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Gebrauchsinformation auf Deutsch CMV BriteTM Test (100 Test) Immunfluoreszenztest zum Nachweis von CMV pp65 in humanen peripheren Leukozyten [REF] VIR-CMV-100 0344 In Vitro Diagnostikum IQ Products Rozenburglaan 13a 9727 DL Groningen Holland Tel: +31 50 5757 000 Fax: +31 50 5757 002 Anwendung Der CMV BriteTM Test dient zum qualitativen Nachweis von pp65 Lower Matrix Protein des humanen Cytomegalie-Virus (CMV) in isolierten peripheren Leukozyten aus menschlichem Blut, das mit den Antikoagulanzien EDTA oder Heparin versetzt wurde. Der Antigennachweis erfolgt durch ein Mix aus zwei monoklonalen Antikörpern (CMV C10 und C11). Der Nachweis von pp65 in humanen peripheren Blutzellen unterstützt die Diagnose der akuten oder reaktiven CMV-Infektion. Zusammenfassung Das humane Cytomegalie-Virus ist ein DNA-Virus, das zur Familie der Herpesviren gehört. Sein Durchmesser beträgt ca. 200 nm. Es besitzt einen Kern (Core) aus doppelsträngiger DNA, ein Kapsid aus 162 Protein-Untereinheiten (Kapsomere) und eine Hülle (Envelope) (1). Infektionen mit dem CMV sind weit verbreitet, verlaufen beim Gesunden aber meist subklinisch. Bei abwehrgeschwächten Patienten und während der fetalen Entwicklung kann eine CMV-Infektion jedoch mit lokaler Symptomatik oder mit schweren generalisierten Krankheitsverläufen einhergehen. Zu den vielfältigen Manifestationen gehören Pneumonie, Retinitis, Hepatitis, Enteritis und neurologische Erkrankungen. Trotz verbesserter Therapieschemata führt die CMV-Infektion bei Transplantatempfängern sowie Patienten mit malignen Tumoren (insbesondere bei Leukämie oder Lymphomen) oder bei lmmunschwäche durch AIDS zu hoher Morbidität und Mortalität. Für diese Patienten besteht das Risiko einer Erkrankung sowohl durch eine Primärinfektion als auch durch eine reaktivierte latente Infektion (2-4). Von besonderer Bedeutung ist die frühe und schnelle Diagnostik der Virusinfektion zur Vermeidung von zu hohen Gaben immunsuppressiver Medikamente und als Begleitung antiviraler Therapie. Schwierigkeiten bereitet jedoch die Unterscheidung zwischen asymptomatischer Virusausscheidung und therapiebedürftiger Infektion. Der Nachweis des Cytomegalie-Virus aus Blutproben (CMV-Virämie) korreliert am ehesten mit dem symptomatischen Krankheitsverlauf, während die Isolierung aus Speichel und Urin auch bei inapparentem Krankheitsverlauf möglich sind (5). Die konventionellen Methoden der CMV-Isolierung aus Blut sind zwar sensitiv, aber das Ergebnis liegt meist erst nach Wochen vor. "Shell Vial Cultures" (Deckglaskulturen) liefern ein Ergebnis innerhalb von 1-2 Tagen, aber die Methode ist für Blutproben nicht empfindlich genug. Dagegen ist der Nachweis von CMV-Antigen (CMVAntigenämie) in polymorphkernigen peripheren Leukozyten (PMNL) sowohl sensitiv als auch schnell (56). Bei dieser Technik werden monoklonale Antikörper verwendet, um das "Lower Matrix" Phosphoprotein pp65 nachzuweisen; pp65 ist ein bei der Virusreplikation früh auftretendes Antigen, das im Überschuß in PMNL vorkommt (6-9). Der CMV-Antigenämie-Test hat sich bewährt zur Diagnose und Überwachung von aktiven CMVInfektionen bei Organ- und Knochenmark-Transplantatempfängern (1,2,10-13,19). Es liegen Berichte vor, wonach auch bei AIDS-Patienten die CMV-Antigenämie eine Korrelation mit der CMV-Erkrankung zeigt. Testprinzip Beim CMV Antigenämie-Test wird ein Mix aus zwei monoklonalen Antikörpern (CMV C10 und C11) verwendet, die gegen das CMV Lower Matrix Protein pp65 gerichtet sind. Im CMVTM Brite Test wird dieser Antikörper-Mix in Verbindung mit einer indirekten Immunfluoreszenzfärbung bei Präparaten aus peripheren Blutzellen (PMNL) eingesetzt, um das CMV-spezifische Antigen pp65 nachzuweisen. 