ps.fachspiegel Gesetzliche Vorschriften zur Untersuchung auf equine Virusarteritis beim Pferd Muhammed Yilmaz, Antje Wöckener, Elisabeth Müller Es kommt nicht selten vor, dass im Dschungel der zahlreichen gesetzlichen Regelungen Missverständnisse im Hinblick auf die Untersuchungen zum Nachweis von equiner Virusarteritis beim Pferd auftauchen. Der folgende Artikel hilft, die komplexen gesetzlichen Regelungen in Bezug auf die equine virale Arteritis besser zu verstehen und entsprechend umzusetzen. Einleitung und Ätiologie Die zu den meldepflichtigen Krankheiten gehörende equine virale Arteritis wurde bereits im Jahre 1953 in einem Pferde­ zuchtbetrieb in Bucyrus, Ohio, USA nach­ gewiesen [16]. Die Infektion wird durch die Spezies equines Arteritis-Virus (EAV) hervorgerufen (Ordnung: Nidovirales, Fa­ milie: Arteriviridae, Genus: Arterivirus) [4]. Es existieren zwar unterschiedlich vi­ rulente Stämme, jedoch reagiert serolo­ gisch gesehen das Virus mit allen Stäm­ men einheitlich [7]. Eine Infektion mit EAV tritt bei allen Equiden wie Pferden, Ponys sowie Zebras auf, bei experimentell infizierten Eseln konnten ebenfalls kli­ nische Symptome hervorgerufen werden [7]. Sind Equiden einmal mit dem EAV-Virus infiziert, können durch Todesfälle, Fruchtverluste, Frühgeburten und Gebur­ ten lebensschwacher Fohlen wirtschaftli­ che Schäden entstehen [1,6,11 ]. Durch vi­ rusausscheidende Hengste, Exportverbote und indirekt durch erhöhten Aufwand in Besamungsstationen kann sich der wirt­ schaftliche Schaden intensivieren [2]. Im Laufe der Jahre 2005-2009 wurden in Deutschland insgesamt 36 EAV-Fälle ge­ meldet (►Abb. 1) [8]. Zeiträume, bei Kurzausscheidern über Wochen, bei mittelfristigen Ausscheidern über Monate und bei Langzeitausschei­ dern über Jahre [16]. Die Virusausscheidung erfolgt bei aku­ ten Infektionen über Nasen- und Augen­ sekret, Speichel, Kot, Sperma, aber auch Gewebe von abortierten Feten [16]. Durch die zeitlich versetzte Übertragung des Virus von Tier zu Tier kann die Infektion über Monate im Bestand persistieren [2]. Dabei beträgt die Inkubationszeit des EAV generell 2-6 Wochen [9]. Das Virus befindet sich über Monate bis zu Jahren in den akzessorischen Ge­ schlechtsdrüsen und wird mit dem Sper­ ma ausgeschieden. Dies ist wiederum testosteronabhängig, weshalb das Virus nach der Kastration nicht mehr nachweisbar ist [3]. Somit erlangt die Erkrankung insbe­ sondere in Deutschland durch die Limi­ tierung des Besamungsgeschäfts und die serokonvertierten Stuten eine enorme Be­ deutung. Allgemeininfektionen mit EAV werden hier selten registriert. Die Abbil­ dung der globalen Verbreitung des EAV in der 2. Hälfte des Jahres 2009 macht deut­ lich, dass auch in Europa über klinische In­ fektionen berichtet wurde (► Abb. 2). Klinik In typischen Fällen einer Infektion mit EAV können folgende Symptome, sowohl einzeln als auch mehrere zusammen, beobachtet werden: Fieber, Depression, Anorexie, Leukopenie, Ödeme (der Glied­ maßen, des Präputiums, supra- oder pe­ riorbital), Konjunktivitis „pink eye", Au­ genausfluss, Rhinitis, Nasenausfluss, Urti­ karia, Aborte oder Totgeburten, fulminan­ te Pneumonie, Enteritis und Pneumoenteritis beim Fohlen. Dabei geht eine beson­ dere Gefahr von trächtigen oder seronega­ tiven Stuten aus [12,16-18]. Die Mortalitätsrate ist relativ niedrig, die meisten Todesfälle tauchen bei neu­ geborenen Fohlen auf, in seltenen Fällen