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Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene
der Medizinischen Universität zu Lübeck
Direktor: Prof. Dr. med. W. Solbach
Die Interaktion von Granulozyten mit
intrazellulären Krankheitserregern am Beispiel
der Infektion mit Leishmania major
Inauguraldissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Universität zu Lübeck
– Aus der Medizinischen Fakultät –
vorgelegt von
Helmut Laufs
aus Göttingen
Lübeck 2001
1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. W. Solbach
2. Berichterstatter/in: ....................................................................................................................................................................
Tag der mündlichen Prüfung: ...................................................................................................................................................
Zum Druck genehmigt, Lübeck, den ..................................................................................................................................
gez. der Dekan der medizinischen Fakultät,....…………………………………………………………………….......
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
0
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ............................................................................................. 4
1
EINLEITUNG ............................................................................................................................ 6
1.1
LEISHMANIA MAJOR ................................................................................................................................ 7
1.2
NEUTROPHILE GRANULOZYTEN .......................................................................................................... 10
1.3
GRANULOZYTEN UND LEISHMANIA MAJOR .......................................................................................... 19
1.4
FRAGESTELLUNG .................................................................................................................................. 21
2
MATERIAL.............................................................................................................................. 22
2.1
GERÄTE................................................................................................................................................. 22
2.2
LABORBEDARF ...................................................................................................................................... 23
2.3
ZELLKULTURMEDIEN UND –ZUSÄTZE .................................................................................................. 24
2.4
IMMUNOLOGISCHE REAGENZIEN ........................................................................................................ 25
2.5
REAGENZIEN FÜR MOLEKULARBIOLOGISCHES ARBEITEN ................................................................. 25
2.6
TESTKITS .............................................................................................................................................. 25
2.7
CHEMIKALIEN UND SONSTIGE REAGENZIEN ....................................................................................... 26
2.8
SOFTWARE ............................................................................................................................................ 26
3
METHODEN............................................................................................................................ 28
3.1
PARASITEN ............................................................................................................................................ 28
3.2
HUMANE ZELLEN ................................................................................................................................. 29
3.3
ZELLKULTURMEDIEN UND KULTURBEDINGUNGEN ............................................................................ 31
3.4
DURCHFLUßZYTOMETRIE: OBERFLÄCHENFÄRBUNG (CD66b, CD63, CD62-L) .............................. 33
3.5
BESTIMMUNG DER INTRAZELLULÄREN SAUERSTOFFRADIKALPRODUKTION .................................... 34
3.6
BESTIMMUNG DER VITALITÄT INTRAZELLULÄRER LEISHMANIA MAJOR ........................................... 34
3.7
ELISA................................................................................................................................................... 36
3.8
RNASE PROTECTION ASSAY (RPA)..................................................................................................... 37
4
ERGEBNISSE .......................................................................................................................... 40
4.1
DIE INTERAKTION NEUTROPHILER GRANULOZYTEN MIT LEISHMANIA MAJOR IN VITRO ................ 40
4.2
DER EINFLUß DER LEISHMANIEN AUF DIE ZYTOKINSEKRETION DURCH GRANULOZYTEN ............. 51
5
DISKUSSION ........................................................................................................................... 57
6
ZUSAMMENFASSUNG ......................................................................................................... 69
7
LITERATURVERZEICHNIS ................................................................................................ 71
8
EIGENE VERÖFFENTLICHUNGEN.................................................................................. 82
9
DANKSAGUNG....................................................................................................................... 83
10 STICHWORTVERZEICHNIS............................................................................................... 84
11 LEBENSLAUF ......................................................................................................................... 86
12 DOKTORARBEIT ALS ONLINE-MATERIAL AUF CD.................................................. 87
3
Abkürzungsverzeichnis
0 Abkürzungsverzeichnis
Folgende Abkürzungen wurden in dieser Arbeit verwendet:
32
P
Ak
APP
Arg
Asp
bp
BSA
CD
cDNA
CGD
Ci
CL
CR
CSF
ddH2O
DNA
DNS
E. coli
ELISA
eNOS
FACS
FCS
FITC
FL
fMLP
FSC
Gly
GlyCAM-1
gp63
GTP
h
HEPES
HGE
HLA
HSA
i.v.
IFN
Ig
IL
IL-1ra
iNOS
L.
LD
LPG
mAk
MAC
MASP
Phosphor-32
Antikörper
Akute-Phase-Proteine
Arginin
Aspartat
Basenpaare (base pairs)
Rinderserumalbumin (bovine serum albumin)
Differenzierungsmarker (cluster of differentiation)
komplementäre (complementary) Desoxyribonukleinsäure
chronische Granulomatose (chronic granulomatous disease)
Curie
kutane Leishmaniose (cutaneous leishmaniasis)
Komplementrezeptor (complement receptor)
koloniestimulierender Faktor (colony stimulating factor)
doppelt demineralisiertes Wasser
Desoxyribonukleinsäure (desoxy-ribonuclein acid)
Desoxyribonukleinsäure
Escherichia coli
heterogener Enzym-Immuntest (enzyme-linked immuno sorbent assay)
endotheliale Stickoxidsynthase
Durchflußzytometrie (fluorescence activated cell sorting)
Fetales Kälberserum (fetal calf serum)
Fluoresceinisothiocyanat
Fluoreszenz
Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanin ( f-Met-Leu-Phe)
forward scatter
Glyzin
glykosilierungsabhängiges Zelladhäsionsmolekül 1
Glykoprotein 63
Guanosintriphosphat
Stunde(n) (hora)
N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure
Humane Granulozytäre Ehrlichiose
Humanes Leukozytenantigen (human leukocyte antigen)
Humanes Serumalbumin
intravenous (intra venam)
Interferon
Immunglobulin
Interleukin
IL-1-Rezeptorantagonist
induzierbare Stickoxid-Synthase
Leishmania
Verdünnungskulturverfahren (limiting dilution)
Lipophosphoglykan
Monoklonaler Antikörper (monoclonal antibody)
Membranattackierender Komplex (membrane attacking complex)
Mannanbindendes Lektin Assoziierte Serinproteasen (Mannan-Binding
4
Abkürzungsverzeichnis
Lectin Associated Serine Proteases)
MBL
Mannanbindendes Lektin (mannan-binding lectin)
MHC
Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex)
min
Minute(n) (minuta)
MIP
inflammatorisches Makrophagenprotein (macrophage inflammatory
protein)
MPO
Myeloperoxidase
mRNA
Boten-Ribonukleinsäure (messenger RNA)
MUL
Medizinische Universität zu Lübeck
NADH
Nikotinamidadenindinukleotid
NADPH
Nikotinamidadenindinukleotidphosphat
NK-Zelle
Natürliche Killerzelle
NNN
Novy-Nicolle-MacNeal
NOS
Stickoxid-Synthase (NO-Synthase)
O.D.
optische Dichte (optical density)
PBMC
mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (peripheral blood mononuclear
cells)
PBS
Phosphatgepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline)
PE
Phycoerythrin
PMA
Phorbol-12-myristyl-13-azetat
Granulozyten Polymorphonukleäre Zelle
PP
Polypropylen
RNA
Ribonukleinsäure (ribonuclein acid)
RNase
Ribonuklease
RNI
Reaktive Stickstoffintermediate (reactive nitrogen intermediates)
ROI
Reaktive Sauerstoffintermediate (reactive oxygen intermediates)
RPMI
Kulturmedium (Roswell Park Memorial Institute Medium)
s.c.
subkutan (subcutaneus)
Sgp 200
sulfatiertes Glykoprotein p200
SSC
sideward scatter
TBE
Tris-Borat-Puffer
TNF
Tumornekrosefaktor
-1
Umin
Umdrehungen pro Minute
UTP
Uridintriphosphat
VL
viszerale Leishmaniose (visceral leishmaniasis)
5
Einleitung
6
1 Einleitung
Leishmania major (L. major) ist ein obligat intrazellulärer Parasit, der nach Infektion des
Menschen phagozytiert wird und sich in Makrophagen vermehrt. Klinisch zeigen sich
unterschiedliche Verlaufsformen der Infektion. Auf der einen Seite kommt es zu einer
lokalisierten kutanen Infektion, die spontan abheilt („Orientbeule“); je nach Infektionsdosis
und –ort, infektiöser Leishmanienspezies und der Immunantwort kann der Erreger jedoch
auch eine unbehandelt tödliche systemische Infektion („Kala-Azar“) hervorrufen (Magill,
Grogl et al. 1993). Für die Analyse der zugrundeliegenden Mechanismen ist ein
Infektionsmodell in der Maus etabliert: Die Infektion von Inzuchtmäusen mit L. major
führt zu einer Erkrankung, die bei manchen Stämmen nach einigen Wochen ausheilt, bei
anderen dagegen letal verläuft. Ursache dafür ist die Ausprägung verschiedener
Immunantworten. Bei resistenten Tieren entwickelt sich eine zelluläre Immunreaktion vom
T-Helfer-1-Typ (TH1-Typ), während bei suszeptiblen Tieren eine TH2-Zellantwort
dominiert. Zur Erklärung soll an dieser Stelle angedeutet werden, daß anhand des
Leishmanieninfektionsmodells ein Konzept entwickelt wurde, gemäß dem sich naive THelferlymphozyten nach Antigenerkennung entweder zu TH1- oder zu TH2-Zellen
differenzieren. Diese unterscheiden sich im Wesentlichen durch ihre Fähigkeit,
unterschiedliche Zytokine zu produzieren. Th1-Zellen produzieren u.a. IL-2 und IFN-γ,
während TH2-Zellen IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 und IL-13 sezernieren (Solbach und Laskay
2000).
Eine Reihe von Untersuchungen belegen, daß die Entwicklung einer TH1- bzw. TH2Antwort bereits einige Stunden bis Tage nach der Infektion beginnt (Solbach, Lohoff et al.
1987; Firestein, Roeder et al. 1989; Gajewski, Joyce et al. 1989; Scharton und Scott 1993;
Reiner und Locksley 1995). Ferner ist bekannt, daß die Begrenzung der Parasiten am
Infektionsort mit einer TH1-Antwort korreliert (Laskay, Diefenbach et al. 1995). Das
bedeutet, daß die Auseinandersetzung des Immunsystems mit dem Krankheitserreger
erstens in den frühen Stunden und zweitens am Ort der Infektion die Ausbildung der
Immunantwort entscheidend beeinflußt. Analysen des Zellinfiltrats am Ort der Läsion
zeigen, daß 10 Stunden nach Infektion über 95% der Zellen Granulozyten sind und
Makrophagen dagegen erst 24 bis 48 Stunden später einwandern (Müller, van Zandbergen
Einleitung
7
et al. 2001). Somit sind Granulozyten noch vor den Makrophagen diejenigen Zellen,
welche früh am Ort der Infektion mit L. major interagieren können.
Obwohl die Rolle von neutrophilen Granulozyten in der Abwehr extrazellulärer
Eitererreger gut untersucht ist, bleibt ihre Funktion in der frühen Abwehr intrazellulärer
Pathogene wie L. major unklar. Deshalb werden in dieser Arbeit die Wechselwirkungen
von L. major und Granulozyten untersucht.
1.1
Leishmania major
1.1.1 Taxonomie
Leishmanien gehören zur Familie der Trypanosomatiden (Abbildung 1). Innerhalb des
Genus sind über 13 humanpathogene Spezies bekannt. Die taxonomische Einordnung
geschieht mit Hilfe struktureller und biochemischer Merkmale. Die Nomenklatur ist
derzeit aufgrund von Genomanalyse im Fluß.
Subregnum:
Protozoen
Klasse
Flagellata
Ordnung
Kinetoplastida
Familie
Trypanosomatidae
Leishmania tropica
Leishmania major
Leishmania mexicana
Genus
Leishmania
Genus
Trypanosoma
Genus
andere
Leishmania braziliensis
Leishmania donovani
andere
Abbildung 1: Taxonomie und Stammbaum der Leishmania spezies.
1.1.2 Lebenszyklus
L. major ist ein einzelliger Parasit, der sich durch binäre Teilung vermehrt. Als Wirt dient
dem Protozoon ein weites Spektrum von Vertebraten, darunter Nager, Haus- und Nutztiere
(Hunde, Rinder) sowie der Mensch. Die Erreger werden durch Sandmücken übertragen
(Phlebotomus spp., Lutzomyia spp., Psachodopygus spp.). Als Trypanosomatiden
Einleitung
8
unterliegen Leishmanien einem Dimorphismus: im Wirt und im Vektor durchlaufen sie
jeweils einen Entwicklungszyklus und liegen in der Sandmücke als Promastigote vor
(Abbildung 2, c). In dieser Form sind sie in vitro kultivierbar. Promastigote liegen
extrazellulär vor, sind 3 bis 6 µm breit, 10 bis 15 µm lang, tragen ein anteriores Flagellum
und sind somit aktiv beweglich. Im Wirbeltier befallen sie Zellen des retikuloendothelialen
Systems (Makrophagen) und wandeln sich intrazellulär zu Amastigoten um (Abbildung 2,
d). Amastigote liegen primär intrazellulär vor, sind ovoid geformt mit einem Durchmesser
von 2 bis 5 µm, tragen kein Flagellum und sind unbeweglich (Turco und Descoteaux
1992).
Durch die Blutmahlzeit der Sandmücke bei einem infizierten Wirt gelangt L. major in
deren Darm (Abbildung 2, e). Die Amastigoten kommen aus den Zellen frei und
entwickeln sich zu Promastigoten (Metazyklogenese). An ihrer Oberfläche synthetisieren
sie eine dichte Glykokalix, deren Hauptbestandteil das Lipophosphoglykan (LPG) ist. LPG
Abbildung 2: Lebenszyklus der Leishmanien. Erläuterung im Text.
Einleitung
9
ist ein Polymer aus Poly-Disaccharid-Phosphaten und vermittelt die Haftung des Parasiten
am Mitteldarm des Vektors (McConville und Ralton 1997; Beverley und Turco 1998).
Nach vier- bis siebentägiger Vermehrung kommt es durch Modifikation des LPG zum
Haftungsverlust. Die infektiösen, metazyklischen, Promastigoten wandern in den Pharynx
ihres Vektors aus und werden bei der nächsten Blutmahlzeit zusammen mit dem Speichel
des Insekts in den Endwirt übertragen (Abbildung 2, f, S. 8). Die Infektiosität der
Promastigoten wird durch Speichelbestandteile gesteigert (Valenzuela, Belkaid et al.
2001). An der Einstichstelle sind die Promastigoten zunächst toxischen Serumbestandteilen
ausgesetzt, darunter Komplementfaktoren, die den Großteil (~ 90 %) der übertragenen
Parasiten vernichten (Sacks und Perkins 1984). Auf der anderen Seite vermitteln
Komplementfaktoren gleichzeitig die schnelle Aufnahme der Parasiten in die Zielzelle, wo
diese vor toxischen Serumbestandteilen geschützt sind (Brittingham, Morrison et al. 1995;
Mosser und Brittingham 1997). Unter physiologischen Bedingungen sind bei
Makrophagen die komplementvermittelten Aufnahmemechanismen die bedeutsamsten
(Sutterwala, Rosenthal et al. 1996). In der Literatur sind für Makrophagen darüber hinaus
Aufnahmewege von L. major beschrieben, die von LPG (Talamas-Rohana, Wright et al.
1990), dem Rezeptor für das C-reaktive Protein oder über den Mannose-Fucose-Rezeptor
(Bogdan und Röllinghoff 1998) vermittelt werden.
1.1.3 Epidemiologie, Krankheitsformen, Diagnostik und Therapie der
Leishmaniosen
Die Art und Schwere der Erkrankung nach einer Leishmanieninfektion hängt sowohl von
der Erregerspezies als auch vom Immunstatus des Infizierten ab. Die Symptomatik reicht
von lokal begrenzten, spontan ausheilenden Hautulzerationen (kutane Leishmaniose, CL,
„Orientbeule“) bis hin zu einer schwersten, lebensbedrohlichen Systemerkrankung
(viszerale Leishmaniose, VL, „Kala-Azar“) (Pearson und Sousa 1996). Üblicherweise führt
zum Beispiel die Infektion mit L. donovani beim Menschen zu VL, die Infektion mit L.
major oder L. tropica zu CL. Andererseits kann L. infantum beide Leishmanioseformen
hervorrufen, und für L. tropica wurde bei infizierten Veteranen des Golfkriegs (Operation
Desert Storm) erstmals auch ein viszerotroper Verlauf beschrieben (Magill, Grogl et al.
1993).
Einleitung
10
Gemäß den Daten der WHO von 1998 sind 12 Millionen, vor allem junge Menschen in 88
Ländern auf allen Kontinenten außer Australien von Leishmaniosen betroffen. 350
Millionen sind dem Erreger exponiert, und es kommt zu mindestens 2 Millionen
Neuerkrankungen jährlich. Dreiviertel der Länder mit endemischer Leishmaniose gehören
zur Gruppe der Entwicklungsländer, wo es zu tödlichen Epidemien kommen kann. In
unseren Breiten machen die Leishmaniosen eher selten von sich reden, obwohl sie in den
benachbarten Mittelmeerstaaten, u.a. in Italien und auf Mallorca, verbreitet sind und
zahlenmäßig zunehmen. Durch das Fortschreiten der AIDS-Pandemie sind in den letzten
Jahren Leishmaniosen vermehrt bei HIV-Infizierten aufgetreten, so daß in Südeuropa 25%
bis 70% der erwachsenen VL-Patienten HIV-positiv sind und 1,5% bis 9,5% der AIDSErkrankten unter VL leiden (Solbach und Laskay 2000). In Deutschland werden 200
importierte Leishmaniosefälle pro Jahr geschätzt (Wichert 2001).
Leishmaniosen werden durch Direktnachweis des Erregers mittels Mikroskopie oder
Kultur sowie durch DNA-Nachweis diagnostiziert. Als Untersuchungsmaterial sind
Gewebeproben aus der Haut, der Milz oder dem Knochenmark geeignet (Cook und
Manson 1996). Immundiagnostik in Form von Antikörpernachweisen ist ebenfalls möglich
(Berman 1997). Um die zelluläre Immunantwort zu testen, kann ein dem MendelMantoux-Test ähnliches Verfahren mit Leishmanin, einer Suspension getöteter
Leishmanien aus der Kultur, durchgeführt werden. Intradermal applizierte und
autoklavierte L. major Promastigote induzieren eine Immunreaktion und werden als
Impfstoff in Studien getestet (Khalil, El Hassan et al. 2000). Während die Hautläsionen im
Rahmen der kutanen Leishmaniose meist spontan heilen und höchstens der topischen
Therapie mit Paromomycinsalbe oder in Form von Wärme- oder Kälteapplikation
bedürfen, muß dem Befall innerer Organe mit antimikrobiell wirksamen Substanzen
begegnet werden: Pentavalentes Antimon, Pentamidin, Liposomales Amphotericin B,
Paromomycin sowie IFN-γ sind die wirksamsten der eingesetzten Therapeutika (Berman
1997). Das erste effektive orale Therapeutikum ist Hexadechylphosphocholin (Miltefosine)
(Jha, Sundar et al. 1999).
1.2
Neutrophile Granulozyten
Der russische Naturforscher Elie Metchnikoff beobachtete, daß Mikroorganismen von
Zellen aufgenommen und verdaut werden und nannte diese Makro- bzw. Mikrophagen
Einleitung
11
(Metchnikoff 1884). Die neutrophilen Granulozyten gehören zur Gruppe der
„Mikrophagen“. Diese Zellen sind in der Lage, unmittelbar nach Eindringen in den
Organismus die Erreger zu bekämpfen, sie bilden die erste Linie der Abwehr. Zusammen
mit
den
Faktoren
des
Komplementsystems
sowie
den
Akute-Phase-Proteinen
„überbrücken“ sie die Zeit bis zum Einsetzen der spezifischen Immunantwort. Gelingt es
Mikroorganismen, diese erste Linie der Abwehr zu unterlaufen, können sie sich bis zum
Einsetzen der spezifischen Antwort weiter vermehren und ausbreiten.