1 Der Testablauf gliedert sich in folgende Schritte: 1) Leukozytentrennung 2) Herstellung von Objektträger-Präparaten durch Zytozentrifugation 3) Fixierung und Permeabilisierung der Zellen 4) Indirekte Immunfluoreszenz-Färbung unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen das CMV pp65 Protein 5) Auswertung und Beurteilung der Ergebnisse Im ersten Schritt wird eine Suspension gereinigter Leukozyten durch Zentrifugation und durch Lyse von kontaminierenden Erythrozyten hergestellt. Die Zellmembran der auf einen Objektträger zentrifugierten und fixierten Leukozyten wird permeabel gemacht, um den Nachweis des CMV pp65 Proteins durch die monoklonalen Antikörper C10/C11 zu ermöglichen. Der gebildete Immunkomplex wird durch Reaktion mit einem zweiten, FITC-konjugierten Antikörper sichtbar gemacht. CMV-Antigen positive Leukozyten zeigen im Fluoreszenzmikroskop eine homogene, gelb-grüne polylobate Kernfärbung. Die Anzahl der positiven Leukozyten wird bei 2 parallel angefertigten Objektträgern gezählt. Die gesamte Testdurchführung einschließlich Probenaufbereitung erfordert weniger als fünf Stunden. Reagenzien Inhalt des Kits 100 Tests 1) CMV BriteTM Reagenz A Dextranlösung (Dextran in PBS), gebrauchsfertig 1 x 100 ml 2) CMV BriteTM Reagenz B Lösung zur Erythrozytenlyse (Ammoniumchlorid-Lösung), Konzentrat: 1:10 mit Aqua dest. verdünnen 1 x 30 ml 3) CMV BriteTM Reagenz C Fixierlösung (Formaldehyd in PBS), Konzentrat: 1:5 mit Aqua dest. verdünnen. Xn 20-22/36-38/40/43 1 x 290 ml 4) CMV BriteTM Reagenz D Lösung zur Permeabilisierung der Zellmembran (Igepal Ca-630 und Serum des Neugeborenes Kalb in PBS), Konzentrat: 1:5 Aqua dest. verdünnen 1 x 290 ml 5) CMV BriteTM Reagenz E Serum des neugeborenes Kalb in PBS, Vor Gebrauch 1:200 mit PBS verdünnen 1 x 15 ml 6) CMV BriteTM Reagenz F Monoklonale Antikörper (Maus), Mix von C1O/C11 (IgG1/IgG1) gegen das CMV Lower Matrix Protein pp65, gebrauchsfertig 1 x 5,9 ml 7) CMV BriteTM Reagenz G FITC-konjugierte Anti-Maus-Immunglobuline v. Schaf mit Evans Blue, gebrauchsfertig 1 x 5,9 ml 8) CMV BriteTM Kontroll-Präparate 20 x 1 Stück Objektträger mit je: 1 Positivkontrolle (fixierte pp65 antigenhaltige Zellen, gemischt mit Antigen-negativen HumanLeukozyten) und 1 Negativkontrolle (fixierte CMV-Antigen-negative Human-Leukozyten), einzeln mit Trockenmittel verpackt, gebrauchsfertig 2 Zusätzlich erforderliche Materialien und Ausrüstung Laborzentrifuge, Vortex-Mischer konische 15 ml-Zentrifugenröhrchen, steril Pipetten, Mikropipetten und Spitzen Phosphatpuffer (PBS); Ca2+ und Mg2+ frei, pH 7,4 Destilliertes (demineralisiertes) Wasser Hemozytometer oder Coulter Counter Objektträger, Diamantstift o.ä. Marker Zytozentrifuge oder entsprechender Aufsatz für Laborzentrifuge Färbeküvette für die Histologie (Glasküvette für bis zu 10 Objektträgern) Feuchte Kammer, 37 °C Inkubator Fluoreszenzmikroskop (Vergrößerung 250 - 1000 x) mit Filterkombination für FITC Einschlußmedium, Deckgläser Abzug Lagerung und Haltbarkeit Lagerung bei 2 - 8 °C. Direkte Sonneneinstrahlung vermeiden. Unter Einhaltung der angegebenen Lagerbedingungen sind die Reagenzien auch nach Anbruch bis zum Verfallsdatum haltbar. Reagenzien nicht nach dem auf der Packung und