Hepatotoxische Nebenwirkungen adenoviraler
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Aus der Medizinischen Universitätsklinik Abteilung Innere Medizin II (Gastroenterologie, Hepatologie, Endokrinologie und Infektiologie) der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Hepatotoxische Nebenwirkungen adenoviraler Genvektoren erster Generation INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Vorgelegt im Jahre 2004 von Afshar-Oromieh, Ali geboren in Tehran/Iran Dekan: Prof. Dr. med. J. Zentner Erstgutachter: Prof. Dr. med. Drs. h.c. H.E. Blum Zweitgutachter: Frau Prof. Dr. med. A. Schmitt-Gräff Jahr der Promotion: 2005 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 6 1. Einleitung 8 1.1 Gentherapie 8 1.1.1 Kausale Therapie 8 1.1.2 Immuntherapie 9 1.1.3 Suizidgentherapie 10 1.2 Gentransfer 11 1.3 Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) 13 1.3.1 Gentherapie des HCC und ihre Risiken 13 1.4 Zielsetzung der Arbeit 14 2. Material und Methoden 16 2.1 Versuchstiere 16 2.2 Versuchsgruppen 16 2.2.1 Tabellarische Darstellung der einzelnen Versuchsgruppen 16 2.2.2 Kontrollgruppe 17 2.2.3 PBS-Gruppe 17 2.2.4 5-FC-Gruppe 17 2.2.5 Versuchsgruppen mit adenoviralen Vektoren 17 2.2.6 5-FU-Gruppe 18 2.3 Verwendete Lösungen und Substanzen 18 2.4 Blutbild 18 2.5 Laborchemische Messungen 18 Inhaltsverzeichnis 2.6 Protokoll der Messungen mit dem Reflotron-Gerät von Roche 19 2.7 Herstellung von Organpräparaten 20 2.8 Vektorreplikation und –aufarbeitung 20 2.9 Zellkultur 22 3. Ergebnisse 23 3.1 Zielsetzung der Experimente 23 3.2 Laborchemie und Blutbild 24 3.3 Leberhistologie 31 3.4 Lebertransduktion in Abhängigkeit verschiedener Vektordosierungen 34 3.5 Serum- und Blutwerte unbehandelter Mäuse 37 4. Diskussion 4.1 Immunologie viraler Hepatitiden 38 39 4.1.1 Erkennung von viralen Antigenen durch T-Lymphozyten 39 4.1.2 Antivirale Wirkung von Antikörpern 40 4.1.3 Interferon 40 4.2 Histopathologie viraler Hepatitiden 40 4.3 Adenoviren und adenovirale Vektoren 42 4.3.1 Eigenschaften des Adenovirus 42 4.3.2 Pathogenese 44 4.3.3 Genomaufbau 45 4.3.4 Infektionsmechanismen 45 4.3.5 Adenovirus-Vermehrung 46 4.3.6 Bedeutung der E1-Region des adenoviralen Genoms 48 4.4 Adenovirale Vektoren in der Gentherapie 49 4.5 Untersuchte Serum- und Blutparameter 50 Inhaltsverzeichnis 4.6 Eigene Ergebnisse 4.6.1 Leberhistologie 50 51 4.6.1.1 Ausmaß der Lebertransduktion 51 4.6.1.2 52 Lebergewebeschädigung 4.6.2 Laborchemie 55 4.6.2.1 GPT (ALT) 55 4.6.2.2 Alkalische Phosphatase (AP) 56 4.6.2.3 Bilirubin und Glukose 57 4.6.2.4 α-Amylase (Pankreatische Amylase) 57 4.6.2.5 Leukozyten 58 4.6.2.6 Andere Parameter 58 5. Zusammenfassung 59 6. Anhang 60 6.1 Definition untersuchter Serum- und Blutparameter 60 6.1.1 Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT) 60 6.1.2 Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) 60 6.1.3 Alkalische Phosphatase (AP) 61 6.1.4 Gamma-Glutamyl-Transferase (GGT) 61 6.1.5 Bilirubin 62 6.1.6 Glukose 62 6.1.7 α-Amylase (Pankreatische Amylase) 63 6.1.8 Weiße Blutkörperchen (WBC) = Leukozyten 63 6.1.9 Harnsäure 63 6.1.10 Kreatinin 64 Literatur 65 Curriculum Vitae 73 Danksagung 75 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 5-FC 5-FU Ad-GFP ALT AP AST CD cDNA CsCl DMEM DNA EDTA FCS G 418 GCV-PPP GFP GGT GOT GPT g h Hb HBsAg HCC HE HLA HLA-B7 HSV-TK IMDM i.p. i.v. IFN IL-1 kbp kg KG l M MAGE mg ml MHC MPS min 5-Fluorcytosin 5-Fluoruracil Adenovirus mit Gen für das grün fluoreszierende Protein Alanin-Aminotransferase Alkalische Phosphatase Aspartat-Aminotransferase Cytosin-Deaminase Complementary-DNA Cäsiumchlorid Dulbecco's Minimal Essential Medium Desoxyribonucleinsäure Ethylendiamin-Tetraessigsäure Fetal Calf Serum Geneticin® (Neomycin-Analogon) Ganciclovir-Triphosphat Grün fluoreszierendes Protein Gamma-Glutamyltransferase Glutamat-Oxalacetat-Transaminase Glutamat-Pyruvat-Transaminase Gramm Stunde(n) Hämoglobin Hepatitis-B-Surface-Antigen Hepatozelluläres Karzinom Hämatoxylin-Eosin Human Leucocyte Antigen Bezeichnung für einen HLA-Subtyp (s. HLA) Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase Iscove's Modified Dulbecco's Medium intraperitoneal intravenös Interferon Interleukin-1 Kilo-Basen-Paare Kilogramm Körpergewicht Liter molar Melanoma Antigen-Encoding Genes Milligramm Milliliter Major Histocompatibility Complex Monozytäres Phagozytensystem Minute(n) Abkürzungsverzeichnis • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • µl ml mRNA n nm Nr. nu/nu OTC PBS PFU RBC RNA RNAs rpm TNFα U L U/min UV-Licht VT WBC Mikroliter Milliliter Messenger-RNA Anzahl Nanometer Nummer nude/nude Ornithin-Transcarbamylase Phosphate Buffered Saline Plaque Forming Units Red Blood Cells (rote Blutkörperchen) Ribonucleinsäure Plural von RNA revolutions per minute Tumornekrosefaktor-α Units Liter Umdrehungen pro Minute ultraviolettes Licht Versuchstag White Blood Cells (weiße Blutkörperchen) Einleitung 1. Einleitung 1.1 Gentherapie In der Behandlung disseminierter Tumorerkrankungen stellt die Chemotherapie nach wie vor die entscheidende Therapiemodalität dar. Bei einer Vielzahl von Patienten, insbesondere mit soliden Tumoren, sind diese Formen der Behandlung jedoch nicht kurativ (4). Ein wesentlicher Nachteil der Chemotherapie ist ihre unzureichende Spezifität für maligne Zellen. Es ist zumeist die gesteigerte Proliferationsrate von Tumorzellen im Vergleich zu normalen Zellen, die eine gewisse tumorselektive Wirkung von Chemotherapeutika ermöglichen. Im Regelfall sind die malignen Zellen diesbezüglich aber nicht homogen, so daß auch immer eine erhebliche Population vorhanden ist, die sich in dieser Hinsicht nicht von normalen Zellen unterscheidet. Die Gentherapie ist deshalb besonders interessant und vielversprechend, weil sie im günstigsten Falle geeignet sein sollte, die den malignen Erkrankungen zugrunde liegenden genetischen Aberrationen zu korrigieren (18;25). Als Gentherapie wird eine gezielte genetische Modifikation von Zellen bezeichnet. Die Ziele hierbei können auf der Korrektur krankheitsrelevanter genetischer Defekte, auf der Einführung von Ersatzfunktionen, sowie auf einer therapeutisch erwünschten Neofunktion der Zelle beruhen. Im Rahmen der Gentherapie von Tumorerkrankungen werden prinzipiell drei Strategien verfolgt: die kausale Therapie, die Immuntherapie und die Suizidgentherapie. 1.1.1 Kausale Therapie Das Modell der Tumorgenese von Eric Fearon und Bert Vogelstein (22), das primär für das kolorektale Karzinom beschrieben wurde, vermutlich jedoch für alle Tumoren in veränderter Form gilt, geht davon aus, daß die Tumorerkrankung durch eine Akkumulation von genetischen Veränderungen hervorgerufen wird. Mindestens zwei, oft mehr Schritte, darunter die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen und die Aktivierung von Protoonkogenen, sind erforderlich, um normale Zellen in maligne Tumorzellen umzuwandeln. Wenn die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen eines der zentralen Ereignisse im Prozeß der Tumorentstehung ist, dann kann die gentherapeutische Expression einer intakten cDNA- Einleitung Kopie des defekten Gens das unkontrollierte Wachstum der Tumorzellen stoppen oder Apoptose induzieren. Die Aktivierung von Onkogenen ist ebenfalls eine häufige Ursache maligner Transformationen. Die Reduktion der Onkogen-Expression kann den malignen Zustand der Zelle revertieren. Tumorzellen, die durch das Onkogen HER-2/neu transformiert wurden, sind das Ziel einer Gentherapie-Studie, die das Adenovirusprotein E1A als therapeutisches Gen verwendet (37). E1A inhibiert die Expression von HER-2/neu auf der Ebene der Transkription und ist so in der Lage, den malignen Phänotyp der Tumorzellen zu revertieren. Andere Studien nutzen Antisense-Oligonukleotide zur Inhibition der Genexpression oder blockieren die Wirkung des onkogenen Proteins durch die intrazelluläre Expression von EinzelstrangAntikörperdomänen (56). 1.1.2 Immuntherapie Immuntherapeutische Strategien basieren auf der Überlegung, daß Tumorzellen bestimmte tumorspezifische Antigene exprimieren, die durch das Immunsystem erkannt und als Ziel für die Eliminierung der Zellen dienen können (35;77). Ein Beispiel für tumorspezifische Antigene kann ein mutiertes Onkogen wie das EVT6-AML1 Fusionsgen sein, das an der Entstehung lymphoblastischer Leukämien beteiligt ist (92). Es kann sich auch um Proteine handeln, die außerhalb der malignen Zellen nicht oder nur sehr selten exprimiert werden wie die Produkte der „Melanoma Antigen-encoding Genes“ (MAGE) in Melanomzellen (17) oder das „Carcinoembryonic Antigen“ (CEA) in Leberzell-Tumoren (44). Die Existenz eines Tumors impliziert allerdings, daß diese malignen Zellen keine ausreichende Reaktion des Immunsystems ausgelöst haben. Eine der möglichen Ursachen für die mangelnde Immunität der Tumorzellen kann der Verlust von HLA-Molekülen sein. Bei zehn HLA-B7-defizienten Melanompatienten wurden mit Liposomen komplexierte Plasmide, die das Gen für HLA-B7 und β-2 Mikroglobulin tragen, in den Tumor injiziert, um eine lokale Immunantwort gegen den Tumor zu induzieren. Zu den wichtigsten Resultaten dieser Studie gehört, daß die Expression des Transplantationsantigens zu einer Immunantwort führt, und daß es als Folge dieser Stimulation zu einer Erkennung von unmodifizierten Tumorzellen kommt. So zeigte einer der Patienten eine partielle Regression einer Metastase. In dieser Studie wurden auch zytotoxische T-Zellen mit einer Spezifität für Einleitung autologe Tumorzellen nachgewiesen (66). Dieses Konzept wird gegenwärtig auch auf die Behandlung gastrointestinaler Tumoren übertragen (34;80). Ein weiterer immuntherapeutischer Ansatz ist die Expression von immunstimulierenden Zytokinen im Tumor. Ziel dieser Strategie ist die Migration von Lymphozyten zum Tumor und die Aktivierung der tumorinfiltrierenden Lymphozyten, um so eine antitumorale Wirkung hervorzurufen (1). Mehrere Studien evaluieren derzeit den Nutzen dieser Strategie für den Patienten. 1.1.3 Suizidgentherapie Durch das Einbringen von Suizidgenen in Tumorzellen oder die Transfektion von Genen, die für prodrug-aktivierende Enzyme kodieren, können Tumorzellen in vivo eliminiert werden. Die Suizidgen-Strategie kann dazu benutzt werden, spezifisch die Zellpopulation zu eliminieren, die diese Gene exprimiert. Da die toxischen Metabolite durch Gap-junctions in benachbarte Zellen diffundieren können, kann eine weitere Eliminierung des Tumors auch dann erreicht werden, wenn nicht jede Zelle das Suizidgen exprimiert. Der Gentransfer erfolgt in der Regel mittels retroviraler oder adenoviraler Vektoren. Etablierte Suizidgene sind das Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase-System (HSV-TKSystem) (61) und das Cytosindeaminase-System (CD) (64). Durch transgene Synthese der HSV-TK wird das primär nicht toxische Prodrug Ganciclovir-Monophosphat in das zytotoxische Ganciclovir-Triphosphat (GCV-PPP) umgewandelt. GCV-PPP wird während der Replikation in die zelluläre DNA eingebaut und führt als atypisches Nukleotid zur Inhibition der DNA-Synthese und damit zur Teilungsunfähigkeit der Tumorzelle. GCV-PPP wird ferner über Gap-junctions in benachbarte Tumorzellen weitergegeben. Dieses als „ Bystandereffekt“ bekannte Phänomen hat zur Folge, daß mit einer kleinen Anzahl gentherapeutisch behandelter Tumorzellen ein signifikanter antitumoraler Effekt erzielt werden kann (24). Das HSV-TK-System wurde in verschiedenen Tiermodellen bereits erfolgreich erprobt. Caruso et al. induzierten im Mausmodell ein kolorektales Karzinom durch Tumorzellimplantation unter die Leberkapsel (9). Nach Injektion von Fibroblasten, die HSVTK-Retroviren bildeten, und Applikation von Ganciclovir kam es zur drastischen Senkung der Tumorgröße und Verlängerung der Überlebenszeit der Mäuse (37;9). Auch Lebermetastasen pankreatischer Tumoren waren durch die adenovirusvermittelte HSV-TK-Strategie und Einleitung nachfolgende Ganciclovir-Gabe therapierbar. Es wurde eine hochsignifikante Hemmung des Wachstums der Tumoren beschrieben (6). 