(Full Article)

Züchtungskunde, 87, (1) S. 47–54, 2015, ISSN 0044-5401
© Verlag Eugen Ulmer, Stuttgart
The effects of the probiotic Enterococcus faecium NCIMB 10415 on
the immune response in weaned piglets (Dissertation)
Susanne Kreuzer-Redmer und Gudrun A. Brockmann
Problemstellung
In der vorliegenden Arbeit wird die sowohl für die praktische Schweineproduktion als
auch für die Veterinärmedizin wichtige Thematik des Einflusses des probiotischen Bakteriums Enterococcus faecium NCIMB 10415 (E. faecium) auf die systemische und Darm
assoziierte Immunantwort von Ferkeln untersucht.
Durchfall und Wachstumsdepressionen bei Ferkeln in der kritischen Phase des Absetzens sind ein wichtiges Produktionsproblem in der Schweinehaltung. Zudem führen
Durchfall und andere Erkrankungen in der Absetzphase zu erheblichen Einschränkungen im Wohlbefinden und der Tiergesundheit der heranwachsenden Ferkel.
In früheren Jahren wurden Antibiotika als Futterzusatz in der Ferkelzucht eingesetzt,
um den Gesundheitsstatus der Ferkel in der kritischen Phase des Absetzens zu verbessern. Dieser Antibiotikaeinsatz hat unter anderem zu Rückständen in Lebensmitteln,
Resistenzen der Bakterien und zunehmenden Bedenken der Verbraucher geführt. Seit
2006 ist der Einsatz von Antibiotika als Futtermitteladditiv in der Europäischen Union
verboten, vor allem um die Entstehung von Antibiotikaresistenzen zu minimieren.
Alternativ werden heute probiotisch wirkende Bakterien und andere Futtermittelzusätze, welche u.a. das Immunsystem stärken und somit die Gesundheit fördern sollen,
verwendet. Viele Hersteller von Futterzusatzstoffen geben eine positive Wirkung von
probiotischen Bakterien auf das Wohlbefinden und die Gesundheit von Schweinen an.
Die Wirkungsmechanismen probiotischer Bakterien, welche zu den angegebenen positiven Effekten führen sollen, sind allerdings noch nicht aufgeklärt. In der Europäischen
Union ist E. faecium NCIMB 10415 als probiotisches Bakterium zugelassen (EG Nr. 1831/
2003). Zur genauen Wirkungsweise und den schützenden Effekten gegenüber Infektionen von E. faecium ist jedoch kaum etwas bekannt. Deswegen wurden im Rahmen des
Sonderforschungsbereiches 852, finanziert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft,
Experimente durchgeführt, in welchen die Effekte einer Supplementation des Futters mit
dem probiotischem Bakterium E. faecium in Deutsche Landrasse Ferkeln im kritischen
Zeitraum des Absetzens auf verschiedene Parameter getestet werden sollten.
HUMBOLDT-UNIVERSITÄT ZU BERLIN, Lebenswissenschaftliche Fakultät, Albrecht Daniel ThaerInstitut für Agrar- und Gartenbauwissenschaften, FG Züchtungsbiologie und molekulare Tierzüchtung, Invalidenstraße 42, 10115 Berlin, E-Mail: [email protected]
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Susanne Kreuzer-Redmer und Gudrun A. Brockmann
Sensitivität der Versuchsferkel gegenüber enterotoxischen Escherichia Coli
Bakterien
Ein Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die genetische Prädisposition für die
Infektionsanfälligkeit für ubiquitär vorkommende enterotoxische Escherichia Coli Bakterien
(ETEC) zu ermitteln, so dass alle für die durchgeführten Fütterungsversuche genutzten
Ferkel die gleiche genetische Prädisposition zur Infektionsanfälligkeit gegenüber ETEC
aufwiesen. Das war eine wichtige Voraussetzung für die gezielten Analysen der Immunantwort zwischen den Fütterungsgruppen in den Probiotika-Experimenten. Die Kolonisation des Dünndarms mit ETEC erfolgt über Fimbrien, die an Rezeptoren der Dünndarmschleimhaut binden. Sind diese Rezeptoren mutiert, kann ETEC nicht binden und somit
den Wirt nicht infizieren. In Schweinen gibt es zwei bekannte Loci, welche mit der Anfälligkeit zur Infektion mit ETEC assoziiert sind. Ein Locus betrifft die genetische Prädisposition zur Infektionsanfälligkeit für ETEC Bakterien mit dem Fimbrien Typ F4ab/F4ac und
ein weiterer Locus codiert den Rezeptor für ETEC Bakterien mit Fimbrien des Typs F18.