den Etiketten der Fläschchen angegebenen Datum verwenden. Warn- und Entsorgungshinweise Zur Präparation der Kontroll-Objektträger wurden Leukozyten von gesunden menschlichen Blutspendern benutzt. Jede Spende wurde auf HBsAg, HIV-1-, HIV-2-, HCV- und CMV-Antikörper getestet und als negativ bewertet. Obwohl die Testmethoden eine hohe Genauigkeit aufweisen, stellen sie keine Garantie dafür dar, daß alle infektiösen Einheiten erkannt werden können. Die Präparate sollten daher so behandelt werden, als ob Krankheiten übertragen werden könnten. Alle Proben und bei der Testdurchführung verwendeten Materialien und Testreagenzien müssen als potentiell infektiös angesehen werden und daher vor der Entsorgung inaktiviert werden (z.B. durch Autoklavieren bei 121 °C, 1 Stunde). Die Reagenzien enthalten NaN3 (< 0,1%), das bei Kontakt mit Blei- oder Kupferrohren explosive Metallazide bildet. Deshalb bei der Beseitigung der Reagenzien mit reichlich Wasser nachspülen. Kontakt mit Haut und Schleimhäuten vermeiden. Das Reagenz C (Fixierlösung) enthält bis zu 9,3 % Formaldehyd, ein hochtoxisches Allergen und eine potentiell cancerogene Verbindung, die unter geeigneten Vorsichtsmaßnahmen verwendet werden soll. Der Kontakt mit Haut oder Augen ist zu vermeiden. Bei Berührung gründlich mit Wasser abspülen. Reagenzien aus Kits unterschiedlicher Chargenbezeichnung nicht mischen, bakterielle Kontamination der Reagenzien vermeiden. Fläschchen nach Gebrauch sorgfältig verschließen. Probenentnahme und -vorbereitung Mittels aseptischer Venenpunktion 5-10 ml Blut entnehmen (Antikoagulanz: Heparin oder EDTA). Die Leukozytenpräparation sollte innerhalb von 6 bis 8 Stunden erfolgen (Lagerung bei 20 - 25 °C). Jede Lagerung des Blutes kann zu einer Abnahme von antigenpositiven Zellen führen. Daher wird eine schnellstmögliche Zellpräparation auf Objektträger empfohlen. Die maximale Lagerdauer wurde nicht untersucht. Bei Patienten mit schwerer Neutropenie (absolute Neutrophilenzahl <200/mm3) sind zur Testdurchführung mindestens 10 ml Blut erforderlich. 3 Vorbereitung der Reagenzien Reagenz B 1:10 mit destilliertem Wasser verdünnen und auf 4 °C kühlen. Reagenz C 1:5 mit destilliertem Wasser verdünnen. Reagenz D 1:5 mit destilliertem Wasser verdünnen. Nicht mehr als den Tagesbedarf der Gebrauchslösungen herstellen! Die Reagenzien A, F und G sind gebrauchsfertig. Reagenz E direkt vor Gebrauch 1:200 mit PBS verdünnen. Testdurchführung Hinweis: Alle Reagenzien (außer Reagenz B) vor der Testdurchführung auf 20 - 25 °C bringen. I. – – – – Leukozytentrennung (Dextran-Sedimentation) 5 - 7 ml Vollblut mit 1,5 ml Reagenz A in einem konischen 15 ml-Röhrchen mit einem VortexMischer 5 - 10 Sek. mischen, 20 Min. bei 37 °C inkubieren (Röhrchen etwa im Winkel von 45° stellen). Deckel nicht fest verschließen. Wird mehr Blut für den Test eingesetzt, muß das Verhältnis Dextran/Blut 1:4 eingehalten werden. Den gesamten Überstand mit möglichst wenigen Erythrozyten mit einer Pipette in ein anderes 15 ml Röhrchen überführen und 10 Min. bei 1200 UpM (ca. 300 x g) zentrifugieren, Überstand verwerfen. Das Zellsediment in 5 ml verdünntem Reagenz B resuspendieren, mit dem Vortex gut mischen und 10 Min. bei 4 °C inkubieren. Nach Zugabe von 5 ml PBS zentrifugieren (10 Min. bei 1200 UpM) und den Überstand verwerfen. Dieser Schritt kann bei nicht ausreichender Lyse der Erythrozyten wiederholt werden. Zellsediment in 5 ml PBS waschen, dann zentrifugieren (10 Min. bei 1200 UpM) und den Überstand