(TRIP6) in Ewing-Sarkomen
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Aus dem Institut für Klinische Biochemie und Pathobiochemie des Universitätsklinikums Würzburg Institutsleitung: Professor Dr. med. Alma Zernecke-Madsen Funktionelle Charakterisierung des Proteins Thyroid Receptor Interacting Protein 6 (TRIP6) in Ewing-Sarkomen Inauguraldissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Julius-Maximilians-Universität Würzburg Vorgelegt von Semjon Manuel Willier aus Stuttgart Würzburg, Februar 2015 Referentenblatt Referentin: Prof. Dr. rer. nat. Elke Butt Korreferent: Prof. Dr. med. Andreas Rosenwald Dekan: Prof. Dr. med. Matthias Frosch Tag der mündlichen Prüfung: 17.07.2015 Der Promovend ist Arzt. Meiner Familie. Vorwort Im Jahre 1973 wurde in den Vereinigten Staaten von Amerika die Onkologie als eine Subspezialität der Inneren Medizin etabliert. Dies stellte den vorläufigen Höhepunkt einer jahrzehntelangen Entwicklung dar, in welcher sich die medikamentöse Therapie von Malignomen, neben etablierten chirurgischen und radiotherapeutischen Behandlungsmöglichkeiten, erst bewähren musste. In den ersten Jahren des 20. Jahrhunderts hatte Paul Ehrlicher den Begriff der Chemotherapie als den Einsatz von chemischen Verbindungen in der Therapie von Erkrankungen geprägt. Er war es auch, der Forschungsarbeiten zur Wirksamkeit von chemischen Wirkstoffen in Tiermodellen durchführte und so etwa die Wirkung von Arsenverbindungen gegen Syphilis mithilfe eines Hasenmodells dokumentieren konnte. Diese wissenschaftlichen Neuerungen führten, in Verbindung mit einer durch lokale Therapieoptionen (d. h. Chirurgie und Bestrahlung) nur ungenügend zu verbessernden Prognose, zu einer rapiden Entwicklung der onkologischen Tumortherapie. Erste vielversprechende Substanzen wie Folsäureantagonisten und Lost-Verbindungen führten zwar nur zu transienter Remission bei hämatologischen Malignomen, aber 1958 konnte Min Chiu Li mit der kurativen Chemotherapie durch Methotrexat bei Chorionkarzinomen einen Paradigmenwechsel einleiten. 1965 wurden die phänomenalen Ergebnisse einer Kombinationstherapie bei Hodgkin-Lymphom-Patienten bekannt: Durch die Kombination verschiedener Wirkstoff ließ sich bei 80% der Patienten eine komplette Remission erzielen, wobei diese bei der Mehrzahl der Patienten auch heute noch anhält. Trotz vieler weiterer Fortschritte besteht noch immer ein dringender Bedarf an medikamentösen Alternativen bei der Therapie von fortgeschrittenen, rezidivierenden oder nicht-ansprechenden Malignomen. Das wachsende Wissen über molekulare Prozesse in Malignomen ebenso wie die Sequenzierung des menschlichen Genoms ermöglicht heute die Entwicklung von zielgerichteten Therapeutika (nach DeVita and Chu, 2008). In diesem Sinne ist es mir ein Anliegen, mit der vorliegenden Arbeit zum Verständnis der Ewing-Sarkome beizutragen, mit der Zielsetzung, durch Impulse zu neuen therapeutischen und diagnostischen Ansätzen die Prognose von Patienten mit Ewing-Sarkom zu verbessern. Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung .................................................................................................................. 1 1.1 Epidemiologische und biologische Aspekte der Tumoren der Ewing-Sarkom-Familie ........... 1 1.2 TRIP6 als multifunktionelles Protein ..................................................................................... 10 1.2.1 Funktion von TRIP6 bei Migration und fokalen Kontakten ............................................... 13 1.2.2 Regulation der Aktivität von TRIP6 und Signaltransduktion............................................. 15 1.2.3 Transkriptionskontrolle und NFκB-Signalling ................................................................... 17 1.2.4 Funktion von TRIP6 in Malignomen .................................................................................. 18 1.3 2. TRIP6 als möglicher pathologischer Faktor in Ewing-Sarkomen ........................................... 20 Materialien und Methoden ...................................................................................... 23 2.1 Materialien ............................................................................................................................ 23 2.1.1 Zelllinien............................................................................................................................ 23 2.1.2 Lösungen, Medien und Seren für die Zellkultur ............................................................... 24 2.1.3 Chemikalien und Reagenzien ............................................................................................ 24 2.1.4 Puffer und Lösungen ......................................................................................................... 25 2.1.5 Antikörper ......................................................................................................................... 27 2.1.5.1 Primärantikörper ...................................................................................................... 27 2.1.5.2 Sekundärantikörper .................................................................................................. 27 2.1.6 Reaktionskits ..................................................................................................................... 28 2.1.7 Ribonukleinsäurekonstrukte für RNA-Interferenz ............................................................ 28 2.1.8 Verbrauchsmaterialien ..................................................................................................... 29 2.1.9 Geräte und Software ........................................................................................................ 30 2.2 Methoden .............................................................................................................................. 33 2.2.1 Übersicht über die durchgeführten Experimente ............................................................ 33 2.2.2 Zellkulturbedingungen ...................................................................................................... 33 2.2.3 Transiente Transfektion von Zellen .................................................................................. 34 2.2.3.1 Adhärente Methode ................................................................................................. 35 2.2.3.2 Solubilisierungsmethode .......................................................................................... 35 2.2.3.3 Vergleich beider Methoden der transienten Transfektion....................................... 36 Inhaltsverzeichnis 2.2.4 Gewinnung von Single-Cell-Kolonien mit induzierbarem Knockdown von TRIP6 ............ 37 2.2.5 Denaturierende Gelelektrophorese.................................................................................. 40 2.2.6 Western Blot ..................................................................................................................... 41 2.2.7 RNA Extraktion .................................................................................................................. 42 2.2.8 cDNA-Synthese ................................................................................................................. 43 2.2.9 Quantitative Real-Time-Polymerase-Kettenreaktion ....................................................... 43 2.2.10 Immunfluoreszenz ............................................................................................................ 44 2.2.11 Proliferationsassay ........................................................................................................... 44 2.2.12 Adhäsionsassay ................................................................................................................. 45 2.2.12.1 Kristallviolett-basierte Methode............................................................................. 45 2.2.12.2 CellTiter-Glo® basierte Methode ............................................................................ 46 2.2.13 Migrationsassay ............................................................................................................... 48 2.2.13.1 Migrationsassay mit wieder verwertbarem Material ............................................. 48 2.2.13.2 Migrationsassay mit Einwegmaterial...................................................................... 50 2.2.14 Colony Forming Assay....................................................................................................... 50 2.2.14.1 Versuche zur Klonogenität mit konstitutivem Knockdown .................................... 50 2.2.14.2 Colony forming Assay mit transientem Knockdown............................................... 52 2.2.15 Analyse von Microarraydaten .......................................................................................... 53 2.2.16 Gene Set Enrichment Analyse .......................................................................................... 54 2.2.17 Statistische Methoden...................................................................................................... 54 3. Ergebnisse ............................................................................................................... 55 3.1 Funktion von TRIP6 als Kotranskriptionsfaktor in EFT .......................................................... 57 3.1.1 Invasive und proliferative Signatur durch TRIP6 .............................................................. 57 3.1.2 Validierung der Microarrays ............................................................................................. 59 3.2 Zelluläre Lokalisation von TRIP6 in Ewing-Sarkom-Zellen .................................................... 60 3.3 TRIP6-Knockdown ohne Einfluss auf Proliferation und Adhäsion ........................................ 61 3.3.1 Proliferation ...................................................................................................................... 61 3.3.2 Adhäsion ........................................................................................................................... 63 3.4 Transienter TRIP6-Knockdown mit verminderter zellulärer Migration................................. 64 3.5 Induzierbarer TRIP6-Knockdown ........................................................................................... 65 3.6 Hemmung der Klonogenität in Single-Cell-Kolonien ............................................................. 66 Inhaltsverzeichnis 3.7 4. Hemmung der Klonogenität unterschiedlicher EFT-Zelllinien .............................................. 67 Diskussion ............................................................................................................... 72 4.1 Einordnung der Ergebnisse.................................................................................................... 72 4.1.1 Funktionelle Ergebnisse .................................................................................................... 73 4.1.2 TRIP6 als Kotranskriptionsfaktor ...................................................................................... 77 4.1.3 TRIP6 und LPAR2 in EFT .................................................................................................... 79 4.2 Ausblick und Perspektiven .................................................................................................... 79 5. Zusammenfassung ................................................................................................... 83 6. Bibliografie .............................................................................................................. 84 7. Appendix ................................................................................................................. 97 7.1 Abbildungsverzeichnis ........................................................................................................... 97 7.2 Abkürzungsverzeichnis .......................................................................................................... 99 Danksagung Curriculum Vitae 1. Einleitung 1.1 Epidemiologische und biologische Aspekte der Tumoren der EwingSarkom-Familie Bösartige Knochen-assoziierte Tumoren stellen weniger als 0,5% aller bösartigen Tumorerkrankungen des Menschen. Im Kindesalter jedoch steigt die Bedeutung dieser Entität: 5% aller Malignome im Kindesalter sind Knochen-assoziierte Tumoren (Parkin et al., 1993). Das Gesamtrisiko an einer malignen Neoplasie zu erkranken beträgt in den ersten zwei Lebensdekaden 1:315 (Schottenfeld and Fraumeni, 2006). Die Ewing sarcoma family of tumors (ESFT) ist neben Osteosarkomen die häufigste Entität der primären, bösartigen Knochen-assoziierten Tumoren bei Kindern. Die jährliche Inzidenz bei Kindern unter 15 Jahren liegt bei etwa 3:1.000.000, das durchschnittliche Alter der Betroffenen bei 15 Jahren mit einer leichten Präferenz für männliche Patienten (6:5) (Jürgens and Dirksen, 2011). Kaukasier sind deutlich häufiger betroffen als Menschen aus Ostasien oder Afrika (Parkin et al., 1993). Der Anteil der Patienten über 15 Jahren ist bei männlichen Patienten mit 55% signifikant höher als bei weiblichen mit 45%; knapp 60% aller Diagnosen werden im 10. - 19. Lebensjahr gestellt, etwa 5% vor dem fünften und 10% nach dem 24. Lebensjahr (Hense et al., 1999). Die kumulative Inzidenz bis zum 15. Lebensjahr beträgt in Deutschland 46:1.000.000. Zur ESFT werden, neben dem typischen Ewing-Sarkom, auch atypische Ewing-Sarkome und maligne periphere primitive neuroektodermale Tumoren (pPNET) gezählt (Hense et al., 1999). Atypische Ewing-Sarkome zeichnen sich durch untypische Morphologie, Immunhistochemie und Klinik aus (Machado et al., 2011). Maligne pPNET werden als differenzierte Ewing-Sarkome betrachtet, manifestieren sich jedoch häufig in Weichteilgewebe (Suh et al., 2002). Im Gegensatz zu den zentralen primitiven neuroektodermalen Tumoren und den vom autonomen Nervensystem ausgehenden pPNET (auch als Neuroblastome bezeichnet) teilen sie die unten ausgeführte genetische Signatur der EFT (Honrado et al., 2014). Schließlich werden auch Askin-Tumoren der ESFT zugerechnet und als pPNET der Brustwand klassifiziert (Shrestha et al., 2011). Am häufigsten findet sich der Primarius im Beckenknochen (26%) sowie in Femur (20%), Tibia (10%), Fibula (8%) und Humerus (6%); weitere Primarien finden sich in den 1 1. Einleitung Knochen der Brustwand (16%), der Wirbelsäule (6%), den übrigen Knochen der Extremitäten (6%) und den Schädelknochen (2%) (Bernstein et al., 2006). So entstehen also mehr als die Hälfte aller EFT-Primarien im Axialskelett. Im Gegensatz zu Osteosarkomen, welche typischerweise an der Knochenmetaphyse auftreten, finden sich Ewing sarcoma family tumors (EFT) meist an der Knochendiaphyse. Die Lokalisation der Erstmanifestation scheint vom Alter des Patienten beeinflusst zu werden. So findet sich beispielsweise bei Patienten unter 5 Jahren der Primarius zu 18% im Becken Dieser Anteil steigt mit dem Alter an, bis er bei Patienten von 20 bis 24 Jahren 31% beträgt (Hense et al., 1999). Die Symptome eines lokalen Ewing-Sarkoms sind wenig charakteristisch: Etwa 60% der Patienten berichten über belastungsabhängige Schmerzen, jedoch nur etwa 20% über Schmerzen während der Nacht (Widhe and Widhe, 2000). Die Schmerzen werden teilweise einem kleineren Trauma zugeschrieben, das zur selben Zeit wie die Schmerzen auftritt. Bei etwa einem Drittel der Patienten lässt sich bereits bei der ersten Untersuchung eine Raumforderung tasten. Insgesamt scheint die Diagnose eines Ewing-Sarkoms schwieriger als die eines Osteosarkoms: Während beim Osteosarkom neun Wochen zwischen ersten Beschwerden und Diagnose liegen, sind es beim Ewing-Sarkom 19 Wochen (Widhe and Widhe, 2000). Laborchemisch können unspezifische Auffälligkeiten auftreten; hierzu gehören eine erhöhte Blutsenkungsgeschwindigkeit, eine Anämie sowie eine Leukozytose (Bernstein et al., 2006). Eine erhöhte Konzentration der Laktatdehydrogenase kann ebenfalls beobachtet werden, korreliert mit der Tumormasse und ist ein negativer prognostischer Marker. Eine Sicherung der Diagnose kann nur durch eine Biopsie erfolgen. Aufgrund ihrer Histologie in der Hämatoxylin-Eosin-Färbung wird die ESFT zu den small, round, blue cell tumors (SBRCT) gezählt. Die Tumorzellen stellen sich als undifferenzierte, runde Zellen mit nur spärlichem Zytoplasmaanteil dar. Durch diese rein morphologischen Kriterien werden die folgenden Malignome zusammengefasst: ESFT, Neuroblastome, Rhabdomyosarkome, kleinzellige Osteosarkome, mesenchymale Chondrosarkome, Non-Hodgkin-Lymphome, desmoplastische SRCT und undifferenzierte Synovialsarkome (Bovée and Hogendoorn, 2010). Um mikroskopisch zu einer Differentialdiagnose zu gelangen, werden immunhistochemische Färbungen genutzt. So lassen sich histologische Schnitte von EFT durch einen Antikörper gegen den Oberflächenmarker CD99 (CD99 antigen) diffus färben (Bernstein et al., 2006). Durch eine Immunhistologie mit den vier Antikörpern gegen CD99, Friend leukemia integration 1 2 1. Einleitung transcription factor (FLI1), HNK-1 sulfotransferase (HNK1) und Caveolin-1 (CAV1) kann ein Tumor der Ewing-Sarkom-Familie in 99% der Fälle diagnostiziert werden, unabhängig davon, ob ein typisches oder ein atypisches Ewing-Sarkom oder ein pPNET vorliegt (Llombart-Bosch et al., 2009). 97% aller EFT wurden in dieser Studie durch den CD99-Antikörper erkannt; vier CD99-negative Fälle wurden durch den CAV1-Antikörper erkannt, der nur 4% der EFT nicht erkannte (Llombart-Bosch et al., 2009). Eine weitere hochsensitive Methode in der histologischen Differentialdiagnostik der SBRCT ist die quantitative real time poly chain reaction (qRT-PCR)aus einem Nadelaspirat ex vivo, etwa aus dem Primarius (Gautam et al., 2010). Ebenfalls unter Anwendung der qRT-PCR kann eine Untersuchung des Knochenmarks und des peripheren Blutes auf das Vorliegen von EFT-typischen Transkripten erfolgen. Diese beiden Methoden führen in etwa 20% d. F. zu einem positiven Ergebnis, wodurch sich die Prognose deutlich verschlechtert (Schleiermacher et al., 2003). Interessant ist die Tatsache, dass EFT der distalen Extremitäten nur sehr selten zu Mikrometastasen oder zirkulierenden Tumorzellen führen. Im Jahr 1983 wurde erstmalig das Vorliegen einer spezifischen chromosomalen Translokation t(11;22)(q24;q12) in fünf Ewing-Sarkom-Zelllinien (Turc-Carel et al., 1983) beobachtet. Delattre et al. beobachteten 1992, dass in Ewing-Sarkomen durch diese Chromosomentranslokation t(11;22)(q24;q12) ein chimäres Transkript der beiden Gene Ewing sarcoma breaktpoint region 1 (EWSR1) und Friend leukemia integration 1 transcription factor (FLI1) generiert wird (Delattre et al., 1992). Das Fusionsprotein besteht aus dem Carboxyterminus (der DNA-bindenden Region) des zur E-twenty-six-Familie (ETS) von Transkriptionsfaktoren gehörenden Proteins FLI1. Der aminoterminale Anteil (also der die Transkription aktivierende Anteil) von FLI1 wird durch den aminoterminalen Anteil des RNAbindenden Proteins EWSR1 ersetzt (May et al., 1993) (Abbildung 1). Es handelt sich bei FLI1 um ein Mitglied einer der größten Familien von Transkriptionsfaktoren mit konservierter DNAbindender Sequenz, das neben Ewing-Sarkomen auch bei Virus-induzierten Leukämien eine zentrale ätiologische Rolle spielt (Rao et al., 1993). Das EWSR1-Gen ist neben seiner Rolle bei der Entstehung von Ewing-Sarkomen als Teil von weiteren EWS-Fusionsproteinen (EFPs) an der Entstehung mehrerer maligner Tumoren wie des desmoplastischen, kleinzelligen Tumors (EWS-WT1) und des angiomatoiden, fibrösen Histiozytoms (EWS-CREB1) beteiligt (Antonescu et al., 2007; Lee et al., 1997). 3 1. Einleitung Abbildung 1: Etwa 90% aller Tumoren der Ewing-Sarkom-Familie zeigen die chromosomale Translokation t(11;22)(q24;q12). Das Fusionsprodukt unter dem Promotor von EWS besteht aus dem aminoterminalen Ende des Gens EWSR1 und dem carboxyterminalen Anteil des Gens FLI1. TAD: transaktivierende Domäne, DBD: DNA-bindende Domäne. Während EWSR1 an etwa 98 % aller EFT beteiligt ist (Mackintosh et al., 2010), ist FLI1 in etwa 90% der Fälle als Fusionspartner involviert. In weiteren 5% der Fälle führt die Translokation t(21;22)(q22;q12) zu dem Fusionsprotein EWS-ERG und in jeweils weniger als 1% aller Fälle lassen sich die Translokationen t(7;22)(p22;q12), t(17;22)(q12;q12) und t(2;22)(q33;q12) mit den Fusionsproteinen EWS-ETV1, EWS-ETV4 und EWS-FEV nachweisen (Mackintosh et al., 2010). Diese Translokationen können nach Bruchstellen weiter klassifiziert werden. Zudem sind auch weitere seltene, für Ewing-Sarkome ursächliche Translokationen bekannt. Im Rahmen der Euro-E.W.I.N.G.99-Studie konnte entgegen früheren Beobachtungen kein Überlebensvorteil der häufigen Typ 1 EWS-FLI1-Translokation gegenüber den weniger häufigen Translokationen EWS-FLI1 Typ 2 und EWS-ERG nachgewiesen werden (Le Deley et al., 2010). Diese weitgehend einheitliche genetische Signatur der ESFT steht deutlich komplexeren genetischen Alterationen bei anderen Sarkomen, etwa dem Osteosarkom oder dem Leiomyosarkom, gegenüber (Forscher et al., 2014). Das Fusionsprotein EWS-FLI1 hat das Potential benigne Zellen zu malignen Zellen zu transformieren. Dies wurde 1993 durch May et al. gezeigt, als murine Fibroblasten (NIH-3T34 1. Einleitung Zellen) durch einen Vektor mit der Sequenz von EWS-FLI1 die vorher nicht vorhandene Fähigkeit zur Koloniebildung gewannen (May et al., 1993). In diesen Versuchen konnte weiterhin gezeigt werden, dass beide Teile des Fusionsproteins für diese Eigenschaft notwendig sind. Während genetisch modifizierte Mäuse mit globaler Expression von EWS-FLI1 nicht lebensfähig sind, besitzen Mäuse, welche EWS-FLI1 selektiv in mesenchymalen Zellen exprimieren, eine normale Lebenserwartung (Lin et al., 2008). Die Expression von EWS-FLI1 alleine führte zu einer Störung der Entwicklung der Gliedmaßen, nicht aber zu einer spontanen Tumorbildung; hierzu kam es erst durch zusätzliche Mutation von p53, wobei 70% Osteosarkome und 17% pleomorphe Weichteilsarkome auftraten (Lin et al., 2008). In hämatologischem Kontext führte die Expression von EWS-FLI1 in einem Mausmodell zu einer akuten myeloischen Leukämie (Torchia et al., 2007). Eine Komplexbildung des Proteins EWS-FLI1 mit hsRPB7, einer Untereinheit der RNAPolymerase II, und eine damit einhergehende verstärkte Wirkung von EWS-FLI1 als Transkriptionsfaktor wurde bereits 1998 nachgewiesen. Hierbei interagiert hsRPB7 mit dem aminoterminalen Ende von EWS und es kommt zu keiner Interaktion zwischen FLI1 und hsRPB7 (Petermann et al., 1998). Um seine volle Wirkung als aktivierender Transkriptionsfaktor zu entfalten ist eine gleichzeitige Bindung des chimären Proteins mit den Transcription factor AP-1 Proteinen im Promotorbereich nötig (Kim et al., 2006). Schließlich wurde auch eine Interaktion von EWS-FLI1 mit der RNA-Helikase A (RHA) beschrieben, wobei wiederum sowohl der Effekt von EWS-FLI1 auf die Transkription als auch die Fähigkeit zur Koloniebildung durch RHA gesteigert werden (Toretsky et al., 2006). Neben den hier beschriebenen Effekten auf transkriptioneller Ebene sind jedoch auch posttranskriptionelle Effekte von EWS-FLI1 zu berücksichtigen. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass EWSFLI1 zwar kaum einen Effekt auf das Transkript des in EFT wichtigen Markers CD99 hat, jedoch durch Unterdrückung der microRNA MiR-30a-5p die Translation der CD99-mRNA vermindert (Fabian et al., 2010; Franzetti et al., 2013). Damit ist der chimäre Transkriptionsfaktor EWS-FLI1 in der Lage, das Transkriptom als die Summe aller zellulär existenten Genprodukte, sowohl direkt durch Bindung an entsprechende Promotoren als auch indirekt durch posttranskriptionelle Effekte, zu verändern. Unter der Vielzahl an betroffenen Genprodukten scheinen Tyrosinkinasegekoppelte Rezeptoren wie etwa der Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) und der Wnt-Signalweg in besonderem Ausmaß betroffen und pathogenetisch relevant zu sein 5 1. Einleitung (Mackintosh et al., 2010; Navarro et al., 2010; Scotlandi et al., 1998). Der Tumorsuppressor Cellular tumor antigen p53 (p53) kann von EWS-FLI1 gebunden werden und kolokalisiert mit EWS-FLI1 im Zellkern (Li et al., 2010). Mechanistisch führt eine Deacetylierung von Lys-382 in p53 zum einen zu einer verminderten Bindung des Proteins an die entsprechenden Promotoren, zum anderen wird in Synergie mit der erhöhten MDM2-Expression der Abbau von p53 beschleunigt (Li et al., 2012). EWS-FLI1 verändert die Funktion von p53 auch indirekt dadurch, dass Mouse double minute 2 homolog (MDM2, ein p53-Antagonist) vermehrt und gleichzeitig cyclin-dependent kinase inhibitor 1 (p21, ein p53 Agonist) vermindert exprimiert wird. Umgekehrt kommt es beispielsweise in humanen Fibroblasten durch ektope Expression von EWS-FLI1 zur Apoptose, welche maßgeblich p53-abhängig ist (Lessnick et al., 2002). Bei der initialen Beschreibung 1921 ging James Ewing von einem endothelialen Ursprung des Ewing-Sarkoms aus (Ewing, 1921). Seither wird dieses Thema kontrovers diskutiert, wobei nach anfänglichen Hinweisen auf einen neuralen Ursprung (Cavazzana et al., 1987) die aktuelle Datenlage für einen mesenchymalen Ursprung spricht (Amaral et al., 2014). So etwa die Beobachtung, dass ein EWS-FLI1-Knockdown in EFT zu einem Expressionsprofil führt, welches mesenchymalen Stammzellen (MSC) ähnelt, und diese EFT-Zellen mit EWSFLI1-Knockdown in entsprechender Umgebung zu Adipozyten und Myozyten differenzieren können (Tirode et al., 2007). Allerdings sind MSC nach konstitutiver Transfektion mit einem EWS-FLI1-Konstrukt nicht in der Lage in immundefizienten Mäusen Tumoren zu formen (Riggi et al., 2008). Die von Tirode et al. beschriebene Veränderung des Expressionsprofiles hin zu einer Signatur der EFT war jedoch auch hier zu beobachten. Und auch die Tatsache, dass die Transfektion nicht zu Wachstumsstopp oder Zelltod führt, spricht für die MSC als Ursprung der EFT. Der zelluläre Ausgangsort der EFT ist deswegen so hochinteressant, weil damit die Frage, was neben der chromosomalen Translokation zur Entstehung eines EFT notwendig ist zu beantworten sein müsste. Sekundäre genetische Alterationen sind in EFT typischerweise eher selten und treten nur in etwa je 13% der Fälle auf. Dabei handelt es sich häufig um Deletionen im Genlocus cdkn2a (welcher den Tumorsuppressor p16 kodiert) oder Mutationen des Proteins p53, deren Vorliegen mit einer schlechten Prognose assoziiert ist (Huang et al., 2005). Kürzlich wurde außerdem gezeigt, dass ein erhöhter Prozentsatz an nicht-physiologischen Kopienzahlvariationen (CNV) ebenfalls mit einer schlechten Prognose einhergeht (Mackintosh et al., 2012). Zusätzlich konnte eine Anreicherung von CNV im Bereich 1q als klinisch relevant 6 1. Einleitung identifiziert werden: Insgesamt liegt diese Variation bei 31% aller Patienten mit EFT vor. Bei Patienten mit Rezidiv ließ sie sich zu 55%, bei Patienten ohne Rezidiv nur zu 12% nachweisen. Als zentraler Mediator der Effekte der CNV im Bereich 1q konnte das Protein Denticleless protein homolog (CDT2) identifiziert werden, welches als Element der Ubiquitinylierung nach CNV-Anreicherung auf 1q zu einer deutlichen Zunahme der Proliferationsrate führt (Mackintosh et al., 2012). Bei der Wahl der unterschiedlichen zur Verfügung stehenden Ewing-Sarkom-Systeme wie etwa 2D- oder 3D-Zellkulturen, Xenograft-Mäusen oder genetisch veränderten Mäusen muss berücksichtigt werden, inwieweit das genutzte System der Biologie von humanen EwingSarkomen ähnelt. Verglichen mit einer 2D-Kultur konnte in einer 3D-Kultur eine signifikant höhere Expression von IGF-1R, wie sie auch in EFT beobachtet wird (s. o.), nachgewiesen werden (Fong et al., 2013). Die Therapie der EFT basiert immer auf einer systemisch-medikamentösen Therapie und einer fakultativen lokalen Therapie (Chirurgie und/oder Radiotherapie). Bei alleiniger lokaler Therapie kommt es in ca. 85% d. F. zu einem Rezidiv, weshalb die Erkrankung an einem EFT auch ohne initiale Metastasierung als systemische Erkrankung gewertet wird. Bei unvollständiger chirurgischer Entfernung des Tumors und bei schlechtem histologischem Ansprechen auf die Chemotherapie konnte durch eine zusätzliche Radiotherapie der Anteil der Lokalrezidive gesenkt werden (Schuck et al., 2003). In einer späteren Studie konnte dieser Sachverhalt jedoch nicht verifiziert werden, sodass hier weitere Studien notwendig sind (Yock et al., 2006). Es gibt bisher keine kontrollierte Studie, die eine lokale Kontrolle durch Chirurgie mit einer lokalen Kontrolle durch Radiotherapie vergleicht. In einer deutschen Studie betrug das lokale Rezidivrisiko nach alleiniger Strahlentherapie 26,3%, verglichen mit 7,5% nach Chirurgie und Strahlentherapie (Bacci et al., 2003). Hierbei ist jedoch zu berücksichtigen, dass eine alleinige Strahlentherapie nur bei nicht-operablen Patienten, also einer Untergruppe mit einer schlechten Prognose, zum Einsatz kam. Für viele Jahre war die Kombination von Doxorubicin, Vincristin, Cyclophosphamid und Dactinomycin der Standard in der medikamentösen Behandlung von EFT. Den verschiedenen Formen der medikamentösen Tumortherapie ist gemein, dass nach einer (neoadjuvanten) Induktionsthrapie und einer lokalen Therapie meist eine Erhaltungstherapie folgt. In den Vereinigten Staaten besteht die Standardtherapie von nicht-metastasierten EFT seit einer Studie von Grier et al. aus alternierenden Zyklen von Doxorubicin, Vincristin, 7 1. Einleitung Cyclophosphamid, Dactinomycin und Ifosfamide oder Etoposide (Grier et al., 2003). In Europa hat sich im Rahmen der EWING-2008-Studie eine Kombination aus Vincristin, Ifosfamid, Doxorubicin und Etoposid als Induktionstherapie durchgesetzt. Nach lokaler Kontrolle erfolgt eine Risikostratifizierung: Bei Standardrisiko folgen mehrere Zyklen Vincristin, Actinomycin D und Etoposid (weibliche Patienten) bzw. Ifosfamid (männliche Patienten). Bei erhöhtem Risiko wird diese Standardtherapie zurzeit mit einer experimentellen Therapie verglichen, welche eine Hochdosis-Chemotherapie mit autologer Stammzelltransplantation umfasst. Die Wahrscheinlichkeit innerhalb von 20 Jahren nach Therapie eines EFT an einem Sekundärmalignom zu erkranken betrug in einer großem US-amerikanischen Metaanalyse 8% (Sultan et al., 2010). Dieses hohe Risiko unterstreicht die Notwendigkeit einer individuellen Bewertung und Therapieplanung jedes einzelnen Patienten mit EFT. Während im Bereich der konventionellen Chemotherapie noch ein gewisser Spielraum für Optimierung zu erwarten ist, wird es eine grundlegende Verbesserung der weiterhin infausten Prognose nur mit modernen und spezifischen Therapieansätzen geben (Fox et al., 2012; Navid et al., 2008). Aktuell wird die Beeinflussung einer Vielzahl von möglichen Zielstrukturen bereits in klinischen Studien getestet. Schon im Jahr 2004 wurde nachgewiesen, dass EWS-FLI1 durch Induktion von insulinlike growth factor binding protein 3 (IGFBP-3) und einer Aktivierung des insulin-like growth factor 1 (IGF-1) Signalweges stark pro-proliferativ und antiapoptotisch wirkt (Prieur et al., 2004). Klinische Studien mit unterschiedlichen Inhibitoren (Antikörpern) gegen insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) zeigten entgegen den Erwartungen nur bei einer Minderheit der Patienten eine Wirkung (Juergens et al., 2011). Ursache ist die kompensatorische Aktivierung alternativer Signalwege nach initialem Ansprechen auf die Inhibition des IGF1RSignalweges. 2011 konnte gezeigt werden, dass nach individualisierter, morphoproteomischer Analyse die zusätzliche Verabreichung von Rapamycin (eines Inhibitors des mammalian target of rapamycin (mTOR)-Signalweges) bei zwei Patienten, welche nur initial auf die IGF1RBlockade angesprochen hatten, zu einer deutlichen Reduktion der Tumormasse führte (Subbiah et al., 2011). Rapamycin wurde bereits 2003 als mögliches Therapeutikum in EFT beschrieben, da es zum einen die Expression von EWS-FLI1 und zum anderen die Proliferation von EFT-Zellen vermindert (Mateo-Lozano et al., 2003). Diese Beobachtung legt nahe, dass für EFT trotz der weitgehend einheitlichen Genetik individuelle Kombinationen von zielgerichteten Medikamenten notwendig sind. 8 1. Einleitung Poly(ADP-ribose)-Polymerase 1 (PARP1) ist ein Protein, welches eine integrale Rolle bei der Reparatur von DNA-Schäden spielt und als Transkriptionsfaktor agieren kann. 2012 wurden in zwei unabhängigen Arbeiten Hinweise für eine starke tumorablative Wirkung von PARP1-Inhibitoren in EFT in vitro beschrieben (Brenner et al., 2012; Garnett et al., 2012). Besonders ausgeprägt war dieser Effekt bei Kombination mit DNA-schädigenden Chemotherapeutika wie etwa dem Alkylans Temozolomid (Brenner et al., 2012). PARP1 wird von EWS-FLI1 induziert und verstärkt gleichzeitig dessen Wirkung; somit ist von einer PARP1Inhibition, neben einer erhöhten Sensitivität für DNA-Schädigung durch Chemo- oder Radiotherapie, auch eine verminderte Aktivität von EWS-FLI1 zu erwarten (Brenner et al., 2012). Vorläufige Ergebnisse von zwei klinischen Studien in der Phase 2 (NCT01583543, NCT01286987) scheinen die starke Wirkung der in vitro und in vivo Experimente nicht widerzuspiegeln. Auch wenn die endgültigen Ergebnisse dieser Studien abzuwarten bleiben, wurden bereits zwei vielversprechende Phase-I-Studien gestartet, die eine Kombination von Temolozemid mit den beiden PARP-Inhibitoren Olaparib und Niraparib bei Patienten mit EFT untersuchen (NCT01858168, NCT02044120) (Vormoor and Curtin, 2014). Eine Vielzahl von weiteren Ansätzen wurde in vitro und in vivo entwickelt und teilweise auch in klinischen Studien evaluiert. Allerdings haben alle bisherigen Studien zu keiner Veränderung der Therapieempfehlungen geführt. Zwei interessante Ansätze seien in der Folge stellvertretend erwähnt. Aufgrund der funktionell relevanten Interaktion zwischen EWS-FLI1 und RNA helicase A (RHA) scheint ein möglicher therapeutischer Ansatz durch Inhibierung dieser Interaktion das Tumorwachstum von EFT zu verlangsamen (Toretsky et al., 2006). Im Jahre 2009 wurde von Erkizan et al. ein Inhibitor beschrieben, der spezifisch genau diese Interaktion blockiert und das EFT-Wachstum in vivo hemmt (Erkizan et al., 2009). Klinische Studien stehen hier jedoch noch aus. Zwei Jahre später wurde durch ein Phagen-Display ein Oligopeptid entdeckt, welches als RHA-Inhibitor sowohl den Effekt von EWS-FLI1 auf die Transkription als auch Zellwachstum vermindert (Erkizan et al., 2011). Auch dieses Molekül wurde noch nicht in klinischem Kontext erprobt. Schließlich liegen auch Hinweise vor, die auf einen therapeutischen Nutzen von Bevacizumab, einem humanisierten monoklonalem Antikörper gegen vascular endothelial growth factor (VEGF) hinweisen (Wagner et al., 2013). Es bleibt zu hoffen, dass in naher Zukunft neue Moleküle Eingang in die Therapieempfehlungen finden werden und dass 9 1. Einleitung langfristig neue Methoden in Diagnostik und Therapie zu einer effizienten und individualisierten Behandlung von Patienten mit EFT integriert werden können. Das Themengebiet der Immuntherapie bei EFT soll hier noch vervollständigend erwähnt werden, denn unterschiedliche Ansätze wie etwa Tumorvakzinierung oder die Gabe von T-Zellen mit chimären T-Zell-Rezeptoren werden bereits klinisch erprobt. Aufgrund der fehlenden Relevanz für die vorliegende Arbeit wird an dieser Stelle nur auf eine Übersichtsarbeit hingewiesen (Rossig, 2014). 1.2 TRIP6 als multifunktionelles Protein Im Jahre 1995 beschrieben Lee et al. eine Reihe von Proteinen, für die eine Interaktion mit Thyroidhormrezeptoren nachgewiesen werden konnte (Lee et al., 1995). Diese Proteine wurden als thyroid receptor interacting proteins (TRIPs) bezeichnet und fortlaufend nummeriert. Ein Mitglied dieser heterogenen Proteinfamilie ist das Protein TRIP6, welches aufgrund seiner Aminosäuresequenz auch als zyxin-related protein 1 (ZRP-1) oder, basierend auf seiner Funktion in Bakterien, als Opa-interacting protein 1 (OIP1) bezeichnet wird (Murthy et al., 1999; Williams et al., 1998). TRIP6 ist ein ubiquitär exprimiertes Protein mit physiologisch maximaler Expression in zervikalen Ganglien, Rückenmark, Schilddrüse und Niere (Abbildung 2) (Su et al., 2004). 1998 wurde die Struktur des Proteins TRIP6 weiter aufgeklärt und es wurden drei C-terminale LIM-Domänen sowie eine prolinreiche N-terminale Region beschrieben (Yi and Beckerle, 1998). Der kodierende Genomabschnitt liegt auf Chromosom 7q22 und umfasst neun Exons, welche eine mRNA mit 1431 bp und ein Protein mit 476 Aminosäuren (50,6 kDa) kodieren (Murthy et al., 1999). Dass es sich bei TRIP6 um ein hochgradig konserviertes Protein handelt, lässt sich daran erkennen, dass das humane und das murine Protein eine zu 85% übereinstimmende Sequenz zeigen (Wang et al., 1999) . Der Aufbau des Proteins zeigt eine Vielzahl von funktionell relevanten Strukturen. So wurden mehrere Phosphorylierungsstellen (Tyr55, Ser92, Tyr123, Ser142 und Ser147) nachgewiesen, wobei bisher einzig für Tyr55 eine funktionelle Relevanz beschrieben wurde (Lai et al., 2005). Ein nuclear export signal (NES) von Leu100 bis Leu107 ermöglicht eine Translokation von TRIP6 aus dem Zellkern. Ebenfalls sind jeweils eine nuclear localization sequence (NLS) C-terminal und N-terminal bekannt, welche analog zum NES einen intranuklären Transport von TRIP6 ermöglichen (Wang and Gilmore, 2001; Wang et al., 1999). Eine Blockade von Exportin 1 oder 10 1. Einleitung eine Mutation des NES führen dementsprechend zu einer Akkumulation von TRIP6 im Zellkern (Wang and Gilmore, 2001). Abbildung 2: Expression von TRIP6 in unterschiedlichen Geweben. Öffentlich verfügbare Daten unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo; GDS596. In einer großen gewebespezifischen Expressionsstudie wurden pro humanem Gewebe je zwei Microarrays (Affymetrix HG-U133A) durchgeführt; die Mittelwerte mit Standardfehler sind abgebildet. Die rote gestrichelte Linie zeigt die mediane Expression an; die blaue gestrichelte Linie die dreifache mediane Expression. Diese strukturellen Elemente erklären die Fähigkeit von TRIP6 gleichzeitig Zellmembran-assoziierte und nukleäre Funktionen zu erfüllen. Nukleär beeinflusst TRIP6 mittels einer Transaktivierungsdomäne (TAD) von Aminosäure (AS) 72-120 die zelluläre Transkription, während drei LIM-Domänen und eine TDC-Domäne vielfältige Protein-ProteinInteraktionen ermöglichen (Willier et al., 2011). Der gesamte N-terminale Abschnitt aus LIMund TDC-Domänen wirkt gleichzeitig als zweite TAD (Abbildung 3). LIM-Domänen enthalten zwei benachbarte Zinkfinger, welche durch ein hydrophobes Dipeptid getrennt sind. Diese Struktur ist nach den drei Proteinen benannt, in welchen sie zuerst beschrieben wurde: Lin-11, Isl-1 und MEC-3. Die Superfamilie von Proteinen, welche LIM-Domänen enthalten, wird in 14 Klassen eingeteilt; eine dieser Klassen ist die ZyxinProteinfamilie, der wiederum TRIP6 zugerechnet wird. Neben TRIP6 werden der Zyxinfamilie Migfilin, WTIP (WT1-interacting protein), Ajuba, LIMD1 (Lim domain-containing protein 1), LPP (lipoma preferred partner) und Zyxin zugerechnet. LPP und Zyxin stehen TRIP6 mit zu 50% bzw. 35% identischen Sequenzen am nächsten. Hierbei weisen die konservierten LIM-Domänen die größte Übereinstimmung auf. Die drei LIM-Domänen sind für den Großteil der nachgewiesenen Protein-Protein-Interaktionen verantwortlich. 11 1. Einleitung Abbildung 3: Darstellung des TRIP6-kodierenden genomischen Abschnittes, der TRIP6 mRNA sowie der Struktur des Proteins TRIP6. Die Zahlen bezeichnen die nummerierten Aminosäuren; Tyrosin- und Serinphosphorylierungsstellen sind blau markiert. X bezeichnet die beiden Dimerisationsequenzen, Y bezeichnet das TDC-Motiv (eine PDZ-bindende Struktur), TAD bezeichnet eine transaktivatorische Domäne, NES bezeichnet das nuclear export signal (s. Text). Interaktionspartner von TRIP6 wurden, soweit bekannt, unter dem entsprechendem Proteinabschnitt notiert. Abkürzungen der Proteinnamen werden im Abkürzungsverzeichnis erläutert. Bindungspartner umfassen membrangebundene Rezeptoren wie LPAR2, Transkriptionsfaktoren wie NFκB und p65, bakterielle Proteine wie Opa und SfrH, Proteine der Aktinorganisation wie Supervillin und Endoglin, Kinasen wie c-Src und AMPK sowie Elemente der Telomerregulation wie POT1 und TRF1 (Lai et al., 2010; Sanz-Rodriguez et al., 2004; SolazFuster et al., 2006; Takizawa et al., 2006; Thornbrough and Worley, 2012; Williams et al., 1998; Worley et al., 2006; Xu et al., 2004). 12 1. Einleitung PDZ-Domänen wurden erstmals in den Proteinen post-synaptic density protein (PSD95), drosophila disc large tumor suppressor (Dlg1) und zonula occludens-1 protein (ZO-1) nachgewiesen, wodurch sich ihre Nomenklatur ergibt. Sie bestehen aus ca. 90 Aminosäuren und spielen eine zentrale Rolle bei der Organisation von Proteinkomplexen, etwa in Assoziation mit der Zellmembran (Ye and Zhang, 2013). Das N-terminale TDC-Motiv von TRIP6 besteht aus den Aminosäuren ELSATVTTDC und ist in der Lage PDZ-Domänen zu binden (Chastre et al., 2009). Diese Domäne ist in den hier interagierenden Proteine PTPN13, SCRIB, NHRF2 und MAGI-1b enthalten (s. u.). Die nukleäre Isoform nTRIP6 besteht aus den Aminosäuren 190 bis 476 von TRIP6: das NES ist demnach nicht enthalten, jedoch kann nTRIP6 über die N-terminale TAD als Transkriptionsfaktor seine Wirkung entfalten (Kassel et al., 2004). Zwar besteht eine gewisse funktionelle Redundanz zwischen den Mitgliedern der Zyxin-Proteinfamilie, allerdings gibt es durchaus distinkte Funktionen: So sind beispielsweise nur LIMD1, WTIP und Ajuba an der zytoplasmatischen microRNA-Prozessierung beteiligt (James et al., 2010; Willier et al., 2011). 1.2.1 Funktion von TRIP6 bei Migration und fokalen Kontakten Zellmigration und die Regulation von fokalen Kontakten werden von einer Vielzahl von Proteinen, wie den Mitgliedern der Zyxin-Proteinfamilie (Grunewald and Butt, 2008; Kadrmas and Beckerle, 2004) beeinflusst. Die Gegenwart von Endoglin, einem membrangebundenen Bestandteil des transforming growth factor β (TGF-β)-Rezeptorkomplexes, führt zu einer Rekrutierung von TRIP6 an Aktinfasern. So scheint TRIP6 in die TGF-β-induzierte Zytoskelettorganisation involviert zu sein, wobei diese Aktivität durch Endoglin reguliert wird (Barbara et al., 1999; Sanz-Rodriguez et al., 2004). In Abwesenheit von Endoglin findet sich TRIP6 wiederum an fokalen Kontakten (Sanz-Rodriguez et al., 2004). Supervillin beeinflusst die zelluläre Migration und die Regulation von fokalen Kontakten und ist ein Bindungspartner von TRIP6 (Takizawa et al., 2006); eine Überexpression von Supervillin führt zu einer durch TRIP6 reversiblen verminderten Adhäsion an Fibronektin. In Osteoklasten wurde eine positive Funktion von TRIP6 bei der Bildung der Resorptionslakune und der Resorption von Knochen nachgewiesen, zwei Prozesse, die auch maßgeblich durch die Funktion des Zytoskelettes beeinflusst werden (McMichael et al., 2010). Dieser Effekt 13 1. Einleitung beruht auf einer Interaktion mit Tropomyosin 4; LPA-Inhibitoren und TRIP6-Knockdown verhinderten diesen Effekt von TRIP6. Schließlich wurden auch für CasL/HEF1, einem Mitglied der p130cas Familie und membrane-associated guanylate kinase with inverted domain structure 1b (MAGI-1b) eine direkte Interaktion aufgezeigt. Beide Proteine sind in die Organisation von fokalen Kontakten involviert und orchestrieren nach extrazellulärem Stimulus die Signaltransduktion auf intrazelluläre Signalwege (Chastre et al., 2009; Yi et al., 2002). Der Einfluss von TRIP6 auf die zelluläre Migration wurde vielfach untersucht, jedoch liegen hier teils widersprüchliche Ergebnisse vor. Initial wurde gezeigt, dass eine Überexpression von TRIP6 in murinen 10T1/2 Embryonalzellen zu einer verminderten Migration führt (Yi and Beckerle, 1998). Im Jahr 2005 wurden diese Ergebnisse bestätigt, indem in zwei humanen Zelllinien (aus Bronchialkarzinom und Plattenepithelkarzinom) gezeigt wurde, dass es nach TRIP6-Knockdown einer Verdopplung der Zellmotilität kommt (Gur’ianova et al., 2005). Im Gegensatz dazu wurde in einer humanen Zervixkarzinom-Zelllinie gezeigt, dass TRIP6 essentiell für die Bildung von fokalen Kontakten und für zelluläre Migration ist (Bai et al., 2007). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Effekt von TRIP6 einerseits vom zellulären Kontext und andererseits von der basalen TRIP6-Konzentration abhängig ist. In Zellen mit hoher TRIP6-Konzentration könnte eine exogene Zufuhr dazu führen, dass die Funktion von Bindungspartnern beeinträchtigt wird, wie dies auch für Supervillin gezeigt werden konnte (Takizawa et al., 2006). In Zellen mit niedriger endogener TRIP6-Expression könnte ein zusätzlicher TRIP6-Knockdown die Funktion von fokalen Kontakten und damit die Migration negativ beeinflussen, während eine exogene Expression einen gegenteiligen Effekt hätte. Die Funktion von TRIP6 in der zellulären Motilität wird von einem mikrobiellen Pathogenitätsfaktor veranschaulicht: Phagozyten, welche von Salmonella typhimurium infiziert sind, weisen eine massiv gesteigerte Motilität auf (Worley et al., 2006). Ein bakteriell sezerniertes Protein (secreted effector protein SseI, srfH) kann TRIP6 binden und führt nur in Anwesenheit von TRIP6 zu einer erhöhten phagozytären Motilität (Worley et al., 2006). Später zeigten die Autoren, dass ein Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP) von sfrH zwar die Migration steigern kann, andere SNPs aber einen gegenteiligen Effekt besitzen können (Thornbrough and Worley, 2012). 