können davon auch adulte Pferde betrof­ fen sein [12,16-18]. Gesetzliche Regelungen Zuchtzulassung von Hengsten Gemäß der Richtlinie 92/65/EWG (Euro­ päische Richtlinie über die tierseuchen­ rechtlichen Bedingungen für den Handel mit Tieren, Samen, Eizellen und Embryo­ nen in der Gemeinschaft sowie für die Ein­ fuhr in die Gemeinschaft) müssen Hengs­ te für die Zulassung als Zuchttiere folgen­ de Anforderungen erfüllen [15]: Epidemiologie Bei etwa der Hälfte der EAV-Infektionen entwickelt sich ein Carrier-Status. Auf­ grund dessen kann sich die Infektion rela­ tiv schnell durch persistent infizierte, kli­ nisch unauffällige Tiere oder Kontakttiere in den Beständen verbreiten. Dabei erfolgt die Virusausscheidung über verschiedene 164 Abb.1 Im Laufe der Jahre 2005-2009 in Deutschland gemeldete Equine-Arteritis-Virus-Fälle [8]. © Laboklin. Yilmaz M et al. Gesetzliche Vorschriften zur Untersuchung auf equine Virusarteritis beim Pferd Enke Verlag | Pferdespiegel 2011; 4:164-167 ps.fachspiegel Abb. 2 Die globale Verbreitung des EAV in der 2. Hälfte des Jahres 2009 macht deutlich, dass auch in Europa über klinische Infektionen berichtet wurde [20]. © WAHIDOIE 2011. 1. Sowohl bei der Aufnahme in die Besa­ mungsstation als auch am Tag der Spermagewinnung dürfen die jeweili­ gen Hengste keine Anzeichen einer In­ fektionskrankheit aufweisen. In die­ sem Zusammenhang müssen sie min­ destens 30 Tage vor der Spermagewin­ nung in Betrieben gehalten werden, in denen während dieser Zeit keine kli­ nischen Anzeichen der EAV festgestellt wurden. In dieser Zeit dürfen sie auch nicht für den Natursprung eingesetzt werden. 2. Es muss ein negativer Befund des Se­ rumneutralisationtests gegen Antikör­ per des EAV vorliegen. Der Test muss in einem behördlich anerkannten La­ bor durchgeführt werden. Sollte sich der Spenderhengst während des Spermagewinnungszeitraums nicht permanent in der Besamungsstation befinden oder mit anderen Equiden in Kontakt kommen, so müssen einmal jährlich zu Beginn der Decksaison und zusätzlich 14 Tage vor der 1. Sperma­ gewinnung die oben genanten Unter­ suchungen (Klinische Untersuchung + Serumneutralisationtest) durchgeführt werden. 3. Während des Spermagewinnungszeit­ raums sind die jeweiligen Unter­ suchungen im Abstand von je 30 Tagen zu wiederholen. Zuchteinsatz von Hengsten auf nationaler Ebene Unter Berücksichtigung von persistieren­ den Infektionen mit EAV wird der Einsatz von Hengsten in der Zucht auf nationaler Ebene mit der „Verordnung über die Ge­ winnung, Abgabe und Verwendung von Sa­ men, Eizellen und Embryonen von Zucht­ tieren (Samenverordnung)" geregelt [19]. Enke Verlag | Pferdespiegel 2011; 4:164-167 Demnach werden folgende Untersu­ chungen vorgeschrieben [19]: 1. Bei serologisch negativem Titer von <1:4 auf EAV (Serumneutralisations­ test) wird die Untersuchung im Ab­ stand von 30 Tagen wiederholt. 2. Bei serologisch positivem Titer ab 1:4 auf EAV (Serumneutralisationstest) muss der Virusnachweis aus Sperma erfolgen. Die Untersuchung des Sper­ mas wird nach 120 Tagen wiederholt. 