Band 41

ZivilschutzForschung
Schriftenreihe der Schutzkommision beim Bundesminister des Innern
Herausgegeben vom Bundesverwaltungsamt – Zentralstelle für Zivilschutz –
im Auftrag des Bundesministerium des Innern
Neue Folge Band
41
W. König, A. Drynda, B. König,
R. Arnold, P. Wachtler, M. Köller
Einfluss von Zytokinen
und Lipidmediatoren auf die
Kontrolle und Regulation
spezifischer Infektabwehr
bei Brandverletzung
ISSN 0343-5164
ZIVILSCHUTZFORSCHUNG
Neue Folge Band 41
ZivilschutzForschung
Schriftenreihe der Schutzkommision beim Bundesminister des Innern
Herausgegeben vom Bundesverwaltungsamt – Zentralstelle für Zivilschutz –
im Auftrag des Bundesministerium des Innern
Neue Folge Band
41
W. König, A. Drynda, B. König,
R. Arnold, P. Wachtler, M. Köller
Einfluss von Zytokinen
und Lipidmediatoren auf die
Kontrolle und Regulation
spezifischer Infektabwehr
bei Brandverletzung
ISSN 0343-5164
Herausgeber: Bundesverwaltungsamt – Zentralstelle für Zivilschutz –
Deutschherrenstr. 93–95, 53177 Bonn
Telefon: (0 18 88) 3 58-0
Telefax: (0 18 88) 3 58-58 03
Internet: www.bundesverwaltungsamt.de
Die Arbeit gibt die Meinung der Autoren wieder. Sie stellt keine Äußerung des
Herausgebers dar und ist auch nicht als solche auszulegen.
© 2001 Bundesverwaltungsamt – Zentralstelle für Zivilschutz – Bonn
Satz und Druck: Druckhaus Dresden GmbH
4
Inhaltsverzeichnis
Einleitung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Kurze Darstellung zur Aufgabenstellung: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Voraussetzungen unter denen das Vorhaben durchgeführt wurde . . . . . . . 9
Planung und Ablauf des Vorhabens. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Wissenschaftlicher und technischer Stand. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
Zusammenarbeit mit anderen Stellen.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
Mikrobielle Pathogenität und Pathogenitätsfaktoren . . . . . . . . . . . . 13
Untersuchungen zu mikrobiellen Pathogenitätsfaktoren. . . . . . . . . . 15
Untersuchungen zum Staphylokokken Leukozidin. . . . . . . . . . . . . . 15
Pathogenitätsfaktoren von Pseudomonas aeruginosa . . . . . . . . . . . . 16
Untersuchungen zur Bedeutung mikrobieller Superantigene . . . . . . 18
Modulation der Immuneffektorreaktionen durch RSV
(Respiratory Syncytial Virus).. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
Zusammenfassung: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
Bedeutung von Pharmaka (Zytokine, lösliche Rezeptoren,
Antagonisten u.a.) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Bedeutung von Wachstumsfaktoren:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Untersuchungen zum PAF-Rezeptorantagonisten. . . . . . . . . . . . . . . 22
Zusammenfassung: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
Therapeutische Interventionen bei der traumabedingten
Immunparalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
Untersuchungen zum Einfluss von γ-Interferon beim Brandverletzten . . 23
Immunmodulation – Untersuchungen zur Immunmodulation
im Rahmen der Ernährungstherapie.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
Erfolgskontrollbericht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
Voraussichtlicher Nutzen, insbesondere Verwertbarkeit des
Ergebnisses und der Erfahrungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
Kurzfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
Die Autoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
Anhang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
5
Einleitung
Kurze Darstellung zur Aufgabenstellung:
Unter dem Thema „Einfluss von Zytokinen und Lipidmediatoren auf die Kontrolle und Regulation spezifischer Infektabwehr bei Brandverletzung“ wurde ein
theoretisch klinisches und klinisch-experimentelles Projekt gefördert. Aus
langjährigen Arbeiten wissen wir, dass die traumabedingte Immunparalyse, wie
sie z.B. bei Polytrauma oder bei der Brandverletzung auftritt, durch eine Dysbalance und u.U. durch ein Versagen der Mediatorkaskaden zustande kommt. Am
Beispiel der Brandverletzung wird dabei offensichtlich, dass nach einer Phase der
Kolonisierung entweder im Rahmen der Stabilisierung der Infektabwehr keine
mikrobielle Invasion stattfindet oder unter Zunahme des Pathogenitätserwerbs
von Mikroorganismen und Veränderung der Infektabwehr es zur mikrobiellen
Invasion kommt. Die Aufgabenstellung sollte deshalb mikrobielle Pathogenitätsfaktoren berücksichtigen, die die Immunparalyse einleiten und andererseits zellbiologische und immunologische Parameter erarbeiten, die die Immunparalyse
anzeigen. Daraus resultierend sollen dann diagnostische Kriterien erarbeitet werden, die als frühe Prädiktivmarker der Immunparalyse eingesetzt werden können.
Auf dem Boden der Erkenntnisse zur traumainduzierten Immunparalyse sollen
für die Zukunft neue therapeutische Ansätze erarbeitet werden. Die vorliegenden
Ergebnisse umfassen deshalb Arbeiten zur Validität von mikrobiellen Pathogenitätsfaktoren, wobei als Indikatorzellen die Immunzellen normaler Donoren eingesetzt wurden. Die Wechselwirkung dieser mikrobiellen Pathogenitätsfaktoren
mit den Zielzellen erlaubt es, anhand von zellbiologischen Charakteristika die
Aktivität der mikrobiellen Pathogenitätsfaktoren zu beurteilen. In einem weiteren
Ansatz wurden bekannte Stimulatoren eingesetzt und Zielzellen von Patienten
mit Brandverletzung, Polytrauma oder großflächigen operativen Eingriffen analysiert. Aus den erzielten Ergebnissen kommen wir zu neuen Erkenntnissen hinsichtlich der Pathogenität von mikrobiellen Exoprodukten, der Bedeutung von
inflammatorischen Mediatoren in der Regulation wie aber auch in der Paralyse
zellbiologischer Funktionen sowie zu neuen Denkkonzepten hinsichtlich therapeutischer Ansätze zur Vermeidung der Immunparalyse. Selbstverständlich
besteht auch für die Zukunft großer Forschungsbedarf.
7
Voraussetzungen unter denen das Vorhaben
durchgeführt wurde
Die Arbeitsgruppe für Infektabwehr (Leiter Prof. Dr. med. W. König) hat über
Jahre die zellbiologischen und immunologischen Voraussetzungen etabliert, um
die mikrobielle Pathogenität in der Wechselwirkung mit humanen Effektorzellen
zu quantifizieren und zu analysieren. So wurden die Mediatorkaskaden (Lipidmediatoranalyse, Zytokinanalyse, Adhäsinrezeptoren u.a.) in der Abteilung etabliert und in vielen Patientenstudien eingesetzt. Eine sehr enge Zusammenarbeit
hinsichtlich des Arbeitsprojektes war durch die Interaktion mit der Abteilung für
Plastische Chirurgie (Prof.Dr.med. Steinau), den Städtischen Krankenanstalten
Dortmund, Universitätsklinik Marienhospital Herne sowie der Universitätsklinik
Josefs-Hospital u.a. gegeben. Durch die Interaktion mit den klinischen Kollegen
der dortigen Abteilung wurde ein entsprechendes Krankengut zusammengestellt
und wesentliche Fragen hinsichtlich der Wechselwirkung mikrobieller Pathogenitätsfaktoren an immungestressten Effektorzellen analysiert. Fernerhin hatten
wir durch diese enge Verzahnung die Möglichkeit, neue Therapieansätze (Dipeptid, Eicosapentaensäure u.a.) in klinischen Studien zu analysieren. Im Rahmen
einer „Multicenterstudie“, wurde der Einfluss von (-Interferon auf die Reaktivierbarkeit von humanen Effektorzellen bei Brandverletzung analysiert. Als wesentlicher Marker der zellulären Reaktivität wurde die Expression von MHCII analysiert.
Planung und Ablauf des Vorhabens
Im Wesentlichen wurde das Vorhaben über zwei thematisch verzahnte Bereiche
durchgeführt; es hatte sich in der Vergangenheit erwiesen, dass eine moderne
Betrachtung zur klinischen Pathophysiologie der Immunparalyse z.B. der Brandverletzten nur dann getroffen werden kann, wenn gleichzeitig die dazugehörige
Grundlagenforschung aktiviert und gefördert wird. Aus diesem Grunde wurde
das Projekt zweigleisig angelegt:
a) zum einen wurde der Einfluss mikrobieller Pathogenitätsfaktoren an humanen
Immuneffektorzellen analysiert,
b) zum anderen wurde die Reaktivität humaner Immuneffektorzellen unter dem
Trauma analysiert.
Dies Vorgehen erwies sich als ausserordentlich vernünftig, da man die Reaktivität
normaler Immuneffektorzellen hinsichtlich unterschiedlicher Pathogenitätsfaktoren kennen muss um dann zu analysieren, inwieweit an verschiedenen Signaltransduktions- oder Schaltelementen hinsichtlich der Mediatorgenerierung, Produktion oder des Verhältnisses der Mediatoren untereinander bei immungestressten
Patienten ein Defizit, ein Überschießen oder ein Missverhältnis auftritt. Es war
also unser Ziel die Ergebnisse aus beiden Bereichen so abzurunden, dass wir diese basistheoretischen Ergebnisse für die Klinik verfügbar machen, um gleichermaßen eine Vertiefung des pathophysiologischen Wissens zu erreichen.
9
Infolge des dualen Ansatzes (klinisch-theoretisch, klinisch) wurden die Arbeiten
parallel zueinander vorangetrieben. Es wurden die klinisch-theoretischen Ansätze
an normalen Spenderzellen durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden normale Spender einbestellt, es wurde Blut (200 ml) entnommen. Nach bewährten Methoden
der Zellauftrennung wurden die Zellen isoliert und mit den mikrobiellen Pathogenitätsfaktoren, die in der Abteilung oder mit anderen Institutionen (national,
international) erarbeitet wurden, inkubiert. Die Auswertungen zu den erzielten
Resultaten (Lipidmediatoren, Zytokine, Lymphozyten, Funktionsanalysen u.a.)
wurden in der Arbeitsgruppe für Infektabwehr durchgeführt. Parallel zu diesen
Experimenten, die also stringent anhand der erhaltenen Ergebnisse weiterentwickelt wurden, waren wir auf die Spenderzellen aus den unterschiedlichen Kliniken angewiesen. Wenn diese Spender nach Rückkoppelung mit den Klinikern
in den Abteilungen vorlagen, wurde Blut im Rahmen der Routineuntersuchung
bei den Patienten entnommen und dann zur Arbeitsgruppe für Infektabwehr
gebracht. Bei einem Großteil der Patienten haben wir den Transfer der Proben
selber durchgeführt. Dies beinhaltete teilweise auch Fahrten von Bochum bis
Essen (Universitätsklinik) oder von Bochum nach Dortmund (Städt. Krankenanstalten).
Wissenschaftlicher und technischer Stand
Die Arbeitsgruppe für Infektabwehr besteht seit 1979. Sie untersteht einem Universitätsprofessor (Prof. Dr. med. W. König). Der wissenschaftliche und technische Stand ist voll gewährleistet und viele internationale Publikationen resultierten aus der vorliegenden Förderung. Hinsichtlich der verwendeten Fachliteratur,
Informations-, Dokumentationsdienste benutzen wir die moderne Kommunikation auf allen unseren Fachgebieten sowie insbesondere Kontakte zu internationalen
Wissenschaftlern durch Vorstellen der Resultate bei internationalen Konferenzen.
Aufgrund dieser langjährigen Interaktionen auf den vorliegenden Gebieten haben
wir Kooperationen mit Arbeitsgruppen in Europa sowie in den USA aufgebaut.
Zusammenarbeit mit anderen Stellen
Hier sind als erstes zu nennen die Universitätskliniken der Ruhr-Universität
Bochum, die Universitätsklinik in Essen, die Städtischen Krankenanstalten Dortmund; hinsichtlich der theoretisch-klinischen Arbeiten sind zu nennen die
Arbeitsgruppen aus den USA (Colorado, NIH), aus Europa (Institut Pasteur,
Paris, Institut für Mikrobiologie, Straßburg).
10
Ergebnisse
Einleitung
Die innovativen Erkenntnisse auf dem Gebiet der mikrobiellen Infektabwehr und
hier insbesondere zur Pathophysiologie der traumabedingten Immunsuppression
sind gekennzeichnet durch die vertieften Vorstellungen zu den unterschiedlichen
Mediatorkaskaden. Die inflammatorischen Effektorzellen, wie z.B. Neutrophile
bilden erste Abwehrbarrieren für Mikroorganismen. Mikroorganismen können
durch bakterielle Pathogenitätsfaktoren ihrerseits wie auch insbesondere durch
Exoprodukte (Toxine, Superantigene u.a.) die Reaktivität der Effektorzellen verändern. Unter den Immuneffektorzellen spielen nicht nur neutrophile Granulozyten, Monozyten sondern auch Entzündungszellen wie Basophile, Mastzellen
und Eosinophile eine bedeutsame Rolle. Die letzteren Zellen, die zunächst vornehmlich als relevant für allergische Reaktionen bekannt waren, spielen auch bei
traumainduzierten Immunreaktionen eine besondere Rolle. Nach Aktivierung von
Entzündungszellen über pseudoallergische Aktivatoren kommt es zur Freisetzung
vielfältiger Mediatoren. Die Freisetzung der Entzündungsmediatoren beeinflusst
wiederum den Reaktivitätserwerb im Rahmen der spezifischen Infektabwehr.
