Testmethoden der Molekularpathologie im Vergleich

24.04.2013
Testmethoden der
Molekularpathologie
im Vergleich
Andreas Bösl (Feldkirch)
Gerlinde Winter (Graz)
Testmethoden der Molekularpathologie
PCR
• Fragmentanalyse
Gelelektrophorese, Kapillarelektrophorese
• Sequenzierung
Didesoxysequenzierung nach Sanger
Pyrosequenzieren
Next Generation Sequencing
• Mutationsanalytik
Restriktionsenzyme, HRM, ARMS-PCR…
Frühjahrstagung der ÖGP 18.04.2013
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24.04.2013
PCR
Polymerase
Chain
Reaction
• Denaturierung
• Annealing
• Elongation
Wahl der Testmethode:
• Verteilung der relevanten Mutationen
Hotspot-Mutation (BRAF) ↔ größere Zahl von Mutationen (KIT)
• Ausgangsmaterial: Operationspräparate, Biopsien
Ausbeute an DNA bei der Extraktion
• Anteil an Tumorzellen im Gewebe
Vorsicht bei weniger als 10% Tumorzellen!
• Möglichkeit der Tumorzellanreicherung
Manuelle Makrodissektion, Laser –Mikrodissektion
• Abdeckung des Testbereichs und Sensitivität des Tests
Frühjahrstagung der ÖGP 18.04.2013
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24.04.2013
Verteilung der relevanten Mutationen
Frühjahrstagung der ÖGP 18.04.2013
Verteilung der relevanten Mutationen
Frühjahrstagung der ÖGP 18.04.2013
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Verteilung der relevanten Mutationen
Hotspot – Mutationen
BRAF – Codon 600
NRAS – Codons 12/13, 61
Frühjahrstagung der ÖGP 18.04.2013
Verteilung der relevanten Mutationen
Große Zahl an Mutationen:
Substitutionen, Deletionen, Insertionen, Komplexe Mutationen
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Analyse von Mutationen - Didesoxysequenzieren
Punktmutationen:
GTT>GAT
c. 1676 T>A
p. V559D
missense mutation
Deletionen:
c. 1669_1674del6
p. W557_K558del
inframe deletion
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Analyse von Mutationen - Didesoxysequenzieren
Pyrosequenzieren
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Pyrosequenzieren
•
Eines der 4 Desoxyribonucleotidtriphosphate (dNTP) wird zugegeben
T T
T
T
T
T
T
T
•
Die DNA Polymerase baut dieses
Nukleotid im Anschluss an den
Sequenzierprimer in den Strang ein,
wenn das Nukleotid passt, d.h.
komplementär zum Gegenstrang ist.
•
Beim Einbau eines Nukleotids wird Pyrophosphat freigesetzt, das löst eine
Kaskade enzymatischer Reaktionen aus.
•
Am Ende der Kaskade wird Luciferin in Oxyluciferin umgewandelt, das als
Lichtblitz detektiert wird.
T
TT
T
TT
Analyse von Mutationen - Pyrosequenzieren
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Didesoxysequenzieren - Pyrosequenzieren
Methode
Reichweite
Sensitivität Limitierungen
Wichtig!
Didesoxy sequenzieren
in FFPE bis
~ 600nt
ca. 20%
Tuz.
Qualität der DNA (Fixierung) und
inhibierende Substanzen
(Melanin)
Doppelansätze
Pyro sequenzieren
ideal 30nt
max. 100nt
ca. 5%
Tuz.
Durch Enzym und Substrate und
auch durch Abbauprodukte der
Reaktion
Doppelansätze
Real-Time basierte Testsysteme…
• verschiedene kommerzielle Systeme
• verschiedene Testanbieter
• unterschiedliche Detektionsverfahren
• Scorpion-ARMS-Primer
• Taq-Man-Sonden, etc.)