1.2 Gentransfer Zentrales Problem jeder gentherapeutischen Strategie ist der Transfer des therapeutischen Gens in die Zielzelle. Nur in wenigen Ausnahmefällen ist es möglich, dem Patienten die Zielzelle zu entnehmen und den Gentransfer ex vivo durchzuführen. In der Mehrzahl der Ansätze ist es erforderlich, die Übertragung der therapeutischen Gene in vivo durchzuführen. Im einfachsten Fall ist es möglich, das Gen in Form von Plasmid-DNA im Komplex mit kationischen Liposomen einzusetzen, um die Effizienz des Gentransfers zu erhöhen (65;80;86). Der Nachteil dieser Methode ist, daß die Plasmid-DNA nur eine begrenzte Zeit in der Zielzelle erhalten bleibt und nahezu keine Zellen die DNA stabil integrieren. Viren haben im Verlauf der Evolution den Transfer genetischer Information in die Zellen ihres Wirtes perfektioniert. Die hohe Effizienz des Gentransfers hat zu der Entwicklung genetisch modifizierter viraler Vektorsysteme geführt. Retroviren sind das bis heute am häufigsten verwendete Transfersystem in GentherapieStudien (60). Mehr als tausend Patienten wurden mit retroviralen Vektoren behandelt und in keinem Fall wurde ein nachteiliger Effekt des Vektors beobachtet (79). Retroviren übertragen ihre genetische Information in Form von einzelsträngiger RNA. Nach der Infektion der Wirtszelle wird das Genom revers transkribiert und mit hoher Effizienz stabil in das Wirtsgenom integriert. Die gegenwärtig verwendeten Vektoren wurden vom MoloneyMurine-Leukemia-Virus (MMLV) abgeleitet. Sie sind replikationsdefizient und tragen zur Sicherheit eine Reihe von Mutationen und Deletionen, welche Rekombinationen und die Bildung replikationskompetenter Viren verhindern (59). Retrovirale Vektoren sind mit Nachteilen behaftet, die ihre Verwendung limitieren. Durch die zufällige Insertion in das humane Genom besteht ein theoretisches Risiko, daß es zur Aktivierung von Protoonkogenen oder zur Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen kommt und als Folge dessen eine benigne Zelle in einen malignen Zustand transformiert wird (20). MMLV-abgeleitete Vektoren können ferner nur proliferierende Zellen infizieren und sind nicht stabil gegenüber dem humanen Komplementsystem, was ihre Verwendung für einen Invivo-Gentransfer auf immunpriviligierte Organe wie das Gehirn beschränkt (13). Einleitung Um einige der Nachteile bisheriger Vektoren zu umgehen, werden auch andere Retroviren auf ihre Eignung als Vektor untersucht. So würde zum Beispiel die Komplementresistenz von Lentiviren die Möglichkeit eines In-vivo-Gentransfers wesentlich verbessern. Außerdem besitzen Lentiviren die Fähigkeit, ruhende Zellen zu infizieren (3;43). Adenoviren besitzen ein lineares doppelsträngiges DNA-Genom von etwa 36 kbp Länge. Sie infizieren ein breites Spektrum an Zellen und können genetische Information auch in ruhende Zellen übertragen (51;82). Die verwendeten Vektoren tragen Deletionen in ihrem Genom, die zum einen die Virusreplikation unterbinden und zum anderen den notwendigen Platz für das therapeutische Gen schaffen. Die extrachromosomale Persistenz von Adenoviren eliminiert das Risiko der Insertionsmutagenese, beschränkt allerdings die Zeitdauer der Genexpression auf wenige Wochen (82). Die Verwendung adenoviraler Vektoren wird durch die Immunogenität viraler Proteine eingeschränkt, die eine Immunantwort gegen das Virus und gegen infizierte Zellen hervorruft (82;90). Die Eliminierung transduzierter Zellen läuft der therapeutischen Intention des Gentransfers in manchen Fällen entgegen und eine wiederholte Infektion durch adenovirale Vektoren ist generell nicht erfolgreich (8). Fortschritte in der Vektorentwicklung führten zu Vektoren mit immer ausgedehnteren Deletionen, die zunehmend Raum für therapeutische Gene schaffen und die sich durch eine reduzierte Immunogenität auszeichnen (2;32;41;49). Wenige Gentherapie-Protokolle verwenden Vektoren, die vom Vaccinia-Virus oder vom Kanarienvogel-Pocken-Virus (Canary Pox Virus), zwei Mitgliedern der Pockenvirus-Familie, abgeleitet wurden. Gegenwärtig werden diese Vektoren in Immuntherapie-Protokollen eingesetzt, da Vaccinia-Viren eine humorale und eine zellvermittelte Immunantwort auslösen und man sich von der Copräsentation von Tumorantigenen und viralen Antigenen eine Verbesserung der induzierten Immunantwort erhofft (11;58). Weiterhin werden auch andere Viren auf ihre Eigenschaft als Vektoren untersucht (3;40;43;46). Einleitung 1.3 Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist weltweit bei Männern das häufigste Malignom. Risikofaktoren für das HCC sind insbesondere virale Hepatitiden. Die chronische Hepatitis B mit HbsAg-Persistenz ist mit einem über 200-fach erhöhten HCC-Risiko assoziiert (5). Untersuchungen zur chronischen Hepatitis-C-Infektion weisen auf einen vergleichbaren Zusammenhang hin (84). Weitere Risikofaktoren sind chronische Lebererkrankungen bei Alkoholmißbrauch, Hämochromatose und α1-Antitrypsin-Mangel (12). 1.3.1 Gentherapie des HCC und ihre Risiken Aufgrund der schlechten Prognose des fortgeschrittenen hepatozellulären Karzinoms werden gegenwärtig alternative Therapiemethoden entwickelt (16). Eine davon ist die Suizidgentherapie mit adenoviralen Vektoren (88). Diese sind für die Behandlung des HCC von besonderem Interesse, da sie einen hocheffizienten Gentransfer in die Leber erzielen können. Die Aufnahme des Vektors in die Zielzelle erfolgt mit Hilfe von Coxsackie- und Adenorezeptoren und mit der des sekundären Adenovirusrezeptors, der einem membranständigen Integrin entspricht (39). Nach Auflösung des viralen Kapsids (uncoating) werden die Nukleinsäuren im Zellkern transskribiert. Im Gegensatz zu retroviralen Vektoren kommt es bei Adenoviren nicht zur Integration der viralen Nukleinsäure in das Wirtsgenom, sondern zur passageren Expression von Transgenen. Die Expression eines mit dem Adenovirusvektor transportierten Gens ist dementsprechend besonders hoch, jedoch zeitlich limitiert. Tierexperimentelle Untersuchungen haben bei Kaninchen eine Expression über zwei Wochen und bei Mäusen bis zu vier Wochen gezeigt (48). In Zusammenhang mit der Anwendung von Adenoviren bei Gentherapie-Experimenten wird allerdings immer häufiger von dosisabhängigen toxischen Effekten berichtet (27;52;56;63;67;91). Hierbei wurden in Tierexperimenten folgende Beobachtungen gemacht: Abnahme von Thrombozytenzahlen, Anstieg von Leberenzymen und Schädigung von Muskel-, Leber- und Lungengewebe sowie vaskulärer Endothelien (56;63;67). Im Rahmen eines klinischen Therapieversuches mit adenoviralen Genvektoren an Patienten mit hereditärem Ornithin-Transcarbamylase-Mangel (OTC-Mangel) kam es sogar im November 1999 bei einem 18-jährigen Patienten zu einer akuten immunologisch-toxischen Reaktion mit Todesfolge (71). Einleitung 1.4 Zielsetzung der Arbeit Die Berichte über Nebenwirkungen adenoviraler Genvektoren zeigen, daß diese neuen gentherapeutischen Ansätze einer genauen Untersuchung ihrer Toxizität bedürfen. Die Cytosindeaminase (CD) ist eines der am häufigsten verwendeten Suizidgensysteme, die im Rahmen der experimentellen Gentherapie eingesetzt werden. Das CD-Genprodukt konvertiert 5-Fluorcytosin in das klinisch häufig verwendete Zytostatikum 5-Fluoruracil (5FU) und ist somit – auch für das HCC – als mögliche Alternative zu einer konventionellen Chemotherapie mit 5-FU zu sehen (s. untere Grafik). Cytosindeaminase (CD) 5-Fluorcytosin (5-FC) [Prodrug] 5-Fluoruracil (5-FU) [Chemotherapeutikum] Das Labor, in dem die vorliegende Promotionsarbeit durchgeführt wurde, arbeitet an einem HCC-Mausmodell, in dem die Wirkung und die Toxizität einer CD-Gentherapie mit einer konventionellen 5-FU-Chemotherapie verglichen werden soll. Die Experimente der vorliegenden Arbeit sind als Beiträge im Rahmen dieses größeren Projektes zu verstehen und sollen dazu dienen: - die Methode der peripher-venösen Injektion adenoviraler Vektoren an Mäusen zu etablieren, - die Lebertransduktion in Abhängigkeit verschiedener Vektordosierungen zu untersuchen, - die Messung von Parametern wie GPT, GOT, GGT, Bilirubin, ALP u.a. im Maus-Serum zu etablieren und - Veränderungen der Leberhistologie nach der Injektion adenoviraler Vektoren zu charakterisieren. Neben der Etablierung der genannten Methoden wurden orientierende Toxizitätsuntersuchungen durchgeführt, die als Vorbereitung für eine vergleichende Studie von CDGentherapie und konventioneller 5-FU-Chemotherapie am HCC-Mausmodell gedacht sind. Einleitung Da die CD-Gentherapie aus Vektorinjektion (i.v.) und anschließender (i.p.) Applikation von 5-FC besteht, wurden folgende Versuchsgruppen untersucht: 1. PBS i.v., anschließend PBS i.p. 2. PBS i.v., anschließend 5-FC i.p. 3. Adenoviraler Vektor i.v., anschließend 5-FC i.p. 4. 5-FU i.p. Als Versuchstiere wurden jeweils Nacktmäuse mit dem Genotyp nu/nu verwendet, da sich diese für die Herstellung humaner Tumormodelle am besten eignen. Der Umstand, daß diese Mäuse keine intakte T-Zellabwehr besitzen, wurde bei der Beurteilung der Toxizität jeweils berücksichtigt. Material und Methoden 2. Material und Methoden 2.1 Versuchstiere Thymusaplastische, weibliche Nacktmäuse eines NMRI-Auszucht-Stammes (Genotyp: nu/nu). 2.2 Versuchsgruppen 2.2.1 Tabellarische Darstellung der einzelnen Versuchsgruppen: Versuchstag PBS 5-FC 5-FC + Vektor 5-FU 0 PBS i.v. PBS i.v. Vektor i.v. - 1 - - - - 2 - - - - 3 PBS i.p. 5-FC i.p. 5-FC i.p. 5-FU i.p. 4 5 PBS i.p. + Blutentnahme PBS i.p. 5-FC i.p. + Blutentnahme 5-FC i.p. 5-FC i.p. + Blutentnahme 5-FC i.p. 5-FU i.p. + Blutentnahme 5-FU i.p. 6 PBS i.p. 5-FC i.p. 5-FC i.p. 5-FU i.p. 7 - - - - 8 - - - - 9 - - - - 10 Organ- und Blutentnahme Organ- und Blutentnahme Organ- und Blutentnahme Organ- und Blutentnahme Tab. 1: Tabellarische Darstellung der einzelnen Versuchsgruppen. Material und Methoden 2.2.2 Kontrollgruppe Die Kontrollgruppe bestand aus drei Versuchstieren, die durch zervikale Dislokation nach tierschutzrechtlichen Bestimmungen getötet wurden. Anschließend wurden Blut und Organe für weitere Untersuchungen entnommen. 2.2.3 PBS-Gruppe Drei Mäusen wurde am Versuchstag 0 10 ml PBS/kg Körpergewicht (KG) in die Schwanzvene injiziert. Nach zwei Tagen wurde von Versuchstag 3 bis 6 30 ml PBS/kg KG i.p. appliziert. Am Versuchstag 4 erfolgte eine Blutentnahme über die Schwanzvene. Am 10. Versuchstag wurden die Tiere durch zervikale Dislokation getötet; anschließend wurden Blut und Organe für Untersuchungen entnommen. 2.2.4 5-FC-Gruppe Zur Untersuchung der Toxizität von 5-Fluorcytosin (5-FC) wurde wie folgt verfahren: Am Versuchstag 0 wurde 10 ml PBS/kg KG i.v. injiziert. Nach zwei Tagen wurde von Versuchstag 3 bis 6 500 mg 5-FC/kg KG i.p. appliziert. Am Versuchstag 4 erfolgte eine Blutentnahme über die Schwanzvene. Am 10. Versuchstag wurden die Tiere durch zervikale Dislokation getötet; anschließend wurden Blut und Organe für Untersuchungen entnommen. 2.2.5 Versuchsgruppen mit adenoviralen Vektoren Für jede Versuchsgruppe wurden drei Mäuse eingesetzt. Am Versuchstag 0 wurden 400 µl Vektorsuspension in die Schwanzvene injiziert. Folgende Vektordosierungen wurden eingesetzt: 1x106, 1x107, 2x108 und 5x108 PFU1. An den Versuchstagen 3 bis 6 wurde 500 mg 5-FC/kg KG i.p. appliziert. Am Versuchstag 4 erfolgte eine Blutentnahme über die Schwanzvene. Am 10. Versuchstag wurden die Tiere durch zervikale Dislokation getötet und Blut und Organe für Untersuchungen entnommen. 1 Die adenovirale Vektormenge wird hier in Plaque Forming Units (PFU) angegeben Material und Methoden 2.2.6 5-FU-Gruppe Zur Untersuchung toxischer Wirkungen des Zytostatikums 5-Fluoruracil (5-FU) wurde über vier Tage 125 mg 5-FU/kg KG i.p. appliziert. 2.3 Verwendete Lösungen und Substanzen Herstellung der 5-FC-Suspension: 5-FC in Pulverform2 wurde in PBS in einer Konzentration von 12 mg/ml gelöst. Dies entsprach einer gesättigten Lösung, die anschließend steril filtriert3 und bei –20 °C gelagert wurde. 2.4 Blutbild Nach Punktion der Schwanzvene mit einer sterilen Injektionsnadel wurden jeweils zwei große Tropfen Blut in einem mit EDTA beschichteten Röhrchen4 aufgefangen und sofort auf Eis gestellt. Die Lagerungszeit auf Eis bis zur Messung der Parameter betrug maximal eine Stunde. Die Messungen erfolgten bei Raumtemperatur mit dem Gerät "Sysmex F-820" und dem Pipettengerät "Sysmex AD-270" der Firma Sysmex . 