14 1. Einleitung 1.2.2 Regulation der Aktivität von TRIP6 und Signaltransduktion Der Signalweg der Lysophosphatidsäure (LPA) ist der wichtigste, in welchem TRIP6 eine entscheidende Rolle spielt. LPA ist ein ubiquitär vorkommendes Phospholipid, das als extrazelluläres Signalmolekül über fünf bekannte LPA-Rezeptoren seine zelluläre Wirkung entfaltet (Choi et al., 2010). Neben seiner zentralen Rolle in neoplastischen Erkrankungen wie Ovarialkarzinomen, spielt das LPA-produzierende Enzym Autotaxin auch in anderen Erkrankungen wie dem akuten Koronarsyndrom oder in Lebererkrankungen eine Rolle (Dohi et al., 2012; Watanabe et al., 2007; Willier et al., 2013). Es konnte gezeigt werden, dass LPA eine Rekrutierung von TRIP6 an ein CXXC-Motiv des C-Terminus des LPA-Rezeptors 2 (LPAR2) bewirkt, wobei diese Interaktion durch die drei LIM-Domänen stattfindet (Xu et al., 2004). Außerdem kommt es zu einer direkten Bindung von TRIP6 mit weiteren Bestandteilen fokaler Kontakte wie focal adhesion kinase (FAK), Paxillin und c-Src (Abbildung 3). Eine Überexpression von TRIP6 in SKOV3-Ovarialkarzinomzellen führt zu einer verstärkten LPAinduzierten Migration (Xu et al., 2004). Hierbei wird die Aktivität von TRIP6 durch die Kinase c-Src und die Phosphatase PTPN-13 reguliert; die bereits oben erwähnte, wichtige Phosphorylierungsstelle an Y55 fungiert dabei als molekularer „Schalter“: eine Phosphorylierung erhöht und eine Dephosphorylierung vermindert den Effekt von TRIP6. Eine Phosphorylierung durch c-Src ermöglicht die Bindung von adaptor molecule crk (Crk); dadurch wird die LPA-induzierte Migration gesteigert (Lai et al., 2005). Eine Punktmutation von Tyr55 zu Phe55 beeinflusst zwar nicht die Lokalisation von TRIP6 an fokalen Kontakten und Aktinfasern, allerdings wird die Bindung an Crk aufgehoben und die LPAinduzierte Aktivierung von extracellular-signal regulated kinases (ERK) deutlich reduziert (Lai et al., 2005). Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 13 (PTPN13) interagiert direkt mit TRIP6 und dephosphoryliert phospho-Tyr55, wodurch die LPA-induzierte Migration vermindert wird (Lai et al., 2007). Wenn man weiter in Betracht zieht, dass c-Src möglicherweise durch PTPN13 reguliert wird, ergibt sich das Bild einer komplexen Regulation der Phosphorylierung von TRIP6 (Roskoski, 2005). Im Kontext dieser Arbeit ist die kontraintuitive Beobachtung interessant, dass PTPN13 in EFT ein direktes Ziel von EWS-FLI1 ist, dadurch in EFT überexprimiert wird und auch funktionell für deren Pathogenese relevant scheint (Abaan et al., 2005). 15 1. Einleitung Darüber hinaus führt die direkte Interaktion von TRIP6 mit LPAR2, einem G-Protein gekoppelten Rezeptor, zur Bildung eines ternären Komplexes aus LPAR2, TRIP6 und NHERF2 (Abbildung 4), welcher auch anteilig den antiapoptotischen Effekt von LPA mediiert (E et al., 2009). Ebenfalls antiapoptotische Signale werden durch Bindung von TRIP6 an den zytoplasmatischen Teil von Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 (CD95, bzw. „Todesrezeptor“) vermittelt; hierdurch wird die Bindung von Fas-associated death domain (FADD) an CD95 beeinträchtigt, wodurch eine Fas antigen ligand-induzierte Apoptose antagonisiert wird (Lai et al., 2010). Abbildung 4: Vereinfachte Darstellung wesentlicher Signalwege von TRIP6. Durch diverse ProteinProtein-Interaktionen und die Fähigkeit zwischen Zytoplasma und Nukleus zu wechseln kann TRIP6 extrazelluläre Stimuli via LPAR2, GR und NFκB zu einer veränderten Transkription integrieren. Durch Bildung eines ternären Komplexes mit LPAR2 und NHERF2 sowie durch Aktivierung von IL-1R kommt es zu einer Degradierung von IκBα und einer subsequenten Aktivierung von NFκB. Nukleär kann TRIP6 die Transkription von Jun/Fos oder NFκB Zielgenen oder die GR-gesteuerte Transrepression steigern. Darüber hinaus ist TRIP6 ein wichtiger Bestandteil von fokalen Kontakten und des Aktinzytoskeletts. 16 1. Einleitung 1.2.3 Transkriptionskontrolle und NFκB-Signalling TRIP6 interagiert auf mehreren Ebenen mit dem Transkriptionsfaktor nuclear factor kappa-B (NFκB), wodurch sich auch seine antiapoptotischen Effekte erklären lassen. NFκB liegt als heterotrimerer Proteinkomplex aus p50, p65 und NF-kappa-B inhibitor alpha (IκBα) im Zytoplasma vor. Durch Aktivierung kommt es zu einer Degradation von IκBα, und der entstandene heterodimere Proteinkomplex p50/p65 transloziert in den Nukleus, wo er als Transkriptionsfaktor antiapoptotische Gene induziert (Abbildung 4) (Bharti and Aggarwal, 2002). TRIP6 verstärkt die Aktivierung von NFκB indirekt durch Interaktion mit Receptorinteracting serine-threonine kinase 2 (RIP2) (Li et al., 2005). RIP2 fungiert als Signaltransduktor von extrazellulären Signalstoffen wie tumor necrosis factor (TNF), Interleukin-1 (IL-1), Toll-like receptor 2 (TLR2) zur NFκB Aktivierung. Darüber hinaus interagiert TRIP6 mit TNF receptorassociated factor 2, IL-1 receptor und Toll-like receptor 2, welche in einer gemeinsamen Endstrecke zu einer Aktivierung von NFκB führen. Folglich kommt es nach TRIP6-Knockdown zu einer verringerten Aktivierung von NFκB durch diese drei Signalmoleküle (Li et al., 2005). Des weiteren ist TRIP6 nach Aktivierung des „Todesrezeptors“ CD95 oder LPAR2Aktivierung in der Lage NFκB direkt zu binden und zu aktivieren, sodass es zu einer Translokation von NFκB/TRIP6 in den Nukleus kommt, wo TRIP6 als transkriptioneller Kofaktor von NFκB fungiert (Lai et al., 2010). Eine erst kürzlich charakterisierte Bindung von TRIP6 an cyclin-dependent kinase 6 (Cdk6), einem Chromatin-gebundenen Kofaktor für NFκB, unterstreicht die wichtige Funktion von TRIP6 für die Aktivität von NFκB (Handschick et al., 2014). Schließlich wird TRIP6 von der AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK) N-terminal phosphoryliert (Solaz-Fuster et al., 2006). In einem Luciferase-Reporter-Versuch konnte gezeigt werden, dass die Aktivität von NFκB durch TRIP6 etwa fünffach und durch nTRIP6 siebenfach gesteigert wird; durch Zugabe von einem Aktivator der AMPK kam es zu einer weiteren Steigerung (Solaz-Fuster et al., 2006). Darüber hinaus interagiert TRIP6 mit dem Glukokortikoidrezeptor (GR) und verstärkt dessen transrepressorische Wirkung (Kassel et al., 2004). Glukokortikoide haben einen antiinflammatorischen Effekt, welcher maßgeblich durch die Repression der Transkription von proinflammatorischen Genen wie IL-6 bedingt ist (Ray and Prefontaine, 1994). In Anwesenheit von Glukokortikoiden verstärkt TRIP6 demnach nicht die NFκB- bzw. die AP1-induzierte Transkription, sondern hemmt genau diese durch Interaktion mit dem GR (Kassel et al., 2004). 17 1. Einleitung Der zugrunde liegende molekulare Wirkmechanismus konnte 2014 aufgeklärt werden: So wurden zwei Bereiche der prä-LIM-Domäne (AS 175-187 und AS 253-265), welcher bisher keine spezifische Funktion zugeordnet werden konnte, als Regionen für die Homodimerisation von TRIP6 identifiziert (Diefenbacher et al., 2014). Das Homodimer ist nun in der Lage thyroid hormone receptor-associated protein 3 (THRAP3) zu binden. Hierdurch kann THRAP3 als regulatorischer Kofaktor zu Promotoren, an die AP-1 gebunden hat, rekrutiert werden. Dies führt zu einer Steigerung der AP-1 mediierten Transkription. Vor dem Hintergrund, dass alle drei LIM-Domänen jeweils für die Interaktion mit THRAP3 und AP-1 notwendig sind, scheint es folgerichtig, dass TRIP6 seiner Funktion als Adaptor nur in einem dimeren Zustand gerecht werden kann. GR ist ein kompetitiver Antagonist der THRAP3-Bindung und kann dadurch transrepressorisch auf den Transkriptionsfaktor AP-1 wirken (Diefenbacher et al., 2014). Jüngste Erkenntnisse belegen eine weitere Funktion des Kotranskriptionsfaktors TRIP6 in neuronalen Stammzellen (NSC): Neben einer erhöhten Expression von TRIP6 in dieser zellulären Entität wurde gezeigt, dass TRIP6 notwendig für die Erhaltung und Proliferation von NSC ist (Lai et al., 2014). Zusätzlich wirkt TRIP6 inhibitorisch auf die Differenzierung von NSC und aktiviert den Notch-Signalweg, welcher eine zentrale Rolle in der Erhaltung von NSC spielt (Giachino and Taylor, 2014). Weitere Transkriptionsfaktoren, die durch TRIP6 gebunden werden, umfassen einerseits den Thyroidrezeptor und den Retinoid-X-Rezeptor, wobei die Funktion dieser Interaktion nicht bekannt ist. 1.2.4 Funktion von TRIP6 in Malignomen TRIP6 ist in einer Vielzahl von Malignomen überexprimiert. So ist es etwa in kolorektalen Adenomen zweifach und in kolorektalen Karzinomen knapp fünffach überexprimiert (Chastre et al., 2009). Auch in Mesotheliomen ließ sich eine Überexpression von TRIP6 beobachten, wobei die Expression von TRIP6 mit dem positiven Prognosemarker Aquaporin 1 korrelierte (Jagirdar et al., 2013). Gleichfalls erhöhte TRIP6-Spiegel wurden in Nasopharynxkarzinomen beschrieben. Eine Phosphorylierung durch c-Src führt hier zu einer vermehrten zellulären Invasion und Migration (Fei et al., 2013). Überexpression von TRIP6 in Madin Darby canine kidney (MDCK) Zellen führt über eine Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB zu einer gesteigerten 18 1. Einleitung Invasivität und einer verringerten Zelladhäsion (Chastre et al., 2009). Auch in GlioblastomZelllinien wurde gezeigt, dass TRIP6 die Aktivität von NFκB verstärkt und dadurch die Invasivität der Zellen steigert (Lai et al., 2010). Gleichzeitig werden sowohl GlioblastomZelllinien als auch Ovarialkarzinom-Zelllinien durch TRIP6 weniger sensibel für CD95- oder Chemotherapie-induzierte Apoptose (E et al., 2009; Lai et al., 2010). Durch die Interaktion von TRIP6 mit MAGI-1b (s. o.) wird die Invasivität von MDCK Zellen massiv gesteigert (Chastre et al., 2009). Dies lässt sich durch die Funktion von MAGI-1b als Zell-Zell-Kontakt-Stabilisator und Gegenspieler zellulärer Invasivität sowie durch seine Interaktion mit β-Catenin, einem pro-invasiven Molekül und Proto-Onkogen, erklären (Dobrosotskaya and James, 2000; Rosenbluh et al., 2014). Mechanistisch konkurriert TRIP6 mit β-Catenin um die Bindung an MAGI-1b; eine Überexpression von TRIP6 führt so zu vermehrt freiem β-Catenin und dieses wirkt proinvasiv. Ähnlich wird die Funktion des Tumorsuppressors Protein scribble homolog (SCRIB) als Stabilisator von fokalen Kontakten und Protein der Zellpolarität durch TRIP6 kompromittiert (Petit et al., 2005). TRIP6 bindet SCRIB und das entstandene Heterodimer transloziert in den Nukleus; der Verlust des Strukturproteins SCRIB von der physiologischen Lokalisation wurde als wesentlicher Schritt der Karzinogenese charakterisiert (Zhan et al., 2008) LPA-induzierte Effekte spielen in Ovarialkarzinomen eine zentrale Rolle (Pua et al., 2009). Kürzlich konnte der Mechanismus, wie TRIP6 das LPA-Signalling verstärkt, weiter aufgeklärt werden. Nach Aktivierung von LPAR2 ermöglicht TRIP6 eine Interaktion zwischen RAC-alpha serine/threonine-protein kinase (Akt) und Cyclin-dependent kinase inhibitor 1B (p27Kip1), wodurch es zur Phosphorylierung eines spezifischen Threoninrests in p27Kip1 kommt (Lin et al., 2013). Wie bei der Funktion als Kotranskriptionsfaktor der AP-1-Proteine ist auch für diese Funktion eine Dimerisation notwendig, deren molekulare Grundlage erst 2014 von Diefenbacher et. al. aufgeklärt wurde (Diefenbacher et al., 2014; Lin et al., 2013). Diese spezifische Phosphorylierung führt zu einer zytosolischen Lokalisation von p27 Kip1 und dadurch zu einem Funktionsverlust dieses negativen Regulators der G1/S-Progression. Darüber hinaus führt TRIP6 zu einer verminderten Expression und einem erhöhten Umsatz von p27Kip1 (Lin et al., 2013). So bewirkt ein Knockdown von TRIP6 durch eine erhöhte nukleäre Konzentration von p27Kip1 eine verminderte Proliferation von Glioblastomzellen. LPP, aber nicht Zyxin, hat einen gleichartigen Effekt, wenn auch weniger stark ausgeprägt. 19 1. Einleitung Die Mehrheit aller malignen Neoplasien weisen genetische Veränderungen wie Kopienzahlvariation oder chromosomale Translokationen auf (Stephens et al., 2011). Eine korrekte Funktion von Telomeren ist Voraussetzung für genomische Stabilität; eine fehlerhafte Telomerfunktion führt zu einem erhöhten Malignomrisiko (Artandi and DePinho, 2010). Shelterin ist ein Proteinkomplex aus sechs Proteinen, welcher die Stabilität der Telomere gewährleistet (Karlseder, 2003). TRIP6 interagiert mit mehreren Mitgliedern dieses Komplexes (POT1, TRF2 und TIN2) und konnte in einer Chromatin-Immunpräzipitation auch im Bereich der Telomere nachgewiesen werden (Sheppard and Loayza, 2010). Weiterhin kam es durch Knockdown von TRIP6 zu einer erhöhten Zahl an telomere dysfunction induced foci (TIF), die eine Schädigung der Telomere anzeigen. Diese beiden Beobachtungen trafen auch für LPP, aber nicht für Zyxin zu. Dieser Mechanismus zeigt, dass nicht nur hohe zelluläre Spiegel von TRIP6 die Entstehung von Malignomen fördern können, sondern dass auch das Fehlen von TRIP6 zur Entstehung von Malignomen beitragen kann. So werden Deletionen im kodierenden Bereich von TRIP6 (7q22) zu den häufigsten Deletionen in hämatologischen Neoplasien gezählt (Johansson et al., 1993) und der Promotorbereich von TRIP6 ist in malignen Melanomen deutlich hypermethyliert (Conway et al., 2011). 1.3 TRIP6 als möglicher pathologischer Faktor in Ewing-Sarkomen Durch die vielfältigen Effekte von TRIP6 in physiologischem Kontext, aber vor allem auch in malignen Tumoren stellte sich die Frage nach einer möglichen Funktion von TRIP6 in EFT. Vorbereitend führten wir eine Analyse von öffentlich verfügbaren Daten aus mRNAMicroarray Experimenten durch, um eine mögliche Überexpression von TRIP6 in pädiatrischen Malignomen auf mRNA-Ebene zu beobachten. Hierzu verglichen wir die Expression von allen Mitgliedern der Zyxin-Proteinfamilie, zu welchen auch TRIP6 gezählt wird, aufgrund der partiellen funktionellen Redundanz innerhalb dieser Familie (Willier et al., 2011). Es zeigte sich, dass TRIP6 als einziges Mitglied der Zyxin-Proteinfamilie in einigen pädiatrischen Malignomen deutlich überexprimiert ist, vor allem in EFT (Abbildung 5). Durch Western Blot und Quantifizierung der mRNA mittels qRT-PCR wurde bestätigt, dass TRIP6 in humanen Ewing-Sarkom-Zelllinien überexprimiert wird. Diese Beobachtungen führten zu der Arbeitshypothese, dass TRIP6 eine funktionelle Bedeutung in der Pathogenese der ESFT besitzt. 20 1. Einleitung Abbildung 5: Relative Expression der Mitglieder der ZyxinProteinfamilie in pädiatrischen Malignomen. .Cell-Dateien wurden gleichzeitig mit RMAExpress normalisiert; die Fehlerbalken zeigen die 10.-90. Perzentile; GSM Datensets wurden von GEO Datasets of the NCBI und EBI array express bezogen; normal: normales Gewebe, ES: Ewing-Sarkom, RMS: Rhabdomyosarkom, MB: Medulloblastom, NB: Neuroblastom, RB: Retiononblastom, glioma: pädiatrisches Gliom, SS: Synovialsarkom, OS: Osteosarkom, c-ALL: B-Vorläufer akute lymphoblastische Leukämie. Um dieser Hypothese weiter nachzugehen, wurden Microarray-Experimente durchgeführt, welche das Transkriptom in EFT-Zellen vor und nach Knockdown von TRIP6 quantitativ verglichen. Diese Experimente wurden in einer Kollaboration in München durchgeführt (Grunewald et al., 2013). In der Folge wurden die erhaltenen Daten mit dem frei verfügbaren Programm Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) daraufhin untersucht, welche funktionellen Effekte durch einen TRIP6-Knockdown in EFT zu erwarten sind (s. Kapitel 3.1.1). Die als TRIP6-abhängig identifizierten Funktionen wurden daraufhin in vitro und in vivo mit gängigen Methoden der Zellkultur überprüft. Im Falle einer zentralen Funktion von TRIP6 in dieser Entität maligner Tumore würde das einerseits bedeuten mit TRIP6 einen neuen prognostischen Marker zu etablieren und andererseits die Möglichkeit eröffnen mit TRIP6 einen neuen, vielleicht entscheidenden Faktor für eine targeted therapy in der Therapie der EFT zu identifizieren. Auch jene Proteine, 21 1. Einleitung welche in das Signalnetzwerk von TRIP6 eingebunden sind, wären in Folge im Hinblick auf ihre Funktion in dieser Entität zu überprüfen. Einige Proteine sind bereits als mögliche pathogenetische Elemente in EFT identifiziert worden. So ist etwa das LPA-generierende Enzym Lipase member I sehr selektiv in EFT überexprimiert und für dieses Epitop spezifische zytotoxische T-Lymphozyten sind in der Lage EFT-Zellen in vitro zu lysieren (Mahlendorf and Staege, 2013). 22 2. Materialien und Methoden 2.1 Materialien 2.1.1 Zelllinien Bezeichnung Kulturmedium Hersteller A673 RPMI 1640, 10% American Type Culture Collection, Manassas, FBS, 1% P/S VA, USA RPMI 1640, 10% Kinderklinik München Schwabing, Technische FBS, 1% P/S Universität München RPMI 1640, 10% German Collection of Microorganisms and Cell FBS, 1% P/S Cultures, Braunschweig, Deutschland SB-KMS-KS1 SK-N-MC Die Zelllinie A673 wurde 1973 aus einem primären Tumor einer 15-jährigen Patientin generiert und in Folge als Tumorzelllinie etabliert. (Giard et al., 1973). Nachdem sie als in vitro Modell für humane Rhabdomysarkome und humane Ewing-Sarkome benutzt worden war, konnte sie 2003 durch genetische Analysen eindeutig als EFT-Zelllinie charakterisiert werden (Martı ́nezRamı ́rez et al., 2003). Die Zelllinie SK-N-MC wurde aus einem primären Tumor entnommen, der 1973 ursprünglich als Neuroblastom beschrieben wurde (Biedler et al., 1973). 1994 konnte gezeigt werden, dass die Zelllinie aufgrund des Vorliegens der EWS-FLI1-Translokation als PNET der Ewing-Sarkom-Familie zugerechnet werden muss. (Dunn et al., 1994). SB-KSM-KS1 ist eine EFT Zelllinie mit einer Typ1 EWS-FLI1 Translokation und wurde 2004 erstmals in einer Publikation erwähnt (damals unter dem Namen SBSR-AKS) (Richter et al., 2009); die Zellen wurden aus einem EFT einer 17-jährigen Patientin entnommen. 23 2. Materialien und Methoden 2.1.2 Lösungen, Medien und Seren für die Zellkultur Bezeichnung Hersteller Dulbecco‘s Phosphate Buffered GIBCO®, Life Technologies, Darmstadt, Deutschland Saline Fetales Bovines Serum GIBCO®, Life Technologies, Darmstadt, Deutschland Opti-MEM GIBCO®, Life Technologies, Darmstadt, Deutschland Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Deutschland RPMI1640+GlutaMAX GIBCO®, Life Technologies, Darmstadt, Deutschland Trypsin-EDTA Lösung Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Deutschland 2.1.3 Chemikalien und Reagenzien Bezeichnung Hersteller Acrylamidlösung (Rotiphorese® Gel 30) Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland Ammoniumperoxodisulfat (APS) Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Deutschland Aqua ad iniectabilia Delta Select, Pfullingen, Deutschland Borsäure Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Deutschland Bromphenolblau Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Deutschland Coumarinsäure Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Deutschland Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Deutschland Doxycyclin hyclate ≥ 98% Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Deutschland Entwicklerlösung (Diamino-Benzidin) DAKO, Hamburg, Deutschland Essigsäure 100% Roth, Karlsruhe, Deutschland Ethanol, unvergällt Merck, Darmstadt, Deutschland Fibrinogen Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Deutschland Fibronectin aus bovinem Plasma Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Deutschland Glycerin Rotipuran® min. 99,5% Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland Glycin Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Deutschland Kollagen Typ 1 Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Deutschland Kristallviolett Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Deutschland Luminol Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Deutschland 24 2. Materialien und Methoden (β-)Mercaptoethnol Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Deutschland Methanol Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Deutschland Milchpulver Blotting-Grade Blocker Bio-Rad Laboratories, München, Deutschland Mowiol 4-88 Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland Natriumchlorid Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Deutschland PageRuler™ Prestained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Paraformaldehyd (PFA) Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Deutschland Ponceau S Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland Power SYBR® Green PCR Master Mix Applied Biosystems, Foster City, CA , USA Sodiumdodecylsulfat (SDS) Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Deutschland Tetramethylethylendiamin (TEMED) Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Deutschland Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS) Merck, Darmstadt, Deutschland Tween SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Deutschland Wasserstoffperoxid (30 % in H20) Merck, Darmstadt, Deutschland Alle anderen Chemikalien und Reagenzien wurden von der Firma Sigma-Aldrich (Schnelldorf, Deutschland) bezogen. 2.1.4 Puffer und Lösungen Bezeichnung Zusammensetzung 0,1% TBS-Tween (TBS-T) 1 ml Tween 1 L 1 x TBS 10 x Tris Buffered Saline Puffer (TBS) 100 mM Tris 1,5 mM NaCl pH 7,5 10 x TRIS-Borat-EDTA-Puffer (TBE) 890 mM Tris 890 mM Borsäure 20 mM EDTA 10% APS 10% Ammoniumpersulfat in H₂0 25 2. Materialien und Methoden 3% TBS-T Milch 3 g Milchpulver 100 ml TBS-T ECL Reagenz A: 200 ml 0,1 M Tris/HCK pH 8,6 + 50 mg Luminol Reagenz B: 11 mg Coumarinsäure in 10 ml DMSO Reagenz C: 30% H₂O₂ Ansatz: 3 ml Reagenz A 300 µl Reagenz B 0,9 µl Reagenz C Elektrophoresepuffer Tris pH 8,9 30,5% (w/v) SDS 192 mM Glycin PFA Lösung 4% Paraformaldehyd in PBS Ponceau S 0,5% Ponceau S in 10% Essigsäure Sammelgelpuffer (Puffer A) 0,5 M Tris/Hcl pH 6,7 SDS-Stopp 200 mM Tris/Hcl pH 6,7 6% (w/v) SDS 15% (w/v) Glycerin 30 µg/ml Bromphenolblau; ad dH₂O Transferpuffer 25 mM Tris 192 mM Glycin 20% Methanol pH 10,0 Trenngelpuffer (Puffer B) 3 M Tris/HCl pH 8,9 26 2. Materialien und Methoden 2.1.5 2.1.5.1 Antikörper Primärantikörper Folgende Primärantikörper zur Detektion von humanen Proteinen wurden eingesetzt. Erkanntes Protein Typ, Verwendung Verdünnung Hersteller Aktin polyklonal, Kaninchen, 1:2000 Western Blot CD164 Santa Cruz CA, USA polyklonal, Kaninchen, 1:500 Western Blot CRYZ 1:200 Western Blot 1:500 Western Blot 1:500 Western Blot Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA monoklonal, Maus, 1:50 Becton Dickinson, Franklin Immunfluoreszenz 2.1.5.2 Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz CA, USA monoklonal, Maus, TRIP6 Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA polyklonal, Ziege, TRIP6 Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz CA, USA polyklonal, Kaninchen, Radixin Santa Cruz Biotechnology, Lakes NJ, USA Sekundärantikörper Folgende Sekundärantikörper wurden zur Erkennung der Primärantikörper eingesetzt. Bezeichnung Markierung Verdünnung Hersteller Goat-anti-rabbit IgG Meerrettich-Peroxidase 1:5000 Bio-Rad, München, Deutschland Goat-anti-mouse IgA Meerrettich-Peroxidase 1:5000 Bio-Rad, München, Deutschland Anti-mouse Cy 2 Carbocyanin 1:500 Dianova, Hamburg, Deutschland 27 2. 