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Real-Time basierte Testsysteme…
Signifikanter Anstieg der Fluoreszenz
(oberhalb der Grundfluoreszenz)
Quantification cycle (Cq)
Crossing point (Cp)
Threshold cycle (Ct)
Hohe Target-Konzentration
Frühe Fluoreszenzzunahme
niedriger Ct
Real-Time basierte Testsysteme…
Verschiedene Sonden- und Detektionsformate
Sequence-independent formats like SYBR Green I
Sequence specific detection formats
Hydrolysis Probes like Universal ProbeLibrary
Probes
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Real-Time basierte Testsysteme…
Sequence Independent Assay Format SYBR Green I
Hydrolysis Probe Format
Fluorescence is quenched
Fluorescence is not quenched
High Resolution Melting…
Wasserstoffbrückenbindungen
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High Resolution Melting…
Änderung des Schmelzverhaltens
Single Nucleotide Polymorphism (SNP´s) detektierbar
Abweichung 0,04°C (Software-gestützte Auswertung)
High Resolution Melting…
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High Resolution Melting…
wildtype
Software-basierte Darstellung des spezifischen Schmelzpunktes
High Resolution Melting…
42bp-Duplikation
Software-basierte Darstellung des spezifischen Schmelzpunktes
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High Resolution Melting…
wildtype
42bp-Duplikation
Software-basierte Darstellung des spezifischen Schmelzpunktes
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Ausblick…
• frühe Detektion von Tumoren in der Medizin
• wenig Tumorgewebe
• weitere Aufschlüsselung der Signalwege
• mehr zu bestimmende Gene/ Tumor
• hohe Anforderung an Personal und Detektionssysteme
Ausblick…
• Ersten Sequenzierungen in den 1970er (Belgien, Ghent)
• Frederick Sanger (UK, Cambridge) entwickelte 1975 die
Kettenabbruch-Methode (Sanger Methode)
• Seit 2005 gibt es die nächste Generation der Sequenzierung
(Roche/454 Pyrosequenzierung, Illumina/Solexa & Applied
Biosystems/SOLiD)
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Ausblick…
Sequencing by synthesis:
• Einzelsträngiges DNA Molekül
• ATP, TTP, CTP, GTP
• Polymerase: synthetisiert den Doppelstrang
Ausblick…
DNA Vorbereitung
Shotgun oder Amplikon
Emulsions-PCR
Klonale Amplifikation
Tag 1
Tag 1 & ü.N.
Pyrosequenzierung
1 DNA Fragment = 1 Bead = 1 Read
Vorbereitung Sequenzierung
Laden der Picotiter Platte
Tag 2
Datenausprozessierung und
Analyse
Ergebnisse als Flowgram
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Ausblick…
• Sequenzielles Fluten der
Picotiter Platte mit Basen
(TACG); 200x
• Komplementäre Nukleotide
generieren beim Einbau ein
Lichtsignal
• CCD Kamera erkennt
Lichtsignal
• Signalstärke ist proportional
zur Anzahl eingebauter
Nukleotide
Ausblick…
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Ausblick…
• Etablierte 454 Technologie:
Pyrosequenzierung
• >70.000 gelesene DNAStücke/Lauf
• Lange Leseweiten: 400-500
bp (in Entwicklung: 1000
bp)
• Durchsatz: ~ 35 Mio. bp
• Genauigkeit: 99,99%
• Bioinformatische Tools
Ausblick…
Vorteile:
• viele Gene können simultan analysiert werden
• geringer Verbrauch an Nukleinsäuren
• hohe Sensitivität und Spezifität
• breites Einsatzsmöglichkeit
• Feststellung von Genmutationen
• Analyse des Transkriptoms (RNA Sequenzierung),
um Genexpression zu bestimmen
• Crime Scene Investigation
• virale/bakterielle Diagnostik
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Ausblick…
Vorteile:
• Geringere Kosten durch den höheren Durchsatz
• Zeitersparnis
• Hohe Genauigkeit/Auflösung (klonale Amplifikation durch
hohe Coverage)
Ausblick…
Nachteile:
• Fehlende Automatisation verschiedener Arbeitschritte
• Personalbindung
• Anschaffungskosten
• Bioinformatik (zentrale Bedeutung)
• viele Informationen ohne momentane klinische Relevanz
( Panelentwicklung notwendig)
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Vielen Dank
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