2.5 Laborchemische Messungen Untersucht wurden folgende Parameter: GPT5, GOT6, Bilirubin, AP7, Gamma-GT8, Kreatinin, Glukose, pankreatische Amylase, Kreatinkinase und Harnsäure. Für alle Messungen wurde das Blut durch Thorakotomie gewonnen (GPT und GOT wurden zusätzlich aus dem Schwanzvenenblut bestimmt). Dabei wurde nach zervikaler Dislokation der Thorax der Versuchstiere in kaudal-cranialer Richtung mit einer Schere eröffnet, die Aorta durchtrennt, das vorliegende Blut mit einer 1 ml Insulinspritze entnommen und in 2 5-FC-Pulver von der Firma Sigma (Katalog-Nr F-7129) Millex-GS non pyrogenic sterile 0,22 µm der Firma "Millipore", Katalognummer SBGS 025 SB 4 EDTA-Röhrchen von KaBE Labortechnik, Nr. 078001 5 GPT = Glutamat-Pyruvat-Transaminase 6 GOT = Glutamat-Oxalacetat-Transaminase 7 AP = Alkalische Phosphatase 3 Material und Methoden Natrium-Heparin-beschichtete Röhrchen9 überführt und bei 800 U/min zentrifugiert. Das dadurch gewonnene Plasma wurde in ein Eppendorfgefäß pipettiert. In den Fällen, in denen die Messungen nicht unmittelbar nach der Probengewinnung erfolgten, wurde das Plasma bis zur Analyse bei -20°C tiefgefroren. Für die Durchführung der Messungen wurde das Messgerät Reflotron der Firma Roche und die jeweils zugehörigen Meßstreifen eingesetzt, die im einzelnen hier aufgeführt sind: -Reflotron GOT, Katalognummer 745120 -Reflotron GPT, Katalognummer 745138 -Reflotron Bilirubin, Katalognummer 905321 -Reflotron AP, Katalognummer 1622773 -Reflotron Gamma-GT, Katalognummer 745081 -Reflotron Kreatinin, Katalognummer 886874 -Reflotron Glukose, Katalognummer 744948 -Reflotron Pancreatic Amylase, Katalognummer 1126679 -Reflotron Kreatinkinase, Katalognummer 1126695 -Reflotron Uric Acid, Katalognummer 745103 2.6 Protokoll der Messungen mit dem Reflotron -Gerät von Roche Für die Messungen wurde jeweils ein Probenvolumen von 32 µl verwendet. Dabei wurde darauf geachtet, nur optisch klares Plasma einzusetzen, da bei stärkerer Trübung durch Hämolyse die Gefahr von Meßfehlern besteht. Bei geringen Mengen an Untersuchungsmaterial wurde die Probe je nach Bedarf mit dem Puffer PBS bis zu 1:15 vorverdünnt. Die Messungen wurden gemäß dem Herstellerprotokoll durchgeführt. 8 9 GGT = Gamma-Glutamyl-Transferase Natrium-heparin-beschichtete Röhrchen der Firma KABE Labortechniken, 4 ml Fassungsvermögen Material und Methoden 2.7 Herstellung von Organpräparaten Nach zervikaler Dislokation der Mäuse wurden Leber, Lunge und Milz jeweils zur einen Hälfte in 10%-Formalin fixiert, zur anderen schockgefroren und bei -80°C gelagert. Die formalin-fixierten Gewebe wurden im Pathologischen Institut der Universität Freiburg in Paraffin eingebettet. Von diesen wurden 10 µm Schnitte angefertigt, mit HE gefärbt und von Frau Prof. Dr. A. Schmitt-Gräff histologisch beurteilt. Die andere Hälfte der Organe wurde für die spätere fluoreszenz-mikroskopische Beurteilung folgendermaßen schockgefroren: Ein Gefäß mit Methylbutan10 wurde in ein größeres, Trockeneis und 99%-Ethanol enthaltendes Behältnis hineingestellt und damit auf ca. –120°C vorgekühlt. Die Organe wurden anschließend für ca. 5 min in das Methylbutan eingelegt und nach dem Schockgefrieren bei -80°C aufbewahrt. Die anschließende Herstellung mikroskopischer Schnittpräparate erfolgte folgendermaßen: Die tiefgefrorenen Organstücke wurden zunächst in Einbettmedium11 eingelegt. Anschließend wurden mit dem Schneidegerät Frigocut-2800 von Reichert-Jung 10 µm Schnitte hergestellt, auf Objektträger12 aufgetragen und bis zur Fluoreszenzuntersuchung bei -80°C gelagert. 2.8 Vektorreplikation und -aufbereitung Ad-GFP ist ein rekombinantes, humanes und durch die Deletion des E1-Gens replikationsdefizientes Adenovirus. In das Virus-Genom ist eine Expressionskassette für das Grün Fluoreszierende Protein (GFP) eingebaut. Die Vermehrung von Ad-GFP erfolgte in 293-Zellen, die das E1-Gen enthalten und somit die Virusreplikation ermöglichen. 293-Zellen wurden in 15 cm-Schalen13, IMDM-Nährmedium14 und 8% FCS15 bis zu einer Konfluenz von 80% kultiviert und anschließend mit jeweils 3 ml Virussuspension infiziert (Titer dieser Suspension: 105 PFU/ml). Nach Infektion wurden die 293-Zellen bei 37°C und 5% CO2 2-3 Tage inkubiert16. Anschließend wurde der Inhalt von 10 Von der Firma "Fulka", Katalognummer 59065 tissue freezing medium von Jung, Nr.020108926 12 Objektträger Superfrost von Menzel 76x26 mm 13 Greiner Labortechnik/Frickenhausen 14 Gibco BRL (Eggenstein) 15 FCS: fetal calf serum, PAA Laboratories GmbH/Linz, Österreich 16 Inkubator B 5060 EK-CO2 11 Material und Methoden drei 15 cm-Schalen in ein 50 ml-Falcon-Gefäß17 überführt und in einer Zentrifuge18 bei 800 U/min pelletiert. Dieses Zellpellet wurde in 2,5 ml PBS + Calcium + Magnesium14 resuspendiert. 5 ml Zellsuspension wurden mit 1g Glass Beads19 und 600 µl 5% Natriumdeoxycholat-Lösung20 versehen und in ein 30 ml-Gefäß 20 überführt. Nach einer 30- minütigen Inkubation auf Eis wurde das entstandene Zelllysat 3 min durch Vortexen vermischt und bei 11000 rpm und 4°C 20 min zentrifugiert21, wodurch zwei Phasen entstanden. Die obere Phase enthält das Virus, das über einen CsCl-Gradienten22 isoliert wurde: 2,06 ml einer gesättigten CsCl-Lösung24 in TE-Puffer23 und 3,54 ml des Zelllysates (entspricht der oben genannten "oberen Phase" nach dem Zentrifugationsschritt bei 11000 U/min) wurden in ein 6 ml Ultrazentifugen-Röhrchen24 überführt, das mit einem Crimper25 verschlossen und in einer TGA-55-Ultrazentrifuge (Firma Kontron/Neufahrn) bei 38000 U/min und 4°C 20 h zentrifugiert wurde. Nach diesem Schritt entstanden virusenthaltende Banden in der oberen Hälfte des CsCl-Gradienten. Mit einer 1 ml-Spritze und einer 26-GKanüle wurde die Virusbande unter sterilen Bedingungen abpunktiert. Danach erfolgte die Reinigung des Adenovirus vom CsCl über eine NAP-25-Säule26. Diese Säule wurde mit 25 ml H2O äquilibriert, mit 2,5 ml der punktierten Virussuspension beladen und mit 3,5 ml H2O eluiert. Das Eluat mit dem Virus wurde mit Millipore-Säulen27 bei 2000 U/min und 4°C auf 1 ml pro Millipore-Röhrchen konzentriert, in Eppendorf-Gefässe28 aliquotiert und bei -80°C aufbewahrt. Die Titerbestimmung des Vektors erfolgte in der 293-Zellinie durch einen Plaque-Assay: 293-Zellen wurden bei einer Konfluenz von 100% zur Virustiterbestimmung mit einer Verdünnungsreihe des Virus infiziert und für 2-3 Stunden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert16. Während der Inkubationszeit wurde eine 2,2%-ige Seaplaque® Agarose-Lösung29 in einem Wasserbad auf 42°C erhitzt, 14,5 ml davon wurden in ein 50 ml-Falcon-Gefäß überführt. In einem zweiten 50 ml-Falcon-Gefäß wurden 14,5 ml 2X-DMEM-Nährmedium20, 400 µl FCS, 400 µl 100x-Penicillin/Streptomycin-Lösung32 und 100X-Glutamin-Lösung32 ebenfalls im Wasserbad bei 38°C erwärmt. Nach einer Stunde wurde die zuvor auf die 29317 Falcon-Gefäß von Becton Dickinson, USA Zentrifuge: Rettich, "Rotixa/KS" 19 SIGMA®/Taufkirchen 20 Sarstedt/Nümbrecht 21 Sorvall® Zentrifuge RC 5B Plus, Sorvall® DuPont, Bad Homburg. Rotor: HFA 22,50/Heraeus Sepatech 22 CsCl: Caesiumchlorid, (SIGMA®, Taufkirchen) 23 TE-Puffer: Tris-EDTA-Puffer 24 Ultrazentrifugen-Tube von Sorvall® # 03945 25 Von der Firma DuPont/Bad Homburg 26 Pharmacia Biotech, Freiburg 27 cut off MW 300000, Millipore Corporation, Frankfurt 28 1,5 ml, Eppendorf-Netheler-Hinz-GmbH/Hamburg 29 FMC® Bio Products, Rockland, USA 18 Material und Methoden Zellen pipettierte Virussuspension aspiriert, die 2,2%-ige Seaplaque® Agarose-Lösung mit dem Nährmedium im Verhältnis 1:1 vermischt und auf die 293-Zellen pipettiert. Nach 6-10 Tagen können im UV-Licht grün fluoreszierende Plaques mikroskopisch ausgezählt, mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor multipliziert und somit der Virustiter in Plaque Forming Units (PFU) pro ml bestimmt werden. 2.9 Zellkultur Gearbeitet wurde mit 293-Zellen, die in Gewebekulturflaschen30 kultiviert und alle 7 Tage passagiert wurden. Dazu wurde das Medium mit einer Pipette31 aspiriert, die Zellen mit 10 ml PBS pro 250 ml Gewebekulturflasche30 gewaschen und danach trypsiniert. Zur Durchführung des letztgenannten Schrittes wurde 5 ml Trypsin-EDTA32 auf die Zellen pipettiert und diese für 5 min. bei 37°C und 5% CO2 inkubiert16. Anschließend wurde die Trypsinierung mit 5 ml Medium (IMDM-Nährmedium14 versetzt mit 8% FCS15) gestoppt. Nach Vereinzelung der Zellen durch mehrmaliges Aspirieren mit einer Pipette31 wurde 1 ml der Zellsuspension in eine neue 250 ml Gewebekulturflasche überführt. Als Medium wurde wiederum IMDMNährmedium + 8% FCS verwendet und mit 5 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung versetzt, um einer bakteriellen Kontamination vorzubeugen. Die sich nun in dieser Gewebekulturflasche befindlichen 293-Zellen wuchsen nach ca. 1 Woche zu einem 100%-konfluenten Zellrasen heran und wurden in diesem Stadium erneut passagiert. 30 31 250 ml Gewebekulturflasche, steril mit Filter,Greiner bio-one PIPETBOY von IBS INTEGRA BIOSCIENCES Ergebnisse 3. Ergebnisse 3.1 Zielsetzung der Experimente Der in der Einleitung erwähnte vielfältige Einsatz adenoviraler Genvektoren verdeutlicht die Notwendigkeit einer umfassenden Kenntnis ihrer toxischen Nebenwirkungen. Als einen Beitrag dazu sollten die in diesem Kapitel aufgeführten Ergebnisse dienen: - Untersuchungen vor allem hepatotoxischer Nebenwirkungen adenoviraler Genvektoren am Mausmodell durch laborchemische und histologische Analysen. - Überblick über eventuelle pankreato- und nephrotoxische Wirkungen. - Orientierender Toxizitätsvergleich zwischen einer konventionellen Chemotherapie mit 5-FU und einer adenoviralen Gentherapie. Ferner sollten im Rahmen der Experimente die Lebertransduktion in Abhängigkeit verschiedener Vektordosierungen untersucht werden. Insgesamt sind die beschriebenen Versuche als Vorbereitung für einen detaillierten Toxizitätsvergleich einer adenoviralen Gentherapie und einer konventioneller Chemotherapie anzusehen. Der Versuchsaufbau ist in Tab. 1 zusammengefasst: Versuchstag 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 PBS 5-FC 5-FC + Vektor 5-FU PBS i.v. PBS i.p. PBS i.p. + Blutentnahme PBS i.p. PBS i.p. Organ- und Blutentnahme PBS i.v. 5-FC i.p. 5-FC i.p. + Blutentnahme 5-FC i.p. 5-FC i.p. Organ- und Blutentnahme Vektor i.v. 5-FC i.p. 5-FC i.p. + Blutentnahme 5-FC i.p. 5-FC i.p. Organ- und Blutentnahme 5-FU i.p. 5-FU i.p. + Blutentnahme 5-FU i.p. 5-FU i.p. Organ- und Blutentnahme Tab. 1: Tabellarische Übersicht der einzelnen Versuchsgruppen. Ergebnisse Zur Erfassung toxischer Schäden wurden bei allen Versuchsgruppen folgende Serum- bzw. Blut-Parameter gemessen: - GPT und GOT: Erhöhte Werte weisen auf hepatozelluläre Schäden hin. - GGT, AP und Bilirubin als Cholestase- bzw. Leberfunktionsparameter. - Glukose-Werte: Diese werden durch hepatische Glukoneogenese, Glykogensynthese und Glykogenolyse beeinflusst und können bei signifikanter Leberinsuffizienz abfallen. - Weiße Blutkörperchen (WBC) als Parameter einer entzündlichen Reaktion. - Erhöhung der Pankreatischen Amylase zeigt eine Pankreas-Schädigung an (z.B. als mögliche Nebenwirkung einer 5-FU-Applikation bekannt). - Kreatinin und Harnsäure als Nierenfunktionsparameter. Eine ausführliche Beschreibung dieser Parameter findet sich im Anhang (S. 60). 3.2 Laborchemie und Blutbild Die Ergebnisse der erwähnten Blut- und Serum-Untersuchungen sind auf den folgenden Seiten dargestellt . Ergebnisse GPT 1000 Tag 4 Tag 10 900 800 700 GPT (U/L) 700 600 500 400 300 200 193 100 24 20 24 23 22 21 28 33 20 32 0 Kontrolle PBS 5-FC 5-FU 2x10e8 5x10e8 Abb. 1: GPT-Werte der einzelnen Versuchsgruppen mit Mittelwert und Standard-abweichung der Versuchstage 4 (linker Balken) und 10 (rechter Balken) in Units/Liter. Dargestellt sind: Kontrolle (n = 3), PBS (n = 3), 5-Fluorcytosin (n = 3), 5-Fluoruracil (n = 2), 2x108 (n = 2) und 5x108 Ad-GFP (n = 1). In Abb. 1 dargestellt sind Serum-GPT-Werte in Units/Liter mit Mittelwert und Standardabweichung der einzelnen Versuchsgruppen am Versuchstag 4 und 10. Das für diese Messungen verwendete Serum wurde jeweils durch Punktion der Schwanzvene gewonnen. Deutlich ersichtlich ist der ca. 8-fache Anstieg der Serum-GPT-Werte nach Injektion von 2x108 Ad-GFP am Versuchstag 4 und der etwa 30-fache Anstieg am Tag 10 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Im Gegensatz dazu ist in den Versuchsgruppen PBS, 5-FC und 5-FU kein bzw. kein signifikanter GPT-Anstieg gegenüber der Kontrollgruppe zu erkennen. Auch zwischen Tag 4 und 10 zeigen diese Versuchsgruppen jeweils keine Unterschiede. Nach Injektion von 5x108 Kontroll-Adenoviren sind die GPT-Werte im Vergleich zur Kontrollgruppe nur leicht erhöht. Hier handelt es sich allerdings nur um ein einziges Versuchstier, so daß eine fehlerhafte Injektion oder eine defekte Vektorpräparation nicht sicher ausgeschlossen werden kann. Ergebnisse AP 1200 Tag 10 1000 AP (U/L) 800 727 600 400 179 217 212 193 153 200 0 Kontrolle PBS 5-FC 5-FU 2x10e8 5x10e8 Abb. 2: Alkalische Phosphatase gemessen im Serum am Versuchstag 10 mit Mittelwert und Standardabweichung in Units/Liter. Dargestellt sind: Kontrolle (n = 3), PBS (n = 3), 5-Fluorcytosin (n = 3), 5-Fluoruracil (n = 2), 2x108 (n = 2) und 5x108 Ad-GFP (n = 1). In Abb. 2 sind Serumwerte für die AP mit Mittelwert und Standardabweichung am Versuchstag 10 in Units/Liter dargestellt. Deutlich zu erkennen ist ein ca. 4-facher Anstieg der AP nach Injektion von 2x108 Adenoviren im Vergleich zur Kontrolle. In allen anderen Versuchsgruppen zeigen sich keine signifikanten Veränderungen. Ergebnisse Bilirubin 8 Tag 10 3,8 7 Bilirubin (mg/dl) 6 5 3 4 3 2 