATACTAC ATGCAGTTAT CCAAGAATAC V L D K I N R R M H F S K T K H S K F N 301 GTATTAGATA AAATCAACCG CCGTATGCAT TTTTCCAAGA CAAAACACAG CAAGTTTAAT E S G Q L S A F Y L F S C I W G A S I I 361 GAGTCTGGAC AGCTAAGTGC ATTTTACCTG TTCTCTTGCA TTTGGGGAGC AAGCATTATT V S E N Y F S D P I S L W K G Y P H T Y 421 GTCTCAGAGA ATTATTTTTC GGATCCAATA AGCCTGTGGA AAGGGTATCC TCACACATAC F P F Q M K F F Y I S Q L A Y W F H A F 481 TTTCCATTCC AGATGAAGTT CTTCTACATT TCCCAGCTGG CTTATTGGTT TCATGCTTTT P E L Y F Q K T K K E D I P R Q L V Y I 541 CCAGAGCTCT ACTTTCAGAA AACGAAAAAG GAAGACATTC CCAGGCAGCT GGTCTACATT G L Y L F H I I G A Y V L N L N R L G L 601 GGTTTATACC TCTTCCATAT TATAGGAGCT TATGTTCTCA ACCTCAATCG CCTGGGTCTG V L L V L H Y F V E F L F H M S R L F Y 661 GTACTGCTAG TTCTGCATTA CTTTGTAGAA TTCCTGTTCC ATATGTCACG TCTGTTTTAC F S N E R Y Q K G F T V W A V L F V L G 721 TTCAGCAATG AGAGATACCA GAAAGGGTTT ACTGTGTGGG CCGTTCTCTT TGTCCTTGGG R L L T L I L S V L T V G F G L A R A E 781 CGCCTCCTCA CTCTTATCCT TTCTGTTCTT ACTGTCGGCT TTGGACTTGC ACGCGCTGAA N Q E L D L S N G N F N I L A I R I T V 841 AATCAAGAGT TGGATCTGAG TAATGGAAAT TTCAACATTT TGGCCATCAG AATCACCGTG L A S I C I T Q A F M M W K F I N F Q L 901 TTGGCATCTA TTTGCATCAC CCAGGCATTT ATGATGTGGA AGTTCATTAA TTTCCAGCTG R R W R E H S S P Q P S S Q R K K A T S 961 AGACGATGGA GAGAGCATTC ATCTCCTCAA CCCTCCTCTC AAAGGAAGAA GGCGACCTCT A K G K A S R K E K 153 E N G V N G T V T S 8. Anhang 1021 GCTAAAGGCA AAGCTTCACG TAAAGAAAAA GAAAATGGAG TGAATGGAAC AGTAACATCA N G A D S P R S R K E K H H H H H H * 1081 AACGGAGCAG ATTCTCCTCG CAGCCGTAAA GAAAAACATCATC ATCATCATCA TTAA Rot hervorgehoben ist der eingefügte His-tag. Blau hervorgehoben sind die veränderten Arginin Codons CGG in CGC 8.1.2 Tth-IM60 mit His-tag M K R L L A A F L F L L P A L A L E V G 1 ATGAAGAGGC TCCTTGCGGC CTTCCTCTTC CTCCTCCCCG CCCTCGCCCT CGAGGTGGGG F K D A D V N G D G T P E K V A V T N L 61 TTCAAGGACG CGGACGTCAA CGGGGACGGG ACCCCGGAAA AGGTCGCCGT CACCAACCTC M D L A F N E A G Q V V G W Y V K A Y K 121 ATGGACCTGG CCTTTAACGA GGCGGGCCAG GTGGTGGGCT GGTACGTGAA GGCCTACAAG G T A F G D Y A R A P N L A A N G P V L 181 GGCACGGCCT TCGGCGACTA CGCCCGCGCC CCCAACCTGG CGGCGAACGG CCCCGTCCTC S P V G F R P L E A E F A V E D G H L L 241 TCCCCCGTGG GCTTCCGTCC CCTGGAGGCG GAGTTCGCCG TGGAGGACGG CCACCTCCTC A R F R G E E G T L T Y R I P K E R Y T 301 GCCCGCTTCC GGGGGGAGGA GGGGACCCTC ACCTACCGCA TCCCCAAGGA GCGGTACACC A E V T A D F P L V L K L S A Q G N P K 361 GCGGAGGTGA CGGCGGACTT CCCCCTCGTC CTTAAGCTCT CCGCCCAGGG GAACCCCAAG A L L E G A A E P A P S G E G R L V Y L 421 GCGCTGTTGG AAGGCGCCGC CGAGCCCGCC CCGAGCGGGG AGGGGCGCCT CGTCTACCTC A W Q T R P K A G Y A L V A F G E G P L 481 GCCTGGCAGA CCCGGCCCAA GGCGGGCTAC GCCCTGGTGG CCTTCGGGGA GGGCCCCTTG E G R L V G R E G E V R L G P G E I L R 541 GAGGGCAGGC TCGTGGGGCG CGAGGGGGAG GTGCGGCTTG GGCCGGGAGA AATCCTCAGG V Y G G Q N E L V R F H V E G L L S F P 601 GTCTACGGCG GCCAGAACGA GCTCGTCCGC TTCCACGTGG AAGGCCTCCT