Die mikrobielle Infektabwehr ist gekennzeichnet durch die unspezifische sowie
durch die spezifische Infektabwehr. Träger der unspezifischen Infektabwehr sind
einerseits inflammatorische Immuneffektorzellen, Serumkomponenten, Zytokine
u.a.; Träger der spezifischen Infektabwehr sind Lymphozyten, die einerseits die
humorale oder die zellvermittelte Immunantwort einleiten; verknüpfende Komponenten für die unspezifische und spezifische Infektabwehr sind die vielfältigen
Entzündungsfaktoren. (Abb.1) In der Vergangenheit war den Lipidmediatoren
besondere Aufmerksamkeit geschenkt worden. Vielfältige aktivierende Stimuli
können rezeptorvermittelt oder nichtrezeptorvermittelt Zellen so stimulieren,
dass es über eine Phospholipaseaktivierung zu einer Translokation der 5-Lipoxygenase mit der Freisetzung von Leukotrienen kommt. Diese Mediatoren haben
chemotaktische und spasmogene Einwirkungen.
Nach neueren Arbeiten können Lipidmediatoren wiederum Zytokine in ihrer
Aktivität regulieren. Somit entsteht ein Konzept, dass verschiedene Mediatorkaskaden interagieren, teilweise synergistisch, additiv oder sogar antagonistisch
wirksam sind. (Abb.2) Mediatoren ihrerseits können wiederum andere Mediatoren freisetzen oder die Zelle „primen“, so dass ein exogener Stimulus nun zu
einer hyperreaktiven Freisetzung von Mediatoren führt. Viele Mediatoren führen
ihre zellbiologische Funktion durch rezeptorvermittelte Wechselwirkung aus.
Diese Rezeptoren können nach der Aktivierung von Zellen freigesetzt werden,
wie es z.B. für den Tumornekrosefaktor (TNF) gezeigt wird. Der Mediator für
sich hat ein duales Gesicht. Für die Homeoestase der Infektabwehr ist die balancierte Freisetzung unterschiedlicher Mediatorkaskaden notwendig. Eine zu starke
Freisetzung von Mediatoren könnte zu einer überschießenden Entzündung
führen. Ein Versagen der Mediatorkaskaden leitet die Immunparalyse ein. Unter
den neugenerierten Mediatoren – hier handelt es sich meistens um Peptide – gibt
es pro- und antiinflammatorische Mediatoren. (Tabellen 1,2,3)
11
Das Konzept, das Interleukine und Zytokine aus unterschiedlichen Vorläuferzellen stammen, hat zu einer didaktischen Einteilung hinsichtlich von Schutz und
Schaden geführt. Aufgrund unterschiedlicher Infektionsmodelle weiß man, dass
aus T-Helferzellen des Typs 1 die Zytokine IL-2 und Interferon-γ vornehmlich
gebildet werden. Diese Zytokine werden für die protektive Infektabwehr in der
Regel benötigt; aus T-Helferzellen des Typs 2 werden Zytokine wie IL-4, IL-5,
IL-13 freigesetzt. (Abb.3) Diese Zytokine haben im Rahmen der allergisch-entzündlichen Reaktion eine herausragende Bedeutung. Die Interleukine IL-4 und
IL-13 wirken als „Switch“-Faktoren bei der IgE-Synthese. Interleukin-5 hat darüber hinaus pleiotrope Funktionen und findet sich bei der mikrobiell induzierten
Immunsuppression von der Konzentration her erhöht. Viele dieser Mediatoren
haben also überlappende Funktionen und sind für unterschiedliche Krankheitsbilder bedeutsam. Interleukin-5 führt zur Eosinophilen Akkumulation, wie es bei
allergisch-entzündlichen Reaktionen aber auch beim ARDS und Polytrauma
gesehen wird. TH2-Zellen können nach ihrer Aktivierung auch Interleukin-10
wiederum freisetzen. Das Interleukin-10 supprimiert TH-1 vermittelte Zytokine
und favorisiert damit die TH-2-Zellentwicklung. Aus Makrophagen und NK-Zellen wird Interleukin-12 nach der Aktivierung gebildet. Interleukin-12 wiederum
induziert die Freisetzung von γ-Interferon. Somit findet sich für fast jede Mediatorkaskade ein aktivierender und gegenregulatorischer Bogen. Aufgrund dieser
komplexen Ergebnisse ist es also verständlich dass nach Eckpfeilern gesucht werden muss, um den Status der Infektabwehr genügend genau zu analysieren. Für
die hier vorliegenden Arbeiten hat es sich als günstig erwiesen, einerseits Zytokine wie Interleukin-1, Interleukin-6 zu studieren, das Chemotaxin Interleukin-8
als einen Vertreter der chemotaktischen Peptide, den Tumornekrosefaktor, der für
Schock-Sepsis verantwortlich gemacht wird, allerdings auch benefizielle Funktionen aufweist sowie Interleukin-4 und Interleukin-13, fernerhin die Zytokine
Interferon-γ und Interleukin-12. (Tabelle 4)
In den vergangenen Jahren hatten wir gezeigt, dass ein frühes Merkmal der verbrennungsinduzierten Immunsuppression wie auch beim ARDS darin besteht,
dass Immuneffektorzellen (Neutrophile) eine verminderte Freisetzung von chemotaktisch aktivem Leukotrien B4 zeigten. Der Neutrophile Granulozyt war in
seiner Reaktivität hinsichtlich der LTB4-Freisetzung weitestgehend inaktiviert.
Eine Reduktion von LTB4-Rezeptoren auf der Oberfläche der Neutrophilen wurde von uns beschrieben. Darüberhinaus konnten wir zeigen, dass im Vergleich
zur Überlebensgruppe bei Brandverletzten ein irreversibler Anstieg von Interleukin-6 vorlag. Hinsichtlich des Differenzierungsmarkers von B-Zellen (CD23)
zeigte sich im Verlauf der Brandverletzung (hier insbesondere vor der mikrobiellen Invasion) unter den Bedingungen von Schock und Sepsis eine Unfähigkeit
der B-Lymphozyten nach Interleukin-4-Zugabe eine CD23-Expression aufzuzeigen. Auf dem Boden der hier vorliegenden Erkenntnisse ist es also verständlich,
dass offenbar frühe zellbiologische Prädiktoren auftreten, die vor der mikrobiellen Invasion das Bild der drohenden Sepsis anzeigten. Die Entwicklung auf dem
Gebiet zur Pathophysiologie der traumabedingten Immunsuppression war durch
die Vielzahl der o.g. Zytokine erweitert worden. Neben der Wechselwirkung von
Zytokinen mit Immuneffektorzellen sowie Zellen der spezifischen Abwehr
kamen neue Ergebnisse zur Überlebenszeit von Zellen hinzu. Der Terminus der
12
„Apoptose (Zelltod)“ wurde geprägt. Ergebnisse aus der Grundlagenforschung
hatten gezeigt, dass eine DNA-Fragmentierung auftritt, die z.B. durch Toxine
unter nicht-toxischem Einfluss zustande kommt. Im Rahmen dieser Fragmentierung kommt es zu einer Abnahme der zellulären Leistung mit den entsprechenden zellulären Funktionen. Weiterführende Arbeiten konnten darüber hinaus
darlegen, dass die „Apoptose“ durch Zytokine wie GM-CSF und G-CSF weitestgehend aufgehoben wird. Daraus ergab sich, dass Wachstumsfaktoren u.U. die
Reaktivität von Immuneffektorzellen erhalten können.
Mikrobielle Pathogenität und Pathogenitätsfaktoren
In den vergangenen zwei Dekaden wurden enorme Fortschritte auf dem Gebiet
der Zell- und Molekularbiologie hinsichtlich der Entzündungsmediatoren und
ihrer pathophysiologischen Auswirkungen bei Infektionskrankheiten und immunpathologischen Stresssituationen erhoben. In diesem Zusammenhang kommt den
Lipidmediatoren sowie in den vergangenen zehn Jahren den Zytokinen eine
besondere Bedeutung zu. Die pathophysiologische Rolle der Zytokine wurde bei
vielen Infektionen anhand von Infektionsmodellen analysiert. Es konnte festgestellt werden, dass beim gramnegativen septischen Schock die Lipopolysaccharide offenbar eine bedeutende Rolle spielen. Die pathologischen Auswirkungen des
Endotoxinschocks wurden durch die Freisetzung von Interleukin-1, Interleukin-6
und des Tumornekrosefaktors erklärt. Diese Zytokine können wiederum andere
Mediatoren induzieren, wie z.B. Prostanoide sowie auch endotheliale Adhesionsmoleküle. Die Molekularbiologie zur Kenntnis der Adhäsionsmoleküle hat dargelegt, dass Entzündungsmediatoren diese Strukturen an Endothelzellen und
Epithelzellen regulieren, so dass es zu einer Stase der Leukozyten kommen kann.
Als Folgereaktion kommt es zur Bildung und Freisetzung inflammatorischer
Moleküle. Es ergibt sich eine Abnahme der Herzfunktion, des Blutdrucks und es
kommt zu markanten Einflüssen an Immuneffektorzellen. Diese Veränderungen
führen dann zum multiplen Organversagen und zum Zelltod des Patienten. Der
septische Schock ist dabei eine akut auftretende Reaktion, wobei diese proinflammatorischen Zytokine ihre große Bedeutung entfalten; die Zytokine haben
jedoch weitgespannte Auswirkungen und finden sich auch bei chronischen Entzündungsreaktionen und Infektionserkrankungen wie z.B. Lepra, Tuberkulose
u.a. Zytokine führen ebenfalls zur Induktion der „Akute-Phase“-Antwort; dies ist
ein integrierter Bestandteil der natürlichen Abwehr gegenüber Mikroorganismen.
Durch molekularbiologische Untersuchungen hinsichtlich der mikrobiellen Erreger wie auch des Wirtes ist es heute möglich, die Bedeutung einzelner Pathogenitätsfaktoren und einzelner Zytokine tierexperimentell zu analysieren.
Die Anwendung genetisch klonierter Mikroorganismen in der Wechselwirkung
mit humanen Effektorzellen hat es darüber hinaus ermöglicht, eine Übertragung
bisheriger und neuer Erkenntnisse zum Problem „Sepsis“ zu erhalten. Während
in den vergangenen 30 – 40 Jahren den Endotoxinen eine ausschließliche Bedeutung zugesprochen wurde, ist heute allgemein akzeptiert, dass abseits vom Lipopolysaccharid andere mikrobielle Faktoren modulierende Funktionen ausüben
und u.U. sogar wichtiger sind als das Lipopolysaccharid. Diese unterschiedlichen
13
mikrobiellen Faktoren können heute in vier Klassen eingeteilt werden; Adhäsine,
Inversine, Aggressine und Impedine. (Abb.4 a,b)
Adhäsine sind mikrobielle Pathogenitätsfaktoren, wie z.B. Fimbrien an E.coli
oder Pseudomonas ssp., die sich an spezifische zelluläre Rezeptoren binden. Es
handelt sich in der Regel um Karbohydrate und Karbohydrat-Wechselwirkungen,
die wiederum zu zellbiologischen Veränderungen am Erfolgsorgan führen. Wir
konnten nachweisen, dass definierte Adhäsine von E.coli Bakterien in sehr spezifischer Weise aus neutrophilen Granulozyten (PMN) sowie Lymphozyten, Monozyten, Basophilen (LMB), die Mediatoren wie Leukotriene und Histamin freisetzen. Damit war ersichtlich, dass die Adhäsin-Immuneffektor-Wechselwirkung zur
Aktivierung der Zielzellen führt. Dies bedeutet, dass die Kolonisierung nur eine
Voraussetzung für die nachfolgende Infektion ist und die entsprechende AdhäsinZellwechselwirkung die pathophysiologischen Reaktionen induziert.
Invasine: Es sind Strukturen von Mikroorganismen, die für die Aufnahme des
Mikroorganismus von wesentlicher Bedeutung sind. Es handelt sich ebenfalls um
mikrobielle Oberflächenstrukturen, die in Wechselwirkung mit Epitopen der Zelle treten. Bekannt sind hier das Invasin von Listeria monocytogenes (Inv, ail) oder
Yersinia ssp. (Yops), Salmonella ssp.. Invasine erlauben durch Wechselwirkung
des Mikroorganismus mit den zellulären Strukturen eine Aktivierung innerhalb
der Zelle, so dass der Mikroorganismus zur Aufnahme kommt. Innerhalb der Zelle kommt es zur Wechselwirkung des Mikroorganismus mit intrazellulären Strukturen und damit zu einer Modulation der zellulären Funktion.
Aggressine: Es handelt sich in der Regel um mikrobielle Exotoxine oder auch
Proteasen. Die Vielfältigkeit der Toxine hinsichtlich der Wechselwirkung an
Immuneffektorzellen wurde in den vergangenen Jahren interdisziplinär erarbeitet.
Es zeigte sich, dass viele Hämolysine durch Rezeptorwechselwirkung Zellen
aktivieren können, dazu gehören z.B. das Pneumolysin oder Streptolysin O. Das
letztere Toxin bindet sich an Cholesterol und führt zur Freisetzung von Leukotrienen. Andererseits können mikrobielle Exotoxine auch modulierend einwirken
und die Mediatorkaskaden selektiv aktivieren oder inhibieren. Ein klassisches
Beispiel ist das E.coli α-Hämolysin. Dieses Toxin supprimiert z.B. die Zytokinfreisetzung. Man kann sich also vorstellen, dass E.coli Bakterien mit spezifischen
Adhäsinen und der α-Hämolysinausprägung zunächst Immuneffektorzellen aktivieren; die gleichzeitige Freisetzung von α-Hämolysin würde die Zytokinfreisetzung supprimieren und damit die spezifische Infektabwehr inhibieren.
Impedine: Dies sind Faktoren, die die zelluläre Funktion supprimieren. Auf die
duale Funktion vieler mikrobieller Exotoxine wurde eingegangen. Mikrobielle
Superantigene oder z.B. das Alginat von Pseudomonas ssp. also mukoide Exoprodukte können phagozytäre Funktionen inhibieren, so dass damit trotz zirkulierender Phagozyten ein Defizit ihrer Funktion eintritt. Diese Substanzen würden
dann die Aufnahme der Mikroorganismen inhibieren und häufig auch durch
Wechselwirkung mit intrazellulären Strukturen (niedrigmolekulare G-Proteine,
Aktin, respiratorischer Burst u.a.) die essentielle Funktion der Phagozyten
blockieren.
