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[DE]
Clonab CMV
Zum Nachweis des HCMV pp65-Antigens in peripheren
Blutleukozyten
Handelsform
[REF] 1
812 600
50-100 Tests
[IVD]
Reagenzien
Einleitung und Verwendungszweck
Das Zytomegalievirus (CMV, Humanes Herpesvirus 5) gehört zu den dsDNAViren bestehen aus einem Kapsid, das die DNA enthält und einer
Lipidmembran (Envelope). Zwischen Hülle und Kapsid befinden sich
Matrixproteine, die beide Strukturen miteinander verbinden. Das Antigen
pp65 gehört zu den Matrixproteinen (lower matrix protein) und macht etwa
5% der Proteine reifer Viruspartikel aus. In Viruskulturen werden nichtinfektiöse Partikel, so genannte "dense bodies", gebildet, die vorwiegend aus
pp65-Protein zusammengesetzt sind.
Das pp65-Antigen wird bereits in frühen Entwicklungsstadien von der
infizierten Zelle synthetisiert. In vivo ist pp65 das dominierende virale Protein,
das während aktiver Infektionen in peripheren Blutleukozyten nachweisbar ist
(2).
In den letzten Jahren hat sich der Direktnachweis des pp65-Antigens in
Blutleukozyten zur Frühdiagnose aktiver CMV-Infektionen bei immunsupprimierten Patienten außerordentlich bewährt (3,4). Das Verfahren
ermöglicht eine Frühdiagnose meist noch vor dem Auftreten der klinischen
Symptomatik und damit den frühzeitigen und gezielten Einsatz von
wirksamen Hyperimmunglobulinen (Cytotect Biotest) bei Risikopatienten, vor
allem nach Transplantation.
Die Zahl Antigen-positiver Leukozyten kann bei symptomatischen Infektionen
1 % erreichen, sie liegt jedoch in der Regel zwischen 1 und 100 pro 105
Leukozyten. Spezifität und Sensitivität werden für die aktive Infektion (symptomatische und asymptomatische Patienten) mit ca. 90% angegeben (5).
Erkrankte Patienten wiesen zum Symptombeginn fast ausnahmslos eine
pp65-Antigenämie auf. Die quantitative Auswertung des Tests eignet sich zur
Verlaufskontrolle und Therapieüberwachung. Das Testergebnis liegt vier bis
sechs Stunden nach der Blutentnahme vor. Gegenüber konventionellen
virologischen Verfahren (ELISA, Kultur) steht damit nach den bisher
vorliegenden Daten ein Verfahren zur Frühdiagnose der aktiven CMVInfektion zur Verfügung, das bei Risikopatienten eine rechtzeitige
prophylaktische oder therapeutische Intervention erlaubt.
Bestandteile
[MAB] 1 ml
Clonab®CMV
Monoklonaler Antikörper (Maus, IgG1).
Mix von C10/C11 gegen das CMV Lower Matrix Protein
pp65, Konservierungsmittel: 0,09% Natriumazid.
1
Gebrauchsinformation
I
Erforderliche Materialien, die nicht im Kit enthalten sind - siehe Anwendungsbeispiele.
Immunogen
Membranfraktion von CMV-infizierten humanen Fibroblasten.
Spezifität
Clonab CMV ist eine optimal eingestellte Kombination der monoklonalen
Antikörper C10 und C11, die beide Spezifität für das CMV-kodierte pp65Antigen besitzen (6). Es findet sich keine Kreuzreaktivität mit Zellen, die
durch andere Viren der Herpesgruppe infiziert sind. Clonab CMV weist keine
Reaktion mit menschlichem Gewebe sowie mit Blutzellen auf.
Haltbarkeit des Kits
Lagerung bei 2-8 °C. Direkte Sonneneinstrahlung vermeiden. Unter Einhaltung der angegebenen Lagerbedingungen sind die Reagenzien bis zum
Verfallsdatum haltbar. Zum mehrmaligen Gebrauch der Reagenzien diese
unmittelbar nach Gebrauch wieder bei 2-8°C lagern.
