Untersuchungen zur neuroprotektiven Wirkung milder Hypothermie

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Veterinärmedizinischen Universität, Wien
Aus dem Department für Pathobiologie
der Veterinärmedizinischen Universität Wien
(Departmentsprecherin: Univ -Prof. Dr. Anja Joachim)
Fach: Pathologie und Gerichtliche Veterinärmedizin
Untersuchungen zur neuroprotektiven Wirkung milder
Hypothermie nach Herzstillstand und Reanimation
unter besonderer Berücksichtigung von
Nekrose und Apoptose im Hippokampus des Schweines
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung der Würde eines
DOCTOR MEDICINAE VETERINARIAE
Der Veterinärmedizinischen Universität Wien
vorgelegt von
Diplom-Tierärztin Katharina Reitl
Wien, im November 2008
Betreuer und 1. Begutachter
Univ.-Prof. Dr Peter Schmidt
Institut fur Pathologie und Gerichtliche Veterinärmedizin
Department für Pathobiologie
Veterinärmedizinische Universität Wien
2. Begutachter
Univ.-Prof. Dr. Armin Saalmüller
Institut fur Immunologie
Department für Pathobiologie
Veterinärmedizinische Universität Wien
Danksagung
Als Erstes gebührt mein Dank Univ.-Prof Dr. Peter Schmidt, welcher mir diese Dissertation
ermöglicht und mit viel Engagement betreut hat, und immer wieder Zeit hatte, auftretende
Probleme mit mir zu besprechen.
Univ -Prof. Dr. Armin Saalmüller möchte ich für seine persönliche Hilfe und wertvollen
Ratschläge danken, ebenso flir sein freundliches Angebot, sein Labor inklusive die
Unterstützung seiner Mitarbeiter, nutzen zu dürfen.
Ebenso möchte ich mich auch bei Dipl. Ing. sc arg Wilhelm Gemer für seine Hilfe bei der
Analyse meiner Versuche mittels Durchflusszytometrie bedanken, und bei Fr, Sandra Groiss
flir ihre tatkräftige Unterstützung bei der Arbeit mit den Zellkulturen.
Einen herzlichen Dank möchte ich an Fr. Karin Fragner, Fr. Ingrid Friedl, Fr. Gudrun Kurz
und Fr Nora Nedorost vom Institut für Pathologie und Gerichtliche Veterinärmedizin richten,
welche mich in die Laborarbeit einführten, mir mit Rat und Tat zur Seite standen und immer
ein offenes Ohr für meine Fragen und Bitten hatten.
Ein herzliches Dankeschön auch meinem Bruder Mag. Michael Stastny für die Hilfe bei der
statistischen Auswertung und der Erstellung der Graphik.
Danke an Dr. Sandra Högler, die mir immer wieder wertvolle Anregungen gegeben und Mut
gemacht hat, ebenso an Klaus Bittermann für seine Geduld bei der Bildbearbeitung.
Auch möchte ich mich bei Dr. Andreas Janata vom AKH Wien für die Beantwortung meiner
vielen Fragen bedanken.
Bedanken möchte ich mich auch bei meinen Arbeitgebern, Dr. Günther Schwarz und Dipl.
Tzt Thomas Voracek, die mir während meines Doktoratsstudiums mit der Regelung meiner
Arbeitszeiten entgegen gekommen sind.
Besonderer Dank gilt meinen Eltern, Auguste und Richard Stastny, für ihr Vertrauen und ihre
Unterstützung während des gesamten Studiums und meinem Mann Mario für sein
Verständnis und seine aufbauenden Worte
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
2 Literaturübersicht
1
2
2.1
Herzstillstand und Reanimation beim Menschen
2.11
Der Herz-Kreislauf-Stillstand
2.1.2
Die Reanimation
2
2
3
2.2
Problematik eines Herzstillstandes
2.2.1
Die Hypoxie
2.2.2
Die Ischämie
4
4
5
2.3
6
Die Reperfüsion
2.4
Formen des Zellunterganges
2.4.1
Nekrose
2.4.2
Apoptose
2.4.2.1 Apoptosekaskaden
2.4.2.2 Caspasen
2.4.2.3 Fraktin
8
9
11
12
14
15
2.5
2.5.1
16
16
Selektive Vulnerabilität des Himgewebes
Hippokampusformation
2.6
Prophylaxe und Therapie von ischämie- und reperftjsionsbedingten
neurologischen Schäden
2.6.1
Mechanismen der Zellprotektion durch Hypothermie
2.6.2
Verschiedene Kühltechniken
3 Tiere, Material und Methode
3.1
Tiere
17
18
19
20
20
3.2
Material
3.2.1
Zellkultur
3.2.2
Thymus, Lymphknoten und Lunge
3.2.3
Himpräparate
3.2.4
Verwendete Lösungen, Antikörper und Kits
3.2.5
Auszug aus den verwendeten Reagenzien, Geräten und sonstigen Materialien
24
24
24
24
25
. 26
3.3
Methode
3.3 1
Etablierung einer Zellkultur mit hoher Apoptoserate zur Evaluierung der
verschiedenen histologischen Färbemethoden
3.3.2
Gewebevorbereitung für die Färbungen
3.3 3
Hämatoxylin - Eosin Färbung
3.3.4
TUNEL Färbung
3.3-5
Immunhistochemie
3.3 6
Lichtmikroskopische Auswertung
28
28
30
30
30
32
34
n
3.3.7
3.3.8
Semiquantitative Erfassung aller TUNEL - positiven Zeil an schnitte in der CAl
Region des linken Hippokampus
34
Statistische Auswertung
35
4 Ergebnisse
4.1
Ergebnisse der Durchflusszytometrie
36
36
4.2
Ergebnisse der Hämatoxylin-Eosin Färbung
4.2.1
Zellkultur
4.2.2
Thymus, Lymphknoten und Lunge
4.2.3
Hippokampus
4 2.3.1
Vorgefundene Veränderungen
4 2.3.2
Verteilung dieser Veränderungen im Hippokampus
4 2.3.3
Unterschiedliche Grade der vorliegenden Befunde und ihre tabellarische
Darstellung
4 2.3.4
Vergleichende Auswertung unter Berücksichtigung der beiden
Untersuchungsgruppen
4.2.3.5
Nachweis von Apoptosefiguren bei degenerierten Nervenzellen in der HE
Färbung
37
37
37
37
37
40
4.3
Ergebnisse der Immunhistochemie
4.3.1
Zellkultur
4.3.2
Thymus, Lymphknoten und Lunge
4.3.3
Hippokampusregion
44
44
44
45
4.4
Ergebnisse der TUNEL Färbung
4.4.1
Zellkultur
4.4.2
Thymus, Lymphknoten und Lunge
4.4.3
Hippokampus
4.4.3.1
Vergleichende Auswertung aller Präparate unter Berücksichtigung ihrer
Gruppenzugehörigkeit
46
46
46
47
41
42
43
47
4.5
Ergebnisse der semi quantitativen TUNEL positiven Zeil an Schnittzählung in der
CAl Region
48
4.6
Statistische Auswertung der Zellanschnittzählung unter Berücksichtigung der
Gruppeneinteilung
5 Diskussion
49
54
5.1
Diskussion der Ergebnisse
55
5.2
Schlussfolgerung
67
6 Zusammenfassung
7 Summary
8 Literaturverzeichnis
68
69
70
Abkürzungsverzeichnis
AKH
ATP
CAST
CPR
CVP
DAB
Allgemeines Krankenhaus
Adenosintriphosphat
Computer Assisted Stereological Toolbox
Cardiopulmonary Resuscitation
zentraler Venendruck
Diaminobenzidin
DMSO
DNA
dUTP
EDTA
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonukleinsäure
2'-deoxyuridine 5'-triphosphate
Ethylendiamintetraessigsäure
ER
FACS
FCM
Fi02
HE
HI
HRP
KG
MAP
paC02
PAP
PBS
PCD
PCWP
PI
PRRSV
PS
ROSC
SSC
TdT
Tpa
TUNEL
ZNS
Endoplasmatisches Retikuium
Fluorescence Activated Cell Sorting
Durchflusszytometrie
inspiratonsche SauerstoffTraktion (eng! : fraction of inspired oxygen)
Hämatoxylin - Eosin
Hypoxie-Ischämie
horseradish peroxidase
Körpergewicht
mittlerer arterieller Blutdruck
arterieller Kohlendioxidpartialdruck
Pulmonalarteriendruck
Phosphate Buffered Saline
Programmed Cell Death
Lungenkapillardruck (engl.: pulmonary capillary wedge pressure)
Propidiumiodid
Porine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus
Phosphat idyl serin
Restoration of Spontaneous Circulation
Standard Saline Citrate
Terminal deoxynucleotid Transferase
pulmonalarterielle Temperatur
terminal deoxynucleotid transferase - mediated dUTP-biotin nick end-labeling
Zentralnervensystem
1 Einleitung
Plötzliche prähospitale Herz-Kreislauf-Stillstände stellen noch immer ein großes Problem für
therapeutische Interventionen dar, denn auch in Fällen, wo eine sofortige Erstversorgung
stattfindet, wird nur eine geringe Überlebensrate erzielt. Weiters können nur 2 - 10 % dieser
Patienten trotz erfolgreicher Reanimation ohne neurologische Defizite aus dem Krankenhaus
entlassen werden (POPP et al., 2005).