CTCCTTCCCC G L F S P N L W G Q L S L G L L W I M E 661 GGCCTCTTCA GCCCCAACCT CTGGGGCCAG CTCTCCTTGG GCCTCCTCTG GATCATGGAG A A Y R F T G N W G L A I L F L T L V V 721 GCGGCCTACC GCTTCACCGG CAACTGGGGC CTCGCCATCC TCTTCCTGAC CCTGGTGGTG R L L L W P L M H Q Q F K S M A E I Q R 781 CGCCTCCTCC TCTGGCCCCT CATGCACCAG CAGTTCAAGA GCATGGCGGA GATCCAGCGC L Q P L I Q K I N E K Y K D D P N K R A 841 CTCCAGCCCC TCATCCAGAA GATCAACGAG AAGTACAAGG ACGACCCCAA CAAGCGGGCG E A T M K L Y Q E H R V N P A A G C L P 901 GAGGCCACCA TGAAGCTCTA CCAGGAGCAC CGGGTGAACC CCGCCGCCGG CTGCCTCCCC L L I Q M P I L F I 154 L W K V I A N Y E F 8. Anhang 961 CTCCTCATCC AGATGCCCAT CCTCTTCATC CTCTGGAAGG TGATCGCCAA CTACGAGTTC G Q G F L W I P D L A L P D P Y Y I L P 1021 GGCCAGGGCT TCCTCTGGAT CCCCGACCTC GCCCTCCCCG ACCCCTACTA CATCCTCCCC V L Y V A S T F L S T W L S A H G N R D 1081 GTCCTCTACG TGGCCAGCAC CTTCCTCTCC ACCTGGCTCT CCGCCCACGG GAACCGGGAC L I R Q S L F M N L I F V F L V L Q F P 1141 CTCATCCGGC AAAGCCTCTT CATGAACCTC ATCTTCGTCT TCCTGGTCCT CCAGTTCCCC S G V T L Y W V L S T L I G L V Q Q W L 1201 TCGGGGGTCA CCCTCTACTG GGTCCTTTCC ACCCTCATCG GCCTCGTGCA GCAGTGGCTC I N K S L A P L K A H H H H H H H H H H 1261 ATCAACAAAA GCCTGGCCCC CCTTAAGGCG CATCATCATC ATCATCATCA TCATCATCAT * 1321 TAA Rot hervorgehoben ist der eingefügte His-tag. 8.2 Daten der CD-Spektroskopie 8.2.1 CD-Spektrum von Tth-IM60, Aq-YidC und YidC Tth-IM60 λ [nm] 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 Θ(λ)mdeg [mdeg] 10,4408806 12,2154806 14,5440806 16,8619806 18,7572806 20,6020806 21,4830806 22,4440806 23,1453806 23,3741806 22,5644806 21,2573806 19,1120806 16,2867806 12,9042806 9,3899206 5,8650006 2,5136006 -0,7117574 -3,7496094 -6,3809594 -8,6212794 -10,3490194 -11,6058194 -12,3790194 -12,8605194 Aq-YidC Θ(λ)MRW [deg cm2/dmol] Θ(λ)mdeg [mdeg] 14279,6 16706,7 19891,5 23061,6 25653,7 28176,8 29381,7 30696 31655,2 31968,1 30860,7 29073 26139 22274,9 17648,8 12842,3 8021,4 3437,8 -973,4 -5128,2 -8727 -11791 -14154 -15872,9 -16930,4 -17588,9 14,100164 16,625364 19,996164 23,114564 25,652464 28,231664 30,505964 31,886664 31,737764 30,977964 29,434164 26,490264 22,549764 17,953864 12,759164 7,682954 2,907264 -1,309776 -5,030546 -8,277476 -11,126136 -13,487636 -15,173236 -16,268536 -16,610636 -16,567736 155 YidC Θ(λ)MRW [deg cm2/dmol] Θ(λ)MRW [deg cm2/dmol] 15257,2 17989,7 21637,1 25011,4 27757,5 30548,4 33009,3 34503,3 34342,2 33520 31849,6 28664,1 24400,2 19427,2 13806,2 8313,4 3145,8 -1417,3 -5443,4 -8956,7 -12039,2 -14594,4 -16418,4 -17603,5 -17973,7 -17927,3 7800 8630,7 10297 11871,8 13341 14654,9 15964 17033,3 17711,6 17847 17563 16691,4 15013,6 12564 9674,2 6703,9 3777,9 971,2 -1667,3 -4067,8 -6223,9 -8054,8 -9529,1 -10552,6 -11224,1 -11592,4 8. Anhang 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 -13,0334194 -12,9522194 -12,9991194 -13,1665194 -13,4581194 -13,6425194 -13,8201194 -13,8662194 -13,9038194 -13,9279194 -13,8719194 -13,6236194 -13,2848194 -12,9031194 -12,5503194 -12,0253194 -11,3842194 -10,6168194 -9,9131194 -9,1630694 -8,3406194 -7,3863494 -6,5083094 -5,6440994 -4,9660894 -4,1676994 -3,4673594 -2,8471294 -2,3919094 -1,9976194 -1,5849394 -1,2738694 -0,9529594 -0,7752624 -0,6448574 -0,5577724 -0,4498194 -0,3227554 -0,2774544 -0,2061714 -0,1160504 -0,0740714 -0,1418184 -0,1116104 -0,0554654 -0,0261324 -0,0390034 0 -0,0113324 -0,0697934 -17825,4 -17714,3 -17778,5 -18007,4 -18406,2 -18658,4 -18901,3 -18964,4 -19015,8 -19048,8 -18972,2 -18632,6 -18169,2 -17647,2 -17164,7 -16446,6 -15569,8 -14520,3 -13557,8 -12532 -11407,2 -10102,1 -8901,2 -7719,2 -6792 -5700 -4742,2 -3893,9 -3271,3 -2732,1 -2167,7 -1742,2 -1303,3 -1060,3 -881,9 -762,8 -615,2 -441,4 -379,5 -282 -158,7 -101,3 -194 -152,6 -75,9 -35,7 -53,3 0 -15,5 -95,5 -16,305736 -16,126536 -16,008136 -15,938436 -15,956236 -15,982236 -16,077836 -16,157936 -16,243636 -16,092936 -15,989536 -15,816236 -15,563536 -15,023536 -14,469036 -13,840136 -13,049436 -12,124836 -11,263436 -10,417736 -9,384016 -8,317516 -7,363786 -6,463556 -5,623356 -4,773696 -3,968636 -3,280636 -2,820056 -2,299956 -1,771676 -1,380856 -1,200566 -1,002641 -0,829577 -0,699113 -0,595404 -0,457321 -0,400014 -0,337204 -0,316032 -0,2394721 -0,2739229 -0,2157655 -0,1918005 -0,0850693 -0,069951 0 -0,056948 -0,1027281 156 -17643,8 -17449,9 -17321,8 -17246,4 -17265,6 -17293,8 -17397,2 -17483,9 -17576,6 -17413,5 -17301,7 -17114,1 -16840,7 -16256,4 -15656,4 -14975,9 -14120,3 -13119,8 -12187,7 -11272,6 -10154,1 -9000,1 -7968,1 -6994 -6084,8 -5165,4 -4294,3 -3549,8 -3051,5 -2488,7 -1917,1 -1494,2 -1299,1 -1084,9 -897,7 -756,5 -644,3 -494,8 -432,8 -364,9 -342 -259,1 -296,4 -233,5 -207,5 -92,1 -75,7 0 -61,6 -111,2 -11786,7 -11875,8 -11868,3 -11871,6 -11944,2 -12059,6 -12186,3 -12311,6 -12363,8 -12388,7 -12368,1 -12267,3 -12089,2 -11813,4 -11474,8 -11049,3 -10533,2 -9884,9 -9131,7 -8345,1 -7594,1 -6854,4 -6111,1 -5425,2 -4730,5 -4088,6 -3499,3 -2960,4 -2477,3 -2048,8 -1649,6 -1339,4 -1076 -886,7 -747,7 -606,7 -472,2 -380,2 -293,8 -214,1 -156,7 -127,3 -110,4 -99,6 -65,2 -12,1 15,9 26,6 31 31 8. Anhang 8.2.2 Strukturanalyse mittels DichroWeb 1 2 1 Contin Set4 2 Tth-IM60 1 Contin Set6 2 1 Contin Set7 2 CDSSTR Set3 3 1 Contin Set3 2 1 Contin Set4 2 Aq-YidC 1 Contin Set6 2 1 Contin Set7 2 CDSSTR Set3 3 1 Contin Set3 2 1 Contin Set4 2 YidC 1 Contin Set6 2 1 Contin Set7 2 CDSSTR Set3 3 Contin Set3 8.2.3 Helix 1 Helix 2 Strand1 Strand2 Turns Unordered 0,302 0,168 0,074 0,061 0,162 0,232 0,296 0,166 0,093 0,066 0,165 0,213 0,335 0,185 0,049 0,048 0,153 0,231 0,326 0,176 0,062 0,051 0,168 0,218 0,307 0,185 0,095 0,073 0,198 0,143 0,307 0,179 0,094 0,068 0,178 0,175 0,332 0,191 0,060 0,055 0,172 0,190 0,329 0,186 0,057 0,052 0,165 0,212 0,36 0,19 0,08 0,05 0,14 0,18 0,325 0,181 0,024 0,059 0,180 0,231 0,320 0,180 0,046 0,064 0,178 0,211 0,338 0,195 0,032 0,047 0,169 0,218 0,325 