Aufgabe II: Untersuchungen am isolierten Herzen (Straub

Aufgabe II: Untersuchungen am isolierten Herzen
(Straub- und Langendorff-Präparation)
Versuchsteil A
Untersuchung ionaler und humoraler Effekte am isolierten Froschherz (StraubherzPräparation)
1. Aufgabenstellung
In diesem Versuchsteil sollen folgende Effekte am isolierten Froschherzen mit Hilfe eines StraubPräparates untersucht werden:
1. Entzug von Ca2+-Ionen
2. Applikation eiskalter Ringerlösung
3. Applikation von Adrenalin
4. Erhöhung der extrazellulären K+-Konzentration
5. Applikation eines Betablockers (selektiver 1-Rezeptorenblocker) und eines Calciumantagonisten
(Ca2+-Kanalblocker Verapamil)
6. Aufzeichnung eines Einthoven-EKGs
2. Die Straubherz-Präparation
nach Storch & Welsch, 1993
Die Präparation des Froschherzens wird vor dem
Praktikum durch Mitarbeiter des Institutes
vorgenommen. Um Ihnen eine Vorstellung vom
Ablauf zu geben, folgt eine kurze Beschreibung
der Präparationsschritte. Man verwendet für
diesen Versuch den Krallenfrosch Xenopus
laevis.
Das Froschherz ist etwas anders aufgebaut als
das Herz eines Säugers. Es besitzt zwei komplett
getrennte Vorhöfe, aber nur einen Ventrikel. Der
linke Vorhof empfängt oxygeniertes Blut aus der
Lunge, der rechte venöses Blut aus dem
Körperkreislauf. Obwohl der Ventrikel ungeteilt
ist, werden sauerstoffreiches und sauerstoffarmes Blut nur teilweise durchmischt.
Sauerstoffreicheres Blut wird in die Körperarterien geleitet; sauerstoffärmeres Blut gelangt in die Lungen
und die Haut, wo das Blut wieder mit Sauerstoff angereichert wird.
Zur Präparation wird der Truncus arteriosus mit einem Faden abgebunden. An der V. cava posterior wird
mit einer Schere möglichst herzfern ein kleiner Schnitt angebracht. Eine vorher mit Ringerlösung gefüllte
Straubkanüle wird an der Schnittstelle eingeführt und so weit vorgeschoben, bis sich die Spitze der
Kanüle im Ventrikel befindet. Das vom Herzen in die Straubkanüle gedrückte Blut wird sorgfältig
abgesaugt und durch Ringerlösung ersetzt. Mit einem Faden wird die Kanüle möglichst herzfern an der
Vene fixiert, damit der Sinus venosus, der primäre Schrittmacher, nicht abgebunden wird. Nun wird das
Herz zusammen mit der Straubkanüle aus dem Frosch durch Abtrennen der noch bestehenden
Verbindungen herausgenommen. Für die Messungen wird die Kanüle an einem Stativ befestigt. Der
mittlere Flüssigkeitspegel in der Kanüle soll bei etwa 20 mm konstant gehalten werden, damit im Herzen
immer der gleiche Druck herrscht.
Achten Sie während der Messungen darauf, dass keine Luftblasen in das Herz gelangen! Die
Ventrikelspitze wird mittels einer elastischen Klemme mit einem am Stativ befestigten mechanischen
Wegeaufnehmer verbunden, der wiederum an einen Messrechner angeschlossen ist. Der Zugfaden wird
vorsichtig gespannt. Die mit der Systole verbundene Verkürzung des Herzens erzeugt so ein
zeitabhängiges Signal, das so genannte Herz-Mechanogramm.
1
3. Durchführung und Auswertung
Das Herz-Mechanogramm wird mit Hilfe einer speziellen Software erfasst und graphisch dargestellt.
Machen Sie sich zunächst mit dem Programm vertraut. Ein Student pro Gruppe sollte die Bedienung des
Programms übernehmen, während die anderen für die Applikation der Substanzen verantwortlich sind.