Ursächlich dafiir verantwortlich ist die geringe Ischämietoleranz von Neuronen im
Allgemeinen, wobei einige Regionen wie zum Beispiel der Hippokampus als besonders
vulnerabel gelten. Während und nach einer neuronalen Ischämie kommt es zu zwei Arten von
Zeil Untergängen. Die akut verlaufende Nekrose ist durch eine Therapie nach einem HerzKreislauf-Stillstand - also in der Reperiusionsphase - nicht mehr zu beeinflussen Der
verzögerte
apoptotische
Zelltod
dagegen
lässt
ein
Zeitfenster
für therapeutische
Interventionen offen.
Mehrere Wissenschaftler erforschen seit Jahren verschiedenste Therapieansätze um diese
verzögerte Nervenzelldegeneration zu beeinflussen. Eine dieser Therapien stellt die
therapeutische milde Hypothermie während oder nach einem Herzstillstand dar.
Nachdem die Forschungsgruppe um Prof Dr. F. Sterz ein Tiermodell (JANATA et al., 2008)
und R. Schock eine Methode (ThermoSuit*; Life Recovery Systems) zur raschen Induktion
einer milden Hypothermie entwickelt hatten, sollten die Auswirkungen auf die Nervenzellen
evaluiert werden.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es deshalb, die unterschiedlichen Schädigungen mit
besonderer Berücksichtigung auf die Art des Zellunterganges im Hippokampus aufzuzeigen.
Insbesondere sollten die Hypothesen überprüft werden, dass neben der Nekrose auch die
Apoptose eine Rolle beim neuronalen Schaden infolge HI/Reperftision spielt und dass eine
induzierte milde Hypothermie nach wiedereinsetzender Durchblutung einen nachweisbaren
neuroprotektiven Effekt erzielt.
2 Literaturübersicht
2.1 Herzstillstand und Reanimation beim Menschen
In der europäischen Union erleiden jährlich rund 350.000 Menschen einen Herz-KreislaufStillstand und müssen reanimiert werden, wobei ca. 315.000 von ihnen versterben. Für den
endgültigen Reanimationserfolg ist jedoch nicht das Wiederherstellen von stabilen
Kreislaufverhältnissen („restoration of spontaneous circulation", ROSC) ausschlaggebend,
sondern die Entlassung aus dem Krankenhaus ohne neurologische Schäden, So können nur ca.
2-10% aller Patienten (POPP et al., 2005) nach Herz-Kreislauf-Stillstand und erfolgreicher
kardiopulmonaler Reanimation („cardiopulmonary resuscitation", CPR) ohne neurologische
Defizite entlassen werden.
Für diese auffallend schlechte Erfolgsrate ist die geringe Ischämietoleranz von Neuronen
verantwortlich
zu
machen.
Diesem
Zellschaden
liegen
sowohl
akut
einsetzende
Mechanismen, wie die Nekrose, als auch verzögerte neuronale Degenerationen zugrunde
(HOLZER u BEHRINGER, 2005; POPP et al., 2005). Ziel einer jeden Therapie, die nach
dem Herz-Kreislauf-Stillstand - also während oder nach der Reperftjsion - beginnt, ist es, die
induzierten Schädigungsmechanismen zu beeinflussen und somit den verzögerten neuronalen
Zelltod abzuschwächen (POPP et al., 2005).
2.1.1
Der Herz-Kreislauf-Stillstand
Bei einem Herzstillstand kommt es etwa nach 10-20 Sekunden zur Bewusstlosigkeit, da der
Sauerstoffspeicher im Gehirn aufgebraucht ist, und nach wenigen Minuten ist mit
irreversiblen Schäden bzw. dem Hirntod zu rechnen (KUSCHINSKY, 2000; MATZ, 2003;
ZEITZER, 2005).
Nach rund 5 min ist der Glucose und ATP Speicher aufgebraucht und es muss auf die viel
weniger effektive anaerobe Glycolyse umgestiegen werden (ZEITZER, 2005).
Die Wiederbelebungszeit spezifiziert die längste Zeitdauer, die nach Eintreten der Ischämie
toleriert werden kann, ohne dass es zu irreversiblen Schäden kommt (KUSCHINSKY, 2000).
Pro Minute, die bis zum Beginn der Herz-Lungen-Wiederbelebung verstreicht, verringert sich
die IJberlebenswahrscheinlichkeit des Patienten um etwa 10 %, wenn von einer
Wiederbelebungszeit von 7-10 min ausgegangen wird. Da diese Zeitangabe experimentell
erforscht wurde, muss bei eingeschränkter Herzfijnktion mit einem noch kürzeren Iniervall
gerechnet werden (KUSCHINSKY, 2000).
2.1.2 Die Reanimation
Die Basisreanimation („Basic Life Support", BLS) erfolgt von Ersthelfern bei allen Formen
des Herz-Kreislauf-Stillstandes, wie der ventrikulären Tachykardie, dem Kammerflimmern,
einer Asystolie und der pulslosen elektrischen Aktivität, nach dem gleichen Schema Das
derzeit gültige Reanimationsschema fiir die
manuelle Reanimation
wird
mit
30
Herzdruckmassagen zu 2 Beatmungen angegeben (KUHN et al., 2007), wobei empfohlen
wird, sofort mit diesen Maßnahmen zu beginnen, wenn ein Atemstillstand festgestellt wird.
Entsprechend den Vorgaben des European Resuscitation Council (ERC) von 2005 entfällt
eine Überprüfung des Kreislaufs für Laienhelfer, da bei einem Atemstillstand meist auch kein
Kreislauf vorhanden ist und v.a. ein Kreislaufstillstand für einen Ungeübten als nicht sicher
feststellbar gilt (HANDLET et al., 2005).
Mit halb- und vollautomatischen Defibrillatoren wurde es Ersthelfern ermöglicht, frühzeitig
Kammerflimmern zu erkennen und eine Therapie einzuleiten. Falls ein automatischer
Defibrillator (automated external defibrillator, AED) vorhanden ist, sollte dieser so rasch wie
möglich zum Einsatz kommen, wobei eine sofortige manuelle Herzdruckmassage deswegen
nicht verzögert werden sollte. Auch während dem Anlegen der Elektroden, sollte die
manuelle Reanimation aufrechterhalten werden (HANDLEY et al., 2005; LÖWEL et al,
2005)
Die erweiterte Reanimation („Advanced Life Support", ALS) wird vom Rettungsdienst bzw
vom Notarzt durchgeführt und beinhaltet die endotracheale Intubation, die maschinelle
Beatmung, einen venösen Zugang, die Medikamentengabe und die Elektrotherapie, je nach
der jeweiligen Form des Kreislaufversagens (KUHN et al., 2007).
Durch den sehr hohen Aufwand für die Reanimationsausbildung von Laien konnten viele
Menschen erfolgreich
wiederbelebt
werden,
ebenso
wie
mit
dem
Aufl^au
eines
Notarzt systems und aller neuen technischen Hilfsmittel. Dennoch blieben die Erfolge weit
hinter den Erwartungen zurück, vor allem im Hinblick auf die völlige Wiederherstellung ohne
bleibende neurologische Defizite (SCHETDEGGER, 2005)
Neue Hoffnung wird in die therapeutische milde Hypothermie während oder nach einem
Herz-Kreislauf-Stillstand gesetzt, nachdem einige Modelle und auch klinische Studien eine
Neuroprotektion nachgewiesen haben (BERNARD et al., 2002; The Hypothermia After
Cardiac Arrest Study Group, 2002). Seit 2003 empfiehlt deshalb die „Advanced Life Support
Task Force of the International Liaison Committee on Resuscitation" (ILCOR ALS Task
Force) die milde Hypothermie von 33 - 34'*C über 12-24 Stunden für alle Patienten nach
einem prähospitalen Herz-Kreislaufstillstand, wenn sie ohne Bewusstsein sind und einen
ventrikulären Herzrhythmus aufweisen (NOLAN et al., 2005; POPP et al., 2005, ZEITZER,
2005)
2.2
Problematik eines Herzstillstandes
2.2.1
Die Hypoxie
Während eines Herz-Kreislauf-Stillstandes kommt es zu einer globalen Hypoxie im gesamten
Körper.
Hypoxie ist eine der häufigsten und wichtigsten Ursachen für Zellschäden und Zelltod
(MYERS u. McGAVIN, 2007). Sie wird definiert als Reduktion der Sauerstoffkonzentration,
die Zellen bzw Geweben angeboten wird, wobei ein komplettes Fehlen von Sauerstoff als
Anoxie bezeichnet wird. Sauerstoff wird fur die oxidative Phosporylierung benötigt, wobei
vor allem höher spezialisierte Zellen wie Neuronen, Leberzellen, Herzmuskelzellen und
Nierentubuluszellen besonders sauerstoffabhängig sind (MYERS u. McGAVIN, 2007).