1,6 1,8 2 1,5 1 0 Kontrolle PBS 5-FC 5-FU 2x10e8 5x10e8 Abb. 3: Bilirubin-Werte gemessen am Versuchstag 10 mit Mittelwert und Standardabweichung in mg/dl. Dargestellt sind: Kontrolle (n = 3), PBS (n = 3), 5-Fluorcytosin (n = 3), 5-Fluoruracil (n = 2), 2x108 (n = 2) und 5x108 Ad-GFP (n = 1). In Abb. 3 ist das Serum-Bilirubin mit Mittelwert und Standardabweichung am Versuchstag 10 in mg/dl dargestellt. Im Gegensatz zu GPT und AP zeigt sich bei den Versuchstieren mit 2x108 Adenoviren kein erkennbarer Bilirubin-Anstieg im Vergleich zu den Kontrollwerten. Die Werte aller Versuchsreihen liegen eng beieinander und schwanken um 1,7 mg/dl. Ergebnisse Glukose 400 Tag 10 350 288 Glukose (m g/dl) 300 278 250 200 157 150 155 138 117 100 50 0 Kontrolle PBS 5-FC 5-FU 2x10e8 5x10e8 Abb. 4: Glukose-Werte gemessen am Versuchstag 10 mit Mittelwert und Standardabweichung in mg/dl. Dargestellt sind: Kontrolle (n = 3), PBS (n = 3), 5-Fluorcytosin (n = 3), 5-Fluoruracil (n = 2), 2x108 (n = 2) und 5x108 Ad-GFP (n = 1). Abb. 4 zeigt Serum-Glukose-Werte der einzelnen Versuchsgruppen mit Mittelwert und Standardabweichung am Versuchstag 10. Auffallend sind die deutlich erhöhten Glukose-Werte in der 5-FC-Gruppe. Die Gruppe 5x108 Adenoviren besteht aus nur einem Versuchstier, der Wert dieser Versuchsgruppe ist deshalb statistisch nicht verwertbar. Im Gegensatz zu den deutlichen Unterschieden der GPT und AP zeigen die Versuchstiere mit 2x108 Adenoviren keine erkennbaren Abweichungen in den Serum-Glukose-Werten. Ergebnisse Leukozyten 25000 Tag 5 Tag 10 18850 Leukozyten/µl Blut 20000 16000 14700 15000 11550 10033 9200 10000 8000 10500 8000 8200 7100 6100 5000 0 Kontrolle PBS 5-FC 5-FU 2x10e8 5x10e8 Abb. 5: Leukozytenzahl gemessen an den Versuchstagen 4 und 10 mit Mittelwert und Standardabweichung pro µl Blut. Dargestellt sind: Kontrolle (n = 3), PBS (n = 3), 5Fluorcytosin (n = 3), 5-Fluoruracil (n = 2), 2x108 (n = 2) und 5x108 Ad-GFP (n = 1). Abb. 5 zeigt die Leukozytenzahl pro µl Vollblut mit Mittelwert und Standardabweichung am Versuchstag 4 und 10. Auffallend sind in erster Linie die erhöhten Werte in den Gruppen 2x108 und 5x108 Adenoviren, während die anderen Versuchsgruppen keine signifikanten Veränderungen gegenüber der Kontrolle aufweisen. Die stark erhöhte Leukozytenzahl in der Gruppe 2x108 Adenoviren entspricht den deutlichen Veränderungen von GPT und AP in dieser Versuchsgruppe (Abb. 1 und 2). Ergebnisse Pankreatische Amylase 9000 Tag 10 Pankreatische Amylase (U/L) 8000 7000 6000 5000 4847 4596 4530 4000 3000 3213 3022 2578 2000 1000 0 Kontrolle PBS 5-FC 5-FU 2x10e8 5x10e8 Abb. 6: Pankreatische Amylase mit Mittelwert und Standardabweichung in Units/Liter. Dargestellt sind: Kontrolle (n = 3), PBS (n = 3), 5-Fluorcytosin (n = 3), 5-Fluoruracil (n = 2), 2x108 (n = 2) und 5x108 Ad-GFP (n = 1). Abb. 6 zeigt die Pankreatische Amylase mit Mittelwert und Standardabweichung am Versuchstag 10 in Units/Liter. Die Abweichungen der einzelnen Versuchsgruppen sind jeweils nur gering und statistisch nicht signifikant. Auch in der Gruppe 2x108 Adenoviren zeigen sich keine erhöhten Werte. Ergebnisse 3.3 Leberhistologie Zur weiteren Untersuchung hepatotoxischer Wirkungen der eingesetzten Substanzen wurden am Pathologischen Institut der Freiburger Universitätsklinik mit HE gefärbte LeberSchnittpräparate angefertigt und von Frau Prof. Dr. A. Schmitt-Gräff beurteilt. Die für diesen Zweck verwendeten Organe wurden den Mäusen jeweils am Versuchstag 10 entnommen (s.o.). Die Besprechung der folgenden sechs Abbildungen bezieht sich auf die dazugehörigen Bilder auf S. 33. Abb. 7: Leber einer Kontrollmaus Diese Abbildung ist beispielhaft für eine Leber ohne jegliche Parenchymschädigung. Sie zeigt die regelmäßige Struktur der Leberzellbalken mit normalen Hepatozyten sowie zwischengelagerten Sinusoiden mit randständigen von Kupffer’schen Sternzellen. Abb. 8: Leber einer Maus nach PBS-Applikation Kein Hinweis auf Zellschädigung feststellbar. Unauffällige Zell- und Parenchymstruktur vergleichbar mit der Normalleber einer Kontrollmaus (s. Abb. 7). Abb. 9: Leber nach Applikation von 5-FC Auch hier eine unauffällige Histologie, vergleichbar mit der Normalleber in Abb. 7 und der Leber nach PBS-Applikation in Abb. 8. Abb. 10: Leber nach Applikation von 5-FU Ebenfalls keine signifikanten Parenchymschäden sichtbar. Ergebnisse Abb. 11: Leber nach Injektion von 1x107 Kontroll-Adenoviren Keine signifikanten Schäden sichtbar, entsprechend der Leber in Abb. 7-10. Abb. 12: Leber nach Injektion von 2 x108 Adenoviren Im Vergleich zum Kontrollgewebe zeigt dieses Schnittpräparat deutliche Zeichen einer schweren Parenchymschädigung. Gemischtes Bild aus azidophil geschrumpften (Pfeil 1) und hydropisch geschwollenen Hepatozyten ( = Zellballonierungen, Pfeil 2), Apoptosen (Pfeil 3) und Karyorrhexis-Figuren (Pfeil 4). Ferner fokale entzündliche Reaktionen mit granulohistiozytären Infiltraten und Sternzell-Proliferationen (Pfeil 5). Das Parenchym ist insgesamt sehr ungeordnet, Läppchenstrukturen sind nicht mehr erkennbar, teilweise kaum noch hepatozytäre Zellgrenzen identifizierbar. Die für eine Virushepatitis typischen T-lymphozytären Infiltrate sind nicht nachweisbar, da die verwendeten thymusaplastischen Nacktmäuse keine T-Lymphozyten besitzen. Zusammenfassend können histologisch in den ersten fünf Versuchsgruppen keine Parenchymschäden nachgewiesen werden. Somit hatten die Substanzen PBS, 5-FC, 5-FU in den eingesetzten Dosierungen (s. Kapitel 2 ) und eine i.v. Injektion von 1x107 KontrollAdenoviren keine erkennbare toxische Leberschädigung zur Folge. Im Gegensatz dazu zeigt die Leber nach Applikation einer höheren Vektordosis deutliche Gewebedestruktionen (s. Abb. 12, S. 33). Diese Befunde decken sich mit den Ergebnissen der laborchemischen Untersuchungen. Ergebnisse Histologie der Leber verschiedener Versuchsgruppen Kontrolle Abb. 7: Mausleber, 400 x, HE Leber eines Kontrolltiers (ohne Behandlung) als Beispiel für eine Leber ohne Parenchymschäden. PBS Abb. 8: Mausleber, 200 x, HE Leber nach einmaliger intravenöser und fünftägiger PBS-Applikation (i.p.). Keine signifikanten Parenchymschäden. 5-FC Abb. 9: Mausleber, 200 x, HE Leber nach fünftägiger 5-FC-Applikation (i.p.). Keine signifikanten Parenchymschäden. 5-FU Abb. 10: Mausleber, 200 x, HE Leber nach fünftägiger 5-FU-Applikation (i.p.). Keine signifikanten Parenchymschäden. 1x107 Ad-GFP Abb. 11: Mausleber, 200 x, HE Leber nach i.v. Applikation von 1x107 PFU Adenoviren (Ad-GFP) + 500 mg 5-FC/kg KG i.p. Keine signifikanten Parenchymschäden. 2x108 Ad-GFP Abb. 12: Mausleber, 400 x, HE Leber nach i.v. Applikation von 2x108 PFU Adenoviren (Ad-GFP) + 500 mg 5-FC/kg KG i.p. Ausgeprägte Parenchymschäden in Form von Zytoplasmabasophilie (1), Zellballonierungen (2), Apoptosen (3), Karyorrhexis-Figuren (4), fokal betonten entzündlichen Reaktionen mit Sternzellknötchen (5) und doppelkernigen Hepatozyten (6). Ergebnisse 3.4 Lebertransduktion in Abhängigkeit verschiedener Vektordosierungen Die Beurteilung der Lebertransduktion in Abhängigkeit verschiedener Vektordosierungen wurde wie folgt durchgeführt: Im Vektorgenom integriert befindet sich eine Expressionskassette für Grün Fluoreszierendes Protein (GFP). Transduzierte Zellen können damit aufgrund ihrer GFP-Expression unter UV-Licht nachgewiesen werden. Von jedem Versuchstier wurden Leber-Gefrierschnitte angefertigt (s. Kapitel 2) und die grün fluoreszierende Fläche dieser Präparate in Bezug zur gesamten Schnittfläche gesetzt, um so den Transduktionsgrad der Leber zu ermitteln (s. Abb. 13b, 14b und 15b, S. 36). Durch eine Gegenüberstellung der genannten Gefrierschnitte mit HE-gefärbten histologischen Schnitten aus der gleichen Leber konnte ferner der Transduktionsgrad mit den histologischen Schäden verglichen werden (s. Abb. 13a - 15b, S. 36). Abb. 13a und 13b: Leber nach Injektion von 5 x108 Adenoviren Beide Präparate stammen von der gleichen Leber. Zum einen als HE-Präparat bei NormalLicht (13a) und zum anderen als Gefrier-Schnittpräparat bei UV-Licht (13b) fotographiert. Abb. 13a zeigt geringe, fokal betonte Schädigung mit vermehrtem Auftreten von doppelkernigen Hepatozyten (Pfeil 1), zytoplasmatischen Vakuolisierungen (Pfeil 2) und vermehrter Basophilie (Pfeil 3). Abb. 13b zeigt das Ausmaß der Transduktion: Bei den hellgrün fluoreszierenden Arealen handelt es sich um adenoviral transduzierte Hepatozyten. Weniger als 5% der Schnittfläche zeigt GFP-Expression. Abb. 14a und 14b: Leber 1 nach Injektion von 2 x108 Adenoviren Abb. 14a zeigt eine hochgradige Parenchymschädigung mit vermehrter Kern-polymorphie, Zytoplasmabasophilie (Pfeil 1), Zellballonierungen (Pfeil 2), Apoptosen (Pfeil 3), Karyorrhexis-Figuren (Pfeil 4) und fokal betonten, entzündlichen Reaktionen mit Sternzellknötchen (Pfeil 5). Abb. 14b zeigt das Ausmaß der Transduktion beim selben Organ: Grüne Fluoreszenz von ca. 60% der Schnittfläche als Hinweis auf eine mittelgradige Transduktion der Leber. Ergebnisse Abb. 15a und 15b: Leber 2 nach Applikation von 2 x108 Adenoviren Abb. 15a zeigt ebenfalls eine hochgradige Parenchymschädigung mit vermehrter Kernpolymorphie, Zytoplasmabasophilie (Pfeil 1), Zellballonierungen (Pfeil 2), Apoptosen (Pfeil 3), Karyorrhexis-Figuren (Pfeil 4) und fokal betonten, entzündlichen Reaktionen mit Sternzellknötchen (Pfeil 5). Abb. 15b zeigt das Ausmaß der Transduktion in derselben Leber: Großflächig grüne Fluoreszenz (ca. 80% des Präparates) als Hinweis auf eine hochgradige Transduktion der Leber durch den adenoviralen Vektor. Zusammenfassend zeigt sich bei der Gegenüberstellung der Präparate in den Abb. 13a - 15b eine gute Korrelation zwischen dem Adenovirus-Transduktionsgrad der Leber und dem Ausmaß der Parenchymschädigung. Ergebnisse Leberparenchymschäden in Relation zur adenoviralen Transduktion der Leber 5x108 Ad-GFP Abb. 13b: Mausleber, UV-Licht, 100 x Gleiche Leber wie in Abb. 13a. Abb. 13a: Mausleber, 400 x, HE Leber nach i.v. Applikation von 5x108 PFU Adenoviren + 500 mg 5-FC/kg KG i.p. Geringe, fokal betonte Schädigung mit vermehrtem Auftreten von doppelkernigen Hepatozyten (1), zytoplasmatischen Vakuolisierungen (2) und vermehrter Basophilie (3). Bei den hellgrün fluoreszierenden Arealen handelt es sich um adenoviral transduzierte Hepatozyten. Weniger als 5% der Schnittfläche zeigt grüne Fluoreszenz. 2x108 Ad-GFP Abb. 14a: Mausleber 1, 400 x, HE Leber nach i.v. Applikation von 2x108 PFU Adenoviren + 500 mg 5-FC/kg KG i.p. Hochgradige Parenchymschädigung mit vermehrter Kernpolymorphie, Zytoplasmabasophilie (1), Zellballonierungen (2), Apoptosen (3), Karyorrhexis-Figuren (4) und fokal betonten entzündlichen Reaktionen mit Sternzellknötchen (5). Abb. 14b: Mausleber 1, UV-Licht, 100 x Gleiche Leber wie in Abb. 14a. Grüne Fluoreszenz von ca. 50% der Schnittfläche als Hinweis auf eine mittelgradige Transduktion der Leber durch adenovirale Vektoren. 2x108 Ad-GFP Abb. 15a: Mausleber 2, 400 x, HE Leber nach i.v. Applikation von 2x108 PFU Adenoviren + 500 mg 5-FC/kg KG i.p. Hochgradige Parenchymschädigung mit vermehrter Kernpolymorphie, Zytoplasmabasophilie (1), Zellballonierungen (2), Apoptosen (3), Karyorrhexis-Figuren (4) und fokal betonten entzündlichen Reaktionen mit Sternzellknötchen (5). Abb. 15b: Mausleber 2, UV-Licht, 100 x Gleiche Leber wie in Abb. 15a. Großflächig grüne Fluoreszenz von ca. 80% der Schnittfläche als Hinweis auf eine hochgradige Transduktion der Leber durch adenovirale Vektoren. Ergebnisse 3.5 Serum- und Blutwerte unbehandelter Mäuse Normalwerte bei Mäusen variieren in Abhängigkeit von Tierstamm, Blutabnahmetechnik, Messtechnik und Alter der Tiere. Für die vorliegenden Versuche und für die weiteren Projekte des Labors war es wichtig, normale Mittelwerte für den hier verwendeten Tierstamm zu ermitteln. Die unten aufgeführten Werte beruhen jeweils auf Messungen von drei Versuchstieren. Angegeben sind jeweils Mittelwert und Standardabweichung. Auf die Ermittlung von Normbereichen wurde verzichtet, da dies eine wesentlich größere Zahl an Versuchstieren erfordern würde. Zum Vergleich sind die eigenen Werte denjenigen der Firma Harlan®/Indianapolis gegenübergestellt. Ein Teil der Abweichungen beruht am ehesten auf Unterschieden in der Blutabnahmetechnik. Bedingt durch die Messmethode erfolgte in unserem Falle die Blutabnahme für die meisten Werte durch Thorakotomie (s. Tab. 2). Im Gegensatz dazu beruhen die Normalwerte der Firma Harlan®/Indianapolis ausschließlich auf Blutabnahmen über die Schwanzvene. Serum- und Blutwerte unbehandelter Nacktmäuse aus eigenen Versuchen (n=3) Normalwerte für Nacktmäuse der Firma Harlan®/ Indianapolis GPT (U/L) 24 (+/- 2,2) 44-91 AP1 (U/L) 179 (+/- 33,3) 110-137 Bilirubin1 (mg/dl) 1,93 (+/- 1,2) <0,1 Glukose1 (mg/dl) 157 (+/- 20,1) 207-248 WBC (Zellen/µl) 8 x 103 ( 1,5-4,2 x 103 Pankreatische Amylase1 (U/L) Hämoglobin (mg/dl) 3213 (+/- 626,2) nicht angegeben 14,6 (+/- 2,1) 14,9-15,2 1,9 x 103) Tab. 2: Mittelwert und Standardabweichung ( ) verschiedener Serum- und Blutparameter für thymusaplastische Nacktmäuse aus eigenen Versuchen sowie Normalwerte der Firma Harlan®/Indianapolis. 