verwerfen. II. Zellzählung, Einstellung der Zellzahl – Das Zellsediment in 1 ml PBS resuspendieren. Bei Patienten mit schwerer Neutropenie (absolute Neutrophilenzahl <200/mm3) das Volumen auf bis zu 0,2 ml verringern. – Die Zellen im Hemozytometer oder im Automaten zählen. – Zellzahl durch Verdünnung mit PBS auf 1,5 x 106 Zellen/ml einstellen. III. Zytozentrifugation – 100 µl der auf 1,5 x 106 Zellen/ml eingestellten Suspension 4 Min. bei 600 - 800 UpM (ca. 60 x g) auf Objektträger zentrifugieren (= ca. 1,5 x 105 Zellen je Präparat). – Mindestens drei Präparate von jeder Patientenprobe anfertigen (zwei für den Test, weitere als Reserve). – Für mind. 5 Minuten trocknen lassen. – Vor der Fixierung können die Präparate bei Raumtemperatur über Nacht aufbewahrt werden. IV. Fixierung und Permeabilisierung – 100 ml Waschlösung herstellen: Reagenz E 1:200 in PBS verdünnen. Nicht mehrfach verwenden! – Präparate für 10 Min. bei Raumtemperatur unter einem Abzug in verdünntes Reagenz C tauchen. – Präparate dreimal in die Waschlösung (50 ml) tauchen, anschließend 5 Min. in derselben Lösung stehenlassen. – Präparate für 5 Min. bei Raumtemperatur in verdünntes Reagenz D tauchen. Nicht mehrfach verwenden! – Präparate zweimal in frische Waschlösung (50 ml) tauchen, dann 5-10 Min. in derselben Lösung stehenlassen. – ca. 15 Sek. mit destilliertem Wasser waschen. – Präparate unter dem Abzug trocknen lassen (ca. 20 Min.). – Die Präparate nach dem Trocknen sofort färben oder bei 2 – 8 °C für max. 24 Stunden lagern. Bei –80 °C sind die Objektträger, dicht in Alufolie verpackt, ca. 3 Monate haltbar. Eingefrorene Präparate in der Folie für 1 - 2 Stunden auftauen lassen und anschließend trocknen. 4 V. – – – – – – – – – Immunfluoreszenzfärbung Die auf die Objektträger fixierten Zellen mit laborüblichem Stift (z.B. Lack- oder Diamantstift) umranden, um das Zerfließen der Antikörperlösung zu vermeiden. Als Kontrolle einen CMV BriteTM Kontroll-Objektträger oder eine Zellpräparation eines CMVAntigenämie positiven Patienten verwenden. Die trockenen Objektträger sowie einen Kontroll-Objektträger 3-5 Min. in einer Küvette in PBS tauchen. Bei den nachfolgenden Schritten darf der Objektträger nicht trocken werden! Immer nur je einen Objektträger aus der Glasküvette entnehmen. Den Bereich um die fixierten Zellen vorsichtig abtupfen. 35 µl Reagenz F auf die fixierten Zellen pipettieren und 30 Min. bei 37 °C in einer feuchten Kammer inkubieren. Zweimal je 3 Min. mit frischem PBS in einer Glasküvette waschen. Immer nur jeweils einen Objektträger aus der Küvette entnehmen und den Bereich um die fixierten Zellen vorsichtig abtupfen. 35 µl Reagenz G auf die fixierten Zellen pipettieren und 30 Min. bei 37 °C in einer feuchten Kammer inkubieren. Zweimal mit frischem PBS und danach 5x mit Leitungswasser waschen, 1-2 Tropfen Einschlußmedium auf die fixierten Zellen tropfen und Deckglas auflegen. Vl. Mikroskopische Auswertung Die Präparate baldmöglichst auswerten (Lagerung bei 2 – 8 °C im Dunkeln bis zu 8 Stunden möglich). Beurteilung erfolgt unter dem Fluoreszenzmikroskop bei 250-facher Vergrößerung. Durch eine stärkere Vergrößerung (400 - 1000fach) kann eine bessere Auflösung erreicht werden. Die gesamte Fläche mit den fixierten Zellen muß durchgemustert werden. Positive Zellen zeigen eine homogene, gelb-grüne polylobate Kernfluoreszenz. Negative Zellen zeigen keine gelb-grüne Fluoreszenz der Kerne. Nicht eindeutig ablesbare durch Artefakte bedingte Färbung ist