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Elisabeth-Gateff-Preis der GfG 2001
Die Serotonin-Biosynthese im Zentralen Nervensystem wird
von einem neuronenspezifischen Tryptophan-Hydroxylase-Isoenzym
geschwindigkeitsbestimmend katalysiert
Diego J. Walther,
Max Delbrück Center for Molecular Medicine, Dept. of Genetics, Bioinformatics and Structural Biology, Berlin-Buch
Definitionsgemäß gibt es lediglich neun
niedermolekulare Neurotransmitter im zentralen Nervensystem (ZNS) von Vertebraten. Daneben sind zwar noch einige Dutzend neuroaktive Peptide bekannt, zur
schnellen Neurotransmission werden jedoch
nur die niedermolekularen Substanzen verwendet. Serotonin (5-HT), einer der neun
niedermolekularen Neurotransmitter, ist
nicht nur der Botenstoff einiger tausend
Neuronen, sondern auch eine ubiquitäre
Substanz in peripheren Geweben, wo 5-HT
erstmals vor fünfzig Jahren aufgrund seiner
vasokonstriktiven Aktivität entdeckt wurde[1]. Tryptophan-Hydroxylase (TPH) katalysiert den geschwindigkeitsbestimmenden
Schritt der 5-HT-Biosynthese, und beeinflusst dadurch das ganze serotonerge System[2]. Eine Vielzahl von Verhaltensstörungen, wie unbegründete Angstzustände, Alkoholismus, Drogenmissbrauch oder Schlafund Essens-Störungen (wie Bulimie und Anorexie) sind mit Dysfunktionen des serotonergen Systems im ZNS in Zusammenhang gebracht worden[3], weshalb die Aufklärung der TPH-Expression und der enzymatischen Regulation unabdingbar ist, um
die vielfältigen Wirkungen des serotonergen
Systems von der biosynthetischen Basis an
zu verstehen. So ist bereits, unter anderem,
ein stimulierender Einfluss von Vitamin D3
auf die 5-HT-Biosynthese gefunden worden[4], wodurch sich, neben der wichtigen
Rolle dieses Vitamins in der Calcium-Homeostase[5], auch dessen stimmungsaufhellende Wirkung erklären lässt.
Außerdem wird TPH in der Ontogenese
früher als erwartet exprimiert, und zwar unmittelbar nach der Befruchtung der Eizelle[6]. TPH und 5-HT scheinen demnach eine vitale Rolle in der präneuronalen Ontogenese von Säugetieren zu spielen, was auch
durch die TPH-Inhibitor-vermittelte Wachstumshemmung von Embryonen untermauert wird[7]. Der frühembryonal lethale Phänotyp von Drosophilamutanten mit erniedrigter 5-HT-Synthese zeigt, dass auch die
Abb. 1: (A) RNase protection assays von Ptph und Ntph. Das Verhältnis zu β-Aktin zeigt, dass die neu
entdeckte NTPH das überwiegende neuronale Serotonin-Biosynthese-Enzym ist (>1:150). (B) RNase
protection assays mit spezifischen Sonden für die beiden Isoformen zeigen die Expression von PtphmRNA in Duodenum, Thymus und Milz von Wildtyp-Tieren aber nicht von Ptph–/– Mäusen. Ntph-mRNA
wird ausschließlich im Gehirn detektiert, unabhängig vom Genotyp der Mäuse. (C) 5-HT und
Tryptophan (Trp) in Vollblut und Duodenum, und (D) 5-HT, Trp und 5-Hydroxy-indol-essigsäure (5HIAA) in Hippocampus, Frontalcortex und Epiphyse von 129SvJ, C57BL/6, Ptph–/–, and Ptph+/+
Mäusen. n.d., unterhalb der Detektionsgrenze (<5 pg/µl). *, statistisch signifikant (p < 0.05) gegenüber
allen anderen untersuchten Mauslinien. +, statistisch signifikant (p < 0.05) gegenüber Ptph+/+
Mäusen aber nicht gegenüber den anderen Labor-Mauslinien. (E) C18-reversed-phase HPLC-FDChromatogramme von TPH-Aktivitätsassays. (Oben) Untransfizierte COS7-Zellen. (Mitte) Mit einem
Ntph-cDNA-enthaltenden eukaryotischen Expressionsvektor transient transfizierte COS7-Zellen.
(Unten) P815-Mastocytom-Zellen, die hohe endogene TPH-Aktivität aufweisen. 5-Hydroxyliertes
Tryptophan (5-HTP) wird mit einer Retentionszeit von 5 min von der Säule eluiert.
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Ontogenese von Invertebraten 5-HT-abhängig ist[8]. Ein 5-HT-Mangel während dieser Phase führt also eindeutig zu lethaler
Fehlentwicklung von Tierembryonen.