Granulozyten gehören zu den Leukozyten und werden im Knochenmark gebildet, wo sie
als Myeloblasten gemeinsam mit den Vorläuferzellen der Makrophagen, den Monoblasten,
aus einer gemeinsamen Stammzelle hervorgehen. Neutrophile Granulozyten besitzen einen
vielgestaltigen, gelappten Kern; man spricht auch von polymorphkernigen Leukozyten
(Polymorphonukleäre Zellen, Granulozyten). Der Kern enthält keinen Nukleolus, ist
chromatinreich und läßt sich mit neutralen Farbstoffen anfärben. Das Zytoplasma ist
schwach azidophil und enthält zahlreiche Speichergranula. Es wurden mindestens vier
Typen identifiziert, die mit verschiedenen Rezeptoren, Enzymen und mikrobiziden
Proteinen ausgestattet sind (Smith 1994). Von den neutrophilen lassen sich eosinophile und
basophile Granulozyten abgrenzen, die zahlenmäßig die Minderheit der Granulozyten
bilden und sich funktionell von Neutrophilen unterscheiden.
Vom Knochenmark werden die Granulozyten an den eigentlichen Wirkort in den Geweben
über den Blutstrom transportiert. Damit befindet sich nur ein kleiner Teil der im Körper
vorhandenen Granulozyten in den Gefäßen (<1% des Blutvolumens). Die Neutrophilenzahl
ist physiologischen und pathologischen Einflüssen unterworfen und beträgt beim
Erwachsenen 2500 – 7500 Zellen pro Mikroliter. Granulozyten machen 40 % bis 75 % der
Leukozyten aus. Ihre Halbwertszeit im Gefäßsystem beträgt 6 - 7 Stunden, ihre
Lebensdauer am Zielort noch maximal 1 – 2 Tage. Pro Tag werden 1011 Granulozyten
nachgebildet (Lloyd und Oppenheim 1992; Smith 1994). Granulozyten sind also sehr
kurzlebige Zellen. Zum Vergleich: Makrophagen können Monate bis Jahre überleben.
Einleitung
12
1.2.1 Die Funktion von Granulozyten als efferente Zellen des
Immunsystems
Granulozyten wurden lange Zeit als im Knochenmark ausdifferenzierte Zellen betrachtet,
die daraus nach sieben bis zehn Tagen Reifungszeit mit allen präformierten
Effektormolekülen hervorgehen, an den Ort der Infektion einwandern, phagozytieren und
neben Chemotaxinen die gespeicherten Vorräte an Enzymen wie Kollagenase, Elastase
und Gelatinase sowie zytotoxische Komponenten wie Myeloperoxidase, Lysozym und
Laktoferrin freisetzen. Nach vollbrachter Leistung gehen die Granulozyten zugrunde.
Eine klassische Aufgabenstellung der Granulozyten ist die Abwehr extrazellulärer
Eitererreger (Bone 1991). Im Zusammenhang mit intrazellulären Erregern werden
Granulozyten kaum erwähnt. Ebenso selten wurde eine Interaktion mit dem spezifischen
Immunsystem untersucht. Dies wurde bislang für die Domäne der Makrophagen gehalten.
Zusammengefaßt dominiert ein Bild des Neutrophilen als efferente Effektorzelle des
angeborenen Immunsystems, die von diesem ausgeht, eine vorbestimmte Aufgabe zu
erfüllen. Ihre Rolle als wichtige Schnittstelle zu den Funktionen des spezifischen
Immunsystems ist bislang wenig untersucht.
1.2.1.1 Rekrutierung und Aktivierung
Im Blut strömende Granulozyten exprimieren L-Selektin (CD62-L), CD11a/CD18 und
andere Adhäsionsmoleküle. Die Ausbildung von Selektinliganden, Selektinen und
Adhäsinen auf den Endothelzellen ermöglicht die gesteuerte Margination und Diapedese
der Granulozyten aus dem Blut in das Gewebe (Abbildung 3, S. 13). Die gelappte Form
des Zellkerns begünstigt den Durchtritt durch das Endothel (Opdenakker, Fibbe et al.
1998). Die Granulozyten werden dann durch chemotaktische Faktoren wie C3a und C5a,
aber auch chemotaktische Zytokine (Chemokine), zum Ort der Infektion geleitet
(Abbildung 3). Diese werden von Phagozyten und anderen Zellen des Immunsystems
produziert, die bereits mit dem Erreger interagiert haben, aber auch direkt durch die
Infektionserreger selbst. Die Einwanderung der Entzündungszellen potenziert sich selbst
durch die weitere Freisetzung chemotaktischer Stoffe.
Einleitung
Abbildung 3: Die akute Entzündungsreaktion. Erläuterung im Text; Abbildung modifiziert
(Delves und Roitt 2000).
Während der Transmigration durch das Endothel werden die Granulozyten aktiviert. Dies
führt zur Ausschüttung der in den verschiedenen Granula präformiert vorliegenden
mikrobiziden Substanzen (Degranulation, Abbildung 3). Der resultierende mikrobizide
Effekt wird durch eine Kombination von oxidativen und sauerstoffunabhängigen
enzymatischen Prozessen als weiteren Mechanismen unterstützt. Die Expression des
granulozytären Oberflächenmoleküls CD62-L nimmt nach der Aktivierung deutlich ab
(Abbildung 3). Hochreguliert werden die Komplementrezeptoren CR1 und CR3 sowie
FcγRI (Smith 1994). Ziel der Granulozyten ist die Eliminierung des Pathogens. Neben der
Ausschüttung toxischer Substanzen besteht ihre Effektorfunktion vor allem in der
Phagozytose des Erregers (Wright und Silverstein 1983).
1.2.1.2 Opsonisierung und Komplementsystem
Die Aufnahme der Erreger wird durch Opsonine wesentlich verbessert. Opsonine binden
an die Oberfläche der Mikroorganismen und gleichzeitig an spezifische Rezeptoren auf
13
Einleitung
14
Phagozyten und wirken dadurch wie ein universeller Adapter zwischen Pathogen und
Freßzelle. Zur Opsonisierung sind Komplementfaktoren, Immunglobuline und AkutePhase-Proteine
befähigt.
Die
Gesamtheit
der
Komplementfaktoren
bildet
das
Komplementsystem, ein hitzelabiles System von über 30 (Glyko-)Proteinen (15% der
Globulinfraktion), die im Serum in einer Konzentration von 3 g/l inaktiv vorliegen
(Walport 2001). Das System kann auf drei Arten aktiviert werden, die alle zur Bildung der
C3-Konvertase führen, dem Schlüsselenzym der Komplementkaskade. Es spaltet den
Komplementfaktor C3 in C3a und C3b, wovon letzteres in großer Menge an die
Oberfläche der Pathogene bindet. Der klassische Weg der Komplementaktivierung trägt
seinen Namen, da er zuerst entdeckt wurde. Hier führen Antigen-Antikörperkomplexe aus
Pathogen
und
IgM
bzw.
IgG
zur
Aktivierung
der
Komplementkaskade.
Entwicklungsgeschichtlich wahrscheinlich älter ist der alternative Weg. Er führt
antikörperunabhängig zur Bildung von C3b (Ofek, Goldhar et al. 1995). Der Lektinweg ist
ebenfalls antikörperunabhängig und wird durch das Mannanbindende Lektin (MBL)
vermittelt. Dieses kalziumabhängige, zuckerbindende Protein gehört zur Gruppe der
Kollektine. Im Serum kommt es in kleinen Mengen vor, in der akuten Phase ist es erhöht
und bindet an Mannosereste auf der Oberfläche von Mikroorganismen, was die
Aktivierung der Komplementkaskade zur Folge hat (Turner 1998). Das Prinzip der
Komplementopsonisierung besteht darin, die Erregeroberfläche mit dem Opsonin C3b zu
beladen, das von Komplementrezeptoren erkannt wird. Es kann auch zur Bildung des
terminalen Lysekomplexes kommen, der durch Lochbildung in der Membran des
Pathogens dessen Desintegration bewirkt.
Auch Antikörper haben opsonisierende Eigenschaften. Ihr variabler Teil bindet spezifisch
an das Pathogen während der konstante Fc-Teil unmittelbar von Fc-Rezeptoren auf
Phagozyten gebunden wird. Neben erregerspezifischen Antikörpern gibt es sogenannte
natürliche Antikörper. Sie sind das Produkt von Immunglobulingenen, die noch keiner
somatischen Mutation unterlagen und Epitope mehrerer Antigene erkennen. Somit liegen
sie ‚natürlicherweise’ im Serum vor (Walport 2001).
Neben dem universellen Prinzip der komplementvermittelten Erregererkennung gibt es
opsoninunabhängige,
z.
T.
sehr
spezielle
Mechanismen.
Dazu
gehört
die
Lektinphagozytose. Sie basiert auf der Bindung zwischen Lektinen auf der
Einleitung
15
Erregeroberfläche und Oberflächenkohlenhydraten der phagozytierenden Zelle (Ofek,
Goldhar et al. 1995).
1.2.1.3 Oxidative und nichtoxidative Mechanismen der Erregerabtötung
Die alleinige Phagozytose des Pathogens führt nicht unmittelbar zu dessen Eliminierung,
insbesondere intrazelluläre Parasiten sind auf das Überleben im Zellinneren spezialisiert.
Erst
die
Auslösung
weiterer
Effektormechanismen
führt
zur
Erregerabtötung.
Granulozyten verfügen diesbezüglich über zwei z.T. redundante Prinzipien, nichtoxidative
und oxidative Mechanismen.
Hydrolytische Enzyme, antimikrobielle Polypeptide, Defensine und saure Hydrolasen
tragen zur nichtoxidativen Vernichtung der Erreger bei. Wie bereits erwähnt, können sie
unverzüglich aus den Granula freigesetzt werden. Der oxidative burst ist ein oxidativer
Mechanismus und bezeichnet einen stark erhöhten Sauerstoffumsatz der Granulozyten
durch Aktivierung einer von NADPH-Cytochrom-b-abhängigen Oxidase, die molekularen
Sauerstoff zu einem Superoxid reduziert. Toxischer als das Superoxid selbst sind weitere
reaktive Sauerstoffintermediate (reactive oxygen intermediates, ROI), die aus diesem
Vorläufer gebildet werden, wie Wasserstoffperoxid (H2O2) durch die Superoxiddismutase
oder
spontane
Dismutation.
Myeloperoxidaseabhänig
werden
Oxyhalide
wie
Hypochlorsäure (HOCl) gebildet, der eine 100- bis 1000fach höhere Aktivität als H2O2
zugeschrieben wird und die in der Protozoenabwehr eine besondere Rolle spielt, da Erreger
sie nicht detoxifizieren können (Eaton 1993). Die Kombination von ROI mit reaktiven
Stickstoffintermediaten führt zu Substanzen besonderer Toxizität wie Peroxynitrit
(OONOO-)3 oder Nitrylchlorid (NO2Cl) (Eiserich, Hristova et al. 1998). Oxidative und
nichtoxidative Prozesse in Kombination potenzieren sich, z.T. reagieren Erreger nur
sensibel auf deren gemeinsamen Angriff.
Einleitung
16
1.2.1.4 Apoptose
Das natürliche Schicksal der Granulozyten ist ein früher Zelltod. Nach Erreichen des
Zielortes im Gewebe kehren Granulozyten in der Regel nicht in die Blutbahn zurück.
Somit ist eine schonende Beseitigung der Granulozyten notwendig, damit dem Gewebe
nicht zusätzlicher Schaden durch die aggressiven Substanzen in den Granulozyten zugefügt
wird. Nach zwölf bis 24 Stunden zeigen Granulozyten deshalb Zeichen der Apoptose.
Dabei kommt es zur Umorganisation der Zelle (Tabelle 1) derart, daß alle Organellen von
Zellmembran umgeben bleiben, keine toxischen Substanzen freigesetzt werden und
dadurch kein Entzündungsreiz entsteht. Die Membranpakete der apoptotischen
Granulozyten werden von Makrophagen erkannt und abgeräumt (Savill, Wyllie et al.
1989). Das Abräumen der apoptotischen Zellen geschieht innerhalb weniger Stunden. Im
Gegensatz zur Aufnahme zahlreicher anderer Partikel setzen Makrophagen ihrerseits dabei
keine gewebeschädigenden Substanzen frei (Haslett, Savill et al. 1989).
1.2.1.5 Primäre Störungen der Granulozytenfunktion
Klinisch sind primäre Störungen der Granulozytenfunktion wichtiger Bestandteil der
Differentialdiagnose rekurrenter Infektionen und Fieber bei Kindern und teils
Erwachsenen. In der Regel fallen die Patienten bereits in jungem Alter durch ihre
Empfindlichkeit gegenüber normalerweise nichtpathogenen Bakterien und Pilzen auf, die
zum Teil charakteristisch für den vorliegenden Phagozytendefekt sind. Von der absoluten
Morphologische Charakteristika (Savill,
Wyllie et al. 1989)
• Kernpyknose und –prominenz
• Chromatinkondensation und –aggregation
• Zytoplasmatische
Vakuolisierung
• Trypanviolettausschluß
in den ersten Stunden
• Zerfall in
membranumgebene
Apoptosekörper
Funktionelle Konsequenzen (Whyte,
Meagher et al. 1993)
• Eingeschränkte Zytoskelettfunktionen
• Chemotaxis
• Verformung
• Stark eingeschränkte Phagozytose
• Verminderte Degranulationsfähigkeit
• Herabgesetzte MPO-Freisetzung
• Produktion von Superoxidanionen
• Herabgesetzt bei Stimulation mit
fMLP oder opsonisiertem
Zymosan
• Erhalten bei Stimulation mit PMA
Tabelle 1: Morphologische und funktionelle Charakteristika der Apoptose neutrophiler
Granulozyten. Zusammengestellt nach (Savill, Wyllie et al. 1989) und (Whyte, Meagher et al.
1993).
Einleitung
17
Verminderung der Neutrophilenzahl lassen sich die Funktionsstörungen unterscheiden. Zur
gestörten Abwehr intrazellulärer Erreger wie Mykobakterien, Salmonellen und Listerien
kommt es zum Beispiel bei unzureichender Produktion von ROI (Lekstrom-Himes und
Gallin 2000).
1.2.2 Die Funktion von Granulozyten als afferente Zellen des
Immunsystems
Bisher wurden die Effektorfunktionen der Granulozyten dargestellt, die in der Literatur gut
beschrieben sind. Wesentlich jünger ist das Verständnis von Granulozyten als afferentes
Glied im Immunsystem. Sie sind aktive Mitglieder im Kommunikationsnetzwerk der
Abwehrzellen (Lloyd und Oppenheim 1992).
1.2.2.1 Zytokine
Zytokine sind zentrale Bindeglieder zwischen der unspezifischen und der spezifischen
Abwehr. Zytokine sind kleine lösliche Proteine und Peptide mit einer Halbwertzeit von
Stunden, die auto- oder parakrin auf Zielzellen wirken (Kirchner 1994). Dabei hängt die
Wirkung nicht nur vom Botenstoff ab, sondern auch von der Zielzelle, von deren Zustand
und eventuellen weiteren auf diese Zelle wirkenden Zytokinen. Daraus ergibt sich eine
große Komplexität. Dennoch lassen sich bestimmten Immunphänomenen charakteristische
Zytokinmuster zuordnen.
Reife Granulozyten behalten ihre Fähigkeit, ein begrenztes, aber signifikantes Spektrum
von messenger RNA (mRNA) und Proteinen zu synthetisieren. Bedeutsam für die afferente
Funktion ist jedoch ihre Fähigkeit, Zytokine zu produzieren (Lloyd und Oppenheim 1992).
Es gibt zahlreiche Belege, daß Granulozyten Chemokine, Wachstumsfaktoren und
Interferone sowohl in vitro als auch in vivo produzieren (Tabelle 2, Seite 18). Darüber
hinaus wurde gezeigt, daß die Interaktion Neutrophiler mit einem gegebenen Agonist nicht
nur zur Sekretion eines spezifischen Musters von Zytokinen führt, sondern daß diese
Antwort auch durch immunregulatorische Zytokine wie Interleukin-10 und Interferon-γ
moduliert werden kann. Wenngleich ihre Vielzahl vor allem in vitro demonstriert wurde,
weisen die Neutrophilenzytokine darauf hin, daß nicht nur die Immunantwort von
Einleitung
18
Granulozyten beeinflußt werden kann, sondern gleichfalls Prozesse der Hämatopoese, der
Wundheilung, der Angiogenese und der Virusabwehr (Cassatella 1999).
Am Anfang einer Infektion stehen Zytokine, die eine Entzündungsreaktion stimulieren und
von Zellen gebildet werden, die früh am Ort der Infektion sind. Von Granulozyten werden
eine Reihe von Zytokinen produziert, die in Tabelle 2 zusammengestellt sind.
Proinflammatorische Zytokine
1
TNF -α
2
IL -1α
2
IL -1β
2
IL -12
3
IFN -α
3
IFN -γ ?!
2
IL -6 ?!
Antiinflammatorische Zytokine
2
IL -1ra
4
TGF -β
Chemokine
2
IL -8
5
GRO -α
5
GRO -β m
6
CINC -1
6
CINC -2α
7
IP -10
8
MIG
9
I-TAC m
10
MIP -1α
10
MIP -1β
11
MCP -1 ?!
Wachstumsfaktoren
12
G-CSF
13
M-CSF ?!
14
GM-CSF ?!
2
IL -3
15
SCF ?! m
Angiogenese- und Fibrinogenesefaktoren
16
VEGF
4
TGF -α
17
HGF
18
LDGF
19
CEMF
Andere
Fas-Ligand
CD30-Ligand
Oncostatin M
20
GDF
21
NGF m
22
BDNF m
23
NT -4 m
Legende: ?! – bedarf weiterer Bestätigung; m – nur mRNA
2
3
4
5
tumor necrosis factor, interleukin, interferon, transforming growth factor, growth-regulated6
7
cytokine-induced-neutrophil
chemoattractant,
interferon-inducible-protein,
oncogene,
8
9
monokine induced by gamma interferon, interferon-inducible-T-cell-alpha-chemoattractant,
10
11
12
macrophage-inflammatory protein, monocyte chemotactic protein, colony-stimulating-factor
13
14
15
16
(CSF), macrophage-CSF, granulocyte-M-CSF, stem cell factor, vascular endothelial
17
18
19
growth factor, hematopoietic growth factor, leukaemia-derived growth factor, corneal20
21
22
endothelium modulation factor, granulocyte derived factor, nerve growth factor, brain23
derived neurotrophic factor, neurotrophin
1
Tabelle 2: Zusammenstellung von Zytokinen oder Zytokin-mRNA, die durch neutrophile
Granulozyten in vitro produziert werden. Nach (Cassatella 1999); Ausführung der Abkürzungen
auf Englisch, soweit die Zytokine in dieser Arbeit näher erwähnt werden, findet sich eine deutsche
Übersetzung im Text.
Einleitung
1.3
19
Granulozyten und Leishmania major
Lange Zeit galten Makrophagen als die fast ausschließlichen Wirtszellen für L. major.
Einzelheiten der Makrophagen-Parasit-Interaktion sind gut beschrieben (Solbach und
Laskay 2000). Minuten nach der Phagozytose von L. major durch Makrophagen bildet sich
um die Leishmanien eine parasitophore Vakuole, die u.a. lysosomale Hydrolasen enthält
(Lang, Hellio et al. 1994; Antoine, Prina et al. 1998). Nach diversen Teilungen des
Parasiten wird die Wirtszelle schließlich lysiert, und die freigesetzten Leishmanien können
dann weitere Zellen befallen und sich ausbreiten (Russell und Talamas-Rohana 1989),
wenn sie nicht von den Makrophagen durch NO und Sauerstoffradikale (Murray und
Nathan 1999) vernichtet werden. Neben Makrophagen im engeren Sinne können aber alle
Zellen der Monozyten-Makrophagen-Linie mit L. major infiziert werden, inklusive
Langerhans- und dendritische Zellen (Locksley, Heinzel et al. 1988; Blank, Fuchs et al.
1993; Moll, Flohé et al. 1995). Demgegenüber haben nur wenige Studien Granulozyten als
mögliche parasitäre Zielzellen zum Inhalt. In vitro-Untersuchungen zeigten die Aufnahme
und Vernichtung von L. donovani durch Granulozyten (Chang 1981; Pearson und
Steigbigel 1981). Eine andere Arbeitsgruppe demonstrierte die L. major-Infektion muriner
Knochenmarkzellen, die einen Granulozytenmarker an ihrer Oberfläche exprimierten, und
erhielt Hinweise dafür, daß ein frühes Erscheinen von Granulozyten am Ort der Infektion
ursächlich für eine Ausweitung der Infektion war (Sunderkotter, Kunz et al. 1993).