Die Kenntnis dieser multiplen Faktoren ist notwendig, um sich in der Zukunft
Gedanken zu machen, wie die Pathophysiologie nach Kolonisierung eines Brandverletzten das Schicksal dieses Brandverletzten entscheiden kann. Es handelt sich
14
nicht um einen einzelnen mikrobiellen Faktor sondern um mehrere Faktoren; es
ist nicht ein einzelnes Abwehrsystem sondern die Komplexität unterschiedlicher
Mediatorkaskaden betroffen. Die Abwehrleistung des lokalen Wundfeldes wie
auch der zirkulierenden Zellen sowie die Stabilität der natürlichen Immunität mit
der Möglichkeit zum Aufbau der spezifischen Abwehr sind zu beachten. All diese
Komponenten sind letztendlich entscheidend, ob die Kolonisierung und mikrobielle Infektion kompensiert wird oder ob es letztendlich zu einer mikrobiellen
Invasion mit dem Tod des Patienten durch die „Burn wound sepsis“ kommt. Es
sind also allgemeingültige Fragen, die beim Brandverletzten wie auch beim
Polytrauma zum Tragen kommt. Voraussetzung für die Beantwortung dieser Fragen ist die exakte Kenntnis der pathophysiologischen Vorgänge, die durch mikrobielle Pathogenitätsfaktoren ausgelöst werden sowie die Analyse der unterschiedlichen zellbiologischen Reaktionsformen auf mikrobielle Reize. (Abb. 5) Nur aus
dieser komplexen Sicht heraus ist es möglich Prädiktivmarker der „Burn wound
sepsis“ einzuführen und innovative therapeutische Ansätze zu erarbeiten.
Die hier darzustellenden Ergebnisse betreffen also
1. weiterführende Arbeiten zu den mikrobiellen Pathogenitätsfaktoren in der
Wechselwirkung mit humanen Immuneffektorzellen und
2. Studien zu den zellbiologischen Auswirkungen, die für den „Immunstress“ und
die „Immunparalyse“ verantwortlich sein können sowie
3. den Einsatz neuer therapeutischer Ansätze zur Stabilisierung der Infektabwehr
und zur Behandlung der traumabedingten Immunparalyse
Untersuchungen zu mikrobiellen Pathogenitätsfaktoren
Untersuchungen zum Staphylokokken Leukozidin
Im Rahmen der mikrobiellen Kolonisierung bei Brandverletzten sind Pseudomonas ssp. und Staphylokokken prädominante Keime, die häufig im Verbund bei
der mikrobiellen Invasion gefunden werden. In früheren Arbeiten hatten wir
gezeigt, dass die Pathogenität der Mikroorganismen im Laufe der mikrobiellen
Invasion offensichtlich zunimmt. Die Frage stellte sich, inwieweit definierte
Pathogenitätsfaktoren die mikrobielle Invasion begünstigen, und welche Parameter der natürlichen Infektabwehr dabei moduliert werden. Im Folgenden wurde in
einer Zusammenarbeit mit dem Institut Bactériologie der Medizinischen Fakultät
der Universität Straßburg das Staphylokokken Leukozidin analysiert. Staphylokokkus aureus Stämme sind mit einer Vielzahl von Erkrankungen assoziiert, wie
z.B. Lungeninfektion, Verbrennungen, Furunkel und Dermonekrosen. Die Pathogenitätsfaktoren von Staph.aureus, insbesondere die Toxine, spielen dabei eine
besondere Rolle für die Auslösung des Krankheitsprozesses. In früheren Studien
konnte gezeigt werden, daß Staphylokokkentoxine (z.B. α-Toxin, δ-Toxin, Toxic
Shock Syndrome Toxin, die Immuneffektorzellen von Probanden hinsichtlich der
Mediatorfreisetzung modulieren. Im Folgenden wurde das Staphylokokken Leukozidin, ein Zweikomponententoxin, analysiert. Es wurde das Panton-ValentineLeukozidin (Luk PV) dem Leukozidin R gegenübergestellt. Diese Zweikompo15
nententoxine (S und F) interagieren synergistisch mit Leukozyten. Beide Toxine
wurden von Staph.aureus V8 isoliert. Nur die gleichzeitige Interaktion von Fund S-Komponenten des Leukozidins entfaltet biologische Aktivitäten. Histologisch ist die Dermonekrose durch einen zentralen nekrotischen Herd sowie durch
eine massive Infiltration von neutrophilen Granulozyten und Makrophagen charakterisiert. Im Folgenden wurde analysiert, inwieweit humane Immuneffektorzellen sich hinsichtlich der Reaktivität gegenüber Staphylokokken Leukozidin
verhalten. Wir können zeigen, dass das Panton-Valentine-Leukozidin pathophysiologisch aktiver als das Luk R ist. Offenbar bestimmt die Zusammensetzung der
Bikomponenten Systeme die Aktivität des Toxins. In kürzlichen Arbeiten haben
wir zeigen können, dass durch Austausch und Modifikation der einzelnen Toxinkomponenten die biologische Aktivität signifikant moduliert wird. Humane
Immuneffektorzellen entlassen nach Wechselwirkung mit Leukozidin das chemotaktisch aktive Leukotrien B4; basophile Granulozyten entlassen Histamin (Abb.
6, 7) und unter den Zytokinen wird das chemotaktisch aktive Interleukin-8 freigesetzt. (Abb. 8) Leukozidin wirkt auch an permeabilisierten Leukozyten. Dies ist
insbesondere wichtig, da im Rahmen der Wechselwirkung eines Toxins mit
humanen Effektorzellen diese häufig permeabilisiert sind und damit das Toxin in
die Zelle gelangt. Offenbar reicht aber der enzymatische Apparat aus, um auch
bei permeabilisierten Leukozyten eine Freisetzung von Lipidmediatoren zu induzieren. Insgesamt gesehen hat Leukozidin also einen ausgeprägten proinflammatorischen Einfluss; erst in hohen Konzentrationen kommt es zur Lyse der Immuneffektorzellen. Zunächst werden also Mediatoren der Entzündung freigesetzt.
Ausschlaggebend ist, dass im Rahmen der Wechselwirkung mit Leukozidin Zellen das „Heatschockprotein 70“ exprimieren. Leukozidin induziert ebenfalls die
Apoptose von Zielzellen. Diese Apoptose wird durch Einwirkung von Wachstumsfaktoren inhibiert. (Abb. 9) Unter dem Einfluss von GM-CSF wird die Leukozidinwechselwirkung mit Effektorzellen und die Freisetzung von Mediatoren
massiv verstärkt. Dies bedeutet, dass in einem bereits entzündlichen Wundfeld
die Besiedlung mit Staph.aureus und die Sekretion von Leukozidin zu einer Aufschaukelung des Entzündungsprozesses führen kann. Man kann sich also vorstellen, dass am Wundfeld vielfältige Zytokine freigesetzt werden. Diese inhibieren
die Apoptose. Durch Bindung des Leukozidins kommt es an den so geschützten
Zellen zu einer massiven Mediatorfreisetzung, die eine weiterführende Entzündung begünstigen und damit die mikrobielle Invasion unterstützen.
Pathogenitätsfaktoren von Pseudomonas aeruginosa
In früheren Arbeiten hatten wir auf die Bedeutung von Pseudomonas ssp. für die
Kolonisierung und mikrobielle Invasion hingewiesen. Wir konnten zeigen, dass
Pseudomonas aeruginosa-Stämme von Brandverletzten zwei Hämolysine sezernieren, d.h. ein hitzelabiles Hämolysin (Phospholipase C) und ein hitzestabiles
Hämolysin, ein Glykolipid. Beide Hämolysine verhalten sich unterschiedlich hinsichtlich der Mediatorfreisetzung. (Abb. 10) Wir untersuchten wiederum an
humanen Immuneffektorzellen (neutrophile Granulozyten, humane periphere
mononukleäre Zellen) den Einfluss unterschiedlicher Pseudomonas aeruginosa16
Stämme. Bekanntlicherweise unterscheiden wir mukoide und weniger mukoide
Stämme. In Anlehnung an die Wachstumsbedingungen wird das Mukopolysaccharid von Pseudomonas aeruginosa gebildet. In klassischer Weise finden wir
sehr viel Mukopolysaccharid (Alginat) bei Pseudomonas aeruginosa-Stämmen
von Patienten mit zystischer Fibrose. Grundsätzlich ist aber für Pseudomonas
aeruginosa das Mukopolysaccharid ein wichtiger Pathogenitätsfaktor. Im Folgenden wurden klinische Isolate analysiert, die einerseits mukoid und weniger stark
mukoid ausgeprägt sind. Wir überprüften an humanen Immuneffektorzellen, ob
durch Wechselwirkung mit Pseudomonas aeruginosa es zur Freisetzung des chemotaktisch aktiven Interleukin-8 kommt. Bekanntlicherweise gehört dieses Zytokin zu den niedrigmolekularen Chemotaxinen und ist außerordentlich aktiv für
die Akkumulation von Entzündungszellen und Adhäsinausprägung an Granulozyten und Zielzellen. In unseren Untersuchungen können wir zeigen, dass eine
definierte Bakterienzellkonzentration vorliegen muss, um eine optimale Freisetzung von Interleukin-8 zu induzieren. Unsere Daten belegen, dass Pseudomonas
aeruginosa Bakterien die Freisetzung von Il-8 aus Granulozyten und Monozyten
induzieren; sie sind damit in der Lage die Entzündungsreaktion zu amplifizieren
und zu perpetuieren, indem zusätzliche Phagozyten an den Entzündungsherd
geholt werden. Die Freisetzung von Interleukin-8 wird dabei nicht durch Alginat
blockiert. Die Befunde sind für die Betrachtung der mikrobiologischen Situation
bei Brandverletzungen von außerordentlicher Bedeutung. Das Wundfeld ist nach
ca. einer Woche mit unterschiedlichen Mikroorganismen kolonisiert; die klinische Erfahrung zeigt, dass die Kolonisierung mit Pseudomonas aeruginosa ein
sehr schlechtes Zeichen darstellt, weil es häufig zur mikrobiellen Invasion
kommt. Man könnte nun davon ausgehen, dass die Bakterien selber zunächst
durch Pathogenitätsfaktoren die Granulozyten an den Ort der Auseinandersetzung chemotaktisch akkumulieren; damit wäre eine erste Abwehrlinie gewährleistet. Gleichzeitig werden aber durch die Wechselwirkung des Mikroorganismus
mit den Phagozyten Granulozyten zerstört, es kommt zur Freisetzung von Proteasen wie natürlich auch zur Generierung von weiteren chemotaktischen Faktoren,
so dass die Entzündung sich aufschaukelt. Eine aufgeschaukelte Entzündung
könnte zu einer verminderten Immunabwehr im Rahmen der neutrophilen Phagozytenabwehr führen. Die mikrobielle Invasion würde trotz des Abrufens von Phagozyten damit begünstigt.
Nicht nur Granulozyten sondern auch Thrombozyten sind Träger von Mediatoren. Auf der Suche nach relevanten Pathogenitätsfaktoren von Pseudomonas
untersuchten wir die Bedeutung des hitzelabilen Hämolysins und eines weiteren
Pathogenitätsfaktors, der Lipase. Die Phospholipasen sind ubiquitäre Enzyme.
Die Aktivierung von Phospholipasen führt wiederum zur Freisetzung von ungesättigten Fettsäuren. Die individuellen Zellpopulationen können je nach ihrer
Enzymausstattung die ungesättigten Fettsäuren in unterschiedliche Metabolite
umwandeln. Im Folgenden zeigen wir, dass neben dem bekannten Exotoxin von
Pseudomonas aeruginosa (d.h. Exotoxin A, das mukoide Polysaccharid) das hitzelabile Hämolysin von außerordentlich großer pathophysiologischer Bedeutung
ist. Pseudomonas aeruginosa Stämme können zwei lipolytische Enzyme produzieren, d.h. die Phospholipase C und die Lipase. Beide Toxine werden extrazellulär sezerniert. Die Wechselwirkung mit Thrombozyten führt zu einer massiven
17
Freisetzung von 12-Hydroxyeicosatetraensäure (12 HETE). (Abb. 11) Dieser
Metabolit ist in der Aktivierung weiterer Entzündungszellen außerordentlich
reaktiv. Die hier vorliegenden Untersuchungen zeigen also sehr deutlich, dass
nicht nur Pseudomonas aeruginosa als Mikroorganismus sondern die relevanten
Pathogenitätsfaktoren für die Freisetzung der Entzündungsmediatoren von außerordentlicher Bedeutung sind. In weiterführenden Arbeiten konnten wir diese
Ergebnisse nicht nur an Thrombozyten sondern auch an Granulozyten und Monozyten bestätigen. Die Phospholipase C in ihrer Wechselwirkung mit Lipase führt
zur Generierung von chemotaktisch aktivem Leukotrien B4, von Sauerstoffmetaboliten , der Histaminfreisetzung aus Basophilen. Die Analyse der Interleukin-8Freisetzung führte zu überraschenden Ergebnissen. Die Phospholipase selber
zeigt für sich nur eine geringe Aktivierung der Interleukin-8-Freisetzung, obwohl
in hohem Maße das chemotaktisch aktive Leukotrien B4 gebildet wird. In höheren Konzentrationen kam es sogar zu einer Suppression der Phospholipase C
induzierten Interleukin-8-Freisetzung. (Abb.12,13) Diese duale Funktion eines
Toxins hinsichtlich der Mediatorfreisetzung hatten wir auch für das E.coli
α-Hämolysin beobachtet. Bekanntlicherweise sind Hämolysin-produzierende
E.coli-Stämme in der Wechselwirkung mit ihrem Zielorgan besonders aggressiv.