1 Serum post mortem aus dem Thoraxraum entnommen (s. Kapitel 2) Diskussion 4. Diskussion Wie in der Einleitung erwähnt, werden in der Gentherapie Vektoren viralen Ursprungs häufig eingesetzt. Hierbei spielen adenovirale Genvektoren eine wichtige Rolle, einerseits aufgrund ihrer hohen Transduktionseffizienz (7;15;78), andererseits wegen der einfachen Produktion und Anzüchtung (15;63;78;91). Beim systemischen Einsatz adenoviraler Verktoren wurde jedoch eine Vielzahl toxischer Effekte, vor allem auf die Leber, beobachtet (27; 52;56;63;67;85). Eine genaue Kenntnis der Nebenwirkungen ist deshalb sowohl für die Evaluierung gentherapeutischer Ansätze als auch für die Grundlagenwissenschaft von großer Bedeutung. Die mögliche Toxizität adenoviraler Vektoren wurde vor allem durch den Tod des 18 jährigen Jesse Gelsinger im Rahmen einer gentherapeutischen Studie in Philadelphia Ende Oktober 1999 deutlich. Ziel dieser Studie war es, mit Hilfe adenoviraler Vektoren bei Patienten mit Ornithintransaminase-Mangel (OTC-Mangel) Hepatozyten mit dem OTC-Gen zu transzudieren. Der therapeutische Vektor wurde in unterschiedlichen Konzentrationen via Vena Portae 18 ProbandInnen mit leichter Ausprägung des OTC-Mangels appliziert. Die ersten 17 Personen zeigten die nach Anwendung von Adenoviren häufig beobachteten Nebenwirkungen wie Fieber, Gliederschmerzen und allgemeines Krankheitsgefühl. Jesse Gelsinger, dem die höchste Dosis appliziert wurde (3,8x1013 Viruspartikel), starb jedoch vier Tage nach Vektorinjektion an den Folgen einer starken systemischen Immunantwort gegen virale Proteine mit daraus folgendem akuten respiratorischen Distresssyndrom (ARDS), disseminierter intravasaler Gerinnung und Multiorganversagen (71). Die vorliegende Arbeit sollte zu einem besseren Verständnis vor allem hepatozellulärer Nebenwirkungen adenoviraler Vektoren beitragen. Hierzu soll zunächst allgemein auf immunologische und histopathologische Prozesse im Rahmen viraler Hepatitiden und auf die Eigenschaften von Adenoviren und adenoviralen Vektoren eingegangen werden. Aufbauend auf diesen Ausführungen werden anschließend die eigenen Ergebnisse diskutiert. Diskussion 4.1 Immunologie viraler Hepatitiden Die immunologische Antwort auf eine Virusinfektion läßt sich vereinfacht in T-Zellantwort, Antikörper- und Interferonreaktion unterteilen: 4.1.1 Erkennung von viralen Antigenen durch T-Lymphozyten T-Lymphozyten spielen bei der Immunreaktion des Organismus auf virale Infekte eine Schlüsselrolle. Vereinfacht kann die Immunantwort auf eine virale Infektion wie folgt zusammengefaßt werden: Ein in die Zelle eingedrungenes Virus liefert Fragmente körperfremder Substanzen, die von einer Gruppe membranständiger Proteine an der Zelloberfläche (MHC-Proteine) „ präsentiert“ werden. Den Komplex aus MHC-Protein und Viruspartikel können T-Lymphozyten mit Hilfe spezifischer Rezeptoren erkennen und binden. Es finden sich allerdings nur wenige TLymphozyten, deren Rezeptor zum genannten Komplex passen. Die Bindung führt zu einer Aktivierung der T-Lymphozyten und ihrer selektiven Vermehrung (klonale Selektion). Dabei helfen verschiedene Interleukine, die von den durch die Bindung aktivierten Zellen des Immunsystems sezerniert werden. So geben aktivierte Makrophagen IL-1 ab. Zusätzlich stimulieren die T-Lymphozyten ihre eigene, klonale Vermehrung mit Hilfe von IL-2. Die durch die klonale Selektion vermehrten und aktivierten T-Lymphozyten übernehmen je nach Typ unterschiedliche Aufgaben. Zytotoxische T-Lymphozyten (CD8) sind in der Lage, körpereigene Zellen, die von Viren befallen sind und ein Virusfragment an ihrer Oberfläche präsentieren, als verändert zu erkennen und zu binden. Daraufhin geben sie Perforin ab, das die Zellmembran der gebundenen Zelle durchlässig macht und sie tötet. T-Helferzellen (CD4) dagegen binden an B-Zellen, die das Virusfragment an MHC-Protein gebunden auf ihrer Oberfläche präsentieren. Dies führt zu einer Selektion einzelner B-Zellen und ihrer massiven Vermehrung. Von Interleukin stimuliert, reifen diese B-Zellen zu Plasmazellen heran und synthetisieren und sezernieren Antikörper (47). Diskussion 4.1.2 Antivirale Wirkung von Antikörpern Antikörper können die Interaktion zwischen Virus und Zelle (Adsorption, Penetration, „ Uncoating“ und Replikation) beeinflussen. Komplement wiederum unterstützt die Virusneutralisation, indem es dieses umhüllt bzw. dessen Lipidmembran lysiert. AntigenAntikörper-Komplexe in Verbindung mit Komplement können auch virusinfizierte Zellen lysieren (76). 4.1.3 Interferon Der übergeordnete Begriff Interferon (IFN) wird für verschiedene, miteinander nicht verwandte Proteinklassen verwendet, die u.a. auch antivirale Wirkung zeigen. Interferone werden von vielen verschiedenen Zelltypen als Antwort auf virale Infektionen, doppelsträngige RNAs, Endotoxine, Mitogene und Antigene gebildet. Die antiviralen Wirkungen der Interferone basieren hauptsächlich auf folgenden drei Mechanismen (76): - Klasse I- und Klasse II-MHC-Glykoproteine werden verstärkt exprimiert, was die Erkennung viraler Antigene durch das Immunsystem begünstigt. - Zellen mit der Fähigkeit, virusinfizierte Zellen zu zerstören (natürliche Killerzellen und Makrophagen), werden aktiviert. - Und schließlich ist auch eine direkte interferonvermittelte Hemmung der viralen Replikation beobachtet worden. 4.2 Histopathologie viraler Hepatitiden Hepatitiden, verursacht durch die hepatotropen Viren A-E, sind sich im klinischen Verlauf und Morphologie sehr ähnlich. Es handelt sich um eine überwiegend vom Immunsystem gegen das Virusantigen gerichtete, deshalb lymphozyten- und histiozytenreiche Entzündung mit Parenchymnekrosen. Im weiteren Verlauf dieser Entzündungsreaktion kann es zu einer portalen Fibrose kommen, die wiederum in einer Leberzirrhose enden kann. Aus letzterem entsteht in ca. 5% der Fälle ein HCC (75). Diskussion Bei viralen Hepatitiden lassen sich je nach Schweregrad drei Verlaufsformen unterscheiden (75): 1. Akute lobuläre Hepatitis mit Einzelzellnekrosen (klassische akute Hepatitis): Hierbei sind die Portalfelder verbreitert, ödematös und dicht mit Lymphozyten infiltriert. Ferner sind Histiozyten, fokal Granulozyten und einige Plasmazellen vorhanden. Die Gallengänge sind alteriert. In späteren Stadien entsteht meist eine zarte Fibrose . Bei Übergriff der portalen Entzündung auf die periportale Grenzlamelle entstehen je nach Schweregrad der Hepatitis einzelne oder zahlreiche lytische hepatozelluläre EinzelzellNekrosen (sog. Mottenfraßnekrosen). Intralobulär zeigt sich in allen Läppchenarealen ein buntes Bild: Nebeneinander hydropisch geschwollene, azidophil geschrumpfte oder nekrotische Leberzellen mit umgebender lymphohistiozytärer Reaktion und fokaler Sternzellproliferation. Azidophile Körper (Councilmanbodies = hepatozelluläre Koagulationsnekrosen) sind in den Sinusoiden auszumachen. In späteren Phasen finden sich an Stelle der Leberzellnekrosen in den Sinusoiden Nester von mit Zeroidpigment beladenen Histiozyten. 2. Akute lobuläre Hepatitis mit Brücken-Nekrosen: Diese stellt eine schwere Verlaufsform der Hepatitis mit Ausbildung zusammenhängender Nekrosezonen zwischen mehreren Portalfeldern und Zentralvenen dar. Histologisches Bild sonst wie bei akuter lobulärer Hepatitis mit Einzelzellnekrosen. 3. Akute panlobuläre fulminante Hepatitis mit panazinären Nekrosen („ maligne Hepatitis“): Die Portalfeldzonen sind stark verbreitert, nicht oder nur gering fibrosiert. Im Grenzbereich sind teilweise deutliche Duktulusproliferationen erkennbar. Weiterhin besteht eine relativ zellarme lympho-histiozytäre Infiltration. Intralobulär ist ein ausgeprägter subtotaler Parenchymverlust sichtbar. Nur noch einzelne Leberzellinseln zeigen hochgradige Zellalterationen und die Sinusoide sind mit Zellschutt ausgefüllt. Folge einer akuten panlobulären fulminanten Hepatitis ist die Ausbildung großer Narbenfelder. Später kommt es meistens zur Ausbildung von Regeneratknoten und einer Leberzirrhose. Eine starke entzündliche Aktivität in der akuten Phase ist oft Ausdruck einer effektiven Immunantwort des Organismus auf den Virusbefall und somit prognostisch eher günstig für eine Ausheilung. Diskussion 4.3 Adenoviren und adenovirale Vektoren Adenoviren bilden die Familie Adenoviridae mit den Gattungen Mastadenovirus (Säugetiere) und Aviadenovirus (Vögel). Beim Menschen sind 51 Serotypen bekannt, die jeweils ein genus-spezifisches Antigen besitzen. Adenoviren sind von großer Bedeutung für Krankheiten verschiedener Organsysteme des Menschen (z.B. Infektionen des oberen Respirationstraktes, Pneumonien, Keratokonjunktivitiden, Gastroenteritiden u.a.). Eine Tumorigenität wurde beim Menschen nicht nachgewiesen, obwohl die Typen 12, 18 und 31 (Subgenus A) nach Injektion in neugeborene Hamster und andere Nager ein hohes onkogenes Potential besitzen (34;54). 4.3.1 Eigenschaften des Adenovirus Adenoviren sind ikosaedrische Viren von etwa 60-90 nm Durchmesser mit 252 Kapsomeren und einer doppelsträngigen linearen DNA. An den Scheitelpunkten tragen die Virionen32 antennenartige Fortsätze mit knopfartig verdickten Enden, sog. Fibern, die der Anheftung der Viren an die Wirtszelle dienen (s. Abb. 16 - 18). Da die Adenoviren keine Hüllmembran besitzen, sind sie gegen Lipidlösungsmittel stabil und weisen auch sonst eine hohe Widerstandsfähigkeit gegenüber Desinfektionsmittel auf. Die 12 Scheitelkapsomere33 am Virion werden als Pentobasis bezeichnet und bedingen die früh im Verlauf der Infektion auftretende typische Zytotoxizität (34;54). 32 Virion: Vollständiges, aus Nukleokapsid und gegebenenfalls Envelope (Virushülle) bestehendes, für die jeweilige Wirtszelle infektiöses Virus 33 Kapsomer: Untereinheit des Kapsids. Kapsid: Proteinumhüllung der Nukleinsäure eines Virions Diskussion Abb. 16: Schematische Darstellung eines Adenovirus34 Abb. 17: Elektronenmikroskopisches Bild einer Adenovirus-Ansammlung35 34 Bildquelle: Veterinärmedizinische Universität Wien; http://www.vu-wien.ac.at/i123/SPEZVIR/ ADENOGEN1.HTML 35 Bildquelle: Electron Micrograph Images; http://web.uct.ac.za/depts/mmi/stannard/adeno.html Diskussion Abb. 18: Elektronenmikroskopisches Bild zweier Adenoviren mit Fibern35 4.3.2 Pathogenese Adenoviren befallen vorwiegend Epithelzellen des Respirationstraktes, der Konjunktiva und des Dünndarms. Bei einer Virämie können aber auch andere Organe betroffen sein, so die Leber und die Nieren. Allerdings reichen die Virusmengen bei einem klassischen Infektionsweg über den Respirationstrakt und anschließende Virusabgabe in die Blutbahn in der Regel nicht aus, um klinisch manifeste Funktionseinschränkungen an Leber oder Nieren zu verursachen. Dazu bedarf es der direkten Einbringung sehr hoher Virusmengen in die Blutbahn. Insgesamt ist die Effizienz der Transduktion durch Adenoviren abhängig von der Spezies und dem jeweiligen Wirtszelltyp (91). Unter anderem durch die Beanspruchung der wirtseigenen Syntheseprozesse für die Produktion viraler Proteine kommt es nach der Transduktion zur Zelllyse (s. weiter im Text). Es wurde ferner beobachtet, daß Adenoviren imstande sind, Apoptose auszulösen (91;31). Die genaueren direkten zytotoxischen Wirkungen von Adenoviren sind noch nicht vollständig geklärt. Die Inkubationszeit bei adenoviral bedingten Erkrankungen variiert (2-15 Tage), was unter anderem auch durch die Vielzahl der Serotypen und Organmanifestationen zu erklären ist (33;54). Diskussion 4.3.3 Genomaufbau Das Genom des Adenovirus besteht aus einer linearen doppelsträngigen DNA von ungefähr 36 kbp Länge, die in 100 Kartierungseinheiten (map units) unterteilt wird. Die Termini der viralen DNA sind kovalent mit einem Protein verbunden, das als Primer während der viralen DNA-Replikation fungiert. Abb. 19: Adenovirale Genomkarte mit den frühen Regionen (E) und der gesamten späten Region34 4.3.4 Infektionsmechanismen Nach Adsorption an Wirtszell-Rezeptoren und der anschließenden Transduktion wird das Kapsid in komplexen Prozessen in Endosomen abgebaut (s. Abb. 20). Abb. 20: Schematische Darstellung der adenoviralen Transduktion34 Diskussion Die in den Zellkern gelangte DNA exprimiert „ frühe Gene“, deren Proteine in hochregulierter Weise die Expression weiterer Virusgene bedingen, was wiederum die Virus-DNAReplikation ermöglicht. Die DNA-Replikation erfolgt ca. 7 – 8 Stunden nach Infektion. Die dann stattfindende späte Replikation führt zu den Kapsidproteinen, worauf dann die Virusreifung erfolgen kann. Besonders erwähnt werden soll die Klasse der frühen E3-Proteine (E für early), die für die Virusreplikation nicht erforderlich sind, aber im infizierten Organismus immunmodulatorische Funktionen ausüben, z.B. die Reduktion des Transports von Klasse-I-MHCKomponenten (Abschwächung des Effekts von zytotoxischen T-Lymphozyten) oder die Reduktion der Ansammlung von polymorphkernigen Leukozyten in der Frühphase der Entzündung (33;54). 