0,191 0,039 0,050 0,168 0,226 0,329 0,190 0,037 0,064 0,194 0,186 0,325 0,186 0,044 0,066 0,183 0,195 0,338 0,194 0,032 0,047 0,169 0,220 0,330 0,192 0,034 0,048 0,167 0,228 0,37 0,2 0,04 0,05 0,15 0,2 0,205 0,144 0,124 0,077 0,190 0,260 0,203 0,156 0,080 0,065 0,235 0,261 0,207 0,153 0,097 0,077 0,194 0,272 0,205 0,160 0,074 0,067 0,221 0,272 0,201 0,133 0,110 0,069 0,165 0,321 0,200 0,151 0,087 0,066 0,220 0,277 0,209 0,146 0,085 0,069 0,173 0,318 0,208 0,160 0,074 0,067 0,212 0,280 0,23 0,15 0,12 0,08 0,19 0,25 Schmelzkurven von Aq-YidC, Tth-IM60 und YidC Aq-YidC Temperatur [C°] 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Θ[mdeg] -16,9431 -17,1201 -16,8428 -16,9687 -17,1977 -16,8811 -16,7301 -16,9697 -16,9446 -16,7513 -16,6992 -16,8394 -16,7603 -16,6833 -16,4547 Tth-IM60 f(T) Θ[mdeg] -0,001 -0,019 0,010 -0,004 -0,028 0,006 0,022 -0,004 -0,001 0,019 0,025 0,010 0,018 0,026 0,050 -30,1467 -30,2363 -30,223 -30,2806 -29,8095 -29,9479 -30,3031 -29,8337 -29,9055 -29,9874 -29,804 -29,7166 -29,8084 -29,5894 -29,3079 157 YidC f(T) -0,003 -0,006 -0,006 -0,008 0,010 0,004 -0,009 0,009 0,006 0,003 0,010 0,013 0,010 0,018 0,028 Θ[mdeg] -12,5153 -12,7916 -12,7841 -12,7296 -12,7033 -12,7154 -12,777 -12,7836 -12,7083 -12,6174 -12,8031 -12,574 -12,6234 -12,6311 -12,4018 f(T) 0,041 -0,007 -0,006 0,004 0,009 0,006 -0,004 -0,006 0,008 0,023 -0,009 0,031 0,022 0,021 0,061 8. Anhang 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 -16,9564 -16,4216 -16,465 -16,6037 -16,4452 -16,4761 -16,5006 -16,1719 -16,1762 -16,3494 -16,3682 -16,2209 -16,1961 -16,309 -16,1289 -15,9296 -15,9474 -15,919 -15,6758 -15,709 -15,9885 -15,779 -15,5269 -15,7095 -15,5728 -15,6152 -15,5659 -15,4441 -15,5063 -15,234 -15,0904 -15,3307 -14,9803 -15,1868 -15,215 -14,8038 -14,9554 -14,9023 -14,7879 -14,6855 -14,4992 -14,5033 -14,4271 -14,4294 -14,3405 -14,2264 -14,3981 -14,2162 -13,9293 -14,0579 -13,9343 -13,7357 -13,8755 -13,8996 -13,528 -13,4764 -0,002 0,054 0,049 0,035 0,051 0,048 0,046 0,080 0,080 0,062 0,060 0,075 0,078 0,066 0,085 0,106 0,104 0,107 0,132 0,129 0,099 0,122 0,148 0,129 0,143 0,139 0,144 0,157 0,150 0,179 0,194 0,169 0,205 0,184 0,181 0,224 0,208 0,214 0,226 0,236 0,256 0,256 0,264 0,263 0,273 0,285 0,267 0,286 0,316 0,302 0,315 0,336 0,322 0,319 0,358 0,364 -29,2543 -29,6546 -29,1146 -29,1942 -29,0346 -28,8869 -28,6638 -28,5093 -28,4439 -28,2345 -28,0957 -28,1007 -27,9124 -27,7421 -27,7124 -27,7102 -27,4388 -27,6715 -27,2698 -26,8917 -26,9641 -26,6614 -26,5472 -26,6175 -26,4223 -26,148 -26,0346 -25,7716 -25,5623 -25,7769 -25,8146 -25,4315 -25,5172 -25,474 -25,154 -25,1487 -25,2188 -24,9381 -24,8473 -24,0976 -23,3625 -21,8472 -18,3227 -15,7269 -13,7626 -12,1797 -10,2263 -8,757 -7,57928 -6,36445 -5,46071 -5,05652 -4,68166 -4,39677 -4,21091 -4,21834 158 0,030 0,015 0,035 0,032 0,038 0,044 0,052 0,058 0,060 0,068 0,073 0,073 0,080 0,086 0,088 0,088 0,098 0,089 0,104 0,118 0,115 