Ebenfalls als dem Überleben des Parasiten dienlich wurde die Infektion von 25% aller
Leukozyten aus Humanblut mit Leishmanien gesehen (Dominguez und Torano 1999). Bei
Hunden wurde die Infektion von Granulozyten mit L. infantum und eine resultierende
Hemmung der ROI-Produktion beschrieben (Brandonisio, Panunzio et al. 1996).
Die existierenden Vorarbeiten, die Neutrophile in der Infektion mit Leishmanien
untersuchen, sind rar. Die Erkenntnisse entstammen vor allem Tiermodellen und
Untersuchungen in vitro, während wenig Erkenntnisse zur humanen Situation vorliegen:
Bei humanen Granulozyten sind die Aufnahmemechanismen und –bedingungen für L.
major, die folgenden intrazellulären Prozesse und das Schicksal der Parasiten noch
weitgehend unbekannt. Zur Frage der Zytokinproduktion durch mit Leishmanien infizierte
Granulozyten liegen bisher keine Daten vor. Die Interaktionen zwischen menschlichen
Granulozyten und L. major bedürfen somit weiterer Untersuchung. Dies ist besonders
Einleitung
deshalb relevant, da Granulozyten ein entscheidendes Bindeglied zwischen angeborener
und adaptiver Immunantwort sind.
Ferner sind Granulozyten in den ersten Stunden nach der Infektion mit L. major die mit
Abstand vorherrschende Zellpopulation am Ort der Läsion (Müller, van Zandbergen et al.
2001). Experimente belegen, daß zu dieser Zeit und an diesem Ort entscheidende
immunologische Weichen im Infektionsverlauf gestellt werden. Über die Rolle der
Granulozyten während dieser Frühphase der Infektion ist nur wenig bekannt.
20
Fragestellung
1.4
21
Fragestellung
In dieser Arbeit wird zum einen die Bedeutung von Granulozyten als efferente Zellen und
zum anderen als afferente Zellen des Immunsystems in der Infektion mit dem
intrazellulären Erreger L. major untersucht.
Im ersten Teil werden mittels zellbiologischer und immunologischer Methoden folgende
drei Fragen bearbeitet:
•
Besteht eine Interaktion zwischen Granulozyten und L. major (Erregeraufnahme)?
•
Welche Auswirkungen hat diese Interaktion auf die Granulozyten und deren
Funktion (Aktivierung, Sauerstoffradikalproduktion, Zelltod)?
•
Welche Konsequenz haben diese Wechselwirkungen für den Erreger?
Im zweiten Teil werden mit molekularbiologischen Techniken folgende Fragen beleuchtet:
•
Können Granulozyten als afferente Zellen des Immunsystems mit anderen Zellen
der Abwehr kommunizieren ?
•
Wie wird diese Kommunikation durch L. major beeinflußt (Zytokinproduktion)?
Material
22
2 Material
2.1
Geräte
Analysenwaage 1265 MP
Sartorius, Göttingen
CO2-Inkubator IG 150
Jouan GmbH, Unterhaching
Durchflußzytometer FACSCalibur®
Becton Dickinson & Co., Mountain
View, CA, U.S.A.
Eismaschine
Scotsman, Vermon Hills, IL, U.S.A.
ELISA-Reader Precision Microplate Reader
Molecular Devices, Ismaning
Gefriertruhen (-70°C, -20°C) Liebherr Comfort
Liebherr Hausgeräte GmbH,
Ochsenhausen
Gelelektrophoresekammer (radioaktiv) S2
Life Technologies, Karlsruhe
Sequencing Gel Electrophoresis Apparatus
Gelelektrophoresekammer Agagel
Biometra, Göttingen
Hitzeblock Unitek HB 130
Unitek, Deutschland
Mikroskop Axioplan
Zeiss, Jena
Mikroskop Axiovert 25
Zeiss, Jena
Mikrowellenherd
Bosch, Stuttgart
Netzgerät P25
Biometra, Göttingen
pH-Meter Beckman 3500 digital
Beckman, München
Phosphoimager BAS 2000
Fuji Photo Film Co., Tokyo, Japan
Photoanlage digit Store duo
Intas, Göttingen
Pipette Finnpette
Labsystems, Helsinki, Finnland
Pipette Kombi
Eppendorf, Hamburg
Pipette Multikanal
Eppendorf, Hamburg
Pipette Transferpette
Brand, Wertheim
Pipette Vario-Mikrotiterpipetten
Eppendorf, Hamburg
Rüttler Vibrofix VF1 Electronic
Janke & Kunkel IKA® Labortechnik,
Staufen
Scanner Power Look II
Umax, Irland
Spektralphotometer Ultrospec 1000
Amersham Pharmacia Biotech,
Freiburg
Sterile Werkbank ANTARES
Biohit, Köln
Material
23
UV-Lichtquelle, UV-Tisch
Intas, Göttingen
Vakuumkonzentrator UVS400A,
Savant, NY, U.S.A.
SpeedVac®Plus SC110A
Wasserbad Bioblock Scientific
Illkirch, Cedex, Frankreich
Zählkammern
Neubauer, Marienfeld
Zellsortiersystem FACS
BD Biosciences, San Jose, CA,
Vantage SE cell sorter system
U.S.A.
Zentrifuge Biofuge fresco
Kendro Laboratory Products
(Heraeus), Hanau
Zentrifuge Megafuge 2.0R
Kendro Laboratory Products
(Heraeus), Hanau
Zytozentrifuge Cytospin mit Einsätzen
2.2
Shandon GmbH, Frankfurt am Main
Laborbedarf
Bakterienfilter, rund, 0,2 µm, steril
Sarstedt, Nümbrecht
Blutentnahmeröhrchen Li-Heparin
Sarstedt, Nümbrecht
Blutentnahmeröhrchen Serum
Sarstedt, Nümbrecht
Cytoträger-Zentrifugeneinsätze
Shandon, Pittsburgh, PA, U.S.A.
Einmalhandschuhe Peha-Soft® powder free
Hartmann, Heidenheim
Einmalhandschuhe Vinyl 2000 PF
Meditrade, Kiefersfelden
Fotofilm
Fuji, Düsseldorf
Gewebekulturplatten 6 Loch, 24 Loch
Greiner, Solingen
Glasobjektträger Menzel Superfrost
Gerhard Menzel Glasbearbeitungswerk
GmbH & Co. KG, Braunschweig
Mikrotiterplatten 96 Loch
Nunc, Wiesbaden
MicroWell™ELISA
Mikrotiterplatten 96 Loch, MicroWell™
Nunc, Wiesbaden
Flachboden (für L. major)
Phosphoimaging Platte
Raytest, Straubenhardt
Pipettenspitzen 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1000 Greiner, Solingen
µl
Polycarbonatröhrchen 15 ml, 50 ml
Sarstedt, Nümbrecht
Polypropylenröhrchen 15 ml, 50 ml
Sarstedt, Nümbrecht
Material
24
Reaktionsgefäße 0,5 ml, 1 ml, 2 ml
Sarstedt, Nümbrecht
Röntgenfilm
Kodak, Stuttgart
Stangenpipetten steril 5 ml, 10 ml, 25 ml
Greiner, Nürtingen
Sterilfiltertips Art®, gestopft, nukleasefrei
Molecular BioProducts, San Diego, CA,
U.S.A.
Sterilfiltertips Biosphere®, gestopft,
Sarstedt, Nümbrecht
nukleasefrei
2.3
Zellkulturmedien und –zusätze
2-Mercaptoethanol
Gibco Laboratories, Eggenstein
Albumin, aus Rinderserum (BSA)
Sigma Diagnostics, Deisenhofen
Albumin, human
Sigma Diagnostics, Deisenhofen
brain heart infusion agar base
Difco, Detroit, MI, U.S.A.
FCS (fetal calf serum)
Sigma Diagnostics, Deisenhofen
Gentamicin
Seromed Biochrom, Berlin
HEPES-Puffer
Seromed Biochrom, Berlin
Kaninchenblut, frisch, defibriniert
Froschek GmbH, Mühlhausen
Kulturmedium RPMI 1640
Gibco Laboratories, Eggenstein
L-Glutamin
Seromed Biochrom, Berlin, BRD
LPS von E. coli, Sacharomyces cerevisiae
Sigma Diagnostics, Deisenhofen
MBL (Mannanbindendes Lektin), aufgereinigt
Statens Serum Institut, Copenhagen,
Denmark
Penicillin-G
Seromed Biochrom, Berlin, BRD
2+
Phosphate Buffered Saline 10x without Ca ,
Gibco, Karlsruhe
Mg2+
Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) without
Apotheke der MUL, Lübeck
Ca2+, Mg2+
Streptomycinsulfat
Seromed Biochrom, Berlin
Material
2.4
25
Immunologische Reagenzien
Antikörper
Konjugat/ Besonderheit
Zellklon Verdünnung Bezugsquelle
anti-CD11b
monoklonal, säurefrei,
M1/70
(Integrin αM chain,
endotoxinarm
BD/Pharmingen,
Heidelberg
Mac-1 chain)
anti-CD62-L
PE, monoklonal
Dreg-56 1 µl/ml
BD/Pharmingen,
Heidelberg
anti-CD66b
FITC, monoklonal
80H3
1 µl/ml
Immunotech,
Marseille,
Frankreich
anti-mouse IgG1
Isotypkontrollantikörper
BD/Pharmingen,
Heidelberg
2.5
Reagenzien für molekularbiologisches Arbeiten
[α-32P]UTP 3000 Ci/mmol
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Ammoniumthiocyanat
Sigma, Deisenhofen
Aqua ad injectabilia, 10 ml
Braun, Heidelberg
Chloroform
Roth, Karlsruhe
Ethanol
Apotheke der MUL, Lübeck
Glycerol
Sigma, Deisenhofen
Guanidinthiocyanat
Roth, Karlsruhe
Isopropanol
Apotheke der MUL, Lübeck
Natriumacetat
Sigma, Deisenhofen
Phenol
Sigma, Deisenhofen
Tris-Borat-Puffer (TBE)
Fluka, Steinheim
2.6
Testkits
DuoSet® ELISA Development System human
R&D Systems GmbH, Wiesbaden, BRD
IL-8
Phagoburst®
Medac, Hamburg
Quantikine® human IL-1ra Immunoassay
R&D Systems GmbH, Wiesbaden
Material
RiboQuant® Multi-Probe RNase Protection
Pharmingen, Heidelberg
Assay System
RiboQuant® Template sets: hck-2, hck-5
2.7
Pharmingen, Heidelberg
Chemikalien und sonstige Reagenzien
Agarose
Sigma, Deisenhofen
ddH2O
Mikrobiologie, MUL, Lübeck
Ethidiumbromid
Sigma, Deisenhofen
Ficoll-Trennlösung 1,077 g/ml
Seromed Biochrom, Berlin
Ficoll-Trennlösung 1,119 g/ml
Seromed Biochrom, Berlin
Giemsa-Färbelösung
Sigma, Deisenhofen
H2O2
R&D Systems GmbH, Wiesbaden
H2SO4 1N
Abbot, Wiesbaden
Histopaque® 1119
Sigma, Deisenhofen
Kristallviolett-Färbelösung
Sigma, Deisenhofen
Methanol
Apotheke, MUL, Lübeck
NaN3
Sigma, Deisenhofen
Percoll-Trennlösung 1,130 +/- 0,005 g/ml
Pharmacia, Uppsala, Schweden
Silikon
Serva, Heidelberg
Streptavidin-HRP
R&D Systems GmbH, Wiesbaden, BRD
Tetramethylbenzidine
R&D Systems GmbH, Wiesbaden, BRD
Trypanblau-Färbelösung 0,4%
Sigma, Deisenhofen
Tween 20
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
2.8
Software
Adobe®Acrobat® 5.0
Adobe Systems Inc., San Jose, CA, U.S.A.
Adobe®Photoshop® 6.0
Adobe Systems Inc., San Jose, CA, U.S.A.
Binuscan
Cédex, Monaco
Cellquest
Becton Dickinson, Mountain View, CA, U.S.A.
Microsoft® Excel
Microsoft Corporation, Mountain View, CA, U.S.A.
Microsoft® Internet Explorer
Microsoft Corporation, Mountain View, CA, U.S.A.
Microsoft® PowerPoint
Microsoft Corporation, Mountain View, CA, U.S.A.
26
Material
Microsoft® Word
Microsoft Corporation, Mountain View, CA, U.S.A.
Phosphoimaging Software
Raytest, Straubenhardt
TINA 2.0®
Zeiss Mikroskop Software
Zeiss, Jena
27
Methoden
28
3 Methoden
3.1
Parasiten
3.1.1 Leishmania major:
Die in den beschriebenen Versuchen verwendeten Leishmanien gehören zum Leishmaniamajor-Stamm MHOM/IL8/FEBNI, der 1981 aus der kutanen Läsion einer israelischen
Patientin isoliert wurde (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. F. Ebert,
Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin, Hamburg). Das Isolat wird durch regelmäßige
In-Vivo-Passagen (s. 3.1.3) durch s.c. Injektion von Promastigoten in die Fußsohle von
BALB/c-Mäusen und nachfolgende In-Vitro-Propagation (s. 3.1.2) der aus der Läsion
gewonnenen Parasiten in biphasischem Kulturmedium weiter gezüchtet (Solbach, Forberg
et al. 1986).
3.1.2
In-Vitro-Kultur
Für die Parasitenkultur wurde ein biphasisches Novy-Nicolle-MacNeal-Kulturmedium in
Flachbodenkulturplatten mit 96 Löchern verwendet, das aus 100 µl Novy-NicolleMacNeal (NNN)-Schrägagar und 100 µl 10%-FCS-Medium (3.3.1.1) pro Vertiefung
bestand. NNN-Schrägagar wurde aus 50 ml defibriniertem, frischem Kaninchenblut, 50 ml
PBS, 30.000 IE Penicillin-G, 30 µg/ml Streptomycinsulfat und 200 ml „brain heart
infusion agar base“ hergestellt.
Die Parasitenkultur wurde im Inkubator in einer 5% CO2-Atmosphäre bei 27° C gehalten.
3.1.3 In-Vivo-Propagation
Zum Erhalt der Infektiosität der Parasiten wurden spätestens nach der 10. In-Vitro-Passage
2 x 106 Promastigote der stationären Wachstumsphase (ca. 7. Tag in Kultur) in 50 µl PBS
s.c. in die linke hintere Fußsohle einer BALB/c Maus injiziert. Es entwickelt sich dann
Methoden
29
eine Infektion, deren Ausmaß in den ersten Wochen mit der lokalen Schwellung der
Fußsohle korreliert. Sobald die Schwellung nicht mehr wesentlich zunahm, wurde der
popliteale Lymphknoten der linken Seite entnommen und homogenisiert. Das Homogenat
wurde anschließend gewaschen und in 10%-FCS Medium (3.3.1.1) als Suspension wie
unter 3.1.2 beschrieben ausplattiert.
3.1.4 Aufbereitung für die Inkubation
Vor Zugabe von Leishmanien zu einem Versuchsansatz wurden die Parasiten zweimal in
Medium (3.3.1.1) gewaschen, und auf die gewünschte Konzentration eingestellt.
3.2
Humane Zellen
Venöses Blut wurde unmittelbar vor Aufreinigungsbeginn jungen, gesunden, weiblichen
oder männlichen Erwachsenen (in der Regel Laborpersonal) entnommen.
3.2.1 Granulozytenaufreinigung
Zur Gewinnung humaner Granulozyten wurde venöses Blut in Heparinröhrchen aus der
Vena mediana cubiti abgenommen und bei Raumtemperatur verarbeitet. Im folgenden ist
das typische Vorgehen bei der Präparation von Granulozyten aus 4,5 ml humanem Vollblut
geschildert.
In einem 15 ml Polypropylenröhrchen wurden 4,5 ml Ficoll-Trennlösung 1,119 g/ml
vorgelegt und die gleiche Menge Blut vorsichtig darüber geschichtet, anschließend für 20
min bei Raumtemperatur und 800g zentrifugiert. Es resultierten von unten nach oben vier
Fraktionen: I. Erythrozyten, II. Ficoll-Zell-Gemisch (v.a. Granulozyten, vereinzelt
Erythrozyten), III. Zellschicht (vor allem Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten), IV.
Plasma.
Methoden
30
Schicht II wurde sorgfältig abgesaugt und zweimal in
Medium gewaschen (10 min, 350g), sodann in 1 ml
Medium (3.3.1.1) aufgenommen und auf einen Percoll-
IV. Plasma
III. Lymphozyten,
Monozyten
Gradienten gegeben. Der Anteil der Stammlösung
(Percoll-Trennlösung 10:1 verdünnt mit 10x PBS) in den
Schichten von unten nach oben betrug 85% bis 65% in
II. granulozytenreiche
Fraktion
5% Schritten entsprechend Dichten von 1,105 g/ml,
1,100 g/ml, 1,093 g/ml, 1,087 g/ml, 1,081 g/ml. Nach
I. Erythrozyten
20minütiger Zentrifugation bei Raumtemperatur und
800g wurde die Zellfraktion im Bereich der 80%-85%
Interphase vorsichtig separiert und zweimal wie oben
beschrieben gewaschen.
Abbildung 4: Resultierende
Zellschichten nach Zentrifugation des Vollbluts auf
Ficoll-Trennlösung (s. Text)
3.2.1.1 Bestimmung der Reinheit und Vitalität
Die verwendeten Granulozyten mußten hochrein sein, um zu gewährleisten, daß die
Beobachtungen auch wirklich die Neutrophilen betrafen und nicht durch Lymphozyten
oder Monozyten bedingt waren. Deshalb wurde nach der Isolierung die Reinheit aller
eingesetzten Präparationen kontrolliert. Dazu wurde ein Zytozentrifugenpräparat der
aufgereinigten Zellen mittels Giemsa gefärbt, und mindestens einhundert Zellen wurden
gezählt. Die Reinheit gemäß typischer zellmorphologischer Kriterien lag immer über 99%.
Mittels Trypanblaufärbung wurde die Lebendigkeit der isolierten Granulozyten getestet.
Für die Experimente wurden nur Zellen einer Vitalität von über 99% verwendet.
Die Zahl der gewonnenen Granulozyten lag zwischen 1,5 x 106 und 2 x 106 pro 1 ml
Vollblut.
Methoden
3.3
31
Zellkulturmedien und Kulturbedingungen
3.3.1 Zellkultur
3.3.1.1 Medium, FCS-Medium, Plasma, Serum
Als Wachstumsmedium für die Zellkultur diente RPMI 1640, das mit 50 µM 2Mercaptoethanol und 2 mM L-Glutamin, 10 mM HEPES-Puffer, 100 µg/ml Penicillin G
sowie 160 µg/ml Gentamicin supplementiert wurde, im folgenden als Medium bezeichnet.
Wenn angegeben, wurde das Medium mit 10% bzw. 20% FCS oder humanem Plasma oder
Serum versetzt. Je nach Experiment wurden die Supplemente für 30 Minuten bei 56°C im
Hitzeblock „hitzeinaktiviert“ (abgekürzt als ‚hi’). Dies diente vor allem zur Ausschaltung
der Wirkung von Komponenten des Komplementsystems.
Plasma wurde nach Blutabnahme im Heparinröhrchen und Zentrifugation auf FicollTrennlösung 1,119 g/ml als Schicht IV zellfrei separiert (siehe 3.2.1). Zur Gewinnung von
Serum fand die Blutentnahme mittels Serumröhrchen statt. Nach abgelaufener Gerinnung
und Zentrifugation konnte das Serum abpipettiert werden.
3.3.1.2 Mannanbindendes-Lektin (MBL)-defizientes Serum
Das unter 4.1.5 (S. 45) und in Abbildung 10 (S. 45) als MBL-defizientes Serum
bezeichnete Serum mit einem MBL-Gehalt von 16 ng/ml (Serum 3) bzw. 12 ng/ml (Serum
4) sowie aufgereinigtes MBL (MBL/MASP complex SSI, lot MO-04, stabilisiert mit 5
mg/ml HSA) wurde freundlicherweise von Dr. J. C. Jensenius (Institut für Medizinische
Mikrobiologie und Immunologie, Universität Aarhus) zur Verfügung gestellt. Die an
gleicher Stelle erwähnten Kontrollseren enthielten 2,3 µg/ml (Serum 1) bzw. 2,8 µg/ml
(Serum 2) MBL. Aufgereinigtes MBL wurde in einer Endkonzentration von 3,3 µg/ml
verwendet (Serum mit MBL).