4.3.5 Adenovirus-Vermehrung Die Replikation der Virus-DNA, Transkription und Adenovirusreifung finden im Zellkern statt. Die mRNA wird im Zytoplasma translatiert. Es entstehen 104 - 105 neue Virionen pro Zelle. Während dieses Prozesses blockieren virale Faktoren (E1B und E4) einerseits die Synthese zellulärer Proteine durch die Repression sowohl des RNA-Transports vom Zellkern ins Zytoplasma als auch deren Translation. Andererseits verhindern sie, daß zelluläre Faktoren die Virusproduktion unterdrücken. Infolgedessen ist die Zelle schon zu Beginn der Expression der frühen adenoviralen Gene auf der Ebene des Stoffwechsels unterversorgt. Sie geht somit innerhalb 30 - 40 Stunden nach der Infektion zugrunde und setzt dann die neu synthetisierten Virionen frei (33;54). Die adenovirale Genexpression wird in sehr frühe, spätere frühe und späte eingeteilt (33;54): 1. Sehr frühe Genexpression: Das erste adenovirale Gen, das exprimiert wird, ist das E1AGen. Die Expression dieses Immediate-Early-Gene wird von zellulären Transkriptionsfaktoren gesteuert. Mehrere mRNA-Transkripte kodieren für die E1A-Proteine, die bei der Aktivierung der Transkription der späteren frühen Gene E1B, E2A, E2B, E3 und E4 eine Rolle spielen. 2. Spätere frühe Genexpression: Die E1B-, E2- und E4-Genregionen kodieren für Proteine mit essentiellen regulatorischen Funktionen. Die Expression von E1B schützt die virale und Diskussion zelluläre DNA vor dem Abbau und hemmt die zelluläre RNA-Translation, wohingegen die späte virale Genexpression durch eine Kombination der Genfunktion von E1B und E4 beschleunigt wird. Ein zweites, von der E4-Region kodiertes Protein spielt außerdem eine Rolle in der Regulation der Transkription der E2-Region. E4-Genprodukte sind darüber hinaus an der viralen Replikation und der Fertigstellung der Virionen beteiligt. Obwohl die E4-Region für mindestens sieben Genprodukte kodieren kann, sind neben den oben beschriebenen essentiellen Funktionen die Aufgaben der anderen möglichen Genprodukte noch unklar. Sie scheinen jedoch nicht essentiell zu sein, da entsprechende Deletionen sich wenig oder gar nicht auf die Wachstumsfähigkeit des Virus in vitro auswirken. Die E3-Region ist für die Infektion von Gewebekulturen nicht essentiell, in natürlich vorkommenden Isolaten jedoch immer vorhanden. Sie scheint daher eine wichtige Rolle in vivo zu haben. Die E3-Region kodiert für Proteine, die dem Virus helfen, den Abwehrmechanismen des Immunsystems zu entkommen. Die Lyse von adenovirusinfizierten Zellen durch zytotoxische T-Lymphozyten wird durch das E3-Genprodukt (Gp19KE3) blockiert. Zusätzlich spielen die E3-Proteine eine wichtige Rolle als Antagonisten der E1Avermittelten Zunahme der Empfindlichkeit von adenovirusinfizierten Zellen sowohl gegenüber dem Tumornekrosefaktor (TNF) als auch gegenüber einer Zytolyse durch aktivierte Makrophagen und natürliche Killerzellen (NK). In menschlichen Zellen besteht ein zusätzlicher Schutz gegen TNF-Zytolyse durch E1B. Der Schutzmechanismus ist in beiden Fällen noch unbekannt. Da die daran beteiligten E1B- und E3-Proteine keine gemeinsamen Eigenschaften zu haben scheinen, existieren vermutlich verschiedene Schutzmechanismen. 3. Späte Genexpression: Der starke späte (Major Late) Promotor (MLP) ist auch bereits in der frühen Phase des adenoviralen Lebenszyklus aktiv. Es entstehen jedoch ausgehend von der frühen Major-Late-Transkriptionseinheit (MLTU, Major Late Transcription Unit) durch frühzeitige Termination der Transkription in dieser Zeit nur kurze mRNA-Moleküle (L1). Zu einem späteren Zeitpunkt der Infektion wird dieser Terminationsblock aufgehoben und die späte MLTU produziert große Mengen an langen RNA-Molekülen (von ungefähr 28 kbp), die man in fünf Familien (L1-5) einteilen kann. Diese fünf mRNA-Familien kodieren fast ausschließlich für Strukturproteine, die für den Zusammenbau des Cores und des Kapsids nötig sind. Andere virale Proteine füllen diese Strukturen aus und stabilisieren sie oder sind mit der viralen DNA im Core assoziiert. Auch Proteine der späten Phase sind für den Zusammenbau und die Reifung der Virionen notwendig. Diskussion 4.3.6 Bedeutung der E1-Region des adenoviralen Genoms Die E1A-Region, welche als erstes virales Gen nach Eintritt in den Zellkern transkribiert wird, kodiert das 12S- und das 13S-Protein. Beide Proteine sind hauptverantwortlich sowohl für die Transkription aller weiteren frühen viralen Gene als auch für die Stimulation der infizierten Zelle, in die S-Phase des Zellzyklus überzugehen, so daß bei Fehlen der E1ARegion eine Virusreplikation nicht möglich ist (72). Um die Transkription der frühen viralen Gene zu initiieren, interagiert das 13S-Protein mit dem TATA-Box-Binding-Protein (TBP), welches die DNA-bindende Untereinheit des Transkriptionsfaktors IID (TFIID) darstellt. TFIID spielt eine zentrale Rolle in der Interaktion mit TATA-Box-enthaltenden Promotoren, indem er den Initiationskomplex der Synthesemaschinerie auf der Template-DNA passend positioniert (36). Desweiteren wird durch die Bindung des 13S-Proteins mit dem TBP der Komplex des zellulären Tumorsuppressorgens p53 mit TBP, welcher eine Repression transkriptioneller Vorgänge bewirkt, kompetitiv gehemmt, da die Bindungsdomänen beider Proteine auf überlappenden Einheiten positioniert sind (23). Der Transkriptionsfaktor NF-κB ist ein Schlüsselregulator in der initialen antiviralen Immunantwort, da er die Transkription von Zytokinen und Adhäsionsmolekülen initiiert und somit zu einer Reihe von proinflammatorischen Prozessen und anderen Abwehrmechanismen führt (81). Durch Bindung der E1A-Produkte an Proteine der p300/CBP-Familie wird unter anderem die IκB-Kinase, die zur Aktivierung des NF-κB entscheidend ist, inhibiert (21). Weitere Regulations- und Abwehrmechanismen der Zelle werden durch die Bindung an p300/CBP beeinflußt. Somit werden auch die Fähigkeiten des p300 zur Transkriptionsaktivierung Zellzyklus-regulierender Proteine und die Aktivierung des Transkriptionsfaktors STAT unterbunden (29). Durch virale Infekte werden Interferone der Klassen I und II induziert und binden an Rezeptoren auf der Oberfläche infizierter Zellen. Zelluläre Komplexe (Jak/STAT) werden hierauf mittels p300 aktiviert, in den Zellkern transferiert und binden dort an InterferonResponse-Elemente (ISREs), wodurch verschiedene Proteinkinasen aktiviert werden, die die intrazellulären Aktivitäten infizierender Viren bekämpfen (55). Infolge der Bindung der E1AProteine an das p300, bleibt die dadurch stark herabgesetzte Initiierung der STAT-Komplexe und somit die Aktivierung der ISREs aus und eine gewisse Refraktivität gegenüber Interferonen ist hergestellt (69;87). Die E1B-Region kodiert zwei große Proteine, E1B-19kDa und E1B-55kDa, die die E1A-induzierte Apoptose infizierter Zellen verhindern (83). Das Diskussion E1B-19kDa-Protein ähnelt in seiner Struktur dem zellulären antiapoptotischen Protein Bcl-2 und blockiert den programmierten Zelltod durch Interaktion mit Proteinen der Bax-Familie, die Apoptose und Nekrose induzieren (42). Es bindet ebenso wie Bcl-2 an Btf, einen wichtigen Transkriptionsrepressor, der dem Zelltod durch Erhöhung der Permeabilität mitochondrialer Membranen, Ausschüttung von Cytochrom C und Initiierung der CaspaseKaskade Vorschub leistet (45;89). Einen parallelen Mechanismus weist die (durch E1A-CR1) induzierte TNFα-vermittelte Apoptose auf, die durch Ausschüttung von Arachidonsäure, erhöhte Zellmembranpermeabilität und die Produktion von Prostaglandinen und Leukotrienen gekennzeichnet ist (19), wobei E1B-19kDa durch die Herabregulation der IκB-Transkription die Reaktionskaskade negativ beeinflusst (26). E1B-55kDa modifiziert die Zellzyklusprogression, indem es an das Tumorsuppressor-Protein p53 bindet, das ähnlich wie pRB sowohl das Fortschreiten von der G1- in die S-Phase als auch die virale und die zelluläre Replikation verhindert (70). E1B-55kDa kollaboriert so mit E1A-Proteinen, ruhende Zellen zu aktivieren. p53 reguliert gleichzeitig die Transkription verschiedener Gene, die in die Induktion der Apoptose involviert sind, unter anderem auch die Transkription der Vertreter der Bax-Familie (s.o.), ein Vorgang der ebenfalls durch die Bindung mit E1B-55kDa verhindert wird (50). In verschiedenen Zelllinien scheint p53 auch in die Initiierung der Apoptose durch den TNFα involviert zu sein (57), dessen Blockierung allerdings hauptsächlich auf die E3-Genprodukte zurückzuführen ist (30). Eine weitere wichtige Funktion des E1B-55kDa ist der Transport der späten viralen Transkripte, wobei es als Synergist mit dem E4-34kDa (orf6) einen Komplex bildet (90). 4.4 Adenovirale Vektoren in der Gentherapie Die in der Gentherapie verwendeten adenoviralen Vektoren vom Serotyp 2 und 5 tragen in ihrem Genom Deletionen, die zum einen ihre eigene Replikation in Wirtszellen unterbinden und zum anderen in ihrem doppelsträngigen Genom den notwendigen Platz (bis zu 7,5 kbp) für das therapeutische Gen schaffen (78). Diese Deletionen beziehen sich bei der ersten Generation adenoviraler Vektoren hauptsächlich auf die E1-Region des Genoms und bei der zweiten Generation adenoviraler Vektoren zusätzlich auf die E2a-Region (63). Die therapeutischen Gene, die in das Virus-Genom eingebaut werden, sind unter die Kontrolle viraler Promotoren gestellt (15). Die nach der Transduktion passager intranukleäre, aber extrachromosomale Persistenz der adenoviralen DNA reduziert das Risiko einer malignen Diskussion Entartung der Wirtszelle, beschränkt jedoch die Zeitdauer der Genexpression auf wenige Wochen bis Monate (82;78). Die Verwendung adenoviraler Vektoren wird durch die Immunogenität viraler Proteine eingeschränkt, die eine durch T-Lymphozyten vermittelte Immunantwort gegen das Virus und die infizierten Zellen hervorruft (82;32). Diese Immunantwort ist es auch, die eine wiederholte Infektion mit Adenoviren stark einschränkt, da eine zweite Abwehr der gleichen Infektion bei einem intakten Immunsystem um ein vielfaches stärker ausfällt (8). Weiterentwicklungen in der Vektorforschung haben zum Ziel, immer ausgedehntere Deletionen im Virus-Genom herbeizuführen, um zunehmend Raum für therapeutische Gene zu schaffen und mittels verminderter Produktion viraler Proteine eine Reduktion der Immunantwort zu erreichen (2;41;49;53). 4.5 Untersuchte Serum- und Blutparameter Eine ausführliche Beschreibung der einzelnen untersuchten Parameter und ihrer Bedeutung für unsere Experimente findet sich im Anhang (S. 60). 