0,127 0,131 0,128 0,136 0,146 0,150 0,160 0,167 0,160 0,158 0,172 0,169 0,171 0,183 0,183 0,180 0,191 0,194 0,222 0,249 0,306 0,437 0,533 0,606 0,665 0,738 0,792 0,836 0,881 0,915 0,930 0,944 0,954 0,961 0,961 -12,5319 -12,609 -12,2137 -12,3673 -12,412 -12,3641 -12,3344 -12,2281 -12,4806 -12,1414 -12,1716 -11,9227 -11,8007 -11,9381 -11,8984 -11,6756 -11,5327 -11,3162 -11,6347 -11,3312 -11,3645 -11,2601 -10,8092 -10,8282 -10,6923 -10,6903 -10,4964 -10,4855 -10,2173 -10,0839 -10,1177 -10,1311 -9,73609 -9,86546 -9,41335 -9,54309 -9,22711 -9,27667 -8,81652 -8,67467 -8,74333 -8,50749 -8,25704 -8,28025 -8,39674 -8,16353 -7,92344 -7,78291 -7,63949 -7,56143 -7,70917 -7,58799 -7,19927 -7,49192 -7,74202 -7,36819 0,038 0,025 0,093 0,067 0,059 0,067 0,072 0,091 0,047 0,106 0,101 0,144 0,165 0,141 0,148 0,187 0,211 0,249 0,194 0,246 0,241 0,259 0,337 0,334 0,357 0,358 0,391 0,393 0,440 0,463 0,457 0,455 0,523 0,501 0,579 0,556 0,611 0,603 0,682 0,707 0,695 0,736 0,779 0,775 0,755 0,796 0,837 0,862 0,887 0,900 0,874 0,895 0,963 0,912 0,869 0,934 8. Anhang 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 8.3 -13,382 -13,2235 -12,9691 -13,1472 -12,8822 -12,8038 -12,0667 -11,2782 -10,7312 -9,99164 -9,74782 -9,04205 -8,61733 -8,1628 -7,98759 -7,76804 -7,36066 -7,42183 0,373 0,390 0,417 0,398 0,426 0,434 0,512 0,595 0,652 0,730 0,755 0,830 0,874 0,922 0,941 0,964 1,006 1,000 -4,1252 -3,99269 -4,0017 -3,76349 -3,52619 -3,63608 -3,5873 -3,53586 -3,38179 -3,32284 -3,52898 -3,39471 -3,32699 -3,32283 -3,18016 -3,18442 -3,19933 -3,11876 0,965 0,969 0,969 0,978 0,987 0,983 0,985 0,986 0,992 0,994 0,987 0,992 0,994 0,994 1,000 0,999 0,999 1,002 -7,42766 -7,28825 -7,13778 -7,19121 -7,50529 -7,25189 -6,97147 -7,11749 -7,00946 -6,84034 0,923 0,947 0,974 0,964 0,910 0,954 1,002 0,977 0,996 1,025 Einteilung der Aminosäuren nach ClustalX * - einzelne, konservierte Aminosäuren : - Aminosäure einer Gruppe, die eine „starken“ Ähnlichkeit aufweisen: STA, NEQK, NHQK, NDEG, QHRK, MILV, MILF, HY, FYW . – Aminosäure einer Gruppe, die eine „schwache“ Ähnlichkeit aufweisen: CSA, ATV, SAG, STNK, STPA, SGND, SNDEQK, NDEQHK, NEQHRK, FVLIM, HFY 8.4 PMF-Analyse Mascot Search Results User : iris Email : [email protected] Search title : Database : NCBInr 20090123 (7704340 sequences; 2652333511 residues) Taxonomy : Bacteria (Eubacteria) (3926559 sequences) Timestamp : 30 Jan 2009 at 15:59:31 GMT Top Score : 182 for gi|82778613, 50S ribosomal protein L2 [Shigella dysenteriae Sd197] Probability Based Mowse Score Protein score is -10*Log(P), where P is the probability that the observed match is a random event. Protein scores greater than 78 are significant (p<0.05). 