Applikation der Lösungen:
Das Herz muss während des gesamten Versuches feucht gehalten werden, indem es ständig mit
Ringerlösung versorgt wird. Dabei ist darauf zu achten, dass die Kanüle ständig mit einem konstanten
Flüssigkeitslevel gefüllt ist. Außerdem sollte das Herz auch von außen mit Hilfe einer Pipette ab und zu
mit Ringerlösung umspült werden. Dabei sollte es jedoch nicht mechanisch gereizt werden. Achten Sie
darauf, dass das Herz beim Tauschen der Lösungen keine Luft zieht. Ersetzen Sie die Testlösung jeweils
wieder durch Ringerlösung, sobald sich die Herzfrequenz und die Amplitude nicht mehr verändern.
Zwischen den Applikationen der Testlösungen ist darauf zu achten, dass der Ausgangszustand nahezu
wieder hergestellt wird.
Konzentration [mmol/l]
Frosch-Ringerlösung
Ca2+-freie
Frosch-Ringerlösung
K+-reiche
Frosch-Ringerlösung
NaCl
NaH2PO4
MgSO4
CaCl2
KCl
100
1
1,6
1,6
4
20
5,5
100
1
1,6
0
4
20
5,5
79
2
1,6
1,6
25
30
5,5
2
NaHCO3 Glucose
Verwenden Sie die in der Tabelle aufgelisteten Lösungen und gehen Sie wie folgt vor!
Welche Effekte beobachten Sie und wie erklären Sie diese?
1. Austausch der Ringerlösung durch Ca2+-freie Ringerlösung.
2. Austausch der Ringerlösung durch eiskalte Ringer-Lösung.
Was würden Sie beim menschlichen Herzen beobachten?
3. Zugabe von Adrenalin zur Ringerlösung (wenige Tropfen der bereitgestellten 10–5 M Lösung).
4. Austausch der Ringerlösung durch K+-reiche Ringerlösung
(Erhöhung der Kaliumkonzentration von 4 mM auf 25 mM).
5. Die jeweils letzte Gruppe kann den Effekt eines Betablockers und eines Ca2+-Kanalblockers testen.
Gehen Sie dabei wie folgt vor:
- Zugabe von ca. 5-10 Tropfen Adrenalin (10–5 M), positiv inotropen und chronotropen Effekt abwarten
- Zugabe von 20-30 µl des -Rezeptorenblockers "Beloc i.v." (Wirkstoff Metoprololtartrat),
Effekt beobachten
- Zugabe von 10 µl des verdünnten Ca2+-Kanalblockers "Verahexal" (Wirkstoff Verapamil), Effekt
abwarten
- Zugabe von 10 µl "Verahexal" (unverdünnt), Effekt beobachten (Hinweis: die Substanz lässt sich nicht
auswaschen).
6. Aufzeichnung eines Einthoven-EKGs
Dafür wird ein Frosch-Herz in eine Schale mit Ringerlösung gelegt. Die Ableitelektroden tauchen so in
die Ringerlösung ein, dass sie das Einthoven-Dreieck bilden. Die Papier-Vorschubgeschwindigkeit wird
mit Hilfe der Tasten [50] und [x 0,1] auf 5 mm/s eingestellt.
Positionieren Sie das Froschherz zunächst passend zum Steiltyp (ca. 90°) und zeichnen drei Herzaktionen
mit dem EKG-Schreiber auf. Drehen Sie anschließend das Herz passend zum Linkstyp und Rechtstyp und
zeichnen jeweils wieder drei Herzaktionen auf. Wie ändern sich die R-Zacken in Ableitung I, II und III?
Geben Sie anschließend ca. 1 ml Adrenalinlösung auf das Herz und beobachten Sie das EKG.