4.6 Eigene Ergebnisse Ziel der vorliegenden Arbeit war in erster Linie die Untersuchung hepatotoxischer Nebenwirkungen adenoviraler Genvektoren erster Generation in thymusaplastischen Nacktmäusen. Dies wurde zum einen anhand der Leberhistologie, zum anderen mittels laborchemischer Untersuchungen durchgeführt. Da Adenoviren außer der Leber auch potenziell andere Organe schädigen können, wurden zusätzlich Pankreatische Amylase sowie Kreatinin- und Harnsäurewerte zur Erfassung eventueller pankreatischer bzw. renaler Schädigungen untersucht. Im folgenden werden die histologischen und laborchemischen Resultate der Tierexperimente diskutiert. Diskussion 4.6.1 Leberhistologie 4.6.1.1 Ausmaß der Lebertransduktion Die Lebertransduktion, die wir nach systemischer Anwendung des adenoviralen Vektors beobachten konnten, erwies sich als variabel und zum Teil diskrepant zur eingesetzten Dosis. So war die Transduktionseffizienz der Leber nach Applikation von 2x108 PFU Adenoviren (≅2x109 Viruspartikel) 60 - 80%, während bei einer Dosis von 5x108 PFU (≅5x109 Viruspartikel) lediglich 5% festzustellen war (s. Abb. 13b, S. 36). Die Arbeitsgruppe Li et al. konnte eine 60% - bzw. 80%-ige Lebertransduktion mit einer Dosis von 3x109 bzw. 4,5x109 Partikel Adenoviren erreichen (bei C57B1/6-Mäusen) (53). In der gleichen Veröffentlichung wurde die Grenze einer feststellbaren Transduktion der Mausleber durch adenovirale Vektoren bei einer Dosis von ca. 1x108 Viruspartikeln gesehen (53). Die eigenen Beobachtungen sind den Daten der genannten Arbeitsgruppe in den Tab. 3 und 4 gegenübergestellt. Vektordosis (PFU) Lebertransduktion 1x106 1x107 2x108 5x108 0% 0% 60% bzw. 80% 5% PFU (≅1x107 Partikel) PFU (≅1x108Partikel) PFU (≅2x109Partikel) PFU (≅5x109Partikel) Tab. 3: Vektordosis in PFU und in Viruspartikel (i.v. Injektion) und die jeweilige Transduktion der Leber eigener Versuche. Die Transduktionseffizienz wurde anhand des Reportergens GFP ermittelt. Vektordosis (Partikelanzahl) Lebertransduktion 1x108 Partikel 5x108 Partikel 3x109 Partikel 4,5x109 Partikel 5x109 Partikel 0% 10% 60% 80% 85% Tab. 4: Vektordosis (i.v. Injektion) und die dazu ermittelten Lebertransduktionen von Li et al. (53). Die Lebertransduktion wurde anhand des Reportergens Lac-Z ermittelt. Diskussion Insgesamt zeigt sich eine recht gute Übereinstimmung. Lediglich bei 5x109 zeigt sich bei unseren Versuchen eine diskrepant niedrige Transduktion der Leber. Allerdings sei hier darauf hingewiesen, daß es sich nur um ein einziges Versuchstier handelt. Dennoch ist diese Abweichung aber beispielhaft für häufig vorkommende Diskrepanzen zwischen eingesetzter Vektordosis und resultierender Lebertransduktion wie sie uns von anderen Arbeitsgruppen berichtet und zum Teil auch veröffentlicht worden sind (91). Die möglichen Gründe sind vielfältig. Zum einen ist die Injektionstechnik über die Schwanzvene schwierig und lässt sich schwer standardisieren. Zum anderen könnte bei manchen Versuchstieren eine gewisse Immunität gegen Adenoviren aufgrund vorausgegangener Exposition bestehen, was dann eine beschleunigte Vektor-Clearance nach sich ziehen würde. Dies trifft vor allem auf immunkompetente Maus-Stämme, weniger aber auf thymusaplastische Nacktmäuse zu. Abgesehen von den erwähnten Variabilitäten des Versuchstieres bestehen solche auch beim Vektor. Hier vor allem bei der Bestimmung des Titers. Sowohl die für unsere Versuche angewandte PFU-Methode, als auch die Virusmengen-Bestimmung durch Messung der optischen Dichte sind schwankungsanfällig. Bei den jeweils parallel und doppelt durchgeführten PFU-Messungen unserer Versuche konnten wir regelmäßig Abweichungen um den Faktor 10 bei derselben Vektorpräparation beobachten. Vergleicht man auch beide Dosisfindungsmethoden miteinander, so ergeben sich ebenfalls Abweichungen bis Faktor 10 (56). Ferner ist bekannt, daß adenovirale Suspensionen äußerst empfindlich gegenüber Umwelteinflüssen (vor allem Temperatur- und pH-Veränderungen) sind. So kann sich der virale Titer allein durch ungünstige Transport- und Lagerungsverhältnisse deutlich verändern. Insgesamt führen wir die in unserem Einzelfall beobachtete Diskrepanz zwischen Vektordosis und Lebertransduktion am ehesten auf Schwankungen bei der Titerbestimmung zurück. 4.6.1.2 Lebergewebeschädigung Die histologische Untersuchung der Leber zeigte 10 Tage nach Applikation von 2x108 PFU Adenoviren deutliche Zeichen einer akuten, schweren Hepatitis und nach Applikation von 5x108 PFU Adenoviren Zeichen einer nur geringgradigen Hepatitis (s. Abb. 12 und 13a, S. 33). Das Ausmaß der Lebertransduktion betrug bei 5x108 PFU Adenoviren 5% und bei 2x108 PFU Adenoviren 60% bzw. 80%. Dies ist ein Hinweis darauf, daß das Ausmaß der Leberschädigung in erster Linie mit dem Transduktionsgrad dieses Organs korreliert und nicht mit der applizierten Vektormenge. Entsprechend fanden sich bei niedriger Verktorsosis und ohne messbare Lebertransduktion (jeweils drei Mäuse mit Applikation von 1x106 PFU Diskussion (≅1x107 Viruspartikel) bzw. 1x107 PFU (≅1x108 Viruspartikel) keine histologischen oder laborchemischen Zeichen einer Hepatitis (Labordaten nicht gezeigt, histologische Daten s. Abb. 11, S. 33) Ähnliche Beobachtungen nach Applikation adenoviraler Vektoren wurden auch von anderen Arbeitsgruppen berichtet (52;91). Obwohl hierbei andere Vektordosierungen und Versuchstiere eingesetzt wurden, sind allen Experimenten Leberparenchymschäden, die vom Grad der Lebertransduktion abhängen, gemeinsam. Zusammengefasst zeigen unsere Beobachtungen, daß das Ausmaß der Leberschädigung mit der Effizienz der Lebertransduktion korreliert. Die hepatotoxischen Effekte nach Applikation adenoviraler Genvektoren können prinzipiell folgende Ursachen haben: 1. Hepatische Schäden durch eine Immunantwort auf eine adenovirale Infektion 2. Toxische Nebenwirkungen des therapeutischen Gens (in unserem Fall GFP) 3. Toxische virale Gene bzw. Genprodukte Ad 1: Der erstgenannte Mechanismus spielt bei Experimenten mit thymusaplastischen Nacktmäusen eine untergeordnete Rolle, da zu einer kompetenten Immunantwort auf virale Infektionen T-Lymphozyten notwendig sind, die den Nacktmäusen fehlen. Die in den histologischen Schnittpräparaten der Leber beobachteten Zellen des MPS (monozytäres Phagozytensystem, bestehend aus Granulozyten, Histiozyten, Sternzellen u.a.) können im Gegensatz zu T-Lymphozyten nicht direkt zytotoxisch auf funktionsfähige virusinfizierte Zellen wirken, sondern phagozytieren lediglich vorgeschädigte bzw. apoptotische Zellen. Entsprechend wird auch in der Literatur berichtet, daß bei Versuchstieren mit intaktem Immunsystem die durch adenovirale Vektoren verursachten hepatischen Schäden deutlich stärker ausfallen als bei immuninkompetenten Nacktmäusen (91). Ad 2: Die beobachteten hepatischen Schäden können zum Teil auch durch das verwendete Markergen GFP verursacht sein. Es finden sich in der Literatur Hinweise, daß die Überexpression von GFP in vivo zytotoxisch ist (10;38). Man vermutet, daß dieser Effekt u.a. durch Überlastung der zelleigenen Proteinexpression zustande kommt. Da wir keine Kontrollversuche mit einem anderen Markergen als Vergleich vorliegen haben, können wir Diskussion nur vermuten, daß dieser Mechanismus zumindest teilweise für die beobachteten Schäden verantwortlich sein könnte. Ad 3: Wie bereits in Kapitel 4.3.7 erläutert, stellen die Wechselwirkungen zwischen viralen Proteinen und denen der Wirtszelle komplexe Vorgänge dar, die bei weitem nicht vollständig entschlüsselt sind. Drei von diesen sollen im folgenden dargestellt werden, die nach aktuellem Stand der Forschung für die zugrundeliegende Fragestellung (toxische Einflüsse viraler Gene/Genprodukte) von Bedeutung sein können: 1. Eines der Produkte der viralen E1-Region, das E1B-55kDa-Protein, inhibiert das proapoptotische Tumorsuppressorprotein p53 (54). Fehlt das E1-Gen - wie im Falle unseres Vektors - entfällt die Inhibition des p53 und die Wirtszelle kann als Reaktion auf eine Transduktion in eine apoptotische Phase übergehen und absterben. 2. Abgesehen von p53 kann eine Apoptose der Wirtszelle als Reaktion auf eine Transduktion mit Adenoviren auch durch TNFα ausgelöst werden (57). Adenovirale E3-Genprodukte können diesen Vorgang normalerweise durch Hemmung von TNFα blockieren (56). Bei fehlender E1-Region ist aber die Transkriptionsrate nachgeschalteter Genabschnitte (z.B. der E3-Region) äußerst gering, so daß diese ihre Wirkung nicht signifikant entfalten können. 3. Darüber hinaus schützt das E1B-Gen durch die genannte p53-Inhibition vor einer TNFαinduzierten Apoptose. Bei Fehlen dieses Gens entfällt dieser Schutzfaktor (33). Es sei nochmals darauf hingewiesen, daß die aktuellen Kenntnisse über adenovirale Genprodukte und ihrer Wechselwirkungen mit der Wirtszelle noch unvollständig und weitere, für die Wirtszelle negative Einflüsse durchaus denkbar sind. Da die vorliegende Arbeit auch als Vorversuch im Rahmen eines Vergleichs von CDGentherapie und konventioneller 5-FU-Chemotherapie gedacht war, wurde der toxische Effekt von 5-FC (Prodrug) und 5-FU (konventionelles Chemotherapeutikum) bei Versuchstieren untersucht. Es fanden sich keine histologischen oder laborchemischen Zeichen einer Leberschädigung (s. u.a. Abb. 9 und 10, S. 33). Diese Vorversuche lassen vermuten, daß Diskussion die konventionelle 5-FU-Chemotherapie wesentlich weniger hepatotoxisch ist als die adenovirale Gentherapie. Ebenso fanden sich keine toxischen Zeichen nach Applikation der Trägersubstanz der adenoviralen Suspensionen, PBS (s. u.a. Abb. 8, S. 33). 4.6.2 Laborchemie Zur Beurteilung der Toxizität adenoviraler Genvektoren wurden neben den erwähnten histologischen Untersuchungen auch laborchemische Analysen durchgeführt. Da auch hier die Beurteilung der Leberschädigung im Vordergrund stand, wurden im Serum GPT, AP, GGT und Bilirubin bestimmt. Zur Erfassung einer möglichen Nierenschädigung wurde zusätzlich im Serum Kreatinin und, zum Ausschluß einer möglichen Pankreasschädigung α-Amylase gemessen. Die Bestimmung der Leukozytenzahl wurde durchgeführt, um eine systemischentzündliche Reaktion zu erfassen. Ausführliche Angaben zu den gemessenen serologischen Parametern finden sich im Anhang (S. 60). 4.6.2.1 GPT (ALT) Wie in Abb. 1 dargestellt, konnten wir nach 5%iger Lebertransduktion einen geringen GPTAnstieg (ca. 0,5-fach) und nach 60-80%iger Lebertransduktion einen deutlichen GPT-Anstieg (ca. 8-fach) beobachten. Umgekehrt wurden bei Versuchen ohne nachweisbare Transduktion der Leber keine GPT-Erhöhungen verzeichnet (s. Abb. 1 und 11). Diese Beobachtungen lassen die Schlußfolgerung zu, daß parralel zur histologischen Leberschädigung auch die Serum-GPT-Werte direkt mit dem Grad der Lebertransduktion korrelieren. Die fehlende GPT-Erhöhung bei den Versuchsgruppen PBS, 5-FC und 5-FU bestätigt unsere histologische Beobachtung, daß diese Substanzen im untersuchten Dosisbereich nicht hepatotoxisch wirken. Von einer GPT-Erhöhung nach Applikation adenoviraler Vektoren wird in verschiedenen Publikationen berichtet. So stiegen die GPT-Werte bei Rhesus-Affen nach einer i.v. Applikation von 3,8x1012 Viruspartikel/kg KG auf Werte von 800 U/L (56), bei Pavianen nach i.v. Injektion von 1,2x1012 bzw. 1,2x1013 Viruspartikel/kg KG auf Werte von 107 bzw. Diskussion 1520 U/L (63) und bei C3H-Mäusen nach gleicher Applikationsart von 4x1011 Viruspartikel/kg KG auf Werte von 500 U/L (55) (s. Tab. 5). Adenovirale Dosis Maximale GPT- GPT-Normalwerte (i.v. Applikation) Werte (U/L) (U/L) 8x10 PFU/kg KG 900 2x1010 PFU/kg KG 30 9 11 200 11 2x10 PFU/kg KG 300 3x1011 PFU/kg KG 400 1x10 PFU/kg KG 11 4x10 PFU/kg KG 11 550 1,2x1012 Partikel/kg KG 100 13 1520 11 250 12 300 12 800 3,4x10 Partikel/kg KG 1,7x10 Partikel/kg KG 3,8x10 Partikel/kg KG Referenz 22 Nacktmaus eigene Versuche 20 CH3-Maus (67) 12-81 Pavian (63) 32 (+/- 13) Rhesus-Affe (56) 500 4,5x10 PFU/kg KG 1,2x10 Partikel/kg KG Tierart Tab. 5: Maximale GPT-Werte (U/L) verschiedener Experimente nach i.v. Applikation adenoviraler Genvektoren. 4.6.2.2 Alkalische Phosphatase (AP) Nach i.v. Injektion einer adenoviralen Dosis von 2x108 PFU konnten wir parallel zum berichteten GPT-Anstieg auch einen deutlichen Anstieg der AP verzeichnen. Auch dieser Parameter bestätigt damit unsere Beobachtung der Korrelation zwischen dem Transduktionsgrad und der Leberschädigung: Bei den Versuchsgruppen mit einer Dosis von 5x108, 1x106 und 1x107 PFU sind Transduktion und AP-Anstieg äußerst gering bzw. fehlen (s. Kapitel 3). In der Literatur wird über einen AP-Anstieg nach i.v. Applikation von adenoviralen Genvektoren (1,7x1012 Partikel/kg KG) bei Rhesus-Affen berichtet: Demnach steigt dieser Parameter am 15. Versuchstag auf ein Maximum von 700 U/L an (56) (s. Tab. 6). Adenovirale Dosis Maximale AP-Werte AP-Normalwerte (i.v. Applikation) Tierart Referenz (U/L) (U/L) 9 730 180 Nacktmaus eigene Versuche 10 2x10 PFU/kg KG 190 3,4x1011 Partikel/kg KG 190 110 (+/- 43) Rhesus-Affe (56) 8x10 PFU/kg KG 12 700 12 1000 1,7x10 Partikel/kg KG 3,8x10 Partikel/kg KG Tab. 6: Maximale AP-Werte (U/L) nach i.v. Applikation adenoviraler Genvektoren. Diskussion 4.6.2.3 Bilirubin und Glukose Bei keiner unserer Versuchsgruppen konnte eine signifikante Änderung der Bilirubin- und Glukose-Werte gegenüber der Kontrollgruppe festgestellt werden. Dies weist darauf hin, daß die histologisch und laborchemisch beobachtete Leberschädigung noch keine schwere Funktionsstörung dieses Organs zur Folge hatte. Bilirubinerhöhungen nach Applikation adenoviraler Vektoren sind zuvor beobachtet worden (s. Tab. 7). So wurde z.B. von einem Anstieg auf maximale Werte von 5 mg/dl nach Applikation von 3,8x1012 Viruspartikel/kg KG an Rhesus-Affen berichtet, während niedrigere Dosen zu keinem Anstieg führten (56). Ähnliches wird auch von Morral et al. Berichtet (63). Jedoch wurden diese Beobachtungen bei immunkompetenten Versuchstieren gemacht, bei denen aufgrund der zusätzlichen Immunreaktion eine stärkere Leberschädigung zu erwarten ist. Es wird somit deutlich, daß für einen signifikanten Bilirubin-Anstieg eher hohe Vektormengen und ein intaktes Immunsystem notwendig sind. Adenovirale Dosis Maximale Bilirubin- Bilirubin-Normal- (i.v. Applikation) Werte (mg/dl) werte (mg/dl) 8x109 PFU/kg KG 2,0 10 2x10 PFU/kg KG 12 Referenz 3,8 Nacktmaus eigene Versuche 0,3-0,7 Pavian (63) 0,3 (+/- 0,1) Rhesus-Affe (56) 1,5 1,2x10 Partikel/kg KG 0,2 1,2x1013 Partikel/kg KG 0,9 11 <1 12 1,7x10 Partikel/kg KG <1 3,8x1012 Partikel/kg KG 5,2 3,4x10 Partikel/kg KG Tierart Tab. 7: Maximale Bilirubin-Werte (mg/dl) verschiedener Experimente nach i.v. Applikation adenoviraler Genvektoren. 