Methoden
32
3.3.2 Inkubation und Stimulation
3.3.2.1 Inkubation mit Leishmania major
Die Inkubation von Zellen mit oder ohne Leishmanien und ggf. den angegebenen Zusätzen
fand - soweit nicht anders beschrieben - in 24-Loch-Platten bei 37° C und 5% CO2 statt.
Die Zellkonzentration (ohne Parasiten) betrug 106 in 1 ml Medium. Es erfolgte ggf. Zugabe
von 20% FCS, 20% Serum oder 20% Plasma (jeweilige Endkonzentrationen). Bei
Inkubationszeiten unter 30 Minuten wurde die Inkubationstemperatur von 37°C
sichergestellt, indem die Proben in ein vorgewärmtes Wasserbad innerhalb des
Brutschrankes gestellt wurden.
3.3.2.2 Blockierung des Komplementrezeptors CR3/Mac-1
Zur Blockierung des Komplementrezeptors CR3 wurden 1 x 106 Granulozyten in 1 ml
Medium für 20 Minuten bei 37°C mit dem monoklonalen, gereinigten Ratte-anti-MausCD11b-IgG1 (Integrin αM chain, Mac-1 chain, 1 µg/100 µl) inkubiert, der mit humanem
CD11b kreuzreagiert (Fearon und Collins 1983). Nicht gebundener Antikörper wurde
anschließend durch Waschen in Medium entfernt. Bei Kontrollansätzen wurde ein RattenIgG1-Kontrollantikörper verwendet.
3.3.3 Giemsafärbung
Ca. 0,5 x 105 Zellen wurden in 100 µl PBS in der Zytozentrifuge bei 500 Umin-1 für 5 min
auf Glasobjektträger zentrifugiert und anschließend luftgetrocknet. Die Objektträger
wurden dann 5 min lang in Methanol fixiert, erneut luftgetrocknet und schließlich für 30
min mit Giemsa-Lösung (Giemsa : ddH2O = 1 : 10) gefärbt, mit H2O gewaschen und
luftgetrocknet.
Methoden
33
3.3.4 Auswertung
3.3.4.1 Identifikation und Zählung intrazellulärer Leishmanien
Zur Untersuchung, ob und wie viele Granulozyten Leishmanien unter unterschiedlichen
Inkubationsbedingungen aufnehmen, wurden die Zellen nach Giemsafärbung von
Zytozentrifugenpräparaten
lichtmikroskopisch
analysiert.
Zur
Bestimmung
der
Leishmanienaufnahmerate wurden mindestens 100 Zellen gezählt und der Anteil mit L.
major infizierter Zellen bestimmt. Eine Zelle galt als Leishmania-positiv, wenn mindestens
ein intrazellulärer Parasit identifiziert werden konnte (siehe Abbildung 7).
3.3.4.2 Identifikation und Zählung apoptotischer Granulozyten
Ebenfalls mittels Lichtmikroskopie nach Giemsa gefärbter Präparate wurden apoptotische
Granulozyten identifiziert. Als morphologische Apoptosekriterien galten kondensiertes
Kernchromatin, fehlende Kernbrücken und ein verminderter Zelldurchmesser im Vergleich
zu „frischen“ Granulozyten.
Zur Bestimmung der Apoptoserate wurden mindestens 100 Zellen gezählt und
mikroskopisch die Anzahl der Zellen bestimmt, die den Apoptosekriterien entsprachen.
3.4
Durchflußzytometrie: Oberflächenfärbung (CD66b, CD63, CD62-L)
Die Durchflußzytometrie ist als automatisiertes Verfahren zur genauen Einzelanalyse einer
großen Zellzahl etabliert. Neben Größe und Granularität können die Zellen in Kombination
mit einer Fluoreszenzmarkierung auf eine Vielfalt von Eigenschaften untersucht werden.
Diese Technik wurde zur Analyse der Expression der Aktivierungsmarker CD66b, CD63
und CD62-L auf der Zelloberfläche sowie der Bestimmung der intrazellulären
Sauerstoffradikalproduktion (s. 3.5) eingesetzt.
105 - 106 Zellen wurden in PBS aufgenommen und mit dem oder den jeweiligen
fluoreszenzmarkierten Antikörpern (s. 2.5) 30 Minuten lang auf Eis inkubiert. Nach
anschließendem zweimaligen Waschen in PBS und Aufsuspendieren der Zellen in PBS
Methoden
34
wurden mit Hilfe des Durchflußzytometers Größe, Granularität und Fluoreszenzintensität
von 10.000 Zellen aufgezeichnet.
Es wurden jeweils parallel Kontrollproben gemessen, die entweder nicht markiert oder mit
entsprechenden Kontrollantikörpern behandelt worden waren. Die Auswertung erfolgte mit
der Software Cellquest®. Tote und aggregierte Zellen wurden mit Hilfe einer Größen- und
Granularitätsvoreinstellung ausgeblendet.
3.5
Bestimmung der intrazellulären Sauerstoffradikalproduktion
Eine typische Funktion von Granulozyten ist die Vernichtung phagozytierter
Mikroorganismen durch Freisetzung von Sauerstoffradikalen (oxidative burst). Diese
Funktion wurde untersucht, indem fluoreszierendes Rhodamin 123 (Fluoreszenz 1, FL-1)
intrazellulär durchflußzytometrisch gemessen wurde. Es entsteht aus dem fluorogenen
Substrat Dihydrorhodamin (DHR) 123 nach Oxidation durch Sauerstoffradikale.
Es wurden 100 µl von 106 Granulozyten/ml mit 20 µl DHR inkubiert. Im Anschluß wurde
1 ml FACS lysing solution (Kitbestandteil Phagoburst®) zur Fixierung der Zellen
hinzugegeben. Die Proben wurden nach Waschen in PBS aufgenommen und mittels
Durchflußzytometrie analysiert.
3.6
Bestimmung der Vitalität intrazellulärer Leishmania major
Um die Vitalität der intrazellulären Parasiten beurteilen zu können, wurden Granulozyten
von nichtphagozytierten freien Leishmanien durch Zellsortierung getrennt und
anschließend in 10% FCS Medium bei 37°C weiter inkubiert, um die intrazelluläre
Abtötung der Parasiten durch die Granulozyten zu ermöglichen. Die Vitalität wurde dann
mittels eines Titrationskulturverfahrens bestimmt.
3.6.1 Titrationskulturverfahren (Limiting dilution)
Zur Untersuchung der Lebendigkeit von L. major im Zellinneren von Granulozyten wurde
das Titrationskulturverfahren angewandt (Laskay, Röllinghoff et al. 1993). Das Prinzip
dieses Verdünnungskulturverfahrens (Limiting dilution, LD) ist, eine Verdünnungsreihe
Methoden
35
einer Leishmanien enthaltenden Lösung anzufertigen, zu inkubieren und zu bestimmen, bis
zu welcher Verdünnung unter Kulturbedingungen noch Parasitenwachstum feststellbar ist.
Während der Inkubationszeit teilen sich lebendige Parasiten, und in Verdünnungsstufen,
die vor Inkubation mindestens einen (bzw. 10, siehe unten) teilungsfähigen Parasiten
enthielten, kann die Teilungsaktivität mikroskopisch nachgewiesen werden.
Die Zellen wurden in eine Zweierverdünnungsreihe (n-te Verdünnung = 2-n) in 96-LochFlachbodenplatten im Dreifachansatz zu je 100 µl Medium gegeben zu Kulturbedingungen
für L. major wie unter 3.1.2 beschrieben. Die Platten wurden dann bei 27°C (s. 3.1.2) für
eine Woche inkubiert, um L. major die Teilung zu ermöglichen. Das Parasitenwachstum
wurde dann für jedes Loch (= jede Verdünnungsstufe) mikroskopisch erfaßt. Die Zahl
lebendiger Leishmanien im Inneren der sortierten Granulozyten wurde dann anhand der
letzten positiven Verdünnungsstufe bestimmt. Die Verdünnungsstufe galt als positiv, wenn
in mindestens zwei der drei Parallelansätze L. major Promastigote nachweisbar waren. Bei
der Berechnung der Ausgangszahl der lebendigen Leishmanien wurde davon ausgegangen,
daß erst ab 10 Promastigoten in einer Vertiefung Wachstum lichtmikroskopisch erfaßt wird
(Solbach, Forberg et al. 1986).
3.6.2 Sortierung nach Größe und Granularität
Granulozyten wurden mit L. major in einem Granulozyten : L. major Verhältnis von 1 : 5
für 3 Stunden bei 37°C in 1 ml Medium mit Zusatz von 20% autologem Serum, 20% FCS
oder Medium allein inkubiert. Die Zellen wurden anschließend gewaschen und in PBS
resuspendiert.
Die
freien
Parasiten
wurden nach
der
Inkubation
mittels
des
Abbildung 5: Selektion von Granulozyten anhand Größe
und Granularität in der Durchflußzytometrie. Alle Zellen, die
innerhalb des gestrichelt markierten Bereiches lagen, wurden
positiv selektiert und aussortiert. Freie Promastigote bilden sich
entsprechend ihrer geringen Größe und Granularität v.a. links
unten im Dot Plot ab.
Methoden
36
Zellsortierapparates (cell sorter) von den Granulozyten abgesondert. Die freien
Promastigoten wurden anhand ihrer geringen Größen- und Granularitätsintensität
identifiziert (Abbildung 5). Zellaggregate sowie Zellen, an deren Oberfläche Leishmanien
lediglich adhärierten, konnten nicht völlig ausgeschlossen werden. Im Anschluß an die
Sortierung wurden die Zellen für 24 Stunden in 10% FCS Medium bei 37°C weiter
inkubiert (s. 3.3.2.1) und anschließend dem Titrationskulturverfahren zugeführt.
3.7
ELISA
Zur Untersuchung von Granulozyten als mögliche Produzenten von Zytokinen wurden die
Konzentrationen des proinflammatorischen Zytokins IL-8 und des antiinflammatorischen
Botenstoffes IL-1ra im Zellüberstand mittels enzymgekoppelten Immunabsorptionstest
(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) gemessen. Der IL-1ra-ELISA wurde gemäß
dem Protokoll des Testkits durchgeführt. Gleiches gilt für den IL-8-ELISA, wobei das
Prinzip sowie die Beschichtung der Platten hier kurz skizziert werden.
Eine 96-Loch-Mikrotiterplatte für ELISA wurde mit 100 µl Fangantikörperlösung (4 µg/ml
Maus anti-human IL-8 Antikörper in PBS) befüllt, die Platte abgedeckt und über Nacht bei
Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluß wurde die Platte dreimal mit Waschpuffer (0,05%
Tween 20 in PBS, pH 7,4) gewaschen. Zur Blockade wurden 300 µl Blockierungspuffer
(1% BSA und 0,05% NaN3 in PBS ) in jede Vertiefung gegeben. Nach einer Inkubation für
60 min bei Raumtemperatur folgte ein weiterer Waschschritt.
Zur Bestimmung des freigesetzten IL-8 wurden 100 µl der IL-8 Standardverdünnung (0;
31,25; 62,5; 125; 250; 500; 1000; 2000 pg/ml rekombinantes humanes IL-8, in
Probenverdünnungspuffer) sowie eine 1:10 Verdünnung der jeweils zu untersuchenden
Zellüberstände in Probenverdünnungspuffer (0,1% BSA, 0,05% Tween 20 in PBS, pH 7,3)
pro Vertiefung im Doppel eingesetzt, die Platte abgedeckt und für 2 h bei Raumtemperatur
inkubiert. Danach wurden die Platten gewaschen (s. oben). Sodann wurden 100 µl
Detektionsantikörper (20 ng/ml biotinylierter Ziege-anti-human IL-8-Antikörper) pro Loch
beigefügt und wie zuvor 2 Stunden lang inkubiert sowie gewaschen. Nun wurden 100 µl
Streptavidin-HRP (1 : 20000 einer 1,25 mg/ml Lösung) in jede Vertiefung gefüllt und die
Platten im Dunkeln für 20 min inkubiert, gewaschen und anschließend 100 µl
Substratlösung (1 : 1 Mischung aus H2O2 und Tetramethylbenzidine) hinzupipettiert. Nach
Methoden
37
mindestens 20 min Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur wurde die Reaktion mit 50
µl Stopplösung (2N H2SO4) beendet.
Die optische Dichte der Lösungen in den einzelnen Vertiefungen wurde mit einem ELISALesegerät bei einer Wellenlänge von 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 570 nm
zweimal gemessen. Aus den beiden Messungen und den Werten der Doppelansätze wurde
das arithmetische Mittel gebildet und schließlich die Konzentration entsprechend der
Eichkurve errechnet.
3.8
RNase Protection Assay (RPA)
Zur Bestimmung des mRNA-Expressionsgrads unterschiedlicher Zytokine wurde der
RNase Protection Assay (RPA) gewählt. Mit diesem Verfahren ist es möglich,
verschiedene mRNA Spezies gleichzeitig zu detektieren und zu quantifizieren.
3.8.1 Isolierung und Analyse von RNA
3.8.1.1 RNA-Extraktion
Aus 5 x 107 Granulozyten pro Ansatz wurde die RNA mittels Phenol-Chloroform
extrahiert (Chomczynski und Sacchi 1987). Dazu wurden die Zellen mittels Denaturing
Solution (Guanidin-, Ammoniumthiocyanat, Natriumacetat) denaturiert, mit gesättigtem
Phenol (Phenol, Glycerol, Natriumacetat) und Chloroform extrahiert und schließlich
mittels Isopropanol gefällt und mit Ethanol gewaschen. Das getrocknete RNA-pellet wurde
in ddH2O aufgenommen und bei 60°C gelöst. Schließlich wurde die RNA-Konzentration
spektralphotometrisch bei 260 nm Wellenlänge bestimmt, wobei eine Einheit optischer
Dichte (O.D.) 40 µg RNA/ml entspricht. Das RNA/Protein-Verhältnis wurde mittels des
folgenden Quotienten abgeschätzt:
RNA / Protein = O.D. bei 260 nm / O.D. bei 280 nm
Die RNA wurde nur dann in den Experimenten verwendet, wenn dieser Quotient >1,8 war.
Methoden
38
3.8.1.2 Analyse der mRNA-Expression mittels RNase Protection Assay
Zum besseren Verständnis soll zunächst das Prinzip des RPA erklärt werden. Der Test
gliedert sich in vier Teile: 1. Synthese der Sonden entsprechend dem Template Set; 2.
RNA-Präparation und Hybridisierung; 3. RNase Behandlung; 4. Gelauftrennung der
Hybridisierungsprodukte.
Das Template Set enthält die aus Plasmiden isolierte c-Desoxyribonukleinsäure (cDNS
bzw. cDNA), entlang der mit Hilfe der T7 RNA Polymerase 32P markierte anti-sense RNA
synthetisiert wird. Ein anschließender DNase-Verdau stoppt die Reaktion ab. Es folgt dann
eine Phenol-Chloroform-Extraktion der gewonnenen Sonden. Nun kann die zu
untersuchende RNA präpariert (s. 3.8.1.1) und über Nacht mit der markierten anti-sense
RNA (im Überschuß) hybridisiert werden. Es schließt sich die RNase-Behandlung an,
welche die Spezifität der Hybridisierung sicherstellt: wo Fehlpaarungen zur Aufhebung
des Doppelstrangs führen, greift die RNase an, freie RNA wird eliminiert. Nach einem
folgenden Proteinase-K-Verdau werden mittels Phenol-Chloroform die Hybride extrahiert
und schließlich einer Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen.
Die Länge der Sonden ist für jedes Zytokingen unterschiedlich und bekannt. Somit ergeben
sich entsprechende Banden. Je nach Menge der Hybride ist am Ort der Banden im Gel
Radioaktivität detektierbar, die mittels Phosphoimaging quantitativ erfaßt werden kann.
Ausgehend davon, daß es in jeder Zelle Gene gibt, die unabhängig von jeglicher
Aktivierung dieser Zelle konstant exprimiert werden, sog. Housekeeping Genes, kann die
RNA-Menge im Verhältnis zum Housekeeping Gene ausgedrückt werden. So lassen sich
dann verschiedene Gene und Proben vergleichen.
Der RNase Protection Assay wurde gemäß Instruction Manual, 5th Edition, April 1998
(RiboQuant® Multi-Probe RNase Protection Assay System) mit den Template Sets hck-2
und hck-5 durchgeführt. Hck-2 beinhaltet anti-sense RNA-Sonden, die mit humaner
mRNA hybridisieren können, welche die humanen Cytokine Ltn (Lymphotactin),
RANTES (regulated upon activation, normal T-cell expressed, and presumably secreted),
IP-10, MIP-1β, MIP-1α, MCP-1, IL-8, I-309, L32, oder GAPDH codiert; für hck-5 gilt
Entsprechendes bezüglich IL-12p35,IL-12p40, IL-10, IL-1α, IL-1β, IL-1Ra, IL-6, IFNγ,
Methoden
L32 und GAPDH. Das Gel wurde vakuumgetrocknet und im Anschluß auf einem Kodak
Film exponiert. Zur quantitativen Erfassung wurde eine Phosphoimaging Platte ebenfalls
aktivitätsabhängig exponiert und eingelesen.
39
Ergebnisse
40
4 Ergebnisse
In den folgenden funktionellen Experimenten wurde sowohl Kulturmedium mit autologem
Spenderplasma als auch -serum eingesetzt. Die Beobachtungen der Plasmaansätze
unterschieden sich nicht signifikant von denen der Serumansätze. Deshalb wird im
folgenden vereinheitlichend von Serum gesprochen.
4.1
Die Interaktion neutrophiler Granulozyten mit Leishmania major in vitro
Die Bedeutung von Granulozyten für die Abwehr extrazellulärer Erreger ist hinreichend
bekannt. So gut wie nicht untersucht ist ihre Funktion bei Infektion mit intrazellulär
wachsenden Mikroorganismen. Am Beispiel der Interaktion mit L. major sollen
wesentliche Merkmale dieser Interaktion beschrieben werden.
4.1.1 Die etablierte Isolierungsmethode liefert reine, nichtaktivierte
Granulozyten
Abbildung 6: Aufgereinigte Granulozyten. Granulozyten wurden wie in 3.2.1 beschrieben
aufgereinigt, und anschließend wurde ein Zytozentrifugenpräparat nach Giemsa gefärbt.
Ergebnisse
41
Die lichtmikroskopisch kontrollierte Reinheit der isolierten Granulozyten betrug über 99%
(Abbildung 6, S. 40). Die durchflußzytometrische Analyse der Oberflächenmarker für
Aktivierung, CD62-L und CD63, belegte, daß die Zellen durch die Aufreinigung nicht
aktiviert wurden (s. Abschnitt 4.1.6 auf Seite 46, Abbildung 11). Die folgenden Ergebnisse
dieser Arbeit wurden somit weder durch verunreinigende Zellen noch durch eine
Aktivierung der Zellen bereits vor Versuchsbeginn verfälscht. Einen zusätzlichen Beweis
der Reinheit der isolierten Granulozyten stellt die fehlende Nachweisbarkeit der mRNA
von IL-6 dar (4.2.4, S. 56), einem typischen Zytokin monozytärer Phagozyten, welches
normalerweise in stimulierten Monozyten- aber nicht in Granulozytenpräparationen
nachgewiesen werden kann (Bazzoni und Beutler 1996).
4.1.2 Granulozyten phagozytieren L. major
Es ist bekannt, daß Makrophagen L. major phagozytieren (Solbach und Laskay 2000). In
den ersten Experimenten dieser Arbeit sollte gezeigt werden, daß auch Granulozyten L.
major aufnehmen. Dazu wurden Granulozyten mit L. major koinkubiert. Es wurde
gefunden, daß Granulozyten Leishmanien aufnehmen (Abbildung 7).
Vakuole
{
L. major
Abbildung 7: Granulozyten nach Inkubation mit L. major. Granulozyten in Medium mit 20%
FCS-Zusatz wurden mit Leishmanien koinkubiert (Granulozyten : L. major = 1 : 5, T=37°C, t=90
min). Zur Verdeutlichung ist links ist eine Zelle dargestellt, die nicht als L. major-positiv gewertet
wurde, da L. major als Promastigote lediglich mit der Zelle assoziiert erscheint, aber nicht sicher
intrazellulär liegt. In der Mitte ist ein L. major-positiver Granulozyt abgebildet mit einem
internalisierten Erreger (Amastigote) nach Aufnahme, rechts eine Zelle nach Aufnahme von mehr
als drei Parasiten.
