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Instrumentelle Arzneistoffanalytik - WS 2016
(Wolfgang Holzer)
empfehlenswerte Literatur:
Hesse - Meier - Zeeh; Spektroskopische Methoden in der
organischen Chemie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 9.
Auflage, 2016
G. Rücker, M. Neugebauer, G. G. Willems; Instrumentelle
pharmazeutische Analytik, Wissenschaftliche
Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart, 5. Auflage, 2013
A. Dominik, D. Steinhilber; Instrumentelle Analytik, Deutscher
Apotheker Verlag, Stuttgart, 2002
J. B. Lambert, S. Gronert, H. F. Shurvell, D. A. Lightner;
Spektroskopie - Strukturaufklärung in der organischen
Chemie, Pearson, München, 2. Auflage, 2012
1
Instrumentelle Analytik
●
Spektroskopische und optische Methoden
●
Elektrochemische Methoden
●
Chromatographische Methoden
Pharmazeutische Analytik
●
Überprüfung und Charakterisierung von Arzneistoffen,
Arzneizubereitungen, Ausgangsmaterialien, Zwischenprodukten mit dem Ziel der ‚Arzneimittelsicherheit‘
Beschreibende Qualitätsmerkmale:
Identität - Reinheit - Gehalt (= Konzentration)
●
Arzneistoffsynthese
●
Strukturaufklärung
●
Pharmakon-Rezeptor Wechselwirkungen
u.a.
2
Beurteilung (Validierung) analytischer Methoden
●
Präzision (Grad der Reproduzierbarkeit)
●
Richtigkeit (Abweichung wahrer Wert – Mittelwert)
●
Nachweisgrenze (Grenzkonzentration)
●
Selektivität/Spezifität (auch in für Bestimmung in einer ‚Matrix‘
geeignet?)
●
Linearität
●
Empfindlichkeit (Anzeigen möglichst geringer Konz.änderungen)
●
Bestimmungsbereich
●
Robustheit (Störanfälligkeit)
Spektroskopische Methoden
Prinzip einer spektroskopischen Methode
Reaktion
Störung
System (Atome, Moleküle)
Response
Störung: meist elektromagnetische Strahlung
3
Absorption, Emission
Zurückfallen in den
Grundzustand
Energie
E2
Anregung
E1
unter Abgabe von
Strahlung
messen kann man:
strahlungslos
(Umwandlung der
Anregungsenergie
in Wärme)
das Ausmaß der Energieaufnahme bei der Anregung
(die Absorption)
die Strahlungsabgabe beim Zurückfallen in den
Grundzustand (die Emission)
Klassifizierung spektroskopischer Methoden
Absorptionsspektroskopie:
● AAS (Atomabsorptionsspektroskopie, atomic absorption)
● UV/VIS (Ultraviolett-Sichtbar Sp., ultraviolet / visible)
● IR (Infrarot Sp., infrared)
● NMR (Kernresonanzspektroskopie, nuclear magnetic resonance)
Emissionsspektroskopie:
● Fluorimetrie (Fluoreszenzspektroskopie, fluorescence sp.)
● AES (Atomemissionssp. = Flammenphotometrie, atomic emission)
Sonderstellung: MS (Massenspektrometrie, mass spectrometry)
Röntgenstrukturanalyse (X-ray structure analysis)
4
Zusammenhang zwischen Energie, Wellenlänge und Frequenz
ν=
E = h•ν
c
λ
E=
h•c
λ
E: Energie (J) h: Planck'sches Wirkungsquantum (6.625•10-34 Js)
ν: Frequenz (s-1 = Hz (Hertz) = cps (cycles per second))
c: Lichtgeschwindigkeit (2.9979 •108 ms-1)
λ: Wellenlänge (m)
Elektromagnetisches Spektrum
λ in nm 10
102
104
103
105
106
1 µm
Röntgen
UV
UV/VIS
Spektr.
1017
107
108
1 cm
IR
VIS
Änderung der
Elektronenverteilung
107
Mikrowellen
109
1m
Radiowellen
Änderung der
Schwingungszustände
Änderung der Rotationszustände
Elektronenspins
Kernspins
IR-Spektr.
Raman-Spektr.
Mikrowellenspektr.
Elektronenspinresonanz
←
←
Frequenz (Hertz) ←
Energie (J/mol)
←
NMR
Spektr.
108
10-1
5
UV/VIS Sektor des elektromagnetischen Spektrums
420
470
530
620
700
rot
Infrarot
10-3 m (milli)
103 K (kilo)
10-6 µ (mikro)
(
106 M (mega) → z. B. MHz
10-9 n (nano) → z. B. nm
109 G (giga)
10-12 p (pico)
1012 T (tera)
10-15 f
750
optisches
Fenster
orange
nahes
UV
580
gelb
fernes
UV
400
violett
Röntgenstrahlen
200
grün
10
blau
λ (nm)
(femto)
1Å = 10-10 m
Maßzahl für das Ausmaß der Absorption
UV/VIS Absorptionskurve - schematisch
Absorptionsmaxima
Absorptionsminimum
λmax
λmax
Maßzahl für die Art der absorbierten Strahlung (λ
λ)
6
Elektronenübergänge und Strahlungsprozesse
Emission
hν
ν
E2
Absorption
E2
E1
hν
ν
E1
∆E = E2 - E1 = hν
ν
Definition von Transmission und Extinktion
d
Probe
I0
T=
I
I0
d: Schichtdicke in cm
I
E = log
I0: Intensität der Strahlung
vor der Probe
I: Intensität der Strahlung
nach Passage der Probe
I0
1
= log
I
T
T: Transmission
E: Extinktion (auch Absorption A = absorbance, bei d=1 auch optische Dichte OD)
E = A darf nicht mit der prozentualen Absorption (I0-I)/I0 •100 verwechselt werden!
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LAMBERT-BEER'sche Beziehung
E=ε•c•d
E = Εspez • c • d
E = Extinktion
ε = molarer Extinktionskoeffizient (= molar
absorbance index = molar absorptivity)
c = Konzentration (mol/l)
d = Schichtdicke (cm)
E = Extinktion
Espez = spezifische Extinktion = spezifischer
Extinktionskoeffizient = Absorptivity
= A1%1cm
c = Konzentration (g/100 ml)
d = Schichtdicke (cm)
Zusammenhang zwischen ε und Espez:
Espez =
10 • ε
M olekulargewicht
Lambert – Beer:
• Gilt streng nur für monochromatisches Licht
• Gilt streng nur für verdünnte Lösungen (c ≤ 10-2 mol/l) – bei
höheren Konzentrationen erfolgt Abweichung von der
Linearität
• Lösung muss klar sein → keine Suspensionen oder Kolloide,
die Schwächung der Strahlung muss ausschließlich durch
Absorption verursacht sein
8
Elektronenübergänge - Jablonski-Termschema
S3
IC
S2
T2
ISC
S1
T1
A A
IC
F
ISC
Ph
S0
Strahlungsprozesse:
A Absorption
F Fluoreszenz
Ph Phosphoreszenz
Strahlungslose Prozesse:
IC internal conversion
ISC intersystem crossing
T1, T2, .. Triplett-Zustände
S1, S2, .. Singulett-Zustände
Franck-Condon Prinzip: während des Übergangs (nur 10-15 s !!!) bleiben
Molekülparameter (Bindungslängen, Bindungswinkel, Konformation, …) erhalten
Absorption und Fluoreszenz als Übergänge zwischen
elektronischen Schwingungs- (ν
ν') und Rotationsniveaus (J')
ν'=3
J'
J'
R
J'
S1
A
ν'=2
ν'=1
ν'=0
F
ν''=3
J''
R
J''
J''
S0
ν''=2
ν''=1
ν''=0
→ UV/VIS-Spektren sind Bandenspektren!
9
Molekülorbitale
• wie in Atomen befinden sich in Molekülen die Elektronen auf genau
festgelegten Bahnen (Molekülorbitale, MO)
• core-Orbitale (innere e-): sind für UV/VIS nicht interessant (E zu hoch),
bei UV/VIS werden Bindungselektronen angeregt
• σ-Orbitale: enthalten e- der Einfachbindungen zwischen den Atomen,
durch Überlappung von Atomorbitalen entlang der Bindungsachse
• σ∗-Orbitale: antibindendes σ-Orbital, hohe Energie
• π-Orbitale: enthalten e- der Doppel- und Mehrfachbindungen zwischen
den Atomen, durch Überlappung von Atomorbitalen senkrecht zur
Bindungsachse; π∗-Orbitale: antibindende π-Orbitale
• n-Orbitale: enthalten e- der freien, nicht bindenden Elektronenpaare
(lone-pairs), z.B. O, N, S Atome
• HOMO: highest occupied molecular orbital
LUMO: lowest unoccupied molecular orbital
HOMO-LUMO Übergang ist energieärmster (= längstwelliger) Übergang
• Quantenmechanische Auswahlregeln legen fest, ob ein Übergang 'erlaubt'
(hohe Wahrscheinlichkeit) oder 'verboten' (niedrige Wahrscheinlichkeit) ist
Quantenmechanische Auswahlregeln
Die meisten der prinzipiell möglichen Elektronenanregungen finden nicht statt
→ ‚verbotene Übergänge‘
welche Übergänge verboten sind legen die Auswahlregeln fest
Spin-Verbot: Multiplizität darf sich während der Anregung nicht ändern, d. h. nur
S → S bzw T → T möglich, nicht aber S → T oder T → S
Überlappungsverbot: bei der Anregung eines Elektrons von einem Orbital in ein
anderes müssen sich die betreffenden Orbitale überlappen, sind sie zu weit
voneinander entfernt kann der Elektronen-Transfer nicht erfolgen
Paritätsverbot (Regel von Laporte): bei Molekülen mit Punktsymmetrie (z.B.
Benzol, Ethen) sind nur Übergänge zwischen solchen Orbitalen möglich, die
unterschiedliche Symmetrie-Eigenschaften bzgl. des Symmetriezentrums aufweisen
Symmetrieverbot: bei nicht punktsymmetrischen Molekülen gilt die Regel von
Laporte zwar nicht, aber auch hier aufgrund von Symmetrie-Eigenschaften Verbote
möglich
10
Molekül-Orbitale und Elektronenübergänge
σ∗
E
n → σ*
π∗
σ → σ*
n → π*
n
π → π*
π
σ
Absorptionsbereiche der verschiedenen Elektronen-Übergänge
λ (nm)
200
Vakuum-UV
400
UV
750
VIS
n → π* (konjugierte Systeme)
n → π*
π → π* (konjugierte Systeme)
π → π*
n → σ*
σ → σ*
11
Absorption einfacher, nicht-konjugierter Chromophore
Bezeichnung
des Überganges
Chromophor
λmax (nm)
σ-Elektronen
C C
und
C H
σ → σ*
≤ 150
einsame Elektronenpaare (lone-pairs, non-bonding)
O
n → σ*
N
n → σ*
~ 185
~ 195
S
n → σ*
~ 195
C O
n → π*
~ 300
C O
n → σ*
~ 190
π → π*
~ 190
π-Elektronen
C C
(isoliert)
Absorptionsmaxima und molare
Extinktionen kongugierter Diene
LUMO
E
HOMO
λmax = 175 nm
ε = 15 000
λmax = 217 nm
ε = 21 000
λmax = 258 nm
ε = 35 000
12
π → π* Absorption von Alkenen
π*
π → π*
E
λmax ~ 175 nm
ε ~15 000
π
β -Carotin
β-Carotin
11 Doppelbindungen
λmax 460 nm (ε 139 000)
13
UV/VIS - wichtige Begriffe
Chromophor: Gruppe mit (leicht) anregbaren Elektronen aus π oder
n-Orbitalen (z.B. C=C–C=C)
Auxochrom: Gruppe mit lone-pair, welche - in Konjugation mit einem
Chromophor - dessen UV/VIS-Absorption in den langwelligen Bereich
verschiebt (z.B. OH, NH2)
bathochromer Effekt (shift): 'Rotverschiebung', Absorptionsmaximum zu
größeren Wellenlängen hin verschoben
hypsochromer Effekt (shift): 'Blauverschiebung', Absorptionsmaximum zu
kleineren Wellenlängen hin verschoben
hypsochromer
shift
H+
bathochromer
shift
π
π*
ca. 190 nm
NH2
+
NH3
n
π*
ca. 230 nm
π*
π
ca. 190 nm
kein lone-pair mehr
vorhanden, daher kein
n
π* mehr möglich
hypochromer Effekt: Erniedrigung der Absorptionsintensität (ε wird kleiner)
hyperchromer Effekt: Erhöhung der Absorptionsintensität (ε wird größer)
Absorptionsspektrum von Benzol
β
p
254 nm
α
Charakterisierung von Banden:
Lage, Intensität, Form, Feinstruktur
14
Absorptionskurven anellierter Benzole
λ (nm)
Absorptionskurven Benzol - Benzoesäure - Zimtsäure
15
Absorptionscharakteristika monosubstituierter Benzole
(Lösungsmittel: Wasser)
Ph-H
λmax
254
ε
204
Ph-CH3
Ph-OH
Ph-OPh-OCH3
260
270
287
269
300
1450
2600
1480
Ph-OCOCH3
Ph-NH2
Ph-NH3+
258
280
254
250
1430
160
Ph-COOH
273
970
Vergrößerung des Chromophors durch intramolekularen
charge-Transfer (elektronenabziehender und
elektronenschiebender Substituent in para-Stellung am
Benzolring)
λmax 375 nm
Nitrobenzol:
λmax 269 nm
Aminobenzol:
λmax 280 nm
1,4-Dinitrobenzol: λmax 260 nm
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Elektronen-Donor-Akzeptor-Komplexe (EDA-Komplexe)
Konjugation, π-Systeme, Farbe……….