Ein hypoxischer Zustand kann durch ungenügende Oxygenierung des Blutes aufgrund von
Herz- und Lungenproblemen entstehen, welcher dann als hypoxische Hypoxie bezeichnet
wird. Als stagnierende Hypoxie bzw. Ischämie wird die Reduktion bzw. das Sistieren der
Blutzuftihr bezeichnet. Ein verringerter Transport von Sauerstoff im Blut - eine so genannte
anämische Hypoxie - entsteht durch eine Anämie oder durch eine verminderte
Sauerstofftransportkapazität der Erythrozyten wie bei einer Kohlenmonoxidvergiftung. Eine
Blockade der Aufnahme des Sauerstoffs in die Zellen, wie zum Beispiel bei einer
Cyanidvergiftung kann ebenfalls zu einer Hypoxie fiihren, welche dann als histo- bzw.
zytotoxische Hypoxie bezeichnet wird (AUER u. BENVENISTE,1997; MYERS u.
McGAVIN, 2007).
Während einer zerebralen Hypoxie kommt es somit zu einer Sauerstoffunterversorgung, bei
der der Blutfluss, bis auf den Fall einer stagnierenden Hypoxie, weiterhin erhalten ist. Bei
einem erhaltenen Blutfluss können Substrate für die anaerobe Glycolyse herbeitransportiert
und Stoffwechselprodukte abtransportiert werden.
Im Falle eines Herz-Kreislauf-Stillstandes kommt es jedoch auch zum Sistieren des
Blutflusses und somit zu hypoxisch-ischämisch bedingten Zellschäden, welche bedeutend
schneller eintreten und gravierender sind als bei rein hypoxisch bedingten Insuhen
(MITCHELL u. COTRAN, 2003; MYERS u. McGAVIN, 2007).
2.2.2 Die Ischämie
Ischämie leitet sich aus dem griechischen Begriffen ischo fiir zurückhalten und haimo für Blut
ab und ist die häufigste Ursache für Zellschäden in der klinischen Medizin (COTRAN, 1999;
MITCHELL u. COTRAN, 2003).
Während eines ischämieschen Insultes reicht die Blutversorgung des Gehirns oder eines
anderen Organs nicht mehr aus, um normale Zellfunktionen aufrechtzuerhalten (AUER u.
BENVTNISTE, 1997).
Man unterscheidet zwei Arten von zerebraler Ischämie, nämlich die fokale und die globale
Ischämie
Bei der fokalen Ischämie kommt es zu einem Verschluss einer Arterie und daraufhin zu einem
verminderten bis sistierten zerebralen Blutfluss in einer umschriebenen Gehirnregion; die
damit verbundene Läsion wird als Hirninfarkt bezeichnet. Das Infarktgebiet ist immer von
einer mäßig durchbluteten Randzone, der sog. Penumbra, umgeben, die bei einer Reperftision
in einem bestimmten Zeitfenster überlebensfähig ist (KUSCHINSKY, 2000)
Bei der globalen Ischämie kommt es dagegen durch Versagen der systemischen Zirkulation
zu einem insuffizienten Blutfluss im gesamten Organismus; dies ist z.B, bei einem
Herzstillstand zu beobachten. Bei einer inkompletten globalen Ischämie kommt es zu
Perfiisionsstörungen des Gehirns infolge eines erhöhten intrakraniellen Drucks, wie er
beispielsweise durch ein diffuses Hirnödem ausgelöst werden kann.
Als permanente globale Ischämie oder auch nicht durchblutetes Gehirn (non-perfused brain) früher auch als Respirator-Gehirn bezeichnet - ist der klinische Gehirntod zu verstehen.
Ischämische Zustände haben insofern schwerwiegende Folgen, da es einerseits zu
hypoxischen Zuständen kommt und andererseits weder Substrate für eine anaerobe Glycolyse
herantransportiert werden können bzw. ein Abtransport von Stoffwechsel Produkten
stattfinden kann Dies fuhrt somit auf mehreren Wegen und schneller zu einer massiven
Zellschädigung als Hypoxie alleine (MITCHELL u. COTRAN, 2003).
2.3 Die Reperfusion
Jede Wiederbelebung hat das Ziel der Wiederherstellung einer spontanen Kreislaufaktivität
und somit einer Wiederherstellung der Durchblutung (Reperfusion) aller Organe,
Die Reperfusion des Gewebes kann jedoch paradoxerweise das ischämisch beeinflusste aber
ansonsten überlebensfähige Gewebe zusätzlich schädigen.
Obwohl der exakte Mechanismus des Reperfusionsschadens unklar ist, dürften mehrere
Mechanismen dafiir verantwortlich sein (MITCHELL u. COTRAN, 2003).
So kommt es beim Einsetzen der Reperfusion zu einem massiven Einströmen von Ca^lonen, da der Interzellularraum bereits durch die ischämische Schädigung viel Kalzium
enthält, welches von den vorgeschädigten Zellen aufgenommen wird
Der starke Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration führt zum Verlust der Integrität
zwischen den Zellen, aktiviert Enzyme (wie zum Beispiel Endonukleasen, siehe 2 4.1) und
Apoptosepfade. Der Oi-Mangel und die danach gebildeten Superoxidanionen lösen außerdem
eine vermehrte Expression von Adhäsionsmolekülen am Endothel der Blutgefäße und eine
Leukozytenemigration
(v.a.
neutrophile
Granulozyten)
aus,
ähnlich
wie
dies
bei
Entzündungen geschieht. So kommt es bei der Reperflision zu einer verstärkten Bindung der
weißen Blutkörperchen an das Endothel der kleinen Blutgefäße und die Wanderung dieser ins
Gewebe. Dort können sie ihrerseits Sauerstoflfradikale und auch aggressiv wirkende
BotenstofFe wie den plättchenaktivierenden Faktor (PAF) oder Leukotriene, freisetzen und
somit Zellmembran und Milochondrien weiter schädigen Zerstörte Mitochondrien können
ihrerseits Sauerstoff nicht mehr genügend reduzieren und so entstehen weitere freie
Sauerstoffradikale. Durch diese freien Radikale kommt es zu einer Zeil- und DNASchädigung infolge Lipidperoxidation, Proteindenaturierung und einer Inaktivienjng von
Enzymen, ebenso kommt es zu Schäden am Zytoskelett und einer weiteren Freisetzung von
Ca^^- Ionen aus intrazellulären Speichern.
Geschädigte Zellen haben weiters auch gestörte antioxidative Abwehrmechanismen
(MITCHELL u. COTRAN, 2003). Laut GROTE u. POHL (2005) ist der Reperftisionsschaden
hauptsächlich durch die vermehrte Bildung von Sauerstoffradikalen bedingt.
Gesunde Zellen verfiigen über Schutzmechanismen um die freien Radikale, welche z.B auch
im geringen Maß als Nebenprodukt bei der mitochondrialen Atmung anfallen, abzufangen.
Antioxidativ wirksam sind Radikalfänger wie die Vitamine C, A und E, Selen, Bilirubin und
Harnsäure,
ebenso
wie
die
Enzyme
Katalase,
Superoxiddismutase
(SOD)
und
Glutathionperoxidase.
Metallionen wie Eisen und Kupfer fördern die Oxidation, somit wirken metallbindende
Proteine (Transferrin, Haptoglobin, Caeruloplasmin) ebenfalls antioxidativ, indem sie die
Radikalbildung hemmen (GROTE u. POHL, 2005).
2.4 Formen des Zellunterganges
Nach einem Hypoxisch-ischämischen Insult und nachfolgendem Reperfusionsschaden kommt
es, je nach Form und Dauer der Ischämie und je nach Vulnerabilität des Gewebes, zu einem
mehr oder weniger massiven Zelluntergang.
Der lichtmikroskopisch sichtbare Zelluntergang wird üblicherweise in Nekrose und Apoptose
unterteilt (COTRAN, 1999; MYERS u. McGAVIN, 2007; RÜPINDER et al, 2007). MAJNO
u. JORIS (1995) wiederum bezeichnen abgestorbenes Gewebe grundsätzlich als Nekrose,
wobei sie der apoptotischen Nekrose (Apoptose) die oncotische Nekrose (eigentliche
Nekrose) gegenüberstellen.
Bei der Nekrose handelt es sich um einen passiven, katabolen, irreversiblen und immer
pathologischen Prozess, während hingegen die Apoptose bis zu einem gewissen Stadium
reversibel ist und einen aktiven Prozess darstellt, welcher Energie benötigt (BANASIAK et
al-, 2000; RENVOIZE et al, 1998). Diese Art von Zelluntergang kommt auch unter
physiologischen
Bedingungen
vor,
wobei
einige
Autoren
diesen
dann
als
sog.