Ergebnisse
42
4.1.3 Granulozyten besitzen Mechanismen für die serumabhängige sowie
die serumunabhängige Phagozytose von L. major.
Die folgenden Experimente sollten das Aufnahmeverhalten in einer Kinetik darstellen und
weiter untersuchen, ob Opsonine für die Phagozytose von Bedeutung sind. Dazu wurden
Granulozyten mit L. major Promastigoten in Zellkulturmedium mit unterschiedlichen
Zusätzen inkubiert (Abbildung 8). Die Zusätze unterschieden sich u.a. in der An- oder
Abwesenheit von Faktoren des Komplementsystems, die wesentliche Opsonine darstellen.
In allen Ansätzen konnte eine Aufnahme von Leishmanien beobachtet werden. Allerdings
zeigten
sich
unter
den
unterschiedlichen
Inkubationsbedingungen
verschiedene
Aufnahmekinetiken.
% PMN mit intrazellulären Leishmanien
In der Gegenwart frischen Serums mit intaktem Komplementsystem, nahm der Großteil
20% Serum
20% hi-Serum
20% hi-FCS
ohne Serum
75
50
25
10
30
90
180
Zeit [min]
Abbildung 8: Kinetik der Phagozytose von L. major Promastigoten durch Granulozyten
in vitro. Granulozyten wurden mit L. major Promastigoten bei 37°C in einem Granulozyten :
L. major Verhältnis von 1 : 5 in Medium mit Zusatz von entweder 20% frischem autologem
Spenderserum oder 20% hitzeinaktiviertem („hi-“) Serum oder 20% hitzeinaktiviertem FCS
oder ohne Serumzusatz inkubiert. Der Prozentsatz von Granulozyten, die mindestens einen
intrazellulären Parasiten aufwiesen, wurde zu den angegebenen Zeitpunkten mikroskopisch
an nach Giemsa gefärbten Zytozentrifugenpräparaten bestimmt. Die gezeigten Daten
stammen aus einem Experiment, welches repräsentativ für fünf durchgeführte Experimente
ist.
Ergebnisse
43
der Granulozyten innerhalb weniger Minuten L. major auf (Abbildung 8). Dieser Anteil
der Granulozyten mit intrazellulären Parasiten stieg während der folgenden dreistündigen
Inkubation lediglich geringfügig weiter an.
Hitzeinaktivierung des Serums führte zu deutlich langsamerer Aufnahme von L. major
durch Granulozyten. Innerhalb der ersten 10 Minuten enthielten höchstens 10% der Zellen
Leishmanien. Jedoch nahmen über 50% der Zellen während der folgenden Inkubation über
3 Stunden Parasiten auf (Abbildung 8). Im Ansatz mit hitzeinaktiviertem FCS nahmen
knapp 30% der Granulozyten Leishmanien innerhalb von 3 Stunden auf.
Um zu untersuchen, ob Granulozyten auch Mechanismen für die opsoninunabhängige,
direkte
Erkennung
und
Aufnahme
von
Leishmanien
besitzen,
wurden
Phagozytoseexperimente in Medium ohne Serumzusatz durchgeführt. Unter serumfreien
Bedingungen waren 10% der Granulozyten dazu in der Lage, innerhalb von 3 Stunden
Leishmanien zu phagozytieren (Abbildung 8).
Diese Versuche zeigen, daß Granulozyten in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des
sie umgebenden Mediums unterschiedliche Mechanismen zur Phagozytose von L. major
verwenden. In Anwesenheit hitzelabiler Serumfaktoren kam es sehr schnell zur Aufnahme,
aber auch in Abwesenheit von Serum nahmen Granulozyten Leishmanien auf.
Hitzeinaktivierung von Serumfaktoren führte zu verlangsamter Aufnahme. Dies weist
darauf hin, daß Granulozyten sowohl über Mechanismen zur opsoninabhängigen als auch
zur opsoninunabhängigen Phagozytose von L. major Promastigoten verfügen.
4.1.4 Der Komplementrezeptor CR3 (Mac-1) ist von Bedeutung bei der
serumunabhängigen wie auch der serumabhängigen Aufnahme von L.
major durch Granulozyten.
Wie gezeigt, reduzierte die Hitzeinaktivierung des Serums die Aufnahmerate von L. major
innerhalb der ersten Minuten auf ein Minimum (Abbildung 8, S. 42). Setzt man das Serum
einer Hitzebehandlung mit 56°C aus, führt dies zur Inaktivierung hitzelabiler
Serumfaktoren, darunter Komponenten des Komplementsystems. Dies könnte dazu führen,
daß nicht genügend C3 an den entsprechenden Rezeptor CR3 auf Granulozyten binden
Ergebnisse
44
kann. Aus diesem Grunde untersuchten wir, ob CR3 an der schnellen serumvermittelten
Aufnahme von L. major durch Granulozyten beteiligt ist. Dazu wurde CR3 auf der
Oberfläche von Granulozyten in vitro mittels anti-CD11b mAk blockiert. Dies führte
annähernd zur Halbierung der Phagozytoserate von L. major durch Granulozyten im
Vergleich zu den mit Kontrollantikörper behandelten Granulozyten (Abbildung 9 A).
Neben der Vermittlung der Aufnahme mit Komplement opsonisierter Bakterien ist der
CR3 auch entscheidend an der opsoninunabhängigen Bindung von Mikroorganismen an
Phagozyten beteiligt (Wright, Weitz et al. 1988; Talamas-Rohana, Wright et al. 1990). Aus
diesem Grund wurde der Effekt von anti-CR3 mAk auch auf die komplementunabhängige
Aufnahme von L. major durch Granulozyten analysiert, d.h. in Abwesenheit von Serum. In
vitro-Blockade des CR3 führte in Medium ohne Serum zu einer Reduktion der Aufnahme
von L. major durch Granulozyten um 30% bis 70% (Abbildung 9 B).
Diese Befunde zeigen, daß der Komplementrezeptor Typ 3 an der Vermittlung der
Aufnahme von Leishmanien durch Granulozyten wesentlich beteiligt ist. Die Phagozytose
konnte durch anti-CR3 mAk jedoch nicht komplett blockiert werden. Dies spricht dafür,
daß weitere Moleküle des Serums an der Aufnahme beteiligt sind.
B
80
Kontrollantikörper
anti-CR3 mAb
% Granulozyten
mit intrazellulären Leishmanien
% Granulozyten
mit intrazellulären Leishmanien
A
40
0
20
Kontrollantikörper
anti-CR3 mAb
10
0
Experiment I
Experiment II
20% Serum
Experiment I
Experiment II
ohne Serum
Abbildung 9: Auswirkung der Rezeptorblockade durch anti-CR3 mAk auf die Aufnahme von L.
major durch Granulozyten. Granulozyten wurden mit anti-CR3 mAk für 20 min bei 37°C präinkubiert,
die Kontrollansätze wurden mit einem Kontrollantikörper inkubiert. Die Granulozyten wurden dann für 2
Stunden mit L. major Promastigoten in einem Granulozyten : L. major Verhältnis von 1 : 5 bei 37°C in
Medium mit 20% frischem Serum (A) bzw. ohne Zusatz von Serum (B) inkubiert. Die Aufnahme der
Parasiten wurde mikroskopisch durch die Auswertung nach Giemsa gefärbter Zytozentrifugenpräparate
erfaßt.
Ergebnisse
45
4.1.5 Opsonisierung mittels Mannanbindendem Lektin (MBL) trägt nicht zur
serumvermittelten Aufnahme von L. major durch Granulozyten bei.
Ein Kandidat für ein solches Molekül ist das hitzelabile Mannanbindende Lektin (MBL),
das den Lektinaktivierungsweg von Komplement vermittelt (Thiel, Vorup-Jensen et al.
1997; Walport 2001).
Die mögliche Beteiligung von MBL wurde in zwei Versuchsreihen untersucht. Zuerst
wurde die Aufnahme von L. major durch Granulozyten in der Gegenwart von Serum
gesunder Spender im Vergleich zu Serum MBL-defizienter Spender verglichen. Abbildung
10 zeigt keine wesentlichen Unterschiede zwischen Normalserum und Serum mit niedriger
MBL-Konzentration. Um die Möglichkeit auszuschließen, daß die evt. vorhandene geringe
Restmenge an MBL ausreichend ist, eine MBL-abhängige Aufnahme zu vermitteln, wurde
serumfreiem Medium aufgereinigtes MBL zugesetzt. Die Anwesenheit von MBL im
Kulturmedium führte nicht zu einer erhöhten Aufnahme von L. major durch Granulozyten
(Abbildung 10). Somit sind zusätzlich zu Komplementfaktoren, die an CR3 binden,
A
Normalserum
% Granulozyten
mit intrazellulären Leishmanien
% Granulozyten
mit intrazellulären Leishmanien
MBL defizientes Serum
B
60
40
20
0
ohne MBL
mit MBL
60
40
20
0
1
2
3
4
ohne Serum
20% hi-FCS
Abbildung 10: Auswirkung von MBL auf die Aufnahme von L. major durch Granulozyten.
Granulozyten wurden für 10 min mit L. major Promastigoten in einem Granulozyten : L. major
Verhältnis von 1 : 5 bei 37°C inkubiert. A) Koinkubation in Medium mit Zusatz von 20%
Normalserum zweier gesunder Spender („) mit 2.3 µg/ml MBL (Serum 1) bzw. 2.8 µg/ml MBL
(Serum 2), oder in Medium mit Zusatz von 20% Serum zweier Patienten mit MBL-Defizienz (†) mit
16 ng/ml (Serum 3, Allotyp LYPB/HYPD) bzw. 12 ng/ml MBL (Serum 4, Allotyp LXPA/LYPB). B)
Koinkubation ohne (†) bzw. mit 3.3 µg/ml aufgereinigtem MBL („) in Medium ohne Serumzusatz
oder mit Zusatz von 20% hitzeinaktiviertem FCS (hi-FCS). Die Daten stammen aus einem
repräsentativen von zwei durchgeführten Experimenten.
Ergebnisse
46
weitere und von MBL verschiedene hitzelabile Serumfaktoren an der serumvermittelten
Phagozytose von L. major durch Granulozyten beteiligt.
4.1.6 Nur die opsoninabhängige Aufnahme von Leishmanien aktiviert die
Granulozyten.
Nachdem gezeigt war, daß Granulozyten prinzipiell zur Aufnahme von Leishmanien in der
Lage sind, untersuchten wir, ob mit Parasiten infizierte Granulozyten auch antimikrobielle
Effektormechanismen aktivieren können. Zunächst wurde die Oberflächenexpression von
104
104
103
102
101
102
103
104
101
102
103
104
102
103
104
103
3%
101
96%
100
101
8%
100
100
101
102
103
91%
102
102
100
101
7%
100
+ L. major
103
92%
12%
100
8%
100
104
103
104
102
104
101
100
100
7%
100
87%
101
101
101
102
102
103
91%
∅ L. major
CD62-L
20% Serum
104
104
20% hi-FCS
92%
103
A
ohne Serum
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
CD66b
B
ohne Serum
260
246
CD66b (mittlere Fluoreszenz)
20% hi-FCS
20% Serum
401
474
376
1306
∅ L. major
+ L. major
Abbildung 11: Auswirkungen von L. major auf die Oberflächenexpression von CD62-L und
CD66b auf Granulozyten. Granulozyten wurden für 90 min mit L. major Promastigoten in einem
Granulozyten : L. major Verhältnis von 1 : 5 bei 37°C in Medium mit Zusatz von entweder 20%
frischem Spenderserum oder 20% hitzeinaktiviertem FCS oder ohne Serumzusatz inkubiert. Die
Granulozyten wurden anschließend mit FITC-konjugiertem mAk gegen CD66b und mit PEkonjugiertem mAk gegen CD62-L markiert und mittels Durchflußzytometrie analysiert. Gemäß der
Quadranteneinteilung bezeichnen die Prozentwerte rechts oben die CD62-L-positiven Granulozyten,
die Prozentzahlen rechts unten die CD62-L-negativen (A). Die Werte der mittleren Fluoreszenz der
CD66b-Färbung sind unter B dargestellt.
Ergebnisse
CD62-L
und
CD66b
auf
Granulozyten
47
analysiert.
CD62-L
gilt
als
Standardaktivierungsmarker für Granulozyten. Nichtaktivierte Zellen sind CD62-L positiv,
während aktivierte Zellen CD62-L negativ sind. Umgekehrt wird CD66b nach Aktivierung
auf höherem Niveau exprimiert. Die Daten in Abbildung 11 A (obere Reihe, „Ø L. major“,
S. 46) zeigen, daß in der Tat die in den Experimenten eingesetzten Granulozyten nicht
aktiviert waren, da sie zu rund 90% CD62-L positiv waren, bei gleichzeitig relativ
niedriger Expression von CD66b (Abbildung 11 A und B, S. 46).
Die Koinkubation der Granulozyten mit L. major führte in der Gegenwart von
Spenderserum zur Aktivierung der Granulozyten (Verlust von CD62-L-Expression,
verstärkte Ausprägung von CD66b, Abbildung 11, S. 46) zeigen konnten. Im Gegensatz
hierzu führte die Koinkubation von L. major mit Granulozyten in der Gegenwart
hitzeinaktivierten FCS oder in serumfreiem Medium nicht zur Zellaktivierung. Die
Granulozyten behielten die starke CD62-L-Expression bei (Abbildung 11 A), die von
CD66b (Abbildung 11 B) war nicht erhöht. Der ausgeprägte Aktivierungsgrad korrelierte
in den Serumansätzen mit der hohen Zahl phagozytierter Leishmanien, die niedrige
Aufnahmerate in Abwesenheit von Serumfaktoren mit der ausbleibenden Aktivierung der
Granulozyten. Die Daten in Abbildung 11 zeigen somit, daß die Aufnahme von L. major
nur dann zur Neutrophilenaktivierung führte, wenn Serumfaktoren als Opsonine zur
Verfügung standen.
4.1.7 Die opsoninabhängige Aufnahme von Leishmanien führt zur
Sauerstoffradikalproduktion in Granulozyten.
Nach Aufnahme von Bakterien durch Granulozyten kommt es in der Regel zur Produktion
reaktiver Sauerstoffintermediate (oxidative burst), die zur Vernichtung der phagozytierten
Bakterien führt. Um zu überprüfen, ob dies auch in der Infektion mit eukaryonten Erregern
wie L. major der Fall ist, wurde nach Koinkubation von Granulozyten mit L. major die
Produktion intrazellulärer Sauerstoffradikale mittels Durchflußzytometrie gemessen. In der
Gegenwart frischen Serums reagierten gut 40% der Zellen mit einer oxidativen Antwort
auf die Stimulation mit Promastigoten (Abbildung 12, S. 48). Nur rund 15% der Zellen
dagegen zeigten eine erhöhte Sauerstoffradikalproduktion, wenn dem Medium
hitzeinaktiviertes Serum zugesetzt wurde. In Abwesenheit von Serum unterblieb die
oxidative Antwort nahezu gänzlich (Abbildung 12).
Ohne Serum
20% hi-FCS
20% Serum
0.2 %
0%
0.1 %
2%
14 %
43 %
+ L. major
(O2-Radikalproduktion)
48
∅ L. major
FL-1
Ergebnisse
SSC
Abbildung
12:
Auswirkungen
von
L.
major
auf
die
Induktion
der
Sauerstoffradikalproduktion durch Granulozyten. Granulozyten wurden bei 37°C mit L. major
Promastigoten in einem Granulozyten : L. major Verhältnis von 1 : 5 für 10 min in Medium
inkubiert mit Zusatz von entweder 20% frischem Spenderserum oder 20% hitzeinaktiviertem FCS
oder ohne Serumzusatz. Die Sauerstoffradikalproduktion durch Granulozyten wurde untersucht
mittels des fluorogenen Substrats Dihydrorhodamin 123, welches nach Interaktion mit
Sauerstoffradikalen zu einem fluoreszierendem Produkt oxidiert wird und durchflußzytometrisch
(FL-1) quantifiziert werden kann. In der linken oberen Ecke ist der Prozentteil der
sauerstoffradikalpositiven Zellen angegeben. Zur Bestimmung des Schwellenwertes in FL-1, ab
dem Granulozyten als ‚burst-positiv’ galten, dienten mit Phorbol-12-myristyl-13-azetat (PMA)
stimulierte Granulozyten (Phagoburst®-Protokoll), in denen zu 99% - 100% die
Sauerstoffradikalproduktion induziert wird. Im dargestellten Experiment resultierte als
Schwellenwert eine relative Fluoreszenz von 103.
4.1.8 Der oxidative burst tötet Leishmanien ab.
Es stellte sich anschließend die Frage, welche Konsequenz die Induktion der
Sauerstoffradikalproduktion von Granulozyten für die Parasiten hat. Zur Beantwortung
dieser Frage wurde die Lebendigkeit der intrazellulären Leishmanien untersucht. Nach
zweistündiger Koinkubation von Granulozyten mit L. major (im Verhältnis 1 : 5) wurden
die freien, nicht phagozytierten Parasiten von Granulozyten mittels FACS-Sortierung
getrennt. Anschließend wurde die Zahl der lebendigen Parasiten mittels des LimitingDilution-Verfahrens (3.6.1, S. 34) bestimmt. In der Gegenwart von Serum war der Anteil
der lebendigen Leishmanien sehr gering. Diese wenigen Parasiten wurden nach Inkubation
Ergebnisse
49
der infizierten Granulozyten bei 37°C für einen weiteren Tag nahezu vollständig eliminiert
(Abbildung 13). In der Gegenwart von hitzeinaktiviertem FCS war der Anteil der
lebendigen Leishmanien hoch, und 50% der intrazellulären Parasiten waren nach weiterer
Inkubation der infizierten Granulozyten für einen Tag noch lebendig (Abbildung 13).
Obwohl sich nur eine niedrige Aufnahme von L. major unter serumfreien Bedingungen
fand, war der Grad Lebendigkeit nach eintägiger Fortinkubation bei 37°C hoch (Abbildung
13).
Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, daß die Mehrheit der Parasiten, die in Anwesenheit von
Serum aufgenommen worden waren, sofort von den Granulozyten getötet wurde. Die
wenigen überlebenden Parasiten wurden dann innerhalb eines weiteren Tages nahezu
vollständig eliminiert. Dagegen überlebten die intrazellulären Leishmanien in Ansätzen mit
hitzeinaktiviertem Serum oder in Medium ohne Serumzusatz.
Anzahl lebendiger Leishmanien in 104 Granulozyten
Abbildung 13: Die Lebendigkeit intrazellulärer Leishmanien in Granulozyten.
Granulozyten wurden für 2 Stunden
mit L. major Promastigoten in einem
Granulozyten : L. major Verhältnis
von 1 : 5 bei 37°C in Medium mit
Zusatz von entweder 20% frischem
Spenderserum
oder
20%
hitzeinaktiviertem FCS oder ohne
Serumzusatz inkubiert. Granulozyten
2000
wurden anschließend von nicht
phagozytierten Promastigoten mittels
FACS-Sortierung
getrennt,
anschließend in 10% FCS Medium
bei 37°C für 24 h weiter inkubiert, um
die intrazelluläre Abtötung der
Parasiten durch die Granulozyten zu
ermöglichen. Die Vitalität von L.
1000
major wurde dann mittels eines
Titrationskulturverfahrens (Limiting
Dilution, LD) bestimmt (s. 3.6.1). Die
Ordinate zeigt die aus dem LDVerfahren berechnete Anzahl der
lebendigen Parasiten pro 104
Granulozyten (Mittelwert aus 3
parallelen Ansätzen (± SD)).
ohne Serum 20% hi-FCS 20% Serum
Ergebnisse
50
3
2
1
Abbildung 14: Unterschied zwischen nicht apoptotischen (links) und apoptotischen (rechts)
Granulozyten. (1) Chromatin, bei Apoptose kondensiert; (2) Kernbrücken, bei Apoptose
aufgehoben; (3) Zelldurchmesser, bei Apoptose vermindert
4.1.9 In Abwesenheit von Serumfaktoren zögert Leishmania major die
Apoptose der Granulozyten hinaus.