Indigo (Bluejeans)
λmax 606 nm (EtOH)
Purpur
1,4-Benzochinon (gelb)
λmax 434 nm (Benzol,
ε = 20)
1,2-Benzochinon (rot)
λmax 610 nm (Benzol,
ε = 20)
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Derivativspektroskopie
Isosbestischer Punkt
Die Absorptionskurven von
Verbindungen mit
dissoziierbaren auxochromen
Gruppen sind stark vom pHWert abhängig. Es existiert
aber eine Wellenlänge, bei der
die Absorption nicht vom pH
beeinflusst wird. Dort befindet
sich der Schnittpunkt aller
dieser Spektralkurven
(isosbestischer Punkt).
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Aufbau eines Absorptionsspektrometers
Lichtquelle
Spalt
Monochromator
Spalt
Küvette
Empfänger
A (E)
Probe
+ LM
I
Empf.
T
reines
LM
I0
Lichtquelle: UV: Wasserstoff-Gasentladungslampe, Vis: Wolfram-HalogenGlühlampe
Monochromator: Prisma oder optisches Gitter
Spalt: je schmäler, desto monochromatischer, aber auch desto weniger Licht
wird durchgelassen → so klein wie nötig, aber so groß wie möglich
Küvetten: UV: nur Quarz geeignet (Glas nur für λ > 300 nm durchlässig)
Photometrische Bestimmung von zwei Stoffen (A, B) nebeneinander
E=ε•c•d
E
Eges. = EA + EB
E(λ1) = εA(λ1) • cA + εB(λ1) • cB
E(λ1)
E(λ2) = εA(λ2) • cA + εB(λ2) • cB
E(λ2)
Mischung
A+B
Stoff A Stoff B
λ
1
λ2
λ
εA(λ1), εA(λ2), εB(λ1), εB(λ2) sind
vorher ermittelte Stoffkonstanten
(bzw. sind tabelliert)
E(λ1), E(λ2) werden gemessen
(Gesamtextinktionen)
2 Gleichungen mit 2
Unbekannten
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Probenvorbereitung und Spektrenaufnahme
•
Aufnahme in Lösung, c ~ 10-4 mol/l
•
Verwendung optisch reiner Lösungsmittel
ab 195 nm: Pentan, Hexan, Heptan, Cyclohexan, Wasser, Acetonitril
ab 210 nm: Methanol, Ethanol, Diethylether
Dichlormethan (>220 nm), Chloroform (>240 nm), Tetrachlormethan
(>260 nm)
ab 280 nm: Benzol, Toluol
ab 310 nm: Pyridin
•
Lösungsmittel mit Eigenabsorption im Messbereich sind ungeeignet!
•
Das Lösungsmittel kann erheblichen Einfluss auf die Lage und das
Aussehen der Banden haben (z.B. beim Wechsel unpolares LM →
polares LM: bathochrome Verschiebung von π→π*, hypsochrome
Verschiebung von n→π*)
Kalibriergerade zur quantitativen Bestimmung
abgelesene Absorption Ax
A
abgelesene Absorptionen
für Lösungen mit bekannter,
verschiedener Konzentration
gesuchte Konzentration cx
c (%)
20
Atomabsorptionsspektroskopie (AAS)
Anhebung von Elektronen in höhere
Atomorbitale
Serien von Absorptionslinien (Linienspektrum)
H-Atom: Lyman, Balmer, Paschen-Serie
höhere Atome: meist nur wenige, scharfe
Linien hoher Intensität
zur Bestimmung mittel AAS wird nur eine
einzige Linie hoher Intensität verwendet
(Resonanzlinie) → ‚Resonanzanregung‘
sehr hohe Spezifität, hohe Empfindlichkeit →
Spurenanalyse
Auswertung via modifiziertes Lambert-Beer
(Kalibrierung unbedingt nötig)
Atomabsorptionsspektrometer (AAS-Gerät)
Glasschild
Hohlkathodenlampe
Zweistrahlgeräte: I0
Atomisierungseinrichtung
Brenner
Monochromator
Anode
Detektor
Hohlkathode
Zerstäuber
Pressluft
Brenngas
Probe
21
Atomabsorptionsspektroskopie (AAS)
E=ε•c• l• f
mittels AAS werden
häufig bestimmt:
Al, As, Pb, Cd, Cr, Cu
Li, Na, Ni, Hg, Zn
E
ε
c
l
f
Extinktion
Extinktionskoeffizient
Atomdampfkonzentration
Atomreservoirlänge = Länge der Flamme
Wirkungsgrad des Atomisierungsprozesses =
Ausmaß, in dem aus dem entsprechenden Salz
Atome frei werden (abhängig von der Flammentemperatur, von der Zusammensetzung des
Brenngases u.v.a.)
es gehen viele Gerätekonstanten ein
Eichkurve notwendig!
Flammenphotometrie
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Flammenphotometer (AES-Gerät)
angeregte Atome
Hohlspiegel
die Flamme muss eine
bestimmte Temperatur
aufweisen!
Monochromator
Zerstäuberkammer
Zerstäuber
Detektor
Brenner
für: Ba, Pb, Cu, Ag,
Brenngas
Li, Na, K, Ca, Ag
Pressluft
sehr empfindliche Methode
(Spurenanalyse)
Probe
AES - verschiedene Anregungseinheiten
ICP
Direct-current plasma (DCP)
Flame
Inductively coupled plasma (ICP)
Laser-induced breakdown (LIBS)
Laser-induced plasma
Microwave-induced plasma (MIP)
Sparc or arc
23
Anregungsspektrum und Fluoreszenzspektrum
Anregungsspektrum
Fluoreszenzspektrum
Absorptionsintensität
Fluoreszenzintensität
λ
4
3
S1
2
1
ν=0
Energie
4
3
S0
2
1
ν=0
Definitionen - Fluorimetrie
F
Anzahl der emittierten Photonen
ϕ =  = —————————————— ≤ 1
Iabs
Anzahl der absorbierten Photonen
ϕ: Quantenausbeute der Fluoreszenz
F: Intensität der Fluoreszenzstrahlung
Iabs: Intensität der absorbierten Strahlung
F = k • I0 • ϕ • ε • c • d
k: Gerätekonstante (Eichkurve notwendig!)
I0: Intensität der Anregungsstrahlung
ε: molarer Extinktionskoeffizient bei λ der Anregung
(Absorptionsspektrum!) d: Schichtdicke c: Konzentration
24
• fluoreszenzfähig sind meist starre, planare Moleküle
(größere Doppelbindungssysteme, (Hetero)Aromaten,
Carbonylverbindungen)
• Fluoreszenzstrahlung ist immer langwelliger als
Anregungsstrahlung
• Fluoreszenzstrahlung ist immer viel schwächer als
Anregungsstrahlung
• Einfluss des Lösungsmittels, von Gegenionen etc.
• oft Verwendung von Fluoreszenzmarkern (z.B. aromatische
Sulfonsäurechloride – reagieren mit Aminen)
• Fluoreszenzdetektoren in der HPLC!
• sehr empfindliche Methode, zu quantitativen Bestimmungen
in sehr niedrigen Konzentrationsbereichen geeignet
(ppb-Bereich, 1 mg Substanz / Tonne Probe!)
Aufbau eines Fluorimeters
Lichtquelle
Anregungsmonochromator
Küvette
Absorptionsmonochromator
Absorptionsempfänger
Substanz
90°
Absorptionsspektrum
Emissionsmonochromator
Emissionsspektrum
Emissionsempfänger
25
IR-Spektroskopie (Schwingungsspektroskopie)
• die IR-Spektroskopie erfasst Molekülschwingungen
• IR-aktiv sind Schwingungen, bei denen sich das Dipolmoment
des schwingenden Moleküls verändert (vollständig symmetrische
Schwingungen sind IR-inaktiv → Raman Spektroskopie)
• je größer die Polaritätsunterschiede der Schwingungspartner desto
intensiver die damit verbundenen Banden (z. B. C-O, C-N)
• 'normaler' IR-Bereich: 2.5 - 50 µm ⇒ 4000 - 200 cm-1
∼ reziproker Wert der in cm ausgedrückten
Wellenzahl ν:
Wellenlänge (Vorteil: direkt proportional zu Frequenz und Energie)
z. B.: λ = 20 µm = 20 • 10-6 m = 20 • 10-4 cm =
∼ 1000
20
2
cm =
cm ⇒ ν =
= 500 cm-1
10 000
1000
2
Schwingungen und Absorptionen der alkoholischen Hydroxyl-Funktion
Valenzschwingung:
entlang der Bindungsachse
(Änderung im Abstand)
z.B. νC–O, νO-H
Molekülrest
Deformationsschwingung
Torsionsschwingung:
Veränderung im Bindungswinkel
oder Torsionswinkel
C – O stretching
z.B. δC–O–H (in plane)
1200 - 1000 cm-1
C
C – O – H bending
(in plane)
1500 - 1200 cm-1
O
H
C – O – H bending
(out of plane, Γ)
650 - 250 cm-1
O – H stretching
3700 - 3000 cm-1
26
Potentialkurve des anharmonischen Oszillators
Eo: Nullpunktsenergie; ED: Dissoziationsenergie
Grundschwingung: n=0 → n=1 (hohe Wahrscheinlichkeit)
Oberschwingungen: n=0 → n=2, n=3, usw. (abnehmende
Wahrscheinlichkeit)
Normalschwingungen (Grundschwingungen)
Ein Molekül mit N Atomen besitzt n = 3 • N (Bewegungs)freiheitsgrade
Davon entfallen 3 auf Translationen (entlang x, y, z) und 3 auf
Rotationen (um x, y, z) → es verbleiben 3N-6 Möglichkeiten für
Schwingungen (lineare Moleküle 3N-5) → Normalschwingungen
Größere Moleküle besitzen sehr viele mögliche Normalschwingungen
Wasser: 3 Atome → 3 • 3 – 6 = 3 Normalschwingungen
νsym
δsym
νasym
27
Hook'sches Gesetz
m1
m2
νosc =
1 k
2π µ
m2
m1
x1
r0
x2
K = - k • ∆r
(Auslenkung ∆r = x1 + x2)
K = rücktreibende Kraft
k = Kraftkonstante
νosc = Schwingungsfrequenz des
Oszillators
m1 • m2
µ=
= reduzierteMasse
m1 + m2
Abhängigkeit der Schwingungsfrequenz von der Bindungsstärke:
C–C
1000 cm-1
C=C
1640 cm-1
C≡C
2200 cm-1
Abhängigkeit der Schwingungsfrequenz von der Masse der Atome:
C–H
C – Br
3000 cm-1
650 cm-1
28
IR - charakteristische Gruppenfrequenzen - Einfachbindungen
Alkane:
Alkene:
Aromaten:
Alkine:
2850 - 2960
3010 - 3100
3010 - 3040
~ 3300
C–H
~ 3000 cm-1
(meist relativ
schwach)
N–H
~ 3400 - 3600 cm-1
meist schärfer und weniger intensiv als OH
O–H
freies OH: ~ 3600 scharf (selten!)
OH in H-Brücken: ~ 3400 - 2500cm-1 (je nach Stärke
der H-Brücke)
OH ist fast immer in H-Brücken eingebunden!
je stärker die H-Brücke, desto länger die OH-Bindung
desto kleinere Wellenzahl
desto intensiver die Bande
desto breiter die Bande
intermolekular H-Brücken sind konzentrationsabhängig,
intramolekulare weitgehend konzentrationsunabhängig
Bildung von
H-Brücken ist
sterisch behindert
→ ‚freies‘ OH
IR - charakteristische Gruppenfrequenzen - Dreifachbindungen
C≡C
~ 2100 - 2300 (Intensität variabel, abhängig von der
Struktur des restlichen Moleküls)
–C≡C–
– C ≡ C –H
C≡N
2150 - 2260
2100 - 2140
~ 2200 - 2300 (manchmal schwach oder abwesend)
Im Bereich 2100-2300 cm-1 auch kumulierte Doppelbindungen:
Isocyanate (R-N=C=O), Isothiocyanate (R-N=C=S), Ketene
(R1R2C=C=O), Carbodiimide (R-N=C=N-R‘), Azide (R-N3),
Diazoalkane (R2CN2), usw.