,»Programmierten Zelltod" (PCD) von der eigentlichen Apoptose differenzieren, da diese Art
von Zelltod ohne äußere Einflüsse, sozusagen „vorbestimmt", abläuft (LAWEN 2003;
MAJNO u. JORIS, 1995; MYERS u. McGAVIN, 2007; RENVOIZE et al, 1998, SLOVITER,
2002)
Der Prozess der Apoptose kann in jedem Stadium in eine Nekrose übergehen, sobald die
gesamten Energiereserven der Zelle aufgebraucht sind. Nicht selten finden sich diese
kombinierten Formen des Zelltodes, da eine primär initiierte Apoptose durch sich
erschöpfende Energiereserven nicht mehr weitergeführt werden kann, und die Zelle dann
sekundär nekrotisch degeneriert (PADOSCH et al,, 2001).
Darüberhinaus werden verschiedene Übergangsformen von
Apoptose zur Nekrose
beschrieben, wie zum Beispiel Aponekrose (FORMIGLI et al., 2000) oder „parapoptosis"
(PAGNUSSAT et al„ 2007)
2.4.1 Nekrose
Der nekrotische Zelltod folgt einer irreversiblen Zeil Schädigung durch Hypoxie, Ischämie und
Zellmembranschäden (MYERS u. McGAVIN, 2007).
Ultrastrukturelle
Veränderungen
sind
nach
weniger
als
6
Stunden,
histologische
Veränderungen zwischen 6 und 12 Stunden und makroskopische Veränderungen nach 24 - 48
Stunden sichtbar (MYERS u. McGAVIN, 2007)
Auf Grund der nicht mehr ausreichenden ATP-Reserven kommt es zur Stimulation der
anaeroben Glycolyse mit der Anhäufiang von Laktat und anderen sauren Valenzen. Durch die
Azidose wird die Membranpermeabilität gesteigert, Na\ CI" und Wasser strömen in die Zelle
ein,
K'
strömt aus Die energieabhängigen NaVCa^'-Antiporter kehren ihre Richtung um, da
ATP fehlt, um die lonenpumpen zu betreiben, und es kommt zu einem Anstieg von Ca^' in
der Zelle (MATZ, 2003; MEYERS u. McGAVIN, 2007).
Im Nervensystem fiihrt eine massive Ausschüttung von exzitatorischen Neurotransmittem
infolge anoxischer Depolarisation zu einem weiteren Ca^^- Einstrom in die Zellen. Zusätzlich
wird die massive Freisetzung von Ca^^ aus intrazellulären Speichern (Mitochondrien und ER)
stimuliert
Als Folge der hohen intrazellulären Ca* Konzentrationen kommt es zur
unspezifischen Induktion von Enzymsystemen wie den Proteasen (Proteinkinase C), den
Phospholipasen (Phospholipase A2), der ATPase und Endonukleasen (COTRAN, 1999;
MYERS u. McGAVIN, 2007). Diese Enzyme führen durch eine Induktion der Hydrolyse
zellulärer Strukturen zum Untergang der Zelle. Es kommt zur Bildung von freien Radikalen,
welche wie unter 2.3 beschrieben, ebenfalls zur Zerstörung von Membranen und
Strukturproteinen beitragen. Nach der Reperilision sind Sauerstoffradikale weitere wichtige
Mediatoren der Zellzerstörung (GROTE u. POHL, 2005; MATZ, 2003).
Morphologische Veränderungen:
Nekrotische Zellen lassen sich histologisch anhand einiger spezifischer Merkmale
identifizieren. Durch den passiven Einstrom von Ionen und Wasser schwillt die Zelle an und
es kommt zum Zellödem. Das Chromatin dekondensiert und die DNA zerfallt unkontrolliert
in unterschiedlich große Fragmente. Es kommt zur Denaturierung von Zytoplasmaproteinen
und Zellorganellen treten in den Extrazellularraum aus (COTRAN, 1999; MATZ, 2003)
Aufgrund der Zunahme der denaturierten intrazytoplasmatischen Proteine, an welche sich
10
Eosin bindet, werden die Zellen rot angefärbt (COTRAN, 1999). Es kommt zur so genannten
eosinophilen Nervenzellnekrose. Der Zellkern von nekrotischen Zellen kann karyolytisch,
pyknotisch oder karyorrhexisch verändert sein bevor er sich auflöst (COTRAN, 1999).
Bei einem nekrotischen Zelluntergang kommt es weiters, durch die austretenden
Zellbestandteile, zur Aktivierung von neutrophilen Granulozyten und Makrophagen und somit
zu einer Entzündungsreaktion im betroffenen Gebiet (BANASIAK et al., 2000; MYERS u.
McGAVIN, 2007).
Formen der Nekrose:
Nach einem hypoxischen Insult ist die Koagulationsnekrose die bedeutendste Nekroseform
welche auch als „strukturierte" Nekrose bezeichnet wird. Das Zytoplasma erscheint homogen
und aufgrund der denaturierten Proteine eosinophil, weiters bleibt die Zetlform relativ lange
erhalten.
Diese Form der Nekrose ist vor allem in der Muskulatur, der Leber und der Niere zu finden.
Im
ZNS
kommt
KoUiquationsnekrose.
es
aufgrund
des
geringen
Hypoxischer Zelltod
im
Eiweißgehattes
ZNS
resultiert
meist
in
einer
zu
einer
schnellen
enzymatischen Auflösung des Neurophils, wobei dabei dessen Struktur sehr schnell verloren
geht (MYERS u. McGAVIN, 2007).
Weitere Formen der Nekrose sind die verkäsende Nekrose, die Fettgewebsnekrose und die
Gangrän (COTRAN, 1999; MYERS u. McGAVIN, 2007).
11
2.4,2 Apoptose
Bereits der Arzt und Philosoph Galen von Pergamon (129 - 203 n. Chr.) beschrieb einen
koordinierten Zelluntergang im Rahmen der Embryonalentwicklung (PADOSCH et al.,
2001) Die Erstbeschreibung und Definition der Apoptose erfolgte durch KERR et al. im
Jahre 1972. Apoptose wurde aus dem Griechischen entlehnt, und beschreibt das Herabfallen
der Blätter eines Baumes bzw. das Abfallen von Blütenblättern (KERR et al., 1972).
Die Apoptose tritt bei einer Vielzahl von physiologischen und pathologischen Ereignissen
auf Sie ist wichtiger Bestandteil der Embryogenese, wobei hier von einigen Autoren
(FUJIKAWA, 2000; HACKER, 2000; MAJNO u. JORIS, 1995) der Begriff PCD bevorzugt
wird. Da die Apoptose aber eine morphologische Veränderung beschreibt, hingegen der PCD
als ein funktionelles Ereignis verstanden wird, verwenden viele Autoren beide Begriffe
synonym (COTRAN, 1999; HACKER, 2000). Auch bei der hormonabhängigen Involution,
der Atrophie und der physiologischen Zellmauserung von Organen und Geweben wird die
Apoptose beobachtet (COTRAN, 1999; HUPPERTZ et al, 1999; MITCHELL u. COTRAN,
2003; PADOSCH et al., 2001). Ebenso gehen während eines Entzündungsgeschehens
Leukozyten
apoptotisch
zugrunde
(COTRAN,
1999).
Veränderungen wie neurodegenerativen Erkrankungen,
Auch
bei
pathologischen
Autoimmunerkrankungen und
zerebraler Ischämie wird der Apoptose heute eine bedeutende Rolle zugeschrieben (NIWA et
al., 2001). Es kann hierbei grundsätzlich zwischen Erkrankungen mit pathologisch inhibierter
oder pathologisch gesteigerter Apoptose unterschieden werden (PADOSCH et al., 2001).
Apoptose kann durch unterschiedliche Faktoren ausgelöst werden. Zum einen durch Stimuli,
die über Oberflächenrezeptoren auf die Zellen einwirken, wobei dies den extrinsischen
Aktivierungsweg darstellt. Aber auch durch Stress im weitesten Sinn - ausgelöst durch
Toxine, Hitzebelastung, radioaktive Strahlung und durch hormoneile Imbalanzen - kann die
Expression apoptotischer Proteine angeregt werden. Hierbei wird von einem intrinsischen
Aktivierungsweg bzw milochondrialen Pfad gesprochen (MYERS u. McGAVTN, 2007).
Beide Wege können an mehreren Stellen miteinander verbunden sein oder ineinander
übergehen (MYERS u. McGAVIN, 2007).
12
Morphologische Veränderungen:
Ein typisches morphologisches Zeichen der Apoptose ist die Kondensation des Chromatins,
wobei die Zellmembran trotz markanter Bewegungen der Zelle („boiling stadium") intakt
bleibt Ferner kommt es zu Ausstülpungen der Zellmembran („membrane blebbing") In der
Folge schrumpft die Zelle und letztlich kommt es zur Abschnürung („budding")
membranumschlossener Partikel, so genannte „apoptotic bodies" (COTRAN,
1999,
HUPPERTZ et al, 1999; PADOSCH et al., 2001).
Durch die Bildung von membranumschlossenen Körperchen („apoptotic bodies") und somit
der Verhinderung der Freisetzung von zellulären Bestandteilen treten im Gegensatz zur
Nekrose keine entzündlichen Begleitreaktionen auf (HUPPERTZ et al., 1999, PADOSCH et
al-, 2001). Die membranumschlossenen Zellreste werden dann von benachbarten Zellen
phagozytiert, ohne Spuren zu hinterlassen (COTRAN, 1999; PADOSCH et at., 2001, Abb. 1,
Pkt. 4).