Für die Entwicklung des Tests zur Bestimmung des ETEC F4ab/ac Rezeptorstatus wurden
die bereits charakterisierten SNP Marker ALGA0106330, MUC13-226 und MUC13-813
genutzt (Tab. 1). Rampoldi et al. (2011) zeigten, dass die für den Gentest verwendeten
3 SNP-Allele, welche sich proximal zu bzw. im MUC13 Gen auf Chromosom 13 befinden,
im Kopplungsungleichgewicht mit dem ETEC F4ab/ac Rezeptorgen stehen.
In der eingesetzten Deutschen Landrasse Population sind die drei SNPs zu 100% gekoppelt und bilden divergente Haplotypen.
Erstmals wurde damit ein Allel spezifischer PCR-Test für die Bestimmung der genetischen Resistenz gegenüber ETEC F4ab/ac entwickelt. Der Gentest basiert auf Fluoreszenz markierten Allel spezifischen Primern (Abb. 1).
Nur Primer welche binden werden amplifiziert und können bei entsprechender Anregung spezifisch ihr Lichtsignal abgeben.
Ein weiterer neuer und schnellerer Allel-spezifischer Gentest wurde für den F18 Rezeptor entwickelt. Er basiert auf dem SNP FUT1M307 direkt im porcinen F18 Rezeptorgen. Dieser Gentest berücksichtigt die aktuellen Entwicklungen in der Molekularbiologie
und ist genauso akkurat wie der von Meijerink et al., 1997 entwickelte Test, jedoch
schneller und kostengünstiger.
Alle getesteten Ferkel waren empfänglich für die Infektion durch ETEC F4ab/F4ac und
ETEC F18. Dadurch konnten Unterschiede bezüglich der Immunantwort auf ubiquitär
vorkommende ETEC Bakterien in den beiden Experimenten mit hoher Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen werden. Die beiden Tests wurden als Standardtests zur Bestimmung
des ETEC F4ab/F4ac oder ETEC F18 Rezeptorstatus vorgeschlagen.
Tab. 1. SNPs zur Bestimmung des ETEC F4ab/ac Rezeptorstatus
SNPs for discrimination of the ETEC F4ab/ac receptor status.
Quelle
Resistenter Haplotyp
Sensitiver Haplotyp
SNP ALGA0106330
SNP MUC13-226
SNP MUC13-813
PorcineSNP60
BeadChip; Ilumina
T
C
Jacobsen et al., 2010
Zhang et al., 2008
G
A
C
T
Effekte des probiotischen Bakteriums E. faecium auf die Immunantwort in Ferkeln
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Abb. 1. Schematische Darstellung der Allel spezifischen Bindung der Primer A1 und A2 zur Differenzierung des Rezeptorstatus
Scheme of allele specific binding of primers A1 and A2 used for the discrimination of the receptor status. Only primers which are able to specifically bind lead to amplification of a product
detected by a fluorescent signal
Durch Genotypisierung von allen in den Experimenten genutzten Elterntieren, sowie
weiteren unverwandten Deutsche Landrasse Schweinen, konnten Genotypen und Allelfrequenzen für die F4ab/F4ac und F18 Rezeptorvarianten (Abb. 2) bestimmt werden.