159 8. Anhang Concise Protein Summary Report Format As Concise Protein Summary Help Significance threshold p< 0.05 Max. number of hits 20 Re-Search All Search Unmatched 1. gi|82778613 Mass: 29928 Score: 182 Expect: 2.5e-12 Queries matched: 17 50S ribosomal protein L2 [Shigella dysenteriae Sd197] gi|156932236 Mass: 27957 Score: 168 Expect: 6.2e-11 Queries matched: 16 50S ribosomal protein L2 [Enterobacter sakazakii ATCC BAA-894] gi|119390347 Mass: 29284 Score: 165 Expect: 1.2e-10 Queries matched: 16 Chain C, Model Of E. Coli Srp Bound To 70s Rncs gi|223571 Mass: 29825 Score: 164 Expect: 1.6e-10 Queries matched: 16 protein L12 gi|33357902 Mass: 29825 Score: 164 Expect: 1.6e-10 Queries matched: 16 Chain A, Real Space Refined Coordinates Of The 50s Subunit Fitted Into The Low Resolution Cryo-Em Map Of The Ef-G.Gtp State Of E. Coli 70s Ribosome gi|15803844 Mass: 29956 Score: 162 Expect: 2.5e-10 Queries matched: 16 50S ribosomal protein L2 [Escherichia coli O157:H7 EDL933] gi|116667435 Mass: 24684 Score: 137 Expect: 7.8e-08 Queries matched: 14 Chain A, Structure Of The 50s Subunit Of A Pre-Translocational E. Coli Ribosome Obtained By Fitting Atomic Models For Rna And Protein Components Into Cryo-Em gi|152972224 Mass: 29930 Score: 134 Expect: 1.6e-07 Queries matched: 14 50S ribosomal protein L2 [Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578] gi|209905813 Mass: 27917 Score: 122 Expect: 2.5e-06 Queries matched: 13 hypothetical protein ENTCAN_00038 [Enterobacter cancerogenus ATCC 35316] gi|16762846 Mass: 29916 Score: 118 Expect: 6.2e-06 Queries matched: 13 50S ribosomal protein L2 [Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str. CT18] gi|50122948 Mass: 29990 Score: 102 Expect: 0.00025 Queries matched: 12 50S ribosomal protein L2 [Pectobacterium atrosepticum SCRI1043] gi|146313382 Mass: 29932 Score: 88 Expect: 0.007 Queries matched: 11 50S ribosomal protein L2 [Enterobacter sp. 638] gi|77957328 Mass: 30096 Score: 87 Expect: 0.0086 Queries matched: 11 COG0090: Ribosomal protein L2 [Yersinia bercovieri ATCC 43970] gi|37528540 Mass: 30201 Score: 86 Expect: 0.0092 Queries matched: 11 50S ribosomal protein L2 [Photorhabdus luminescens subsp. laumondii TTO1] gi|77962743 Mass: 30153 Score: 86 Expect: 0.0096 Queries matched: 11 COG0090: Ribosomal protein L2 [Yersinia mollaretii ATCC 43969] gi|22127863 Mass: 30168 Score: 86 Expect: 0.0096 Queries matched: 11 50S ribosomal protein L2 [Yersinia pestis KIM] gi|77978230 Mass: 30199 Score: 86 Expect: 0.0096 Queries matched: 11 COG0090: Ribosomal protein L2 [Yersinia intermedia ATCC 29909] gi|212708984 Mass: 30089 Score: 82 Expect: 0.023 Queries matched: 10 hypothetical protein PROVALCAL_00016 [Providencia alcalifaciens DSM 30120] gi|212706658 Mass: 30106 Score: 81 Expect: 0.03 Queries matched: 10 hypothetical protein PROVRUST_01585 [Providencia rustigianii DSM 4541] gi|188535275 Mass: 29994 Score: 74 Expect: 0.18 Queries matched: 10 50S ribosomal protein L2 [Erwinia tasmaniensis Et1/99] gi|197287071 Mass: 30152 Score: 73 Expect: 0.19 Queries matched: 9 50S ribosomal protein L2 [Proteus mirabilis HI4320] gi|213417260 Mass: 14049 Score: 71 Expect: 0.31 