selten (< 5%): - Hauptsächlicher Artefakt ist eine unspezifische cytoplasmatische Fluoreszenz, ggf. mit schwarzen Stellen. Die Fluoreszenz erscheint dann matt und mehr gelbstichig. Vielfach sind es Eosinophile, die sich nicht ausreichend mit Evans Blue angefärbt haben. Anhand der Färbemuster lassen sich Artefakte und Zellen mit CMV-Antigenämie gut unterscheiden. - Eine typische grünliche Fluoreszenz nur der randständigen Zellen des Präparates ist als negativ zu werten. Sind die Präparate nicht auswertbar, werden die Reservepräparate gefärbt oder eine neue Probe aufbereitet. Ein typisches Ergebnis CMV pp65 antigenpositiver Zellen, die von einer Patientenprobe gewonnen wurden, zeigt die Abb. 1. Das Ergebnis positiver und negativer Kontrollen ist in Abb. 2 bzw. 3 dargestellt. Qualitätskontrolle Die im Kit enthaltenen Kontrollpräparate dienen nur zur Überwachung der Färbetechnik und haben keinen Einfluss auf den diagnostischen Wert des Kits. Eine ausreichende Färbung der positiven Kontrolle ist Voraussetzung für die Auswertung der Patientenproben. Die positive Kontrolle sollte eine homogene gelb-grüne Fluoreszenz der positiven Zellen mit runder Morphologie zeigen (Zellkern ist nicht sichtbar), dementsprechend fehlt diese bei der negativen Kontrolle. Trotz der Tatsache, dass die Qualitätsvorschriften strikt befolgt werden, könnten sich einzelne positive Zellen in der negativen Kontrolle befinden. In solchen Fällen sollte die Färbung für ungültig erklärt werden. Die positiven Einzelzellen auf der Negativkontrolle bedeuten nicht, dass die Objektträger mit Patientenproben nicht interpretiert werden können. Auch die Zellaufbereitung sollte durch geeignete Kontrollen überprüft werden. 5 Ergebnisse Interpretation Die Auswertung der Patientenproben erfolgt qualitativ und wird nach folgender Definition als positives oder negatives Ergebnis beurteilt: Positives Ergebnis: Mindestens eine CMV-Antigen positive Zelle in einem der beiden parallel gefärbten Objektträgern ist nachweisbar. Eine Korrelation zwischen der Anzahl positiver Zellen und dem Krankheitsbild kann aus einer einzelnen Patientenprobe nicht abgeleitet werden. Negatives Ergebnis: Keine CMV-Antigen positive Zelle in beiden parallel gefärbten Objektträgern ist nachweisbar. Für die Beurteilung eines negativen Resultats sollten mindestens 5 x 104 Zellen vorliegen. Ist bei einem der beiden Objektträger keine eindeutige Auswertung aufgrund von Artefakten möglich, wird folgendermaßen interpretiert: Positiv: Mindestens 1 CMV-Antigen positive Zelle auf einem der beiden Objektträger sichtbar, unklares Ergebnis bei dem anderen Objektträger. Negativ: keine CMV-Antigen positive Zelle auf einem der beiden Objektträger sichtbar, unklares Ergebnis bei dem anderen Objektträger. Ist aufgrund von Artefakten keine eindeutige Auswertung beider Parallelproben möglich, sollten die Resultate nicht interpretiert werden. Einschränkungen der Methode 1) Der Nachweis des CMV pp65 Lower Matrix Strukturproteins sollte in einem Labor mit Erfahrung in immunozytochemischen Techniken erfolgen. 2) Die Aussagefähigkeit des CMV BriteTM Tests wurde nur mit humanen Leukozyten untersucht, neonatale Proben wurden nicht getestet 4) Die Test-Charakteristika wurden nur mit Heparin und EDTA als Antikoagulanzien geprüft. 5) Der CMV BriteTM Test ist für die Durchfluß-Cytometrie nicht geeignet. 