Die Lebenszeit von Granulozyten im Körper beträgt maximal ein bis zwei Tage (Lloyd
und Oppenheim 1992). In vivo weisen die Zellen bereits nach 24 Stunden Zeichen der
Apoptose auf (Savill, Wyllie et al. 1989). In vitro zeigen Granulozyten schon nach
wenigen Stunden in Zellkulturmedium Merkmale der Apoptose (Abbildung 14, rechts).
Bei den mikroskopischen Auswertungen der bisherigen Experimente war wiederholt
aufgefallen, daß in Anwesenheit von Leishmanien nach wenigen Stunden dagegen kaum
morphologisch apoptotische Granulozyten zu finden waren (Abbildung 15). Um dies
ohne L. major
mit L. major
Abbildung 15: Das Apoptoseverhalten von Granulozyten in Medium mit und ohne L. major.
Granulozyten wurden allein bzw. mit L. major Promastigoten in einem Granulozyten : Leishmanien
Verhältnis von 1 : 5 für 12 Stunden bei 37°C in Medium inkubiert, anschließend die nach Giemsa
gefärbten Präparate fotografiert.
Ergebnisse
ohne L. major
% apoptotische Granulozyten
100
51
Abbildung 16: Apoptoserate infizierter und
nicht infizierter Granulozyten. Granulozyten
wurden ohne (□) bzw. mit (■) L. major für 24
Stunden bei 37°C in einem Granulozyten : L.
major Verhältnis von 1 : 5 in Medium mit Zusatz
von 20% hitzeinaktiviertem FCS (hi-FCS)
inkubiert. An
nach Giemsa gefärbten
Zytospinpräparaten wurde mikroskopisch der
Prozentsatz von Granulozyten bestimmt, die
morphologische Apoptosemerkmale aufwiesen.
Dargestellt sind drei voneinander unabhängige
Experimente (Exp. I-III), es wurden jeweils
mindestens 100 Zellen gezählt.
mit L. major
80
60
40
20
0
Exp. I
Exp. II
Exp. III
20% hi-FCS
weiter zu untersuchen, wurden Granulozyten in unterschiedlichen Ansätzen mikroskopisch
auf morphologische Charakteristika der Apoptose untersucht.
Nach 24 Stunden Inkubation in Medium mit Zusatz von 20% hitzeinaktiviertem FCS
zeigten Granulozyten ohne L. major zu 86% (± 1%) morphologische Merkmale der
Apoptose. Dagegen reduzierte sich die Apoptoserate nach Koinkubation der Granulozyten
mit Leishmanien auf 11% bis 54% (Abbildung 16).
Die dargestellten Ergebnisse zeigen, daß Leishmanien offenbar in das Apoptoseprogramm
der sonst kurzlebigen Granulozyten eingreifen und deren Eintreten in die Apoptose
hinauszögern.
4.2
Der
Einfluß
der
Leishmanien
auf
die
Zytokinsekretion
durch
Granulozyten
Die bisher gezeigten Ergebnisse haben belegt, daß Granulozyten Leishmanien aufnehmen
und dies Konsequenzen für die Zellfunktionen der Granulozyten hat, wie etwa für die
Produktion von Sauerstoffradikalen oder die Veränderung des Apoptoseverhaltens. In den
folgenden Experimenten ging es darum zu untersuchen, wie die Zytokinproduktion durch
die Infektion verändert wird.
Ergebnisse
52
4.2.1 L. major induziert die Bildung proinflammatorischer Zytokine durch
Granulozyten.
Es ist bekannt, daß die frühe entzündliche Reaktion des infizierten Gewebes für die
Ausbildung einer spezifischen Immunantwort auf L. major bestimmend ist (Solbach und
Laskay 2000). Granulozyten bilden den Großteil des frühen entzündlichen Infiltrats. Sie
sind zur Produktion verschiedener Zytokine fähig (Cassatella 1999) und spielen somit eine
mögliche Rolle bei der Entwicklung einer spezifischen Immunantwort. Um dies zu
untersuchen,
wurde
die
durch
L.
major
induzierte
Erzeugung
pro-
bzw.
antiinflammatorischer Zytokine durch Granulozyten geprüft.
Zunächst wurden die Sekretion sowie die mRNA-Expression des proinflammatorischen
chemotaktischen Zytokins (Chemokin) IL-8 untersucht. Dazu wurden Granulozyten mit
und ohne L. major für 2 bzw. 24 Stunden inkubiert. In Medium ohne Zusatz oder mit
hitzeinaktiviertem FCS blieb die Sekretion von IL-8 nach 2 Stunden mit und ohne L. major
mit unter 80 pg/ml niedrig (Tabelle 3, obere Zeilen, links und Mitte), in der Gegenwart von
Serum lag sie mit bis zu 211 pg/ml höher (Tabelle 3, obere Zeilen, rechts). Nach 24
Stunden ließ sich im Kulturüberstand in Gegenwart von L. major innerhalb aller drei
Ansatzgruppen eine deutliche Steigerung des Gehalts an IL-8 nachweisen (Tabelle 3,
untere Zeilen). Am deutlichsten war diese Steigerung in der Gegenwart von Serum mit
einer Steigerung auf über 3400 pg/ml in den Ansätzen mit L. major gegenüber den 24Stunden-Kontrollen ohne L. major (maximal 85 pg/ml, Tabelle 3, untere Zeilen, rechts).
Im FCS-Ansatz war diese Steigerung ebenfalls deutlich (Tabelle 3, Mitte), in der Gruppe
IL-8 Gehalt in pg/ml im Kulturüberstand von Granulozyten in Medium
Inkubationszeit
2 Stunden
24 Stunden
Exp I
Exp II
Exp III
Exp IV
ohne Serum
+L. major
∅
∅
2
2
18
41
72
2
47
65
3
17
283
349
mit 20% hi-FCS
+L. major
11
52
1892
2433
∅
85
2
25
85
mit 20% Serum
+L. major
211
97
3994
3438
Tabelle 3: L. major stimuliert die Sekretion von IL-8 durch Granulozyten. Granulozyten
wurden mit L. major Promastigoten für 2 und 24 Stunden bei 37°C in einem Granulozyten : L.
major Verhältnis von 1 : 5 in Medium ohne Zusatz oder mit Zusatz von entweder 20%
hitzeinaktiviertem FCS oder 20% frischem Spenderserum inkubiert. Der IL-8 Gehalt des
Kulturüberstands wurde mittels ELISA bestimmt.
Ergebnisse
53
mit Medium ohne Zusatz blieb der gemessene Gehalt von IL-8 im Kulturüberstand auch in
Anwesenheit von Leishmanien mit unter 350 pg/ml vergleichsweise niedrig (Tabelle 3,
links).
Dieses beobachtete Sekretionsverhalten der Granulozyten zeigt, daß innerhalb von 24
Stunden die Freisetzung von IL-8 durch L. major induziert wird. Dies ist insbesondere in
der Gegenwart von Serum der Fall.
Es wäre möglich, daß die Dauer der Proteinbiosynthese von IL-8 ursächlich für diese
Latenzzeit ist. Deshalb wurde untersucht, ob L. major die IL-8-Produtkion auch auf
mRNA-Ebene stimuliert.
Dazu wurden Granulozyten für 3 Stunden mit bzw. ohne L. major inkubiert. Im Anschluß
daran wurde die RNA der Zellen isoliert, parallel auch RNA von frisch isolierten
Granulozyten ohne Inkubation. Die RNA wurde schließlich mittels RNase Protection
Assay (RPA) untersucht, einem semiquantitativem Verfahren, mit welchem mRNASequenzen wie z.B. von IL-8 mittels einer radioaktiv markierten Sonde spezifisch
nachgewiesen werden können (3.8, S. 37). Sowohl in frischen als auch in inkubierten
Granulozyten fand sich IL-8-mRNA (Abbildung 17, S. 54). Zur relativen Quantifizierung
wurden die detektierten Aktivitäten von IL-8 mit der jeweiligen Aktivität von L32
verglichen, einem Gen, dessen Expression konstant angenommen wird (housekeeping
gene). Es zeigte sich, daß sich die detektierten mRNA-Mengen von IL-8 für Granulozyten
nach Koinkubation mit und ohne Leishmanien kaum voneinander unterschieden und auch
ohne Inkubation die gleiche IL-8-mRNA-Menge nachzuweisen war (Abbildung 17). Somit
führt die Koinkubation von Granulozyten mit L. major zur Sekretion präformierten IL-8.
IL-1 ist ein weiteres proinflammatorisches Zytokin, das wie IL-8 u.a. chemotaktisch auf
Neutrophile wirkt. Im Gegensatz zum hauptsächlich membrangebundenen IL-1α wird IL1β sezerniert. Die Produktion von IL-1β-mRNA wurde parallel mit der von IL-8
untersucht.
Ergebnisse
54
IL-1β
MIP-1β
IL-1ra
MIP-1α
IL-8
L32
Stunden
L. major
0
Ø
3
Ø
PMN
3
+
L32
0
Ø
3
Ø
3
+
PMN
Abbildung 17: Zytokingenexpression von Granulozyten nach Inkubation mit L. major.
Granulozyten wurden mit bzw. ohne L. major Promastigoten für 0 und 3 Stunden bei 37°C in
einem Granulozyten : L. major Verhältnis von 1 : 5 in Medium mit Zusatz von 20%
hitzeinaktiviertem FCS inkubiert. Die Zytokingenexpression wurde mittels RNase-Protection-Assay
(RPA) untersucht. Als Mengenbezug diente das Housekeeping Gen L32. Zu diesem sind die
einzelnen Zytokinbanden in Bezug zu setzen: obwohl die IL-8-Bande nach dreistündiger
Inkubation mit L. major (ganz rechts) absolut schwächer ist als die der Ansätze ohne Inkubation
mit L. major (links daneben) so ist der Quotient aus den Grauwerten von IL-8 und L32 desselben
Ansatzes größer als in den Ansätzen ohne L. major. Die absoluten Zahlen wurden mittels der
Phosphoimaging Software TINA 2.0® ermittelt (nicht dargestellt).
Im Gegensatz zu IL-8 war in der RNA nichtinkubierter Granulozyten keine mRNA von IL1β zu detektieren (Abbildung 17). Nach 3 stündiger Inkubation ohne L. major wurde IL1β-mRNA nachgewiesen, in Gegenwart von Leishmanien war die Aktivität zudem deutlich
erhöht (Abbildung 17).
Dies bedeutet, daß Leishmanien die Produktion von IL-8 mRNA durch Granulozyten nicht
induzieren, sondern daß IL-8-mRNA konstitutiv in Granulozyten vorliegt. Dagegen liegt
die IL-1β-mRNA nicht konstitutiv vor, sondern wird durch L. major induziert. Somit
wurde nachgewiesen, daß L. major auf zwei unterschiedlichen Wegen die Kommunikation
von Granulozyten mit dem Immunsystem beeinflußt: erstens können Leishmanien eine
Steigerung der Sekretion eines Proteins, wie im Falle von IL-8 gezeigt, bewirken, und
zweitens wird die Proteinbiosynthese auf mRNA-Ebene stimuliert, wie z. B. im Falle von
IL-1β.
Ergebnisse
55
4.2.2 L. major induziert die Produktion von mRNA der Chemokine MIP-1α
und MIP-1β, aber nicht von Ltn, RANTES, IP-10, MCP-1 und I-309.
Zur genaueren Beschreibung der Rolle von Granulozyten als Produzenten chemotaktischer
Zytokine wurde das Spektrum der untersuchten Chemokin-mRNA erweitert. Dazu wurde
analog zur mRNA-Untersuchung von IL-8 und IL-1β aus Granulozyten direkt nach
Aufreinigung bzw. nach 3 stündiger Koinkubation mit und ohne Leishmanien mRNA
isoliert und mittels RPA analysiert.
Die mRNA der Chemokine MIP-1α und MIP-1β wurde nicht konstitutiv exprimiert. Eine
leichte Expression der Zytokin-mRNA war jedoch nach dreistündiger Kultivierung der
Granulozyten in vitro ohne L. major nachweisbar (Abbildung 17, S. 54). Koinkubation von
Granulozyten mit L. major für drei Stunden führte zu hochgradiger Expression von MIP1α und MIP-1β (Abbildung 17). Dagegen konnte in keinem der Ansätze mRNA der
Chemokine Ltn, RANTES, IP-10, MCP-1 oder I-309 nachgewiesen werden (nicht
dargestellt).
Dies belegt, daß in Granulozyten die mRNA-Produktion weiterer Chemokine wie MIP-1α
und MIP-1β durch L. major induziert wird. Die fehlende Induktion von Ltn, RANTES, IP10, MCP-1 und I-309 zeigt, daß es sich nicht um eine generelle Aktivierung der
Zytokingentranskription handelt, sondern selektiv proinflammatorische Botenstoffe
gebildet werden.
4.2.3 Granulozyten exprimieren die mRNA des antiinflammatorischen
Zytokins IL-1-Rezeptorantagonist (IL-1ra) konstitutiv und unabhängig
von L. major.
Analog
zur
Sekretion
der
proinflammatorischen
Zytokine
wurde
auch
der
antiinflammatorische Botenstoff IL-1ra untersucht. Die ELISA-Experimente ergaben, daß
Leishmanien die IL-1ra-Freisetzung durch Granulozyten nicht signifikant beeinflussen
(nicht dargestellt).
Ergebnisse
56
Demgegenüber konnte die konstitutive Produktion von IL-1ra-mRNA mittels RPA
eindeutig nachgewiesen werden. Es kam aber nicht zur Induktion der mRNA durch
dreistündige Inkubation mit oder ohne L. major (Abbildung 17, S. 54).
Aus den dargestellten Ergebnissen läßt sich ableiten, daß Granulozyten grundsätzlich in
der Lage sind, den antiinflammatorischen Botenstoff IL-1ra zu produzieren und somit
entzündungsbegrenzende Kapazität haben. Infektion mit L. major fördert aber weder auf
RNA- noch auf Proteinebene die IL-1ra-Produktion, anders als bei den gegensätzlich
wirkenden proinflammatorischen Zytokinen IL-1β bzw. IL-8.
4.2.4 mRNA von IL-6, IL-10, IL-12 oder IFN-γ in Granulozyten lag weder
konstitutiv noch durch L. major induziert vor.
Die L. major-Infektion ist Modell für die Etablierung einer TH1- bzw. TH2Immunantwort, die jeweils durch ein bestimmtes Zytokinprofil charakterisiert sind
(Solbach und Laskay 2000). Dazu gehören auf der TH1-Seite u.a. IFN-γ und IL-12 und auf
der TH2-Seite IL-6 und IL-10. NK-Zellen, Monozyten und Makrophagen sind als
Produzenten der jeweiligen immunologischen Botenstoffe gut charakterisiert. Ob
Granulozyten eventuell selbst direkt an der Ausbildung des einen oder anderen Typs der
Immunreaktion beteiligt sind, sollte durch die mRNA-Analyse spezifischer TH1- bzw.
TH2-Zytokine beleuchtet werden.
Mittels RPA wurde mRNA untersucht, die aus Granulozyten unmittelbar nach
Aufreinigung aus dem Blut oder nach Inkubation mit oder ohne L. major für 3 Stunden
isoliert worden war. Es fand sich kein Signal für IL-6, IL-10, IL-12 oder IFN-γ (nicht
dargestellt).
Somit stellen Granulozyten allein und auch nach Stimulation mit L. major keine Quelle der
genannten Zytokine dar, bilden also nicht unmittelbar die charakteristischen Zytokine, die
für die Ausbildung einer TH1- bzw. TH2-Immunantwort verantwortlich sind. Darüber
hinaus spricht der fehlende Nachweis von mRNA des monozytentypischen IL-6 gegen eine
Kontamination der Kulturen mit Monozyten und somit für einen granulozytenspezifischen
Nachweis aller vorhandenen mRNA.
Diskussion
57
5 Diskussion
In dieser Arbeit wurde die Interaktion von Granulozyten mit dem intrazellulären
Krankheitserreger L. major untersucht. Dies geschah vor dem Hintergrund, daß erstens die
Interaktion von Granulozyten mit intrazellulären Krankheitserregern im Gegensatz zu
extrazellulären kaum untersucht ist, und zweitens Granulozyten als Regulatorzellen der
unspezifischen Abwehr wenig erforscht sind. Die Bedeutung der Interaktion zwischen
Granulozyten und L. major wird durch die Tatsache unterstrichen, daß innerhalb der ersten
Stunden Granulozyten sehr schnell an den Ort einer subkutanen Infektion der Maus
rekrutiert werden (Müller, van Zandbergen et al. 2001), aber erstaunlicherweise nur wenig
über ihre Bedeutung bei der menschlichen Infektion bekannt ist.
In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß Granulozyten in der Interaktion mit dem intrazellulären
Krankheitserreger L. major eine vielfältige Rolle spielen. Die hier dargestellten Ergebnisse
zeigen, daß opsonisierte Leishmanien von Granulozyten phagozytiert werden und diese
aktivieren. Die Aktivierung wurde funktionell durch den Nachweis der Produktion von
Sauerstoffintermediaten (ROI) belegt. Aktivierte Granulozyten sind in der Lage, innerhalb
von 24 Stunden die Mehrzahl der Parasiten abzutöten. Nicht opsonisierte Leishmanien
werden ebenfalls aufgenommen, jedoch langsamer. Die Granulozyten werden dabei nicht
aktiviert, die ROI-Produktion bleibt aus, und der Großteil der intrazellulären Erreger
überlebt. Die Untersuchungen führten zu der neuen Erkenntnis, daß die Infektion mit L.
major die Apoptose der kurzlebigen Granulozyten um 24 bis 48 Stunden hinauszögert.
Weiter wurde erstmalig gezeigt, daß L. major die Sekretion von IL-8 durch Granulozyten
hervorruft und die mRNA-Produktion des proinflammatorischen Zytokins IL-1β sowie der
Chemokine MIP-1α und MIP-1β induziert.
Die
Experimente
erwiesen,
daß
Granulozyten
über
unterschiedliche
Phagozytosemechanismen verfügen. Aus den Ergebnissen geht hervor, daß die Funktion
der Granulozyten und damit auch das Schicksal der Parasiten davon abhängt, wie L. major
in die Zelle aufgenommen wird. Welcher dieser Mechanismen sich die Granulozyten zur
Aufnahme von L. major hauptsächlich bedienen, liegt in der Zusammensetzung des
Milieus begründet, das sie umgibt. Während beispielsweise in Medium ohne Serum keine
Komplementfaktoren enthalten sind, stehen diese bei Zusatz frischen Serums zur
Diskussion
58
Verfügung. Zusammen mit anderen hitzelabilen Faktoren können sie für die schnelle
Aufnahme von L. major durch Granulozyten verantwortlich gemacht werden.
Es ist bekannt, daß an der komplementvermittelten Phagozytose durch Neutrophile der
Komplementrezeptor CR3 beteiligt ist (Witko-Sarsat, Rieu et al. 2000). Durch Blockierung
dieses Rezeptors mittels Antikörper wurde die Aufnahme von Leishmanien durch
Granulozyten deutlich reduziert. Dies belegt, daß CR3-abhängige Mechanismen an der
Phagozytose von L. major durch Granulozyten wesentlich beteiligt sind. Die Aktivierung
des alternativen Wegs der Komplementkaskade mit resultierender Ablagerung von C3b auf
der Oberfläche von L. major Promastigoten wurde beschrieben (Mosser und Edelson 1987;
Puentes, Da Silva et al. 1990) ebenso wie deren CR3-vermittelte Aufnahme durch
Makrophagen (Mosser, Vlassara et al. 1987). Die hier dargestellten Resultate zeigen, daß
offenbar nicht nur Makrophagen, sondern auch Granulozyten über vergleichbare CR3bedingte Aufnahmemechanismen verfügen.
Die Blockierung von CR3 auf Granulozyten führte zu einer Reduktion der Phagozytoserate
um 30% bis 70%. Dies bedeutet, daß dieser Rezeptor nicht nur an der oben diskutierten
opsoninabhängigen, sondern auch an der opsoninunabhängigen Ingestion von L. major
durch Granulozyten beteiligt ist. Von Makrophagen ist eine serumunabhängige Bindung
des Oberflächenmoleküls LPG von Leishmania mexicana an eine CR3-Untereinheit
bekannt (Talamas-Rohana, Wright et al. 1990). Für Granulozyten wurde die Fähigkeit zur
opsoninunabhängigen, aber CR3-vermittelten Phagozytose bei Streptokokken der Gruppe
B
gezeigt
(Antal,
Cunningham
et
al.