Sicherheitshinweise
Reagenz nicht einnehmen. Kontakt mit Augen, Haut und Schleimhaut
vermeiden. Alle Proben, Kontrollen und Objektträger müssen als potentiell
infektiös angesehen werden. Nicht mit dem Mund pipettieren. Entsprechend
guter Laborpraxis sind Schutzhandschuhe, Schutzbrille und Schutzkleidung
zu tragen. Flüssigkeiten und nichtbrennbare Materialien sollten mit
Natriumhypochlorit dekontaminiert werden (Endkonzentration: 3 %,
Einwirkzeit mindestens 30 Minuten). Flüssiger Abfall, der Säure enthält, muss
vor der Beseitigung neutralisiert werden. Alle Labormaterialien, die
wiederverwendet werden sollen, müssen 1 Stunde bei 121°C autoklaviert
werden. Einatmen, Verschlucken und Berührung mit der Haut von
Reagenzien vermeiden. Der Antigenämie Test ist nur von geschultem und
autorisiertem Fachpersonal durchzuführen. Auf keimarmes Arbeiten ist zu
achten. Bei Beschädigung der Original Testpackung ist der Hersteller zu
informieren.
Verwendungshinweis
Der Nachweis des pp65-Proteins in Zellen oder Geweben ist prinzipiell mit
allen bekannten immunzyto- bzw. immunhistochemischen Verfahren möglich
(siehe Anwendungsbeispiele), die zum Nachweis von MausImmunglobulinen
geeignet sind, wie z. B. die alkalische Phosphatase anti-alkalische Phosphatase-Färbung (APAAP-Methode). Es wird empfohlen bei jeder
Bestimmung eine positive und eine negative Kontrolle mitzuführen. Selbst
entwickelte Anwendungsprotokolle (in Haus) sind vom Anwender
selbstständig und in eigener Verantwortung zu validieren.
Anwendungsbeispiele
I. Fibroblastenkulturbestätigung
Benötigtes Material, das nicht im Kit enhalten ist
Auf runden Deckgläsern (Durchmesser: 12 mm) in Spezialröhrchen mit
flachem Boden (Durchmesser: 16,5 mm) werden humane Fibroblasten
angelegt.
Wachstumsmedium: MEM + 10% FCS Erhaltungsmedium: MEM + 0,5%
FCS.
Je 1 ml Medium wird für eine Deckglaskultur benötigt.
Durchführung
1. Urin- und Bronchiallavage (BAL).
Das Material ist entweder sofort zu verarbeiten oder bei 4-8°C zu lagern.
1.1 2 ml des Materials werden mit 2 ml MEM aufgeschüttelt und dann 60
Minuten bei 6.000 UpM zentrifugiert.
1.2 Der Überstand wird verworfen und das Zentrifugat anschließend mit 1 ml
MEM aufgeschüttelt.
1.3 Je 2 Deckglaskulturen werden dann mit je 0,3 ml des Zentrifugats
beimpft und 1 Nacht bzw. 1 Woche bei 37°C bebrütet.
2. Heparinisiertes Blut (0,2 ml Heparin und 10 ml Blut).
Das Material ist entweder sofort zu verarbeiten oder bei 37°C zu lagern.
2.1 2 ml Dextran (6% Dextran T 500 in 0,9% NaCI) und 7 ml heparinisiertes
Blut werden in einer 10 ml Spritze gemischt.
2.2 Anschließend erfolgt eine Inkubation bei 37°C (30 Minuten), wobei
darauf zu achten ist, dass die Spritze schräg gestellt wird (Winkel etwa
45°). Danach wird die Kanüle gebogen und die Leukozytenfraktion in ein
Röhrchen gespritzt. Die Erythrozytenschicht bleibt in der Spritze und wird
verworfen.
2.3 Anschließend wird die Leukozytenfraktion für 8 Minuten bei 800 UpM
zentrifugiert und der Überstand abgegossen. Die Zellen werden dann
vorsichtig aufgeschüttelt, 5 ml MEM hinzugegeben und erneut für 8
Minuten bei 800 UpM zentrifugiert.
Der Waschvorgang wird nochmals wiederholt.