Der Probiotikum-Effekt auf die Immunantwort
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss des Probiotikums E. faecium
auf die darmassoziierte Immunantwort von Ferkeln ohne oder mit experimenteller Infektion durch Salmonella enterica serovar Typhimurium zu untersuchen.
In den Versuchen wurden dem Futter der Muttersau ab vier Wochen ante partum
4.2 × 106 Kolonie bildenden Einheiten (KBE) E. faecium pro g Futter und dem Prestarter
Abb. 2. Genotypen und Allelfrequenzen für die F4ab/F4ac und F18 Rezeptorvarianten in 430 genotypisierten Deutsche Landrasse Schweinen.
Genotypes and allele frequencies of F4ab/F4ac und F18 receptor variants genotyped in 430
German Landrace pigs
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Susanne Kreuzer-Redmer und Gudrun A. Brockmann
Futter der Ferkel 5.1 × 106 KBE E. faecium pro g Futter zugesetzt. Die Absatzferkel erhielten 3.6 × 106 KBE E. faecium pro g Starter-Futter.
Um die Immunantwort der Ferkel zu erfassen, wurden Immunzellpopulationen des
adaptiven Immunsystems untersucht, welches zur Klärung von Infektionen in der Absetzperiode wichtig ist (Abb. 3).
Die Immunantwort wurde im lymphatischen Gewebe des Darms (im Speziellen: mesenteriale Lymphknoten und Peyersche Platten von Ileum und Jejunum sowie die ileale
Papilla) und im Blut im Vergleich zu einer nicht supplementierten Kontrollgruppe untersucht. Die Lymphozyten-Populationen und -Subpopulationen wurden durchflusszytometrisch auf Proteinebene und mittels quantitativer PCR hinsichtlich des Transkriptniveaus
von Transkriptionsfaktoren, die an der Differenzierung von Immunzellen beteiligt sind,
analysiert. Für die Differenzierung in TH1 Zellen wurde die Transkriptmenge der Transkriptionsfaktoren TBET (T-box transcription factor), für TH2 Zellen GATA3 (Trans-acting
T-cell-specific transcription factor) und für Treg Zellen FOXP3 (Forkhead box P3) ermittelt.
Abb. 3. T- und B-Lymphozyten des adaptiven Immunsystems, die im Darm assoziierten Lymphgewebe untersucht wurden. Dargestellt sind charakteristische Oberflächenmoleküle
(CD3, TcR-N4 delta, CD4, CD8, IgM, CD21, MHCII, CD25) anhand derer eine Identifizierung
der einzelnen Populationen mittels Durchflusszytometrie möglich ist. TH: T Helferzelle, Tregs:
regulatorische T Helferzelle, CTL: zytotoxischer T Lymphozyt.
Depiction of T and B lymphocytes of the adaptive immune system analyzed in gut associated
tissues. Shown are characteristic surface markers (CD3, TcR-N4 delta, CD4, CD8, IgM, CD21,
MHCII, CD25), which were used to identify immune cell populations by flow cytometry. TH:
T helper cell, Tregs: regulatory T helper cell, CTL: cytotoxic T lymphocyte.
Effekte des probiotischen Bakteriums E. faecium auf die Immunantwort in Ferkeln
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In einem ersten Fütterungs-Experiment zur Wirkung von E. faecium im Vergleich von
Kontrolle und Behandlung wurden jeweils sechs Ferkel pro Fütterungsgruppe am 12.,
26., 34., und 54. Lebenstag beprobt, wobei die Ferkel am 26. Lebenstag abgesetzt wurden. Dieses Experiment hat sich zudem auf die Interaktion zwischen dem Wirt Schwein
und natürlich vorkommenden Viren konzentriert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit
konnte eine signifikante Erhöhung von zytotoxischen T-Zellen in den Ferkeln vor dem
Absetzen am 12. Lebenstag nachgewiesen werden (Abb. 4). Zytotoxische T-Zellen sind in
der Lage entartete und infizierte Zellen zu töten und somit auch sehr wichtig in der Klärung von Infektionen.