29
IR - charakteristische Gruppenfrequenzen - Doppelbindungen
~ 1620 - 1850 cm-1, sehr wichtig!
C=O
1) abhängig von der Elektronegativität von Substituenten X an
der Carbonylfunktion - je größer EN von X, desto größer νC=O
Aldehyd
R-CO-H
Keton
R-CO-R'
Carbonsäureester
R-CO-OR'
Carbonsäure
R-CO-OH
Carbonsäurechlorid R-CO-Cl
~ 1720 - 1740
~ 1705 - 1725
~ 1735 - 1750
~ 1760 (Monomer, sehr selten!)
~ 1790 - 1815
2) abhängig von Konjugationseffekten - in α,β-ungesättigten
C=O Funktionen ist νC=O um ca. 20 - 40 cm-1 kleiner
gesättigtes Keton
R-CO-R'
~ 1705 - 1725
α,β-ungesättigtes Keton R-CO-CH=CH-R' ~ 1665 - 1685
Aryl-Keton
R-CO-Aryl
~ 1680 - 1700
R = jeweils Alkyl!!!
IR - charakteristische Gruppenfrequenzen - Doppelbindungen
C=O
3) bei cyclischen Carbonylverbindungen ist νC=O abhängig von der
Ringspannung (Ringgröße) ⇒ zunehmende Ringspannung
führt zu erhöhter Frequenz von νC=O
1780
1750
1725 - 1700 (wie offenkettiges
Keton)
4) νC=O stark abhängig von H- Brückenbindungen
H-Brücke führt zu Verschiebung von ~ 40 - 60 cm-1 zu
kleineren Wellenzahlen
Carbonsäure: Momomer
~ 1760
Dimer (üblicherweise vorliegend) ~ 1725 - 1700
30
weitere Doppelbindungen
C=C:
Alkene (nicht konjugiert): 1620-1680 cm-1
α,β-ungesättigte Carbonylverbindungen: 1590-1640 cm-1
Diene, Triene: 1600, 1650 cm-1
Aromaten: 2-3 Banden 1500-1600 cm-1
C=N: 1640-1690 cm-1
C=S: 1050-1200 cm-1
NO2: 1350 und 1560 cm-1 (sym. und asym. Valenzschwingung)
IR-Spektrum von Salicylsäuremethylester
100
50
O
O
OH
0
4000
3000
2000
1500
Wellenzahl ν∼ (cm-1)
Bereich der funktionellen Gruppen
hauptsächlich Valenzschwingungen
meist gut interpretierbar
O-H
C≡C
C=C, C=O
N-H
C≡N
C=N, N=O
C-H
X=Y=Z
N-H Deformation
1000
500
Fingerprint-Bereich
hauptsächlich Deformationsund Gerüstschwingungen
meist nicht vollständig
interpretierbar
31
IR-Spektren von Phenol und Anilin
IR-Spektrum von Benzoesäureamid
NH: oft 2 Banden
Amid I: C=O Valenzschwingung
Amid II: N-H bending
32
IR-Spektrum von Cimetidine
100
50
ν(C≡ N)
0
4000
3000
2000
1500
Wellenzahl ν∼ (cm-1)
1000
500
H
N
H
N
S
N
N
N
H
Cimetidine
C
N
IR - Aufnahmetechniken
Probenvorbereitung für Transmissionsmessungen
• KBr (KCl) Pressling (KBr-disc): häufig verwendet, polar,
enthält immer Spuren von H2O → νO-H ∼ 3450 cm-1
• Nujol-Technik (Paraffinöl): apolar, C-H (C-C) Bereich
vom Medium überlagert (für Luft- bzw.
feuchtigkeitsempfindliche Substanzen)
• in Lösung (NaCl-Zelle): Lösungsmittel z. B. CHCl3, CCl4
(Eigenabsorption des LM, Zweistrahlgerät!)
• flüssige (nicht wässrige) Proben: direkt zwischen NaCl
Plättchen (liquid film)
• gasförmige Proben in Spezialzellen (Umweltanalytik, GC-IR)
Das Aussehen des IR-Spektrums ein und derselben Substanz ist
sehr stark von der verwendeten Aufnahmetechnik abhängig!!!
33
Reflexionsmessungen
Abgeschwächte Totalreflexion (attenuated total reflexion,
ATR)
keine Probenvorbereitung nötig, Substanz wird auf
Probenträger aufgebracht und mit einer integrierten
Pressvorrichtung angedrückt (Vermeidung von Reflexionen
im Probeinneren)
Bestrahlung schräg von unten mit IR, Messung der
abgeschwächten Reflexionsstrahlung (mehrfache innere
Reflexion – MIR)
IR - Spektrometer
• Absorptionsspektrometer (ähnlich UV, strahlungsdurchlässige Bauteile dem IR-Bereich angepasst → HalogenidKristalle!)
• FTIR-Spektrometer (Fourier-Transform)
• alle Wellenlängen werden gleichzeitig angeregt
• man erhält ein Interferogramm (Überlagerung von
Schwingungen, 'Zeitdomäne')
• aus diesem wird durch eine mathematische Operation (FourierTransformation) das gewohnte IR-Spektrum erzeugt
('Frequenzdomäne' = Frequenz (Wellenzahl) gegen Intensität)
• Vorteil: viel schneller (Kopplung mit chromatographischen
Verfahren möglich), empfindlicher (besseres Signal-Rausch
Verhältnis), hohe Präzision (Eichung mittels Laser)
34
FT-IR Spektrometer (Michelson-Interferometer)
stationärer Spiegel
HeNe Laser
Apertur
Strahlenteiler
Strahlungsquelle
(Nernst-Stift, SiC-Globar, ..)
beweglicher Spiegel
Schlitten
Substanzprobe
Vergleichsprobe
Detektor
FT-IR
Interferogramm Referenz (I0)
‚Zeitdomäne‘
Interferogramm Probe (I)
Differenzbildung (I-I0)
und Fouriertransformation
IR-Spektrum (‚Frequenzdomäne‘)
35
1743 cm-1
O
O
???
oder
H3 C
O
CH3
H3 C
CH3
36
1688 cm-1
O
CH3
CH3
oder
???
O
1770 cm-1
O
O
O
O
O
37
IR – Resümee
• Nachweis bestimmter funktioneller Gruppen (z.B. C=O)
• routinemäßig bei der Strukturaufklärung
• Pharmazeutische Analytik: Identifizierung von
Arzneistoffen (Identitätsprüfung), Reinheitskontrolle
• meist nur qualitativ
• quantitative Bestimmungen zwar möglich, aber
ungenauer und mühsamer als bei UV/vis
Massenspektrometrie
• im Massenspektrometer werden Moleküle, die sich im
Gaszustand befinden, in energiereiche positive (bzw.
negative) Ionen übergeführt → Ionisierung
• die gebildeten energiereichen Ionen zerfallen (zumindest
zum Teil) in geladene und ungeladene Bruchstücke
→ Fragmentierung
• die geladenen Teilchen werden in einem elektrischen Feld
beschleunigt, nach ihrer Massenzahl (m/z) aufgetrennt
(meist in einem Magnetfeld) und registriert
• im resultierenden Massenspektrum sind die Massenzahlen
der (Fragment)-Ionen gegen ihre relative Intensität
dargestellt
• das Massenspektrum gibt meist wertvolle Hinweise auf die
Struktur der untersuchten Substanz
38
Aufbau eines Massenspektrometers
Pumpen
10-6 - 10-8 Pa
Hochvakuum
Einlaßsysteme
(Probenzuführung)
Ionenquelle
(Ionisierung,
Fragmentierung)
Analysator
(Fokussierung)
Empfänger
Verstärker
Schreiber
EDV-System
Substanz
rel.
Int.
m/z
Massenspektrum
MS – Probenzuführung – Einlass-Systeme
• Direkt-Einlass ('Schubstange'): beheizbarer Tiegel für feste
oder flüssige Proben, wird über Schleusenkammer in das
Massenspektrometer eingeführt, dann wird die Probe
verdampft (kombinierbar mit EI, CI, MALDI)
• Direkt-Infusion: Probe wird aus einem Vorratsbehälter über
eine Kapillare dosiert und kontinuierlich in das
Massenspektrometer eingeführt (besonders für Proben in
Lösung bzw. bereits im gasförmigem Zustand)
kombinierbar mit EI, CI, Spray-Methoden
erlaubt die Kopplung mit chromatographischen Methoden
(GC-MS, HPLC-MS)
39
•GC-MS (GC = Gaschromatographie)
für flüchtige Substanzen, GC-Trägergas mittels Jet-Separator
größtenteils abgetrennt
Kombination einer Hochleistungstrennmethode mit einer
Hochleistungsanalysenmethode, äußerst leistungsfähig
Jet-Separator
GC-Säule
Ionenquelle
Trägergas
+ Substanz
Trägergas
Substanz
Vakuum
•HPLC-MS Kombination (HPLC = high performance liquid
chromatography)
für polare Substanzen, Entfernung der polaren mobilen Phase
und Ionisierung mittels Elektrospray-Verfahren (ESI)
Ionisierung
• Entreißen eines Elektrons
→ es entsteht ein Radikal-Kation der Ladung +1 (Molekül-Ion,
M+•), sehr energiereich, fragmentiert stark, hauptsächlich bei EI
• Anlagerung eines Elektrons
→ es entsteht ein Radikal-Kation der Ladung -1, weniger
wichtig, nur für Moleküle mit hoher Elektronenaffinität (z.B.
Halogenverbindungen)
• Protonierung
→ durch Anlagerung eines Protons entsteht ein Kation [M+1]+
vorzugsweise an ‚basischen‘ Stellen des Moleküls (Atome mit
freien Elektronenpaaren wie Amine, O-Verbindungen),
bei CI, ESI, APCI, MALDI (Positiv-Modus); oft auch [M+Na]+
• Deprotonierung
→ durch Entfernen eines Protons entsteht ein Anion [M-1]-, bei
sauren Verbindungen (Carbonsäuren, Phenole),
bei CI, ESI, APCI, MALDI (Negativ-Modus)
40
Ionisierungstechniken
• gewünschter Information
• den Eigenschaften der Probe
Auswahl abhängig von
leicht verdampfbare
Elektronenstoß-Ionisation (electron impact, EI)
Substanzen
Chemische Ionisation (CI) → 'weiche' Ionisierungs(Verdampfungsmethoden) technik
schwer verdampfbare
Substanzen
(Desorptionsmethoden)
Feld-Desorption (FD)
Fast Atom Bombardement (FAB)
matrix-assisted Laser-Desorption (MALDI)
Sekundärionen-MS (SIMS)
Substanzen in Lösung
Elektrospray-Ionisation (ESI)
(Zerstäubungsmethoden) Atmospheric Pressure CI (APCI)
Inductive Coupled Plasma (ICP)
Desorption Electrospray Ionization (DESI)
Atmospheric Pressure Photo Ionization (APPI)
Das Aussehen eines Massenspektrums hängt sehr stark von der jeweils
verwendeten Ionisierungstechnik ab!