2.1.6 Materialien und Methoden Reaktionskits Bezeichnung Hersteller CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Promega, Madison, WI, USA Proliferation Assay CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay Promega, Madison, WI, USA HiPerFect Transfection Reagent Qiagen, Hilden, Deutschland NulceoSpin RNA II Macherey-Nagel, Düren, Deutschland High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Applied Biosystems, Foster City, CA , USA TRIPZ Inducible Lentiviral shRNA GE Healthcare, Chalfont St Giles, Großbrittanien 2.1.7 Ribonukleinsäurekonstrukte für RNA-Interferenz Die Zielsequenz von Hs_TRIP6_4 liegt in Exon 6 der TRIP6-mRNA und reicht von Position 1075 bis 1095 der TRIP6-mRNA (NCBI Reference Sequence NM_003302.2). Die Zielsequenz von Hs_TRIP6_5 liegt in Exon 8 der TRIP6-mRNA und reicht von Position 1404 bis 1424 der TRIP6-cDNA. Die Zielsequenz der TRIP6 shRNA liegt in Exon 6 und reicht von Position 1003 bis 1019 der TRIP-6-mRNA. Die Sequenz der Allstars Negative Control siRNA wird vom Hersteller nicht bekannt gegeben. Die Sequenzen der übrigen genutzten RNA-Konstrukte werden unten angegeben. Bezeichnung Sequenz in der Ziel-mRNA Hersteller AllStars Negative Nicht vorhanden Qiagen, Hilden, Deutschland CD164 siRNA 5‘-TAGCGCCCATCTCCAACGTAA-3‘ Qiagen, Hilden, Deutschland CRYZ siRNA 5‘-AAGAGTCATCATAGTAGGAAA-3‘ Qiagen, Hilden, Deutschland Hs_TRIP6_4 siRNA 5‘-TGGGCTGCTTTGTAtGTTCTA-3‘ Qiagen, Hilden, Deutschland Hs_TRIP6_5 siRNA 5‘-CAGGAGGAGACTGTGAGAATT-3‘ Qiagen, Hilden, Deutschland Radixin siRNA 5‘-AAGAAATAACCCAGAGACTCT-3‘ Qiagen, Hilden, Deutschland TRIP6 shRNA 5‘-TCTCCGCAGCCACCACACT-3‘ Thermo Fischer Scientific, Control siRNA Waltham MA, USA 28 2. 2.1.8 Materialien und Methoden Verbrauchsmaterialien Art Bezeichnung / Hersteller Aufsätze für Zellzähler Scepter™ Sensors 60 µm, Merck, Darmstadt, Deutschland Combitips 2,5 ml, 5 ml, 10 ml, 12,5 ml Eppendorf, Hamburg, Deutschland Deckgläschen 24 mm Hartenstein, Würzburg, Deutschland Desinfektionsmittel Sterillium® classic pure, Paul Hartmann AG, Heidenheim an der Brenz, Deutschland Terralin® liquid, Schülke&Mayr, Norderstedt, Deutschland Einfrierröhrchen 2 ml Nunc, Waltham, MA, USA Filme für Chemilumineszenz X-Ray Film Super RX; Fujifilm Europe, Düsseldorf, Deutschland Filter 0,2 µm / 0,45 µm Filtropur S, Sarstedt, Nürnbrecht, Deutschland Kulturplatten 10 cm, Cellstar® Kulturplatte, Greiner Bio-One, Kremsmünster, Österreich Multiwellplatten für Q-RT-PCR, 96-Well AB 1100 Thermo Fast 96 Detection Plate, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Multiwellplatten für Zellkultur, 48-Well, Greiner Bio-One, Kremsmünster, Österreich für Suspensionskultur Multiwellplatten für Zellkultur, 6-Well, Cellstar®, Greiner Bio-One, Kremsmünster, 12-Well, 24-Well, 48-Well Österreich Multiwellplatten für Zellkultur, 96-Well Lumitrac200, Greiner Bio-One, Kremsmünster, Österreich Multiwellplatten für Zellkultur, 96-Well Costar®, Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Deutschland Nitrocellulosemembran Whatman® PROTRAN®, Schleicher&Schuell Bioscience, Dassel, Deutschland Objektträger 76 x 26 mm R. Langenbrinck, Emmendingen, Deutschland Overhead Kopierfolie Soennecken, Overath, Deutschland 29 2. Materialien und Methoden Pipettenspitzen 10 µl, 20 µl, 200 µl, 1000 µl, Biosphere® Filter Tips, Sarstedt, Nürnbrecht, Deutschland Pipettenaufsätze 5 ml, 10 ml, 25 ml, Cellstar®, Greiner Bio-One, Kremsmünster, Österreich 2 ml, 5 ml, 10 ml, Glaspipetten, Paul Marienfeld, Lauda Königshofen, Deutschland Reaktionsgefäße 15 ml, 50 ml, Cellstar® Polypropylene Tubes, Greiner Bio-One, Kremsmünster, Österreich 1,5 ml, 2 ml, Eppendorf Safe-Lock Tubes, Eppendorf, Hamburg, Deutschland Sicherheitshandschuhe (Latex) BioWorld Medical, Meggen, Schweiz (Nitril) Hartenstein, Würzburg, Deutschland Transwelleinsätze Costar® Transwell Corning, Incorporated, Corning Incorporated, Coning NY, USA Whatman Nucleopore Track-Etch GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Membrane, Filtration Products Großbrittanien Zellkulturflaschen T25 und T75 Cellstar®, Greiner Bio-One, Kremsmünster, Österreich Zellschaber Cell Scraper, SPL Life Sciences, Gyeonggi-do, Korea 2.1.9 Geräte und Software Bezeichnung Hersteller Belichtungskammer Dr. Goos-Suprema, Heidelberg, Deutschland Brutschrank Model 3336, Labotect, Göttingen, Deutschland Elektrophoresekammer Elektrophoresekammer Noras, Würzburg, Deutschland Feinwaagen Universal und Typ1801, Sartorius, Göttingen, Deutschland Filmentwickler X-OMAT M 35, Kodak, Rochester, NY, USA Gelkammern Eigenbau Gerät zur Messung der DNA- Spectrophotometer Nanodrop 2000c, Thermo Fischer Konzentration Scientific, Waltham MA, USA 30 2. Materialien und Methoden Hilfsmittel zum Zählen von Neubauer Zählkammer improved 0,01 mm, Paul Zellen Marienfeld, Lauda Königshofen, Deutschland Scepter™ Handheld Automated Cell Counter, Merck, Darmstadt, Deutschland Kühlgeräte Gefrierschrank MediLine, Liebherr International, Biberach an der Riß, Deutschland Kryotank Chronos Biosafe® Cryomatik, Messer, Bad Soden am Taunus, Deutschland Kühlschrank Kirsch, Philiph Kirsch, Offenburg, Deutschland Magnetrührer RCTbasic, Ika® Werke, Staufen, Deutschland Mikroinjektionsspritzen Hamilton Bonaduz, Bonaduz, Schweiz Mikroskop Axiovert 200, Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland Axiovert 25, Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland pH-Meter PHM 82 Standard pH-Meter, Radiometer Analytical, Lyon, Frankreich Pipette (elektrisch) Accu-jet® pro, Brand, Wertheim, Deutschland Pipetten (manuell) 2 μl, 20 μl, 200 μl, 1000 μl, Pipete-Lite, Rainin Instrument, Oakland CA, USA 2 μl, 20 μl, 200 μl, 1000 μl, Eppendorf Research®/ Reference®, Eppendorf, Hamburg, Deutschland Multipipette Multipette®, Eppendorf, Hamburg, Deutschland Plate Reader Victor2 1420, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA ThermoMax Microplate Reader, molecular Devices, Biberach an der Riss, Deutschland Reaktionsgefäßständer Brand, Wertheim, Deutschland qRT-PCR Cycler Thermocycler GeneAmp® PCR System 2700, Applied Biosystems, Foster City, CA , USA qRT-PCR System 7500 Real Time PCR System, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA Scanner FARE Level 2, Canon, Tokio, Japan 31 2. Materialien und Methoden Schüttler Duomax1030 und Orbitalshaker Rotamax 120, Heidolph Instruments, Schwabach, Deutschland KS10, Edmund Bühler, Tübingen, Deutschland VibroShaker L-40, Hartenstein, Würzburg, Deutschland Software VisiView 2.0.3, Visitron Systems, Puchheim, Deutschland Adobe Photoshop 9.0.2, Adobe, München, Deutschland Microsoft Office 2010, Redmond WA, USA RMAExpress, Entwickler: Ben Bolstad, (Bolstad et al., 2003) Zotero 3.0.11.1, Entwickler: Center for History and New Media der George Mason University, USA GraphPad PRISM, GraphPad Software, La Jolla, CA, USA ImageJ 1.47, Entwickler: Wayne Rasband Gene Set Enrichtment Analysis Software, (Subramanian et al., 2005) Spannungsgeräte PowerPac 300, Bio-Rad Laboratories, München, Deutschland PowerPacHC, Bio-Rad Laboratories, München, Deutschland Sterile Werkbank SterilGard Class II Type A/B3, The Bakor Company, Sanford ME, USA Thermomixer Thermomixer comfort und Thermomixer compact, Eppendorf, Hamburg, Deutschland Transferkammer Trans-Blot™, Bio-Rad Laboratories, München, Deutschland Transwell Inserts 24 well Transwell Permeable Supports with 8 µm pores, Corning, NY, USA Vakuumpumpe Laboport Vakuumpumpe, KNF Neuberger, Freiburg, Deutschland Vortex Genie 2 Bender&Hobein, Zürich, Schweiz Wasserbad Köttermann, Uetze, Deutschland Zellzähler Scepter ™ 2.0, Merck, Darmstadt, Deutschland Zentrifugen 5415D, Eppendorf, Hamburg, Deutschland Universal 16A und 320R, Andreas Hettich, Tuttlingen, Deutschland 32 2. 2.2 2.2.1 Materialien und Methoden Methoden Übersicht über die durchgeführten Experimente Abbildung 6 zeigt eine graphische Zusammenfassung aller im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Experimente. Abbildung 6: Übersicht über die im Rahmen des Projektes durchgeführten Experimente. Grau unterlegte Experimente wurden außerhalb unseres Labors in Kollaborationen durchgeführt. 2.2.2 Zellkulturbedingungen Die Zelllinien A673, SK-N-MC und SB-KMS-KS1 sowie die Single-Cell-Kolonien wurden bis zu einer Zelldichte von 1 x 10⁶ Zellen / ml bei 37°C unter einer Atmosphäre mit 5% CO₂ inkubiert. Zelllinien und Single-Cell-Kolonien wurden in RPMI 1640 Medium kultiviert; das Medium wurde mit 10% hitzeinaktiviertem Kälberserum (FBS) und 1% Streptomycin / PenicillinMischung angereichert. Bei Verdacht auf mikrobielle Verunreinigung wurden die Zellen mit zugehöriger Kulturflasche verworfen. 33 2. Materialien und Methoden Die Zelllinien wurden nur bis zur 10. Passage genutzt, da bei höheren Passagen funktionelle Veränderungen zu beobachten waren. So zeigte sich beispielsweise eine verminderte Adhäsion der SK-N-MC-Zelllinie bei hohen Passagen. Vor Beginn eines neuen Experimentes wurden die Zellen gesplittet, d. h. die adhärenten Zellen einer Kulturflasche von nicht adhärenten Zellen oder Zelldetritus getrennt. Zunächst wurde mit 5 ml (T25) bzw. 10 ml (T75) PBS gewaschen. Dann wurden die Zellen mit 1 ml (T25) bzw. 3 ml (T75) Trypsin vom Flaschenboden gelöst, in 4 ml (T25) bzw. 7 ml (T75) RPMI 1640 Medium aufgenommen und anschließend 3 min bei 100 x g zentrifugiert. Hierbei wurde RPMI 1640 Medium genutzt, welches mit 10% FBS und 1% Streptomycin / PenicillinMischung versetzt war, um die Zellen vor einem protrahierten Trypsin-Verdau zu schützen. Nach Zentrifugation wurde der Überstand abgesaugt und das Zellpellet in 1 ml Medium resuspendiert. Je nach erwarteter Gesamtzellzahl wurde eine Verdünnung im Verhältnis 1:10 oder 1:20 hergestellt. Diese Verdünnung wurde genutzt, um die Zellen mit einem Instrument zur Zellzählung (Neubauerkammer oder Scepter™ 2.0) zu zählen. Gewünschte Zellzahlen konnten für Experimente entnommen werden. Um die Zellen aufzutauen, wurde das Einfrierröhrchen dem Stickstofftank entnommen und direkt in ein 37 °C Wasserbad gegeben. Sobald die Zellsuspension in dem Einfrierröhrchen flüssig war, wurde der gesamte Inhalt in ein mit 10 ml RPMI 1640 gefülltes 15 ml Reaktionsgefäß gegeben. Dieses Reaktionsgefäß wurde 3 min bei 100 x g zentrifugiert, der DMSO-haltige Überstand wurde entfernt und das Zellpellet nach Resuspension in eine Kulturflasche gegeben. Zum Wegfrieren wurden die Zellen einer Zellkulturflasche mit PBS gewaschen, mit Trypsin abgelöst und in einem 15 ml Reaktionsgefäß pelletiert. Das Pellet wurde in 6 ml Gefriermedium resuspendiert, wobei das Gefriermedium aus 3,4 ml RPMI, 2,0 ml FBS und 0,6 ml DMSO bestand. Je 1,5 ml wurden in ein Einfrierröhrchen gegeben und dieses wurde erst einen Tag bei -80°C aufbewahrt, bevor es im Stickstofftank eingelagert wurde. 2.2.3 Transiente Transfektion von Zellen Zu Beginn wurden zwei unterschiedliche Methoden der transienten Transfektion mit small interfering RNA (siRNA) verglichen: adhärente Methode und Solubilisierungsmethode. 34 2. Materialien und Methoden Nachdem sich die Solubilisierungsmethode als effizienter erwiesen hatte, wurde nur noch mit dieser Methode gearbeitet. 2.2.3.1 Adhärente Methode An Tag 1 wurden 1 x 10⁵ Zellen in den 6 Kulturvolumina einer 6-Well Platte ausgesät. An Tag 2 wurde der Transfektionsansatz vorbereit: 5 µl der 20 µM siRNAs wurden in 100 µl RPMI 1640 (ohne Zusätze) pipettiert und durch kurzes Schwenken vermischt. Dann wurde 5 µl HiPerfect in ebenfalls 100 µl RPMI (ohne Zusätze) pipettiert. Diese zweite Verdünnung wurde zu der siRNA Verdünnung gegeben, durch „Anschnippen“ wurde vorsichtig gemischt; dann ließ man diesen 210 µl Ansatz 15 min inkubieren. Währenddessen wurden die Zellen mit 1 ml RPMI 1640 (ohne Zusätze) gewaschen und dann 800 µl RPMI 1640 (ohne Zusätze) pro Well pipettiert. Nach 15 min wurden dann pro Well 200 µl des Transfektionsansatzes zugegeben. Nach 240 min wurde in jedes Well 1 ml RPMI 1640 Medium mit 20% FBS und 2% P/S pipettiert. 2.2.3.2 Solubilisierungsmethode Die Zellen wurden geerntet und gezählt, in entsprechende Zellkulturplatten gegeben und vorübergehend im Brutschrank gelagert. Dann wurden Opti-MEM Medium (ohne Zusatz), HiPerfect und die siRNAs bereitgestellt, wobei HiPerfect und siRNAs auf Eis gelagert wurden. Anschließend wurde in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß zuerst 500 µl Opti-MEM gegeben, dann 12,5 µl HiPerfect und 25 nmol (entspricht 1,2 µl der 20 µM siRNA-Suspension) der siRNA (nonsi, si_TRIP6_4 oder si_TRIP6_5). Diese Ansätze inkubierten 8 min bei Raumtemperatur, wobei alle zwei Minuten jeder Ansatz am Boden „angeschnippst“ wurde, um eine effektive Komplexbildung von Transfektionsreagenz und siRNA zu gewährleisten. Daraufhin wurden die Transfektionsansätze zu den jeweiligen Zellsuspensionen zugegeben. Unten sind die Details zu der transienten Transfektion in unterschiedlichen Volumina angegeben. Bezeichnung 6-well T25 RPMI 1640 ohne Zusatz 200 µl 500 µl HiPerfect 4 µl 12,5 µl siRNA (TRIP6_4, TRIP6_5, nonsi) 0,8 µl 1,25 µl Transfizierte Zellen 2 x 10⁵ 5 x 10⁵ 35 2. Materialien und Methoden 2.2.3.3 Vergleich beider Methoden der transienten Transfektion Um die Funktion von TRIP6 in EFT-Zellen zu beschreiben wurde die Expression des Proteins mit zwei unterschiedlichen siRNA-Konstrukten herunter reguliert, um mögliche off-target Effekte auszuschließen (Lader et al., 2007). Hierzu wurden vorbereitend für die funktionellen Tests zwei verschiedene Methoden der transienten Transfektion miteinander verglichen, die in den Kapiteln 2.2.3.1 und 2.2.3.2 bereits näher beschrieben wurden. Abbildung 7: Vergleich der adhärenten und der solubilisierten Methode der transienten Transfektion in A673-Zellen. Der linke Teil zeigt eine deutliche Reduzierung der TRIP6-Bande im Western Blot nach Transfektion mit si_TRIP6_5 nach solubilisierter Transfektion bei gleichbleibender ActinLadungskontrolle. Rechts zeigt sich ein schwacher Effekt bei der transienten Transfektion mit si_TRIP6_5 mit der adhärenten Methode. Es ergab sich ein deutlich effizienterer Knockdown mit der Solubilisierungsmethode; hier werden im Gegensatz zu der adhärenten Methode die Zellen transient transfiziert, direkt nachdem sie in einer definierten Konzentration in ein neues Kulturmedium gegeben wurden. Bei der adhärenten Methode werden bereits adhärente Zellen transient transfiziert. Mit dem Programm ImageJ wurde eine densitometrische Quantifizierung des Knockdowns durchgeführt. Dies ergab einen Knockdown von 12 % durch die adhärente Methode und einen Knockdown von 60% durch die Solubilisierungsmthode (Abbildung 7). Aufgrund dieser Ergebnisse wurde im weiteren Verlauf mit letzterer Methode weitergearbeitet. Um einen effektiven und effizienten Knockdown von TRIP6 in den folgenden funktionellen Experimenten zu erreichen, wurden unterschiedliche Konzentrationen der siRNA-Konstrukte in A673- und SK-N-MC-Zellen getestet. 36 2. Materialien und Methoden Abbildung 8: Optimierung der genutzten Reagenzien bei der transienten Transfektion. Nach mehrmaliger Testung wurde aufgrund des guten Knockdowns in der Folge je 0,8 µl siRNA zur Transfektion genutzt. Bei den Kombinationen beider siRNA-Konstrukte gibt die erste Zahl das Volumen von siRNA si_TRIP6_4 und die zweite das von si_TRIP6_5 an. Kombinationen beider siRNA-Konstrukte zeigten keinen Vorteil gegenüber der alleinigen Nutzung beider siRNA-Konstrukte, sodass in der Folge nicht mit Kombinationen gearbeitet wurde (Ausnahme: Kurzzeitproliferation). Abbildung 8 zeigt den Effekt der unterschiedlichen si-RNA-Konstrukte auf die Aktinmenge als Ladungskontrolle und die Proteinmenge von TRIP6. 2.2.4 Gewinnung von Single-Cell-Kolonien mit induzierbarem Knockdown von TRIP6 Neben der Arbeit mit transientem Knockdown wurde auch mit konstitutivem Knockdown gearbeitet. Zum einen sind mit konstitutiven Knockdown-Modell in vivo Experimente möglich, die mit transientem Knockdown nicht zu realisieren sind, wie etwa die Simulierung eines TRIP6-Knockdowns in einem Mausmodell. Zum anderen vereinfachen diese Zellen in vitro Experimente wie den Colony Forming Assay erheblich. Darüber hinaus wird eine weitere RNASequenz zum Knockdown genutzt; etwa bei den Colony Forming Assays wurden somit drei unterschiedliche RNA-Konstrukte zum TRIP6-Knockdown genutzt: neben den beiden siRNAs eben auch das shRNA-Konstrukt. Dies ermöglicht es Phänotypen auszuschließen, die offtarget Effekten einzelner RNA-Sequenzen anstatt dem TRIP6-Knockdown zuzuordnen sind. Nach Standardprotokoll des Herstellers wurden in unserem Labor A673-Zellen und SKN-MC-Zellen mit einem pTRIPZ-Vektor mit short hairpin (sh)-RNA-Konstrukten gegen zufällige 37 2. Materialien und Methoden RNA-Sequenzen (nonsi), gegen Kinesin-like protein KIF11 (EG5) als Positivkontrolle und gegen TRIP6 stabil transfiziert (s. TRIPZ Inducible Lentiviral shRNA, technical manual). Neben mehreren Selektionsmarkern, welche im Verlauf des Standardprotokolls die Selektion von erfolgreich stabil transfizierten Zellen erleichtern, gibt es noch zwei funktionell zentrale Elemente. Das tetracycline responsive element (TRE), ein durch Doxycyclin aktivierbarer Promotor, und ein roter Fluoreszensmarker (tRFP), welcher neben der klonierten sh-RNA ebenfalls unter der Kontrolle des TRE-Promotors liegt und erfolgreich transfizierte Zellen nach Induktion rot fluoreszieren lässt (Abbildung 9). Abbildung 9: Der zur stabilen Transfektion von A673 und SK-N-MC genutzte pTRIPZ-Vektor. Quelle: http://www.bmgc.umn.edu/prod/groups/ahc/@pub/@ahc/@bmgc/documents/asset/ptripz_techni cal_manual.pdf. Die erfolgreiche Transfektion wurde anhand von Western Blots nach Exposition gegenüber Doxycyclin festgestellt. Abbildung 10 zeigt, dass es bei Zugabe von Doxycyclin zu A673-Zellen, welche ein shTRIP6 Konstrukt enthalten, zu einer verminderten Expression von TRIP6 kommt. Außerdem wurde das Vorliegen des roten Fluoreszensmarkers (TurboRFP fluorescent reporter), welcher auf dem Vektor kodiert wird, als Indikator für eine erfolgreiche stabile Transfektion gewertet (Abbildung 11). Um Zellen gleicher Genetik zu erlangen, wurden Single-Cell-Kolonien gebildet. Dazu wurde die heterogene Zellpopulation stabil transfizierter Zellen soweit verdünnt, dass eine Konzentration von 7 Zellen / ml erreicht wurde. Von dieser Zellsuspension wurden je 100 µl in zwei 96-Well Platten gegeben; somit enthielt jedes Well dieser beiden Platten statistisch 0,7 Zellen. Bei der Herstellung der Zellverdünnungen wurde konditioniertes RPMI 1640 Medium verwendet. Dieses Medium wurde aus einer T75 Kulturflasche entnommen, nachdem es über Nacht mit A673-Zellen inkubiert worden war. 38 2. Materialien und Methoden Abbildung 10: Überprüfung einer erfolgreichen Transfektion von A673-Zellen durch Bewertung des Effektes von 1,0 µg/ml Doxycyclin auf die Expression von TRIP6. Die 96-Well Platten wurden beobachtet. Wells mit mehr als einem Zellklon wurden nicht weiter berücksichtigt, und nach 14 Tagen wurden auch Wells, in denen keine Kolonie sichtbar war, ausgeschlossen. Abbildung 11: Fluoreszenzaufnahme zur Überprüfung einer erfolgreichen Transfektion von A673Zellen mit sh(nonsi) und spezifischer shRNA gegen TRIP6. (sh(TRP6)). Durch Zugabe von 1 µg/ml Doxycyclin zu dem Kulturmedium wurde neben der Expression der shRNA (s. Kapitel 3) auch die Expression des roten Fluoreszensmarkers tRFP induziert. Pro Platte wurden zwischen 3 bis 8 Kolonien ausgewählt. Nachdem diese auf der 96Well Platte 200% konfluent gewachsen waren, wurden sie konsekutiv in größere Kulturbehälter überführt, bis zu T75 Kulturflaschen. Dann wurden die Zellpopulationen auf 39 2. Materialien und Methoden eine effektive stabile Transfektion überprüft. Dies geschah erstens mikroskopisch: Da der Vektor mit dem sh_TRIP6 Konstrukt auch ein Red Fluorescent Protein (RFP) enthält, kommt es drei Tage nach Zugabe von Doxycyclin wieder zur Expression dieses Markes (nicht gezeigt). Zweitens wurde ein TRIP6-Knockdown in den einzelnen Single-Cell-Kolonien mittels Western Blot nach drei Tagen Zellwachstum in Anwesenheit von Doxycyclin dokumentiert (s. Kapitel 3.5). Nach Effizienz des Knockdowns und phänotypischer Ähnlichkeit mit den Wildtyp (wt) Zelllinien wurde je ein Klon für weitere Arbeiten gewählt. Weiterhin wurde die notwendige Doxycyclin-Konzentration für einen effektiven Knockdown ermittelt (s. Kapitel 3.5). 2.2.5 Denaturierende Gelelektrophorese Alle Proben, die in einer Gelelektrophorese analysiert wurden, wurden in einen SDS-Stopp Puffer mit 10% Mercaptoethanol aufgenommen und für 5 min auf 95°C erhitzt. Daraufhin wurden die Proben bei - 20°C gelagert. Bezeichnung 3 cm Sammelgel 9 cm Trenngel Acrylamidlösung 350 µl 3,2 ml Puffer A pH 6,7 320 µl - Puffer B pH 8,9 - 1,25 ml SDS 10% 25 µl 100 µl Aqau dest. 1,8 ml 5,3 ml APS 10% 200 µl 200 µl TEMED 2,5 µl 7,5 µl Bei der SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese bestanden die Gele aus einem unteren Trenngel mit 10% Polyacrylamid und einem oberen Sammelgel mit 3% Polyacrylamid mit Taschen für die Proben. Oben ist die Zusammensetzung der Gele dargestellt. Nachdem die Proben in die Taschen des Sammelgels aufgetragen wurden, wurde für etwa 30 min eine Spannung von 60 V angelegt, bis die Lauffront das Trenngel erreicht hatte. Dann wurde für 60 min eine Spannung von 130 V angelegt, durch die sich die Proteine der Probe der Größe nach in dem Gel verteilten. Mindestens eine Tasche wurde mit dem PageRuler™ Prestained Protein Ladder beladen, um den aufgetrennten Proteinen auch eine 40 2. Materialien und Methoden Größe in Kilodalton zuordnen zu können. Abbildung 12 zeigt die einzelnen Banden dieses Markers. 