In einer parallelen Arbeit am Bundesinstitut für Risikobewertung an denselben Ferkeln wurden ubiquitär vorkommende Viren untersucht. Unter anderem wurde gefunden, dass Rotavirus A später und in geringerer Zahl im Kot der Ferkel aufgetreten ist. Die
Erhöhung der relativen Anzahl der zytotoxischen T-Zellen vor dem Absetzen könnte
einen protektiven Effekt gegen Rotavirus A hervorgerufen haben. Das Resultat dieses
Experimentes stützt die Hypothese, dass das probiotische Bakterium E. faecium einen
positiven Effekt auf die Immunantwort von Ferkeln unter der Berücksichtigung ausgewählter natürlich auftretender Virusinfektionen im Schwein zum kritischen Zeitpunkt
des Absetzens hat.
In einem weiteren Experiment wurden Effekte von E. faecium auf die darmassoziierte
Immunantwort nach einer experimentellen Infektion mit Salmonella enterica serovar
Typhimurium (S. Typhimurium) untersucht. Die Ferkel wurden am 26. Lebenstag abgesetzt und am 36. Lebenstag mit S. Typhimurium infiziert. Es wurden Proben von jeweils
Abb. 4. Relative Zellzahl von zytotoxischen T-Zellen in ilealen Lymphknoten (IL LN) und im Blut von
Ferkeln mit (graue Säulen) und ohne (weiße Säulen) Gabe des Probiotikums E. faecium.
N = 6/Fütterungsgruppe/Alter in Tagen
Relative cell count of cytotoxic T cells in ileal lymph nodes (IL LN) and blood of piglets with (grey
bars) and without (white bars) E. faecium supplementation. N = 6/feeding group/days of age
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Susanne Kreuzer-Redmer und Gudrun A. Brockmann
sechs Ferkel pro Fütterungsgruppe (+/– E. faecium) von mesenterialen Lymphknoten und
Peyerschen Platten vom Ileum und Jejunum sowie der ilealen Papilla und vom Blut zwei
Tage (38. Lebenstag) und 28 Tage (64. Lebenstag) nach der Infektion genommen. Die
Supplementierung des Futters mit E. faecium hatte keinen Effekt auf die relative Anzahl
von allen in Abbildung 3 dargestellten T- und B-Zellpopulationen in den untersuchten
darmassoziierten Geweben und im Blut. Es konnte jedoch in einer differenzierteren
Untersuchung der T-Helferzellsubpopulationen in magnetisch sortierten CD4 positiven
Lymphozyten aus dem ilealen Lymphknoten höhere Transkriptmengen von GATA3 und
FOXP3 in der Kontrollgruppe im Vergleich zur E. faecium gefütterten Probiotika-Gruppe
beobachtet werden (Abb. 5). TBET war im Vergleich zu FOXP3 und GATA3 nur gering
exprimiert und zeigte keine Unterschiede in den Fütterungsgruppen.
GATA3 ist mit der Differenzierung von naiven T Helferzellen zu aktivierten protektiven TH2 Zellen assoziiert. FOXP3 ist transient in allen aktivierten T Helferzellen exprimiert. Das in Abbildung 5 dargestellte Expressionsmuster lässt den Schluss zu, dass in
der probiotischen Fütterungsgruppe eine geringere Aktivierung von TH2 Zellen vorliegt.
TH2 Zellen sind für eine effiziente adaptive Immunantwort sehr wichtig. Sie aktivieren
unter anderem B Zellen. In einer parallelen Untersuchung am Bundesinstitut für Risikobewertung wurden zudem höhere Salmonellentiter im Kot sowie in den Tonsillen in der
E. faecium gefütterten Gruppe gefunden. Die stärkere TH2 assoziierte Immunantwort in
der Kontrollgruppe im Vergleich zu der probiotisch gefütterten Gruppe hat wahrscheinlich zu der beobachteten besseren Beseitigung von S. Typhimurium in der Kontrollgruppe beigetragen. In diesem Experiment konnte keine erhöhte Immunantwort und
damit verbundene bessere Widerstandsfähigkeit gegen eine S. Typhimurium Infektion
durch die Gabe von E. faecium festgestellt werden.