Electron-Impact (EI) Ionisation und Fragmentierung
Probe wird mit energiereichen Elektronen (70 eV) beschossen
Molekül
Ionisierung
Molekülion
Fragmentierung
a
A-B-C-D
[A-B-C-D]+ •
Heterolyse
Homolyse
b
1. Schritt
A
Neutralmolekül
[B-C-D] + •
Radikal-Kation
A•
Radikal
[B-C-D] +
Kation
2. Schritt
B
Neutralmolekül
[C-D] + •
Radikal-Kation
[C-D] +
Kation
B
Neutralmolekül
41
EI-Ionenquelle eines Massenspektrometers
Ionenquelle
(-)
(--)
Filament
Kammerspannung
Elektronenstrahl
EinlassSystem
Substanz-Dampf
Ionenstrom
Analysator
Ionisation,
Fragmentierung
Elektronenauffänger
Beschleunigungselektroden
Chemische Ionisation
Verwendung eines Hilfsgases, z. B. Methan, Isobutan, NH3
150 eV
1)
CH4 → CH4+•• + e- (Aktivierung des Gases)
2)
CH4+•• + CH4 → CH5+ + CH3 •
3)
CH5+ + M| → [M+H]+ + CH4
[M+H]+ ist kein Radikalkation → stabiler!
für saure Verbindungen: Verwendung eines basischen
Hilfsgases (z.b. NH3) → negativ geladene Ionen [M-H]-
42
MS-Desorptionsmethoden für polare,
schwer flüchtige Verbindungen
+
'EnergieLaser
puls'
durch:
Atome an einer
Oberfläche
(Matrix)
energiereiche
Atome
energiereiche
Ionen
desorbierte Ionen
Ionisierungstechniken: FAB (Fast Atom Bombardement)
bombardierender Atomstrahl (Ar, Xe)
Matrix
(z.B. Glycerin) mit
gelöster Substanz
Sonde
desorbierte Ionen
Ionenanalysator
metallische Spitze
(+kV für Spektren positiver Ionen,
-kV für Spektren negativer Ionen)
z.B. für organische Säuren, Polypeptide, Oligosaccharide, Oligonucleotide
Nachteil: Störung durch desorbierte Matrix-Molekül-Ionen
43
Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)
Laser-Strahl (gepulst)
Probenträger
(Stahl, 25 kV)
Matrix: z.B. 2,5Dihydroxybenzoesäure
(DHB), Sinapinsäure
(SA), 3-Hydroxypicolinsäure (3-HPA),
usw.
•
•
•
•
•
Einbettung der Probe in kristalline Matrix (Matrix : Probe ca. 1000 : 1)
Matrix-Moleküle müssen bei der Laser-Wellenlänge absorbieren, werden
dabei photo-ionisiert und übertragen Protonen auf die Probe → [MH]+
Probenvorbereitung wichtig (Matrix muss für Probe ‚passen‘!)
Messbereich bis MG 1 000 000 (verteilt auf mehrere Bereiche), sehr mild!
üblicherweise Kombination mit Flugzeit-Analysatoren (TOF)
weitere Desorptionsmethoden
Sekundärionen-MS (SIMS)
Durch Beschuss mit energiereichen Ionen (Cs+, Ar+, Ga+)
werden aus der Probe, die sich auf einer Metalloberfläche
befindet, positive und negative Ionen erzeugt; für Peptide und
Oligosaccharide, zur Analyse von Kontaminationen auf
Oberflächen
Feld-Desorption: Probe wird von einem aktivierten Draht
(beschichtet mit feinsten Kohlenstoff-Nadeln) unter Einfluss
starker elektrischer Felder desorbiert
44
Zerstäubungsmethoden: Elektrospray-Ionisierung
(ESI) bei HPLC-MS Kombination
freie Ionen
heißes Trockengas
(N2)
geladenes Aerosol
3-6 kV
MS
HPLC
Desolvatisierung
Spray-Gas
(N2)
elektrisch
leitender
Überzug
Ionen-Emission
N2
Ablauf für Gas- und
Lösungsmitteldampf
weitere Zerstäubungsmethoden
Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)
Ähnlich ESI, aber keine Spannung auf der Spraykapillare, Ionisierung des
Dampfgemisches (Probe plus N2) via Entladungsnadel
Vorteil gegenüber ESI: auch für apolare Verbindungen; Nachteil: höhere
thermische Belastung
Inductive Coupled Plasma (ICP)
für Bestimmung von Elementen, Eluat trifft unter Inertgas auf ca.
10 000 °C heiße Fackel, Zersetzung in atomare Bestandteile, Bildung von
Atom-Ionen
Desorption Electrospray Ionization (DESI)
Oberflächenanalyse (z.B. DC-Platten); geladene LM-Tröpfchen werden
auf Versuchsfläche gesprayt
Atmospheric Pressure Photo Ionization (APPI)
ähnlich APCI, Ionen werden aus dem Spray durch Bestrahlung mit
UV-Lampe erzeugt, für lipophile, unpolare Substanzen
45
Anwendungsbereich verschiedener Ionisierungsmethoden in
Abhängigkeit von Polarität und Molmasse
ionisch
ESI
APCI
MALDI
CI
EI
unpolar
101
103
104
Molmasse (MG)
102
106
105
MS von Ephedrin unter Verwendung verschiedener
HC
Ionisierungstechniken
3
NHCH3
OH
100
Ephedrin,
MG = 165
100
EI
FI
58
50
107
50
166
(M+1)
105
0
0
50
100
150
100
50
100
150
100
166
(M+1)
CI (Isobutan)
50
FD
50
107
58
148
0
166
(M+1)
108
148
92
0
50
100
150
50
100
150
46
MS - Analysatoren
•
•
•
•
•
magnetischer Sektor (Sektorfeldgeräte)
Quadrupol-Analysator
Ionenfalle (QIT) und Orbitrap
time of flight (TOF)
Fourier transform Ionencyclotronresonanz (FT-ICR)
Kenngrößen eines Analysators:
• Massenbereich (Messbereich, z.B. zwischen m/z 50-2000)
• Scangeschwindigkeit (Geschwindigkeit, mit dem der
Massenbereich durchgescannt werden kann, z.B. 2000 m/z s-1)
• Genauigkeit (Abweichung von der berechneten Masse des
Ions, ∆m/m)
• Auflösung: siehe 10% TAL-Definition
Magnet-Analysator eines Massenspektrometers
(Sektorfeld-Gerät)
Analysator-Rohr
Ionenstrom
Ionenquelle
Flugbahn m1
m2
B
Flugbahn m1
(die Pole des Elektromagneten befinden
sich oberhalb und unterhalb der
Zeichenebene)
Massenbereich ~ 10-6000
geringe Scangeschwindigkeit
m1
rel.
Int.
m/z
Massenspektrum
47
Auftrennung von Ionen im Magnetfeld
(Sektorfeld-Gerät)
r=
r
B
U
m
z
1 2⋅ U⋅m
B
z
Flugbahnradius
Magnetfeldstärke
Beschleunigungsspannung
Masse des Ions
Ladung des Ions (meist 1)
Quadrupol-Analysator
• Quadrupol-Feld zwischen 4 parallelen Metallstäben
∼
∼
• Wechselspannung ∼ wird so eingestellt, dass nur
Teilchen einer ganz bestimmten Masse zwischen den
Stäben 'durchkommen'
• arbeitet sehr schnell (→ GC-MS)
• nicht für hohe Massen (bis ca. 4000 m/z)
• relativ geringes Auflösungsvermögen
48
Quadrupol-Ionenfalle (Ion Trap, QIT, Paul-Falle)
• Ionenquelle und Massenanalysator befinden sich in einer gemeinsamen
Kammer
• positive Ionen werden durch ein Radiofrequenzfeld (Ring-Elektrode) in
einem zylinderförmigen Behältnis 'gefangen'
• nach einem Stablilisierungsschritt wird die Spannung an der
Ringelektrode sukzessive erhöht und die Ionen nach steigender Masse
freigesetzt und detektiert
• Massenbereich 50-6000, hohe Scangeschwindigkeit
Orbitrap-Analysatoren
äußere Elektrode
Zentralelektrode
Schwingung
•Ionen werden in elektrostatischem Feld gefangen, umkreisen die
spindelförmige Zentralelektrode und schwingen gleichzeitig entlang der
z-Achse in Abhängigkeit von m/z
•Die Schwingungen erzeugen in den äußeren, gespaltenen Elektroden Signale,
die mittels Fourier-Transformation in m/z-Werte umgewandelt werden
•Vorteile: hohe Genauigkeit, hohe Auflösung, Massenbereich bis 6000 m/z,
technisch viel weniger aufwendig als FT-ICR (keine Hochfeld-Magnete nötig)
49
Time of Flight (TOF) Analysator
Laser
linearer
Detektor
MALDI
Probenplatte
Detektor für Reflektron-
*Problem: Ionen
gleicher Masse haben
nicht genau gleich
große Geschwindigkeit
Modus*
(höhere Genauigkeit
und bessere Auflösung)
Flugrohr
Reflektron
tTOF ∝ m/z
kleine Ionen
fliegen
schneller!
Massenbereich 10 - > 300 000, hohe Scangeschwindigkeit
Bestimmung der Molekülmasse von Peptiden und
Proteinen heute meist mittels MALDI-TOF
Doppelt fokussierendes Massenspektrometer
(Hochauflösung)
Einlaßsysteme
Ionenquelle
elektrostatische
Fokussierung
Magnet-Fokussierung
Empfänger
50
Definition der Auflösung
A=
A: Auflösung
m: Masse
∆m: Unterschied der zu
trennenden Massen
m
∆M
'normales' MS: A ca. 1000-2000
hochaufgelöstes (high resolution) MS:
A ca. 150000!
N2: 28.0061
CO: 27.9949
C2H4: 28.0313
mit HRMS
unterscheidbar
75%
genaue Massenzahlen
reiner Isotope:
10%
1H:
1.007825
12C: 12.00000 (Definition)
14N: 14.003074
16O: 15.994915
zwei gleich intensive,
benachbarte Signale
mit 10% Überlappung
(10% TAL-Definition)
zwei gleich intensive Peaks
bei ungenügender Auflösung,
registriert wird die Resultierende
(außen)
Periodensystem
1
2
H
He
1.0079
4.0026
3
4
5
6
7
8
9
10
Li
Be
B
C
N
O
F
Ne
6.939
9.0122
10.811 12.011 14.007 15.999 18.998 20.179
11
12
13
14
15
16
17
18
Na
Mg
Al
Si
P
S
Cl
Ar
20.99
24.305
26.982 28.086 30.974 32.06
35.453 39.948
19
20
21
22
23
24
25
K
Ca
Sc
Ti
V
Cr
Mn Fe
26
26
28
29
30
31
32
33
34
35
36
Co
Ni
Cu
Zn
Ga
Ge
As
Se
Br
Kr
39.098 40.08
44.956 47.90
50.942 51.996 54.938 55.847 58.933 58.71
63.546 65.38
69.735 72.59
74.922 78.96
79.904 83.80
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
Rb
Sr
Y
Zr
Nb
Mo
Tc
Ru
Rh
Pd
Ag
Cd
In
Sn
Sb
Te
J
Xe
85.47
87.62
88.905 91.22
92.906 95.94
98.906 101.07 102.91 106.4
107.87 112.4
114.82 118.69 121.75 127.60 126.90 131.30
55
56
57
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
Cs
Ba
La
Hf
Ta
W
Re
Os
Ir
Pt
Au
Hg
Tl
Pb
Bi
Po
At
Rn
132.91 137.34 138.91 178.49 180.95 183.85 186.2
190.2
192.2
195.09 196.97 200.59 204.37 207.19 208.98 (209)
(210)
(222)
87
88
89
104
105
106
107
108
109
Fr
Ra
Ac
Rf
Db
Sg
Bh
Hs
Mt
(223)
226.03 (227)
(261)
(262)
(263)
(262)
(265)
(266)
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
Ce
Pr
Nd
Pm
Sm
Eu
Gd
Tb
Dy
Ho
Er
Tm
Yb
Lu
140.12 140.91 144.24 (145)
150.35 151.96 157.25 158.93 162.50 164.93 167.26 168.93 173.04 174.97
90
91
92
93
94
95
98
99
100
101
102
103
Th
Pa
U
Np
Pu
Am Cm Bk
Cf
Es
Fm
Md No
Lw
(243)
(251)
(254)
(257)
(258)
(260)
232.04 231.04 238.03 237.05 (224)
96
(247)
97
(247)
(259)
51
Massenanalyse – Begriffe
Einheit: [u] ‚unit‘: 1/12 der Masse des Isotops 12C (synonym: Da (Dalton), amu)
nominale Masse: Summe der zu ganzen Zahlen gerundeten Atommassen einer
Verbindung. Verbindungen gleicher nominaler Masse bezeichnet man als isobar
(auch wenn sich diese in ihrer exakten Masse unterscheiden) z.B. N2, CO, C2H4
– alle 28
exakte Masse: die mit hoher Genauigkeit ( ≥4 Nachkommastellen, doppelt
fokussierende Geräte) gemessene Masse: z.B. N2: 28.0061
isotopische Masse: exakte Masse eines Isotops
monoisotopische Masse: Masse jenes Teilchens, bei dem nur die häufigsten Isotope
der jeweiligen Elemente zur Gesamtmasse beitragen
Kohlenstoff: 12C, 13C, (14C); Wasserstoff: 1H = H, 2H = D, (3H=T)
Methan: Mmi entspricht exakter Masse von 12CH4; nicht: 13CH4, 12CDH3, 12CD2H2,
12CD H, 12CD ; 13CH , 13CDH , 13CD H , 13CD H, 13CD , 14CH …usw……(14CT ).