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Versuchsteil B
Computersimulation zur Wirkung physiologischer und
Substanzen am isolierten Rattenherz (Langendorff-Präparat)
pharmakologischer
1. Einführung
Dieser Versuchsteil wird als Simulation mit Hilfe der Software SimHeart durchgeführt. SimHeart
ist ein realitätsnahes Programm, das keine gemessenen Versuchsergebnisse verwendet, sondern die
Herzaktion nach einem mathematischen Algorithmus berechnet. Es besteht somit die Möglichkeit,
auch ohne Präparation eines Tieres einige der klassischen Versuche am Langendorff-Herzen im
virtuellen Labor durchzuführen.
2. Aufgabenstellung
A) Schauen Sie sich zuerst das Video über die Präparation eines Langendorff-Herzens an!
B) Untersuchen Sie die Wirkung von
1. Adrenalin
2. Acetylcholin
3. Atropin (Parasympatholytikum)
4. Propranolol (nichtselektiver-Rezeptorenblocker)
5. Verapamil (Ca2+-Kanalblocker)
6. Strophanthin (Herzglykosid)
Beobachten Sie dabei die Wirkung auf die Herzfrequenz sowie auf die Druckamplitude!
3. Durchführung
Machen Sie sich zunächst mit dem virtuellen Schreiber vertraut. Testen Sie eventuell einige
Einstellungen für „Resolution“ in mV/Div (Div = Kästchen) und „Speed“ in cm/s (1 Kästchen ist
1 cm breit), um eine optimale Registrierung zu erhalten. Die Nährlösung (Perfusat) fließt aus
einem Vorratsbehälter durch einen mit Carbogen durchperlten Zwischenbehälter. Das Perfusat hat
eine konstante Fließgeschwindigkeit von 10 ml/min. Dem Perfusat können Pharmakalösungen mit
einer variablen Fließgeschwindigkeit beigemischt werden. Das Gemisch wird über eine Kanüle in
die Aorta geleitet und gelangt von dort über die Herzkranzgefäße in das Herzmuskelgewebe.
Dadurch wird auch außerhalb des Organismus die Grundversorgung des Herzmuskels mit
Nährstoffen und Sauerstoff
gewährleistet,
während
gleichzeitig die Wirkung von
Pharmaka untersucht werden
kann.
In
der
linken
Herzkammer befindet sich
ein Ballonkatheter, der über
eine Flüssigkeitssäule mit
dem Transducer verbunden
ist. Dieser wandelt die
Druckänderungen infolge der
Herzkontraktionen
in
elektrische Signale um und
gibt diese über das rote
Kabel an den Verstärker
weiter.
4
Applizieren von Substanzen:
Das Herz wird ständig mit einer physiologischen Lösung (Krebslösung) mit einer Flussrate von
10 ml/min (= 10.000 µl/min) umspült. Bei der Applikation von Substanzen wird ein zusätzlicher
Flüssigkeitsstrom in diese Krebslösung geführt. Bei der Festlegung der Konzentration muss
beachtet werden, dass die eingestellten Konzentrationen durch die ständig fließende Krebslösung
noch einmal verdünnt werden.
Beispiel: Stellen Sie eine Konzentration von 10-4 M mit einer Flussrate von 10 µl/min ein, so
erfolgt eine Verdünnung durch die Krebslösung um den Faktor 1000, da diese Krebslösung
konstant mit 10.000 µl/min fließt. Die endgültige Konzentration der Substanz am Herzen ist also
nicht 10-4 M sondern 10-7 M. Stellen Sie dagegen eine Flussrate von 100 µl/min ein, so ist der
Verdünnungsfaktor nur 100. Die endgültige Konzentration beträgt also 10-6 M.
Die Zufuhr der Substanzen erfolgt mit Hilfe des Perfusors. Es können 2 unterschiedliche
Wirkstoffe gleichzeitig appliziert werden.