3. Bei Teilnahme an einem Impfpro­ gramm wird der Virusnachweis aus Sperma alle 120 Tage durchgeführt. Tiere, die Anzeichen auf eine Infektion mit EAV zeigen oder bei denen die oben ge­ nannten Untersuchungsergebnisse positiv waren, sind unverzüglich von der Samen­ gewinnung auszuschließen [19]. Positiver Untersuchungsbefund Abwei­ chend kann ein Hengst im Falle eines posi­ tiven Befundes im Virusneutralisations­ test oder bei der Virusisolierung aus Sper­ ma zum Decken oder zur Spermagewin­ nung eingesetzt werden, wenn zweimal hintereinander im Abstand von 1 Woche der Virusnachweis aus Sperma negativ er­ bracht wurde [19]. Geimpfte Tiere Wird an einem Impfpro­ gramm teilgenommen, wodurch der Vi­ rusneutralisationstest auf EAV ein positi­ ves Ergebnis ergibt, können die jeweiligen Hengste als Spermaspender eingesetzt werden, wenn im Abstand von 120 Tagen kein Virus aus Sperma nachgewiesen wur­ de [19]. Dauerausscheider Equiden, die dauer­ haft Virus ausscheiden, können zur Sa­ mengewinnung eingesetzt werden, wenn der Tierhalter der zu besamenden Stute zuvor über die Folgen schriftlich infor­ miert wurde. Bei der Abgabe oder Ver­ wendung des infizierten Spermas muss von der zu besamenden Stute ein max. 30 Tage altes serologisches Ergebnis auf EAV vorliegen [19]. Die mit dem Sperma des betroffenen Hengstes zu besamenden Stuten müssen von anderen Equiden getrennt gehalten werden [19]: TL wenn das Ergebnis ihrer serologischen Untersuchung positiv war: eine Woche nach der letzten Besamung. 2. wenn das Ergebnis ihrer serologischen Untersuchung negativ war: 4 Wochen nach der letzten Besamung. Diagnostik Klinik Bei Symptomen wie Fieber, Depressionen, Ödemen, Konjunktivitis, Nasenausfluss und Abort besteht der Verdacht auf EAV. Aufgrund der vielfältigen Symptomatik, die auch bei anderen systemischen Er­ krankungen vorhanden ist, ist eine Unter­ scheidung zu der Differenzialdiagnose anhand der klinischen Symptome recht schwierig [5]. Als Differenzialdiagnosen kommen fol­ gende Krankheiten und Infektionen in Be­ tracht [5]: 1. Pferdeinfluenza 2. equine infektiöse Anämie 3. afrikanische Pferdepest 4. equine Herpesviren 1 und 4, u.ä. Diagnostische Methoden Die nach der Weltorganisation für Tier­ gesundheit (OIE) für den Handel mit Pfer­ den vorgeschriebenen Methoden sind: • der Virusneutralisationstest (Serum­ neutralisationstest), • die Isolierung des Virus' aus Sperma mittels Zellkultur • die Isolierung des Virus' anhand der Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) [21]. Virusneutralisationstest Bei dieser Methode wird EAV mit Serum inkubiert. Auf dieses Gemisch werden die für diese Viren empfänglichen RK-13-Zellen gegeben und auf das Vorkommen eines zytopathischen Effekts im jeweiligen Titer untersucht (► Abb. 3). In der Literatur wird oftmals davon be­ richtet, dass das im Virusneutralisations­ test untersuchte Serum zytotoxisch auf Yilmaz M et al. Gesetzliche Vorschriften zur Untersuchung auf equine Virusarteritis beim Pferd 165 ps.fachspiegel Summary Legislative rules concerning to the investigation of equine viral arteritis of horses In the context of numerous regulations misunderstandings regarding the equine viral arteritis can occur. This article aims at making veterinary surgeons under­ stand the legal requirements in Germany and appropriately implement the regula­ tions. Key words equine viral arteritis Literatur Abb. 3 Durch EAV verursachter zytopathischer Effekt auf RK-13-Zellen: Die Zellen lösen sich aus dem Zellverband, erkennbar an den Lücken zwischen den Zellen. © Laboklin. die hier eingesetzten RK-13-Zellen wirken kann. Dies liegt insbesondere vor, wenn die betroffenen Pferde gegen Herpesviren geimpft wurden. Leider kann die Zytotoxi­ zität auf RK-13-Zellen