2.4.2.1 Apoptoseküskaden
Die Apoptosekaskaden setzen sich aus Initiatoren und Effektoren bzw. Exekutoren zusammen
und besitzen als gemeinsame Endstufe den apoptotischen Zelltod (HUPPERTZ et al., 1999;
PADOSCH et al, 2001).
Wie schon unter 2.4 2 erwähnt, wird zwischen einer extrinsischen und einer intrinsischen
Apoptosekaskade unterschieden.
Die extrinsische Kaskade wird durch spezifische rezeptorvermittelte Signale aus der
Umgebung der Zelle initiiert. Durch die Ligand - Rezeptorbindung können intrazelluläre
Caspase-Adapterproteine an die Todesrezeptoren binden (Abb. I, Pkt. 1). An diesem neu
entstandenen Komplex aktivieren sich die Procaspasen 8 und 10 gegenseitig (PADOSCH et
al., 2001; LEIST und JÄÄTTELÄ, 2001). Auch die Caspase 2 wird Todesrezeptor-vermittelt
aktiviert (PADOSCH et al, 2001).
Auslöser der intrinsischen Kaskade ist eine, durch unspezifische schädliche Einflüsse
verursachte, mitochondriale Dysfiinktion, Bei Störung des sensiblen Gleichgewichts aus pround antiapoptotisehen Proteinen kommt es zur Durchlässigkeit der Mitochondrienmembran.
Eine große, aus über 20 verschiedenen Mitgliedern, bestehende Proteingruppe stellt die BclFamilie dar, wobei Bcl-2 und Bcl-x die zwei wichtigsten antiapoptotischen Proteine sind
13
(LAWEN, 2003). Wenn die Zelle nun „Stress" ausgesetzt ist, gehen an der mitochondrialen
Membran diese Proteine verloren und sie werden durch proapoptotische Proteine derselben
Familie ersetzt, wie Bak, Bax und Bim. Weiters nimmt die Permeabilität der mitochondrialen
Membran zu, wenn Bcl-2/Bcl-x Level abnehmen, und verschiedenste Proteine welche die
Caspasekaskade aktivieren können, strömen aus (Abb. 1, Pkt. 2). Eines dieser Proteine ist
Cytochrom c, welches im Zytosoi an Apaf-1 („apoptosis activating factor"-!) bindet und
dieser Komplex aktiviert dann wiederum die Caspase 9. Ein anderes mitochondriales Protein
ist AIF („apoptosis - inducing factor"), welches nach dem Austreten ins Zytoplasma
verschiedene Apoptoseinhibitoren inaktiviert (MYERS u. McGAVIN, 2007).
Die Apoptosekaskade kann weiters durch zytolytische Proteine, welche durch zytotoxische T
Lymphozyten sezerniert werden (z.B. Granzyme B, Perforin; Abb. 1, Pkt. 1), den Verlust von
Zellverbindungen, Vorhandensein oder Fehlen von speziellen Wachstumsfaktoren, einen
Anstieg oder Abfall der Konzentration spezieller Hormone (z.B. Steroide), und durch externe
Einflüsse wie z.B. Strahlung oder chemische Noxen, ausgelöst werden (HUPPERTZ et al,
1999).
©
withdrawal ot
(1) R«csptor-ll9an<) InteractlonB
• FAS/FAS ligarxJ
• TNF/TNF receptor
growth factors
orhormonct
LigarKlstof
phagocytk:
cell receptors
Cytoplasmic bud
Apoptotic body
Abb. 1; Schematische Darstellung von Abläufen während der Apoptose
(MITCHELL u COTRAN, 2003)
14
Die gemeinsame Endstufe der Kaskaden wird durch die Aktivierung der EfFektorcaspasen
initiiert (Abb. 1, Pkt. 3). Dieser Schritt ist die Ursache fiir die Fragmentierung der DNA, die
Spaltung wichtiger Substratproteine und somit fur den apoptotischen Zelltod. Bei Aktivierung
der Effektorcaspasen ist der „point of no return" erreicht und der apoptotische Zelltod ist
irreversibel (HUPPERTZ et al, 1999)
2.4.2.2 Caspasen
Die Caspasen tragen ihren Namen aufgrund ihrer Cystein-abhängigen Aspart at-Spezi fität
(Cystein /^Apartate-specific Pvoteiruises). Die Caspasefamilie besteht aus mindestens 14
verschiedenen Proteinasen (HUPPERTZ et al., 1999; KÖHLER et al., 2002; LAWEN, 2003;
PADOSCH et al, 2001; RUPINDER et al, 2007), welche nach ihrer Funktion in
Initiatorcaspasen (2, 8, 9, 10), Effektor- bzw. Exekutionscaspasen (3, 6, 7) und in nicht primär
an apoptotischen Prozessen beteiligte inflammatorische Caspasen (Caspase 1,4, 5, 11, 12, 13
und 14) unterteilt werden (KÖHLER et al., 2002; PADOSCH et al., 2001; RUPINDER et al.,
2007)
Sie liegen in einer inaktiven Form, als sog. Procaspasen vor und werden auf ein proapoptotisches Signal hin durch Proteolyse in ihre aktive Form übergeführt. Die Procaspasen
bestehen aus je vier Domänen: Einer N-terminalen Prodomäne (2 - 25 kDa), einer großen (17
- 21 kDa) und einer kleinen Untereinheit (10 - 13 kDa), und einer kurzen Verknüpfungsregion
(„linker") zwischen der großen und der kleinen Untereinheit (KÖHLER et al., 2002).
Initiatorcaspasen haben eine lange (> 90 Aminosäuren) und Eflfektorcaspasenen eine kurze
Prodomäne (KÖHLER et al, 2002; LAWEN, 2003). Bei der Aktivierung wird die Prodomäne
abgespalten und es lagern sich je zwei große und zwei kleine Untereinheiten zu einem
stabilen Tetramer zusammen, welches dann katalytisch aktiv ist (KÖHLER et al., 2002;
MATZ, 2003).
Die Caspase 3 wird während der meisten Apoptoseprozesse aktiviert und wird als
Haupteffektorcaspase bezeichnet.
Ihre Aktivierung dürfte essentiell
fiir die DNA
Frakturierung, ebenso wie fur die Chromatinkondensation und das „blebbing" der
Plasmamembran sein (KÖHLER et al., 2002; LAWEN, 2003).
15
Caspasen spielen eine dominante Rolle während der Apoptose, doch dürfte es zumindest eine
weitere - Caspase unabhängige - Form des apoptotischen Zellunterganges geben.
Mitochondrien können nämlich wie schon erwähnt den sog. „apoptosis-inducing factor"
(AIF) freisetzen, welcher Chromatinbrüche und -kondensation induzieren kann. Dies ist bei
weitem nicht so deutlich, wie bei den durch Caspasen induzierten Vorgängen; auch kommt es
dabei anstatt einer Schrumpfting zu einer Zellschwellung (LAWEN, 2003).
2.4.2.3 Fraktin
Während der Apoptose wird ß-Aktin durch die aktivierte Caspase 3 gespalten, wobei ein aus
ca. 130 Aminosäuren (15 kDa) bestehendes Stück vom C-Terminus und ein 244 Aminosäuren
(32 kDa) großes Stück vom N-Terminus des ß-Aktins entsteht. Dieses 32 kDa große Stück
wird als Fraktin (^agment of actin) bezeichnet. Durch diese Spaltung werden antigene
Determinanten freigelegt die von entsprechenden Antikörpern erkannt werden können.
Letztere können als späte Marker der Apoptose eingesetzt werden (SUURMEIJER et al.,
1999)
16
2.5 Selektive Vulnerabilität des Hirngewebes
Nicht
alle
Regionen
des
Gehirns
sind
gleich
empfindlich
gegenüber
Hypoxie/Reperfijsionsschäden, Einige Gehirnareale weisen schon Nervenzellschäden auf
wenn andere Regionen noch völlig unversehrt wirken Zu diesen besonders vulnerablen
Regionen zählen die Pyramidenzellen in Neocortex und Hippocampus, die Purkinjezellen im
Kleinhirn und die Nervenzellen in Putamen, Thalamus, Striatum, den Amygdala, und in
anderen subkortikalen Kernen (ANANIADOU et al., 2005; EBNER, 2005),
2.5.1
Hippokampusformation
Die Formation des Hippokampus steht in Studien über Hypoxieschäden häufig im
Mittelpunkt, da sie als selektiv vulnerabel gilt, ebenso wie die Großhirnrinde (WHITE et al.,
1996)
Die Hippokampusformation besteht aus dem Comu ammonis (Ammonshom oder
Hippokampus), dem Cornu ammonis inversum (Gyrus parahippocampalis), dem Gyrus
dentatus, den Fimbria hippocampi und der Fomix (NICKEL et al., 1992).