2.2.6 Western Blot Nach der Gelelektrophorese sind die in einer Probe enthaltenen Proteine nach molekularer Masse im Gel aufgetrennt, wobei die kleinsten Proteine am weitesten von den Taschen entfernt sind. Die Proteine in diesem Gel wurden nun in einer Blotting Kammer durch einen wet blot 60 min bei 2 A auf eine Nitrocellulosemembran transferiert. Bei einem wet blot ist die Kammer vollständig mit Transferpuffer gefüllt. Direkt nach dem Transfer wurde durch eine Ponceau-Färbung der erfolgreiche Transfer bestätigt; durch die PonceauFärbung konnte auch überprüft werden, ob das Gel Abbildung 12: PageRuler™ gleichmäßig beladen worden war (Abbildung 13). Nach dieser Prestained Protein Ladder von Färbung wurde die Membran mit Wasser und TBS-T ThermoFisher Scientific gewaschen und für eine Stunde bei Raumtemperatur auf dem Transversalschüttler mit TBS-T mit 3% Milchpulver als Blockmedium inkubiert, wodurch noch freie Bindungsstellen der Nitrocellulosemembran gesättigt wurden. Dieser Schritt gewährleistet, dass in späteren Schritten die Antikörper nicht unspezifisch an die Nitrocellulosemembran binden. Danach wurde die Membran mit dem in TBS-T mit 3% Milchpulver verdünnten Primärantikörper über Nacht bei 4°C inkubiert. Anschließend wurde die Membran insgesamt 30 min mit TBS-T gewaschen, wobei das TBS-T zweimal gewechselt wurde. Der Nachweis des primären Antikörpers erfolgte über einen Meerrettich-Peroxidase gekoppelten sekundären Antikörper. Die Membran wurde mit dem in Blockmedium verdünnten Antikörper für 60 min bei Raumtemperatur auf dem Transversalschüttler inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt (30 min, zweimal TBS-T Wechsel) wurde die Membran auf eine Overhead Kopierfolie gelegt und 2 min vollständig mit ECL-Lösung benetzt. Zuletzt wurde ein Film aufgelegt, welcher Sekunden bis Minuten belichtet und dann entwickelt wurde. 41 2. Materialien und Methoden Abbildung 13: Ponceau-Färbung zur Ladungskontrolle bei Western Blot. Das gleichmäßige Intensitätsmuster der einzelnen Proben spricht für eine gleichmäßige Beladung. Das Vorhandensein der Banden bestätigt einen erfolgreichen Proteintransfer. 2.2.7 RNA Extraktion Jeweils 1 x 10⁶ A673 und SK-N-MC wt Zellen wurden in 10 cm Nunclon Schalen transient transfiziert. Nach ca. 48 h wurden die Zellen trypsiniert, pelletiert und dann nach dem Protokoll NucleoSpin RNA II der Firma Machery-Nagel die RNA aus den Zellen extrahiert. a) Pro Zellpellet werden 350 µl RA1 Puffer mit 3,5 µl Mercaptoethanol versetzt; dieses Volumen wird auf das Zellpellet pipettiert, und durch hoch- und herunterpipettieren wird das Zelllysat homogenisiert. b) Durch Zugabe von 350 µl 70%-igen Ethanols wird die Bindungseigenschaft der RNA an die Matrix der Säulen optimiert; 2 x 5 min vortexen. c) Das Volumen von 700 µl wird je in eine NucleoSpin RNA II Column gegeben; die Säulen werden 1 min bei 11000 g zentrifugiert, wodurch die Nukleinsäuren an die Membran binden. d) Um die Effektivität des folgenden DNA-Verdaus zu verbessern, werden pro Säule 350 µl Membrane Desalting Buffer (MDB) zugegeben, der die Zellmembran destabilisiert. e) Pro Säule werden 10 µl rekombinante DNAse mit 90 µl Reaction Buffer for DNAse versetzt und auf die Matrix der jeweiligen Säule pipettiert; um einen vollständigen Verdau zu gewährleisten, lässt man die Säulen 15 min bei RT inkubieren. f) In drei Waschschritten wird nach Zugabe von (1) 200 µl RA2 Puffer, (2) 600 µl RA3 Puffer und (3) 250 µl RA3 Puffer je 60 Sekunden, 60 Sekunden und 120 Sekunden bei 11000 g 42 2. Materialien und Methoden zentrifugiert; die Durchläufe werden verworfen und die Säulen nach dem letzten Waschschritt auf ein 1,5 ml Reaktionsgefäß gesetzt. g) Je nach erwarteter RNA Konzentration wird mit 30-60 µl RNAse freiem Wasser bei 11000 g zentrifugiert; das Eluat enthält die aufgereinigte RNA der Zelllysate. 2.2.8 cDNA-Synthese Die extrahierte RNA wurde mit Hilfe des High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit von Applied Biosystems in cDNA umgeschrieben. Die Konzentration der RNA-Eluate mit dem Gerät Spectrophotometer NANODROP 2000c gemessen und pro cDNA Ansatz wurden 1000 ng RNA pipettiert. a) Ein Mastermix aus je 2 µl 10X RT Buffer, 2 µl 10X RT Random Primers, 0,8 µl dNTP Mix, 1 µl RNAse Inhibitor und 1 µl Multiscribe Reverse Transcriptase pro Well wurden pipettiert; aus diesem Mastermix wurden je 6,8 µl in PCR Caps vorgelegt. Diese Schritte fanden alle auf Eis statt. b) Bei bekannter RNA-Konzentration wurde dem RNA-Eluat ein Volumen mit 100 ng RNA entnommen; dieses Volumen wurde mit RNAse freiem Wasser auf 20 µl aufgefüllt. c) Die cDNA Synthese wurde in einem Thermocycler GeneAmp® PCR System 2700 durchgeführt; folgende Programmierung wurde gewählt: 1. 10 min bei 25 °C, 2. 120 min bei 37 °C, 3. Standby bei 10 °C. Nach dem letzten Schritt enthalten die Caps die aus der RNA gewonnene cDNA. 2.2.9 Quantitative Real-Time-Polymerase-Kettenreaktion Die erhaltene cDNA wurde mit dem Gerät 7500 Real Time PCR System von Applied Biosystems quantifiziert. Auf einer 96-Well Platte werden pro Well 10 µl Power Syber Green PCR Master Mix, 1 µl Primer Mix und 9 µl der mit 180 µl RNAse freiem Wasser auf 200 µl 1:10 verdünnten cDNA pipettiert. Folgendes Programm wurde eingestellt: 40 Zyklen: (1) 50 °C, 2 min, (2) 95 °C, 10 min, (3) 95 °C, 15 Sekunden, (4) 60 °C, 1 min. Die Ergebnisse wurden als .txt Datei in Microsoft Excel eingelesen; als Referenztranskript wurde Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) genutzt. Die weitere Prozessierung der Daten erfolgte mittels statistischer Standardmethoden in Microsoft Excel. 43 2. Materialien und Methoden 2.2.10 Immunfluoreszenz Um die Lokalisation von TRIP6 in EFT-Zelllinien zu beurteilen, wurden mit einem hierfür geeigneten Antikörper gegen TRIP6 Immunfluoreszenz-Experimente durchgeführt. Hierzu wurden ein Tag vor Fixierung der Zellen 5 x 104 A673 wt Zellen in 2 ml Medium in ein Well einer 6-Well Multiwellplatte gebracht; in diesem Well befanden sich drei sterilisierte Deckgläschen, auf denen die Zellen über Nacht anwuchsen. Dann wurde das Medium abgesaugt, einmal mit 1 ml PBS gewaschen, 10 Minuten mit 4% PFA-Lösung auf Eis fixiert, 5 x mit 1 ml PBS gewaschen. Weiter wurde das verbleibende PFA mit 50mM NH4Cl für 10 Minuten blockiert, es folgte ein weiterer Waschschritt mit PBS, dann wurde die Membran mit 0,1% Triton-X in PBS für 10 Minuten permeabilisiert. Nun folgte die Zugabe des Primärantikörpers gegen TRIP6, wobei eine Verdünnung von 1:50 gewählt wurde. Daraufhin folgte eine Inkubation für 3 Stunden bei RT. Danach wurde Cy3 anti-mouse Antikörper in einer Verdünnung von 1:500 in 10 % goat serum/ 0,1 % TRITON-X in PBS hinzugegeben. Daraufhin wurden die Plättchen 30 Minuten bei RT abgedunkelt inkubiert. Abschließend folgte erneut dreimaliges Waschen mit PBS, dann wurden die Deckgläschen auf einen mit einem Tropfen Mowiol 4-88 bedeckten und beschrifteten Objektträger gedrückt, wobei die Zellen zwischen Objektträger und Deckgläschen zu liegen kamen. 2.2.11 Proliferationsassay Um eine mögliche Beeinflussung der Proliferation durch TRIP6 zu beurteilen, wurden Proliferationsassays mit und ohne TRIP6-Knockdown durchgeführt. Hierzu wurden A673 wt und SK-N-MC wt Zellen transient transfiziert und dann nach folgendem Schema in eine 48Well Multiwellplatte pipettiert, wobei die Reihen A-F jeweils 8 x dieselben Proben enthalten. Pro Well wurden 100 µl einer Zellsuspension mit einer Konzentration von 3 x 10⁴ Zellen pro Milliliter (A673) bzw. 6 x 10⁴ Zellen pro Milliliter (SK-N-MC) ausgesät, da während der Experimente beobachtet worden war, dass SK-N-MC-Zellen langsamer proliferieren. Die Reihen enthielten folgende drei Kontrollen: (1) Mock Control: keine Transfektion, (2) HiPerfect Control: nur Zugabe von HiPerfect und (3) Nonsi Control: Transfektion mit nonsiRNA. Diese wurden den drei Proben mit TRIP6-Knockdown gegenübergestellt: (4) Transfektion mit si_TRIP6_4, (5) Transfektion mit si_TRIP6_5 und (6) Gemisch beider si_TRIP6-RNAs. 44 2. Materialien und Methoden Nach etwa 60 h begann die Auswertung der Proliferation. Hierzu wurden zuerst die beiden Lösungen des CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay im Verhältnis 1:20 versetzt. So wurden 2 ml der MTS Lösung mit 100 µl der PMS Lösung vermischt. Dann wurden je 40 µl des MTS-PMS Gemisches in die ersten fünf Wells der Reihen A-F pipettiert. Nach 240 min im Brutschrank wurden die Volumina der einzelnen Wells (die ersten fünf Spalten) in eine 96-Well Platte transferiert und die Absorption bei 490 nm in einem ELISA Reader bestimmt. Da die Absorption linear mit der Zellzahl steigt, kann durch die Absorption auf die Zellzahl in einem Well rückgeschlossen werden. Die letzten drei Spalten werden in SDS-Stopp + 10% Mercaptoethanol aufgenommen, um die Menge des vorhandenen TRIP6 zu dokumentieren. 2.2.12 2.2.12.1 Adhäsionsassay Kristallviolett-basierte Methode Zu Beginn wurden 5 x 10⁵ Zellen in einer T25 Kulturflasche transient transfiziert. Danach wurden die Zellen nach etwa 60 h geerntet und gezählt. 48-Well-Multiwellplatten wurden erst mit Fibrinogen beschichtet und dann mit BSA geblockt. Nun wurden pro Well 200 µl Zellsuspension mit 4 x 10⁴ (A673) bzw. 8 x 10⁴ Zellen pipettiert. Nachdem etwa 50% der Zellen am Boden der Wells adhärent angewachsen waren (A673: 3-5 h, SK-N-MC: 10-15 h, mikroskopische Kontrolle vor Versuchsauswertung) wurde der Versuch ausgewertet. Hierzu wurde das Medium mit den nicht-adhärenten Zellen entfernt, 2 x vorsichtig mit 200 µl PBS gewaschen und schließlich die 48-Well Platte auf Eis gelegt; pro Well wurden 200 µl einer 40% PFA Fixierlösung zugegeben. Nach 10 min wurde die PFA-Lösung entfernt; die nun fixierten Zellen wurden 2 x mit je 200 µl PBS gewaschen. Dann wurden für 3 min 150 µl einer 1% Kristallviolettlösung zugegeben. Daraufhin wurde jedes Well 3 x mit 200 µl PBS gewaschen. Schließlich wurden 200 µl 100% Essigsäure zugegeben; nach fünf Minuten wurden aus jedem Well 150 µl entnommen und in eine 96-Well Multiwellplatte überführt. Zwecks Auswertung wurde am Ende die Absorption bei 595 nm bestimmt, wobei diese Absorption linear von der Menge des gebundenen Kristallvioletts und damit von der Anzahl der adhärenten Zellen zur Zeit des Versuchsendes abhängt. Kristallviolett ist ein Triphenylmethanfarbstoff mit fungozider Wirkung, der unter anderem Hauptbestandteil der bakteriellen Gram-Färbung ist. 45 2. Materialien und Methoden 2.2.12.2 CellTiter-Glo® basierte Methode Da die Kristallviolett-basierte Methode den Nachteil hatte, große Standardfehler zu generieren, wurde eine zweite Methode durchgeführt, um die zelluläre Adhäsion zu messen. Statt einer Absorption wird hier eine Lumineszenz gemessen; nach Zugabe der CellTiter-Glo®Reagenzien ist diese proportional zur Menge des zellulären ATP, eines Indikators metabolisch aktiver Zellen. Zellzahl und Adhäsionszeit entsprechen Kapitel 2.2.12.1. Abbildung 14: Schema des Vorversuches bei den Adhäsionsassays. Es wurde bestimmt, welche der drei Beschichtungen den Zellen die besten Bedingungen zur Adhäsion bietet. Hierbei wurde keine Beschichtung (N) mit Fibronektinbeschichtung (F) und Kollagenbeschichtung (C) verglichen. 500 450 relative Adhäsion 400 350 300 250 A673 wt 200 SK-N-MC wt 150 100 50 0 nicht beschichtet Kollagen-1-beschichtet Fibronektin-beschichtet Abbildung 15: Relative Adhäsion von wt A673- und SK-N-MC-Zellen. Der Anteil adhärenter Zellen in nicht-beschichteten Wells einer 48-Well Platte wird dem Wert «100» zugeordnet. Es zeigte sich eine gesteigerte Adhäsion beider Zellen vor allem nach Beschichtung mit Fibronektin. 46 2. Materialien und Methoden Es wurden 48-Well Multiwellplatten für die Suspensionskultur genutzt; die Wells dieser Platten wurden entweder nicht beschichtet oder mit Kollagen 1 bzw. Fibronektin beschichtet. Um zu entscheiden, ob die Versuche mit Kollagen oder Fibronektin durchgeführt werden sollten, wurden Vorversuche mit nicht-transfizierten Zellen nach dem Schema von Abbildung 14 gemacht. Nachdem sich die beste Adhäsion mit Fibronektin-Beschichtung gezeigt hatte, wurde bei den Experimenten mit dieser Beschichtung gearbeitet (Abbildung 15). In jedes Well wurden 100 µl mit der entsprechenden Zellzahl pipettiert nach Schema pipettiert (Abbildung 16). Nach Ablauf der Adhäsionszeit wurden die ersten fünf Spalten einer Reihe zweimal mit 200 µl PBS gewaschen und schließlich wieder 100 µl RPMI 1640 zugegeben. Abbildung 16: Schema eines Adhäsionsassays mit der CellTiterGlo® Methode. Nun wurde dem CellTiter-Glo® Substrat der CellTiter-Glo® Puffer zugegeben und 100 µl dieses Gemisches in jedes Well gegeben. Die 48-Well Platte wird 2 min auf einen Orbitalschüttler gestellt, um die Zelllyse zu induzieren. Danach wurden die 200 µl jedes Wells in eine nicht-transparente 96-Well-Platte (Lumitrac 200) gegeben und die Lumineszenz der einzelnen Wells mit einem Plate Reader analysiert. Die letzten drei Wells jeder Reihe wurden zur Quantifizierung der gesamten Zellen pro Well genutzt. Der Quotient aus adhärenten Zellen in den ersten fünf Wells und der gesamten Zellzahl in den letzten drei Wells wurde als relative Adhäsion gewertet. 47 2. Materialien und Methoden 2.2.13 Migrationsassay 2.2.13.1 Migrationsassay mit wieder verwertbarem Material Zwei Tage vor Beginn des Versuches wurden A673- und SK-N-MC-Zellen in T25 Zellkulturflaschen transient transfiziert. Hierbei werden 5 x 105 Zellen pro T25 Flasche mit 600 µl Transfektionsreagenz (inklusive 12 µl HiPerfect und 1,2 µl siRNA) inkubiert. Abbildung 17: Aufgeschraubte, wiederverwendbare Transwell-Kammer. Die Dichtung ist auf dem unteren Modul zu sehen; auf der Dichtung kommt die Filtermembran mit der beschichteten Fläche nach unten zu liegen. In die Wells der Grundplatte wird eine chemoattraktive Lösung pipettiert. Ein Tag vor Beginn des Versuches wird eine Porenmembran auf eine mit 15 ml Fibronektin-Lösung (5 µg / ml) gefüllte Petrischale gelegt und dort 30-60 min inkubiert; danach wird die Porenmembran luftgetrocknet und bis zum Versuch bei RT gelagert. Ebenfalls einen Tag vor Versuchsbeginn wird die wiederverwendbare Kammer bei 37°C gelagert. Am Versuchstag werden 20 ml Basalmedium in eine Petrischale pipettiert und 1 h zum Entgasen bei 37°C inkubiert. Auf diesem entgasten Medium wird jetzt die Membran zwecks Hydrierung für 10 min gelagert. 48 2. Materialien und Methoden Abbildung 18: Zusammengeschraubte, wiederverwendbare Transwellkammer. Die Zellsuspensionen werden in die Wells der Deckplatte und damit auf die Porenmembran pipettiert. Unterdessen werden von den Kontroll-Zellen und den Zellen mit TRIP6-Knockdown, Zellsuspensionen mit definierter Zellkonzentration erstellt: 3 x 10 5 Zellen in 500 µl. Nun werden 28,5 µl RPMI Medium mit einem Zusatz von 25 µg hEGF pro 100 µl in den unteren Teil der wiederverwendbaren Transwell-Kammer-Vorrichtung gegeben. Dann wird die hydrierte Membran auf die 48 gefüllten Wells gelegt (wobei die beschichtete Seite nach unten zu liegen kommt) und auf diese eine Dichtung, die das Auslaufen von Flüssigkeit verhindern soll. Schließlich wird der obere Teil der Transwell-Kammer auf die Membran geschraubt. Nun werden 52 µl der Zellsuspension pro Well zugegeben, was ca. 1,5 x 10 5 Zellen entspricht. Diese Vorrichtung wird nun für 3-5 Stunden im Brutschrank bei 37°C inkubiert (Abbildungen 17 und 18). Nach Ablauf dieser Zeit wird der Apparat auseinander gebaut, die Membran wird auf der nach unten liegenden Seite mit Kristallviolett gefärbt, während die Oberseite mit einem Wattetupfer gesäubert wird. Somit werden die Zellen, welche die Porenmembran durchwandert haben, gefärbt dargestellt, während die Zellen, welche auf der Oberseite angewachsen sind, entfernt werden. Leider ergaben sich bei der Auswertung Probleme, sodass in der Folge die Versuche zur Migration mit einem Einwegsystem wiederholt wurden (s. Kapitel 2.2.11.2). Vor allem die Differenzierung zwischen Zellen, Luftblasen und Kristallviolett außerhalb von Zellen machten es unmöglich, valider Aussagen zu treffen. 49 2. Materialien und Methoden 2.2.13.2 Migrationsassay mit Einwegmaterial Die beiden Zelllinien A673 und SK-N-MC wurden transient transfiziert und in T25 Flaschen ausgesät. Nach 48 h wurde das Medium abgesaugt, die adhärenten Zellen werden mit PBS gewaschen und es wird RPMI 1640 mit 1% Penicillin/Streptomycin als Hungermedium zugegeben. Nach 24 Stunden werden die Zellen geerntet und gezählt. Um eine unbeeinträchtigte Migration zu gewährleisten, werden die Zellen nur kurz mit Trypsin bedeckt, dieses dann aber sofort abgesaugt. Dann werden die Zellen in RPMI 1640 Hungermedium aufgenommen, pelletiert und gezählt. Die Transwell-Inserts für 24-well Platten wurden mit 5 µg / ml Kollagenlösung beschichtet; nun werden 5 x 10⁴ Zellen in 500 µl pro Well auf den Transwell-Insert pipettiert und die 24-Well Platte wird für 4 h (A673) bzw. 13 h (SK-N-MC) in den Brutschrank gestellt. Das Volumen unter dem Insert enthielt im Gegensatz zu dem Hungermedium der Zellsuspension 10% FBS, wobei das FBS hat eine chemoattraktive Funktion. Nach Ablauf dieser Zeit wird die Zellsuspension abgesaugt und die migrierten Zellen auf der Unterseite der Transwell-Inserts werden mit Kristallviolett angefärbt und dann über die Absorption bei 595 nm quantifiziert. 2.2.14 2.2.14.1 Colony Forming Assay Versuche zur Klonogenität mit konstitutivem Knockdown Die beiden Zellklone A673 sh(nonsi) C3 und A673 sh(TRIP6) A8 wurden in 12-Well Multiwellplatten nach dem in Abbildung 19 gezeigten Schema ausgesät. Folgende Werte wurden bei den beiden Zellklonen variiert: (1) FBS Konzentration: 2% und 10%, (2) Zellkonzentration: 3 x 10⁴ und 1,5 x 10⁴ sowie 4000 und 2000 Zellen pro Well, (3) ohne Doxycyclin und mit 0,5 µg / ml Doxycyclin. Jede Probe wurde in drei Wells einer Spalte als Triplett pipettiert. Auf einer fünften Platte werden je 4000 Zellen ausgesät, in 10% FBS haltigem Medium; hierbei enthält die erste Spalte A673 sh(nonsi) C3 Zellen ohne Doxycyclin, die zweite Spalte dieselben Zellen mit 0,5 µg / ml Doxycyclin. Die dritte Spalte enthält A673 sh(TRIP6) A8 Zellen ohne Doxycyclin, die zweite Spalte dieselben Zellen mit 0,5 µg / ml Doxycyclin. Diese fünfte Platte wird am Tag der Auswertung zur Bestätigung eines 50 2. Materialien und Methoden Knockdowns von TRIP6 durch Western Blot genutzt. An Tag 7 wird ein Mediumwechsel durchgeführt und nach 8-12 Tagen wird der Versuch ausgewertet. Die Variation der FBS-Konzentration wurde deshalb durchgeführt, um einen möglichen Effekt von TRIP6 in FBS-armem Milieu erkennen zu können. Letztlich waren die hier gewählten Zellkonzentrationen jedoch zu hoch und die Auswertbarkeit war hier deshalb nicht gegeben. Zur Auswertung kamen so die Ansätze mit 10% FBS, wobei sich hier die Konzentration von 4000 Zellen pro Well als am besten auswertbar darstellte und somit zur Evaluation der Versuche genutzt wurde. Abbildung 19: Schema eines Colony Forming Assays. Die ersten vier 12-Well Platten werden nach Färbung für die Auswertung der Kolonieanzahl und der Koloniegröße genutzt; die vier grau hinterlegten Felder beschreiben die Spezifikationen der vier unterschiedlichen 12-Well Multiwellplatten. Eine fünfte Platte wird zur Gewinnung von Proben für die Western Blot genutzt (s. Text). Dabei wurden die Wells der vier Testplatten mit je 1 ml PBS gewaschen und dann auf Eis gelagert; daraufhin wurde jedes Well mit 300 µl -20°C kaltem, 100 % Methanol bedeckt, um die Zellen zu fixieren. Nun wurde das Methanol entfernt und 300 µl einer 2,3% Kristallviolettlösung für 10 min zugegeben. Nach der Entfernung dieser Färbelösung wurde 3 x mit 1 ml dH₂O gewaschen, um alles Kristallviolett, das nicht in den fixierten Zellen aufgenommen wurde, zu entfernen. Zur Auswertung wurden die vier gefärbten 12-Well Multiwellplatten mit einem Scanner gescannt (Abbildung 20), mit Adobe Photoshop importiert und als .psd Dateien gespeichert. In demselben Programm wurden die einzelnen Wells ausgewählt und als .bmp Dateien gespeichert. Diese .bmp Dateien wurden mit dem Programm ImageJ geöffnet und 51 2. Materialien und Methoden weiter bearbeitet. Zuerst wurde mit dem runden Auswahlwerkzeug ein Well ausgewählt; dann wurde durch den Befehl Clear Outside alles, was außerhalb des Wells lag, entfernt. Nun wurde mit dem Befehl Sharpen der Kontrast erhöht, und durch den Befehl Make Binary eine binäre Bilddatei generiert. Mit dem Befehl Analyze Particles konnte sowohl die Anzahl der Kolonien als auch die Größe der Kolonien berechnet und als Textdatei zur weiteren Analyse mit Microsoft Excel ausgegeben werden. Die Zellen der fünften Platte wurden in 30 µl SDS-Stopp pro Well aufgenommen um Anhand eines Western Blot die Proteinmenge zu quantifizieren. Abbildung 20: Eingescannte 12-Well-Platte zur Auswertung der Colony Forming Assays. Die einzelnen Ansätze wurden in Tripletten pipettiert. Die Proben für die Kontrolle des Knockdowns durch Western Blot wurden separat auf einer fünften Platte pipettiert. 2.2.14.2 Colony forming Assay mit transientem Knockdown Um die Ergebnisse, welche durch die Colony Forming Assays (CFA) mit konstitutivem Knockdown beobachtet wurden, zu bestätigen, wurden CFA mit wiederholtem transienten Knockdown durchgeführt. Es wurden in 12-Well Platten je 1 x 103 A673-Zellen bzw. 2 x 103 SBKMS-KS1- oder SK-N-MC-Zellen pipettiert; direkt danach wurden diese in jedem Well mit 2 µl HiPerfect, 0,3 µl siRNA und 100 µl OPTI-MEM-Medium inkubiert. An Tag 3, 6 und 9 wurde eine 52 2. Materialien und Methoden Retransfektion durchgeführt; hierbei wurde die Methode der adhärenten transienten Transfektion angewendet und je Well 3 µl HiPerfect, 3 µl siRNA und 100 µl OPTI-MEM-Medium zugegeben. Jeder Ansatz wurde in Dupletten pipettiert und es wurden folgende 6 siRNAs verwendet: (1) nonsi, (2) si_TRIP6_4, (3) si_TRIP6_5, (4) si_CD164, (5) si_RDX und (6) si_CRYX. Der Grund, weshalb die letzteren drei siRNA-Konstrukte getestet wurden, war die Tatsache, dass es sich dabei um drei der durch TRIP6-Knockdown am stärksten negativ regulierten mRNAs handelt (s. u.). Deshalb wurde untersucht, ob gegebenenfalls der Effekt von TRIP6 auf die Expression dieser Gene für die verminderte Fähigkeit zur Koloniebildung verantwortlich ist. 2.2.15 Analyse von Microarraydaten Seit einigen Jahren sind Autoren von Artikeln in fast allen biomedizinischen Journalen dazu verpflichtet, verwendete Microarraydaten im Internet zu veröffentlichen. Eine häufig genutzte Datenbank ist GEO datasets (Gene Expression Omnibus), betrieben vom National Center for Biotechnology Information als Teil der United States National Library of Medicine, welche wiederum zum Amerikanischen Gesundheitsministerium zu rechnen ist. Durch eine GEO accession number (GSE) werden die Daten von einem Microarray zusammengefasst und durch ein GSE Dataset (GSM) werden zusammenhängende GSE Daten, welche zu einem Experiment gehören, zusammengefasst. Ergebnisse von Microarray-Datenanalysen sollten grundsätzlich kritisch gesehen werden, da regelmäßig falsch-positive Ergebnisse generiert werden (Simon, 2008). Bei korrekter Bearbeitung lassen sich aber durchaus Arbeitshypothesen aus den Expressionsanalysen ableiten. Zwecks Analyse wurde ein zu analysierendes GSM-Datenset von der Datenbank Gene Expression Omnibus datasets heruntergeladen; es wurden jeweils nur Datensets auf der gleichen Microarray Plattform verglichen. Dann wurde mit dem Programm RobustMulti-array Average (RMA) Express erst die von Affymetrix bereitgestellte .CDF Datei geladen und danach die einzelnen .CEL Dateien des GSM Datensatzes (Irizarry et al., 2003). Über den Befehl Write results to file konnte eine .txt Datei generiert werden, welche weiter mit Microsoft Excel beurteilt wurde. Zwecks besserer graphischer Darstellung wurde auch GraphPad PRISM zur 53 2. Materialien und Methoden Generierung von Diagrammen genutzt. Neben den frei verfügbaren GSM Datensets wurden auf diese Weise auch Microarray-Daten nach TRIP6-Knockdown in EFT-Zelllinien analysiert, welche in einer kollaborierenden Arbeitsgruppe generiert worden waren (s. Kapitel 2.2.16). 