auch nicht bei Se­ rumproben von Pferden, die nicht gegen Herpesviren geimpft wurden, ausgeschlos­ sen werden. In wissenschaftlichen Kreisen wird vermutet, dass die Ursache nicht nur mit der Impfung gegen Herpesviren, son­ dern auch mit verschiedenen Impfungen gegen andere Erreger, medikamentösen Behandlungen und mit weiteren noch ungeklärten Faktoren zusammenhängen könnte [10,14]. Im Falle einer Zytotoxi­ zität des Serums empfiehlt es sich, nach einigen Wochen eine weitere Probe zu un­ tersuchen oder die Untersuchung anhand der Isolierung des Virus' zu beurteilen. Serumpaaruntersuchung Zusätzlich zu den oben erwähnten gesetzlichen Unter­ suchungen können zur indirekten Erre­ gerdiagnostik Serumpaaruntersuchungen durchgeführt werden. Hier sollte beachtet werden, dass Pferde bei einer akuten In­ fektion im Abstand von 3-4 Wochen Anti­ körper gegen das EAV produzieren kön­ nen. Daher ist es sinnvoll, im Falle eines Verdachts auf EAV 3-4 Wochen nach der 1. Probenentnahme eine weitere Serum­ probe untersuchen zu lassen. Wird nach dieser Untersuchung ein Titeranstieg von 3-4 Stufen festgestellt, ist ein Rückschluss auf das Infektionsgeschehen möglich [13]. 166 Virusisolierung aus Sperma mittels Zellkultur bzw. RT-PCR Als ersten Schritt sollten die betroffenen Tiere mittels Virusneutralisationstest auf EAV untersucht werden. Liegt ein positiver Befund vor, sollte kontrolliert werden, ob die betroffenen Equiden an einem Impf­ programm gegen EAV beteiligt sind. Dabei muss auch beachtet werden, ob vor der Impfung möglicherweise ein negativer Befund im Hinblick auf den Virusneutrali­ sationstest vorlag [16]. Liegt ein positiver Befund (Titer ≥ 1:4) bei Hengsten vor, wird die Virusisolierung aus Sperma entweder mittels Zellkulturen oder mittels RT-PCR durchgeführt [21]. Sperma ist in vielen Fällen toxisch für Ge­ webezellen, daher sollte die RT-PCR die Methode der Wahl sein [16]. Bekämpfung Neben den gesetzlichen Bestimmungen sind für die Bekämpfung von EAV hygie­ nische Maßnahmen wie die Isolierung kranker und verdächtiger Tiere, Sperrung der Zuchtbetriebe, Quarantäne beim Zukauf sowie die ständige Kontrolle der Hengste auf EAV-Antikörper und EAVAusscheidungen durchzuführen [16]. Zur Prophylaxe sind in Deutschland in­ aktivierte Vakzine zugelassen, jedoch ist dann die Differenzierung der geimpften Tiere von tatsächlich infizierten Tieren nicht möglich [16]. Yilmaz M et al. Gesetzliche Vorschriften zur Untersuchung auf equine Virusarteritis beim Pferd 1 Ahlswede L, Leyk W, Zurmühlen K. Untersuchungen zur Equinen Virusarteritis: Serologische Untersuchungen, Virusnachweise in Sperma und abortierten Feten, Impfungen. Prakt Tierarzt 1999; 29: 18-25 2 Ahlswede L, Zurmühlen K. Was sollte der praktische Tierarzt über die EVA (Equine Virus Arteritis) wissen? Prakt Tierarzt 2001; 82:1040-1044 3 Aurich C. Reproduktionsmedizin beim Pferd: Gynäkologie, Andrologie, Geburtshilfe. Stuttgart: Parey; 2005 4 Cavanagh D. Nidovirales: a new order comprising Coronaviridae and Arteriviridae. Arch Virol 1997;142:629-633 5 Center for Food Safety and Publich Health. Equine Viral Arteritis (2099). Im Internet: http://www. cfsph.iastate.edu/Factsheets/pdfs/equine_ viral_arteritis.pdf; Stand: 17.05.2011 6 Eichhorn W, Heilmann M, Kaaden OR. Equine viral arteritis with abortions: serological and virological evidence in Germany. 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