1992).
Die
CR3-Beteiligung
an
der
opsoninunabhängigen Aufnahme von L. major durch Granulozyten ist allerdings hier
erstmals direkt belegt.
Auf der anderen Seite zeigten die Blockierungsexperimente, daß zusätzlich zu CR3 weitere
Oberflächenmoleküle an der Aufnahme von L. major und deren Bindung an die
Granulozytenoberfläche beteiligt sein müssen, da die Zugabe von anti-CR3-Antikörper zu
Granulozyten nur zur teilweisen Blockierung der Phagozytose von L. major führte. Ein
weiterer, serumabhängiger Mechanismus, der zu einer CR3-unabhängigen Aufnahme von
L. major durch Granulozyten führt, könnte die Opsonisierung der Parasiten mit natürlichen
Antikörpern sein, die an Fcγ-Rezeptoren auf Granulozyten binden. Eine solche
Phagozytose mit Antikörpern opsonisierter Mikroorganismen durch Granulozyten wurde
Diskussion
59
bereits beschrieben (Witko-Sarsat, Rieu et al. 2000), und natürliche Antikörper, die an
Leishmanien binden, konnten in frischen Seren nachgewiesen werden (Schmunis und
Herman 1970).
Die langsamere Phagozytoserate von L. major durch Granulozyten nach Hitzeinaktivierung
des Serums zeigte, daß hitzelabile Komponenten die schnelle Aufnahme vermitteln. Dazu
gehören Komplementfaktoren, aber auch das Mannanbindende Lektin (MBL), eine
hitzelabile Serumkomponente, deren wichtige Rolle bei der Komplementaktivierung und
der Phagozytose von Mirkoorganismen durch Phagozyten bereits gezeigt wurde (VorupJensen, Jensenius et al. 1998). MBL hat einen opsonisierenden Effekt und erhöht die
Aufnahmerate mannosereicher Pathogene durch Granulozyten (Kuhlman, Joiner et al.
1989). Es bindet an endständige Mannosereste des Lipophosphoglykans auf der Oberfläche
von Leishmanien und wirkt als Aktivator der Komplementkaskade. Die Anheftung des
MBL an die Oberfläche promastigoter Leishmanien stellt einen zusätzlichen Mechanismus
der C3b-Bildung dar, welche die Bindung an Makrophagen mitbewirkt (Green, Feizi et al.
1994). Experimente in dieser Arbeit mit MBL-defizienten Seren und aufgereinigtem MBL
unterstützten allerdings diese Bedeutung von MBL für die Opsonisierung bei der
serumabhängigen Aufnahme von L. major durch Granulozyten nicht. Also müssen neben
Komplementfaktoren, die an CR3 binden, weitere hitzelabile Serumfaktoren existieren, die
sich von MBL unterscheiden und an der serumvermittelten Aufnahme promastigoter
Leishmanien durch Granulozyten beteiligt sind.
In den Experimenten ohne frisches Serum war eine Aufnahme zu beobachten, die im Fall
von Granulozyten in Medium mit hitzeinaktiviertem FCS zwar langsam war, aber
letztendlich zu einer hohen Aufnahmerate führte. In verschiedenen Untersuchungen konnte
die Aufnahme von Bakterien durch Granulozyten in Abwesenheit von Antikörpern und
Komplement demonstriert werden (Ofek, Goldhar et al. 1995; Dong und Murphy 1997;
Estabrook, Zhou et al. 1998) ebenso die serumunabhängige Aufnahme von Leishmanien
durch deren direkte Bindung an den Mannoserezeptor auf Makrophagen (Wilson und
Pearson 1986; Wilson und Pearson 1988). Aber da Granulozyten den Mannoserezeptor
nicht exprimieren, ist ein davon verschiedener Mechanismus der Leishmanienbindung an
Granulozyten unter serumfreien Bedingungen noch zu erforschen.
Diskussion
60
Granulozyten sind somit in der Lage, Leishmanien in den verschiedenen Milieus auf
unterschiedliche Art und Weise aufzunehmen. Dabei konnten zum Teil neue und zum Teil
im Zusammenhang mit anderen Erregern oder bei Makrophagen beschriebene
Mechanismen identifiziert werden. Es wurde gefunden, daß CR3 maßgeblich an der
Aufnahme von L. major durch Granulozyten beteiligt ist. Entscheidend für die
Interpretation dieser Ergebnisse ist allerdings die Frage, welche Konsequenzen sich aus
den unterschiedlichen Aufnahmewegen für die Abwehr der Parasiten ergeben.
Eine Granulozyten-Erreger-Interaktion hat in der Regel eine Aktivierung der Zelle zur
Folge. Eine artifizielle Aktivierung der Granulozyten durch die Aufreinigung mußte zur
weiteren funktionellen Untersuchung der Zellen zunächst ausgeschlossen werden, denn
Aktivierung und Degranulation durch unterschiedliche Isolierungsmethoden von
Granulozyten sind in der Literatur beschrieben (Haslett, Guthrie et al. 1985; Kuijpers, Tool
et al. 1991). Die in dieser Arbeit angewandte Methode zur Granulozytenaufreinigung
stellte den Einsatz nicht voraktivierter Granulozyten sicher, wie die hohe CD62-LExpression der isolierten Zellen bewies. Dies wurde durch die Vermeidung eines
hypotonen Lyseschritts zur Beseitigung der Erythrozyten erreicht, indem diese mittels
Dichtegradient separiert wurden. So konnte eine Stimulation der Granulozyten durch
Membranfragmente lysierter Erythrozyten verhindert werden, wie sie in der Literatur
beschrieben ist (Dominguez und Torano 1999).
Es wurde gezeigt, daß die Granulozyten bei Aufnahme von L. major in der Gegenwart von
Serum aktiviert werden, was zur Elimination der Erreger durch die Produktion toxischer
Sauerstoffintermediate führt. Dieser Befund entspricht früheren hinweisenden Berichten,
daß reaktive Sauerstoffintermediate Hauptmediatoren der Tötung von Leishmanien durch
Granulozyten sind (Chang 1981; Pearson und Steigbigel 1981; Murray und Nathan 1999).
Es wurde beschrieben, daß Granulozyten aus Kaninchenblut in der Gegenwart frischen
autologen Serums L. infantum aufnehmen und effizient töten, wofür ROI als Agens
vermutet wurden (Brandonisio, Panunzio et al. 1996). Ganz im Gegensatz dazu blieb in
den Experimenten dieser Arbeit eine Aktivierung der Granulozyten in Medium mit
hitzeinaktiviertem FCS oder ohne Zusatz von Serum aus, obwohl es auch in diesen
Ansätzen zu einer Aufnahme von L. major kam. Die fehlende Aktivierung war auch mit
einer fehlenden Sauerstoffradikalproduktion der Granulozyten verbunden. Das bedeutet,
daß die an der serumunabhängigen Aufnahme beteiligten Mechanismen den oxidative
Diskussion
61
burst nicht induzieren oder L. major in die Lage versetzen, die Sauerstoffradikalproduktion
zu verhindern. In der Konsequenz überlebt L. major die Phagozytose durch Granulozyten.
Dies ist ein interessanter Aspekt der Rolle von Granulozyten in der Abwehr eines
intrazellulären Erregers: statt zur Vernichtung führt die Interaktion von Granulozyten mit
L. major zu dessen Aufnahme ohne Abtötung. Bei der Humanen Granulozytären
Ehrlichiose
(HGE)
wurde
kürzlich
ebenfalls
gezeigt,
daß
Ehrlichien
die
Sauerstoffradikalproduktion von Granulozyten inhibieren (Mott und Rikihisa 2000). Zwar
ist die Fähigkeit der Leishmanien bekannt, der tödlichen Stickoxidproduktion durch
Makrophagen zu entgehen (Buchmüller-Rouiller und Mauël 1987; Passwell, Shor et al.
1994). Für L. donovani wurde auch beschrieben, daß eine membranständige saure
Phosphatase die ROI-Produktion von Neutrophilen inhibiert (Remaley, Glew et al. 1985).
Die
Beobachtung
aber,
daß
L.
major
seine
Vernichtung
durch
die
Sauerstoffradikalproduktion von Granulozyten vermeiden kann, ist dagegen neu.
Die endgültige Wirtszelle der Leishmanien sind nicht Granulozyten, sondern Makrophagen
(Solbach und Laskay 2000). Somit könnten Granulozyten in der Frühphase der Infektion
einen „Übergangswirt“ bis zur Ankunft der Makrophagen an der Infektionsstelle darstellen
und eine pathologische Rolle in der Entzündung spielen. Diese Sichtweise erscheint um so
attraktiver vor dem Hintergrund des Befundes, daß L. major die Apoptose der
Granulozyten hinauszögert. Dies könnte L. major Zeit geben, sich wie in einer
parasitophoren Vakuole vor toxischen Agenzien zu schützen, wie es in Makrophagen der
Fall ist (Solbach und Laskay 2000).
Die Verzögerung der Apoptose von Granulozyten durch L. major ist in den Experimenten
mit Medium und hi-FCS sicher belegt worden. Daß L. major die Apoptose der aktivierten
Granulozyten in der Gegenwart von Serum hinauszögert, ist unwahrscheinlich. Denn
Studien haben gezeigt, daß Phagozytose mittels CR3 die Apoptose Neutrophiler induziert.
Als Kandidat für das Bindeglied zwischen Phagozytose und Apoptose in Granulozyten
werden ROI angeführt (Coxon, Rieu et al. 1996; Oishi und Machida 1997). In
Granulozyten von Spendern mit NADPH-Oxidase-Defizienz (CGD-Patienten) kommt es
nicht zur Apoptose, was auch auf den Zusammenhang zwischen ROI und Apoptose
hinweist (Coxon, Rieu et al. 1996). Dies stützt die dargestellten Beobachtungen, daß L.
major das Leben derjenigen Granulozyten verlängert, in denen die ROI-Produktion nicht
induziert wird und die Parasiten nicht abgetötet werden.
Diskussion
62
Bereits in einem sehr frühen Apoptosestadium werden Granulozyten spezifisch von
Makrophagen erkannt und innerhalb von Minuten aufgenommen und abgebaut (Savill,
Wyllie et al. 1989). Der programmierte Zelltod von Granulozyten stellt eine das Gewebe
schonende Beseitigung der Granulozyten dar und kann als physiologisch vorgesehene
Begrenzung des Entzündungsprozesses verstanden werden. Granulozyten ohne L. major
werden
natürlicherweise
apoptotisch.
Für
diese
spontane
Apoptose
ist
eine
Proteinneusythese nicht erforderlich (Whyte, Savill et al. 1997). Dagegen ist die
Verhinderung der Apoptose von Granulozyten ein aktiver Prozeß bezüglich einer
notwendigen Neusynthese von ‚Überlebensproteinen‘ (Whyte, Savill et al. 1997).
Granulozyten zeigen darin ein gegensätzliches Verhalten zu anderen Zellarten. Somit
können die Befunde, daß L. major die Apoptoserate von Granulozyten senkt, dadurch
erklärt werden, daß die Granulozyten synthetisch aktiv werden. Die Produktion zweier
Kandidaten für ein solches ‚Überlebensprotein’ durch Granulozyten nach Koinkubation
mit L. major, wurde in dieser Arbeit demonstriert: Sowohl IL-8 als auch IL-1β haben eine
die Apoptose verzögernde Wirkung (Kettritz, Gaido et al. 1998). Colotta und Mitarbeiter
fanden unter In-Vitro-Bedingungen eine Steigerung der Überlebensrate von Granulozyten
nach Inkubation mit IL-1β um 89,5% (Colotta, Re et al. 1992).
Eine Möglichkeit der Apoptoseverzögerung durch Leishmanien wurde für Makrophagen
beschrieben. Intrazelluläre L. donovani verhindern den Eintritt von Makrophagen in die
Apoptose. Inkubation dieser Zellen mit LPG, welches auch auf L. major vorkommt,
resultierte ebenfalls in Hemmung der Apoptose (Moore und Matlashewski 1994). Auch
andere intrazelluläre Krankheitserreger, die Granulozyten infizierten, machten diese Zellen
gegen den programmierten Zelltod resistenter, wie zum Beispiel für den Erreger der HGE
gezeigt (Yoshiie, Kim et al. 2000). Somit hemmen verschiedene intrazelluläre
Mikroorganismen, die auf das Überleben ihrer Wirtszelle angewiesen sind, effektiv die
Mechanismen der Apoptose, darunter auch L. major.
Aus den Beobachtungen, daß L. major nach Aufnahme durch Granulozyten in Medium
nicht abgetötet wird, sondern im Gegenteil einen Übergangswirt in Granulozyten findet
und dessen Apoptose verzögert, erscheint ummittelbar vorteilhaft für den Parasit. Dagegen
werden die Leishmanien in aktivierten Granulozyten vernichtet. Diese unterschiedlichen
Auswirkungen auf den Krankheitserreger spiegeln die unterschiedlichen Funktionen der
Diskussion
63
Granulozyten wider, die diese in der Auseinandersetzung mit L. major haben können. Dies
verdeutlicht, daß Granulozyten nicht unflexible Effektorzellen des Immunsystems sind, die
mittels präformierter Botenstoffe immer die gleiche Abwehrfunktion ausüben, um dann
nach kurzer Aktivität durch Makrophagen abgeräumt zu werden. Die Befunde dieser
Arbeit zeigen vielmehr eine flexible Rolle der Granulozyten in der frühen Immunabwehr
von L. major.
Diese Tatsache wird durch die Identifikation der Zytokine, die von Granulozyten nach
Interaktion mit L. major spezifisch produziert wurden, unterstützt. Die kurzlebigen
Granulozyten wurden lange Zeit für reine Freßzellen gehalten, unfähig Proteine zu
synthetisieren. Das lag u.a. daran, daß sie ihre Fähigkeit zur Phagozytose aufrechterhalten
auch wenn experimentell die ohnehin spärlich ausgebildeten Organellen blockiert werden,
die an der Proteinsynthese beteiligt sind (Lloyd und Oppenheim 1992). Inzwischen ist aber
klar, daß Neutrophile über eine Kapazität zur Synthese einer – wenn auch begrenzten –
Palette sowohl von Effektorproteinen als auch von Zytokinen verfügen (Lloyd und
Oppenheim 1992). Durch die in dieser Arbeit nachgewiesene Produktion von Zytokinen
können Granulozyten auf den weiteren Verlauf der Immunantwort Einfluß nehmen und
spielen dadurch im Immunsystem zusätzlich zu ihrer Rolle als efferente Zellen eine Rolle
als Regulatorzellen (afferente Zellen) der sich aufbauenden spezifischen Immunreaktion.
Im Vergleich zu Monozyten ist bei Granulozyten der Besatz mit Ribosomen und
Organellen des Endoplasmatischen Retikulums dürftig. Im Rahmen der Experimente dieser
Arbeit fiel der geringe Gehalt ribosomaler RNA dieser Zellen auf. Deshalb mußten etwa
fünfmal so viele Neutrophile eingesetzt werden, um eine ausreichende RNA-Menge
isolieren zu können, wie Monozyten hätten eingesetzt werden müssen. Das
Ungleichgewicht der Potenz Neutrophiler und Monozyten, Zytokine in einer biologisch
relevanten Menge zu produzieren ist nur ein scheinbares. Berücksichtigt man das im
Gewebe herrschende Verhältnis von Granulozyten zu Makrophagen von mindestens 20 : 1,
wie es zehn Stunden nach Infektion am Ort der Läsion vorliegt (Müller, van Zandbergen et
al. 2001), müßte ein einzelner Granulozyt nur ein Zwanzigstel der Zytokinmenge eines
Monozyten produzieren, damit die absolute Menge – und damit die Bioaktivität – identisch
ist.
Diskussion
64
Granulozyten in ihrer großen Zahl sind relevante Produzenten von Zytokinen und können
den Verlauf der Immunantwort beeinflussen, wie anhand der IL-8-Sekretion durch
Granulozyten gezeigt werden konnte. Obwohl IL-8 von verschiedenen Zellen sezerniert
wird,
darunter
T-Lymphozyten,
Epithelzellen,
Keratinozyten,
Fibroblasten
und
Endothelzellen, stellen Neutrophile eine der wichtigsten Quellen dieses Zytokins dar
(Cassatella 1999). Gleichzeitig sind sie selbst auch die Hauptzielzellen von IL-8, so daß
die IL-8-Produktion zu einer sich selbst fördernden Rückkopplung führt (Gainet, CholletMartin et al. 1998). Neben seiner chemotaktischen Bedeutung aktiviert IL-8 noch weitere
Zellfunktionen wie beispielsweise die Phagozytose (Baggiolini, Walz et al. 1989). Die
durch Leishmanien hervorgerufene IL-8-Sekretion durch Granulozyten führt daher
wahrscheinlich zur beschleunigten Rekrutierung von Granulozyten an den Ort der
Infektion und verstärkt die Ingestion der Parasiten. Zudem könnte die chemotaktische
Wirkung von IL-8 auf T-Lymphozyten eine Rolle in der Entwicklung einer T-Zellvermittelten Immunreaktion gegen L. major spielen. Ob die IL-8-vermittelte T-ZellRekrutierung an der kürzlich bei Mäusen beschriebenen granulozytenabhängigen
Ausbildung einer TH2-dominierten Immunantwort beteiligt ist (Tacchini-Cottier, Zweifel
et al. 2000), bleibt zu erforschen.
Neben IL-8 zählt auch IL-1 zu den wichtigen proinflammatorischen Zytokinen. IL-1 wurde
initial als potentes Pyrogen identifiziert, das seine Wirkung bereits im femtomolaren
Bereich entfaltet. Neben seiner Funktion als die Apoptose von Granulozyten verzögernder
Mediator ist für IL-1 u.a. die Erhöhung des oxidative burst in Granulozyten und die
Induktion proinflammatorischer Zytokine, darunter IL-8, beschrieben. IL-1 führt außerdem
zur vermehrten Expression von Zelladhäsionsmolekülen (Curfs, Meis et al. 1997). Die
dargestellten Experimente zeigten, daß L. major innerhalb von 3 Stunden die IL-1βProduktion der Granulozyten auf Ebene der Transkription induziert. Dies steht im Einklang
mit Befunden, daß Granulozyten nach Stimulation mit LPS zwei bis sechs Stunden zur
Transkription der mRNA von IL-1β benötigen (Lloyd und Oppenheim 1992). Im
Gegensatz dazu induziert L. major die IL-8-Sekretion auf posttranslationaler Ebene. IL-1β
kann seine ergänzende proinflammatorische Wirkung demzufolge erst zeitlich versetzt zu
IL-8 entfalten, fördert dann aber bereits speziellere Abwehrmechanismen wie die
Auslösung des oxidative burst. Somit konnten in dieser Arbeit Granulozyten als
Produzenten der immunologischen Botenstoffe IL-8 und IL-1β identifiziert werden, die
Diskussion
65
entscheidend an der Entstehung und Aufrechterhaltung einer akuten Entzündung beteiligt
sind.
Darüber hinaus ergibt sich aus den Experimenten, daß Granulozyten eine maßgebliche
Bedeutung für den Aufbau der frühen unspezifischen Entzündungsreaktion und der
nachfolgenden spezifischeren Immunantwort haben. L. major induziert die mRNAProduktion des inflammatorischen Makrophagenproteins (MIP) durch Granulozyten. Für
MIP-1α und MIP-1β ist vor allem eine chemotaktische Wirkung auf Monozyten, T-Zellen
und im Falle von MIP-1α auf alle Arten der Granulozyten beschrieben (Ben-Baruch,
Michiel et al. 1995; Curfs, Meis et al. 1997). Neben diesem allgemeinen
proinflammatorischen Effekt bewirken MIP-1α und MIP1-β eine Veränderung der
Zusammensetzung des zellulären Infiltrats am Ort der Entzündung. Während in der frühen
Phase der Entzündung Granulozyten vorherrschen, werden sie im eher chronischen Verlauf
durch mononukleäre Phagozyten und Lymphozyten abgelöst (Beil, Meinardus-Hager et al.