2.2.16 Gene Set Enrichment Analyse Da TRIP6 neben seiner Funktion in Bezug auf das Zytoskelett ebenfalls in der Lage ist, über verschiedene Signalwege die zelluläre Transkription zu verändern, wurden in einer kooperierenden Arbeitsgruppe Analysen durchgeführt, um den Effekt von TRIP6 auf das zelluläre Transkriptom in EFT zu evaluieren. Hierzu wurde 48 h nach transienter Transfektion von A673 wt und SK-N-MC wt Zellen das Transkriptom mittels DNA-Microarrays untersucht. Pro Zelllinie wurden zwei Kontrollen (unbehandelt und nonsiRNA) sowie zwei unterschiedliche siRNAs gegen TRIP6 (si_TRIP6_4 und si_TRIP6_5) eingesetzt. Das Transkriptom wurde mit einem Affymetrix Human Gene 1.0 ST Chip beurteilt. Die generierten .CEL Dateien wurden mit dem Programm RMAExpress gleichzeitig normalisiert, wozu die verfügbare HuGene10stv1_Hs_ENTREZG.cdf Datei genutzt wurde. Die erhaltenen Expressionsdaten wurden mit MS Excel weiter bearbeitet; die relative Differenz der Expression nach TRIP6-Knockdown wurde gemittelt und die entstandene Datentabelle als preranked list mit dem Tool GSEA analysiert (Subramanian et al., 2005). Hierbei wurden die 1000 Permutationen durchgeführt und es wurden nur Transkripte berücksichtigt, welche einem bekannten Gen zuzuordnen sind. Dabei wurde die Genset Datenbank c2.all.v4.0.symbols.gmt genutzt. 2.2.17 Statistische Methoden Zwecks Auswertung experimentell gewonnener oder online verfügbarer Daten wurden diese in das Programm Microsoft Excel 2010 eingegeben. Bestimmt wurden Mittelwerte und der Standardfehler; durch einseitige T-Tests wurde das Signifikanzniveau von Datensätzen bewertet. Wenn Wiederholungen desselben Versuches zusammengefasst wurden, wurde ein Mittelwert der Mittelwerte einzelner Wiederholungen und der zugehörigen Standardabweichungen gebildet. Die erhaltenen Werte sind graphisch in Tabellen dargestellt. 54 3. Ergebnisse Wie in Kapitel 1.3 erwähnt, konnten wir in EFT einzig die Überexpression von TRIP6 aus der Zyxin-Proteinfamilie beobachten. Da die Pathogenese der EFT wesentlich auf dem chimären Transkriptionsfaktor EWS-FLI1 basiert, stellte sich die Frage, ob dieser für die Überexpression von TRIP6 verantwortlich ist. Hierzu wurden öffentlich verfügbare Daten zu Experimenten mit Knockdown oder Überexpression von EWS-FLI1 analysiert. Sollte EWS-FLI1 die Expression von TRIP6 induzieren, so müssten sich nach EWS-FLI1 Knockdown erniedrigte TRIP6-Konzentrationen in EFT-Zellen nachweisen lassen. In einem verfügbaren Datenset (GSE14543) wurden in fünf EFT-Zelllinien Microarray-Analysen vor und nach EWS-FLI1-Knockdown durchgeführt (Kauer et al., 2009). Die Quotienten aus der Expression von TRIP6 vor und nach EWS-FLI1 Knockdown wurden gebildet (Abbildung 21). Ein gepaarter, einseitiger T-Test ergab für beide beurteilten Probesets (209129_at und 214262_at) keinen signifikanten Unterschied vor und nach EWS-FLI1-Knockdown (p > 0,05). 1,2 relativer Expressionindex 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 STA-ET-7.2 STA-ET-1 209129_at TC252 SK-N-MC WE68 214262_at Abbildung 21: Expression von TRIP6 vor und nach EWS-FLI1-Knockdown. Es wurde jeweils der Quotient aus der relativen Expression nach Knockdown und der relativen Expression vor Knockdown in den fünf EFT-Zelllinien (STA-ET-7.2, STA-ET-1, TC252, SK-N-MC, WE68) gebildet (relativer Expressionsindex). Dass dieser Index bei allen fünf Zelllinien etwa „1“ beträgt, zeigt, dass es zu keiner veränderten Expression von TRIP6 nach EWS-FLI1-Knockdown kommt. Beide Probesets für TRIP6 auf dem verwendeten Microarray wurden beurteilt: 209129_at und 214262_at. 55 3. Ergebnisse Die Microarraydaten eines Experimentes vor und nach ektoper Expression von EWS- FLI1 in humanen mesenchymalen Progenitorzellen, welche aktuell als wahrscheinlichste Vorläuferzellen der EFT betrachtet werden, waren ebenfalls online verfügbar (GSE8665, Miyagawa et al., 2008). Es wurden wiederum die Quotienten aus der Expression von TRIP6 nach 24, 48 und 72 Stunden ektoper EWS-FLI1-Expression und ohne ektope EWS-FLI1Expression gebildet (Abbildung 22). Ein gepaarter und einseitiger T-Test ergab keinen signifikanten Unterschied zwischen der TRIP6-Expression mit oder ohne ektope EWS-FLI1Expression (p > 0,05). 1,2 relativer Expressionsindex 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 nach 24 stunden nach 48 Stunden 209129_at nach 72 Stunden 214262_at Abbildung 22: Expression von TRIP6 nach ektoper Expression von EWS-FLI1 in humanen mesenchymalen Progenitorzellen. Es wurde jeweils der Quotient aus der relativen Expression nach Knockdown und der relativen Expression ohne Knockdown in modifizierten UET-13-Zellen gebildet (relativer Expressionsindex). Dass dieser Index jederzeit etwa „1“ beträgt, zeigt, dass es durch die ektope Expression von EWS-FLI1 zu keiner veränderten Expression von TRIP6 nach 24-72 Stunden kommt. Es wurden beide Probesets für TRIP6 auf dem verwendeten Microarray beurteilt: 209129_at und 214262_at. Zusätzlich wurde im Rahmen des Projektes in einer Kollaboration eine ChromatinImmunpräzipitation in EFT-Zellen mit einem FLI1-Antikörper durchgeführt, da der Promotorbereich von TRIP6 eine putative FLI1-Bindungsstelle enthält. Hier ließ sich jedoch kein Anhalt für eine Bindung von EWS-FLI1 im Promotorbereich finden (Grunewald et al., 2013). In der Zusammenschau sprechen diese Daten für eine Überexpression von TRIP6, unabhängig von dem chimären Transkriptionsfaktor EWS-FLI1. 56 3. 3.1 Ergebnisse Funktion von TRIP6 als Kotranskriptionsfaktor in EFT Aufgrund der eingangs beschriebenen Funktion von TRIP6 im Kontext der Transkription und aufgrund der Vielzahl von Interaktionspartnern wurde die Genexpression in EFT-Zelllinien im Normalzustand und nach TRIP6-Knockdown mittels Microarray-Experimenten verglichen. 3.1.1 Invasive und proliferativen Signatur durch TRIP6 In einer kollaborierenden Arbeitsgruppe wurden Microarray-Experimente vor und nach TRIP6Knockdown durchgeführt. Um den Effekt von TRIP6 auf das gesamte Transkriptom zu integrieren, wurde eine Gene Set Enrichment Analyse durchgeführt. Diese Methode ordnet jedem Genset, also mehreren Genen, die zum Beispiel eine biologische Funktion teilen, einen Enrichment Score (ES) zu. Ist dieser negativ, ist das untersuchte Genset im entsprechenden Phänotyp vermindert, ist er positiv, so ist es in diesem Phänotyp vermehrt exprimiert. Abbildung 23: Übersicht über das Ergebnis der Gene Set Enrichment Analyse. Links wird der Zusammenhang zwischen Enrichment Score (s. Text) und untersuchten Gensets beschrieben; Rechts wird der Zusammenhang zwischen normalisiertem Enrichment Score (NES) und False Detection Rate (FDR) bzw. nominellen P-Wert dargestellt. Der linke Teil von Abbildung 23 zeigt, dass nach TRIP6-Knockdown mehr Gensets vermindert als vermehrt sind. Der Normalisierte Enrichment Score (NES) entspricht dem tatsächlichen ES, dividiert durch den mittleren ES aller Permutationen des Datensets. 57 3. Ergebnisse Die Problematik der falsch-positiven Ergebnisse stellt sich bei dieser Art der Analyse ebenso wie generell bei der Methode der Microarrays. Um dieses Problem kontrollieren zu können, werden der nomineller P-Wert und die False Detection Rate (FDR) bestimmt; der Zusammenhang zwischen diesen beiden Werten und dem NES wird im rechten Teil von Abbildung 23 dargestellt. Abbildung 24: Der Knockdown von TRIP6 geht mit einer negativen Regulation einer Vielzahl von Gensets einher, welche in metastatischen Malignomen beschrieben wurden oder als pro-proliferativ gelten. Ebenfalls kommt es zu einer negativen Regulation von Genen, welche mit einer Resistenz gegen Chemotherapeutika wie Doxorubicin einhergehen. Dieses Medikament ist in der Standardtherapie der EFT enthalten (s. Kapitel 4). 58 3. Ergebnisse Nach TRIP6-Knockdown werden solche Gensets vermindert exprimiert, die Gene enthalten, welche mit zellulärer Proliferation (etwa CHANG_Cycling_GENES) oder Metastasierung (WINNEPENNICKX_MELANOMA_METASTASIS_UP, BIDUS_METASTASIS) assoziiert sind (Abbildung 24). Die Ergebnisse legen nahe, dass der Kotranskriptionsfaktor TRIP6 die Expression der Gene dieser Gensets verstärkt. Diese Tatsache in Verbindung mit der selektiven TRIP6-Überexpression in EFT legt eine wichtige Rolle von TRIP6 in EFT nahe. In der Folge wurden die hier vorhergesagten funktionellen Veränderungen in EFT-Zelllinien nach TRIP6-Knockdown evaluiert. 3.1.2 Validierung der Microarrays In einer kollaborierenden Arbeitsgruppe wurden Microarray-Experimente vor und nach TRIP6Knockdown in A673- und SK-N-MC-Zellen durchgeführt (Grunewald et al., 2013). Neben der integrativen Analyse dieser Experimente mittels der GSEA-Methode, welche Gruppen von Genen beurteilt, untersuchten wir, inwieweit einzelne Gene nach TRIP6 unterschiedlich exprimiert werden. Die Auswertung ergab eine verminderte Expression der Gene Radixin, CRYZ (crystalline zeta), CD164 und SLC39A10 (solute carrier family 39, member 10) während UIMC1 (ubiquitin interaction motif containing 1) hochreguliert wurde. Diese Auswahl wurde nach Kriterien der Relevanz und der Effektstärke des TRIP6-Knockdowns auf die Transkriptmenge getroffen. In derselben kollaborierenden Arbeitsgruppe war gezeigt worden, dass sich einige dieser Ergebnisse auch durch Q-RT-PCR bestätigen lassen (Transkripte von CD164, CRYX und Radixin). Zusätzlich wurde in unserer Arbeitsgruppe eine zeitabhängige Verminderung der Proteinmenge dieser Proteine beobachtet (vgl. Kapitel 3.7). Um die Validität der Ergebnisse der Microarrays weiter zu prüfen, wurde die Expression der beiden Gene UIMC1 und SLC39A10 nach Knockdown von TRIP6 durch qRT-PCR quantifiziert. Bei UIMC1 handelt es sich um ein Transkript, welches nach TRIP6-Knockdown um 30% vermehrt exprimiert wird, während das Transkript des Gens SLC39A10 um 35% vermindert exprimiert wird; beide Transkripte sind mit Malignität in Verbindung gebracht worden (Kagara et al., 2007; Novak et al., 2009). Abbildung 25 zeigt, dass sich zwar ein Trend für die zu erwartenden Veränderungen ergibt, allerdings keine signifikante differentielle Expression zu beobachten ist. 59 3. Ergebnisse Abbildung 25: Der Knockdown von TRIP6 hat keinen signifikanten Effekt auf die Transkripte von UIMC1 und SLC39A10 in A673- und SK-N-MC-Zellen. Jedoch lässt sich der Trend erkennen, der aus der Microarray-Analyse zu erwarten war: eine leicht gesteigerte Transkriptmenge für UIMC1 und eine verminderte Transkriptmenge von SLC39A10. 3.2 Zelluläre Lokalisation von TRIP6 in Ewing-Sarkom-Zellen Um evaluieren zu können, wo TRIP6 in EFT-Zellen seine Funktion entfaltet, wurden Immunfluoreszenz-Bilder in A673-Zellen angefertigt. Hier zeigte sich, dass TRIP6 hauptsächlich im Bereich von Zell-Zell-Kontakten lokalisiert ist; allerdings wurde in einigen Zellen auch ein nukleäres Signal beobachtet (Abbildung 26, Pfeile). Diese Beobachtung spricht dafür, dass TRIP6 in EFT-Zellen entsprechend seiner Funktion als nukleozytoplasmatisches Shuttle-Protein in beiden Zellkompartimenten funktionell aktiv ist. 60 3. Ergebnisse Abbildung 26: Immunfluoreszenz mit TRIP6-Antikörper in A673-Zellen. TRIP6 ist hauptsächlich im Bereich der Zell-Zell-Kontakte lokalisiert; in einigen Zellen lässt sich jedoch auch ein nukleäres TRIP6Signal erkennen (weiße Pfeile). 3.3 TRIP6-Knockdown ohne Einfluss auf Proliferation und Adhäsion 3.3.1 Proliferation Maligne Tumoren wie die ESFT zeichnen sich durch eine Vielzahl von pathologischen Eigenschaften aus. Eine zentrale Rolle spielt die Fähigkeit zur abnorm gesteigerten Proliferation dieser Zellen (Schulze and Harris, 2012). Aus diesem Grund wurde die Proliferation von EFT-Zelllinien ohne und mit TRIP6-Knockdown beurteilt, um eine mögliche Beteiligung des Kotranskriptionsfaktors TRIP6 zu untersuchen. Ein effektiver TRIP6Knockdown wurde bei allen ausgewerteten Versuchen im Western Blot bestätigt (Abbildung 27). 61 3. Ergebnisse Abbildung 27: Western Blot mit Nachweis des Knockdown von TRIP6 bei Durchführung der Versuche zur Proliferation. Bei der Beurteilung der Proliferation über 48-66h kam es zu keiner einheitlichen signifikanten Verminderung der Proliferation; die nonsiRNA-Kontrolle wurde jeweils als Referenz genutzt (Abbildung 28). Einzig durch si_TRIP6_5 kam es in A673 zu einer signifikanten Verminderung der Proliferation (20% Effektstärke, p=0,01). Dieser Sachverhalt wird in Kapitel 4.1 diskutiert. 140 relative Proliferation 120 100 80 A673 60 SKNMC 40 20 0 Kontrolle HiPerfect Kontrolle nonsi Kontrolle si_TRIP6_4 si_TRIP6_5 Kombination 0,4 + 0,4 Abbildung 28: Der Knockdown von TRIP6 führt zu keiner einheitlichen signifikanten Verminderung der Proliferation in EFT-Zelllinien. Die Proliferation der Kontrollen, die mit nonsiRNA behandelt wurden, wurde als Referenz gesetzt und ihr wurde eine relative Proliferation von „100“ zugeordnet. 62 3. Ergebnisse 3.3.2 Adhäsion Aufgrund der soliden Datenlage, die für eine Beteiligung von TRIP6 in der Organisation von fokalen Kontakten spricht, untersuchten wir die Fähigkeit von EFT-Zellen, an Fibronektinbeschichteten 48-Well-Kulturplatten zu adhärieren (vgl. Kapitel 2.2.12). Hierzu wurden die Zellen ca. 60 Stunden vor Beginn des Experimentes transient transfiziert; ein effektiver Knockdown wurde bei jedem Experiment mittels Western Blot bestätigt (Abbildung 29). Abbildung 29: Western Blot zur Kontrolle des effektiven Knockdown von TRIP6 in A673- und SK-NMC-Zellen bei den Adhäsionsversuchen. 140 relative Adhäsion 120 100 80 A673 60 SK-N-MC 40 20 0 Kontrolle nonsi Kontrolle si_TRIP6_4 si_TRIP6_5 Abbildung 30: Der Knockdown von TRIP6 führt zu keiner einheitlichen Veränderung der Fähigkeit zur Adhäsion von EFT-Zellen. Obwohl beide siRNA-Konstrukte gegen TRIP6 zu einem effektiven Knockdown von TRIP6 führten, ließen sich bei der Analyse der adhärenten Zellen Unterschiede beobachten 63 3. Ergebnisse (Abbildung 30). So kam es nur durch si_TRIP6_5 zu einer signifikanten Reduktion der Adhäsion in SK-N-MC-Zellen (p<0,05); dieser Effekt wurde trotz ebenfalls deutlichem TRIP6-Knockdown mit si_TRIP6_4 nicht beobachtet. Dies kann zwei mögliche Ursachen haben: Entweder führt si_TRIP6_5 nicht durch die Reduktion der TRIP6-Konzentration, sondern durch den Abbau einer weiteren zufälligen mRNA zu einer verminderten Adhäsion, oder aber erst der effektivere Knockdown durch si_TRIP6_5 führt zu einer verminderten Adhäsion (vgl. Kapitel 3.3.1). Auch dies muss in Betracht gezogen werden, da si_TRIP6_5 konsistent zu einem stärkerenTRIP6-Knockdown führte als si_TRIP6_4. Dieser Sachverhalt wird eingehend in Kapitel 4.1 diskutiert. Zusammenfassend lässt sich daher kein klarer Effekt von TRIP6 auf die zelluläre Adhäsion konstatieren. 3.4 Transienter TRIP6-Knockdown mit verminderter zellulärer Migration Die Fähigkeit maligner Zellen von einem Primärtumor aus zu streuen und Metastasen zu setzen, spielt eine zentrale Rolle in allen Malignomen (Yamaguchi and Condeelis, 2007). Bei EFT wird die Prognose besonders stark vom Vorliegen von Metastasen beeinflusst: 5 Jahre nach Diagnosestellung zeigen 45% aller Patienten ohne Metastasen einen Rückfall, während dies bei 79% der Patienten mit Metastasen der Fall ist (Cotterill et al., 2000). Aus diesem Grund wollten wir wissen, ob TRIP6 in Bezug auf die zelluläre Migration eine funktionelle Rolle spielt. Abbildung 31: Western Blot mit Darstellung eines effektiven Knockdowns von TRIP6 im Rahmen der Versuche zur Migration. 64 3. Ergebnisse Für diesen Versuch wurden A673- und SK-N-MC-Zellen wiederum mit zwei spezifischen siRNA-Konstrukten gegen TRIP6 inkubiert und anschließend die Migration durch eine modifizierte Boydenkammer mit 8 µm Porengröße gemessen. Zum Zeitpunkt der Versuche lag ein effektiver TRIP6-Knockdown vor (Abbildung 31). Beide Konstrukte führten zu einer statistisch signifikanten Verminderung der zellulären Migration (Abbildung 32). 140 relatives Migration 120 100 80 A673 60 SKNMC 40 20 0 MOCK nonsi Kontrolle siTRIP6_4 siTRIP6_5 Abbildung 32: Die Migration von A673- und SK-N-MC-Zellen wird durch TRIP6-Knockdown signifikant vermindert. Beide si-RNA-Konstrukte führen zu einer signifikant verminderten Migration in beiden Zelllinien (p<0,05). 3.5 Induzierbarer TRIP6-Knockdown Die Herstellung von A673 mit induzierbarem Knockdown wurde mit dem TRIPZ Lentiviral Inducible shRNA gene set von GE Healthcare nach dem Standardprotokoll des Herstellers in unserem Labor durchgeführt. Dazu wurden die beiden EFT-Zelllinien A673 und SK-N-MC jeweils mit einem nonsi-sh-Konstrukt, einem EG5-sh-Konstrukt und einem TRIP6-sh-Konstrukt stabil transfiziert. Anschließend wurden Single-Cell-Kolonien generiert (vgl. Kapitel 2.2.4). Um für die weiteren Versuche die Konzentration von Doxycyclin zu ermitteln, die einerseits einen effektiven Knockdown von TRIP6 ermöglicht, andererseits aber möglichst wenige Nebeneffekte hat, wurden unterschiedliche Konzentrationen getestet. Abbildung 33 zeigt die Proteinmenge von Aktin und TRIP6 ohne Zugabe von Doxycyclin sowie mit unterschiedlichen Doxycyclin-Konzentrationen. Da Klon G4 bereits bei einer Doxycyclinkonzentration von 0,5 µg / ml einen effektiven Knockdown von TIRP6 zeigt, wurde mit diesem Klon und der Konzentration 0,5 µg / ml weiter gearbeitet. 65 3. Ergebnisse Abbildung 33: Testung unterschiedlicher Konzentrationen von Doxycyclin zur Induktion des TRIP6Knockdowns. Die Konzentration von Doxycyclin wird in µg / ml angegeben. Es wurden wt A673-Zellen sowie zwei Single-Cell-Klone mit sh(TRIP6)-Konstrukt getestet. 3.6 Hemmung der Klonogenität in Single-Cell-Kolonien Zwingende Voraussetzung für eine maligne Zelle ist, neben der Fähigkeit zur Migration, die Fähigkeit einer einzelnen Zelle zu einer Zellkolonie zu expandieren. Für diese Versuche nutzten wir den Zellklon G4, welcher eine Single-Cell-Kolonie der Zelllinie A673 mit einem sh(TRIP6)-Konstrukt darstellt. Über 8-12 Tage wurde die Fähigkeit von einzelnen Zellen zur Koloniebildung beurteilt, wobei eine kontinuierliche DoxycyclinExposition einen permanenten TRIP6-Knockdown gewährleistete. Abbildung 34 zeigt links den effektiven Knockdown von TRIP6 bei diesen Experimenten. Es konnte eine deutliche und hochsignifikante Verminderung sowohl der Anzahl gewachsener Kolonien (durch TRIP6-Knockdown um ca. 70% vermindert) als auch der Fläche der einzelnen Kolonien (durch TRIP6-Knockdown um etwa 40% vermindert) beobachtet 66 3. Ergebnisse werden. Der Klonogenitätsindex gibt diese Verminderung als Produkt von Kolonienanzahl und Kolonienfläche wider und ist für diese Versuche in Abbildung 35 rechts dargestellt. Abbildung 34: Der Effekt eines TRIP6-Knockdowns auf die Klonogenität. Der linke Teil der Abbildung zeigt, dass die Zugabe von Doxycyclin bei A673 sh(TRIP6)-Single-Cell-Kolonien zu einem effektiven Knockdown von TRIP6 führt. Der rechte Teil zeigt, dass die Fähigkeit zur Koloniebildung durch konstitutiven TRIP6-Knockdown stark vermindert wird; im Gegensatz dazu zeigt Doxycyclin bei mit einem mit sh(nonsi)-Konstrukt transfizierten A673-Zellen keinen Effekt auf diese zelluläre Funktion. In der Zusammenschau sprechen diese Ergebnisse für eine wichtige Rolle von TRIP6 bei der Fähigkeit von EFT-Zellen aus einzelnen Zellen eine Kolonie zu entwickeln. Aufgrund des deutlichen Effektes wollten wir ausschließen, dass ein anderes, durch die stabile Geninsertion zufällig in seiner Expression beeinflusstes Gen den beobachteten Phänotyp verursacht. Hierzu führten wir wiederum Colony Forming Assays durch, wobei wir aber zur Verminderung der TRIP6 Expression nicht die A673 sh-Transfektanden benutzten, sondern wt Zellen, die wiederholt transient transfiziert wurden. 3.7 Hemmung der Klonogenität unterschiedlicher EFT-Zelllinien Wie in Kapitel 3.6 erläutert, dienten die Colony Forming Assays mit transienter Transfektion zum einen der Bestätigung der Ergebnisse aus den Versuchen mit dem induzierbarem Knockdown. Zum anderen sollte überprüft werden, ob die Transkripte, die durch TRIP6Knockdown negativ reguliert werden, funktionell für die Klonogenität relevant sind. Zu diesen Genprodukten zählen die Proteine Radixin, CD164 und CRYZ; diese drei Proteine tragen zur Malignität anderer Tumoren bei (Havens et al., 2006; Jiang et al., 2014; Lapucci et al., 2010). In unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass ein konstitutiver Knockdown von TRIP6 mit einer zeitabhängigen Verminderung der Proteinmenge dieser drei 67 3. Ergebnisse Proteine im Western Blot einhergeht (Abbildung 35). Darüber hinaus konnte in der kollaborierenden Arbeitsgruppe eine verminderte Menge der drei Transkripte nach TRIP6Knockdown mittels Q-RT-PCR dokumentiert werden (Daten nicht gezeigt). CRYZ Abbildung 35: Knockdown von TRIP6 geht mit einer Veränderung der Proteinmenge von Radixin, CD164 und CRYZ einher. Eine weitere Untersuchung im Rahmen dieser Arbeit zur Regulation von SLC39A10 und UIMC1 mit qRT-PCR ergab keine statistisch signifikante Veränderung der Genexpression beider Proteine nach TRIP6-Knockdown obwohl die Microarray-Versuche eine um 31% erhöhte UIMCI-Expression und um 34% verminderte SLC39A10-Expression aufzeigten (s. Kapitel 3.1.2). Aus diesem Grund wurde die Wirkung von folgenden siRNA-Konstrukten auf die Klonogenität geprüft: nonsi Kontrolle, si_TRIP6_4, si_TRIP6_5, si_Radixin, si_CD164 und si_CRYZ. Um eine valide Aussage über den Knockdown der einzelnen Proteine machen zu können, wurde vor Auswertung durch Western Blot eine Angleichung der Probenmenge mittels Western Blot auf das Haushaltsprotein Actin vorgenommen (Routinevorgehen, hier allerdings aufgrund des ausgeprägten Effektes durch TRIP6-Knockdown auf die Klonogenität besonders relevant). Alle Versuche wurden mindestens dreimal durchgeführt. Während für TRIP6, Radixn und CRYZ gute Knockdowns dokumentiert werden konnten, war dies für das Protein CD164 nicht der Fall (Abbildung 36). Abbildung 37 quantifiziert die Knockdowns von TRIP6 und den von TRIP6 regulierten Proteinen. Der TRIP6Knockdown ist in den SK-N-MC-Zellen am effektivsten (auf 19, bzw. 8%) und hier zeigt sich nach TRIP6-Knockdown auch die am stärksten verminderte Klonogenität. Trotz des guten 68 3. Ergebnisse Radixin-Knockdowns in allen drei Zelllinien (auf jeweils 62%, 38% und 55%) kommt es nur in A673- und SK-N-MC-Zellen zu einer verminderten Klonogenität. Abbildung 36: Western Blots im Rahmen der Colony Forming Assays nach transienter Transfektion mit siRNA-Konstrukten gegen TRIP6, Radixin, CD164 und CRYX in drei unterschiedlichen Zelllinien. Ähnliches lässt sich beim CRYZ-Knockdown beobachten. Hier kommt es nur in A673Zellen zu einer deutlichen Verminderung der Klonogenität, während sich dies in den beiden anderen Zelllinien trotz guten Knockdowns (auf 34%, bzw. 51%) nicht beobachten lässt. Abbildung 37: Densitometrische Quantifizierung der Knockdowns der Proteine TRIP6, Radixin, CD164 und CRYZ in drei unterschiedlichen EFT-Zelllinien. Die angegebene Zahl beschreibt, wieviel Prozent des jeweiligen Proteins nach Knockdown vorhanden ist. 69 3. Ergebnisse CRYZ und Radixin scheinen somit nicht in allen Zellen eine Rolle bei der Klonogenität zu spielen; in einzelnen Fällen (z. B. Radixin in SK-N-MC-Zellen, CRYZ in A673-Zellen) zeigt sich nach einem effektiven Knockdown aber durchaus ein um 40% bzw. 45% verminderter Klonogenitätsindex (Abbildung 38). Durch Transfektion mit dem siRNA-Konstrukt gegen CD164 kommt es zu keinem effektiven Knockdown des Proteins CD164 und es zeigt sich auch keine veränderte Klonogenität. 