3
4
4
3
2 2
3
4
4
4
‚Molekulargewicht‘: jener Massenwert, der sich aus der Summe der mittleren
Massen der Elemente (über deren Isotopenverteilung gemittelt) ergibt – kann nicht
direkt gemessen werden!
MS - Spektrenauswertung
% rel. Int.
100%
Basis-Peak (base peak) = größter
Peak im Spektrum, wird als
100% relative Intensität gesetzt,
alle anderen Peaks werden in %
des Basispeaks angegeben
50%
Molekülionen-Peak
(parent peak), M+•, muß
M-y nicht immer vorhanden
sein!
M-x
m/z
0%
'Schlüsselbruchstücke'
52
Isotopenpeaks - Nachweis bestimmter Elemente - Brom
1:1
Brom: Gemisch aus 2 Isotopen 79Br : 81Br 1 : 1
HBr
1 Brom-Atom im Molekül (z.B. HBr) :
80
2 Brom-Atome im Molekül (z.B. Br2):
→ MG 158
79Br–81Br → MG 160
81Br–79Br → MG 160
81Br–81Br → MG 162
79Br–79Br
82
1:2:1
W= 1
Br2
W = 1+1 = 2
W=1
158
160
162
3 Brom-Atome im Molekül: → 1 : 3 : 3 : 1
1:3:3:1
aaa
X
1
3 Br im Molekülaab aba baa X+2 1 + 1 + 1 = 3
bzw. Fragmention
abb bab bba X+4 1 + 1 + 1 = 3
bbb
X+6 1
X+2 X+4
X
X+6
Isotopenpeaks - Nachweis bestimmter Elemente - Chlor
3:1
Chlor: Gemisch aus 2 Isotopen 35Cl : 37Cl 3 : 1
HCl
1 Chlor-Atom im Molekül (z.B. HCl) :
36
2 Chlor-Atome im Molekül (z.B. Cl2):
→ MG 70
35Cl–37Cl → MG 72
37Cl–35Cl → MG 72
37Cl–37Cl → MG 74
35Cl–35Cl
W = 3•3 = 9
W = 3•1 = 3
3+3 = 6
W = 1•3 = 3
W = 1•1 = 1
38
9:6:1
70
72
Cl2
74
3 Chlor-Atome im Molekül: → 27 : 27 : 9 : 1
aaa
X
W = 3•3•3 = 27
aab aba baa X+2 W = 3•3•1 + 3•1•3 + 1•3•3 = 27
abb bab bba X+4 W = 3•1•1 + 1•3•1 + 1•1•3 = 9
bbb
X+6 W = 1•1•1 = 1
53
Isotopenpeaks - allgemeine Formel
(a + b)n
a: leichteres Isotop b: schwereres Isotop
n: Anzahl der Atome des isotopen Elements
a/b: Mengenverhältnis der Isotopen
binomischer Lehrsatz:
(a +
b)1
=a+b
(a + b)2 = a2 + 2ab + b2
Isotopenpeaks treten auch z.B. bei
C auf, allerdings kaum auswertbar
(12C : 13C ∼ 99 : 1) → sehr kleine
'Nebenpeaks' → 'Schotter'
(a + b)3 = a3 + 3a2b + 3ab2 + b3
die Zahl der Glieder des Binoms gibt die Anzahl der
Isotopenpeaks an, die Zahlen selbst das Verhältnis der
Intensitäten
z.B. für 2 Cl-Atome im Molekül:
(3 + 1)2 = 9 + 2•3•1 + 1 = 9 + 6 +1
wichtig für Strukturaufklärung (Aufstellen einer
Strukturformel) mittels MS:
• Elemente O, C, S: gerade Wertigkeit, gerades Atomgewicht
• Elemente H, F, Cl, Br, I: ungerade Wertigkeit, ungerades
Atomgewicht
→ Verbindungen, die nur diese Elemente enthalten, haben
immer eine geradzahlige Molekülmasse (Molekulargewicht)
Ausnahme: N ungerade Wertigkeit, gerades Atomgewicht
→ Verbindungen mit einer ungeraden Anzahl an N-Atomen
haben stets ein ungerades Molekulargewicht!
54
Fragmentierungsverhalten bei EI-Ionisierung
Prinzipielle Zerfallsmöglichkeiten eines Molekülions
(1)
(2)
[A – B]+••
A•
Molekülion
neutrales
Radikal
[A – B]+••
A||
Molekülion
Neutralteilchen
mit gerader
Elektronenzahl
+
B+
Kation mit gerader
Elektronenzahl
+
B •+
Radikalkation
Weg (1) energetisch meist bevorzugt
Weg (2) bevorzugt, wenn besonders stabiles Neutralteilchen
(H2O, N2, CO) entsteht
Einige charakteristische Neutralteilchen,
die aus M+• abgespalten werden
Neutralteilchen
aus
führt zu Ion mit m/z

H
Aldehyden
M-1
CH3
Methylverbindungen
M-15
H2O
Alkoholen
M-18
C2H4
CO
ex McLafferty
M-28
N2
CHO
Aldehyden
M-29
C2H5
Ethylverbindungen
M-29
OCH3
Methoxyverbindungen
M-31
55
homolytische Spaltung in α-Stellung zu
einer C-Heteroatombindung (α
α-Spaltung)
H
α
R•
R – C – Y+•
H
+
H2C = Y +
Ion mit gerader
Elektronenzahl
Y = OH, NH2, =O
prim. Alkohole: R–CH2–OH+• → R• + H2C=OH+ (m/z = 31)
prim. Amine:
R–CH2–NH2+• → R• + H2C=NH2+ (m/z = 30)
Aldehyde:
R–C=O+•
→ H• + R–C≡O+ (M+-1)
H
O·
Methylester:
R
→ R• + H–C≡O+ (m/z = 29)
+
OMe
→ R• + |O≡C-OCH3+ (m/z = 59)
→ OCH3• + R–C≡O|+ (m/z = M+-31)
56
Mc Lafferty - Umlagerung
Voraussetzungen:
• π-Elektronensystem
• H-Atom am dazu γ-ständigen C
• Molekül muss so beweglich sein, dass 6-gliedriger
Übergangszustand möglich ist
γ
β
α
stabiles
Neutralteilchen
Radikal-Kation
Spaltung der Bindung α,β zum π-Elektronensystem
Retro-Diels-Alder (RDA) Reaktion
Beispiele:
- C2H4
m/z = 171
m/z =284
m/z = 143
m/z = 152
m/z = 132
57
Onium-Reaktion
H
α-Spaltung
m/z = 222
m/z = 177
Onium
aus
Phthalsäureestern
(Weichmacher)
m/z = 149
charakteristische Fragmentionen
m/z
Ion
aus
—————————————————————————
29
HCO+
Aldehyden
C2H5
+
Ethyl-Verbindungen
+
30
CH2NH2
31
CH2OH+
prim. Alkohol
OCH3+
Methoxy-Verbindungen
C3H7+
Propyl-Verbindungen
43
59
prim. Amin
CH3
CO+
CH3-CO-X
CH3
OCO+
Methylester
77
C6H5
+
Phenyl-Verbindungen
91
Tropylium+
Benzyl-Verbindungen
105
C6H5
CO+
Benzoyl-Verbindungen
58
Übergangssignale (metastabile Ionen)
mT 2 ⋅ zM
m =
mM ⋅ zT
∗
mT: Masse des Tochterions
mM: Masse des Mutterions
zM: Ladung des Mutterions (meist 1)
zT: Ladung des Tochterions (meist 1)
MS von Benzoesäuremethylester
105
O
77
O
105
51
CH3
77
- HC≡CH
- CO
136 (M+)
- OCH3
59
MS einer unbekannten Substanz
77
156 158
MS von Brombenzol
77
Br
156 158
60
MS einer unbekannten Substanz
234/236/238
155/157
MS von 1,4-Dibrombenzol
Br
234/236/238
- Br
Br
- Br
155/157
61
MS von 4-Nitrobenzaldehyd
151
O
H
150
NO2
????
106
78
137 (M+)
62
MS von Nicotinsäuremethylester
106
O
78
O
N
CH3
78
105
137 (M+)
????????
1689
78
106
M+ = 121
63
EI-Massenspektrum von Benzocain
120
165
(M+)
92
137
Röntgenstrukturanalyse - Interferenz
konstruktive Interferenz
→ Verstärkung
destruktive Interferenz
→ Auslöschung
64
Röntgenstrukturanalyse - Beugungsbedingung (Bragg)
• Beugung von Röntgenstrahlen an
den Gitterbausteinen eines Kristalls
(λ ähnlich den Gitterkonstanten).
Bragg - Bedingung
θ
• In Abhängigkeit von der
Phasendifferenz erfolgt konstruktive
bzw. destruktive Interferenz.
}d
Gitterbausteine
θθ
d
• Es entstehen charakteristische
Beugungsmuster. Aus diesen kann
dsinθ
man die Daten der Elementarzelle
für konstruktive Interferenz:
nλ = 2dsinθ (Bragg-Bedingung) des Kristalls berechnen.
dsinθ
n: Beugungsordnung
λ: Wellenlänge
d: Gitterabstand
θ: Beugungswinkel
Röntgenstrukturanalyse - Aufnahme von Beugungsbildern
X-Ray Diffraction
X-ray
Tube
High
Voltage
X-ray
Beam
Crystal
Photographic
Plate
Lead
Screen
65
Röntgenstrukturanalyse - Elektronendichten
Nach Messung der Streuintensitäten mit speziellen
Diffraktometern werden die Elektronendichten berechnet
(Computer) und in Konturdiagrammen wiedergegeben.
FourierSynthese
Beugungsbild/
Streuintensitäten
Elektronendichte-'map'
Röntgenstrukturanalyse
• alle Bindungslängen
• alle Bindungswinkel
• alle Torsionswinkel
• H-Brücken
CH3
N
N
O
H
O
W. Holzer, K. Mereiter, B. Plagens, Heterocycles 50, 799 (1999)
Elementarzelle
66
Röntgenstrukturanalyse
Vorteile:
• liefert genaue 3-dimensionale Struktur (alle Bindungslängen, Bindungswinkel, Torsionswinkel)
• Bestimmung der absoluten Konfiguration bei chiralen
Verbindungen (wenn schwereres Atom vorhanden)
Nachteile:
• Beschränkung auf den festen Zustand
• Bio-Moleküle können im physiologischen Milieu anders
vorliegen als im Kristall
• genügend große Einkristalle der Probe erforderlich (viele
Substanzen kristallisieren nicht oder nicht gut genug)
• Position der H-Atome muß nachträglich berechnet werden,
da deren Röntgenbeugung nur sehr schwach ist
Struktur eines Enzyms - ermittelt via X-ray
67
Kernresonanz-Spektroskopie (NMR)
Einteilung der Atomkerne
Nuklid ist charakterisiert durch Ordnungszahl (OZ) und
Massenzahl (MZ)
gerade (g)
MZ
OZ
14
N (ug)
7
15
N (uu)
7
13
C (gu)
6
12
6
C (gg)
ungerade (u)
ug, gu, uu - Kerne: Spinquantenzahl I > 0 (1/2, 1, 3/2, 2, ...),
besitzen magnetisches Moment µ
gg-Kerne: Spinquantenzahl I = 0, kein magnetisches Moment µ,
dem NMR-Experiment nicht zugänglich! → z.B. 12C, 16O !
wichtige NMR-aktive Kerne: 1H (99.985%), 2H (0.015%), 13C
(1.1%), 15N (0.36%), 19F (100%), 31P (100%), [17O (0.037%)]
Der Spin des Wasserstoffkerns (Protons)
Spin
Magnetfeld
+
N
S
+
S
N
Symbol für den
Kernspin
1H-Kerne
(I = ½) verhalten sich wie kleine 'Stabmagnete'
(richtiger: atomare Kreisel)
68
1H-Kerne
(I = ½) im Magnetfeld
ohne Anlegen eines äußeren Magnetfelds sind die magnetischen Momente
der Kerne gleichmäßig in alle Raumrichtungen verteilt, es existiert keine
bevorzugte Richtung
beim Anlegen eines äußeren Magnetfeldes B0 ergeben sich 2 Einstellmöglichkeiten: 1. in Richtung von B0 (energetisch günstiger)
2. gegen die Richtung von B0 (energetisch etwas ungünstiger)
Bo
Besetzung der Energieniveaus α und β im Gleichgewichtszustand
(Boltzmann-Verteilung)
mit Magnetfeld
β
ohne Magnetfeld
∆E = h ν
Bo > 0
Bo = 0
α
∆E
−
Nβ
∆E
γhB0
= e kBT ≈ 1 −
= 1−
Nα
kBT
kBT
kB = Boltzmann-Konstante = 1.3805•10-23 JK-1
T = absolute Temperatur in K
Nα,β = Anzahl der Kerne im α bzw. β-Niveau
∆E für 1H bei 400 MHz
(Bo = 9.5 T): 3.8 x 10-5
Kcal/mol
→ Nα / Nβ = 1.000064
• je größer B0, desto größer die Energiedifferenz zwischen
α und β Niveau → möglichst starkes Magnetfeld!!!!