2.4 Danach wird der Überstand abgegossen und die Zellen mit 1 ml MEM
geschüttelt.
2.5 Je 2 Deckglaskulturen werden dann mit je 0,2 ml des Zentrifugats
beimpft und 1 Nacht bzw. 1 Woche bei 37°C bebrütet.
3. Die erste Deckglaskultur wird 1 Tag nach Beimpfen des Materials fixiert
und die zweite Deckglaskultur mit dem Erhaltungsmedium MEM + 0,5%
FCS gefüttert.
3.1 Zum Fixieren ist das Medium abzusaugen und 1 ml Aceton auf das
Deckglas zu pipettieren. Der Ansatz wird dann 10 Minuten im
Kühlschrank fixiert.
3.2 Eine heiße Nadel wird durch den Boden des Röhrchens gestochen, und
mit der Nadel das Deckglas leicht nach oben gedrückt. Mit einer Pinzette
wird das Deckglas herausgenommen und mit einer Zellschicht nach
oben auf ein Papierhandtuch gelegt (Papierhandtuch mit Probennummer
beschriften).
Danach sind die Objektträger mit den Probennummern zu beschrif-ten
und die Deckgläser mit farblosem Nagellack aufzukleben.
II. Zytospin-Methode
Benötigtes Material, das nicht im Kit enthalten ist
1. 6 ml Citrat-Blut
2. 6% (w/v) Hydroxyethyl-Stärke (MW 450.000) in 0.15 M NaCI
(Plasmasteril, Fresenius, Bad Homburg) oder 5% (w/v) Dextran 500 in
0.15 M NaCI (Pharmacia, Freiburg)
3. Hämolysepuffer: (bei 4°C max. 2 Wochen haltbar)
Ammoniumchlorid
0,83 g
Kaliumhydrogencarbonat
0,1 g
Aqua dest.
ad 100 ml
4. Waschpuffer (PBS, pH 7,4):
Natriumchlorid
8,67 g
Kaliumchlorid
0,2 g
Kaliumdihydrogenphosphat
0,2 g
1,150 g
Dinatriumhydrogenphosphat - 2H20
Aqua dest.
ad 1000 ml
5. Fixierlösung:
Aceton p.a./Methanol p.a. 1:1 (v/v)
6. Wärmeschrank (37°C)
7. 10 ml Zentrifugen-Röhrchen
8. Pipetten, -spitzen
9. Tischzentrifuge (z. B. Zentrifuge Universal, Bio-Rad)
10. Zytozentrifuge (z. B. Shandon, Cytospin)
11. Ventilator, Fön (kalt)
12. Zell-Counter (z. B. Coulter) oder Neubauer-Zählkammer
13. Objektträger
Durchführung
1. 2 ml Plasmasteril oder Dextran in ein 10 ml Zentrifugen-Röhrchen
geben.
2. Blutprobe und Plasmasteril bzw. Dextran getrennt im Wasserbad oder
Wärmeschrank auf 37°C erwärmen.
3. 6 ml Citratblut zu dem Plasmasteril bzw. Dextran geben, vorsichtig
mischen und bei 37°C senkrecht stehend 30 Min. inkubieren.
4. Überstand (Leukozytenfraktion) abheben und in ein neues Röhrchen
geben.
5. 8 Min. bei 200 x g zentrifugieren. Überstand dekantieren.
6. Sediment kurz aufschütteln und in 3 ml Hämolysepuffer aufnehmen, 3
Min. inkubieren und mit Waschpuffer auffüllen.
7. 2 x 8 Min. bei 500 x g waschen.
| 0197
186750/11 – 09/2015
Zellsuspension mit PBS auf 1 x 106 Zellen/ml einstellen.
Zytozentrifugation von 200 µI Suspension für 5 Min. bei 550 UpM
(Shandon, Cytospin). Anm: Mit Aceton entfettete Objektträger benutzen!
Empfehlenswert ist die Herstellung von 2 Präparaten pro Patient als
Doppelansatz.
10. 30 Min. mit einem Ventilator trocknen oder Trocknung über Nacht bei
Raumtemperatur (empfehlenswert).