6) Der Nachweis des CMV pp65 Lower Matrix Strukturproteins in peripheren Blutleukozyten ist nicht der Beweis einer symptomatischen Erkrankung, da die Viren über einen langen Zeitraum nach einer akuten Infektion persistieren können, und da Patienten mit CMV-Antigenämie (insbesondere mit niedrigen Werten) einen asymptomatischen Krankheitsverlauf aufzeigen können. Veröffentlichte Berichte beschreiben auch Patienten, die Antigenämie-negativ und Virämie-positiv sind; einige dieser Patienten können dennoch erkrankt sein. Folglich schließt ein negativer Antigenämie-Test eine CMV-Infektion oder eine CMV-Erkrankung nicht völlig aus. 7) Die Zahl der Antigen-positiven Zellen je Objektträger kann durch Lagerung der heparinisierten Blutprobe abnehmen (15,16,17). Deshalb empfiehlt es sich, die Objektträger baldmöglichst nach der Blutentnahme herzustellen. Angaben zur maximal möglichen Lagerdauer von Proben bei Raumtemperatur können nicht gemacht werden. 8) Da die monoklonalen Antikörper mittels eines typischen Stammes hergestellt wurden, besteht die Möglichkeit, daß neue CMV-Varianten nicht erfaßt werden. Stämme mit einem Aminosäureaustausch in der Zielregion der Antikörper bleiben evtl. unerkannt. 6 Testcharakteristika Der CMV BriteTM Test wurde von zwei virologischen Labors in Kliniken mit Transplantationszentren oder AIDS-Behandlungszentren evaluiert: 300 venöse Blutproben wurden entnommen von 206 Transplantatempfängern (159 allogene KMT und 47 solide Transplantate), von 85 HIV positiven/AIDSPatienten und von neun immunkompetenten Patienten. 92 Proben (30,7%) wurden mit dem CMV BriteTM Test als positiv bewertet. Untersuchungen von Blutspendern zeigen, daß keine der Proben im CMV BriteTM Test wiederholt reaktiv waren. Der CMV BriteTM Test wurde mit dem Virusnachweis in konventioneller Zellkultur (CC) und in Shell Vial Cultures (SV) unter Verwendung von peripheren Leukozyten verglichen. Vergleich des CMV BriteTM Tests mit CC und SV (Klinik 1) CMV BriteTM Test CC/SV + - Gesamt + 3 0 3 - 45 103 148 Gesamt 48 103 151 Vergleich des CMV BriteTM Tests mit CC und SV (Klinik 2) CMV BriteTM Test CC/SV + + 28 3 Gesamt 31 - 16 102 118 Gesamt 44 105 149 Vergleich des CMV BriteTM Tests mit CC und SV (Klinik 1 + 2) CMV BriteTM Test CC/SV + - Gesamt + 31 3 34 - 61 205 266 Gesamt 92 208 300 Sensitivität: 31 / 34 = 91,2% (95% Cl = 76,3 - 98,1%) Spezifität: 205 / 266 = 77,1% (95% Cl = 70,2 - 81,1%) Die Problematik der CMV-Kultur (konventionell und SV) im Vergleich zur CMV-Antigenämie ist in der Literatur dokumentiert (21). Diskrepante Ergebnisse scheinen die Folge antiviraler Therapie oder Inhomogenität der Proben zu sein. Der Nachweis der CMV-Antigenämie wurde in Verbindung mit der Zellkultur als eindeutiger Beweis einer aktiven Infektion akzeptiert (4. Internationaler CMV Workshop, Paris, 19. - 21.4.1993) Bei abweichenden Ergebnissen wurden zur Klärung weitere Hinweise für das Vorliegen einer CMVInfektion herangezogen wie positive Urinkultur, Rachenabstrich, Bronchiallavage, histologische Befunde, Kulturen aus Biopsiematerial, serologische Untersuchungen auf CMV-IgG oder -IgM (nicht bei KMT oder AIDS-Patienten), Ergebnisse von nicht kommerziell verfügbaren CMV-Antigenämie Tests und die Patientenanamnese. 