• je tiefer die Temperatur, desto größer ∆E (wenig Spielraum!)
69
Anregung, Relaxation, Sättigung
Nβ
Relaxation
∆E = hν
Anregung
Nα
β
α
Gleichgewicht
(Boltzmann-Verteilung,
nach Relaxation)
nach
Anregung
Sättigung
Relaxation: das System kehrt nach einer Störung wieder in das
thermische Gleichgewicht (Boltzmann-Verteilung) zurück
Resonanzbedingung (Larmor-Gleichung)
ωo
µ
Bo
h
⋅ B0 = h ⋅ ν
2π
bzw. ω = 2πν = γ ⋅ B0
∆E = γ ⋅
auf µ wirken zwei Kräfte - die eine versucht ihn
entlang B0 auszurichten, die andere hält ihn
'spinning' → es resultiert eine Kreiselbewegung
(Präzessionsbewegung) in einem bestimmten
Winkel zu B0 ('Kernkreisel' )
→ Analogie zum mechanischen Kreisel
(dort Schwerkraft anstatt B0)
⇒ ν = γ⋅
B0
2π
γ = magnetogyrisches (gyromagnetisches) Verhältnis (Naturkonstante welche
die Empfindlichkeit eines Kernes für das NMR-Experiment beschreibt)
ν = Resonanzfrequenz (60-900 MHz bei NMR-Geräten)
ω = Kreisfrequenz der Präzessionsbewegung, Larmorfrequenz
70
Abschirmung des Atomkernes durch die
Elektronenbewegung
B0
B0
in Abhängigkeit von der Beschaffenheit der Elektronenhülle
erfährt der Atomkern eine mehr oder weniger große
Abschirmung → unterschiedliche elektronische Umgebung
führt zu (leicht) unterschiedlichen Resonanzfrequenzen!!!
NMR-Spektrometer (CW) - schematisch
Proberöhrchen mit
Lösung
Sweep- und
x
Shim Spulen
Empfänger
-spule
Magnet
Magnet
S
N
z
Computer,
Bildschirm
Schreiber
Verstärker
Sender
y
Oszilloskop
Senderspule
71
NMR - Meßverfahren
1) CW-Technik (continous wave)
die einzelnen Resonanzen werden nacheinander durch kontinuierliche Veränderung von ν (Frequenz-sweep) oder B0 (Feld-sweep)
unter Erfüllung der Resonanzbedingung ν = γ/2π•B0 erfaßt
→ veraltet, langsam, unempfindlich (nur für empfindliche Kerne),
keine modernen NMR-Experimente möglich
2) Puls-Fourier-Transform Technik (PFT)
alle Resonanzen werden durch einen RF-Puls gleichzeitig angeregt
das erhaltene Interferogramm (Überlagerung aller Abklingkurven =
free induction decay - FID) wird durch eine mathematische
Operation (Fourier-Transformation) in das NMR-Spektrum
umgewandelt
→ schnell, empfindlich (Akkumlierung von FIDs üblich), besser
bearbeitbar; moderne NMR-Spektroskopie verwendet 'Pulsfolgen' =
Kombination von mehreren Pulsen verschiedener Richtung und
Größe, getrennt durch genau definierte Zeitintervalle
Kryomagnet (supraleitende Spule)
heute praktisch ausschließlich
verwendet (Permanent- oder
Elektromagnete nur bis 100
MHz, Kryomagnet bis 1GHz)
72
Benchtop NMR Spektrometer
Spezieller Permanentmagnet (hier 60 MHz 1H-Frequenz)
Für einfache Anwendungen wie Analyse unkomplizierter
Moleküle, Reaktionskontrolle, Qualitätskontrolle, usw.
Ausbildung (Lehrzwecke)
Verteilung der Kerne auf dem Doppelpräzessionskegel
z
Wegen Nα > Nβ resultiert eine
makroskopische Gesamt-Magnetisierung
(bulk) M0 in z-Richtung (Richtung des
Magnetfeldes B0). Durch die statistische
Verteilung in der xy-Ebene sind die
Komponenten entlang der x- und y-Achse
gleich Null! (keine tranversale Magnetisierung)
B0
M0
Nα
y
B0
x
Nβ
übliche vereinfachte
Darstellung
73
Puls-NMR
z
B0
z
90°x-Puls
Mo
Puls (B1)
y
B1
B1 aus…
x
x
Mxy ωo
y
nach 90°-Puls beginnt M in der xy-Ebene zu rotieren (mit der Larmorfrequenz ω0)
→ damit detektierbare, transversale Magnetisierung erzeugt! Detektion mittels
Empfängerspule(n) auf der x und y-Achse → der rotierende Vektor M erzeugt dort
eine sinus (cosinus) - förmige Wechselspannung mit der Frequenz ω0
-x
t
-y
+y
+x
+1
usw.
0
-1
Puls-NMR - Relaxation und FID
nach Abschalten des Pulses (Störung der GG-Population) kehrt das
System wieder ins GG (M0 in Richtung von B0) zurück
(Relaxation) → der rotierende Vektor M richtet sich wieder in die
z-Richtung auf - die transversale Magnetisierung zerfällt. Es
resultiert in der Empfängerspule daher eine Wechselspannung mit
abnehmender Amplitude, im Realfall eine Überlagerung vieler
Abklingkurven - der FID (free induction decay).
Amplitude
→ Zeit
'Realfall' (viele spins mit
verschiedener Frequenz und
verschiedener Amplitude)
74
vom FID zum NMR-Spektrum
Umwandlung der Zeitdomäne FID (Signalamplitude als
Funktion der Zeit) in die Frequenzdomäne NMR-Spektrum
(Signalamplitude als Funktion der Frequenz) durch FourierTransformation
f (t ) =
+∞
∫ F (ν )e
−i 2πν
dν
−∞
FT
F (ν ) =
+∞
∫ f (t )e
i 2πν
FT
dt
−∞
Realteil
→Absorption
Imaginärteil → Dispersion
1H-NMR
0
t1
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80
0.90
1.00
sec
- Abschirmung und chemische Verschiebung
• 1H wichtigster NMR aktiver Kern – natürliche Häufigkeit ist
99.985%
I=½
γ groß → sehr empfindlich
• Abschirmung: auf 1H-Kern wirkt nicht exakt B0, sondern –
bedingt durch die elektronische Abschirmung – ein etwas
kleineres Feld Beff
• Beff = B0 – σB0 = (1 – σ) B0 (σ: Abschirmungskonstante)
→ Resonanzbedingung: ν = γ/2π (1 – σ) B0
• Protonen mit unterschiedlicher elektronischer Umgebung haben
unterschiedliche Resonanzfrequenzen. Das 1H-NMR Spektrum
einer Substanz mit unterschiedlichen Sorten von Protonen besteht
daher aus so vielen Signalen, wie es verschieden Typen von
Protonon im Molekül gibt
• Signale zueinander verschoben → chemische Verschiebung
75
Chemische Verschiebung
• Es wird nicht die absolute Lage eines Resonanzsignales gemessen
(z.B. 500 000 423 Hz) sondern die relative Lage zum Signal einer
CH
Standardsubstanz (Tetramethylsilan = TMS). Die Lage des
H C Si CH
Standardsignales wird definitionsgemäß 0 gesetzt.
CH
3
3
3
3
• Angabe der chemischen Verschiebung nicht in Hz weil dann
Aufnahmen bei verschiedenen Feldstärken nicht vergleichbar sind
(ν ist von B0 abhängig – siehe Resonanzbedingung)
TMS
• δ-Skala: chem. Verschiebung als dimensionslose Zahl angegeben,
damit unabhängig von B0
δ=
ν(Signal) − ν(TMS)
ν(Signal) − ν(TMS)
oder δ (ppm) =
Betriebsfr equenz
MHz des Gerätes
z.B. 500 MHz-Gerät, ν(Signal) = 2000 Hz → δ (ppm) = 2000/500 = 4
ppm = parts per million = 1/1 000 000 !!! (keine physikalische Einheit!)
1H-NMR
Spektrum - CH3Cl, CH2Cl2, CHCl3 (äquimolar)
niedrigere Frequenz
höheres Feld
Abschirmung
höhere Frequenz
tieferes Feld
Entschirmung
CH3Cl
SiMe4
CH2Cl2
(TMS)
CHCl3
7.26 ppm
10.0
9.0
8.0
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0
(δ, ppm)
• Die Intensität eines Signals wird durch seine Fläche bestimmt (Integral)
• die Intensitäten 2-er Signale verhalten sich so wie das Verhältnis der
Protonen, welche die 2 Signale liefern (z.B. CH3- zu CH2- = 3 : 2)
• man erhält nur relative Intensitäten!
76
1H-NMR
chemische Verschiebung
Beeinflussung hauptsächlich durch:
• Induktive Substituenteneffekte
elektronegative Substituenten in der Nähe des betrachteten Protons
erniedrigen die Elektronendichte → Entschirmung, Tieffeldverschiebung,
δ groß
elektropositive Substituenten erhöhen die Abschirmung →
Hochfeldverschiebung, δ klein
• Mesomerieffekte
positive Partialladung in (relevanten) mesomeren Grenzstrukturen →
Elektronenmangel, Entschirmung, δ groß
negative Partialladung → hohe Elektronendichte, Abschirmung, δ klein
• Anisotropieeffekte
durch B0 wird ein sekundäres Magnetfeld erzeugt, welches nicht in allen
Raumrichtungen gleich groß ist (anisotrop). Je nach räumlicher Lage des
betreffenden Protons zu diesem Sekundärfeld kann Entschirmung oder
Abschirmung erfolgen
Induktive Substituenteneffekte
• stark nur über 1 Bindung, mit zunehmenden Abstand rasch abnehmend
CH3-Cl
CH3-CH2-Cl
δ 3.05
CH3-CH2-CH2-Cl
1.04
MeX
1.42
δ(Me)
EN(X)
• Bei Mehrfachsubstitution kumulative Effekte
MeLi
–1
1.0
MeSiMe3
0
1.8
CH4
δ 0.23
MeH
0.4
2.1
MeMe
0.8
2.5
MeNH2
2.36
3.0
MeOH
3.38
3.5
MeI
2.16
2.5
MeBr
2.70
2.8
MeCl
3.05
3.0
MeF
4.25
4.0
MeNO2
4.33
CH3Cl
3.05
∆δ 2.82
CH2Cl2
5.33
2.28
CHCl3
7.26
1.93
• δ (Methin) > δ (Methylen) > δ (Methyl)
Me2-CH-Cl
δ 4.13
Me-CH2-Cl
3.51
CH3-Cl
3.05
77
Mesomerieffekte
H
6.52
H
7.00
H
N
H + H
N
H
H
H + H
N
H + H
N
−
−
H
−
H
7.26
6.61
−
−O + O
N
8.17
H
7.53
H
−
O + O
N
H
−
−
−
O + O
N
+
−
O + O
N
+
H
+
H
7.69
−
O
5.93
6.88
O
+
O
6.37
O
−
4.65
+
Benzol - Ringstromeffekt
Benzol
[18]-Annulen
(13C: 128.5)
H
9.28
7.26
H
H
-2.99
H
(13C:
123.3)
H
Ethen
9.17
7.26
5.37
-
+
jeweils 6 π-Elektronen (n = 1)
5.28
5.79 (13C: 132.0)
≡
Cylooctatetraen
Hückel-Regel:
Aromaten besitzen (4n + 2)
π-Elektronen (n = 1, 2, 3, ...)
78
magnetische Anisotropie von C=C, C=O, C≡
≡C, NO2
1.66
4.96
H 3C
0.91 1.33
H
C C
H3C CH2 CH3
5.73 H
Propan
H 4.88
H ist in B im Vergleich zu A
um 1.7 ppm tieffeldverschoben
Propen
2.20
H3 C
+H
1.8 H3C C C H 1.8
C O
H
9.80 H
Acetaldehyd
C
H
C
Propin
A
B
magnetische Anisotropie in Cyclohexanderivaten
Hax
Hax (axial) stärker abgeschirmt
als Heq (äquatorial)
Heq
HO
H
H
H
HO
OH
3.78
OMe
5.18
O
H
OH
HO
O
H
H
α-Form
4.69
H
H
H
HO
OH
3.97
OMe
OH
H
β-Form
Methoxygalaktose
79
chemische Äquivalenz
Zwei Kerne innerhalb eines Moleküls sind chemisch äquivalent, wenn
sie durch eine auf das Molekül anwendbare Symmetrieoperation
ineinander übergeführt werden können, oder wenn sie durch eine
schnelle (schneller als die NMR-Zeitskala), intramolekulare Bewegung
im Zeitmittel identisch werden. Kerne mit identer chemischer
Verschiebung nennt man isochron. Isochronie kann aufgrund
chemischer Äquivalenz erfolgen oder aber auch rein zufällig bedingt
sein.