1. Reagenzglasständer mit gewünschtem Wirkstoff auswählen (aktuelle Wirkstoffbezeichnung auf Reagenzglasständer anklicken und neue im Dropdown-Menü auswählen)
2. Bei gedrückter Maustaste wird das Reagenzglas mit der gewünschten Konzentration aus
dem Reagenzglasständer in einen der beiden Perfusorschächte überführt.
3. Am Zählwerk den gewünschten Stromfluss in µl/min einstellen. Durch die rote
Leuchtdiode unterhalb des Zählwerkes wird signalisiert, dass der eingestellte Wert nur im
Zählwerk eingegeben, aber noch nicht vom Perfusor übernommen ist.
4. Pfeiltaste neben der roten Diode drücken. Die Diode wird grün. Der Wert wird vom
Perfusor übernommen und erscheint im Display der Stromflusstaste.
5. Zur Applikation der Substanz wird die Stromflusstaste gedrückt.
6. Durch Drücken der Stop-Taste wird die Applikation beendet.
7. Hinweis: Vor dem Zurückstellen eines Reagenzglases muss der zugehörige Reagenzglasständer ausgewählt werden.
Achten Sie darauf, dass zwischen den einzelnen Teilversuchen ausreichend lange Kontrolllösung
(Krebslösung) appliziert wird, um das Herz von Substanzresten zu befreien und somit den
Ausgangszustand wiederherzustellen. Beim parallelen Zugeben von zwei Substanzen müssen
zeitgleich beide Perfusoren angeschaltet sein.
Wertebestimmung:
Die Auswertung der Druckamplitude und der Frequenz wird sofort nach Stabilisierung des Effektes
durchgeführt. Dazu werden die Kästchen ausgezählt und anhand der eingestellten Auflösung bzw.
Schreibergeschwindigkeit in mV bzw. Schläge/min umgerechnet. Stellen Sie „Resolution“ und
„Speed“ so ein, dass die Aufzeichnungen möglichst gut auswertbar sind. Bei der Amplitudenauswertung ist zusätzlich zu beachten, dass der Verstärker an seinem Ausgang 1 mV pro 2 mmHg
liefert. Das heißt, die errechneten Amplituden in mV müssen anschließend durch Multiplikation
mit dem Faktor 2 in mmHg umgerechnet werden. Sollte die Kurve aus dem Bild laufen, kann die
Nulllinie durch Verschiebung des Schreibers korrigiert werden.
4. Auswertung
Tragen Sie die Werte in die Tabelle ein und erläutern Sie ihre Beobachtungen!
1.
Welchen Einfluss hat Adrenalin auf Herzkraft und Frequenz (Inotropie, Chronotropie)?
2.
Welchen Einfluss hat Acetylcholin auf Herzkraft und Frequenz? Beachten Sie den
Unterschied zwischen isoliertem Herz und physiologischer Situation im Organismus.
3.
Welche Wirkung hat Atropin bei alleiniger Applikation und warum? Welche Wirkung
erwarten Sie bei alleiniger Applikation von Atropin in vivo?
4.
Wie verändert sich die Acetylcholinwirkung bei gleichzeitiger Applikation von
Atropin?
5.
Wie verändert Propranolol die Adrenalinwirkung?
6.
Bei Überdosierung von Verapamil kann es zum Herzstillstand kommen. Wie ist dieser
zu erklären und was ist die eigentlich angestrebte therapeutische Wirkung dieses Ca2+Kanalblockers?
7.
Welchen Effekt hat das Herzglykosid g-Strophanthin?