11. 90 Sec. in Aceton/Methanol 1:1 bei 4°C fixieren. Zeit muss exakt
eingehalten werden!
12. 5 Min. an der Luft trocknen.
Die so vorbereiteten Präparate können jetzt eingesetzt werden für die
Immunfärbung.
8.
9.
III. Immunfluoreszenz-Methode
Benötigtes Material das nicht im Kit enthalten ist
Clonab CMV, Anti-Maus IgG FITC (z. B. Dako), Verdünnungspuffer (siehe
APAAP-Methode),
Waschpuffer
(PBS,
siehe
Zytospin-Methode),
Evansblau/PBS: 0,1 g/I Evansblau in PBS, Ventilator (Fön) kalt, feuchte
Kammer, Küvetten, Deckgläschen 24 x 50 mm, Fluoreszenzmikroskop (400
x), Zellstofftücher.
Durchführung
1. Inkubation mit dem Primärantikörper Clonab CMV.
 Das Röhrchen sollte vor Gebrauch kurz zentrifugiert werden, da sich
Reagenz im Deckel sammeln kann.
1.1 Inkubation der Präparate für 30 Minuten mit mindestens 50 µI Clonab
CMV (1:5 in Verdünnungspuffer vorverdünnt) bei Raumtemperatur in der
feuchten Kammer.
1.2 Präparat dreimal spülen; dazu den Objektträger jeweils für 2 Minuten in
PBS stellen, dazwischen Puffer erneuern. Anschließend die Umgebung
um das Präparat trocknen.
2. Inkubation mit dem Sekundärantikörper IgG FITC (z.B. DAKO).
2.1 Inkubation des vorbehandelten Präparates mit 50 µI FITC-konjugiertem
Ziege-anti-Maus Immunglobulin (Verdünnung gemäß Herstellerangabe)
bei Raumtemperatur für 30 Minuten in der feuchten Kammer.
2.2 Präparat zweimal spülen; dazu den Objektträger jeweils für 2 Minuten in
PBS stellen, dazwischen Puffer erneuern.
Präparat danach 1 Minute in 0,1 g/I Evansblau/PBS eintauchen, kurz in
aq. dest. spülen und die Umgebung um das Präparat trocknen.
2.3 Auf das Präparat wird 1 Tropfen Glycerin/PBS (Verhältnis 9:1)
aufgetropft und mit einem Deckglas (24 x 50 mm) eingedeckt.
2.4 Die Auswertung erfolgt am Fluoreszenzmikroskop (Vergrößerung 1:400).
IV. Immunfärbung mit der APAAP (alkalische Phosphatase antialkalische Phosphatase)-Methode
Benötigtes Material, das nicht im Kit enthalten ist
1. Clonab CMV
 Das Röhrchen sollte vor Gebrauch kurz zentrifugiert werden, da sich
Reagenz im Deckel sammeln kann.
2. Clonab CMV: APAAP Kit
3. Waschpuffer (TBS, pH 7,6):
Natriumchlorid
43,9 g
Tris 30,25 g
Aqua dest.
ad 5000 ml mit 0,1 N
HCI auf pH 7,6 einstellen
4. Verdünnungspuffer:
TBS, pH 7,6; mit 1 % Rinderalbumin (BSA) oder fötalem Kälberserum
(FCS)
5. Mayer's Hämatoxylin (Sigma)
6. Kayser's Glycerin Gelatine (Merck) oder Immunomount (Shandon)
7. Kontroll-Objektträger (Kitbestandteil)
8. feuchte Kammer
9. Küvetten
10. Pipetten, -spitzen (50 µI)
11. Zellstofftücher
12. Handschuhe
13. Teströhrchen
14. Deckgläschen (24 x 50 mm)
15. Lichtmikroskop (100 x)
Durchführung
1. Inkubation der Zytospinpräparate mit 50 µI Clonab-CMV (1:10 in
Verdünnungspuffer vorverdünnt) 30 Min. bei Raumtemperatur in der
feuchten Kammer.
2. Präparat zweimal waschen; dazu den Objektträger jeweils für 1 Min. in
TBS-Puffer stellen, Puffer erneuern. Danach Zytospinpräparate
ringsherum mit Zellstoff abtrocknen (abtupfen).