Aus Vorgenanntem erwarteten wir, dass
Tph-KO-Mäuse nicht lebensfähig sein würden, so wie es bereits für Tyrosin-Hydroxylase-KO-Mäuse gezeigt worden ist[9], erhielten aber augenscheinlich gesunde homozygote Mutanten. Überraschenderweise
zeigten HPLC-Messungen unverändert hohe 5-HT-Gehalte im ZNS von Tph-KO-Mäusen, wohingegen periphere Gewebe im Vergleich mit Wildtyp-Mäusen nur noch Gehalte um die Detektionsgrenze enthielten
(Abb. 1)[10].
Obwohl in den vergangenen vierzig Jahren umfassende Studien zur 5-HT-Biosynthese durchgeführt worden sind, blieben die
zusammengetragenen Kenntnisse spärlich
und widersprüchlich, zumindest im Vergleich mit den anderen Mitgliedern der Hydroxylasen-Familie, der Phenylalanin- und
der Tyrosin-Hydroxylase[2]. Insbesondere
sind verwirrend divergente biochemische
Charakteristika für die TPH-Aktivität aus
zentralnervösen und peripheren Geweben
erhalten worden, die bisher keine überzeugende Erklärung fanden[11].
Molekularbiologische Untersuchungen
des Tph-Gens und von Tph-mRNA bestätigten frühere Befunde, dass TPH am höchsten
in peripheren Geweben exprimiert wird[12],
führten uns aber auch zur Entdeckung von
Splicing-Isoformen sowie eines putativen intronischen Promotors. Die extrem niedrige
Expression der Isoformen genügte aber
nicht zur Erklärung der unveränderten 5HT-Gehalte im ZNS, weshalb wir durch Homologie-Suche in der humanen Genomsequenz ein zweites Tph-Gen entdeckten, dessen Expression wir durch Klonierung der
cDNA verifizierten (GenBank AY098914).
Wir klonierten auch die Homologen cDNAs
der Maus und der Ratte (GenBank AY09565
und AY098915) und fanden, dass dieses
zweite Tph-Gen ausschließlich und mindestens 150-fach höher im ZNS exprimiert
wird, als das bekannte Tph-Gen (Abb. 1).
Deshalb nannten wir das zweite TPH-Isoenzym nTPH (neuronale TPH; Tph2) und das
bekannte pTPH (periphere TPH; Thp1)[10].
Der ausgeprägteste Phänotyp der
Tph(Ptph)-KO-Mäuse ist eine erhöhte Blutungstendenz mit verlängerten Blutungszeiten. Unsere Untersuchungen zeigten,
dass die überwiegende Wirkung von 5-HT
in der Blutungsstillung die regulierte Ausschüttung des von Willebrand-Faktors aus
den Weibel-Palade-Korpuskeln vaskulärer
Endothelzellen und aus α-Granula von
Thrombozyten ist, und nicht seine vasokonstriktorische oder Thrombozyten-aggregierende Wirkung, wie bisher angenommen.
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Dieser Befund ist für Thrombose-Erkrankungen von großer Bedeutung, da Ptph-KOMäuse in experimentellen Modellen gegen
Thrombenbildung geschützt sind[13, 14]. Eine spezifische pharmakologische Manipulation der pTPH ohne Beeinflussung der
nTPH verspricht deshalb einen 5-HT-abhängigen therapeutischen Ansatz ohne zentralnervöse Nebenwirkungen[13] und umgekehrt, psychopharmakologische Behandlung
ohne periphere Nebenwirkungen[14].
pTPH scheint weiteren Befunden nach
für die T-Zell-vermittelte Immunantwort
notwendig zu sein, da Ptph-KO-Mäuse verminderte T-Zell-vermittelte allergische Reaktionen sowie eine erhöhte TransplantatToleranz aufweisen, weshalb durch spezifische pharmakologische Manipulation der
pTPH ohne Beeinflussung der nTPH immunsuppressive Behandlungsansätze denkbar sind[13]. Neben vielen anderen untersuchten Parametern[15–17 und darin zitierte Literatur], scheinen pTPH und 5-HT außerdem eine ursächliche Rolle in Fällen T-Zell-vermittelter pathologischer Abstoßung von Föten zu spielen, weshalb auch hier Möglichkeiten der 5-HT-abhängigen immunsuppressiven Therapie denkbar sind[13]. Ferner
ist zu erwarten, dass sich dieses erweiterte
Verständnis über antithrombotische, immunsuppressive, psychopharmakologische
und diagnostische Verfahren hinaus auch auf
die Weiterentwicklung spezifischer Zytostatika gegen 5-HT-produzierender Tumore[18, 19] auswirken wird.