180 160 relative Klonogenität 140 120 100 SB-KMS-KS1 SK-N-MC 80 A673 60 40 20 0 siControl siTrip6_4 siTrip6_5 RDX CD164 CRYZ Abbildung 38: Relative Klonogenität von drei unterschiedlichen Zelllinien nach transienter Transfektion durch siRNA-Konstrukte gegen TRIP6, Radixin, CD164 und CRYZ. Wie erwartet ließ sich auch in diesen Versuchen eine deutliche Reduktion, sowohl der Kolonieanzahl, als auch der Koloniefläche nach TRIP6 Knockdown beobachten; das Produkt aus diesen beiden Werten wurde wiederum als Klonogenitätsindex bezeichnet. Je nach untersuchter Zelllinie (A673, SK-N-MC und SB-KMS-KS1) kam es zu einer Reduktion des Indexwertes von 50% bis 80% nach transientem Knockdown von TRIP6 durch beide siRNAKonstrukte (Abbildung 38). Dass der Effekt von TRIP6 sich in den drei untersuchten Zelllinien nachweisen lässt, spricht für eine universale Rolle des Proteins in EFT-Zellen. In mindestens zwei Fällen konnte gezeigt werden, dass die Proteine Radixin und CRYZ, deren Expression in Microarrays, qRT-PCR und in Western Blots nach TRIP6-Knockdown vermindert sind, den Effekt von TRIP6 auf die Klonogenität von EFT-Zelllinien anteilig 70 3. Ergebnisse mediieren (Radixin in SK-N-MC und CRYZ in A673-Zellen). Dass sich für diese Proteine kein einheitlicher Effekt im Hinblick auf die Klonogenität zeigt, deutet darauf hin, dass diese Proteine im Gegensatz zu TRIP6 keine universale Funktion in EFT besitzen, sondern, dass der zelluläre Kontext die Funktion der einzelnen Proteine beeinflusst. Etwa zeigt sich trotz CRYZKnockdown von 68% in SK-N-MC-Zellen keine veränderte Klonogenität. Die Ursache könnte ein Unterschied in der Expression von mit TRIP6 interagierenden Transkriptionsfaktoren (wie NFκB oder GR) sein. 71 4. Diskussion Zentrale Ziele der modernen onkologischen Forschung sind die Entwicklung von neuen, gezielten und individuellen Therapieoptionen in der Behandlung von Malignomen sowie die Entwicklung von Biomarkern zwecks Risikostratifizierung bei Malignompatienten. Mehrere bedeutende Errungenschaften auf diesen Gebieten haben bereits Einzug in die klinische Praxis gefunden. So verbessert der Einsatz von spezifischen Tyrosinkinaseinhibitoren bei chronischer myeloischer Leukämie sowie gastrointestinalem Stromatumor die Prognose ganz entscheidend mit einem vergleichsweise milden Nebenwirkungsspektrum (Iqbal und Iqbal, 2014). Ebenfalls etabliert hat sich die Risikostratifizierung bei Mammakarzinomen in Abhängigkeit der Expression von maßgeblich drei Rezeptoren (human epidermal growth factor receptor type 2, Östrogenrezeptor und Progesteronrezeptor) (Foulkes et al., 2010). Allerdings gibt es bei einer Vielzahl von Malignomen noch dringlichen Forschungsbedarf, da die bereits implementierten modernen Diagnostika und Therapeutika aktuell nur für ein begrenztes Patientenkollektiv von Nutzen sind. Vor diesem Hintergrund wurde in der vorgelegten Arbeit untersucht, ob die Überexpression von TRIP6 in EFT funktionelle Relevanz besitzt und ob sich diese in diagnostische oder therapeutische Konzepte einbringen lässt. Aufgrund der weiterhin infausten Prognose dieser Tumorentität und der genetischen Homogenität, die einheitliche Therapiekonzepte nahelegt, stellen EFT einen gleichermaßen dringlichen wie vielversprechenden Forschungsgegenstand dar. Da bereits in mehreren malignen Neoplasien eine funktionelle Relevanz von TRIP6 für Zellmigration, Proliferation und Anti-Apoptose beschrieben wurde (Lin et al., 2013; Yamamura et al., 2013), lag für uns der Verdacht nahe, dass die Überexpression von TRIP6 in EFT ebenfalls hierfür bedeutsam sein könnte. 4.1 Einordnung der Ergebnisse Das zentrale Ereignis in der Pathogenese der ESFT ist die Bildung von unterschiedlichen chimären Transkriptionsfaktoren, wobei diese in der Regel aus dem Gen EWSR1 und einem Mitglied der Transkriptionsfaktorfamilie E-twenty-six (am häufigsten FLI1 und ERG) bestehen. 72 4. Diskussion Dieser chimäre Transkriptionsfaktor führt in der Folge über mehrere Mechanismen zu einem veränderten Transkriptom, wobei eine Vielzahl von Transkripten vermehrt oder vermindert exprimiert werden (Mackintosh et al., 2010). So kommt es etwa zu einer verminderten Expression des Tumorsuppressors Zyxin und einer Überexpression der TRIP6- dephosphorylierenden Phosphatase PTPN13 (Mackintosh et al., 2010). In Anbetracht der teilweise redundanten Funktion der Mitglieder der Zyxin-Proteinfamilie ist interessant, dass Zyxin in EFT eine TRIP6 diametrale Funktion als Tumorsuppressor besitzt (Chaturvedi et al., 2014). Diese Beobachtung legt nahe, dass die Mitglieder der Zyxin-Proteinfamilie durchaus distinkte Funktionen innehaben und keinesfalls kompensatorisch auftreten; in gleicher Weise lässt sich auch die Beobachtung deuten, dass TRIP6 als einziges Mitglied dieser Proteinfamilie in EFT überexprimiert ist (s. Abbildung 5). Wie eine kollaborierende Arbeitsgruppe zeigen konnte, kann EWS-FLI1 nicht an eine putative Bindungsstelle im Promotor von TRIP6 binden; zusätzlich wird durch EWS-FLI1 Knockdown keine veränderte TRIP6-Expression beobachtet. Diese Erkenntnisse sprechen klar dafür, dass TRIP6 nicht zu der Gruppe der EWS-FLI1-regulierten Proteine in EFT zählt und seine Überexpression demnach unabhängig von EWS-FLI1 besteht. Daher stellt sich die Frage, wie spezifisch die TRIP6-Überexpression in EFT ist und wie es zu einer Erhöhung der Expression von TRIP6 kommt, da sekundäre Mutationen nur in gut 10% aller EFT nachgewiesen werden können (Huang et al., 2005). 4.1.1 Funktionelle Ergebnisse Ein Knockdown von TRIP6 mittels RNA-Interferenz geht mit einer verminderten Expression von Genen einher, welche mit Invasivität und Proliferation von Malignomen in Verbindung gebracht wurden (s. Abbildung 24). Trotz des hier beobachteten Effektes von TRIP6 auf die Genexpression in EFT ließ sich bei der Untersuchung der zellulären Kurzzeitproliferation und der Adhäsion kein klarer Effekt durch TRIP6-Knockdown beobachten. Diese Tatsache spricht gegen eine wichtige Rolle von TRIP6 für die Malignität von EFT, da eine Deregulation dieser zellulären Funktionen als maßgebliches Charakteristikum von malignen Zellen betrachtet wird (Bendas and Borsig, 2012; Evan and Vousden, 2001). Auch wurde keine Veränderung des Zellzyklus und der Apoptoserate nach TRIP6-Knockdown beobachtet (Grunewald et al., 2013). 73 4. Diskussion Bei der Diskussion der Ergebnisse zur zellulären Proliferation ist zu berücksichtigen, dass die Zellen erst beim Pipettieren in die Multiwellplatten transient transfiziert wurden und erst nach etwa 12 Stunden ein effektiver Knockdown von TRIP6 zu beobachten ist (Daten nicht gezeigt). Ein Trend zur verminderten Proliferation ließ sich bereits nach 60 h erkennen; nach transienter Transfektion initial und nach 48 h und Auswertung nach 72 - 96h kommt es zu einer signifikanten Verminderung der Proliferation (Grunewald et al., 2013). Bei den Versuchen zur Proliferation zeigte sich ein funktioneller Unterschied bei Nutzung der beiden unterschiedlichen siRNA-Konstrukte gegen TRIP6. Die signifikant verminderte Proliferation durch Transfektion mit si_TRIP6_5 in A673-Zellen stand einem fehlenden Effekt durch si_TRIP6_4 gegenüber. Dies wurde darauf zurückgeführt, dass es durch Transfektion mit si_TRIP6_5 zu einer stärkeren Verminderung der Proteinmenge von TRIP6 im Vergleich zu si_TRIP6_4 kam (s. Abbildungen 27, 36 und 37). Eine densitometrische Auswertung der Western Blots zu diesen Experimenten zeigt durch si_TRIP6_4 eine Verminderung der TRIP6-Menge um 66% bzw. 81% und durch si_TRIP6_5 um 78% bzw. 87% in A673- und SK-N-MC-Zellen. Damit hat TRIP6 einen Effekt auf die Proliferation, dieser wird aber erst durch einen starken Knockdown sichtbar. Alternativ ist jedoch auch ein off-target Effekt in Betracht zu ziehen, da jede siRNA neben dem Zieltranskript auch andere Transkripte beeinflusst (Buehler et al., 2012). Während der Versuche zur zellulären Adhäsion lag zu jeder Zeit nachweisbar ein verminderter TRIP6-Spiegel vor. Das bedeutet, dass TRIP6 im Netzwerk seiner Interaktionspartner (wie Endoglin und Supervilin) im zellulären Kontext der EFT keine Rolle bei der Adhäsion an die ECM (respektive Fibronektin in den durchgeführten Adhäsionsexperimenten) spielt, obwohl TRIP6 in EFT-Zellen primär an der Plasmamembran lokalisiert ist (s. Abbildung 26). Zu berücksichtigen ist allerdings, dass die durchgeführten Experimente nicht alle Aspekte der zellulären Adhäsion erfassen. Die Komplexität einer verminderten Adhäsion bei malignen Zellen, welche sich aus dem Zellverbund des Primärtumors lösen, und der andererseits gesteigerten Adhäsion von Tumorzellen, welche fremd des originären Mikromilieus adhärieren, lässt hier kein endgültiges Urteil zu. Bei Beurteilung der Ergebnisse hinsichtlich zellulärer Adhäsion stellte sich erneut die Frage, weshalb beide genutzten siRNAKonstrukte nicht zu demselben funktionellen Ergebnis führen. Es kam nämlich zu einer verminderten Adhäsion nach Transfektion mit si_TRIP6_5 in SK-N-MC-Zellen, während dies 74 4. Diskussion bei einer Transfektion mit si_TRIP6_4 nicht der Fall war. Da die ersten Versuche zur zellulären Adhäsion wegen technischer Mängel (Kristallviolett-basierte Methode) nicht auswertbar waren, konnten die im Ergebnisteil präsentierten Daten erst gegen Ende des Projektes erhoben werden. Aus diesem Grund konnte nicht mehr auf mögliche off-target Effekte mit Wahl einer anderen siRNA reagiert werden. Auch hier besteht jedoch die Möglichkeit, dass erst der effektivere TRIP6-Knockdown durch si_TRIP6_5 zu einer veränderten zellulären Funktion führen kann. Der wichtigste Phänotyp dieser Arbeit, die verminderte Klonogenität nach TRIP6Knockdown, konnte jedoch durch den Einsatz von drei unterschiedlichen siRNA-Konstrukten eindeutig nachgewiesen werden. Durch eine Principal Component Analysis ließe sich nach offtarget Effekten in den durchgeführten Microarray-Experimenten suchen (Ringnér, 2008). Aufgrund fehlender Relevanz und Konsequenz wurde an dieser Stelle darauf verzichtet. Derartige, unerwünschte Nebeneffekte können durch den gleichzeitigen Einsatz von einer Vielzahl siRNAs gegen dasselbe Transkript (sog. siRNA-Pools) ausgeschlossen werden (Hannus et al., 2014). Während bei der Beurteilung der zellulären Proliferation bereits bei Versuchsbeginn eine hohe Konzentration von Zellen vorliegt und sich Zell-Zell-Kontakten schnell entwickeln können, wird bei den Experimenten zur zellulären Klonogenität (CFA) eine deutlich niedrigere Konzentration von Zellen gewählt (Proliferation: 3-6 x 104 Zellen / ml, CFA: 2-4 x 103 Zellen / ml). Dadurch ergibt sich, dass in der Folge einzelne Zellen zu einer Kolonie von Zellklonen wachsen (Franken et al., 2006). Die Prozesse der Adhärenz und Zellteilung als Elemente der Metastasierung werden so besser simuliert, da kein Zellverband, sondern einzelne Zellen und deren Fähigkeit zur Bildung einer Kolonie beurteilt werden. Hierdurch fällt die parakrine Beeinflussung durch benachbarte Tumorzellen weg, welche in dieser Form auch in vivo nicht vorliegt. Außerdem wird durch die lange Dauer des Versuches von 9-12 Tagen die tatsächliche Fähigkeit zur unbegrenzten Zellteilung besser dargestellt. Aufgrund der eingangs erwähnten Beobachtungen hinsichtlich des Transkriptomes nach TRIP6-Knockdown und des unklaren Effektes auf die zelluläre Proliferation wurden daher Versuche zur zellulären Klonogenität durchgeführt. Hier zeigte sich sowohl nach wiederholtem transienten als auch nach konstitutivem Knockdown von TRIP6 eine deutlich verminderte Fähigkeit zur Koloniebildung in drei unterschiedlichen EFT-Zelllinien. Dabei kam es nach TRIP6Knockdown sowohl zu einer verminderten Anzahl von Kolonien als auch zu einer verminderten 75 4. Diskussion Fläche der einzelnen Kolonien (Daten nicht gezeigt). Dies spricht dafür, dass TRIP6 sowohl für die Fähigkeit einer Zelle zur Bildung einer Kolonie als auch zum Wachstum einer solchen wesentlich beiträgt. Demgegenüber zeigte sich nach einzelnem Knockdown der beiden Proteine Radixin und CRYZ, welche nach TRIP6-Knockdown vermindert vorliegen, kein konsistenter, signifikanter Effekt. In einzelnen Zelllinien kommt es jedoch durch Knockdown dieser Proteine zu einer verminderten Koloniebildung (vgl. Kapitel 3.7). Diese Daten sprechen klar dafür, dass die Bildung einer Metastase – denn dieser Prozess wird durch den Versuchsaufbau zumindest zum Teil simuliert – durch Abwesenheit von TRIP6 deutlich eingeschränkt wird. Eine Möglichkeit zur Erklärung der verminderten Koloniebildung nach TRIP6Knockdown bietet die Funktion von TRIP6 als Kotranskriptionsfaktore zu fungieren. Ein Knockdown der von TRIP6 regulierten Proteine Radixin und CRYZ führt in einzelnen Zelllinien zu einer verminderten Koloniebildung. Desweiteren interagiert TRIP6 mit mehreren Mitgliedern des Sheltrin-Proteinkomplexes und wirkt so genomisch stabilisierend. In humanen Fibrosarkomzellen kam es nach TRIP6-Knockdown zu einem vermehrten Auftreten von telomere dysfunction induced foci, was für eine protektive Wirkung von TRIP6 im Hinblick auf humane Telomere spricht und dafür, dass die verminderte Klonogenität als Resultat geschädigter Telomere zu verstehen ist (Sheppard and Loayza, 2010). Die geschädigten Telomere werden als schadhafte DNA erkannt und führen zu Zellzyklusarrest und Apoptose (Sfeir, 2012). Da sekundäre Mutationen in EFT nur in ca. 10% aller Fälle auftreten, ist von einer funktionierenden DNA-damage response (DDR) auszugehen. Tumorsuppressoren wie p53 können vermehrte DNA-Schäden nach TRIP6-Knockdown erkennen und in Zellzyklusarrest und Apoptose umsetzen. Die in dieser Arbeit erhobenen Daten zur verminderten Klonogenität nach TRIP6Knockdown wurden in einer kooperierenden Arbeitsgruppe in einem Mausmodell weiter untersucht und der Effekt des induzierten TRIP6-Knockdowns auf Wachstum und Metastasierung von EFT-Zellen nach Injektion in die Schwanzvene von immundefizienten Mäusen verifiziert. Es zeigte sich sowohl eine verminderte Tumorigenität (also ein vermindertes Wachstum der Primärtumoren) in Abwesenheit von TRIP6 als auch eine verminderte hepatische Metastasierung (Grunewald et al., 2013). Dieses wichtige in vivo Ergebnis belegt, dass TRIP6 sowohl für Wachstum als auch Metastasierung von EFT-Zellen eine wichtige Rolle spielt. 76 4. Diskussion Eine weitere Bestätigung für diesen Sachverhalt zeigte sich in Experimenten zur zellulären Migration. In der vorgelegten Arbeit wurde nach TRIP6-Knockdown eine signifikant verminderte Migration um etwa 20% beobachtet. In der vorhandenen Literatur zur Funktion von TRIP6 hinsichtlich der zellulären Migration wurden unterschiedliche Effekte beschrieben: So hemmt TRIP6 in humanen Lungen- und Epidermoidkarzinomen sowie in murinen embryonalen Fibroblasten die Migration (Gur’ianova et al., 2005; Yi and Beckerle, 1998). In Ovarialkarzinomen und Zervixkarzinomen zeigte TRIP6, wie in der vorliegenden Arbeit, promigratorische Eigenschaften (Bai et al., 2007; Xu et al., 2004). Weiterführende Experimente in der kollaborierenden Arbeitsgruppe konnten ebenfalls eine verminderte zelluläre Invasion, also die Kombination aus ECM-Abbau und Migration, nach TRIP6-Knockdown belegen (Grunewald et al., 2013). 4.1.2 TRIP6 als Kotranskriptionsfaktor TRIP6 wirkt, neben seiner Funktion als Linker-Protein bei der Organisation von Zytoskelett und Signaltransduktion, auch als Kotranskriptionsfaktor (Willier et al., 2011). Aus diesem Grund wurde in der vorgelegten Arbeit auch der Effekt eines TRIP6-Knockdowns auf das Transkriptom von Ewing-Sarkom-Zellen und auf einzelne, ausgewählte Transkripte untersucht. Hier zeigte sich ein Einfluss auf eine Vielzahl von in Tumoren pathogenetisch relevanten Gensets in der Gene Set Enrichment Analysis (vgl. Kapitel 3.1.1). Ebenfalls konnte eine verminderte Expression der Proteine Radixin, CRYZ und CD164 nach TRIP6-Knockdown gezeigt werden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass TRIP6 seine Funktion in der Pathogenese der ESFT mindestens teilweise durch seine Funktion als Kotranskriptionsfaktor dieser Gene entfaltet. Da ein TRIP6-Knockdown mit einer markant verminderten zellulären Klonogenität einhergeht, wurde der Effekt von wiederholtem transienten Knockdown dieser drei Gene auf die Klonogenität untersucht. Dies erbrachte allerdings keine klaren Ergebnisse. Einerseits kam es zu keinem befriedigenden Knockdown des Proteins CD164 (s. Abbildung 36). Andererseits kam es durch Knockdown von Radixin und CRYZ nicht in allen Zelllinien zu einer verminderten Klonogenität. Betrachtet man jedoch einzelne Zelllinien, so lassen sich durchaus signifikante Effekte nach dem spezifischen Knockdown beobachten. So kommt es etwa durch den Knockdown von 77 4. Diskussion CRYZ in der SB-KMS-KS1-Zelllinie zu einer signifikanten Verminderung der Klonogenität; dasselbe gilt bei einem guten Knockdown von Radixin in SK-N-MC-Zellen (s. Abbildung 38). Diese Ergebnisse lassen sich meines Erachtens am ehesten dahingehend interpretieren, dass die verminderte Fähigkeit von EFT-Zelllinien zur Bildung von Kolonien auch über die Funktion von TRIP6 als Transkriptionsfaktor mediiert wird. Die erwähnten Proteine spielen hier sicherlich eine Rolle, wobei diese von der betrachteten EFT-Zelllinie abhängig ist; im Gegensatz hierzu legt die funktionelle Relevanz von TRIP6 in allen EFTZelllinien diesem Protein eine universale Rolle in EFT nahe. Um hier mehr Klarheit zu schaffen, müsste untersucht werden, ob die Transkriptionfaktoren, deren Funktion durch TRIP6 beeinflusst wird (wie etwa der Glukokortikoidrezeptor oder NFκB, s. Kapitel 1.2.3), im Promoterbereich etwa der drei erwähnten Gene binden können. Sollte das der Fall sein, ließe sich durch ChromatinImmunpräzipitation-Experimente klären, ob erwähnte Transkriptionsfaktoren, und letztlich auch TRIP6, im Bereich der Promotoren nachweisbar ist. Ein interessantes Beispiel für ein Genset, dessen Expression durch TRIP6 reguliert wird, ist das Genset „KANG_DOXORUBICIN_RESISTANCE“ (s. Abbildung 24). Dieses Genset wurde 2004 beschrieben und enthält 19 Gene, deren Transkripte in Magenkarzinomzelllinien mit multipler Chemoresistenz (gegen 5-Fluorouracil, Cisplatin und Doxorubicin) im Vergleich zu nicht-resistenten Magenkarzinomzelllinien vermehrt vorliegen (Kang et al., 2004); TRIP6 selbst ist in diesem Genset nicht enthalten. Nach TRIP6-Knockdown wird dieses Genset jedoch vermindert exprimiert. Da Doxorubicin fester Bestandteil der Standardprotokolle zur EFTBehandlung darstellt, wurde in einer kollaborierenden Arbeitsgruppe untersucht, ob EFTZellen nach TRIP6-Knockdown besser durch Doxorubicin zu eliminieren sind. Es ergab sich in den Experimenten kein Anhalt für einen auf Doxorubicin sensitivierenden Effekt nach TRIP6Knockdown (nicht publizierte Daten). Ein weiterer Hinweis für eine Rolle von TRIP6 für die Resistenz gegen klassische Chemotherapeutika wurde kürzlich beschrieben: mittels 2D-Proteinelektrophorese und Massenspektrometrie wurden Proteine identifiziert, die in gegen das Spindelgift Paxlitaxel resistenten MCF-7 Mammakarzinomzellen im Vergleich zu nicht-resistenten Zellen unterschiedlich exprimiert werden. TRIP6 wird als einziges der drei identifizierten Proteine vermehrt in resistenten Zellen exprimiert und findet sich dort um 650% überexprimiert 78 4. Diskussion (Pavlíková et al., 2014). Ein Knockdown von TRIP6 in diesen Zellen führte zu einem verminderten Wachstum von resistenten Zellen. Da sich im Rahmen dieser Arbeit kein Effekt eines TRIP6-Knockdowns auf die Effektivität einer Doxorubicintherapie in vitro ergab, wäre es interessant in weiteren Studien zu untersuchen, welche Transkripte in gegen das Chemotherapeutikum resistenten EFT-Zellen differentiell exprimiert werden. 4.1.3 TRIP6 und LPAR2 in EFT Wie in Kapitel 1.2 erwähnt, spielt der LPA-Rezeptor LPAR2 eine zentrale Rolle im Signalnetzwerk von TRIP6. Im Sinne einer Aktivierung von TRIP6 kommt es zu einer Phosphorylierung von TRIP6 an Tyrosin-55 durch die Kinase Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src; dagegen kommt es durch die Phosphatase Tyrosine-protein phosphatase nonreceptor type 13 hier zu einer deaktivierenden Dephosphorylierung (Lai et al., 2007). Die Expression von LPAR2-Rezeptoren in unterschiedlichen EFT-Zelllinien wurde bereits beschrieben (Schmiedel et al., 2011). Zusätzlich wurde das Enzym Membraneassociated phospholipase A1 beta (LIPI), ein LPA-generierendes Enzym, 2008 als EFTspezifischer Marker identifiziert. Dieses Protein konnte sonst nur noch in geringen Mengen in Schilddrüse und Hoden nachgewiesen werden (Foell et al., 2008). Aus diesem Grund versuchten wir die bereits bekannte Interaktion von LPA-Signalling und TRIP6 in EFT zu bestätigen. In Untersuchungen mit einem eigens hierfür entwickelten phospho-Y55Antikörper gelang es unserer Arbeitsgruppe jedoch nicht, die Abhängigkeit von phospho-Y55TRIP6 von der extrazellulären LPA-Konzentration nachzuweisen. Der Nachweis hätte eine Grundlage für die Evaluation des Protein-Netzwerkes von LIPI über LPA, LPAR2, Src, TRIP6 und PTPN13 in EFT dargestellt. 