Pathophysiologische Reaktionen wie Meningitis, Sepsis werden nicht nur durch
spezifische Adhäsine von E.coli ausgelöst sondern auch durch E.coli zusammen
mit der α-Hämolysinproduktion. Die Untersuchungen belegen also, dass nicht
nur die taxonomische Definition eines Mikroorganismus entscheidend ist für das,
was sich beim Brandverletzten abspielt sondern dass die individuellen Pathogenitätsfaktoren mit den Komponenten der natürlichen und spezifischen Infektabwehr interagieren.
Untersuchungen zur Bedeutung mikrobieller Superantigene
Als Superantigene bezeichnet man eine heterogene Gruppe von Proteinen, die
einen äußerst wirksamen Mechanismus der T-Lymphozytenstimulation benutzen.
Sie binden über MHCII Moleküle an antigenpräsentierenden Zellen und vernetzen variable Anteile des T-Zellrezeptors auf CD4+ und CD8+-T-Zellen. Obwohl
es unterschiedliche Typen von Superantigenen gibt, die untereinander kaum verwandt sind, benutzen sie die gleichen molekularen Mechanismen. (Abb. 14 a-d)
Im Rahmen ihrer Bindung werden sie nicht prozessiert, wie dies für konventionelle Antigene üblich ist. Ihre pathophysiologischen Auswirkungen sind offenbar
durch die ungewöhnlichen Mechanismen der T-Lymphozytenstimulierung vermittelt. Der Prototyp der Superantigene, die von Infektionserregern gebildet werden, sind Staphylokokken Enterotoxine sowie die pyrogenen Exotoxine, die aus
Staphylokokken und Streptokokken gebildet werden. Andere Mitglieder dieser
Familie sind das „Toxic-Shock-Syndrom“-Toxin von Staph.aureus und das Streptokokken Superantigen von S.pyogenes. Einige Toxine haben untereinander eine
Sequenzhomologie z.B. SEA und SEB zu mehr als 50% im Unterschied zu TSST-1.
In Folge der außerordentlichen Wirksamkeit der Toxine kann ein geringer bakterieller Fokus bereits zu einer generellen Aktivierung des Immunsystems führen.
Eine solche polyklonale T-Zell-Aktivierung kann zur Immunsuppression führen;
18
die Superantigene können Anergie oder Tod durch Apoptose an T-Zellen induzieren. Die Injektion von Staphylokokken Enterotoxin B in Mäusen führt zu einer
partiellen Depletion von V8-T-Zellen. Die V8+ Zellen, die immer noch in der
Milz vorliegen, antworten weder auf SEB noch auf T-Zellrezeptorantikörper. Die
schockähnlichen Symptome, die durch Superantigene induziert werden, kommen
durch die massive Freisetzung von Lymphokinen und Monokinen zustande. Ein
kritischer Mediator ist wohl TNFα. Das TNF wird wahrscheinlich von T-Lymphozyten produziert. Superantigene können immunpathologische Phänomene
sowie die Aktivierung von autoreaktiven B-Zellen wie z.B. Streptokokkenerkrankungen induzieren. In jüngster Zeit gibt es Hinweise, dass mikrobielle Superantigene auch für die Induktion und Persistenz der atopischen Dermatitis mitverantwortlich sein sollen. Im Folgenden untersuchten wir die Wechselwirkung von
Toxic-Shock-Syndrom-Toxin und einiger Mutanten hinsichtlich der Mediatorfreisetzung aus humanen Immuneffektorzellen. Die mutierten TSST-Moleküle erhielten wir in der Zusammenarbeit mit Dr. Bonventre, USA. Diese Untersuchungen sind in sofern relevant weil man sich vorstellt, dass durch Veränderung von
Superantigenen neue immuntherapeutische Anwendungen zu erreichen sind.
Unsere Untersuchungen zeigen sehr deutlich, dass TSST-1 hinsichtlich der Freisetzung von unterschiedlichen Zytokinen (IL-6, TNF u.a.) hochaktiv ist und an
wesentlichen Eckpunkten der natürlichen wie auch spezifischen Immunität Einfluss hat. Es gibt TSST-Mutanten, die diesen Einfluss nicht mehr haben. Die Frage stellt sich, inwieweit solche Mutanten in Zukunft für die Blockierung von
Rezeptorstrukturen eingesetzt werden können, die durch mikrobielle Superantigene normalerweise okkupiert werden. Man könnte sich vorstellen, dass diese
Mutanten sich binden und damit das natürliche Superantigen keine Bindungsstelle mehr hat und damit keine Reaktivität auslöst. (Abb.15 a) Weiterführende
Arbeiten wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Ulrich, NIH, USA, durchgeführt.
Mit Dr. Ulrich wurden Mutanten des Staphylokokken Enterotoxin B (SEB) analysiert. (Abb. 15 b,c) Wir können zeigen, dass die Zytokinfreisetzung (TNF, IL-10,
IL-12) von der Sekretion wie auch von der molekularbiologischen Expression
durch diese Mutanten moduliert werden. In diesem Zusammenhang soll betont
werden, dass Zytokine wie Interleukin-12 Hoffnungsträger sind, da sie die protektive Immunität offenbar erhöhen. Interleukin-12 induziert offenbar auch Interferon-γ. Interleukin-10 andererseits wirkt antiinflammatorisch aber begünstigt
durch eine Stabilisierung des TH1-Zellpools die Aktivität eines TH2-Zellpools.
Inwieweit durch eine verstärkte oder modulierte Interleukin-10-Freisetzung Zytokine freigesetzt werden, die eine Allergisierung favorisieren, kann an diesem
Punkt nicht gesagt werden. Andererseits wissen wir heute dass Zytokine, die zu
einer Allergisierung führen, wiederum potente inflammatorische Aktivität ausüben und im Rahmen der Immunsuppression offenbar eine große Rolle spielen. So
findet man z.B. das Interleukin-4 nicht nur bei allergischen Prozessen sondern
auch bei der Immunsuppression (HIV).
Die hier vorgestellten Untersuchungen zeigen also sehr deutlich, dass pathogene
Mikroorganismen ihrerseits über unterschiedliche Faktoren mit den Immuneffektorzellen in Wechselwirkung treten. Bei gramnegativen Bakterien spielt sicher
das zellgebundene und lösliche Polysaccharid eine Rolle. Wenig bearbeitet wurden Strukturkomponenten der Mikroorganismen oder auch sezernierte Exopro19
dukte (Phospholipase, Lipasen u.a.). Das Zusammenwirken dieser Exoprodukte
und Superantigene führt zu einer Modulation der Immunantwort. Für die künftige pathophysiologische Betrachtung von Schock und Sepsis wird man also nicht
allein von dem klassischen Bild einer gramnegativen Sepsis (LPS) induzierten
pathophysiologischen Veränderung ausgehen müssen, vielmehr wird man das
Konzept vertreten müssen, dass mehrere Pathogenitätsfaktoren am Wirkort relevant sind und Immuneffektorzellen modulieren.
Modulation der Immuneffektorreaktionen durch RSV
(Respiratory Syncytial Virus).
Virale Infektionen sind eine zusätzliche Komplikation bei immunsupprimierten
Patienten; da RSV pathophysiologisch im frühen Lebensalter aber auch rekurrierend und rezidivierend bei Erwachsenen häufig der bakteriellen und respiratorischen Infektion vorausgeht, haben wir die Wechselwirkung von RSV mit bronchialen Epithelzellen und Immuneffektorzellen analysiert. Es wurde überprüft,
ob die Wechselwirkung mit RSV Mediatoren der Entzündung entlässt. Dies ist in
der Tat der Fall. Das chemotaktisch aktive Interleukin-8 wie auch der Tumornekrosefaktor (TNF) und lösliche Zytokinrezeptoren werden zeit- und dosisabhängig entlassen. Man muss sich also vorstellen, dass die Wechselwirkung des
Epithels mit dem RSV zu einer Freisetzung von Entzündungsmediatoren führt.
Diese sorgen für ein inflammatorisches Entzündungspotential. Diese Entzündungszellen können sich durch Aufregulation unterschiedlicher Adhäsine unterhalb des Epithels anlagern und innerhalb ihrer Aktivierung das Epithel durch
weitere Mediatoren beeinflussen. RSV führt aber auch zu einer gezielten Freisetzung von Interleukin-10. (Abb. 16) Ein wichtiger Pathogenitätsfaktor ist hierbei
das G-Protein. Mittels des isolierten G-Proteins konnten wir nachweisen, dass in
der Tat das antiinflammatorische Zytokin Interleukin-10 freigesetzt wird. Man
kann sich also vorstellen, dass bei schweren polytraumatischen Situationen
(ARDS u.a.) Zytokine wie Interleukin-10 letztendlich ein TH2-“Pattern“ favorisieren. Dieses TH2-Zytokin-“Pattern“ konnte in der Tat im Rahmen der viralen
Infektion nachgewiesen werden. Interleukin-5 führt z.B. zu einer Akkumulation
von Eosinophilen. Diese Daten belegen und unterstreichen die Befunde, dass
beim ARDS in der Lungenlavage es massiv zu einer Eosinophilie kommt. Die so
aktivierten Eosinophilen führen wiederum mittels ihrer kationischen Proteine zu
ernsten pulmonalen pathophysiologischen Veränderungen.
Zusammenfassung:
Anhand unterschiedlicher mikrobieller Pathogenitätsfaktoren haben wir zeigen
können, dass neben Endotoxin wichtige Pathogenitätsfaktoren die Reaktivität von
Immuneffektorzellen modulieren. Die Aktivierung von Entzündungsmediatoren
ist eine wichtige Voraussetzung für die Balancierung der Infektabwehr. Eine
überschießende Reaktion führt zu deletären Reaktionen. Eine persistierende
Wechselwirkung von Pathogenitätsfaktoren mit humanen Immuneffektorzellen
20
führt zur Anergie und damit zur Immunparalyse. Diese Immunparalyse gibt der
mikrobiellen Invasion Vorschub und dem Wachstum von opportunistischen Keimen. Es muss deshalb das Ziel sein, neben einer taxonomischen Beobachtung
von Mikroorganismen an der Wundfläche die Pathologie der Entzündung durch
unterschiedliche Pathogenitätsfaktoren verstehen zu lernen. Die Grundlagen
eines besseren Verständisses werden dann zu innovativen therapeutischen Ansätzen führen sowie diagnostische Prädiktivmarker im Verlauf der Brandverletzung
auch klinisch ermöglichen.
Bedeutung von Pharmaka
(Zytokine, lösliche Rezeptoren, Antagonisten u.a.)
Unsere Untersuchungen haben dargelegt, dass die Wechselwirkungen unterschiedlicher Entzündungsmediatoren (Zytokine, Lipidmediatoren, zelluläre
Adhäsionsmoleküle, lösliche Rezeptormoleküle u.a.) für die Balance der Infektabwehr wie aber auch für das Versagen der natürlichen und spezifischen Infektabwehr verantwortlich ist. Das Interleukin-4 als Wachstumsstimulationsfaktor hat
eine herausragende Bedeutung. Interleukin-4 findet sich nicht nur als „Switch“Faktor sondern spielt auch im Rahmen der Suppression eine große Rolle. Die
Inkubation von Interleukin-4 verändert das nachfolgende zell- und molekularbiologische Zytokinmuster nach Stimulation mit mikrobiellen Superantigenen. Interleukin-4 führt im Verlaufe der Wechselwirkung zu einer massiven Suppression.
Daraus ergeben sich u.U. Möglichkeiten, durch Wegfangen von Interleukin-4
mittels mutierter Moleküle oder löslicher Il-4-Rezeptoren therapeutisch in vivo
einmal eingreifen zu können. Anhand eines Brandverletzten wurden die Zellen ex
vivo in vitro mit dem IL-4-Mutantenmolekül inkubiert und die Freisetzung von
Mediatoren analysiert. (Abb.17) Auch hier eröffnen sich neue Perspektiven, die
einer weiteren Analyse und Untersuchung bedürfen.
Bedeutung von Wachstumsfaktoren:
Die Wechselwirkung mikrobieller Exoprodukte führt nicht nur zur Aktivierung
von Immuneffektorzellen sondern auch zum beschleunigten Zelltod, d.h. zur
Apoptose. Im Rahmen dieser kurzen Lebenszeit kommt es zu einem Abknicken
der Mediatorfreisetzung. Ein Versagen der natürlichen Infektabwehr ist die Folge.
Die Zugabe von Wachstumsfaktoren könnte die Phagozyten stabilisieren. In
Untersuchungen ex vivo in vitro zeigten wir, dass Toxine die Effektorzellen deaktivieren. Die Wechselwirkung von Effektorzellen mit Wachstumsfaktoren führt zu
einer gesteigerten Freisetzung von Mediatoren. Hier liegt also nahe, dass u.U.
Wachstumsfaktoren für therapeutische Ansätze von außergewöhnlicher Bedeutung sein könnten. Neben Zytokinen stellt sich die Frage, ob eine antientzündliche Therapie die zellbiologische Leistung moduliert. (Abb. 18)
21
Untersuchungen zum PAF-Rezeptorantagonisten
Wir überprüften einen neuentwickelten PAF-Rezeptorantagonisten, der stereospezifisch mit dem PAF-Rezeptor interagiert sowie seinen Stereoisomer. Der
Thrombozyten-aggregierende Faktor (PAF) aktiviert Immuneffektorzellen. Es
kommt nach Wechselwirkung mit dem PAF-Rezeptorantagonisten zu einer zeitabhängigen Inhibition von Leukotrien B4 sowie auch Interleukin-8 aus PMN und
LMB.(Abb.19,20) Diese Untersuchungen zeigen sehr deutlich, dass Substanzen,
die Mediator-spezifisch ausgerichtet sind, aufgrund der Wechselwirkung mit bisher nicht bekannten zellbiologischen Strukturen die Freisetzung anderer Mediatoren moduliert. Der hier beschriebene PAF-Rezeptorantagonist könnte deshalb
von außergewöhnlich großer Bedeutung sein, da Mediatoren abseits von PAF
durch diese Substanz moduliert werden. Es bleibt abzuwarten, welche Bedeutung
der PAF-Rezeptorantagonist für die Behandlung akuter sowie auch chronisch entzündlicher Reaktionen hat. In Anlehnung an die hier vorgestellten Daten überprüften wir auch einen H1-Rezeptorantagonisten, d.h. das Cetirizin. Das Cetirizin
ist ein H1-Antagonist. Cetirizin moduliert humane Immuneffektorzellen. Es inhibiert die Freisetzung des chemotaktisch aktivem Leukotrien B4 wie auch des
chemotaktisch aktiven Interleukin-8. Unsere Untersuchungen zeigen also sehr
deutlich, dass ein klassisches Antihistaminikum offenbar abseits seiner bisherigen Spezifität (H-1) hinsichtlich der Modulation von Immuneffektorzellen außerordentlich wirksam ist.