3. Inkubation der Zytospinpräparate mit 50 µI Brückenantikörper (Reagenz
E, 1 :50 in Verdünnungspuffer) aus dem Clonab CMV APAAP Kit für 30
Min. bei Raumtemperatur in der feuchten Kammer.
4. Waschen, wie unter 2. beschrieben.
5. Inkubation der Zytospinpräparate mit 50 µl APAAP-Komplex (unverdünnt, Reagenz F) aus Clonab APAAP Färbekit, für 30 Min. bei
Raumtemperatur in der feuchten Kammer.
6. Waschen, wie unter 2. beschrieben.
Eine Wiederholung der Schritte 3 und 5 für jeweils 10 Minuten einschließlich der Waschvorgänge führt zur Verstärkung des Signals.
7. Substratreaktion mit Färbereagenzien aus dem Clonab CMV: APAAP
Kit.
Das Reagenz ist unmittelbar vor Gebrauch wie folgt anzusetzen: 2
Tropfen Pufferkonzentrat (Flasche A) in ein Röhrchen tropfen und mit
Aqua dest. auf 2 ml auffüllen. 1 Tropfen Substratkonzentrat (Flasche B)
zugeben und vermischen.
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Industriestr. 1, D-63303 Dreieich, Germany
Tel.: +49-6103-3130-0, Fax: +49-6103-3130-724
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In einem zweiten Röhrchen je 1 Tropfen Neufuchsinlösung (Flasche C)
und 1 Tropfen Aktivierungsreagenz (Flasche D) vermischen und 3 Min.
stehen lassen. Die so erhaltene Chromogenlösung in das erste
Röhrchen mit der Substratlösung überführen und mischen.
8. Zytospinpräparate mit dem Substrat-Chromogen-Reagenz bedecken und
20 Min. bei Raumtemperatur in der feuchten Kammer inkubieren.
9. Zwei- bis dreimal in Aqua dest. oder TBS spülen.
10. 7 Min. in Mayer's Hämatoxylin (1:10 mit TBS verdünnt) gegenfärben. Mit
Leitungswasser oder TBS spülen.
11. Eindecken in Immunomount (Shandon) oder in Kayser's Glycerin
Gelatine (Merck) und Auswertung unter dem Lichtmikroskop (100 x).
Resultate
Das pp65-Antigen findet sich vorwiegend in den Zellkernen von Granulozyten; mononukleäre Zellen sind selten Antigen-positiv. Die Zahl Antigenpositiver Leukozyten kann bei symptomatischen Infektionen 1% erreichen, sie
liegt jedoch in der Regel zwischen 1 und 100 pro 105 Leukozyten.
Leistungsdaten
Es wurden 64 Transplantationspatienten über einen Zeitraum von 16 Wochen
nach Transplantation prospektiv untersucht. Von 24 Patienten mit
serologischem Befund einer aktiven HCMV Infektion waren mit dem Clonab
CMV Reagenz 21 positive (relative Sensitivität von 87,5%). Drei Patienten
waren Antigenämie positive ohne einen serologischen Befund (relative
Spezifität 92.5%). Bei symptomatischen HCMV Infektionen entsprach die
Sensitivität 100%(3,4).
Kreuzreaktivität
Zur Untersuchungen der Kreuzreaktivität wurden klinische lsolate folgender
Viren untersucht: Herpesvirus Typ 1 und Typ 2, Varicella zoster Virus, Adenovirus 2, 4 und 5, Parainfluenza Virus 1, 2 und 3, Respiratory syncytial virus,
Polio Virus 3 (Wildtyp 3), Echovirus 11 und 30, Epstein-Barr Virus
(Laborstamm P3HR1), Humanes Herpes Virus Typ 6 (Laborkette GS), HIV
(Typ 1, kommerziell erhältliche IF Objektträger). Es wurde keine Kreuzreaktivität festgestellt, außer einer schwach positiven Reaktion mit 6 der 7 HSV-1Isolate in der Shell Vial Culture. Die schwache Färbung, die bei den 6 HSV-1
Isolaten beobachtet werden konnte, ist cytoplasmatischen Ursprungs (d.h.
nur außerhalb des Kerns an wenigen Stellen in geringer Anzahl erkennbar).