5
Wirkungsweise der pharmakologischen
Substanzen:
Applizierte Substanz
Konz. Amplitude
[mol/l] [mmHg]
Kontrolle
+ Adrenalin
--10-07
10-06
Kontrolle
+ Acetylcholin
--10-07
10-06
10-06
+ Adrenalin
Kontrolle
+ Atropin
+ Acetylcholin
--10-06
10-07
10-06
Kontrolle
+ Adrenalin
+ Propranolol
--10-06
10-06
10-05
Kontrolle
+ Adrenalin
+ Verapamil
--10-06
10-06
10-05
10-04
Kontrolle
+ g-Strophanthin
--10-08
10-07
Kontrolle
+ Verapamil
+ g-Strophanthin
--10-07
10-08
6
Frequenz
[Schläge/
min]
5. Theorie zur Wirkungsweise der Substanzen
Adrenalin:
Positiv inotroper Effekt: Adrenalin aus dem Nebennierenmark und Noradrenalin aus den Nervenendigungen des
Sympathikus binden an 1-adrenerge-Rezeptoren des Arbeitsmyokards. Über eine G-Protein-Kaskade wird die
Adenylatzyklase aktiviert, was zu einem Anstieg des intrazellulären cAMP führt. cAMP aktiviert die Proteinkinase
A, die über eine Phosphorylierung des L-Typ-Ca2+-Kanals diesen aktiviert und somit einen vermehrten Ca2+Einstrom bewirkt. Die erhöhte Ca2+-Konzentration bewirkt eine erhöhte Kontraktionskraft.
Positiv chronotroper Effekt: Adrenalin und Noradrenalin binden beide an 1-Rezeptoren der Sinusknotenzellen. Es
findet auch in diesen Zellen die oben beschriebene cAMP-Kaskade statt. Der erhöhte cAMP-Spiegel steigert direkt
den Schrittmacherstrom If, der durch cAMP-gesteuerte unspezifische Kationenkanäle getragen wird. Parallel kommt
es wie in den Myokardzellen auch hier zu einem gesteigerten Ca2+-Einstrom (Phosphorylierung durch
Proteinkinase A). Die Aktivierung der Schrittmacherkanäle und der Ca2+-Kanäle führt zu einer schnelleren
diastolischen Depolarisation und zu einem steileren Aufstrich des Aktionspotentials im Sinusknoten.
Acetylcholin:
Negativ inotroper Effekt: Der direkte Einfluss von Acetylcholin aus dem Parasympathikus ist auf die Strukturen des
Vorhofes beschränkt. Im Vorhofmyokard bindet es an muskarinerge ACh-Rezeptoren. Dies bewirkt über ein
inhibitorisches G-Protein die Hemmung der Adenylatzyklase, wodurch der cAMP-Spiegel der Zelle sinkt und die
Phosphorylierung der Ca2+-Kanäle durch die Proteinkinase A verringert wird. Die Konsequenz ist ein verminderter
Ca2+-Einstrom, was die verminderte Kontraktionskraft erklärt.
Negativ chronotroper Effekt: Durch den hemmenden Einfluss auf die Adenylatzyklase in den Sinusknotenzellen hat
Acetylcholin eine Verminderung des Schrittmacherstromes zur Folge. Depolarisationen werden dadurch verzögert.
Gleichzeitig kommt es zu einer rezeptorgesteuerten Aktivierung eines Kaliumkanals, was über die -Untereinheit
des inhibitorischen G-Proteins vermittelt wird. Es kommt dadurch zu einem vermehrten Kaliumausstrom, was
ebenfalls die Depolarisation verzögert.
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Atropin:
Atropin ist ein Alkaloid aus Nachtschattengewächsen, das beispielsweise in der Notfallmedizin (z. B. als Gegengift
zu Muscarin) und in der Augenheilkunde eingesetzt wird. In hohen Dosen kann es zur Atemlähmung führen. Es
wirkt parasympatholytisch, d. h. es vermindert die Wirkung von Acetylcholin, indem es die Bindungsstellen an
muskarinergen Acetylcholin-Rezeptoren besetzt, ohne die Rezeptoren zu aktivieren.
Propranolol:
Dieses Medikament blockiert -adrenergen-Rezeptoren (nichtselektiver Betablocker) und gehört somit zu den Sympatholytika. Da die Sympathikuswirkung am Herzen verringert wird, verringern sich Herzkraft und -frequenz.