Zusammenfassung:
Innovative therapeutische Ansätze können in der Entwicklung von Zytokinen,
löslichen Zytokinrezeptoren oder auch Antizytokinen liegen. Die letztgenannte
Therapie ist sicherlich sehr kostenaufwendig. Exakte Vorstellungen zu der Strukturwechselbeziehung eines Zytokins mit dem Rezeptor sind dagegen außerordentlich wichtig. Klassische oder neu zu entwickelnde Pharmaka könnten mit
Rezeptorstrukturen von Zellen interagieren und damit die entzündliche Ausprägung von Immuneffektorzellen modulieren. In diesem Zusammenhang kommt
also nicht nur Zytokinen, die zellulär protektiv oder Mediator neutralisierend sind,
eine große Bedeutung zu sondern auch klassischen oder neu zu entwickelnden
Pharmaka, die in einem breiteren Sinne entzündungsinhibierend sind ohne dass
damit eine u.U. bestehende Immunsuppression weiterhin begünstigt wird. Zu
bedenken ist hier, dass Mediatoren der Entzündung benötigt werden, um ein
Gleichgewicht der Infektabwehr zu erzielen. Mediatoren haben also auch benefizielle Funktionen. Es ist notwendig dies Gleichgewicht herzustellen.
22
Therapeutische Interventionen bei der traumabedingten
Immunparalyse
Wie eingangs dargestellt, wurde das Projekt über zwei wesentliche Schienen
bearbeitet:
a) es wurden Arbeiten zum Einfluss mikrobieller Pathogenitätsfaktoren hinsichtlich der Freisetzung von Mediatoren der Entzündung mit der Fragestellung
durchgeführt, über welche Mechanismen (Mediatoren, Zell-Zell-Interaktionen,
Signaltransduktion, intrazelluläre Schaltmoleküle u.a.) die Immunparalyse
zustande kommt. Aufgrund dieser Arbeiten wird es möglich sein, therapeutische Ansatzmöglichkeiten zu finden an denen man intervenieren kann.
b) Ein zweiter wesentlicher Arbeitsbereich beschäftigte sich mit der Fragestellung, inwieweit man zum derzeitigen Zeitpunkt aufgrund des bisherigen Wissens die Trauma-induzierte Immunsuppression therapeutisch angehen kann.
Wie bereits erwähnt, stehen bereits Zytokine oder lösliche Zytokinrezeptoren
oder auch Antizytokine zur Verfügung. Im Folgenden wird über Arbeiten
berichtet, die wir mit verschiedenen Universitätskliniken oder auch städtischen
Krankenhäusern im Umfeld der RUB durchgeführt haben.
Untersuchungen zum Einfluss von γ-Interferon beim
Brandverletzten.
Es handelte sich um eine Multicenterstudie, doppelblind und randomisiert sowie
placebokontrolliert. Insgesamt sind 230 Patienten in Europa in diese Studie eingegangen. 12 der Patienten wurden von uns hinsichtlich detaillierter immunologischer Parameter analysiert. γ-Interferon (100 µg täglich subkutan) wurde den
Patienten bis Tag 20 appliziert. An den Tagen 1, 3, 7, 14, 30 sowie 50 wurden folgende Parameter analysiert; d.h. HLADR und HLADQ – Expression sowie
Mediatorfreisetzung aus Granulozyten nach Stimulation mit dem Kalzium-Ionophor A23187. (Abb. 21)
Im Verlauf des posttraumatischen Geschehens sieht man initial eine Suppression
von HLADR und HLADQ, die sich über die Zeit normalisiert; diese Normalisierung ist unabhängig von der Interferon-γ-Applikation. Allerdings ist dieser Verlauf zeitlich schneller in der Verumgruppe. Unter der Annahme, dass MHCIIMoleküle für die antigene Präsentation und damit für die Auslösung der
natürlichen wie auch der spezifischen Immunität verantwortlich sind, ist es natürlich wünschenswert, dass im Rahmen der Interferon-γ-Therapie es zu einer
schnelleren Aufregulation von MHCII tragenden Zellen kommt. Die kritische
Frage stellt sich an diesem Punkt, ob die hier vorgenommene Therapie (Zeitpunkt, Konzentration) in Bezug zum Patiententrauma sowie zu entsprechenden
Einschluss- und Ausschlusskriterien überhaupt relevant sein kann. Die Diskussion anlässlich einer intereuropäischen Konferenz zeigte, dass bezogen auf den
klinischen Verlauf keine positiven Effekte auf die infektionsbedingte Mortalität
zu sehen ist. Die Einschlusskriterien enthielten die Bedingung, dass Patienten mit
mehr als 90%iger Verbrennung aufgenommen sowie alle Altersstufen mitberück23
sichtigt wurden. Kritisch muss man anmerken, dass hier natürlich rigide Eckpfeiler gesetzt sind. Es wäre wünschenswert, wenn eine Folgestudie im Rahmen einer
Subgruppierung von Patienten (Verbrennungsgrad, Patientenalter) durchgeführt
wird. Es bleibt abzuwarten, ob und wann eine solche Studie durchgeführt werden
kann, da diese mit außerordentlich hohen Kosten verbunden ist.
Immunmodulation – Untersuchungen zur Immunmodulation
im Rahmen der Ernährungstherapie.
Man weiß aus vielfältigen Untersuchungen, dass die Ernährung einen gravierenden
Einfluss auf Parameter der natürlichen wie auch spezifischen Infektabwehr ausübt. In diesem Zusammenhang ist die Applikationen ungesättigter Fettsäuren im
Austausch der C20:4 Arachidonsäure vielfältig beschrieben worden. Andere
Möglichkeiten bestehen z.B. in der Applikation definierter Peptide, die u.U. stimulatorisch an unterschiedlichen Zellen der Infektabwehr wirksam sind. Im Folgenden ist eine Zusammenstellung unserer Daten gegeben:
a) Einfluss von Eicosapentaensäure (enteral, parenteral)
Es wurden in der enteralen Studie n=80 Patienten mit Impact® (Sandoz, Bern)
therapiert. Es wurden präoperativ, postoperativ (Tage 1, 5, 10) die Gesamtleukozyten von Patienten nach großen Oberbauchoperationen für die Stunden analysiert. Es wurden die Zellen mit dem Kalzium-Ionophor und dem bakteriellen
Peptid fMLP stimuliert; Messparameter waren die Leukotriensynthese über die
„Reverse Phase“ HPLC sowie die Produktion des chemotaktisch aktiven Zytokins Interleukin-8. Bei den Resultaten lässt sich nachweisen, dass es zu einer signifikanten Verschiebung der biologisch hochaktiven Serie-4 Leukotriene zugunsten der biologisch weniger aktiven Serie-5 Leukotrienen kommt. (Abb. 22) Es
findet sich kein signifikanter Unterschied bei Interleukin-8. Hinsichtlich der klinischen Validität der Therapie lassen sich die Aussagen an diesem Punkt noch
nicht konkretisieren. Unter der Annahme, dass die Leukotriene der 4 Serie in der
Regel im Rahmen des Entzündungsgeschehens, falls überschießend gebildet,
eher schadensbringende Funktionen ausüben, wäre die Akkumulation des Leukotriens der 5er Serie benefiziell zu werten. Man sollte betonen, dass es nicht um
eine völlige Elimination von Mediatorkaskaden sondern um eine Dämpfung proinflammatorischer Mediatorkaskaden geht. Bei der parenteralen Therapie wurden
über das gleiche Abnahmeschema 80 Patienten nach großen chirurgischen Oberbaucheingriffen untersucht. Die Resultate der parenteralen Therapie sind mit
denen der enteralen Therapie vergleichbar. Zusätzlich wurden die systemischen
Zytokine (TNF, IL-10, IL-6) in dieser Studie untersucht. Es fällt auf, dass in der
Verumgruppe der Trauma-induzierte Anstieg von TNF, IL-6 und IL-10 gedämpft
wird. Wir haben in früheren Studien gezeigt, dass Interleukin-6 bei Brandverletzten irreversibel ansteigt in der Nicht-Überlebensgruppe. Wir müssen deshalb
davon ausgehen, dass dem Interleukin-6 eine wichtige Rolle bezüglich des
Abschaltens wichtiger zellulärer Funktionen zukommt, die im Rahmen der Infektabwehr notwendig sind.
24
Man kann sich natürlich auch vorstellen, dass die Akkumulation von „AkutePhase-Proteinen“ die Zellen so übermäßíg stimuliert, dass nach längerer Expositionszeit diese deaktiviert werden. Insofern kommt einer Dämpfung der Interleukin-6-Freisetzung u.U. eine große Bedeutung zu. Hinsichtlich des TNF
bestehen verschiedene Vorstellungen. TNF als Mediator von Kachexie, Sepsis
und Schock hat natürlich auch benefizielle Funktionen. An diesem Punkt muss
noch einmal darauf hingewiesen werden, dass die Therapie zu einer Dämpfung
der TNF-Freisetzung führt und nicht zu einer kompletten Elimination von TNF.
Eine Elimination von TNF z.B. mit anti-TNF oder löslichen TNF-Rezeptoren
führt zum Anstieg opportunistischer Infektionen. Hinsichtlich des Interleukin-10
ist dieser Befund sehr interessant. Interleukin-10 hat antiinflammatorische Aktivitäten und supprimiert das Zytokinprofil der T1-Zellen.
Dieser Zellpool generiert bekanntlicherweise Interleukin-2 und das Interferon-γ.
Aufgrund der Dämpfung des „T1-Zytokinpools“ kommt es zu einer relativen Favorisierung des T2-Zytokinpools. Es ist bekannt, dass Zytokine aus dem T2-Zytokinpool, z.B. Interleukin-4, im Rahmen der Immunsuppression offenbar wichtige
induzierende Funktionen haben. Insofern kommt der Dämpfung der Interleukin10-Funktion ebenfalls eine wichtige Interpretation zu. Hinsichtlich des klinischen
Verlaufes zeigen sich in der Verumgruppe weniger posttraumatische Infektionen
als in der Placebogruppe. Weiterführende Studien müssen durchgeführt werden,
um die Signifikanz der beobachteten Resultate herauszuarbeiten.
b) Einfluss des Dipeptids (Ala-GLN)
In Zusammenarbeit mit der Abteilung für Intensivmedizin und Anästhesiologie
der Universitätsklinik – Marienhospital, Herne, wurden 60 Patienten hinsichtlich
der klinischen Verträglichkeit des Dipeptids überprüft. Von diesen 60 Patienten
wurden 10 Patienten immunologisch analysiert. Die Untersuchungen wurden präoperativ und postoperativ an den Tagen durchgeführt. Als Messparameter der zellulären Aktivität diente die Analyse der Leukotriene sowie die Analyse des chemotaktisch aktiven Zytokins Interleukin-8. Folgende Resultate wurden erhoben:
es kam posttraumatisch zu einer Verminderung der Zysteinylleukotriene; in der
Verumgruppe wurde die verminderte Synthese aufgehoben. (Abb. 23)
Dies spricht dafür, dass das Dipeptid offenbar einen modulierenden Einfluss hinsichtlich der Leukotriensynthese ausübt. Unter der Annahme, dass Phagozyten
mit ihrer Stoffwechselleistung dem Druck der mikrobiellen Auseinandersetzung
entgegenwirken, ist die Fähigkeit des Dipeptids zu einer stimulatorischen Aktivierung von phagozytären Leistungen natürlich interessant. Es müssen weiterführende Arbeiten durchgeführt werden, inwieweit diese Stimulation wie wir auch
ex vivo in vitro an Normalspenderzellen zwischenzeitlich haben belegen können,
einen protektiven Effekt hinsichtlich der postoperativen Phase ausübt.
c) Zusammenfassung
Aus den vorgegebenen Resultaten wird ersichtlich, dass es einige Therapieschemata gibt, die im Rahmen der natürlichen wie auch spezifischen Immunität einen
dämpfenden wie auch einen aktivierenden Einfluss an verschiedenen Parametern
haben. Wie eingangs erwähnt, sind die unterschiedlichen Mediatorkaskaden miteinander vernetzt. Die Methoden sind notwendig, um die Infektabwehrlage zu
25
stabilisieren. Es wird wichtig sein, ein Überschießen von Mediatorkaskaden entweder zu dämpfen oder eine supprimierte Mediatorkaskade im Verlauf einer bleibenden Infektion zu aktivieren. Selbstverständlich sind dies Anfangsschritte, die
im Verbund mit den basis-theoretischen Untersuchungen ihren Sinn machen. Weiterführende Untersuchungen sind unbedingt notwendig, um den Einfluss dieser
Therapie hinsichtlich unterschiedlicher Parameter (Immunstimulation, Dämpfung von Mediatorkaskaden u.a.) weitergehend zu analysieren.