Sie könnte auf Fc-Rezeptoren, die von HSV-1 infizierten Zellen im SV-Test
exprimiert wurden, zurückzuführen sein und ist vergleichbar mit dem Muster
von HSV-1 monoklonalen Antikörpern. Weitergehende Untersuchungen
schlossen eine Kreuzreaktion zwischen HSV und dem CMV-Antigenämie
Test bei Verwendung des monoklonalen C10/C11 Antikörper-Mix aus.
Grenzen des Verfahrens
Der Nachweis des CMV pp65 Lower Matrix Strukturproteins sollte in einem
Labor mit Erfahrung in immunozytochemischen Techniken erfolgen. Typ und
Ausstattung der verwendeten Geräte beeinflusst das optische Erscheinungsbild der Ergebnisse. Die Reaktionen variieren möglicherweise aufgrund des
verwendeten Mikroskops, der Lichtquelle, des Alters der Materialien, der
Filterkombination und -dicke, der unterschiedlichen Empfindlichkeit der
Antigensubstrate oder der angewandten Untersuchungsmethode. Jedes
Labor sollte mittels geeigneter Kontrollmaßnahmen eigene Kriterien für die
Auswertung der Patientenproben aufstellen. Der Nachweis des pp65 Proteins
in peripheren Blutleukozyten ist nicht der Beweis einer symptomatischen
Erkrankung, da die Viren über einen langen Zeitraum nach einer akuten
Infektion persistieren können und da Patienten mit CMV-Antigenämie (insbesondere mit niedrigen Werten) einen asymptomatischen Krankheitsverlauf
aufzeigen können. Ein negativer Antigenämie-Test schließt eine CMV-Infektion oder eine CMV-Erkrankung nicht völlig aus.
Die Zahl der Antigen-positiven Zellen je Objektträger kann durch Lagerung
der heparinisierten Blutprobe abnehmen (6). Deshalb empfiehlt es sich, die
Objektträger baldmöglichst nach der Blutentnahme herzustellen. Angaben zur
maximal möglichen Lagerdauer von Proben bei Raumtemperatur können
nicht gemacht werden. Bei Patienten mit schwerer Neutropenie (absolute
Neutrophilenzahl <200/mm3) sind zur Testdurchführung mindestens 10 ml
Blut erforderlich. Da die monoklonalen Antikörper mittels eines typischen
Stammes hergestellt wurden, besteht die Möglichkeit, dass neue CMVVarianten nicht erfasst werden. Stämme mit einem Aminosäureaustausch in
der Zielregion der Antikörper bleiben evtl. unerkannt.
Literatur
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devices.
2. Grefte, J.M.M., Van der Gun, B.T.F., Schmolke, S., Van der Giessen, M.,
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the principal viral antigen present in peripheral blood leukocytes during
an active cytomegalovirus infection. J.Gen.Virol. 73, 2923-2932.
3. Bein, G., Bitsch, A., Hoyer, J., Steinhoff, J., Fricke, L., Machnik, H.,
Dennin, R., Kirchner, H. (1993). A longitudinal prospective study of
cytomegalovirus pp65 antigenemia in renal transplant recipients.
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4. Bein, G., Bitsch, A,. Hoyer, J., Kirchner, H. (1991). The detection of
human cytomegalovirus immediate early antigen in peripheral blood
leucocytes. J. Immunol. Methods 137, 175-180.
5. Van der Bij, W., Schirm, J., Torensma, R., Van Son, W.J., Tegzess,
A.M., The, T.H. (1988) Comparison between viremia and antigenemia for
detection of cytomegalovirus in blood. J. Clin. Microbiology 26, 2531 2535.
6. Boeckh, M., Woogerd, P.M., Stevens-Ayers, T., Ray, C.G., and Bowden,
R.A. (1994). Factors influencing detection of quantitative Cytomegalovirus antigenemia. J.Clin.Microbiology 32, 832-834.
| 0197
186750/11 – 09/2015