Das Ammonshom wir seit 1934 nach Lorente de Nö in 4 Regionen, die so genannte CAl,
CA2, CA3 und CA4 Region unterteilt (EL FALOUGY u. BENUSKA, 2006, FULLER u.
BURGER, 2007).
Bei Hypoxie und Ischämie sind die einzelnen Regionen des Hippokampus unterschiedlich
vulnerabel, wobei die CAl Region als empfindlichste giU, während die CA3 Region erst bei
schweren Insulten geschädigt wird (PADOSCH et al., 2001).
Laut WHITE et al. (1996) sind die Pyramidenzellen der Lagen III und V des Cortex und
Neuronen der CAl und der CA4 Region des Hippokampus am empfindlichsten, wohingegen
MAITI et al. (2007) nachgewiesen haben, das die CA3 Neuronen nach hypobarischem
hypoxischen Insuh vulnerabler seien als CAl Neuronen.
Der Hippokampus ist wichtig für Gedächtnis und Lemen. Die Hippokampusformation als Teil
des limbischen Systems ist an der Steuerung von Emotionen beteiligt und dürfte nach neueren
Forschungen auch eine Rolle beim Essverhalten und beim Appetit spielen (EL FALOUGY u.
BENUSKA, 2006)
17
2.6 Prophylaxe und Therapie von ischämie- und reperfusionsbedingten
neurologischen Schäden
Zur Prophylaxe bzw. bei der Therapie neurologischer Schäden infolge Ischämie/Reperflision
kommt der Induktion einer Hypothermie eine besondere Bedeutung zu.
Im frühen 19. Jh. (POPP et al., 2005) fällt Ärzten erstmals die höhere Überlebensrate von
verwundeten Soldaten auf, wenn sie zugleich an einer - damals unkontrollierten Hypothermie litten. Erste klinische Untersuchungen wurden in den Jahren 1958 und 1959
veröffentlicht (BENSON et al., 1959), wobei davon 4 Patienten nach einer Reanimation am
offenen Herzen gekühlt wurden (HOLZER u. BEHRINGER, 2005; POPP et al., 2005) Björn
Westin und Kollegen (THORESEN u WYATT, 1997) badeten bereits in den 70ern
asphyxische Neugeborene in Eiswasser und berichteten über eine stark verringerte Mortalität.
Ebenso gibt es unzählige Fallberichte von Überlebenden mit Ischämiezeiten von bis zu einer
Stunde nach Unfällen in eiskalten Gewässern, welche vor allem auch mit gutem
neurologischem Ergebnis aus dem Krankenhaus entlassen werden konnten (POPP et al.,
2005) In den 1980ern wurden erstmals Studien über den Effekt von therapeuthischer
Hypothermie nach einem Herz-Kreislauf-Stillstand von Safar et al an Hunden durchgeführt
(SAFAR u KOCHANEK, 2002).
Derzeit werden drei verschiedene Modellansätze verfolgt, um neurologische Schäden am
maturen zentralen Nervensystem zu minimieren bzw. zu verhindern. Einerseits die Kühlung
vor dem Herzstillstand („protective hypothermia"), diese wird bereits in der Herz- und
Neurochirurgie eingesetzt, wobei es sich hier um „geplante" Herzstillstände handelt. Zweitens
die induzierte Hypothermie während eines Herzstillstandes, noch vor der Reanimation
(„preservative hypothermia") Diese Methode wurde entwickelt für Patienten mit großem
Blutverlust, wie z.B : nach SchussVerletzungen und Unfällen. Hierbei werden die Patienten
vor dem Beginn der Reanimation, während dem Transport und der chirurgischen Blutstillung,
durch verschiedene Methoden gekühlt („suspended animation for delayed resuscitation")
(HOLZER u. BEHRINGER, 2005)
Die dritte Gruppe von Wissenschaftlern beschäftigt sich mit der Kühlung während bzw nach
der Reanimation bzw, der Reperfiision („resuscitative hypothermia"). Hier wird die Kühlung
während der Reanimation („early resuscitative hypothermia") bzw. nach erfolgreichem ROSC
18
(„late resuscitative hypothermia") eingeleitet und fur einige Stunden (meist 12-24 Stunden)
aufrechterhalten (JANATA et al, 2006)
Weiters wurden zahlreiche Modelle entwickelt, um die neonatale Hypothermie nach
hypoxisch/ischämischen Geburtskomplikationen zu evaluieren, welche aber im Rahmen
dieser Arbeit nicht weiter beschrieben werden sollen.
2.6.1
Mechanismen der Zellprotektion durch Hypothermie
Der wohl bekannteste Effekt einer Hypothermie besteht in der generellen Herabsetzung der
Metabolisierungsrate der Zelle und damit in einer Verringerung des Glukose- und
Sauerstoffverbrauchs. Dies führt zu geringeren Laktat- und Pyruvatspiegeln, und somit zu
einer Reduzierung einer Azidose. Auch kommt es zu einer Hemmung der Lipidperoxidation,
und zu einer Abschwächung eines Hirnödems (HOLZER u BEHRTNGER, 2005). Weiters
konnte auch eine verminderte Aktivierung der Caspasen nachgewiesen werden. Diese beruhte
einerseits auf einer direkten Hemmung der Caspasen, und anderseits auf einer Verminderung
mitochondrialer Dysfunktionen, die normalerweise zu einer Aktivierung von Caspasen fuhren
(HOLZER u. BEHRINGER, 2005; POPP et al., 2005). Ferner konnte in Untersuchungen
gezeigt werden, dass es durch eine Hypothermie zu einer Minimierung von freien
SauerstofFradikalen kommt, wenngleich der Mechanismus der Reduktion nicht geklärt ist
(POPP et al., 2005).
Darüber hinaus kann durch eine therapeutische Hypothermie die ischämie- und
reperfijsionsbedingte Aktivierung von VEGF („vascular endothelial growth factor'*) und
folglich von Stickstoffmonoxid (NO) reduziert werden; in folge dessen können die dadurch
induzierten Störungen der Membranfunktionen über mehrere Stunden verzögert werden
(POPP et al, 2005).
Ebenfalls nachgewiesen werden konnte eine verminderte Freisetzung exzitatorischer
Neurotransmitter. Unter physiologischen Bedingungen werden Neurotransmitter wie
Glutamat und Aspartat pulsatil synaptisch freigesetzt. Sie werden normalerweise sofort
wieder reabsorbiert und inaktiviert. Dieser Prozess ist jedoch energieabhängig und so
während
einer
Ischämie
stark
beeinträchtigt.
Die
daraus
resultierende
exzessive
19
Kalziumüberladung der Zelle würde ihrerseits wiederum zellschädigende Prozesse, wie
mitochondriale Dysflmktion und Caspaseaktivierung, auslösen (POPP et al, 2005).
2.6.2 Verschiedene Kühltechniken
Das wichtigste Ziel jeder Kühltechnik besteht darin, eine besonders schnelle Kühlung bis zum
Erreichen der Zieltemperatur zu bewirken (POPP et al, 2005)
Einerseits kommen einfache, externe Kühlmethoden wie Kahluft, Kältematten, Eispacks und
eiskahe Infusionen, andererseits interne, invasive Verfahren, wie z.B, endovaskuläre
Kühlkatheter und extrakorporale Zirkulation, zum Einsatz.
Kahluft, Eispacks und Kältematten können den Körper um rund 0,4 - 0,9 ^'C pro Stunde
abkühlen, wobei die Gesamtkühl zeit zum Teil deutlich über 4 Stunden liegt Schnelle eiskalte
Infusionen (30ml/kg KG innerhalb von 30 min ) erreichen eine Kühlgeschwindigkeh von
etwa 3,2 "C pro Stunde. Die invasiven Techniken fuhren zu einer noch schnelleren Kühlung,
wobei mit der extrakorporale Zirkulation bis zu 12 "C pro Stunde erreicht werden können
(POPP et al, 2005).
Eine weitere Technik stellt der LRS ThermoSuit* dar, wobei Eiswasser in einer dünnen
Schicht über die Körperoberfläche gepumpt wird. Bei dieser Methode konnte eine
Zieltemperatur von 34 "C innerhalb von 9 Minuten erreicht werden, was einer
Kühlgeschwindigkeit von durchschnittlich 0,4 °C pro Minute (24 "^C/h) entspricht (JANATA
et al., 2008).
20
3 Tiere, Material und Methode
3,1 Tiere
Für die Untersuchungen wurden 16 weibliche Schweine (31+/- 3 kg) der Rasse Pietrain x
Edelschwein vom Hochschulgut „Medau" der Veterinärmedizinischen Universität Wien in
Bemdorf (Austria) verwendet.