26
Erfolgskontrollbericht
Die hier vorliegenden Ergebnisse haben einen wichtigen Beitrag zur Frage der
mikrobiellen Pathogenität sowie von Pathogenitätsfaktoren in der Auslösung und
Persistenz des septischen Schocks erbracht. Die Analyse zur Freisetzung der Entzündungsmediatoren, die möglichen Ansätze der Therapie zur Stabilisierung der
Infektabwehr sind allesamt innovativ. Es muss daher abgewartet werden, inwieweit im Verlaufe weiterer Arbeiten und Förderungen sich diese therapeutischen
Ansätze nicht nur als innovativ sondern auch als klinisch wirksam erweisen. Die
Arbeiten zu den klinisch-theoretischen Grundlagen der mikrobiellen Pathogenität, der Beantwortung der zellbiologischen Leistung sowie der Signaltransduktion sind Grundlage dafür, um für die Diagnostik die Prädiktivmarker des drohenden Schocks zu erarbeiten. Insofern stellen die Ergebnisse einen wesentlichen
Beitrag zu den förderpolitischen Zielen des Förderprogramms dar. Die Traumainduzierte Immunparalyse bei Brandverletzten ist ein wichtiger Grund dafür, dass
trotz moderner Kenntnisse der Intensivtherapie heute immer noch ein wesentlicher Prozentsatz der so Geschädigten trotz moderner derzeitiger Therapiemöglichkeiten verstirbt.
Hinsichtlich des wissenschaftlichen und technischen Erfolges konnten wir
wesentliche Ergebnisse und Erkenntnisse sammeln. Sie betreffen die Wertigkeit
unterschiedlicher mikrobieller Pathogenitätsfaktoren von Bakterien wie Pseudomonas ssp., Staphylokokken sowie E.coli; fernerhin die Bedeutung von mikrobiellen Exotoxinen sowie Superantigenen. In der Vergangenheit war den Exotoxinen eine wesentliche Bedeutung für die Pathophysiologie von Schock/Trauma
zugesprochen worden. Heute zeigt sich aber immer mehr, dass neben den Endotoxinen mikrobielle Exotoxine und Superantigene gemeinsam ihren Einfluss an
Immuneffektorzellen nehmen. Der eine oder andere pathophysiologische Aktivator kann in diesem Zusammenhang relevanter sein. Insofern ist es wichtig die
unterschiedlichen Segmente und Aktivatoren zu kennen, um aus dem unterschiedlichen Verhalten hinsichtlich der zellbiologischen Ansprechbarkeit diagnostische Erfahrungen zu sammeln und diese in der Zukunft in die Praxis umzusetzen.
Hinsichtlich des Finanzierungs- und Zeitplans wurde der vorgegebene Zeitrahmen eingehalten. Die Finanzierung war leider für das 1. Jahr gekürzt. An dieser
Stelle sollte bemerkt werden, dass naturgemäß die theoretisch-klinischen Untersuchungen vom Untersucher her geplant und anhand der vorliegenden Ergebnisse
kontinuierlich weiterentwickelt werden können. Hinsichtlich der Patientenstudien
sind wir darauf angewiesen, dass in der Zusammenarbeit mit der Klinik das Patientenmaterial anfällt und zum anderen natürlich bei groß angelegten Studien,
dass diese Studien auch innerhalb eines Zeitrahmens zur Durchführung und zum
Abschluss kommen. Dies ist in der vergangenen Förderperiode durch einen
intensiven Einsatz der Mitarbeiter und durch Zusammenarbeit mit unterschiedlichen Kliniken sehr erfolgreich durchgeführt worden. So konnten wichtige klinische Studien initiiert aber auch abgeschlossen werden. Diese Zusammenarbeit
27
umfasste die Kliniken in Bochum selber, das Universitätsklinikum Essen, die
Städt. Krankenanstalten in Dortmund und auf der europäischen Ebene hinsichtlich der γ-Interferon-Studie eine von der Firma Boehringer konzipierte Studie
zum Wirkmechanismus von γ-Interferon mit unterschiedlichen Verbrennungs- und
Forschungszentren in Europa.
Die bisherigen Ergebnisse sind akademischer Natur und sicherlich auch schon
kliniksnah. Einzelne Therapieschemata (z.B. Einsatz von ungesättigten Fettsäuren u.a.) sind im Einsatz und werden sicherlich in der Zukunft für verschiedene
Fragestellungen in der Klinik ihren Fuß fassen.
Im Rahmen der bisherigen Arbeiten wurden keine Erfindungen in Anspruch
genommen. Es sind keine Schutzrechtsanmeldungen oder erteilten Schutzrechte
wie deren Verwertung geplant.
Insgesamt lässt sich anhand der Publikationen und Abstrakts festhalten, dass im
Rahmen der vorgegebenen Förderung über die drei Jahre wir wesentliche Beiträge haben erarbeiten können, die theoretisch-klinisch relevant und auch für die
Pathophysiologie der Immunparalyse von ausserordentlich hohem Interesse sind.
Innovative Ansätze zu neuen Therapiemaßnahmen wurden iniziiert, durchgeführt
und evaluiert. Selbstverständlich ist das Krankheitsbild der Immunparalyse nur
dann zu beherrschen, wenn man die modernsten Erkenntnisse der Grundlagenforschung einbezieht. In Anbetracht der Tatsache, dass das gesamte Feld der
Immunologie (Zellbiologie und Molekularbiologie) außerordentlich wichtige
Erkenntnisse gebracht hat, sollte das Projekt in den nächsten Jahren fortgeführt
werden. Nur so lassen sich die hier gewonnenen Erkenntnisse verifizieren und für
kliniksrelevante Fragestellungen übertragen.
28
Voraussichtlicher Nutzen, insbesondere Verwertbarkeit
des Ergebnisses und der Erfahrungen
Diagnostische Prädiktivmarker, insbesondere bei Patienten mit Polytrauma,
Immunsuppression als Folge der Brandverletzung sowie innovative therapeutische Ansätze können nur dann realisiert werden, wenn man die Pathophysiologie
mikrobieller Erkrankungen verstehen lernt. Von den hier erhobenen Befunden
lassen sich folgende Aussagen verwerten:
1. die taxonomische Zuordnung der Mikroorganismen alleine ist nicht ausreichend, um Prädiktivmarker für den möglichen Ausgang bei der Brandverletzung zu erheben,
2. es erscheint notwendig, mikrobielle Isolate hinsichtlich relevanter Pathogenitätsfaktoren zu analysieren, um das Ausmaß der pathophysiologischen Wechselwirkung quantifizieren zu können.
3. der Einstrom unterschiedlicher mikrobieller Pathogenitätsfaktoren (intakte
Mikroorganismen, Exotoxine, Endotoxine Superantigene) ist für das Bild der
Mediatoraktivierung wie auch für das Fortschreiten der Immunparalyse verantwortlich,
4. innovative therapeutische Ansätze umfassen die Gabe von Zytokinen, löslichen
Zytokinrezeptoren, Antizytokinen, antiinflammatorischen Substanzen sowie
Immunmodulatoren,
6. bei der Komplexität der Mediatorkaskaden ist zu überlegen, ob es Angriffsziele gibt, die auf einer breiteren Basis die Immunität stabilisieren können.
Die hier erarbeiteten Ergebnisse lassen sich allesamt bereits verwerten. Sicherlich
wird man eine realistische Durchführung zu den einzelnen Punkten erst dann
haben, wenn der komplexe Ablauf der Sepsis verstanden ist. Die vorliegenden
Ergebnisse stellen aber die Grundlage dar, um zu diagnostischen Prädiktivmarkern wie auch therapeutischen innovativen Ansätzen zu gelangen.
Zusammenfassend haben diese Untersuchungen unser Verständnis zur Pathophysiologie der Trauma-induzierten Immunsuppression insbesondere bei der Brandverletzung vertieft. Die gegenwärtigen modernen zellbiologischen Werkzeuge
wurden eingesetzt, um die Mediatorgenerierung sowie Reaktivität von Immuneffektorzellen zu quantifizieren. Therapeutische Ansätze wurden ex vivo in vitro an
humanen Immuneffektorzellen von Normalpersonen wie auch Polytraumatisierten und Brandverletzten durchgeführt, mit der Zielsetzung eine Reaktivierung der
Effektorfunktion zu erhalten. Die Ergebnisse belegen, dass diese Reaktivierung
möglich ist, jedoch abhängig vom Zeitpunkt der Zugabe eines entsprechenden
Zytokins ist. Zielsetzung müsste es sein, durch Zugabe von zu entwickelnden
Pharmaka oder auch Infusionsschemata eine Balancierung der Mediatorkaskaden
zu erreichen, ohne unbedingt den einzelnen Mediator für sich spezifisch zu inhibieren. Es sollte nicht das Ziel sein, die gesamten Mediatorkaskaden zu inhibieren, da die Mediatoren essentielle Bestandteile der Infektabwehr sind. Im
Wesentlichen würde dies für eine Immunmodulation im breiteren Sinne sprechen,
29
wobei sicherlich Eckpfeiler zu definieren sind, an denen man die Modulation
quantifizieren kann oder den Ausgangspunkt der Modulation auch in Relation
zum Krankheitsbild wird beurteilen können. Es besteht also nach wie vor dringender Forschungsbedarf, um die vielfältig anwachsenden Daten zur Pathophysiologie der Immunparalyse zu verwerten und im Sinne der Bearbeitung diagnostischer Prädiktivmarker und innovativer Therapieansätze zu gestalten.
30
Kurzfassung
Entzündungsmediatoren spielen eine essentielle Rolle im Ablauf der natürlichen
und spezifischen Immunität. Ein ausgewogenes Verhältnis der unterschiedlichen
Kaskaden ist notwendig, um der mikrobiellen Infektion entgegenzuwirken. Überschießende Reaktionen führen zu Schock und Sepsis; ein Nichtansprechen der
Mediatorkaskaden oder der zellulären Antwort auf unterschiedliche Mediatoren
führen zu opportunistischen Infektionen. Die Komplexität der pathophysiologischen Vorgänge bei Brandverletzten ist trotz der therapeutischen Erfolge nach
wie vor unbestritten. Die mikrobielle Kolonisierung ist sehr häufig durch eine
mikrobielle Invasion gefolgt. Parameter seitens des Mikroorganismus, wie
mikrobielle Pathogenität oder ein Abknicken der Immunität sind für die Brandverletztensepsis verantwortlich. Die modernen Erkenntnisse der Molekular- und
Zellbiologie und insbesondere die Einsicht in die komplexen Abläufe der Mediator-gesteuerten Signaltransduktionswege hat zu neuen diagnostischen Prädiktivmarkern sowie innovativen Ansätzen geführt. In der vorliegenden Arbeit wird
berichtet, dass die mikrobiellen Pathogenitätsfaktoren, die für die Aktivierung
von Entzündungszellen verantwortlich sind, unterschiedlicher Natur sind. Neben
LPS spielen mikrobielle Adhäsine, Exotoxine und die intrazelluläre Infektion
eine herausragende Rolle. Unterschiedliche Pathogenitätsfaktoren können dabei
Entzündungsmediatorkaskaden abrufen oder auch inaktivieren. Aus dieser dualen
Funktion mikrobieller Pathogenitätsfaktoren erklärt sich, warum es im Verlauf
einer Kolonisierung u.U. zu einem Abknicken der Infektabwehr kommt. Neben
den mikrobiellen Exoprodukten spielen Superantigene von Staphylokokken,
Streptokokken eine herausragende Rolle. Sie können durch Wechselwirkung mit
dem T-Zellrezeptor und MHCII-Strukturen eine Vielfalt von Zytokinen aus
humanen Zellen aktivieren, die zu Schock und Sepsis führen. Neue therapeutische Ansätze könnten darin bestehen diese Superantigene durch mutierte
Moleküle zu ersetzen, um damit im Rahmen der progredienten Aktivierung von
humanen Immuneffektorzellen eine therapeutische Gegenoffensive zu starten.
Die weitreichenden Kenntnisse zur Molekularbiologie und Immunologie unterschiedlicher Zytokine erlauben es im Krankheitsverlauf u.U. mutierte Zytokine
einzusetzen oder Zytokine anzuwenden, die bei der Immunparalyse zu einer
Reaktivierung von Immuneffektorzellen führen. Ein wichtiges Phänomen ist
dabei der selektive Zelltod (Apoptose), der zu einer Inbalance der natürlichen
und spezifischen Infektabwehr führt. Diese Mechanismen können durch eine
Antizytokintherapie ausbalanciert werden.
Die vorliegende Arbeit hat also unsere Kenntnisse zu den mikrobiellen Pathogenitätsfaktoren, die zur Immunparalyse führen, weitgehend vertieft, bereichert und
erfordert innovatives Denken. Es ist nicht nur wichtig die taxonomische Zuordnung des Erregers zu evaluieren, sondern die diagnostischen Tore zur Evaluierung der mikrobiellen Pathogenität zu öffnen. Aus den Überlegungen zur
mikrobiellen Pathogenität lässt sich dann folgern, inwieweit der Druck der Pathogenitätsfaktoren auf das Immunsystem stattfindet. Die Evaluierung unterschiedlicher Mediatorkaskaden erlaubt es, den Status des Immunsystems zu analysieren.
31
Erste therapeutische Ansätze wurden in klinischen Studien von uns erbracht. In
einer „Multicenterstudie“ wurde der Einfluss von 8-Interferon bei Brandverletzten analysiert. Obwohl sich immunologische Veränderungen zeigen, ist die Wirksamkeit der 8-Interferontherapie nach wie vor umstritten. Vertiefte Untersuchungen sind jedoch notwendig; eine Subgruppierung der Patienten ist angezeigt.
Darüberhinaus wurde die Immunmodulation durch eine nutritive Therapie analysiert. Auch hier zeigen sich immunologische Veränderungen hinsichtlich der
Lipidmediatoraktivierung und der Zytokinfreisetzung.
Zusammenfassend kann man sagen, dass die Arbeiten neue Perspektiven zur
mikrobiellen Pathogenität und ihren Einfluss auf die Mediatorkaskaden eröffnet
hat, fernerhin, dass es möglich ist anhand der Zytokine Eckpfeiler der natürlichen
und spezifischen Immunität zu erheben und fernerhin, dass weitere Forschung
durchgeführt werden muss, um die nutritive Immunregulation oder pharmakologische sowie biotechnologische Modulation der Infektabwehr zu analysieren und
in die Praxis umzusetzen. Es besteht also nach wie vor dringender Forschungsbedarf, um die traumabedingte Immunparalyse besser zu verstehen und dieser entgegenzuwirken.