Abb. 5. Relative Transkriptmenge der Transkriptionsfaktoren TBET (T-box transcription factor = TH1
Zell assoziiert), GATA3 (Trans-acting T-cell-specific transcription factor = TH2 Zell assoziiert)
und FOXP3 (Forkhead box P3 = Treg Zell und allgemein mit aktivierten T Helferzellen assoziiert) in Ferkel mit (schwarze Säulen) oder ohne (weiße Säulen) probiotischer Fütterung
2 Tage (2d) und 28 Tage (28d) nach Infektion mit S. Typhimurium
Relative transcript amount of the transcription factors TBET (T-box transcription factor = TH1
cell associated), GATA3 (Trans-acting T-cell-specific transcription factor = TH2 cell associated)
and FOXP3 (Forkhead box P3 = Treg cell associated, as well as associated with activated T helper
cells) of piglets with (black bars) and without (white bars) E. faecium feeding two days and
28 days post infection with S. Typhimurium
Effekte des probiotischen Bakteriums E. faecium auf die Immunantwort in Ferkeln
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Schlussfolgerung
Die Ergebnisse der beiden Experimente zeigen eine ambivalente Wirkung des probiotischen Bakteriums E. faecium. Auf der einen Seite konnte durch die Supplementierung
des Futters mit E. faecium eine frühe Immunantwort, welche zu der späteren und geringeren Rotavirus A Infektion der Ferkel der Probiotika Gruppe geführt haben könnte, gezeigt werden. Auf der anderen Seite wurde deutlich, dass eine Futtersupplementierung
mit E. faecium nicht zu einer protektiven Aktivierung des Immunsystems gegen eine
Infektion durch S. Typhimurium nach dem Absetzen geführt hat. Im Gegenteil, für die
nicht-supplementierte Kontrollgruppe konnte eine höhere TH2 assoziierte Immunantwort nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse legen die Hypothese nahe, dass E. faecium
eventuell nur einen positiven Effekt auf virale Infektionen, jedoch nicht auf fakultativ
invasive bakterielle Infektionen, unter anderem durch S. Typhimurium hervor gerufen,
haben kann. Der spätere Beprobungszeitpunkt im Infektionsexperiment könnte eine
alternative Erklärung für den schlechteren Immunschutz gegenüber dem Pathogen
S. Typhimurium in der probiotischen Fütterungsgruppe sein.
Demnach haben E. faecium Effekte auf der einen Seite unterschiedliche Auswirkungen
auf verschiedene Pathogene und auf der anderen Seite wahrscheinlich auch einen zeitlichen Faktor, welcher zu beachten ist. Weitere Experimente sind notwendig, um eine
Pathogenspezifität und den ursächlichen Mechanismus von E. faecium aufzuklären.
Die Arbeiten wurde finanziert von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG)
innerhalb des Sonderforschungsbereichs 852/1 „Ernährung und intestinale Mikrobiota
– Wirtsinteraktionen beim Schwein“
Literatur
Der Inhalt der Dissertation wurde in folgenden Originalartikeln veröffentlicht:
Kreuzer, S., P. Machnowska, J. Assmus, M. Sieber, R. Pieper, M.F. Schmidt, G.A. Brockmann, L. Scharek-Tedin and R. Johne, (2012a): Feeding of the probiotic bacterium
Enterococcus faecium NCIMB 10415 differentially affects shedding of enteric viruses in
pigs. Vet. Res. 43(1), 58.