Befindet sich in Nachbarschaft einer CH2- (oder z.B. CMe2-) Funktion
ein chirales (oder prochirales) Zentrum, sind die beiden Methylenprotonen Ha und Hb (bzw. Methylgruppen) nicht mehr chemisch
äquivalent! Man bezeichnet solche Gruppen als diastereotop.
HH
*
Hb
Hb H
H
Me
*
HC C C* COOH
Ph C C* COOH
Me
Ha NH2
Ha NH2
Leucin
Phenylalanin
Cholesterin
Symmetrie
• die Zahl der im Spektrum eines Moleküls auftretenden Signale
ist entscheidend von der Symmetrie im Molekül abhängig!
∗
•
H3C CH2 Br
∗
• ∗
H3C C
H2
∗H C
3
HC
∗3
CH3
2 Signale
(3:2)
2 Signale
(3:1)
•
H
•
H
∗ H3C
CH3
H3C
H
H3C
Cl
1 Signal
∗ H3C
∗H
∗
CH3
∗
H
∗
∗
H
?
H
CN
1 Signal
2 Signale
(3:1)
∗
∗
H
H
?
NC
H
∗
• Enantiomere: die korrespondierenden Signale optischer
Antipoden sind im achiralen Milieu ident (völlig idente
Spektren)
erst im chiralen Milieu (chiraler Hilfsstoff, chirales LM)
kann Nichtäquivalenz auftreten
H
80
1H-NMR
Verschiebungsbereiche organischer Moleküle
Protonen an Heteroatomen
• 'acide' Protonen: OH, NH, SH sehr beweglich, bilden H-Brücken
• δ stark abhängig von Konzentration, Temperatur, Lösungsmittel
• schnelle Austauschreaktion (Identifizierungsmöglichkeit):
R-O-H* + H-OH → R-O-H + H*-OH
• Zugabe von D2O zur Probelösung: ROH + DOD → ROD + HOD
→ Signal von ROH verschwindet, eines für HOD erscheint
EtOH
H in intramolekularen H-Brücken haben größte Verschiebung
O
O
H
O
R
R
H
H
N
N
O
oft 14-18 ppm!
intramol. H-Brücken
weitgehend konzentrationsunabhängig
81
Spin-Spin Kopplung
B0
HA entweder ↑ (in Richtung B0 → Verstärkung von B0)
oder ↓ (entgegen B0 → Abschwächung von B0)
C–HA
C-HB
• Wenn HB einen Kern HA der Sorte ↑ ‘spürt ‘ kommt es bei (geringfügig‘) anderer
Frequenz zur Resonanz als wenn HA der Sorte ↓ angehört:
• da beide Sorten aber statistisch gleich verteilt sind (geringe Besetzungsunterschiede
hier vernachlässigbar) kommt es zu einer 1:1 Aufspaltung des Signals von HB. Der
Abstand der beiden Signalkomponenten ist die Kopplungskonstante J.
• J kann ein positives oder negatives Vorzeichen haben (aus dem Spektrum meist nicht
direkt ablesbar)
• Kopplungen werden durch Bindungselektronen übertragen (skalare Spin-Spin
Kopplung)
• Kopplung erfolgt gegenseitig → analoge Situation für HA: J(B,A) = J(A,B)
• die Größe von J ist unabhängig von der Stärke des äußeren Magnetfeldes B0 !!!!!
Spin-Spin Kopplung
JAB JAB
HA– C–HA
B0
B0
C–HB
HA
energetisch
gleichwertig
Triplett
1:2:1
δΒ
JAB JAB JAB
Quartett
1:3:3:1
HA– C–HA
C–HB
δΒ
Allgemein: Koppelt ein Proton mit n äquivalenten Nachbarprotonen, so beträgt
seine Signalmultiplizität n + 1 Linien. Die relativen Signalintensitäten verhalten
sich wie Binomialkoeffizienten (Pascal‘sches Dreieck).*
*
Nur für
Spektren
1.Ordnung
82
Kopplungsbaum
AMX
AM2
JAM = 10 Hz
JAX = 4 Hz
JAM = 10 Hz
JAM
JAM
JAX
JAM
JAX
1
:
JAM
2
:
1
1 :1 : 1 :1
Sign
al
Dublett eines Dubletts
(dd)
Triplett (t)
Vorzeichen von Kopplungskonstanten
Die Kopplungskonstante J hat - definitionsgemäß – dann ein positives
Vorzeichen, wenn die antiparallele Einstellung die Energie absenkt
I
S
1J
ist positiv für Kerne
mit γ > 0 (z.B. 13C-1H)
E
Links: ohne Kopplung (J = 0)
Rechts: J > 0 (positiv) → Absenkung der
Energieniveaus 2 (αβ) und 3 (βα)
CH2-Gruppe: parallele Einstellung
ist günstiger (Hund‘sche Regel) →
2J(H,H) meist negativ
3J(H,H)
positiv, long-range
Kopplungen positiv oder negativ
83
Spektrenordnung
• Spektren 1. Ordnung: ∆ν/J > 10
• Spektren höherer Ordnung: ∆ν/J < 10
• mehr Linien als 1. Ordnung
• δ und J können meist nicht mehr direkt abgelesen werden (Computeranalyse)
• keine binomialen Intensitätsverhältnisse
• oft charakteristische Dachform
Magnetische Äquivalenz
2 Kerne A und B sind magnetisch
äquivalent, wenn sie
a) chemisch äquivalent sind und
b) zu allen anderen möglichen
Kernen, die nicht die gleiche
chemische Verschiebung wie A und
B aufweisen, die gleiche
Kopplungskonstante besitzen. Die
Kopplung zwischen magnetisch
äquivalenten Kernen ist im
Spektrum nicht direkt beobachtbar
(aber sie existiert).
magnetische Äquivalenz oder
Nichtäquivalenz ist entscheidend für
das Aussehen von Spektren!
84
Nomenklatur von Spinsystemen
• chemisch äquivalente Kerne werden mit dem gleichen Großbuchstaben
bezeichnet, chemisch nicht äquivalente Kerne mit verschiedenen Großbuchstaben
(z.B. A, B, M, X). Große Unterschiede in ihrer chem. Verschiebung (in Hz) kann
man durch - im Alphabet - weit auseinanderliegende Buchstaben kennzeichnen
(z.B. AX), kleine mit nahe liegenden (z.B. ABC).
• magnetisch nicht äquivalente, aber chemisch äquivalente Kerne werden durch
einen hochgestellten Apostroph voneinander unterschieden, z.B. AA', XX'
• mehrere magnetisch äquivalente Kerne werden durch eine tiefgestellte Zahl hinter
dem entsprechenden Buchstaben zusammengefaßt, z.B. Methyl: CH3 → A3
H3C CH2 OR
O2N
A3X2
OMe
A6
N
ABC
N
N
H H
S
AA'BB'
NO2
Cl
A2B
Ph
H
Br
AA'BB'
N
H
H
COOH
H
NH2
N
AA'BB'
ABX
Größe von Kopplungen
• Nomenklatur:
oder nJAX
n = Anzahl der Bindungen zwischen den koppelnden Kernen
nJ(A,X)
2J
4J
3J → vicinale Kopplung
→ geminale Kopplung
>4
und J → Fernkopplungen (long-range), meist nicht mehr aufgelöst
• Die Größe der jeweiligen Kopplung hängt von der Anzahl der
Bindungen (n) zwischen den Kopplungspartnern ab, in starkem
Ausmaß aber auch von sterischen (Bindungsabstände und –winkel,
Torsionswinkel) und elektronischen Faktoren
• Kopplungen zu aciden H's sind nur bei langsamen Austausch
beobachtbar (z.B. in DMSO-d6 → starker Akzeptor)
Pyridin
Kopplungen in Benzol (subst. Benzolen)
H
H
H
6
H
3J
(ortho)
7.5 (7 - 9) Hz
4J
(meta)
1.4 (1 - 3) Hz
3J(3,4)
3
5
H
3J(2,3)
4
H
N
2
4J(2,4)
= 4.9 Hz
= 7.7 Hz
4J(2,6)
= 1.2 Hz
= 1.4 Hz
= -0.1 Hz
5J(2,5)
= 1.0 Hz
4J(3,5)
5J
(para)
0.7 (< 1) Hz
85
Vicinale Kopplung – Karplus-Kurve
Die vicinalen Kopplung (3J(H,H)) ist in hohem Ausmaß vom Diederwinkel φ ,
welchen die beiden H-Atome im Fragment H-C-C-H einschließen, abhängig
φ
ax
H3C CH2 R
7 - 8 Hz
3J(ax,ax)
~ 10 - 13 Hz (φ 180°)
~ 2 - 5 Hz (φ 60°)
3J(ax,eq) ~ 2 - 5 Hz
(φ 60°)
eq
eq
3J(eq,eq)
ax
H
H
H
φ = 0°
3J
cis
H
φ = 180° H
= 6 - 14 Hz
meist ~ 10
H
Ph
3J
trans
= 14 - 20 Hz
meist ~ 16
3J
H
COOH
= 12 Hz
(cis)
Ph
3J
Zimtsäure
COOH
H
= 16 Hz
(trans)
Sehr wichtig für die Strukturaufklärung!! (→ Peptide usw.)
Spektrenvereinfachung
• Spin-Entkopplung
(homonuklear, heteronuklear)
koppelt A mit B oder nicht?
B
JAB
Einstrahlung
bei νA
• höhere Feldstärken
250 MHz
A
JAB
O
1/3
Eu
CMe3
3+
O
CMe3
Eu(DPM)3
60 MHz
Tris(dipivaloylmethanato)europium
ROH + Eu(DPM)3
RO→Eu(DPM)3
H
• Shift-Reagentien
86
Nicotinsäureethylester – 1H-NMR (400 MHz) in CDCl3
peak-picking
Dehnung
4
5
6
2
Pyridin: δ H-2,6 > H-4 > H-3,5
Integral
1H-NMR
von Ethylbenzol in CDCl3 (80 MHz)
87
Benzhydrol in DMSO-d6
Ph
AB-System
OH
CH
H2O
DMSO*
Benzhydrol in DMSO-d6 - nach Zugabe von D2O
Ph
HOD
CH
DMSO*
88
Benzhydrol in CDCl3
#
schneller Austausch, daher
keine Kopplung mit OH
Ph
CH#
1H-NMR
OH
(80 MHz) von Phenacetin in DMSO-d6
3J(OEt):
(1.3728-1.1988)/2
• 80 = 6.96 Hz
89
1H
NMR (60 MHz) mittels
benchtop NMR Spektrometer
13C-NMR
Spektroskopie
I = ½, natürliche Häufigkeit 1.1%, γ(13C) nur ¼ von γ(1H) → wesentlich
weniger empfindlich als 1H (PFT-Spektrometer, Spektrenakkumulation, spezielle
Meßtechniken)
13C:
13C
ist 'diluted spin':
C—C—C—C ca. 96%, dem NMR Experiment nicht zugänglich (I = 0)
C—C—C—C
C— C—C—C
C—C—C—C
C—C—C—C
ca. 1%
ca. 1%
ca. 1%
ca. 1%
C—C—C—C
C—C—C—C
.......usw.........
C—C—C—C
ca. 1/100%
ca. 1/100%
ca. 1/106 %
diese Isotopomere werden beim
'normalen' 13C-NMR
Experiment gemessen
geht beim 'normalen' 13C-Experiment
im Rauschen unter; mit speziellen
Verfahren (INADEQUATE) meßbar
(C = 13C, C = 12C)
90
13C-NMR
- Besonderheiten
• Das 'normale' 13C-NMR Spektrum stammt nicht von einer
einheitlichen Substanz, sondern von einem Gemisch
verschiedener Isotopomere
• 13C,13C-Kopplungen sind im 'normalen' 13C-NMR Spektrum
nicht sichtbar (die Wahrscheinlichkeit für 2 benachbarte
13C-Kerne ist äußerst gering)
• Kopplungen mit Protonen sind sichtbar. Daher meist sehr viele
Linien (wegen der – meist – vielen Kopplungen mit 1H).