Die Ergebnisse sind notwendig, um die Pathophysiologie der Sepsis, insbesondere bei Brandverletzten zu verstehen. Mit den neu gewonnenen Erkenntnissen lassen sich neue Therapieansätze entwickeln.
32
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37
Die Autoren
Wolfgang König
Univ.-Professor Dr.med.
Direktor des Instituts für Medizinische Mikrobiologie an der Otto-von-GuerickeUniversität Magdeburg, 39120 Magdeburg
Manfred Köller
Priv. Doz. Dr.rer.nat.
ehemaliger Projektleiter der Abteilung Infektabwehrmechanismen für Medizinische Mikrobiologie der Ruhr-Universität Bochum, jetzt: Chirurgische Universitätsklinik, Bergmannsheil Bochum, 44789 Bochum
Brigitte König
Priv. Doz. Dr. rer. nat.
Institut für Medizinische Mikrobiologie an der Otto-von-Guericke-Universität Magdeburg, 39120 Magdeburg
Ralf Arnold
Dr. rer. nat.
Institut für Medizinische Mikrobiologie an der Otto-von-Guericke-Universität Magdeburg, 39120 Magdeburg
Andreas Drynda
Dr. rer. nat.
Institut für Medizinische Mikrobiologie, Otto-von-Guericke-Universität Magdeburg, 39120 Magdeburg
Paul Wachtler
Dr. med.
Marienhospital Herne, Medizinische Klinik I, Ruhr-Universität Bochum, 44625
Herne
39
Anhang
Abbildung: 1
Die Abbildung zeigt die unterschiedlichen Wege der Infektabwehr auf;
Neutrophile, Granulozyten und Makrophagen sind u.a. bestimmend für die Entzündungsreaktion. Die Wechselwirkung von dendritischen Zellen mit T-Zellen
führt zur Einleitung der spezifischen Immunität; Makrophagen, „Natural Killer“Zellen sowie γδ-T-Zellen in der Mukosa sind zelluläre Elemente der natürlichen
Immunität;TH2-Zellen in Wechselwirkung mit B-Zellen stimulieren die Antikörpersynthese; TH1-Zellen in Wechselwirkung mit Monozyten führen zur Freisetzung von Zytokinen und antibakteriellen Substanzen.
41
Abbildung: 2
Einfluss der Zytokine
Zytokine bestimmen die Akkumulation von Zellen (Chemotaxis; die metabolische Aktivierung, die Proliferation, die Inhibition der Proliferation, die Differenzierung wie Zelltod (Apoptose)
42
Tabelle 1
Darstellung der Zytokinfamilien; dazu gehören die Interleukine, die zytotoxischen Zytokine, die koloniestimulierenden Faktoren, die Interferone, die Wachstumsfaktoren sowie die Chemokine
43
Tabelle 2
Zytokine mit proinflammatorischen Wirkungen
44
Tabelle 3
Zytokine mit antiinflammatorischen Wirkungen
45
Tabelle 4:
Biologische Wirkung von Interleukin-1, Interleukin-6 und Tumornekrosefaktor
46
Abbildung: 3
Einfluss der T1- und T2-Zytokine auf Immunzellen. Neuroendokrine Faktoren
(lokal, systemisch) wirken auf TH-0-Zellen und verändern das T1- sowie T2Zytokinmuster. Dies ist gemeinsam den Vorgängen bei Allergie wie auch Schock
und Sepsis.
47
Abbildung: 4 a, b
Einfluss mikrobieller Faktoren (Moduline) aus Immuneffektorzellen mit der Freisetzung von Zytokinen sowie der Modulation der zellulären Antwort.
48
Abbildung: 5
Einfluss von Bakterien und Toxinen sowie Virus auf Mastzellen, Neutrophile, Eosinophile.
Es kommt zur Aktivierung der Zellen mit der Freisetzung multipler Zytokine und
Mediatoren. Gleichzeitig werden diese Zellen geprimt. T-Lymphozyten werden
ihrerseits wiederum programmiert. Es kommt zur Freisetzung vielfältiger Mediatoren durch die Wechselwirkung mikrobieller Exoprodukte mit Zellen der Infektabwehr. Diese entfalten chemotaktische Aktivitäten und sind verantwortlich für
das mikrobielle „Killing“, führen zur Mediatorfreisetzung und der Freisetzung
von Proteasen. Vorgänge der akuten und chronischen Entzündung werden
dadurch reguliert.
49
Abbildung: 6
Histaminfreisetzung aus humanen Basophilen durch Luk-PV und Luk-R
Eine humane Zellsuspension (LMB) (5x106) wurde mit Luk-PV oder Luk-R in
den angegebenen Konzentrationen (0-, 5-, 50-, 500-, 1000-, 2000-, 3000 ng) für
1h bei 37°C inkubiert. Formylmethionylleucylphenylalanine (FMLP, 10-4M)
diente als Positivkontrolle. Die Daten entsprechen den Mittelwerten von 3 unterschiedlichen Experimenten. * signifikanter Unterschied gegenüber Luk-R.
50
Abbildung: 7
Leukotrien B4 Freisetzung aus humanen Neutrophilen durch Luk-PV und Luk-R
Humane PMN (107/500µl) wurden mit Luk-PV oder Luk-R in den angegebenen
Konzentrationen (0-, 5-, 50-, 500-, 1000-, 2000-, 3000 ng) für 1h bei 37°C inkubiert. Formylmethionylleucylphenylalanine (FMLP, 10-4M) diente als Positivkontrolle. Die Daten entsprechen dem Gesamt-LTB4 (LTB4 + 20-COOH-LTB4 + OHLTB4) und sind Mittelwerte von 3 unterschiedlichen Experimenten. * signifikanter Unterschied gegenüber Luk-R.
51
Abbildung: 8
Interleukin-8 Freisetzung aus humanen Neutrophilen durch Luk-PV und Luk-R
Humane PMN (107/500µl) wurden mit Luk-PV oder Luk-R in den angegebenen
Konzentrationen (0-, 5-, 50-, 500-, 1000-, 2000ng) für 1h bei 37°C inkubiert. Die
Daten sind Mittelwerte von 8 unterschiedlichen Experimenten. * signifikanter
Unterschied gegenüber Luk-R.
52
Abbildung: 9
Zellbiologische Vorgänge zur Einleitung des Zelltodes (Apoptose)
Dieser kann über pharmakologische, immunologische Aktivierung (T-Zellrezeptor) sowie Fas-ligand eingeleitet werden. Zytokine führen zur Aktivierung einer
Sphingomyelinase mit der Freisetzung von intrazytoplasmatischem Ceramid; es
kommt zum oxidativen Stress. Kortikoide führen ebenfalls zur gesteigerten
Apoptose. Metabolite der Arachidonsäure und der Eicosapentaensäure regulieren
und verzögern die Apoptose.
53
Abbildung: 10
Einwirkung von Pseudomonas aeruginosa Kulturüberstandsfraktionen auf die
Interleukin-8-Freisetzung aus humanen Monozyten
Humane Monozyten (4x105) wurden stimuliert mit konzentrierten (1:1) oder mit
Verdünnungen (1:5, 1:100) der unterschiedlichen Kulturüberstandsfraktion; die
Molekulargewichts „cut off“– Punkte belaufen sich auf >50.000; 30.000 –
50.000, 5.000-30.000; und unter 5.000 Da der entsprechenden Pseudomonas
aeruginosa-Stämme (PAO1; PAO1∆SR, PAO1∆SRN). Die Kulturüberstände wurden isoliert nach 24 h und analysiert hinsichtlich von Interleukin-8 durch ELISA
(Triplikatbestimmung). Die Ergebnisse zeigen Mittelwerte und Standardabweichungen aus drei unabhängigen Experimenten. *wesentlicher Unterschied im Vergleich zu unstimulierten Zellen; p<0,05
54
Pseudomonas
aeruginosa Stämme
Phospholipase-Typ
PAO1 wild type
hämolytisch,
nicht-hämolytisch
PAO∆SR
nicht-hämolytisch
PAO PLCN°
hämolytisch
PAO1∆SRN
keine
55
Abbildung: 11
Einfluss von gereinigter Pseudomonas aeruginosa Lipase auf die Phospholipase C
(Pseudomonas aeruginosa, C.perfringens) induzierte 12-HETE-Freisetzung
Thrombozyten (108/500µl) wurden mit gereinigter Phospholipase inkubiert
(P.aeruginosa, C. perfringens; 10 U) in der Anwesenheit von gereinigter Pseudomonas aeruginosa Lipase (0-, 0.43-, 4.3-, 108-, 216-, 433 U). Die Inkubation wurde
über 60 Min. bei 37° C durchgeführt; die Werte für die unstimulierten Zellen wurden von den anderen Werten für die 12-HETE Bildung subtrahiert. *sind hier
Unterschiede im Vergleich zu Phospholipase C stimulierten Thrombozyten in der
Abwesenheit von Pseudomonas aeruginosa Lipase (p< 0,05). Ergebnisse sind Mittelwerte ± Standardabweichung (Balken) von drei unabhängigen Experimenten.
56
Abbildung: 12
Wirkung von gereinigter Pseudomonas aeruginosa Lipase auf die Phospholipase
induzierte Leukotrien B4-Freisetzung aus humanen neutrophilen Granulozyten.
Neutrophile (107/500µl) wurden mit gereinigter Phospholipase C (P.aeruginosa:
10 U; C.perfringens: 10 U) in der Anwesenheit von gereinigter Pseudomonas
aeruginosa Lipase inkubiert. Die Inkubation lief über 30 Min. bei 37° C. Die Werte
der unstimulierten Zellen wurden subtrahiert von den anderen Werten für die
LTB4-Bildung. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± Standardabweichung (Balken)
von drei unabhängigen Experimenten *signifikante Unterschiede im Vergleich zur
Stimulation in der Abwesenheit von Lipase, (p< 0,05).
57
Abbildung: 13
Einwirkung von gereinigte hämolytischer Pseudomonas aeruginosa Phospholipase C auf die Interleukin-8-Freisetzung (ng/ml) aus humanen Monozyten.
Humane Monozyten (4x105)/ml wurden mit gereinigter Phospholipase C von
P.aeruginosa zu den angezeigten Konzentrationen über 24 h stimuliert. Die
Ergebnisse zeigen die Standardwerte ± von drei unabhängigen Experimenten.
*signifikante Unterschied im Vergleich zu unstimulierten humanen Monozyten (0
U PLC)(p<0,05)
58
Abbildung: 14
Zytokinfreisetzung (TNF-alpha, IL-6, IL-10, IL-12) aus humanen PBMC durch
Superantigene
Humane PBMC (1x106/ml) wurden mit den unterschiedlichen bakteriellen
Superantigenen (SEB; TSST-1, ETA) in einer Konzentration von 10ng/ml für 24-,
48-, 72-, 96-, 120-, und 144h stimuliert. Die Überstände wurden mittels zytokinspezifischer ELISAs auf den Gehalt von TNF-alpha, IL-6, IL-10, IL-12 hin
untersucht. Es ist ein repräsentatives Experiment gezeigt.
59
Abbildung: 15 a
Exemplarische Darstellung zum Wirkmechanismus mikrobieller Superantigene
und ihrer Mutanten.
60
Abbildung: 15 b
TNF-alpha Freisetzung aus humanen PBMC durch SEB und SEB-Mutanten
Humane PBMC (1x106/ml) wurden mit SEB oder SEB-Mutanten für 24-, 48-,
und 72h bei 37°C stimuliert. Die Überstände wurden mittels ELISA auf ihren
TNF-alpha Gehalt untersucht.
61
Abbildung: 15 c
TNF-alpha Freisetzung aus humanen PBMC durch SEA und SEA-Mutanten
Humane PBMC (1x106/ml) wurden mit SEA oder einer SEA-Mutante für 24-,
48-, und 72h bei 37°C stimuliert. Die Überstände wurden mittels ELISA auf
ihren TNF-alpha Gehalt untersucht.
62
Abbildung: 16
Dosis- und zeitabhängiger Einfluss des gereinigten G-Proteins von RSV auf die
Interleukin-10-Freisetzung aus humanen PBMC.
Humane PBMC (1x106/ml) mit unterschiedlichen Konzentrationen von G-Protein (von 0 – 10 µg/106 PBMC) über 2-, 4-, 6-, 12-, 18-, 24 Stunden behandelt. Die
ELISA-Werte sind Mittelwerte + Standardabweichung von drei unabhängigen
Experimenten. IL-10-Spiegel sind signifikant verschieden (p< 0,05) von unbehandelten PBMC (p< 0,05)
63
Abbildung: 17
Einfluss einer teilaktiven IL-4-Mutante auf die Zytokinsynthese aus LMBs eines
schwerbrandverletzten Patienten
1 x 106 LMBs/ml RMI 1640 wurden für 3 Tage in Abwesenheit oder Anwesenheit
einer teilaktiven IL-4-Mutante (Y124 D) in Kultur genommen. Anschließend wurde die spontane IL-6 Freisetzung mittels ELISA quantifiziert.
Patient: 39 J., männl., 35 % 2.° + 3.° Verbr., zusätzliches Polytrauma
64
Abbildung: 18
DNA-Fragmentierung in neutrophilen Granulozyten.
5 x 106 Zellen/1ml RPMI 1640 wurden für 18 h in Kultur genommen. A: Medium
Kontrolle, B: in Anwesenheit von 40 µM Arachidonsäure, C: in Anwesenheit von
1µM MK 886 (Leukotien-Synthese-Inhibitor), D: in Anwesenheit von 1µM Indomethacin (Prostaglan-dinsynthese-Inhibitor). Anschließend wurden die Zellen
mit Propidium-Jodid markiert und über FACS analysiert.
65
Abbildung: 19 a,b,c
Einfluss von SM-12502 auf die Freisetzung von Leukotrienen aus neutrophilen
Granulozyten.
1 x 107 Zellen/500µl PBS wurden mit verschiedenen Konzentrationen von SM12502 präinkubiert (20 min. 37° C in Anwesenheit von CA2+/Mg2+ (1mM/0,5
mM) und anschließend mit dem Ca-Ionophor A23187 (A, 5µM), fMLP (B) 1µM
in Anwesenheit von 1µM Cytochalasin B) und mit NaF (C, 20mM in Anwesenheit
von 10µM AlCl3) stimuliert. Die freigesetzten Leukotriene wurden über RPHPLC quantifiziert.