7 Vergleich des CMV BriteTM Tests mit der Kultur und weiteren prädiktiven Methoden zum Nachweis einer CMV-Infektion Klinik 1 CMV BriteTM Test 6 CMV erwartet + + 47 Gesamt 53 Gesamt 1 48 103 98 151 + 42 2 44 CMV BriteTM Test 3 102 105 Gesamt 45 104 149 CMV erwartet + - 89 3 CMV BriteTM Test + 9 199 Gesamt 98 202 Gesamt 92 97 Klinik 2 CMV erwartet + Gesamt Klinik 1 + 2 208 300 19 der ursprünglich 64 diskrepanten Ergebnisse konnten durch einen nicht kommerziell verfügbaren CMV-Antigenämie Test in Verbindung mit der CMV-Serologie geklärt werden. Sensitivität: 89 / 98 = 90,8% (95% Cl = 83,3 - 95,7%) Spezifität: 199 / 202 = 98,5% (95% Cl = 95,7 - 99,7%) Positiv vorhergesagter Wert: 89/92 = 96,7% (95% Cl = 90,8 - 99,3%) Negativ vorhergesagter Wert: 199/208 = 95,7% (95% Cl = 91,6 - 97,9%) Kreuzreaktivität Untersuchungen zur Kreuzreaktivität wurden mit Einzelisolaten von solchen Viren durchgeführt, die Ähnlichkeit mit dem CMV haben, d.h. auch ähnliche klinische Symptome hervorrufen und/oder im peripheren Blut vorkommen (HSV-1 wurde mit 7 Isolaten getestet). Klinische lsolate folgender Viren wurden untersucht: Herpesvirus Typ 1 und Typ 2 Varicella zoster Virus Adenovirus 2, 4 und 5 Parainfluenza Virus 1, 2 und 3 Respiratory syncytial virus (RSV) Polio Virus 3 (Wildtyp 3) Echovirus 11 und 30 Epstein-Barr Virus (Laborstamm P3HR1)* Humanes Herpes Virus Typ 6 (Laborkette GS)* HIV (Typ 1, kommerziell erhältliche IF Objektträger)** *National Institute of Public Health and Environmental Protection, The Netherlands **Institut Virion, Schweiz 8 Es wurde keine Kreuzreaktivität festgestellt, außer einer schwach positiven Reaktion mit 6 der 7 HSV1-Isolate in der Shell Vial Culture. Die schwache Färbung, die bei den 6 HSV-1 Isolaten beobachtet werden konnte, ist cytoplasmatischen Ursprungs (d.h. nur außerhalb des Kerns an wenigen Stellen in geringer Anzahl erkennbar). Sie könnte auf Fc-Rezeptoren, die von HSV-1 infizierten Zellen im SV-Test exprimiert wurden, zurückzuführen sein und ist vergleichbar mit dem Muster von HSV-1 monoklonalen Antikörpern. Weitergehende Untersuchungen schlossen eine Kreuzreaktion zwischen HSV und dem CMV-Antigenämie Test bei Verwendung des monoklonalen C1O/C11 Antikörper-Mix aus. Auflage 3 9 Bibliography 1. Van Son. W.J. and The, T.H. (1989). Cytomegalovirus infection after organ transplantation: an update with special emphasis on renal transplantation. Transpl. Int. 2, 147-164. 2. The, T.H., Van der Bij, W., Van den Berg, A.P., Van der Giessen, M., Weits, J., Sprenger, H. and Van Son, W.J. (1990). Cytomegalovirus antigenemia. Rev. Inf. Dis. 12, S737-744. 3. Boeckh, M., Bowden, R.A., Goodrich, J.M., Pettinger, M., Meyers, J.D. (1992). Cytomegalovirus antigen detection in peripheral blood leukocytes after allogeneic marrow transplantation. Blood 80, 1358 – 1364. 4. Mazzulli, T., Rubin, R.H., Ferraro, M.J., D’Aquila, R.T., Doveikis, S.A., Smith, B.R., The, T.H. and Hirsch, M.S. (1993). Cytomegalovirus antigenemia: clinical correlations in transplant recipients and in persons with AIDS. J.Clin. Microbiology 31, 2824-2827. 5. Van der Bij, W., Schirm, J., Torensma, R., Van Son, W.J., Tegzess, A.M., The, T.H. (1988) Comparison between viremia and antigenemia for detection of cytomegalovirus in blood. J. Clin. Microbiology 26, 2531 – 2535. 6. Grefte, J.M.M., Van der Gun, B.T.F., Schmolke, S., Van der Giessen, M., Van Son, W.J. and The, T.H. (1992). The lower matrix protein pp65 is the principal viral antigen present in peripheral blood leukocytes during an active cytomegalovirus infection. J.Gen.Virol. 73, 2923-2932. 7. Gerna, G., Revello, M.G., Percivalle, E., Zavattoni, M., Parea, M., Battaglia, M. (1990). Quantification of human cytomegalovirus viremia by using monoclonal antibodies to different viral proteins. J. Clin. Microbiology 28, 2681 – 2688. 