Der Versuch an den lebenden Tieren wurde
im
Biomedizinischen Forschungszentrum (Leiter: Univ. Prof. Dr. U. Losert) am AKH Wien
unter der wissenschaftlichen Leitung von Prof Dr. F
Sterz
(Universitätsklinik ilir
Notfallmedizin) der Medizinischen Universität Wien durchgeführt (Genehmigungsnummern:
von
2002:
GZ66.009/42-Pr4/2002,
Verlängerung
2004:
GZ66.009/270-BrGT/2004,
Verlängerung 2005: GZ66.009/0283-BrGT/2005)
Die Tiere wurden 14 Tage vor Versuchsbeginn an das Institut verbracht, um sie an die neue
Umgebung zu gewöhnen Für den Versuch wurden die Tiere in 2 Gruppen zu je 8 Tieren
eingeteilt 12 Stunden vor dem Versuchbeginn wurde den Tieren, bei freiem Zugang zu
Trinkwasser, das Futter entzogen.
Nach Prämedikation mit Midazolam (1,25 mg/kg), Acepromazin (1,75 mg/kg), Atropin (0,5
mg/Tier), Enrofloxacin (5 mg/kg) und Piritramide (15 mg/Tier), wurde die Narkose mit
Propofol (40 - 80 mg/Schwein) eingeleitet. Danach wurden die Schweine intubiert und mit
einem Tidalvolumen von 10 ml/kg, einem positiven end-exspiratorischen Druck von 5 cm
H2O und einem Fi02 von 0,3 mechanisch beatmet, wobei das Verhältnis von In- zu
Exspiration bei 1:2 lag (Servo 300, Maquet Critical Care, Solna, Schweden). Die
Beatmungsfrequenz wurde so angepasst, dass sich der paC02 zwischen 35 - 40 mmHg
befand. Zur Narkose wurden Propofol (20 mg/kg/h i.v ) und Boli von Piritramide (30 mg i.v.)
verwendet Flüssigkeit wurde als physiologische Kochsalzlösung über einen venösen Zugang
am Ohr mittels Perfusor (5
ml/kg/h) appliziert. Elektroden zur Ableitung eines
Elektrokardiogrammes (EKG) wurden an den Extremitäten und eine Pulsoxymetersonde
wurde am Schwanz befestigt. Weiters wurden eine Magensonde, und jeweils eine
21
Temperatursonde (General Purpose Sensor 9F, Nellcor, Pleasanton, USA) in die Speiseröhre
und in die Harnblase gelegt. Um die Hirntemperatur zu messen, wurden Sonden (Generic
Thermocouple Probe, Biosys"•, Vienna, A) jeweils 1 cm links und rechts der Sagittalnaht und
1 cm vor der Coronalnaht über Bohrlöcher 2 cm tief in das Frontalhirn eingebracht.
Für die Bestimmung des mittleren arteriellen Blutdruckes (MAP) und fiir die Entnahme von
Blutproben wurde ein Katheter in die A brachialis eingeführt. Ein weiterer Katheter wurde
über die V jugularis dexter in die Pulmonalartene eingeführt, um den zentralen Venendruck
(CVP), den Pulmonalarteriendruck (PAP), den Lungenkapillardruck (PCWP) und die
pulmonal arterielle Temperatur (Tpa) zu messen. Weiters wurde dieser Zugang für Medikation
und Infusion genützt.
Während der Vorbereitungen wurde die Körpertemperatur durch eine Heizdecke oder einen
Ventilator innerhalb des Normbereiches von 38,5 +/- 0,2 "^C gehahen.
Nach Stabilisierung der kardiopulmonalen Parameter wurden die Heizdecken entfernt, die
intravenöse Flüssigkeitszufuhr und die Narkoseaufrechterhaltung unterbrochen und 50 lU/kg
Körpergewicht Heparin intravenös appliziert. Nach einem Propofolbolus von 40 mg/Tier
wurde ein Herzstillstand über ein Kammerflimmem, welches durch einen externen Impuls
von 2 Sekunden Dauer und von 90 Volt und 60 Hertz ausgelöst wurde, herbeigeführt. Zur
selben Zeit wurde der Trachealtubus vom Respirator getrennt.
Nach lOminütigem untherapiertem Herzkreislaufstillstand wurden die Tiere mit einem
mechanischem Thoraxkompressor (Thumper®, Typ 1000, Michigan Instruments Inc., Grand
Rapids, MI) und manueller Ventilation (Laerdal Silicone Resuscitators*, Laerdal, Stavanger,
Norwegen) reanimiert Nach 3 Minuten Basisreanimation (basic life support - BLS) wurden
erweiterte Reanimationsmaßnahmen mit 0,4 lU/kg Vasopressin und Flüssigkeitsgabe (5
ml/kg/h) durchgeführt (Advanced Cardiac Life Support, ACLS). Nach insgesamt 6 Minuten
kardiopulmonaler Reanimation (CPR) wurde eine zweite Dosis Vasopressin verabreicht und
nach 8 Minuten wurden bis zu 3 Defibrillationen (Heartstart* 4000, Laerdal, Stavanger,
Norwegen) mit 150 J durchgeführt, um einen Spontankreislauf (Restoration of Spontaneous
Circulation, ROSC) herzustellen. Wurde damit kein ROSC erreicht, erfolgten die Gabe von
0,04 mg/kg Epinephrin und bis zu drei weitere Defibrillationen eine Minute darauf Konnte
daraufhin immer noch kein Spontankreislauf erzielt werden, wurde der Versuch an diesem
Tier beendet.
22
Alle Tiere, die erfolgreich wiederbelebt werden konnten, wurden unmittelbar nach ROSC in
die Hypothermie- oder die Kontrollgruppe randomisiert.
Die Tiere der Hypothermiegruppe wurden daraufhin in die ThermoSuit® (TSS, Life Recovery
Systems HD, LLC, Kinneion, NJ) umgelagert, die den größten Teil des Körpers (95 %)
umhüllt und mit Hilfe eines Flüssigkeitspumpsystem kaltes Wasser (0-4 '^C) bei direktem
Hautkontakt durch das Innere des Anzuges pumpt. Diese Kühlung wurde solange fortgesetzt,
bis eine Tpa von 34 °C erreicht wurde, welche 1 '*C über der Zieltemperatur lag, um ein
überschießendes Abkühlen zu vermeiden
Nach
Erreichen
spontaner
Zirkulation
wurden
ein
allfälliges
Basendefizit
mit
Natriumbikarbonat ausgeglichen und ein MAP von > 60 mmHg mit Hilfe von Infusionen,
Norephinephrin und Vasopressin eingestellt. Die Tiere blieben für 20 h am Respirator, um
den SauerstofFpartialdruck zwischen 100 und 150 mmHg und den arteriellen CO2 Druck bei
35 - 40 mmHg zu halten. Die Narkose und Analgesic wurden während dieser Zeit mit 12
mg/kg/h Propofol und Piritramide (7,5 mg/Tier alle 6 h) aufrecht erhallen, die neuromuskuläre
Blockade erfolgte durch einen Rocuroniumbolus von 0,6 mg/kg, gefolgt von einer
Dauerinfusion mit 15 |ig/kg/h. Blutdruckspitzen (MAP > 150 mmHg) wurden, eine
ausreichende Anästhesie vorausgesetzt, mit Urapidilboli von 0,1 mg/kg i.v., und eine
Hypotension (MAP < 80 mmHg) mit physiologischer Kochsalzlösung oder Plasmaexpander,
gefolgt von Norepinephrin und Vasopressin, je nach Bedarf, behandelt.
Die Intensivtherapie umfasste auch das Freihalten der Atemwege, eine periodische tiefe
Lungenbeatmung, eine Lageveränderung der Tiere und eine balancierte Flüssigkeitszufuhr.
Zur Infektionsprophylaxe erhielten die Tiere 5 mg/kg Enrofloxacin im Abstand von 24
Stunden.
Um ein weiteres Abkühlen zu verhindern, wurde die Tpa mit Hilfe von Heizdecken (Warm
Air R Hyperthermi a system 134, CSZ Cincinnati Subzeroproducts, Ohio, USA) und
Ventilatoren konstant auf 33,0 +/- 1 "^C bis 16 h nach Erreichen der spontanen Zirkulation
gehalten; danach startete das Erwärmen der Tiere, um nach 20 h wieder eine Tpa von 38,5 +/I °C zu erreichen.
Vor dem Beginn des Erwärmens und 20 h danach wurde die Haut der Schweine auf
kältebedingte Veränderungen untersucht.
23
Die neuromuskuläre Blockade wurde nach 18 h, die Sedierung und Analgesic nach 20 h
unterbrochen. Nach Einsetzen von Spontanatmung und Stabilisierung der kardiovaskulären
und pulmonalen Funktionen, wurden die Schweine extubiert und in einen Stall verbracht, wo
sie weiter beobachtet wurden.
Krämpfe, Opisthotonus, Manegebewegungen, Hyperventilation und Zeichen von Unbehagen
wurden mit Midazolam (0,4 mg/kg) oder Boli von Propofol (40 mg/Tier) kontrolliert.
Piritramid (7,5 mg/Tier) wurde bei Anzeichen von Schmerz intravenös oder intramuskulär
verabreicht. Nach 36 h wurde den Tieren Wasser und Futter angeboten; bei fehlender Futterund Tränkeaufnahme erhielten sie 10 %ige Glucoselösung intravenös
Nach 9 Tagen wurden die Tiere von verblindeten Tierärzten (Klinik für Schweine,
Veterinärmedizinische Universität Wien, Austria) neurologisch untersucht Wenn nötig,
wurde die Sedation mit Naloxone (0,8 mg/Tier) und Flumazenil (2 mg/Tier) aufgehoben.