Queries matched: 8 50S ribosomal protein L2 [Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str. E01-6750] gi|88860956 Mass: 30158 Score: 64 Expect: 1.7 Queries matched: 8 50S ribosomal protein L2 [Pseudoalteromonas tunicata D2] gi|194394668 Mass: 11733 Score: 63 Expect: 1.9 Queries matched: 7 ribosomal protein L2 [Enterobacter sp. ECC_113] gi|213977963 Mass: 15740 Score: 57 Expect: 7.5 Queries matched: 7 50S ribosomal protein L2 [Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str. AG3] gi|183600750 Mass: 30119 Score: 56 Expect: 11 Queries matched: 8 hypothetical protein PROSTU_04344 [Providencia stuartii ATCC 25827] gi|83682123 Mass: 51655 Score: 54 Expect: 15 Queries matched: 7 Ser-Asp rich fibrinogen-binding, bone sialoprotein-binding protein [Staphylococcus aureus] gi|83681789 Mass: 51615 Score: 54 Expect: 15 Queries matched: 7 Ser-Asp rich fibrinogen-binding, bone sialoprotein-binding protein [Staphylococcus aureus] gi|149276078 Mass: 26239 Score: 51 Expect: 29 Queries matched: 7 probable insertion sequence ATP-binding protein, IS21 family [Pedobacter sp. BAL39] gi|170680574 Mass: 4268 Score: 50 Expect: 38 Queries matched: 3 hypothetical protein EcSMS35_4543 [Escherichia coli SMS-3-5] gi|191171999 Mass: 4242 Score: 50 Expect: 38 Queries matched: 3 hypothetical protein EcF11_4733 [Escherichia coli F11] gi|16263587 Mass: 38833 Score: 47 Expect: 75 Queries matched: 5 oxidoreductase [Sinorhizobium meliloti 1021] gi|188494328 Mass: 4286 Score: 47 Expect: 77 Queries matched: 3 hypothetical protein Ec53638_1679 [Escherichia coli 53638] 2. gi|85060253 Mass: 30053 Score: 105 Expect: 0.00012 Queries matched: 12 50S ribosomal protein L2 [Sodalis glossinidius str. 'morsitans'] gi|22854675 Mass: 24035 Score: 101 Expect: 0.00031 Queries matched: 11 ribosomal protein L2-like protein [primary endosymbiont of Sitophilus zeamais] gi|22854673 Mass: 24065 Score: 101 Expect: 0.00031 Queries matched: 11 ribosomal protein L2-like protein [Sodalis glossinidius] gi|126461099 Mass: 21224 Score: 47 Expect: 84 Queries matched: 4 ATP--cobalamin adenosyltransferase [Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029] 3. gi|17545996 Mass: 24991 Score: 55 Expect: 13 Queries matched: 5 cytochrome C oxidase subunit II [Ralstonia solanacearum GMI1000] 4. gi|215919140 Mass: 186879 Score: 55 Expect: 14 Queries matched: 12 putative glutamate dehydrogenase, NAD-specific [Coxiella burnetii RSA 493] gi|212212389 Mass: 186865 Score: 55 Expect: 14 Queries matched: 12 NAD-specific glutamate dehydrogenase [Coxiella burnetii CbuG_Q212] gi|161830430 Mass: 186223 Score: 54 Expect: 17 Queries matched: 12 putative glutamate dehydrogenase, NAD-specific [Coxiella burnetii RSA 331] gi|209364039 Mass: 186933 Score: 54 Expect: 18 Queries matched: 12 NAD-specific glutamate dehydrogenase [Coxiella burnetii Dugway 5J108-111] 5. gi|118430779 Mass: 73642 Score: 54 Expect: 16 Queries matched: 7 