Kreuzer, S., P. Janczyk, J. Assmus, M.F. Schmidt, GA. Brockmann and K. Nöckler,
(2012b): No Beneficial Effects Evident for Enterococcus faecium NCIMB 10415 in
Weaned Pigs Infected with Salmonella enterica Serovar Typhimurium DT104. Appl.
Environ Microbiol. 78(14), 4816–25.
Kreuzer, S., M. Reissmann and G.A. Brockmann, (2013a): Gene test to elucidate 1 the
ETEC F4ab/F4ac receptor status in pigs. Vet. Microbiol. 162(1), 293–5.
Kreuzer, S., M. Reissmann and G.A. Brockmann, (2013b): New fast and cost-effective
gene test to get the ETEC F18 receptor status in pigs. Vet. Microbiol. 163(3–4), 392–4.
Kreuzer, S., J. Rieger, E.M. Strucken, N. Thaben, H. Hunigen, K. Nockler, P. Janczyk,
J. Plendl and G.A. Brockmann, (2014): Characterization of CD4 + subpopulations and
CD25 + cells in ileal lymphatic tissue of weaned piglets infected with Salmonella Typhimurium with or without Enterococus faecium feeding. Vet. Immunol. Immunopathol.
158(3–4), 143–55.
Siepert, B., N. Reinhardt, S. Kreuzer, A. Bondzio, S. Twardziok, G.A. Brockmann, K.
Nöckler, I. Szabó, P. Janczyk, R. Pieper and K. Tedin, (2014): Enterococcus faecium
NCIMB 10415 supplementation affects intestinal immune-associated gene expression
in post-weaning piglets. Vet. Immunol. Immunopathol. 157(1–2), 65–77.
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Susanne Kreuzer-Redmer und Gudrun A. Brockmann
Twardziok, S., R. Pieper, J. Aschenbach, C. Bednorz, G.A. Brockmann, M. Fromm, S.
Klingspor, S. Kreuzer, U. Lodemann, H. Martens, L. Martin, J.F. Richter, L. ScharekTedin, B.F. Siepert, I.C. Starke, K. Tedin, W. Vahjen, L.H. Wieler, S.S. Zakrzewski,
J. Zentek and P. Wrede, (2014): Cross-talk Between Host, Microbiome and Probiotics:
A Systems Biology Approach for Analyzing the Effects of Probiotic Enterococcus faecium
NCIMB 10415 in Piglets. Molecular Informatics 33 (3), 171–182.
Jacobsen, M., S.S. Kracht, G. Esteso, S. Cirera, I. Edfors, A.L. Archibald, C. Bendixen,
L. Andersson, M. Fredholm and C.B. Jorgensen, (2010): Refined candidate region
specified by haplotype sharing for Escherichia coli F4ab/F4ac susceptibility alleles in
pigs. Anim. Genet. 41, 21–25.
Meijerink, E., R. Fries, P. Vogeli, J. Masabanda, G. Wigger, C. Stricker, S. Neuenschwander, H.U. Bertschinger and G. Stranzinger, (1997): Two alpha(1,2) fucosyltransferase genes on porcine chromosome 6q11 are closely linked to the blood group
inhibitor (S) and Escherichia coli F18 receptor (ECF18R) loci. Mamm. Genome 8, 736–
741.
Rampoldi, A., M.J. Jacobsen, H.U. Bertschinger, D. Joller, E. Burgi, P. Vogeli, L.
Andersson, A.L. Archibald, M. Fredholm, C.B. Jorgensen and S. Neuenschwander,
(2011): The receptor locus for Escherichia coli F4ab/F4ac in the pig maps distal to the
MUC4-LMLN region. Mamm Genome 22, 122–129.
Zhang, B., J. Ren, X. Yan, X. Huang, H. Ji, Q. Peng, Z. Zhang and L. Huang, (2008):
Investigation of the porcine MUC13 gene: isolation, expression, polymorphisms and
strong association with susceptibility to enterotoxigenic Escherichia coli F4ab/ac. Anim.
Genet. 39, 258–266.