8. Revello, M.G., Percivalle, E., Di Matteo, A., Morini, F., Gerna, G. (1992). Nuclear expression of the lower matrix protein of human cytomegalovirus in peripheral blood leukocytes of immunocompromised viremic patients. J. Gen Virol 73, 437 – 442. 9. Gerna, G., Revello, M.G., Percivalle, E., Morini, F. (1992). Comparison of different immunostaining techniques and monoclonal antibodies to the lower matrix phosphoprotein (pp65) for optimal quantitation of human cytomegalovirus antigenemia. J. Clin. Microbiology 30, 1232 – 1237. 10. Van den Berg, A.P., Van der Bij, W. Van Son, W.J., Anema, J., Van der Giessen, M., Schirm, J., Tegzess, A.M., The, T.H. (1989). Cytomegalovirus antigenemia as a useful marker of symptomatic cytomegalovirus infection after renal transplantation: a report of 130 consecutive patients. Transplantation 48, 991 – 995. 11. Van den Berg, A.P., Klompmaker, I.J., Haagsma, E.B., Scholten-Sampson, A., Bijleveld, C.M.A., Schirm, J., van der Giessen, M., Slooff, M.J.H., The, T.H. (1991). Antigenemia in the diagnosis and monitoring of active cytomegalovirus infection after liver transplantation. J. Infect. Dis. 164, 265 – 270. 12. Gerna, G., Zipeto, D., Parea, M., Revello, M.G., Silini, E. Percivalle, E., Zavattoni, M., Milanesi, G. (1991). Monitoring of human cytomegalovirus infections and ganciclovir treatment in heart transplant recipients by determination of viremia antigenemia and DNAemia. J. Infect. Dis. 164, 488 – 498. 13. The, T.H., van der Ploeg, M., van der Berg, A.P., Vlieger, A.M., van der Giessen, M., van Son, W.J. (1992). Direct detection of cytomegalovirus in peripheral blood leukocytes – a review of the antigenemia assay and the polymerase chain reaction. Transplantation 54, 193 – 198. 14. Landry, M.L. and Ferguson D. (1993). Comparison of quantitative cytomegalovirus antigenemia assay with culture methods and correlation with clinical disease. J.Clin.Microbiology 31, 28512856. 15. Boeckh, M., Woogerd, P.M., Stevens-Ayers, T., Ray, C.G., and Bowden, R.A. (1994). Factors influencing detection of quantitative Cytomegalovirus antigenemia. J.Clin.Microbiology 32, 832834. 16. Landry, M.L., Ferguson D., Cohen, S., Huber, K., and Wetherill, P. (1995). Effect of delayed specimen processing on Cytomegalovirus antigenemia test results. J.Clin.Microbiology 33, 257259. 17. Nìubò, J., Pérez, J.L., Carvajal, A., Ardanuy, C., and Martin, R. (1994). Effect of delayed processing of blood samples on performance of cytomegalovirus antigenemia assay. J.Clin.Microbiology 32, 1119-1120. 10 18. Gerna, G., Parea, M., Percivalle, E., Zipeto, D., Silini, E., Barbarini, G., and Milanesi, G. (1990). Human cytomegalovirus viraemia in HIV-1 seropositive patients at various clinical stages of infection. AIDS 4, 1027 – 1031. 19. Koskinen, P.K., Nieminen, M.S., Mattila, S.P., Häyry, P.J., and Lautenschlager, I.T. (1993). The correlation between symptomatic CMV infection and CMV antigenemia in heart allograft recipients. Transplantation, 55, 547-551. 20. Landry, M.L., Ferguson, D., Stevens-Ayers, T., De Jonge, M.W.A., and Boeckh, M. (1996). Evaluation of CMV BriteTM Kit for detection of Cytomegalovirus pp65 antigenemia in peripheral blood leukocytes by immunofluorescence. J.Clin. Microbiol. 34, 1337-1339. 21. Erice, A., Holm, M.A., Gill, P.C., Henry, S.A. et al (1992). Cytomegalovirus (CMV) antigenemia assay is more sensitive than shell vial cultures rapid detection of CMV in polymorphonuclear blood leukocytes. J. Clin. Microbiology 30, 2822-2825. Version 3 11