66
Abbildung: 20 a,b
Einfluss von SM-12502 auf die Freisetzung von IL-8 aus peripheren Leukozyten
Periphere Ganulozyten (A) oder Lymphozyten/Monozyten (B) wurden mit
unterschiedlichen Konzentrationen von SM-12502 für 90 Min. in Anwesenheit
von 1mM Ca++ und 0,5 mM Mg++ in PBS inkubiert. Die Freisetzung von IL-8
wurde anschließend im ELISA gemessen.
67
Abbildung: 21
Synthese von LTB4 aus Gesamtleukozyten schwerbrandverletzter Patienten
(n=12) in Korrelation zur HLA-DR-Expression auf Monozyten.
1x 107 Gesamtleukozyten wurden mit dem Ca-Ionophor A23187 (5µM) in Anwesenheit von 1mM Mg stimuliert. Die gebildeten Leukotriene wurden über RPHPLC analysiert. Die Expression von HLA-DR auf Monozyten wurde mittels
FACS-Analytik quantifiziert.
Control: Placebogruppe
Verum: IFN-γ 100µg sc. täglich
68
Abbildung: 22
Verhältnis der LTB4/LTB5-Mediatoren nach vollständiger parenteraler Ernährung
(TPN) postoperativer Patienten1x107 Gesamtleukozyten/500µl PBS wurden mit dem Ca-Ionophor A23187
(5µM) in Anwesenheit von 1mM Ca und 0,8 mM Magnesium stimuliert. Die
gebildeten Leukotriene wurden über RP-HPLC quantifiziert.
Control: Kontrollgruppe 20 Patienten ohne Ω-3-Fettsäure-Supplementierung
Verum: Verumgruppe 20 Patienten mit Ω-3-Fettsäuren-Supplementierung,
p< 0.0001
69
Abbildung: 23
Einfluss eines Dipeptides AlaGln (Alanyl-Glutamin) auf die Synthesekapazität für
LTE4 aus LMBs.
1 X 107 LMBs/500 µl PBS wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von
AlaGln (Dipeptamin“, Fresenius) 15 Min präinkubiert; anschließend wurden die
Zellen mit dem Ca-Iononphor A23187 (5µM) unter Zugabe von 1 µM Ca und 0,5
mM Magnesium stimuliert. Die freigesetzten Leukotriene wurden mittels RPHPLC quantifiziert.
70
Zivilschutz-Forschung, Neue Folge
Schriftenreihe der Schutzkommission beim Bundesminister des Innern
Herausgegeben vom Bundesverwaltungsamt
– Zentralstelle für Zivilschutz –
ISSN 0343-5164
im Auftrag des Bundesministeriums des Innern
Band 50
– in Vorbereitung –
R. Zech
Entgiftung von Organophosphaten durch Phosphorylphosphatasen und Ethanolamin
2002, Broschur
Band 49
– in Vorbereitung –
G. Matz, A. Schillings, P. Rechenbach
Task Force für die Schnellanalytik bei großen
Chemieunfällen und Bränden
2002, Broschur
Band 48
Zweiter Gefahrenbericht der Schutzkommission
beim Bundesminister des Innern
Bericht über mögliche Gefahren für die Bevölkerung bei Großkatastrophen und im Verteidigungsfall
2001, 92 Seiten, Broschur
Band 47
J. Rasche, A. Schmidt, S. Schneider, S. Waldtmann
Organisation der Ernährungsnotfallvorsorge
2002, 88 Seiten, Broschur
Band 46
F. Gehbauer, S. Hirschberger, M. Markus
Methoden der Bergung Verschütteter aus zerstörten Gebäuden
2002, Broschur
Band 45
V. Held
Technologische Möglichkeiten einer möglichst
frühzeitigen Warnung der Bevölkerung
– Kurzfassung –
2001, 144 Seiten, Broschur
Band 44
E. Pfenninger, D. Hauber
Medizinische Versorgung beim Massenanfall
Verletzter bei Chemikalienfreisetzung
2002, Broschur
Band 43
D. Ungerer, U. Morgenroth
Empirisch-psychologische Analyse des menschlischen Fehlverhaltens in Gefahrensituationen
und seine verursachende und modifizierenden
Bedingungen sowie von Möglichkeiten zur Reduktion des Fehlverhaltens
2002, 300 Seiten, Broschur
Band 42
45., 46. und 48. Jahrestagung der Schutzkommission beim Bundesminister des Innern
– Vorträge –
2000, 344 Seiten, Broschur
Band 41
W. König, M. Köller
Einfluss von Zytokinen und Lipidmediatoren auf
die Kontrolle und Regulation spezifischer
Infektabwehr bei Brandverletzung
2002, 76 Seiten, Broschur
Band 40
Institut der Feuerwehr Sachsen-Anhalt
Entwicklung von Dekontaminationsmitteln und
-verfahren bei Austritt von Industriechemikalien
2002, Broschur
Band 39
TÜV Energie und Umwelt GmbH
Optimierung des Schutzes vor luftgetragenen
Schadstoffen in Wohngebäuden
2002, Broschur
Band 38
W. Kaiser, M. Schindler
Rechnergestütztes Beratungssystem für das
Krisenmanagement bei chemischen Unfällen
(DISMA®)
1999, 156 Seiten, Broschur
Band 37
– in Vorbereitung –
K.-J. Kohl, M. Kutz
Entwicklung von Verfahren zur Abschätzung
der gesundheitlichen Folgen von Großbränden
71
Band 36
M. Weiss, B. Fischer, U. Plappert und T. M. Fliedner
Biologische Indikatoren für die Beurteilung multifaktorieller Beanspruchung
Experimentelle, klinische und systemtechnische
Untersuchung
1998, 104 Seiten, Broschur
Band 35
K.Amman, A.-N. Kausch, A. Pasternack, J. Schlobohm, G. Bresser, P. Eulenburg
Untersuchung der Praxisanforderungen an Atemund Körperschutzausstattung zur Bekämpfung
von Chemieunfällen
2002, Broschur
Band 34
W. Heudorfer
Untersuchung der Wirksamkeit von Selbstschutzausstattung bei Chemieunfällen
1998, Broschur
Band 33
J. Bernhardt, J. Haus, G. Hermann, G. Lasnitschka,
G. Mahr, A. Scharmann
Laserspektrometrischer Nachweis von Strontiumnukliden
1998, 128 Seiten, Broschur
Band 32
G. Müller
Kriterien für Evakuierungsempfehlungen bei
Chemiekalienfreisetzungen
1998, 244 Seiten + Faltkarte, Broschur
Band 31
G. Schallehn und H. Brandis
Beiträge zur Isolierung und Indentifizierung
von Clostridium sp. und Bacillus sp. sowie zum
Nachweis deren Toxine
1998, 80 Seiten, Broschur
Band 30
G. Matz
Untersuchung der Praxisanforderung an die Analytik bei der Bekämpfung großer Chemieunfälle
1998, 192 Seiten, Broschur
Band 29
D. Hesel, H. Kopp und U. Roller
Erfahrungen aus Abwehrmaßnahmen bei chemischen Unfällen
1997, 152 Seiten, Broschur
72
Band 28
R. Zech
Wirkungen von Organophosphaten
1997, 110 Seiten, Broschur
Band 27
G. Ruhrmann, M. Kohring
Staatliche Risikokommunikation bei Katastrophen
Informationspolitik und Akzeptanz
1996, 207 Seiten, Broschur
Band 26
43. und 44. Jahrestagung der Schutzkommission beim Bundesminister des Innern
– Vorträge –
1997, 326 Seiten, Broschur
Band 25
K. Buff, H. Greim
Abschätzung der gesundheitlichen Folgen von
Großbränden
– Literaturstudie – Teilbereich Toxikologie
1997, 138 Seiten, Broschur
Band 24
42. Jahrestagung der Schutzkommission beim
Bundesminister des Innern
– Vorträge –
1996, 205 Seiten, Broschur
Band 23
K. Haberer, U. Böttcher
Das Verhalten von Umweltchemikalien in Boden
und Grundwasser
1996, 235 Seiten, Broschur
Band 22
B. Gloebel, C. Graf
Inkorporationsverminderung für radioaktive
Stoffe im Katastrophenfall
1996, 206 Seiten, Broschur
Band 21
Arbeiten aus dem Fachausschuß III: Strahlenwirkungen – Diagnostik und Therapie
1996, 135 Seiten, Broschur
Band 20
Arbeiten aus dem Fachausschuß V
I. – D. Henschler: Langzeitwirkungen phosphororganischer Verbindungen
II. – H. Becht: Die zellvermittelte typübergreifende
Immunantwort nach Infektion mit dem Influenzavirus
III. – F. Hoffmann, F. Vetterlein, G. Schmidt;
Die Bedeutung vasculärer Reaktionen beim akuten
Nierenversagen nach großen Weichteilverletzungen
(Crush-Niere)
1996, 127 Seiten, Broschur
Band 19
Radioaktive Strahlungen
I. – B. Kromer unter Mitarbeit von K. O. Münnich,
W. Weiss und M. Zähringer:
Nuklidspezifische Kontaminationserfassung
II. – G. Hehn:
Datenaufbereitung für den Notfallschutz
1996, 164 Seiten, Broschur
Band 18
L. Clausen, W.R. Dombrowsky, R.L.F. Strangmeier
Deutsche Regelsysteme
Vernetzungen und Integrationsdefizite bei der
Erstellung des öffentlichen Gutes, Zivil- und
Katastrophenschutz in Europa
1996, 130 Seiten, Broschur
Band 17
41. Jahrestagung der Schutzkommission beim
Bundesminister des Innern
– Vorträge –
1996, 197 Seiten, Broschur
Band 16
F. E. Müller, W. König, M. Köller
Einfluß von Lipidmediatoren auf die Pathophysiologie der Verbrennungskrankheit
1993, 42 Seiten, Broschur
Band 15
Beiträge zur dezentralen Trinkwasserversorgung
in Notfällen
Teil II: K. Haberer und M. Drews
1. Einfache organische Analysenmethoden
2. Einfache Aufbereitungsverfahren
1993, 144 Seiten, Broschur
Band 14
Beiträge zu Strahlenschäden und Strahlenkrankheiten
I. – H. Schüßler: Strahleninduzierte Veränderungen
an Säugetierzellen als Basis für die somatischen
Strahlenschäden
II. – K. H. von Wangenheim, H.-P. Peterson, L.E.
Feinendegen: Hämopoeseschaden, Therapieeffekte
und Erholung
III. – T. M. Fliedner, W. Nothdurft: Präklinische
Untersuchungen zur Beschleunigung der Erholungsvorgänge in der Blutzellbildung nach Strahleneinwirkung durch Beeinflussung von Regulationsmechanismen
IV. – G. B. Gerber: Radionuklid Transfer
1993, 268 Seiten, Broschur
Band 13
H. Mönig, W. Oehlert, M. Oehlert, G. Konermann
Modifikation der Strahlenwirkung und ihre Folgen für die Leber
1993, 90 Seiten, Broschur
Band 12
Biologische Dosimetrie
I. – H. Mönig, Wolfgang Pohlit, Ernst Ludwig
Sattler: Einleitung: Dosisabschätzung mit Hilfe der
Biologischen Dosimetrie
II. – Hans Joachim Egner et al.: Ermittlung der
Strahlenexposition aus Messungen an Retikulozyten
III. – Hans Mönig, Gerhard Konermann: Strahlenbedingte Änderung der Chemilumineszenz von Granulozyten als biologischer Dosisindikator
IV. – Paul Bidon et al.: Zellmembranänderungen
als biologische Dosisindikatoren. Strahleninduzierte
Membranänderung im subletalen Bereich. Immunbindungsreaktionen an Lymphozyten
1993, 206 Seiten, Broschur
Band 11
Beiträge zur Katastrophenmedizin
vergriffen
Band 10
W. R. Dombrowsky
Bürgerkonzeptionierter Zivil- und Katastrophenschutz
Das Konzept einer Planungszelle Zivil- und Katastrophenschutz
1992, 79 Seiten, Broschur
Band 9
vergriffen
39. und 40. Jahrestagung der Schutzkommission
beim Bundesminister des Innern
Band 8
vergriffen
Beiträge zur dezentralen Trinkwasserversorgung
in Notfällen
Teil I: K. Haberer und U. Stürzer
Band 7
E. Pfenninger und F. W. Ahnefeld
Das Schädel-Hirn-Trauma
vergriffen
73
Band 6
O. Messerschmidt und A. Bitter
Neutronenschäden
vergriffen
Band 5
vergriffen
R. E. Grillmaier und F. Kettenbaum
Strahlenexposition durch Ingestion von radioaktiv kontaminiertem Trinkwasser
Band 4
vergriffen
W. R. Dombrowsky
Computereinsatz im Zivil- und Katastrophenschutz
Band 3
B. Lommler, E. Pitt, A. Scharmann und R. Simmer
Der Nachweis schneller Neutronen in der Katastrophendosimetrie mit Hilfe von Ausweisen aus
Plastikmaterial
1990, 66 Seiten, Broschur
Band 2
vergriffen
Gammastrahlung aus radioaktivem Niederschlag
Berechnung von Schutzfaktoren
Band 1
vergriffen
L. Clausen und W. R. Dombrowsky
Zur Akzeptanz staatlicher Informationspolitik
bei technischen Großunfällen und Katastrophen
Katastrophenmedizin – Leitfaden für die
ärztliche Versorgung im Katastrophenfall
Neuauflage 2001, Broschur
Broschüren und eine komplette Liste aller
bisher erschienenen und bereits vergriffenen
Bände können kostenlos bezogen werden bei:
Bundesverwaltungsamt
– Zentralstelle für Zivilschutz –
Deutschherrenstraße 93–95
53177 Bonn
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Notitzen
75
Notitzen
76