1992). Stimulierte Granulozyten haben als Produzenten des Chemokins MIP-1α an dem
Wechsel des zellulären Infiltrats von Granulozyten zu mononukleären Zellen den
Hauptanteil (Kasama, Strieter et al. 1993). Antikörperblockade von MIP-1α führte zur
Reduktion der gesamten durch Neutrophile bewirkten chemotaktischen Wirkung auf
Monozyten um 60% (Kasama, Strieter et al. 1993). Im Fall der Leishmanieninfektion in
vivo zeigte die immunhistologische Analyse der Läsionen von Patienten mit kutaner oder
viszeraler Leishmaniose eine moderate bzw. deutliche Erhöhung von MIP-1α. Innerhalb
der untersuchten Gruppe chemotaktischer β-Zytokine war MIP-1α als einziges deutlich
exprimiert, und die Autoren sehen es verantwortlich für die Rekrutierung von
Makrophagen und T-Zellen in der kutanen Leishmaniose (Ritter, Moll et al. 1996). In der
vorliegenden Arbeit wurde demgemäß gezeigt, daß Granulozyten als Produzenten von
MIP-1α eine afferente Rolle in der Immunantwort bei Infektion mit dem intrazellulären
Erreger L. major zukommt.
Die fehlende Induktion der Chemokin-mRNA von Ltn, RANTES, IP-10, MCP-1 und I-309
bedeutet, daß Granulozyten diese nicht ohne weiteres produzieren und daß die Aufnahme
von L. major zur differentiellen Produktion nur bestimmter Zytokine führt. Außer für IP-10
und MCP-1 gibt es für die Produktion der genannten Chemokine durch Granulozyten bis
heute keinen Hinweis in der Literatur.
Diskussion
66
Weder ohne noch mit Stimulation mit L. major konnte mRNA der Interleukine IL-6, IL-10,
IL-12 oder von IFN-γ nachgewiesen werden. Wie anhand eines Mausmodells in der
Infektion mit L. major erforscht, korreliert die Heilung der Infektion im Verlauf u.a. mit
einem erhöhten Spiegel von IL-12 und IFN-γ (TH1-dominierte Immunantwort), der fatale
Ausgang mit Erhöhung von IL-6 und IL-10 (TH2-dominierte Immunantwort) (Solbach und
Laskay 2000). Das in dieser Arbeit genutzte In-Vitro-System gibt keinen Hinweis auf
Granulozyten als direkte Quelle dieser Zytokine. Es ist aber möglich, daß andere durch
Granulozyten sezernierte Zytokine über die Stimulation unterschiedlicher Zellen des
Immunsystems die Weichenstellung der Immunantwort beeinflussen.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, daß die serumabhängige Aufnahme von L. major
zur schnellen Tötung der intrazellulären Leishmanien führt, wohingegen der Großteil der
intrazellulären Parasiten in Granulozyten überlebt, wenn L. major in Abwesenheit
hitzelabiler Serumfaktoren phagozytiert wird. Der Parasit ist dann in der Lage, die
Sauerstoffradikalproduktion der Granulozyten zu vermeiden. Diese Befunde legen eine
Doppelrolle der Granulozyten bezüglich ihrer Interaktion mit L. major nahe. Einerseits
üben Granulozyten eine Abwehrfunktion in der frühen Immunreaktion gegen diesen
Parasiten aus, indem sie L. major vernichten. Andererseits stellen Granulozyten
möglicherweise ein intrazelluläres Milieu für Leishmanien bereit, das den Parasiten ein
Überdauern der ersten Stunden bis Tage der Infektion ermöglicht. Das Überleben
intrazellulärer Pathogene wie L. major im Wirtsorganismus hängt von der Fähigkeit der
Phagozyten ab, diese Mikroorganismen zu erkennen und zu internalisieren. Letztere
können allen antimikrobiellen Substanzen des umgebenden Milieus entgehen, wenn es
ihnen gelingt, eine intrazelluläre Vakuole zu bilden. Myeloide Zellen wurden lange für
sichere Zielzellen (‚safe targets’) der Leishmanien gehalten (Mirkovich, Galelli et al.
1986). Es wurde nachgewiesen, daß Komplementaktivierung durch Membranbestandteile
promastigoter
Leishmanien
zum
für
die
Infektion
mit
Leishmanien
nötigen
Komplementverbrauch führt (Ilg, Stierhof et al. 1995; Peters, Kawakami et al. 1997).
Folglich könnte dieser lokale Komplementverbrauch nach Infektion mit Leishmanien ein
Milieu schaffen, in dem eine komplementunabhängige Aufnahme der Parasiten erfolgt, die
zu deren verlängerten Überleben führt. Da L. major in Granulozyten nach
opsoninunabhängiger Phagozytose in Granulozyten überleben kann, könnten diese Zellen
den Leishmanien als sichere Zielzellen (‚safe targets’) zum Überleben der Frühphase der
Diskussion
67
Infektion dienen. Dies stünde in Einklang mit der Ansicht, daß die schnelle Aufnahme
promastigoter Leishmanien durch Leukozyten nach der Infektion die früheste
Überlebensstrategie der Parasiten ist (Dominguez und Torano 1999).
Zwei mögliche Bedeutungen ergeben sich aus dem Überleben der Leishmanien in
Granulozyten, das mit der Lebensverlängerung der Wirtszelle assoziiert ist. Einerseits mag
dies die Überbrückung der Zeit bis zur Ankunft der Makrophagen ermöglichen, den
eigentlichen Wirtszellen von L. major. Deren Rekrutierung bewirken neben IL-8 und IL-1β
v. a. MIP-1α und MIP-1β, deren Synthese von L. major induziert wurde. Andererseits
bedeutet die verlängerte Lebensspanne und Rekrutierung der Granulozyten durch IL-8 und
IL-1β
eine
protrahierte
Entzündungsreaktion
und
ermöglicht
die
Produktion
immunologischer Botenstoffe, die zur Ausbildung einer spezifischen Immunantwort zu
Ungunsten der Parasiten führen kann.
Die Antworten auf die Fragestellung dieser Arbeit werden in der folgenden Grafik noch
einmal zusammenfassend dargestellt.
Diskussion
68
Granulozyt
CD62-L
CD63
L. major
Amastigote
CD62-L
CD63
A1
10 min, Serum
B1
10 min, ohne Serum
Sauerstoffradikale
Apoptose
Minuten bis Stunden, Serum
A2
Apoptose
unterbleibt
IL-8
Stunden, hi-FCS
ohne Serum B2
MIP-1α, MIP-1β,
IL-1β mRNA
Aktivierung
T-Zelle
schonendes
Abräumen
IL-8
Stunden, Serum
Makrophage
A3
Stunden, hi-FCS
safe target
ohne Serum B3
Abbildung 18: Zusammenfassung. A: In Anwesenheit von Serumfaktoren führt die Interaktion von
Granulozyten und L. major zur Phagozytose der Parasiten durch Neutrophile. Diese werden aktiviert,
verlieren die Expression von CD62-L und verstärken jene von CD63 (A1). Gleichzeitig kommt es zur
Sauerstoffradikalproduktion und konsekutiven Vernichtung der intrazellulären Erreger (A2). Durch
die Sekretion von IL-8 und die Induktion der mRNA von MIP-1a, MIP-1ß und IL-1ß kommunizieren
Granulozyten mit anderen Zellen der Immunabwehr (A3, B3). Ohne Serum werden Leishmanien
langsamer aufgenommen, die Granulozyten werden nicht aktiviert und produzieren keine
Sauerstoffradikale (B2), die IL-8-Sekretion ist niedrig. Bei Infektion mit L. major wird die natürliche
Apoptose hinausgezögert (B2), und L. major könnte bis zur Ankunft von Makrophagen überleben
und in diesen eine sichere Zielzelle (safe target) finden (B3).
Zusammenfassung
69
6 Zusammenfassung
Granulozyten sind die Hauptabwehrzellen bei Infektionen durch extrazelluläre
Krankheitserreger. Bei einer Infektion mit dem intrazellulären Pathogen Leishmania major
(L. major) sind Granulozyten die ersten Abwehrzellen am Ort der Infektion, aber ihre
Bedeutung für die Immunantwort ist kaum erforscht. In dieser Arbeit wurde die Interaktion
von humanen Granulozyten mit L. major in vitro untersucht. Dazu wurden Granulozyten
mit einer Reinheit von über 99% aus peripherem venösen Humanblut isoliert. Die
Expression der Oberflächenmarker CD62-L und CD63 belegte, daß die aufgereinigten
Zellen nicht aktiviert waren.
Koinkubation von Granulozyten mit Leishmanien führte zur Phagozytose der Parasiten
durch
die
Granulozyten,
woran
der
Komplementrezeptor
CR3
beteiligt
war.
Inkubationsexperimente mit und ohne Zusatz von Serum bzw. hitzeinaktiviertem Serum
zum Kulturmedium wiesen hitzelabilen Serumfaktoren eine entscheidende Bedeutung bei
der Interaktion zwischen Granulozyten und L. major zu: In Anwesenheit hitzelabiler
Serumfaktoren nahmen rund 50% der Granulozyten innerhalb von zehn Minuten L. major
auf. Dies führte zur Aktivierung der Granulozyten und zur konsekutiven intrazellulären
Produktion von Sauerstoffradikalen. Mikroskopische Analysen zeigten, daß infizierte
Granulozyten die Leishmanien innerhalb eines Tages nahezu vollständig eliminierten. In
Medium oder hitzeinaktiviertem (hi-) FCS dagegen, also in Abwesenheit hitzelabiler
Serumfaktoren, nahmen innerhalb von 10 Minuten weniger als 10% der Granulozyten
Leishmanien auf, nach drei Stunden rund 30% (hi-FCS). Die Zellen wurden nicht aktiviert,
die Sauerstoffradikalproduktion unterblieb, und die Parasiten wurden intrazellulär nicht
getötet.
Die natürlicherweise sehr kurzlebigen Granulozyten zeigten in Medium mit hi-FCS
innerhalb von 24 Stunden zu über 80% zellmorphologisch Zeichen der Apoptose, dagegen
nur etwa 10% bis 50% der Zellen nach Koinkubation mit Leishmanien.
Gegenüber nichtinfizierten Granulozyten steigerte die Infektion mit L. major die
granulozytäre Sekretion von IL-8 um rund 300 pg/ml ohne und rund 3000 pg/ml mit
hitzelabilen Serumfaktoren und induzierte die mRNA-Produktion der Zytokine MIP1α,
MIP-1β und IL-1β in Medium mit hi-FCS.
Zusammenfassung
70
Die Experimente zeigen, daß Granulozyten eine Doppelrolle in der Bekämpfung von L.
major zukommt. In Anwesenheit von hitzelabilen Serumfaktoren tragen sie als
Effektorzellen zur Reduktion der Parasitenlast bei. Andererseits dienen sie L. major in
Abwesenheit hitzelabiler Serumfaktoren als Wirtszelle. Durch die Produktion von
Zytokinen modulieren Granulozyten als Regulatorzellen die Immunantwort. Die Fähigkeit
der Leishmanien, die Granulozytenapoptose zu verzögern und intrazellulär zu überleben,
stellen wichtige Evasionsfaktoren dieses Erregers dar.
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***
Eigene Veröffentlichungen
82
8 Eigene Veröffentlichungen
ORIGINALARBEITEN
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Jensenius J.C.; Solbach, W.; Laskay, T. Intracellular survival of
Leishmania major in neutrophil granulocytes after opsoninindependent uptake. Infect Immun. (in press)
Müller, K.; van Zandbergen, G.; Hansen, B.; Laufs, H.; Jahnke,
N.; Solbach, W.; Laskay, T. Chemokines, NK cells and
granulocytes in the early course of Leishmania major infection in
mice. Med Microbiol Immunol (Berl). (in press)
Laufs, H.; Nigrovic, P.; Schneider, L.; Oettgen, H.; del Nido, P.;
Moskowitz, I.; Perez-Atayde, A. Giant cell myocarditis in a 12
year-old girl with common variable immunodeficiency. Mayo
Clin Proc. (in press)
VORTRÄGE
In vitro Untersuchungen zur Interaktion von Granulozyten und
Leishmania major (4. Minisymposium „Infektion und
Immunabwehr“ auf Burg Rothenfels, 1998)
Interactions of Leishmania major with human granulocytes in
vitro (15. Frühjahrstagung der Deutschen Gesellschaft für
Immunologie, Stuttgart, 1999)
DISSERTATIONSARBEIT
Die Interaktion von Granulozyten mit intrazellulären
Krankheitserregern am Beispiel der Infektion mit Leishmania
major. Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und
Hygiene der Medizinischen Universität zu Lübeck
(http://www.hygiene.mu-luebeck.de)
http://www.laufs.com/helmut/dissertation.pdf
Danksagung
83
9 Danksagung
Herrn Prof. Dr. med. WERNER SOLBACH gilt mein besonderer Dank für die Vergabe des Themas der
Dissertation und seine jederzeit vorbildliche leitende Betreuung der Arbeit sowie seine ständige
Verfügbarkeit.
Herrn Prof. Dr. med. HOLGER KIRCHNER danke ich für die Beratung im Umfeld dieser Arbeit und im
gesamten Studium sowie für die großzügige Möglichkeit, zur Etablierung der Granulozytenaufreinigung auf
Buffy coats seines Instituts zurückgreifen zu dürfen. Herrn Privatdozent Dr. rer. nat. LOTHAR RINK danke ich
für die unterstützende Beratung zu Fragen der immunologischen Untersuchung von Granulozyten und die
initiale Bereitstellung von Antikörpern.
Frau NICOLE JAHNKE danke ich für die Einführung in allgemeine Verhaltensweisen im Labor, speziell das
molekularbiologische und das Arbeiten mit Zellkulturen und das geistige Salz in der und um die Laborsuppe
zu jedem Zeitpunkt der Arbeit.
Frau Diplom Biologin KERSTIN MÜLLER danke ich für die Weitergabe der Erfahrung im RPA sowie
unermüdlichen Diskurs.
Frau MAREN GERKE danke ich für die professionelle und freundschaftliche Einführung in eine Technik der
Granulozytenisolierung.
Den Mitarbeitern des Instituts für Biochemie danke ich für die Erlaubnis der Mitbenutzung ihrer
Phosphoimaging-Einrichtungen, dem Institut für Molekularbiologie für die Möglichkeit, im Radioaktivlabor
zu arbeiten.
Herrn Dr. JENS FLEISCHER und Herrn Dr. NORBERT REILING danke ich für die Durchführung der
Zellsortierung im Forschungszentrum Borstel.
Ganz besonders herzlich möchte ich mich bei Herrn Privatdozent Dr. rer. nat. TAMÁS LASKAY für seine
immer ausgezeichnete, engagierte und besonders freundschaftliche Betreuung in allen Phasen der Arbeit
bedanken. Ohne seine mitreißende Begeisterung für wissenschaftliches Arbeiten (und viele andere Dinge
darüber hinaus) und seine kompetente und konstruktive Kritik hätte die Arbeit nur halb so viel Spaß gemacht.
Die Versuche wurden mit finanzieller Unterstützung des Sonderforschungsbereichs 367/B10 der Deutschen
Forschungsgemeinschaft durchgeführt.
Stichwortverzeichnis
84
10 Stichwortverzeichnis
A
IL-8 18, 36, 52, 53, 64
IP-10 18, 55, 65
Amastigote 8, 41
K
Apoptose 16, 33, 50, 51, 61, 62
C
Komplementsystem 13, 42, 43
L
CD62-L 12, 33, 41, 46, 47, 60
CD63 33, 41
Leishmania major 6, 28
CD66b 33, 46, 47
Aufnahme 41, 42, 43, 44, 45, 59
CR3 32, 43, 44, 58
Granulozyten, und 19
E
ELISA 36, 52
Identifikation 33
Inkubation 32
Krankheitsformen 9
F
Lebendigkeit Siehe Vitalität
Lebenszyklus 7, 8
FCS-Medium Siehe Medium
Lipophosphoglykan Siehe LPG
Fragestellung 21, 67
opsoninunabhängige Aufnahme 42,
G
Stamm 28
Giemsafärbung 32
Granulozytenaufreinigung 29, 40, 60
H
Hitzeinaktivierung 31, 43
I
I-309 55, 65
IFN-γ 18, 56, 66
43, 62
Taxonomie 7
Vitalität 34, 49
Leishmaniose 9, 10
Limiting dilution Siehe
Titrationskulturverfahren
LPG 8, 58, 62
L-Selektin Siehe CD62-L
Ltn 55, 65
IL-1 18, 53, 64
IL-10 56, 66
IL-12 18, 56, 66
IL-1ra 18, 55
IL-6 18, 56, 66
M
Mac-1 Siehe CR3
Mannanbindendes Lektin Siehe MBL
MBL 14, 31, 45, 59
MCP-1 18, 55, 65
Stichwortverzeichnis
85
Medium 31, 42, 43, 45, 47, 50, 57
Plasma Siehe Medium
MIP 18, 55, 65
polymorphkernige Leukozyten Siehe
mRNA Siehe RNA
Neutrophile Granulozyten
N
Promastigote 8, 41
Propagation 28
Neutrophile Granulozyten 10
R
Affektorfunktion 17, 63
Aktivierung 13, 41, 47, 60 Siehe
RANTES 55, 65
aufgereinigte 40
reactive oxygen intermediates Siehe
Effektorfunktion 12, 17, 60
oxidative burst
Enzyme 12
RNA 37, 54, 55, 56, 63
Funktion 11, 17, 66
RNase Protection Assay Siehe RPA
Funktionsstörungen 16
ROI Siehe oxidative burst
Isolierung Siehe
RPA 37, 38, 56
Granulozytenaufreinigung
S
Lebenszeit 50
Leishmania major, und 19, 40
safe target 66, 68
Reinheit 30, 41
Sauerstoffradikale Siehe oxidative burst
Sortierung 35
Serum Siehe Medium
Zytokine 18, 51, 54, 55, 56
Software 26
NNN Siehe Novy-Nicolle-MacNeal
T
Novy-Nicolle-MacNeal 28
TH-Zellantwort 6, 56, 66
O
Opsonine Siehe Komplementsystem
Titrationskulturverfahren 34, 48
Trypanosomatiden 7
Opsonisierung 42, 45, 47
Z
oxidative burst 15, 19, 34, 47, 48, 60
Zellen 29
P
Zellkultur 31, 32
Parasit 28
Zusammenfassung 68, 69
Phagozytose 41, 42, 43, 59
Zytokine 17, 18, 51, 52, 54, 56, 63, 64
Lebenslauf
86
11 Lebenslauf
Name:
Helmut Laufs
Geburtstag und -ort:
9. Juni 1975 in Göttingen
SCHULEN:
1985 – 1994
Kath. Jesuitengymnasium Sankt-Ansgar-Schule, Hamburg
08/1991 – 01/1992
Huron High School, Ann Arbor, Michigan, U.S.A.
1994
Abitur
STUDIENSTIFTUNG:
1994
Aufnahme in die Studienstiftung des Deutschen Volkes
STUDIUM:
1994 – 2001
Humanmedizin an der Medizinischen Universität zu Lübeck
1996
Ärztliche Vorprüfung
1995 – 1996
Informatik an der Fernuniversität Hagen
Kurs: Konzepte imperativer Programmierung
10/1996 – 02/1997
Humanmedizin an der Universität Wien
1997
I. Staatsexamen, Humanmedizin
10/1998
Famulatur an der Harvard Medical School, Cardiovascular
Division, Department of Medicine (Dr. J. K. Liao), Brigham and
Women’s Hospital, Boston, U.S.A.
2000
II. Staatsexamen, Humanmedizin
2001
III. Staatsexamen, Humanmedizin
PREISE UND STIPENDIEN:
1994
Paul-Overhage-Preis (Sankt-Ansgar-Schule, Abiturpreis)
2000
Stipendium der Studienstiftung des Deutschen Volkes für ein PJTertial an der Harvard Medical School, Boston, U.S.A.
PROMOTION:
1/1998 – 8/1999
Experimentelle Durchführung am Institut für Medizinische
Mikrobiologie und Hygiene der Med. Universität zu Lübeck,
Direktor: Prof. W. Solbach
BERUF:
seit 8/2001
Arzt im Praktikum an der Klinik für Neurologie der Johann
Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main, Direktor: Prof.
H. Steinmetz
Doktorarbeit als Online-Material auf CD
12 Doktorarbeit als Online-Material auf CD
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Literaturdatenbank
Der Lebenslauf befindet sich auf Seite 86.
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Helmut Laufs