4.6.2.4 α-Amylase (Pankreatische Amylase) Wir konnten in keiner Versuchsgruppe einen Anstieg dieses Enzyms registrieren (s. Abb. 6, S. 30), was somit eine Pankreasschädigung applizierter Substanzen in der angewandten Dosierung ausschließt. In früheren Studien berichten einige Arbeitsgruppen über keine Pankreasschädigungen, andere über Pankreatitis nach Applikation adenoviraler Genvektoren (28;62;68). Diskussion 4.6.2.5 Leukozyten Nach Applikation von 2x108 und 5x108 Adenoviren wurde ein signifikanter Anstieg der Gesamtleukozytenzahl gegenüber der Kontrolle beobachtet (Abb.14). Diese Leukozytose ist als systemische Entzündungsreaktion zu deuten und korreliert ebenfalls wie die anderen gemessenen Toxizitätsmarker mit der adenoviralen Lebertransduktion und weniger mit der applizierten Dosis. Ein Anstieg konnte ansonsten bei keiner anderen Versuchsgruppe festgestellt werden. 4.6.2.6 Andere Parameter GGT, Kreatinin und Harnsäure konnten mit unserer Methodik nicht bestimmt werden, da der jeweils untere Grenzwert für eine Messung nicht erreicht wurde (Daten nicht gezeigt). Dies liegt mit hoher Wahrscheinlichkeit daran, daß die Proben aufgrund ihrer geringen Menge stark vorverdünnt werden mußten (1:8 bis 1:15). Zusammenfassung 5. Zusammenfassung Unsere Experimente demonstrierten deutliche hepatotoxische Wirkungen adenoviraler Vektoren erster Generation. Genannte Wirkungen korrelieren viel weniger mit der applizierten Menge an Vektoren als mit dem Transduktionsgrad der Leber und damit der Vektoremenge, die in Hepatozyten eindringt. Es zeigte sich ferner durch die Auswahl geeigneter Versuchstiere, daß Leberparenchymschäden eher auf eine direkte hepatozelluläre Schädigung durch adenovirale Vektoren als auf eine indirekte immunvermittelte Schädigung zurückzuführen sind. Es kann vermutet werden, daß bei einem intakten Immunsystem die durch adenovirale Vektoren verursachten Schäden am Wirtsorganismus deutlich stärker ausfallen würden, als bei den von uns untersuchten immuninkompetenten Nacktmäusen. Dies ist durch Tierexperimente bereits gezeigt worden (63). Wir fanden keine Hinweise darauf, daß 5-FC oder 5-FU in den untersuchten Dosierungen hepatotoxische Wirkungen besitzen. Anhand dieser Vorversuche zeigt sich, daß – vor allem in Bezug auf die Leber – eine konventionelle Chemotherapie mit 5-FU weitaus weniger akute Toxizität verursacht als eine adenovirale Gentherapie. Hinweise auf eine Schädigung von Pankreas und Niere durch adenovirale Vektoren ergaben sich für die eingesetzten Dosierungen nicht. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen einen wesentlichen Nachteil der aktuellen adenoviralen Gentherapie. Einerseits ist eine hohe Transduktion des Zielorgans für eine erfolgreiche Therapie notwendig bzw. erwünscht, andererseits korreliert das Ausmaß der Transduktion mit der Organschädigung. Ein durch die Arbeitsgruppe O´Neal et al. durchgeführter Toxizitätsvergleich zwischen adenoviralen Genvektoren erster und zweiter Generation erbrachte keine signifikanten Unterschiede (67). Die gewonnenen Erkenntnisse zeigen die Risiken von Therapieversuchen mit intravasal applizierten adenoviralen Vektoren beim Menschen, vor allem, wenn Leberfunktionseinschränkungen bereits vorhanden sind und verdeutlichen die Notwendigkeit der Entwicklung neuer, in Bezug auf ihre Toxizität verbesserter Genvektoren. Anhang 6. Anhang 6.1 Definition untersuchter Serum- und Blutparameter36: 6.1.1 Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT) = Alanin-Aminotransferase (ALT) Dieses Enzym kann als ein leberspezifisches Enzym betrachtet werden und liegt im Zytoplasma der Hepatozyten in gelöster Form vor. Es ist somit geeignet als Suchenzym zur Erkennung von Lebererkrankungen. Es zählt neben Glutamat-Oxalacetat-Transaminase zu den sogenannten Transaminasen. Die Aufgabe von GPT besteht in der Übertragung der NH2Gruppe von Aminosäuren auf Ketosäuren. Bei der akuten Virushepatitis sind im Wesentlichen alle Zellen eines Leberläppchens befallen. Es liegt eine Schwellung der Hepatozyten mit einer Permeabilitätsstörung der Zellmembran vor. Auf diese Weise kann GPT in das Serum gelangen. Die Höhe der in das Serum übertretenden Enzymaktivitäten korreliert mit der Menge des geschädigten Parenchyms (Ausnahme: chronische Hepatitis, bei der keine Korrelation zwischen Höhe der GPT und der Aktivität des entzündlichen Geschehens vorhanden ist). Die Plasma-Halbwertszeit der GPT beträgt 47 Stunden. 6.1.2 Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) = Aspartat-Aminotransferase (AST) GOT kommt in der Leber, im Herzmuskel- und im Skelettmuskelgewebe vor. Eine Erhöhung dieses Enzyms kann somit potenziell auf eine Schädigung aller drei Gewebearten hinweisen. GOT kommt zu 30% im Zytoplasma gelöst und zu 70% an mitochondriale Strukturen gebunden vor. Die Funktion und die Pathophysiologie entspricht der von GPT. Die PlasmaHalbwertszeit beträgt 17 Stunden. Bei einer akuten Virushepatitis ist der GOT/GPT-Quotient normalerweise < 1,0. Stärkere Leberschädigung verursacht einen vermehrten Übertritt der Transaminasen, insbesondere der mitochondrialen GOT in das Plasma. Ein GOT/GPT-Quotient > 1,0 ist Indikator eines solchen Geschehens und zeigt den Untergang von Hepatozyten an. 36 Alle Angaben aus: „Labor und Diagnose“, 5.Auflage 1998, TH-Books-Verlag Anhang 6.1.3 Alkalische Phosphatase (AP) Die im Serum/Plasma meßbare Gesamtaktivität der AP ist die Summe der Aktivitäten multipler Enzymformen, die verschiedenen Geweben entstammen. Es existieren folgende Isoenzyme: Leber-, Nieren- und Knochen-AP. Bekannt sind ferner das intestinale, das plazentare und das Keimzell-Gen der AP, die jeweils für spezifische Isoenzyme kodieren. Die AP ist bei ca. 60% der Leber- und Gallenwegserkrankungen pathologisch erhöht. Differentialdiagnostische Bedeutung hat sie im Muster mit ALT, AST und GGT zur Erkennung cholestatischer Zustände. In Relation zur Aktivität der Transaminasen ist die AP erhöht bei Cholestase und normal bei fehlender cholestatischer Komponente. Die AP wird in der Leber in Hepatozyten gebildet. Bei hepatobiliären Erkrankungen kommt es zu einer Zunahme der AP-Synthese. Es wird dabei vermehrt AP auf der Zellmembran verankert. Durch Phospholipase-D des Plasmas wird diese abgelöst, und es resultiert eine Erhöhung der Leber-AP im Plasma. Bei Cholestase wird die in den Gallenwegen zellmembran-gebundene AP nicht von Phospholipase-D des Plasmas abgelöst, da die Galle dieses Enzym nicht enthält. Es kommt vielmehr zu einer Ablösung der AP als höhermolekularer Komplex. Unter cholestatischen Bedingungen passiert die AP die „tight junctions“ und gelangt ins Plasma. Dort wird sie, typisch für eine Cholestase, als höhermolekulare AP nachgewiesen. Die Aktivität der AP ist bei Raumtemperatur nach 3 Tagen um 3% vermindert, bei 4°C ist keine Aktivitätsabnahme innerhalb einer Woche nachzuweisen. 6.1.4 Gamma-Glutamyl-Transferase (GGT) Die GGT ist ein größtenteils membrangebundenes Enzym und befindet sich vor allem in der Leber, in den Epithelien der intrahepatischen Gallengänge sowie in Nieren, Pankreas, Milz und Dünndarm. Die im Serum meßbare GGT stammt größtenteils aus der Leber und ist teils an HDL-Cholesterin gebunden und teils frei im Plasma gelöst. Die Plasma-Halbwertszeit der ersten Form beträgt 20 Stunden, die der zweiten 9 Stunden. Messindikation stellen vor allem Leber- und Gallenwegserkrankungen dar, wobei GGT im Falle einer Cholestase sensitiver als die AP ist. Anhang 6.1.5 Bilirubin Das Gesamtbilirubin (bestehend aus dem direkten, dem indirekten und dem Delta-Bilirubin) wird zur Differentialdiagnose und der Verlaufsbeurteilung des Ikterus gemessen. Unkonjugiertes Bilirubin wird in Hepatozyten in direktes Bilirubin umgewandelt und Letzteres wiederum in die Galle sezerniert. 80% des täglich gebildeten Bilirubins entstehen aus dem Hämoglobinabbau überalterter Erythrozyten. Einteilung der Hyperbilirubinämien: a) Prähepatischer Ikterus: Entsteht durch ein vermehrtes Bilirubinangebot, z.B. bei Hämolysen. b) Intrahepatischer Ikterus: Entstehung meistens aufgrund von hepatischen Schädigungen oder bei Bilirubin-Stoffwechselstörungen. Bei dieser Variante liegen neben einer Erhöhung aller drei Bilirubin-Fraktionen zusätzlich erhöhte Transaminasen (GOT und GPT) vor. c) Posthepatischer Ikterus: Entsteht aufgrund eines mechanischen Verschlusses der Gallenwege. 6.1.6 Glukose Die intraindividuellen Schwankungen der Blutzuckerkonzentration sind aufgrund der Abhängigkeit von der Muskelarbeit und dem zeitlichen Abstand von der Nahrungsaufnahme größer als bei anderen Blutparametern. Bei der Interpretation der Werte sollte eine Standardisierung der Probenentnahmen erfolgen. Diese beinhaltet das Untersuchungsmaterial (arterielles oder venöses Vollblut, Plasma oder Serum) und den Zeitpunkt der Entnahme in Relation zur Nahrungsaufnahme. Da diese Standardisierung bei unseren Tierexperimenten nicht möglich war, wurde die Alternative der zufälligen Nicht-Nüchternentnahme von venösem Vollblut gewählt. Den Blutzucker-Messungen im Rahmen unserer Experimente liegt folgende Überlegung zugrunde: Bei einer deutlich ausgeprägten Schädigung der Leber würde die Glukoneogenese-Leistung dieses Organs reduziert und somit der Blutzuckerwert abfallen. Anhang 6.1.7 α-Amylase (Pankreatische Amylase) α-Amylase wird im sekretorischen Epithel des Pankreas und der Mundspeicheldrüsen synthetisiert. Beim Gesunden werden 99% dieses Enzyms in den Gastrointestinaltrakt abgegeben, während Abflußstörungen oder Schädigungen des synthetisierenden Organs zu einer vermehrten Abgabe der α-Amylase in den Kreislauf führen. Messindikation dieses Enzyms ist hauptsächlich der Nachweis einer Pankreasschädigung. α-Amylase, die zu 100% glomerulär filtriert wird, wird zu 50% tubulär rückresorbiert. Die Plasma-Halbwertszeit ist daher abhängig von der Nierenfunktion und beträgt beim Gesunden 9 - 18 Stunden. Die Aktivität im Serum weist ein typisches Altersprofil bei hohen individuellen Abweichungen aus: Neugeborene besitzen nur Speichelamylase mit 25-50% der endgültigen Konzentration, die nach 12 Monaten auftritt. Pankreasamylase erscheint erst nach 1-2 Monaten. Ihre Konzentration steigt kontinuierlich und erreicht den Referenzbereich Erwachsener im 5. Lebensjahr. 6.1.8 Weiße Blutkörperchen (WBC) = Leukozyten Indikationen zur Messung der Leukozytenzahl bestehen u.a. bei Verdacht auf Infektionen, Entzündungen, Intoxikationen und Gewebenekrosen. Zuverlässige Werte werden im EDTABlut entnommen (s. Material und Methoden). In diesem sind die Leukozyten bei Raumtemperatur bis zu 24 Stunden und bei 4°C bis zu 48 Stunden stabil. 6.1.9 Harnsäure Sie ist das Produkt des menschlichen Purinstoffwechsels, wird glomerulär filtriert und zu 90% von den Nierentubuli rückresorbiert. Der Harnsäurespiegel ist stark von Alter, Ernährungsgewohnheiten und Nierenfunktion abhängig. Im Falle einer Nierenschädigung werden erhöhte Werte erwartet werden. Anhang 6.1.10 Kreatinin Es ist ein Endprodukt des Muskelproteinstoffwechsels, gelangt ins Plasma und wird durch glomeruläre Filtration über die Nieren ausgeschieden. Der Serumkreatininwert steht somit in direkter Relation zur Höhe des Glomerulumfiltrates (GFR) und ist ein Indikator zur Abschätzung der Nierenfunktion. Hierbei ist jedoch zu berücksichtigen, daß der Kreatininwert in der Regel erst ab einer Verminderung der GFR um mehr als 50% pathologisch wird. Literaturverzeichnis Literatur 1. Alexandroff AB, McIntyre CA, Porter JC, Zeuthen J, Vile RG, Taub DD (1998) Sticky and smelly issues: lessons on tumour cell and leucocyte trafficking, gene and immunotherapy of cancer. Br. J. Cancer; 77: 1806-11. 2. Amalfitano A, Hauser MA, Hu H, Serra D, Begy CR, Chamberlain JS (1998) Production and characterization of improved adenovirus vectors with the E1, E2b, and E3 genes deleted. J. Virol.; 72: 926-33. 3. Arya SK, Zamani M, Kundra P (1998) Human immunodeficiency virus type 2 lentivirus vectors for gene transfer: expression and potential for helper virus-free packaging. Hum. Gene Ther.; 9: 1371-80. 4. Bailar JC, III, Gornik HL (1997) Cancer undefeated. 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