Dagegen kann die neu identifizierte
nTPH, die unabhängig exprimiert wird, und
5-HT nur im ZNS synthetisiert, nur spezifisch für die serotonergen Effekte in der Verhaltensphysiologie verantwortlich sein, mit
den entsprechenden wichtigen Implikationen für die psychiatrische Forschung. Über
Jahrzehnte sind diagnostische Korrelationsversuche peripherer und zentraler 5-HT-Metabolitenkonzentrationen unternommen
worden, um von peripheren Gehalten auf die
Diego J. Walther
geboren 1967 in Buenos
Aires, Argentinien,
Chemiestudium und
Spezialisierung auf Biochemie (1988 – 1996)
an der TU Berlin, Diplomarbeit zum Thema:
„Welche sind die natürlichen Liganden der
FKBPs in Streptomyces?
– Suche nach ProteinProtein-Interaktionen
mit Hilfe des „Two-Hybrid Systems“ unter der
Anleitung von PD Dr. U.
Keller, Spezialisierung
auf Molekularbiologie,
Dissertation (1996 –
2000) am Max-Delbrück-Center (MDC) für
Molekulare Medizin in
Berlin-Buch in der Arbeitsgruppe von PD Dr.
M. Bader über die „Erstellung von transgenen
Tiermodellen mit definierten Dysfunktionen
des serotonergen Systems“, danach PostDoc und Stipendiat
(2000 – 01.2003) des
„Verbund Klinische
Pharmakologie BerlinBrandenburg“ am MDC,
seit Februar 2003 Leiter der „Neurochemistry
Group and Mouse Lab“
im Department Prof. Dr.
H.-H. Ropers für Humangenetik, MPI für
Molekulare Genetik in
Berlin. Schwerpunkte
sind die Etablierung und
histologische und physiologische Charakterisierung von Tiermodellen serotonerger Dysfunktion und von Tiermodellen für weitere
humane Erkrankungen,
sowie die Entwicklung
von Tryptophan-Hydroxylase-abhängiger
Prozytostatika gegen
Serotonin-produzierende Tumore und die Untersuchung Serotoninabhängiger Signaltransduktionsmechanismen.
zentralnervösen zu schließen[20]. Außerdem
sind zahlreiche diagnostische Korrelationsversuche von Polymorphismen des PtphGens mit psychiatrischen Erkrankungen
durchgeführt worden[21]. Alle diese
Bemühungen müssen nun aus einer anderen Perspektive betrachtet werden, da
nTPH im ZNS von Vertebraten den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt katalysiert und keine signifikante Ptph-Expression im Nervensystem zu finden ist[10].
Das Jahr 2003 markiert den 50. Jahrestag
der Entdeckung der DNA-Struktur durch
James D. Watson und Francis Crick. Der 19.
Internationale Kongress für Genetik vom
6.–11. Juli 2003 in Melbourne, Australien,
wird der Höhepunkt der weltweiten Feierlichkeiten anlässlich dieser Entdeckung
sein. James D. Watson und andere Wissenschaftler, die an der Aufklärung der molekulargenetischen Grundlagen beteiligt waren (z.B. Seymour Benzer, H. Gobind
Khorana und Charles Yanofsky), werden an dem Kongress teilnehmen.
Mit dem wissenschaftlichen Thema „Genomes – The Linkage to Life“ wird
der Kongress insbesondere die weitere Entwicklung der Humangenomprojekte im
Blick haben.
3.000 Teilnehmer werden erwartet, das
Programm repräsentiert mit 280 geladenen
Sprechern in 6 Themenfeldern und insgesamt 54 Symposien den Gesamtbereich der
modernen Genetik. Das detaillierte Programm, Anmeldung und Registrierung finden Sie unter www.geneticscongress2003.com
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Es ist also gelungen, zwei unabhängig regulierte 5-HT-generierende Systeme im
ZNS und in der Peripherie zu identifizieren,
eine entscheidende Erkenntnis für alle unseren weiteren Untersuchungen der 5-HTFunktionen in vivo.
Danksagung
Herrn Priv.-Doz. Dr. Michael Bader danke
ich ganz besonders herzlich und aufrichtig,
nicht nur für die Möglichkeit, das vorgegebene Thema weitgehend selbstständig
bearbeiten zu dürfen, sondern auch für das
große Vertrauen und die jederzeit bereitwillig geleistete, professionelle aber auch
freundschaftliche Hilfestellung, die er mir
im Laufe meiner Dissertationsarbeit zuteil
werden ließ!
Literatur
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Korrespondenzadresse:
Dr. Diego J. Walther
Max-Planck-Institute for Molecular Genetics
Department Ropers
Neurochemistry Group and Mouse Lab
Ihnestr. 73, D-14195 Berlin
Phone office: + 49-30 / 8413-1664
Phone lab: + 49-30 / 8413-1678/-1679/-1680
Fax: + 49-30 / 9413-1383
Mobile: +49 (0)163 256 47 98
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or: [email protected]
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