hypothetical protein SAPPV1_gp55 [Staphylococcus phage phiNM] 6. gi|60677302 Mass: 51067 Score: 54 Expect: 16 Queries matched: 6 sensor histidine kinase [Clostridium perfringens] 7. gi|220935397 Mass: 48007 Score: 53 Expect: 18 Queries matched: 6 hypothetical protein Tgr7_2229 [Thioalkalivibrio sp. HL-EbGR7] 8. gi|161521432 Mass: 80665 Score: 51 Expect: 33 Queries matched: 7 glycoside hydrolase family 13 protein [Burkholderia multivorans ATCC 17616] 9. gi|56416791 Mass: 58232 Score: 49 Expect: 46 Queries matched: 6 hypothetical protein AM613 [Anaplasma marginale str. St. Maries] 10. gi|187923987 Mass: 37711 Score: 49 Expect: 49 Queries matched: 6 transcriptional regulator, AraC family [Burkholderia phytofirmans PsJN] 11. gi|70734045 Mass: 23272 Score: 46 Expect: 88 Queries matched: 4 ADP-ribose pyrophosphatase [Pseudomonas fluorescens Pf-5] 160 8. Anhang 12. gi|197788692 Mass: 16191 Score: 46 Expect: 90 Queries matched: 4 hypothetical protein OCAR_1570 [Oligotropha carboxidovorans OM5] Search Parameters Type of search : Peptide Mass Fingerprint Enzyme : Trypsin Fixed modifications : Carbamidomethyl (C) Variable modifications : Oxidation (M) Mass values : Monoisotopic Protein Mass : Unrestricted Peptide Mass Tolerance : ± 50 ppm Peptide Charge State : 1+ Max Missed Cleavages : 1 Number of queries : 25 Selected for scoring : 23 Mascot: http://www.matrixscience.com/ 161 Eidesstattliche Erklärung Hiermit versichere ich, Dipl. Biol. Susanne Hilke Meyer, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig verfasst und nur unter Verwendung der angeführten Literatur und Hilfsmittel angefertigt habe. Diese Arbeit wurde bisher keiner anderen Prüfungsbehörde in gleicher oder ähnlicher Form vorgelegt. Stuttgart-Hohenheim, den 20.03.2011 162 Lebenslauf Persönliche Daten Susanne Meyer geb. Neefe geboren 13.10.1979 in Leonberg verheiratet Berufserfahrung ab 08/2010 wissenschaftliche Mitarbeiterin an der Universität Hohenheim im Institut für Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie im Fachgebiet Biotechnologie 10/2004 – 12/2009 wissenschaftliche Mitarbeiterin an der Universität Hohenheim im Institut für Mikrobiologie Studium 01/2005 – heute Universität Hohenheim Promotion im Institut für Mikrobiologie Thema: Tth-IM60 – eine Membraninsertase aus Thermus thermophilus 1999 – 2004 Universität Hohenheim Studiengang: Biologie Abschluss: Dipl.-Biol., Note: sehr gut (1,4) Vertiefungsfächer: Mikrobiologie, Genetik, Biochemie und allg. Virologie Thema der Diplomarbeit: Klonierung, heterologe Expression und Rekonstitution der Tram-Proteine aus Xenopus und humanen Zelllinien Schulbildung 1986 – 1999 Grundschule und Gymnasium in Weil der Stadt Abschluss: Abitur (2,2) Praktische Tätigkeiten 07/2003 – 03/2004 Ungeprüfte wissenschaftliche Hilfskraft an der Universität Hohenheim 10/2000 – 09//2001 Werksstudentin in der Abteilung „Entwicklung Antriebe“ bei der R. Bosch GmbH 163