Vorteil: viel 'Nachbarschaftsinformation', Nachteil: oft
unübersichtlich bis nicht mehr interpretierbar
• → durch verschiedene Maßnahmen (Entkopplung)
Kopplungen zu 1H ganz oder teilweise eliminiert
Ursachen von 13C chemischen Verschiebungen
Beff = (1 – σ) B0 (σ: Abschirmungskonstante)
σ = σdia + σpara + σaniso
σdia : beschreibt Abschirmung durch Elektronen mit sphärischer Symmetrie
(s-Elektronen), bei 1H dominierend
σpara : beschreibt Einfluss von Elektronen mit nicht-sphärischer
Ladungsverteilung, negatives Vorzeichen (→ Entschirmung), dominiert bei allen
Kernen außer Wasserstoff, enthält Term 1/∆E (∆E ~ mittlere Anregungsenergie),
d.h. geringere Anregungsenergien führen zu stärkerer Entschirmung
σaniso : beschreibt Einfluss der Anisotropie-Effekte von Nachbargruppen, weniger
wichtig bei 13C als bei 1H
Campher
δC=O = 215.6 ppm
λmax (n → π*) = 292 nm
∆E = 401.5 kJ/mol
Thiocampher
δC=S = 269.0 ppm
λmax (n → π*) = 492 nm
∆E = 234.5 kJ/mol
91
13C-NMR
chemische Verschiebungen
üblicherweise gemessener Kernbereich ca. 0 – 220 ppm
Referenzsubstanz: TMS
δ(13C) abhängig von:
1) Hybridisierungszustand des C-Atoms
2) Substituenteneinflüssen
3) Elektronendichte
Hybridisierung: δ sp2
C=C ~ 90 – 160 ppm
C=O ~ 150 – 220 ppm
C=S ~ 180 – 240 ppm
C=N ~ 110 – 160
>
δ sp
δ sp3
>
Alkane: ~ 0 – 100 ppm
C≡ C ~ 50 – 110 ppm
C≡ N ~ 105 – 120 ppm
Substituenteneinflüsse:
• steigende Alkylsubstitution führt zu Entschirmung
δ Cquartär > δ Ctertiär > δ Csekundär > δ Cprimär > δ CH4
Substituenteneinflüsse:
• elektronegative Substituenten führen zu Entschirmung
CH3F 75 ppm
Extrembeispiele: CF4 119 ppm
CH3Cl 25 ppm
CI4 – 292 ppm
CH3Br 10 ppm
CH3I – 21ppm → 'Schweratomeffekt' (Hochfeldverschiebung)
CH3OCH3 61.2 ppm
• γ-Effekt: in C-Kette Abschirmung des C-Atoms in γ-Stellung zu
6
26
X (X = OH, Cl, CO, ...)
30
23
α
β
33
γ
29
32
14 ppm
• γ-Effekt bei stereochemischen Problemstellungen
92
Substituenteneinflüsse:
• α-Effekte bei Dreifachbindungen
117.7
133.4
79.2
CH3-C≡N
CH3-C≡C-H
1.9
0.3
CH3-CH=CH2
19.4
66.9
115.9
Elektronendichte: je geringer die Ladungsdichte (je 'positiver')
desto größer die chemische Verschiebung (ähnlich 1H-NMR)
156 ppm
128.5 ppm 100 ppm
O
-
+
O
R
R
R
R
O
O
+
R
R
C
R
R
+
C
199.0
127.4
129.9
127.4
150.6
13C
142.5
93.0
158.6
91.7
chemische Verschiebungen
93
Signalintensität: 13C-NMR Spektren unter üblichen
Aufnahmebedingungen nicht integrierbar da sehr große
Unterschiede im Relaxationsverhalten der einzelnen C-Atome;
quartäre C-Atome meist geringere Signalintensität
13C,1H
Spin-Spin Kopplung*
1J:
direkte Kopplung 100 – 300 Hz, meist 120 – 200
abhängig von der Hybridisierung: sp > sp2 > sp3
(Ethan: 1J = 125 Hz, Ethen : 1J = 156 Hz, Ethin: 1J = 248 Hz)
elektronegative Substituenten am C-Atom vergrößern 1J
2J, 3J, 4J
..... – 10 bis 60 Hz, meist 0 – 20 Hz (Absolutbetrag)
Nachteil 1H-gekoppelter Spektren: massive Signalüberlagerungen, zusätzlich
Verschlechterung des Signal/Noise (S/N) durch Aufsplitten der Resonanzen in
sehr viele Linien (z.B. R-CH2-CH2-CH3 → 36 Linien!
⇒ Entkopplung von 1H !!
* Aufspaltungsregeln wie bei 1H
13C-NMR
1H-NMR
CH
Bereich
CH2 CH3
Entkopplungstechniken
13C-NMR
Cq
CH
Bereich
CH2
CH3
1H-gekoppeltes 13C-NMR
1H-breitbandentkoppeltes
13C-NMR
(lauter Singuletts)
off-resonance entkoppeltes
13C-NMR: 2J, 3J eliminiert,
1J reduziert* (SFORD)
selektive Entkopplung
Bei der Entkopplung erfolgt auch ein Empfindlichkeitsgewinn durch den Nuclear Overhauser Effekt (NOE)!
* veraltet, heute Multiplizitätsinformation via Editing mittels APT, DEPT, INEPT u.a
94
APT - Attached Proton Test (auch SEFT, JMODXH)*
O
6
2/6 u.
3/5
C
E
5
1
A
B
D
4
2
4
B
3
C
D E
A
1
BB
200
100
0 ppm
CH, CH3
APT
* SEFT = Spin Echo Fourier Transform
JMODXH = J-modulated Spin-Echo
Cq, CH2
Spektren-Editing via DEPT*
CH3
A
CH2
1
6
2
5
3
4
CH
C
B
OH
D
alle CHn
quartäre C-Atome werden nicht erfasst!
*Distorsionless Enhancement by Polarisation Transfer
95
Ibuprofen: 13C (oben) plus DEPT editing
CDCl 3
13C-NMR
- Inkrementberechnungen
Berechnung von m-Cresol
(3-Methylphenol):
Me
128.5+ 9.3
128.5+ 0.6
128.5
128.5+ 0.6
128.5+ 0.0
128.5+ 0.0
128.5-3.1
Me
Me
129.1-7.3
137.8+1.4
129.1-12.7
128.5+26.9
128.5+1.4
125.4-12.7
129.1
128.5
OH
Me
139.2
116.4
121.9
155.4
129.5
129.9
112.7
128.5
125.4
Me
121.8
137.8
129.1
OH
berechnet
139.9
116.3
155.1
112.5
OH
gefunden
Computerprogramm zur Spektrenabschätzung:
CSEARCH robot referee – CSEARCH/NMRPREDICT
http://nmrpredict.orc.univie.ac.at/c13robot/robot.php
96
2D-NMR
Präparation
Evolution/
Mixing
Detektion
t1
FID
t2
• Evolutionsphase t1 wird systematisch variiert
Evolution
mix
• FID damit von 2 Zeitvariablen abhängig (t1,t2)
• 2 × Fourier-Trasformation (nach t1 und t2)
• Signal durch 2 Frequenzen charakterisiert
• δ,δ-Spektren: auf beiden Achsen
chemische Verschiebungen
• δ,J-Spektren: auf einer Achse chem.
Verschiebung, auf der anderen
Kopplung
2D-NMR - Darstellungsmöglichkeiten
1D-Spektrum
2D - Contour Plot
(Konturdiagramm)
2D - Stacked Plot
97
COSY (Correlated Spectroscopy)
A
Information über das
Kopplungsnetzwerk
(welches H koppelt
mit welchem H?)
Diagonalsignale:
'normales' Spektrum
B
C
O
A
C
B
E
D
E
E
D
Kreuzsignale: zeigen
Korrelationen an
D
C
A
B
Chinin – COSY, Aromatenbereich
7
5
7
3
8
2
98
HETCOR (idente Information: HMQC, HSQC)*
→ Welches H hängt an welchem C?
B
13C-NMR
A
C
O
D
E
A
C
E
D
B
E
D
1H-NMR
C
A
B
* HMQC: Heteronuclear Multiple Quantum Coherence; HSQC: Heteronuclear Single Quantum Coherence
Chinin – HSQC editiert
CH, CH3: rot
CH2:
blau
21
20
19
17
16
18
15
11
10
5
4a
6
12
13
4
14
3
7
2
8a
8
1
99
HSQC
HMBC: C,H-Korrelation über mehrere Bindungen
Korrelation über eine Bindung (1J) wird unterdrückt
Chinin – HMBC, Aromatenbereich
2
8
5
3
7
21
3
7 5
Heteronuclear
Multiple
Bond
Correlation
nicht vollständig
unterdrückte 1JKopplung
4a
8
20
2
8a
4
6
100
NOESY – Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy
Räumlich benachbarte Kerne (d < ~ 3.5 - 4Å) geben Kreuzpeaks
(off-diagonal) → Distanzinformation!
δ (f1)
Hd
schwacher NOE
d größer
Hc
Hb
C
Ha
Ha
Hc
Hb
starker NOE,
d klein
kein NOE,
d zu groß
Hd
δ (f2)
NOESY - Beispiel
NH
1ax
1ax
6eq
3ax,5ax
NH
6‘
6ax
101
NOEs bei der Strukturbestimmung von Proteinen
C
N
NOE
N
C
C
NOE
N
C
N
NOEs bei der Strukturbestimmung von Proteinen
α-helix(NHi-NHi+1)
NH(i)
NH(i-1)
β -sheet ( NHi- HAi-1 )
( HAi - HAj )
102
Praktische Durchführung von Messungen
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Probe wird in deuteriertem Lösungsmittel gelöst; häufig verwendet: CDCl3,
d6-DMSO, d6-Aceton, d6-Benzol, D2O
Lösung wird in zylindrisches Röhrchen (NMR-tube, Durchmesser meist 5 mm)
gefüllt und dieses mit Teflonkappe verschlossen
Röhrchen wird mit Spinnerturbine versehen (richtige Position wird mit
Schublehre eingestellt – siehe Bild)
Röhrchen wird in der Bohrung des Magneten (oder im Autosampler) platziert
und mittels Pressluftstrom in den Probenkopf befördert
‚Lock‘ (Konstanthalten des Feld/Frequenz-Verhältnisses via Deuterium-Signal)
‚Shim‘ (Feinhomogenisierung des Magnetfeldes via Shimspulen)
Abstimmung der Receiver-Empfindlichkeit
Messung durch Acquisition und Addition mehrerer Pulse (scans)
→ FID
Prozessieren (FT, Phasenkorrektur) meist dezentral
Resümee NMR - wichtigste Anwendungen in der
pharm. Analytik/organ. Chemie
• Analytik in der Synthese: Kontrolle präparativen Arbeitens
(Konstitution, Einheitlichkeit, Verunreinigungen)
• Strukturbestimmung in Lösung: Konstitution und Stereochemie, von
Syntheseprodukten, Naturstoffen, Biomolekülen; auch für größere
Moleküle (z.B. Proteine zur Zeit bis ca. 30 kD ~ 250 Aminosäuren,
allerdings erst nach Isotopenanreicherung)
• Untersuchung intermolekularer Wechselwirkungen
(Enzym-Inhibitor, DNA-Interkalator oder Repressor, RezeptorSubstrat, Rezeptor-Arzneistoff, Antikörper-Antigen usw.)
• Untersuchung der molekularen Dynamik
(via Relaxationsparameter), z.B. Proteinfaltung, Proteinfunktion
• Bestimmung von Diffusionsparametern
103
DANKE!
Prüfungsmodalitäten für ‚Instrumentelle pharmazeutische Analytik‘
•
•
•
•
•
•
•
•
Die Prüfung erfolgt schriftlich (ausnahmslos!)
10 Fragen (darunter können unter anderem auch Rechenbeispiele,
multiple-choice Fragen, Skizzen, usw. sein)
Zur Beantwortung der Fragen steht genau 1 h Zeit zur Verfügung
Die Fragen müssen mit einem nicht-radierbaren PermanentSchreibgerät (Kugelschreiber, Faserschreiber, Füllfeder, NICHT mit
Bleistift) beantwortet werden
Die Verwendung von Taschenrechnern, Mobiltelephonen und anderen
Hilfsmitteln ist nicht gestattet. Es wird empfohlen, ein Lineal zur
Prüfung mitzubringen
Für jede richtig beantwortete Frage wird 1 Punkt vergeben, dafür muss
die Frage vollständig richtig beantwortet werden (es werden keine
halben Punkte vergeben)
Notenschlüssel: 10P = 1, 9P = 2, 8P = 3, 7P = 3, 6P = 4, ≤ 5P = 5
Laut einer Richtlinie der Studienprogrammleitung werden komm.
Prüfung gleichzeitig mit den ‚normalen‘ Prüfungen unter den selben
Rahmenbedingungen und mit den selben Fragen durchgeführt
104