4.2 Ausblick und Perspektiven Trotz intensiver Forschung zu neuen therapeutischen Möglichkeiten der Behandlung von EFT hat bis jetzt kein gezielter Therapieansatz Einzug in die Behandlungsprotokolle gefunden. Auch die neuesten vielversprechenden in vitro und in vivo Ergebnisse mit PARP-Inhibitoren, welche im Jahre 2012 viel Hoffnung erweckten, konnten daran bisher nichts ändern. 79 4. Diskussion Einen entscheidenden Schritt vorwärts in der Behandlung von EFT könnte der neu identifizierte Einfluss von TRIP6 auf die Klonogenität dieser Tumorzellen bringen. Durch die Möglichkeit über TRIP6 die Fähigkeit der Zellen zur Migration und Invasion zu beeinflussen, erweist sich das Protein als ein wichtiger korrektiver Faktor in EFT. Diese Erkenntnis eröffnet die Möglichkeit einer diagnostischen oder therapeutischen Nutzung. Aktuelle Therapieprotokolle differenzieren lediglich aufgrund des wichtigsten prognostischen Markers „Vorliegen von Metastasen“ zwischen lokalisiertem und metastasiertem Befund. Zwei dringende Fragen könnten mit neuen, prädiktiven Markern beantwortet werden: Welche Patienten mit lokalisiertem Befund sind nach einer Standardtherapie gefährdet, ein Rezidiv zu erleiden? Welche Patienten mit Metastasen sind durch konventionelle Therapie heilbar? Abbildung 39: Expression von TRIP6 in EFT mit lokalem Rezidiv, ohne lokales Rezidiv und in EFT-Metastasen. Die Expressionsdaten wurden von der Datenbank Gene Expression Omnibus unter der Bezeichnung GSE12102 bezogen. 2009 wurde eine Studie publiziert, in welcher Microarray-Experimente bei EFTPrimarien durchgeführt wurden und diese Expressionsprofile mit dem Verlauf der Erkrankung korreliert wurde (Scotlandi et al., 2009). Von 37 EFT-Patienten entwickelten 17 ein lokales Rezidiv innerhalb von drei Jahren, während 13 Patienten kein Rezidiv zeigten. Zudem wurden sieben Proben von Metastasen analysiert. TRIP6 fand sich in dieser Arbeit nicht unter den sechs Transkripten, die den größten Unterschied in Bezug auf die Expression in der RezidivGruppe, verglichen mit der Gruppe ohne Rezidiv, aufwiesen. Abbildung 39 zeigt jedoch, dass TRIP6 in den Patienten, die im Beobachtungszeitraum kein Rezidiv entwickelten, weniger stark exprimiert wird als in den beiden anderen Gruppen 80 4. Diskussion (also lokales Rezidiv und Metastase, p-Werte 0,061 respektive 0,034). Die beiden Gruppen „lokales Rezidiv“ und „Metastase“ lassen sich anhand der TRIP6-Expression nicht unterscheiden. Dieses Ergebnis spiegelt auch die Befunde der Studie wieder, die ebenfalls keinen Unterschied in der Transkriptionssignatur der beiden letzteren Gruppen beobachten konnte, während das Patientenkollektiv ohne Rezidiv von diesen beiden Gruppen durch hierarisches Clustering zu trennen war (Scotlandi et al., 2009). Dieser Befund unterstreicht damit die funktionelle Relevanz von TRIP6 in EFT und eine mögliche Nutzung des Proteins als Biomarker. Sollte sich hier die Vermutung verfestigen, dass TRIP6 als klinischer Biomarker in EFT in Frage kommt, sind folgende Kriterien für onkologische Biomarker zu berücksichtigen: Die Expression von TRIP6 muss mit einem eindeutig erhöhten Risiko einhergehen, etwa bei lokalisiertem Befund durch Standardtherapie ein Rezidiv zu erleiden. Diese Erkenntnis könnte dazu genutzt werden, EFT-Patienten mit hoher TRIP6Expression einer erweiterten, experimentellen Therapie zuzuführen. Zusätzlich muss ein Biomarker effizient und kosteneffektiv bestimmbar sein, Proben und die technologische Methodik müssen einfach verfügbar sein (Hodgson et al., 2009). Da endgültige EFT-Diagnosen immer anhand von Material ex vivo gestellt werden, ist Material in der Regel vorhanden; die anderen Kriterien treffen bei einer immunhistologischen Färbung ebenfalls zu. Eine weitere Möglichkeit in der EFT-Diagnostik ist es, ein Set von Markern zur Risikostratifizierung einzusetzen. Mehrere Proteine werden hierfür bereits experimentell evaluiert; es liegen bereits vielversprechende Ergebnisse für die Proteine Twist-related protein 1 und Platelet-derived growth factor receptor alpha sowie für Microsomal Glutathione STransferase 1 vor (Choo and Yang, 2014; Scotlandi et al., 2009). TRIP6 wäre ein weiterer Kandidat. Die Tatsache, dass TRIP6 durch den chimären Transkriptionsfaktor EWS-FLI1 nicht induziert wird, obwohl dieser nach heutiger Erkenntnis der entscheidende Mechanismus in der Pathogenese der EFT darstellt, spricht allerdings eher gegen TRIP6 als Zielstruktur einer spezifischen Therapie. Auch stellt sich die Frage, wie die Aktivität von TRIP6 in EFT therapeutisch inhibiert werden kann, da eine klinische RNA-Interferenz-Therapie bislang nicht ohne weiteres möglich ist, auch wenn auf RNA-Interferenz basierende Therapien im onkologischen Kontext durchaus schon in klinischen Phase-1-Studien erprobt werden (Wu et al., 2014). Eine weitere Möglichkeit stellt die Entwicklung eines Antikörpers gegen TRIP6 dar, was jedoch, wie bereits 81 4. Diskussion erwähnt, in Anbetracht der ubiquitären Expression von TRIP6 in humanem Gewebe keine hochspezifische Therapieoption darstellt; zudem ist TRIP6 als intrazelluläres Molekül für Antikörper nur schwer zugänglich. Dasselbe Problem stellt sich bei der Entwicklung eines small molecule als Inhibitor der Funktion von TRIP6; außerdem stellt sich hier die Frage, an welcher molekularen Struktur dieser Inhibitor ansetzen sollte. Typischerweise entfalten diese small molecules, welche aufgrund des geringen molekularen Gewichtes von unter 900kDa durch Diffusion intrazellulär wirken können und eine hohe Bioverfügbarkeit aufweisen, ihre Wirkung an Rezeptoren oder Enzymen. Zwar weist TRIP6 keine bekannte enzymatische Funktion auf und ist auch kein Rezeptor, trotzdem kann durch die Inhibierung von Protein-Protein-Interaktionen in das Signalnetzwert eingegriffen werden. So wurde etwa auch (S)-YK-4-279 als ein Inhibitor der Interaktion von RNA-Helikase A (s. Kapitel 1.1) mit EWS-FLI1, beschrieben, welcher in einem EFT-Xenograft-System in Ratten zu einer kompletten Remission in 2 von 6 Fällen führt (Hong et al., 2014). Auch EWS-FLI1 wurde bis vor kurzem zu den nicht zu inhibierenden Proteinen gezählt. Aktuell werden, wie eingangs erwähnt, viele unterschiedliche Proteine als Zielstrukturen in klinischen Studien evaluiert. Die beeindruckenden in vitro Ergebnisse zu PARP-Inhibitoren lassen hoffen, dass die Studien zur Kombinationstherapien von Temolozemid und PARP-Inhibitoren wie Olaparib und Niraparib diese Ergebnisse widerspiegeln werden. Die Ergebnisse vieler Studien zeigten, dass trotz der einheitlichen, chromosomalen Translokation individuelle Therapieoptionen notwendig sind. So war die Effektivität von Figitumumab, einem Antikörper gegen IGFR1, maßgeblich von dem vor Therapiebeginn vorliegendem IGF-1 Serumspiegel abhängig. Insgesamt wurde in einer Phase-II Studie eine moderate Aktivität beobachtet (14% teilweises Ansprechen, 25% stabiler Befund; Juergens et al., 2011). In einer instruktiven Studie aus dem Jahr 2011 konnte anhand von zwei Fällen gezeigt werden, dass nach initialem Ansprechen auf IGFR1-Inhibitoren die kompensatorische Hochregulierung von anderen Signalwegen zu einer Resistenz führen kann. Die Analysen des Proteoms ergab eine Aktivierung des mTOR-Signalwegs; eine Hemmung dieses Signalweges führte zu einer kompletten Remission in beiden Patienten (Subbiah et al., 2011). Diese eindrucksvolle Studie untermauert die These, dass jeder EFT-Patient eine individualisierte Therapie benötigt. 82 5. Zusammenfassung Das Ewing-Sarkom (EFT) ist nach dem Osteosarkom das zweihäufigste Knochen-assoziierte Malignom im Kindesalter. Das entscheidende Ereignis in der Pathogenese dieser Entität stellt eine chromosomale Translokation dar, welche zur Entstehung eines chimären Transkriptionsfaktors, meist EWS-FLI1, führt. Unsere Absicht war es, die Mechanismen zu verstehen, die letztlich zur Metastasierung von Ewing-Sarkomen mit der damit verbundenen, infausten Prognose führen. Die Mitglieder der Zyxin-Proteinfamilie sind in vielfältige zelluläre Funktionen involviert. Hierbei nehmen sie, teilweise funktionell redundant, Einfluss auf zytoplasmatische und nukleäre Prozesse. Durch Analyse von öffentlich verfügbaren Microarraydaten konnten wir belegen, dass lediglich das Protein TRIP6 (thyroid receptor interacting protein 6) aus der Familie in EFT deutlich überexprimiert ist. Dieses Protein ist, neben seiner Funktion in der Organisation des Zytoskeletts, auch nukleär als Kotranskriptionsfaktor und als Element der Telomerprotektion tätig. Vielfach wurde eine Implikation des multifunktionellen Adaptorproteins in maligne Prozesse dokumentiert. Die Überexpression von TRIP6 in EFT ist jedoch unabhängig von EWS-FLI1. Eine Bindung von EWS-FLI1 an eine putative Bindungsstelle im Promotor von TRIP6 konnte nicht nachgewiesen werden. Die Analyse von Microarrays nach TRIP6-Knockdown in EFT-Zelllinien identifizierte mehrere Gensets, welche mit Proliferation und Invasivität assoziiert sind und die nach TRIP6Knockdown vermindert exprimiert werden. Die für Malignome pathogenetisch relevanten Zielgene Radixin, CD164 und CRYZ konnten als Zielgene des Kotranskriptionsfaktors TRIP6 durch qRT-PCR und Western Blot bestätigt werden. Durch RNA-Interferenz-mediierte Verminderung der Proteinmenge von TRIP6 in EFT kam es zu einer deutlich reduzierten Klonogenität und Migration der Zellen in vitro. Nach induzierbarem TRIP6-Knockdown konnte eine verminderte Tumorigenität und hepatische Metastasierung von hierfür generierten EFTEinzelzellklonen in vivo beobachtet werden. Zusammengefasst deuten diese Daten auf eine Rolle von TRIP6 in der Pathogenese der EFT und insbesondere beim Prozess der Metastasierung hin. Somit legen diese Ergebnisse eine weitere Evaluierung von TRIP6 als Biomarker oder molekulare Zielstruktur für therapeutische Ansätze in EFT nahe. 83 6. Bibliografie Abaan, O.D., Levenson, A., Khan, O., Furth, P.A., Uren, A., and Toretsky, J.A. (2005). PTPL1 is a direct transcriptional target of EWS-FLI1 and modulates Ewing’s Sarcoma tumorigenesis. Oncogene 24, 2715–2722. Amaral, A.T., Manara, M.C., Berghuis, D., Ordóñez, J.L., Biscuola, M., Lopez-García, M.A., Osuna, D., Lucarelli, E., Alviano, F., Lankester, A., et al. (2014). Characterization of human mesenchymal stem cells from ewing sarcoma patients. Pathogenetic implications. PloS One 9, e85814. 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Appendix 7.1 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Etwa 90 % aller Tumoren der Ewing-Sarkom-Familie zeigen die chromosomale Translokation t(11;22)(q24;q12). ............................................................................................. 4 Abbildung 2: Expression von TRIP6 in unterschiedlichen Geweben ............................................. 11 Abbildung 3: Darstellung des TRIP6-kodierenden genomischen Abschnittes, der TRIP6 mRNA sowie der Struktur des Proteins TRIP6................................................................................... 12 Abbildung 4: Vereinfachte Darstellung wesentlicher Signalwege von TRIP6. .............................. 16 Abbildung 5: Relative Expression der Mitglieder der Zyxin-Proteinfamilie in pädiatrischen Malignomen. .......................................................................................................................... 21 Abbildung 6: Übersicht über die im Rahmen des Projektes durchgeführten Experimente.......... 33 Abbildung 7: Vergleich der adhärenten und der solubilisierten Methode der transienten Transfektion in A673-Zellen. .................................................................................................. 36 Abbildung 8: Optimierung der genutzten Reagenzien bei der transienten Transfektion............. 37 Abbildung 9: Der zur stabilen Transfektion von A673 und SK-N-MC genutzte pTRIPZ-Vektor..... 38 Abbildung 10: Überprüfung einer erfolgreichen Transfektion von A673-Zellen durch Bewertung des Effektes von 1,0 µg/ml Doxycyclin auf die Expression von TRIP6. .................................. 39 Abbildung 11: Fluoreszenzaufnahme zur Überprüfung einer erfolgreichen Transfektion von A673Zellen mit sh(nonsi) und spezifischer shRNA gegen TRIP6. ................................................... 39 Abbildung 12: PageRuler™ Prestained Protein Ladder von ThermoFisher Scientific ................... 41 Abbildung 13: Ponceau-Färbung zur Ladungskontrolle bei Western Blot. ................................... 42 Abbildung 14: Schema des Vorversuches bei den Adhäsionsassays. ........................................... 46 Abbildung 15: Relative Adhäsion von wt A673- und SK-N-MC-Zellen. ......................................... 46 Abbildung 16: Schema eines Adhäsionsassays mit der CellTiterGlo® Methode. .......................... 47 Abbildung 17: Aufgeschraubte, wiederverwendbare Transwell-Kammer.................................... 48 Abbildung 18: Zusammengeschraubte, wiederverwendbare Transwellkammer. ........................ 49 Abbildung 19: Schema eines Colony Forming Assays. .................................................................. 51 Abbildung 20: Eingescannte 12-Well-Platte zur Auswertung der Colony Forming Assays. .......... 52 Abbildung 21: Expression von TRIP6 vor und nach EWS-FLI1-Knockdown. .................................. 55 Abbildung 22: Expression von TRIP6 nach ektoper Expression von EWS-FLI1 in humanen mesenchymalen Progenitorzellen. ........................................................................................ 56 Abbildung 23: Übersicht über das Ergebnis der Gene Set Enrichment Analyse............................ 57 Abbildung 24: Der Knockdown von TRIP6 geht mit einer negativen Regulation einer Vielzahl von Gensets einher, welche in metastatischen Malignomen beschrieben wurden oder als proproliferativ gelten.. ................................................................................................................ 58 97 7. Appendix Abbildung 25: Der Knockdown von TRIP6 hat keinen signifikanten Effekt auf die Transkripte von UIMC1 und SLC39A10 in A673- und SK-N-MC-Zellen. ........................................................... 60 Abbildung 26: Immunfluoreszenz mit TRIP6-Antikörper in A673-Zellen. ..................................... 61 Abbildung 27: Western Blot mit Nachweis des Knockdown von TRIP6 bei Durchführung der Versuche zur Proliferation. .................................................................................................... 62 Abbildung 28: Der Knockdown von TRIP6 führt zu keiner signifikanten Verminderung der Proliferation in EFT-Zelllinien ................................................................................................. 62 Abbildung 29: Western Blot zur Kontrolle des effektiven Knockdown von TRIP6 in A673- und SKN-MC-Zellen bei den Adhäsionsversuchen. ........................................................................... 63 Abbildung 30: Der Knockdown von TRIP6 führt zu keiner einheitlichen Veränderung der Fähigkeit zur Adhäsion von EFT-Zellen. ................................................................................................. 63 Abbildung 31: Western Blot mit Darstellung eines effektiven Knockdowns von TRIP6 im Rahmen der Versuche zur Migration. .................................................................................................. 64 Abbildung 32: Die Migration von A673- und SK-N-MC-Zellen wird durch TRIP6-Knockdown signifikant vermindert. ........................................................................................................... 65 Abbildung 33: Testung unterschiedlicher Konzentrationen von Doxycyclin zur Induktion des TRIP6-Knockdowns................................................................................................................. 66 Abbildung 34: Der Effekt eines TRIP6-Knockdowns auf die Klonogenität. ................................... 67 Abbildung 35: Knockdown von TRIP6 geht mit einer Veränderung der Proteinmenge von Radixin, CD164 und CRYZ einher. ........................................................................................................ 68 Abbildung 36: Western Blots im Rahmen der Colony Forming Assays nach transienter Transfektion mit siRNA-Konstrukten gegen TRIP6, Radixin, CD164 und CRYX in drei unterschiedlichen Zelllinien. ................................................................................................................................ 69 Abbildung 37: Densitometrische Quantifizierung der Knockdowns der Proteine TRIP6, Radixin, CD164 und CRYZ in drei unterschiedlichen EFT-Zelllinien. .................................................... 69 Abbildung 38: Relative Klonogenität von drei unterschiedlichen Zelllinien nach transienter Transfektion durch siRNA-Konstrukte gegen TRIP6, Radixin, CD164 und CRYZ. ................... 70 Abbildung 39: Expression von TRIP6 in EFT mit lokalem Rezidiv, ohne lokales Rezidiv und in EFTMetastasen. ........................................................................................................................... 80 98 7.2 Abkürzungsverzeichnis µl Mikroliter Akt RAC-alpha serine/threonine-protein kinase AS Aminosäure bp Basenpaare CAV1 Caveolin-1 CD164 CD164 molecule, sialomucin CD99 CD99 antigen Cdk6 Cyclin-dependent kinase 6 CNV (copy number variation), Kopienzahlvariation CRYZ Crystalline zeta EFPs Ewing sarcoma oncogene fusion proteins EFT Ewing sarcoma family tumors ES Enrichment Score ESFT Ewing sarcoma family of tumors ETS E-twenty-six EWS Ewing sarcoma oncogene EWSR1 Ewing sarcoma breakpoint region 1 FDR False Discovery Rate FLI1 Friend leukemia integration 1 transcription factor GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GR Glukokortikoidrezeptor hEF1 Enhancer of filamentation 1 hEGF Human epithelial growth factor HNK1 HNK-1 sulfotransferase IGF-1 Insulin-like growth factor 1 IGF1R Insulin-like growth factor 1 receptor IGFBP-3 Insulin-like growth factor binding protein 3 IL-1 Interleukin 1 LIM Lin11, Isl-1 und Mec-3 99 7. Appendix LIMD1 Lim domain containing protein 1 LPAR2 Lysophosphatidic acid receptor 2 LPP Lipoma preferred partner MAGI-1b Membrane-associated guanylate kinase with inverted domain structure 1b MDCK Madin–Darby canine kidney cells MDCK Madin Darby canine kidney Mdm2 Mouse double minute 2 homolog ml Mililiter MSC Mesenchymal stem cell mTOR mammalian target of rapamycin NES Nuclear export signal NES Normalisierter Enrichment Score NFκB Nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells nonsi Non-silencing NSC Neuronale Stammzelle OIP1 Opa-interacting protein 1 p21 Cyclin-dependent kinase inhibitor 1 p27Kip1 Cyclin-dependent kinase inhibitor 1B P53 Cellular tumor antigen p53 PDZ Post-synaptic density protein (PSD95), Drosophila disc large tumor suppressor (Dlg1) and zonula occludens-1 protein (ZO-1) PNET Primitiver Neuroektodermaler Tumor POT1 Protection of telomeres protein 1 pPNET Peripherer Primitiver Neuroektodermaler Tumor PTPN-13 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 13 qRT-PCR Quantitative Real-Time Poly Chain Reaction RHA RNA Helicase A RT Raumtemperatur SBRCT Small blue round cell tumors SCRIB Protein scribble homolog sh Short hairpin 100 7. Appendix si Small interfering SLC39A10 solute carrier family 39, member 10 SrfH Secreted effector protein SseI TAD Transactivation domain THRAP3 Thyroid hormone receptor-associated protein 3 TLR2 Toll-like receptor 2 TNF Tumor necrosis factor TRIP6 Thyroid interacting protein 6 UIMC1 Ubiquitin interaction motif containing 1 Wnt-Signalweg Wingless and Int-1 WTIP WT1-interacting protein ZRP-1 Zyxin-related protein 1 101 Danksagung Ich möchte allen, die mir den Einstieg in das wissenschaftliche Arbeiten im Rahmen dieser Dissertation ermöglicht haben, ganz herzlich danken. An erster Stelle ist hier Frau Prof. Dr. rer. nat. Elke Butt zu nennen, der ich für die Überlassung dieses hochinteressanten Themas aber auch für die herzliche Aufnahme in ihre Arbeitsgruppe sehr dankbar bin. Im Laufe der vergangenen Jahre bis zum jetzigen Zeitpunkt unterstützte sie mich stets hochprofessionell und freundlich bei den vielen Fragen, die sich dem Neuling in der biomedizinischen Forschung stellen. Von ihrer Erfahrung aber auch von der Freiheit, die sie mir während meiner Zeit im Labor gewährte, konnte ich sehr profitieren. Herr Dr. Dr. Thomas Grünewald war mir in den vergangenen Jahren ein weiterer wichtiger Mentor; in zahlreichen und langen Gesprächen nahm er sich stets Zeit für meine Fragen. Seine wegweisenden und kreativen Ideen waren außerordentlich bereichernd für diese Arbeit. Auch das Praktikum, welches er mir am Institut Curie ermöglichte, zeigte mir neue Aspekte der Forschung zu Ewing-Sarkomen in einem weltweit führenden Labor. Frau Petra Thalheimer unterstützte mich jederzeit nicht nur bei technischen Herausforderungen, wofür ich mich von ganzem Herzen bedanken möchte. Frau Dr. Cora Reiß und Herrn Martin Orth danke ich für die Herstellung der sh-Transfektanden und all die spannenden Gespräche im Büro, beim Mittagessen oder im Labor. Während der Jahre des experimentellen Arbeitens im Labor habe ich mich dort stets gerne aufgehalten; es waren vor allem die liebenswerten und intelligenten Menschen, die das Haus Auvera zu einem besonderen Ort machten. Ich möchte zudem der Medizinischen Fakultät der Universität Würzburg für das Promotionsstipendium danken, welches mir gewährt wurde. Ohne diese Förderung wäre es mir nicht möglich gewesen, mich dieser Arbeit in der erforderlichen Weise zu widmen. Ohne die stete Unterstützung und Begleitung meiner lieben Eltern wären diese Dissertation und das gesamte Medizinstudium für mich nicht möglich gewesen. Für Korrektur von Syntax und Semantik bedanke ich mich bei Frau Nicola und Marie Danner, von deren germanistischer Expertise diese Dissertation in höchstem Grade profitieren konnte. Herrn Alexander Axmann schließlich danke ich ausdrücklich für gewohnt stilsichere und versierte Hilfestellung hinsichtlich des Layouts. Curriculum Vitae Semjon Willier Geburtsdatum/ -ort 21.08.1988 in Stuttgart Familienstand ledig Konfession evangelisch Schule und Studium 05/2014 Zweiter Teil der Ärztlichen Prüfung; Note: 1,0 03/2012 - 07/2012 Studium an der Universität Caen (Frankreich) im Rahmen des ERASMUS-Programmes 10/2009 - 03/2013 Teilnahme an dem Begleitstudiengang „Experimentelle Medizin“ der Universität Würzburg; Gesamtnote 1,22 08/2009 Erster Teil der Ärztlichen Prüfung; Note 1,5 10/2007 Aufnahme des Studiums der Humanmedizin an der Universität Würzburg 06/2006 Erwerb der allgemeinen Hochschulreife am Karlsgymnasium Stuttgart; Note 1,5 München, den 09. Oktober 2015 (Semjon Manuel Willier)