Dadurch sinkt das Herzminutenvolumen und mit ihm der arterielle Mitteldruck. 
Verapamil:
Verapamil ist ein Ca2+-Kanalblocker und wird daher auch als Kalziumantatagonist bezeichnet. Bei therapeutischen
Konzentrationen führt der geringere Ca2+-Einstrom zur Verringerung von Schlagkraft und Frequenz des Herzens
und dadurch zur Senkung des arteriellen Mitteldrucks. Außerdem reduziert Verapamil den Tonus der glatten
Muskulatur der Blutgefäße. Dadurch sinkt der periphere Widerstand und mit ihm der arterielle Mitteldruck.
Strophantin (=Ouabain):
Diese Substanz gehört zu den Herzglykosiden. Sie vermitteln ihre therapeutischen Effekte bei Herzinsuffizienz
überwiegend durch die Kontraktionskraftsteigerung der Kardiomyozyten. Die Wirkung der Herzglykoside beruht
hauptsächlich auf Hemmung der Na+/K+-ATPase. Diese Hemmung hat zur Folge, dass die beim Aktionspotenzial
eingeströmten Na+-Ionen nicht mehr vollständig zurückgepumpt werden können und somit die intrazelluläre Na+Konzentration steigt. Da der elektrochemische Na+-Gradient die Triebkraft für den Vorwärtsmodus (Na+ rein, Ca2+
raus) des Na+/Ca2+-Austauscher ist, wird in der Diastole weniger Ca2+ nach extrazellulär transportiert und
stattdessen ins SR gepumpt. Somit kann in der nächsten Systole mehr Ca2+ aus dem SR freigesetzt werden und die
Kontraktionskraft steigt. Herzglykoside haben eine geringe therapeutische Breite. Bei Überdosierung kommt es zu
gefährlichen Elektrolyt- und Herzrhythmusstörungen. Die Herzinsuffizienz wird allerdings heutzutage in erster
Linie nicht über eine Stärkung, sondern eine Entlastung des Herzens durch Blutdrucksenkung mit Betablockern,
Hemmern des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems und Diuretika behandelt. Die klinisch verwendeten Herzglykoside sind Digitoxin und Digoxin.
6. Schwerpunkte zur Vorbereitung auf das Praktikum
- Ruhemembranpotential und Einwärtsgleichrichter-Kanäle (Kir-Kanäle)
- Aktionspotentialformen und verantwortliche Ionenkanäle von Schrittmacherzellen und Zellen des
Arbeitsmyokards
- spannungsabhängiger Na+-Kanal und seine drei Zustandsformen
- absolute und relative Refraktärzeit
- Erregungsbildungs- und -leitungssystem des Herzens
- vegetative Innervation des Herzens und zugehörige Transmitter bzw. Rezeptoren
- inotrope, chronotrope und dromotrope Effekte
- elektromechanische Kopplung im Arbeitsmyokard
- Ca2+-Transportprozesse der Myokardzelle
- Rolle von Phospholamban bei einer sympathikotonen Stimulation des Herzmuskels: Wofür ist die
Aktivierung der SERCA von Bedeutung?
- Frequenzinotropie
- Wirkung von Hypokaliämie und Hyperkaliämie auf das Herz
- Begriffe Antagonist und Agonist
- Druck-Volumen-Diagramm des linken Ventrikels
- Ruhedehnungskurve, Kontraktionsformen
- isobare und isovolumetrische Maxima, Unterstützungskurve
- Darstellung der 4 Herzphasen im Diagramm
- Frank-Starling-Mechanismus und seine Bedeutung
- Einfluss des Sympathikus
- Ventrikelfunktionskurve
- Koronardurchblutung, Koronarreserve
- Energetik des Herzmuskels
- EKG (Einthovendreieck und Lagetypen)
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