Für die morphologischen Studien wurden die Schweine tief anästhesiert,
der Thorax
linksseitig eröffnet und danach die Aorta descendens ligiert. Über eine große Kanüle, welche
proximal der Ligatur in die Aorta eingeführt wurde, wurden die Schweine bei eröffnetem
rechtem Vorhof mit einer perfusorgesteuerten Infusion von 4 Litern Kochsalzlösung entblutet.
Nach der Kochsalzlösung wurde 1 Liter Paraformaldehyd (3 %, pH 7,4) mittels einer Pumpe
infiindiert. Bei der anschließenden Obduktion wurde das Gehirn entnommen und zur weiteren
Fixierung nochmals in eine 4 %ige Paraformaldeydiösung eingelegt.
24
3.2
Material
3.2.1 Zellkultur
Die Zellkulturversuche wurden am Institut fur Immunologie (Univ. Prof. Dr, Armin
Saalmüller) der Veterinärmedizinischen Universität Wien, Austria, durchgeführt.
Verwendet wurden porcine SV40 transformierte Nierenepithelzellen (Max B Zellen; d/d
haplotype minipig; PAULY et al., 1995). Diese wurden in RPMI Medium 1640 + LGlutamine + P/S + 10 % FCS Gold (PAA, Pasching, A) kultiviert.
3.2.2 Thymus, Lymphknoten und Lunge
Es wurden Präparate von Lymphknoten- bzw. Lungen (Protokollnummern W 1713/02, F
940/02 und F 941/02) von Schweinen mit einer Infektion mit dem .J^orcine Reproductive and
Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) und von Thymus (Protokollnummern F 1283/04, F
1284/04, und F 1285/04 verwendet. Diese wurden aus dem Sektionsgut des Institutes für
Pathologie und Gerichtliche Veterinärmedizin der Veterinärmedizinischen Universität Wien
im Rahmen von Routine Sektionen entnommen.
3.2.3 Hirnpräparate
Die vorfixierten Gehirne wurden mit Hilfe einer Schneidevorrichtung und eines
Organmessers in zwei Hälflen zerteilt; anschließend wurde die linke Hälfte in 3 mm dicke
Koronarschnitte zerlegt. Die rechte Hälfle wurde für sterologische Untersuchungen im
Rahmen eines anderen Versuches asserviert.
25
Für die weiteren Untersuchungen standen somit die Gehirnhälften folgender Tiere zur
Verfugung:
Gruppe 1
Hypothermiegruppe
Gruppe 2
Normothermiegruppe
SA2J2
SA 213
SA 215
SA 222
SA 228
SA 232
SA 234
SA 214
SA 218
SA 221
SA 223
SA 224
SA 225
SA 229
SA 238
SA 231
3.2.4 Verwendete Lösungen, Antikörper und Kits
Zellkiiltur:
PBS:
D-PBS + CaCl2 + MgCIi; Ref 14040-091, GIBCO, Invitrogen Corporation, USA
Molekularbiologische und Immunhistochemische Färbung:
PBS:
PBS - Stammlösung: 10,52g Na2HP04 + 0,98g KH2PO4 ad 1000 ml Aqua dest.
PBS - Gebrauchslösung: 180 ml Stammlösung + 900 ml physiologische NaCl
26
CitratpufFer:
0,01M, pH 6,0; Zitronensäure Monohydrat 2,1g, Aqua dest. 900ml, 2M NaOH
(titrieren auf pH 6,0), ad 1000ml Aqua dest.
TUNEL Kit: DeadEnd• Colorimetric TUNEL System; Kat. Nr.: G7130, Promega
Corporation, USA
DAB Kit fiir Immunhistochemie: DAB Substrate Kit for Peroxidase; Kat, Nr : SK-4100,
Vector Laboratories, Burlingame, USA
ABC Reagenz Kit: Avidin-biotin peroxidase Reagenz; Vectastain ABC Kit (Standard), Kat.
Nr : PK-4000, Vector Laboratories, Burlingame, USA
Goat - Normalserum: 1:10; 0,3 ml Serum + 2,7 ml PBS
Kat. Nr.: S-1000, NGS Vector Laboratories, Burlingame, USA
Caspase Antikörper: Rabbit polyclonal anti-active caspase-3 Antikörper; Kat. Nr.: 557035,
BD Biosciences, USA
Fraktin Antikörper: Rabbit anti-fractin polyclonal Antikörper (32 kDa Fragment von betaActin); Kat. Nr.: AB3150, Chemicon International, USA
3.2.5
Auszug aus den verwendeten Reagenzien, Geräten und sonstigen Materialien
Formalin: Natriumphosphatpuffer, gepuffertes Formalin, pH 7, 7 %, Inhaltstoffe von Merck,
Darmstadt, D
Zellkultur:
Camptothecin: (S)-(+)-Camptothecin, ~ 95 % (HPLC), Pulver; Kat. Nr.: C991I; SigmaAidrich Corporation, USA
27
Trypsin-EDTA (Ix) 0,25 %: 2,5 g Trypsin (1:250) + EDTA-4Na/L in HBSS ohne
Ca^^+Mg^'; Kat. Nr.: 25200-056, GIBCO, Invitrogen Corporation, USA
Bluecaps: Polypropylen Röhrchen (PP-Tubes), 50 ml, Kat. Nr.: 227261; Greiner-Bio-One,
Kremsmünster, A
Zellkulturgefäße: Filter Top Zellkultur Flasche, Wachstumsfläche 75 cm\ Kat. Nr.: 658175;
Greiner-Bio-One, Kremsmünster, A
Sicherheitswerkbank:
Hera
safe;
Heraeus,
Kendro
Laboratory
Products
GmbH,
Langenselbold, D
Molekularbiologische und immunhistologische Färbung:
Paraformaldehyd 4% fiir TUNEL: 4 g Paraformaldehyd ad 100 ml PBS (pH 7,4) bei 70 **C
lösen mittels 3 Tropfen IM NaOH
zur vollständigen Auflösung, daraufhin
geschlossene Flasche fiir 2 Stunden im Wasserbad bei 65 °C inkubieren; die Lagerung
erfolgt bei 4 "C für max. 4 Wochen.
Vortex: Reamix 2789, Assistent; Karl Hecht GmbH & Co. KG, Sondheim, D
Thermomixer: Thermomixer compact, Eppendorf AG, Hamburg, D
Tischabzug: Waldner Elektronics FAZ 2, Abzug: Variolab, Mobilien W 90, Abluftmenge:
350 m^/h, Waldner Laboreinrichtungen GmbH & Co., Wangen, D
28
3.3 Methode
3.3.1 Etablierung einer Zellkultur mit hoher Apoptoserate zur Evaluierung der
verschiedenen histologischen Färbemethoden
Zur Gewinnung von Zellpräparaten, die eine gesicherte hohe Apoptoserate aufweisen, wurden
porcine Nierenzellen (siehe; 3.2.1) kultiviert. Nach Erreichen eines 70 - 90 % konfluenten
Zellrasens in Passage 3 wurde die Apoptose mit Hilfe von Camptothecin induziert. Dafür
wurden eine Camptothecinstammlösung von 4 mg/ml und daraus mehrere Arbeitslösungen
von 1 ug/ml, 4 ug/ml, 8 ug/ml und 64 ^g/ml mit DMSO als Lösungsmittel hergestellt. Um
die höchstmögliche Apoptoserate bei einer möglichst geringen Nekroserate zu erreichen,
wurden verschiedene Intoxikationszeiten evaiuiert (4 h, 7 h, 8 h, 12 h, 16 h, 24 h, 31 h). Die
Kontroll-Zellkultur erhielt die äquivalente Menge an DMSO (10 mg/ml) ohne CamptothecinZusatz im Nährmedium.
Bestimmung der Apoptose/Nekroserate in Zellkulturen nach Camtothecin-Behandlung
mittels Durchflusszytometrie (FCM)
Zu Versuchsbeginn wurden die Zellrasen auf Konfluenz mikroskopisch kontrolliert. Danach
wurde das Medium vorsichtig abpipettiert und die Zellen wurden mit der jeweiligen
Camtothecin- bzw. DMSO-Gebrauchslösung bedeckt (20 ml). Darauiliin wurden die Kulturen
wieder in den Inkubator (Hera cell 150; Heraeus, Kendro Laboratory Products GmbH,
Langenselbold, D) verbracht.
Nach 4, 7, 8, 12, 16, 24 und 31 Stunden wurde der Überstand der Zellkulturen abgenommen
und 7 ml Trypsin eingebracht Es erfolgte eine weitere Inkubation ftir 3 Minuten bei 37 ''C.
Nach einer mikroskopischen Kontrolle der vollständigen Ablösung der Zellen wurde das mit
Trypsin versetzte Medium in „Bluecaps" umgefiillt und bei 1300 U/min für 10 Minuten
zentrifiigiert (Zentrifuge: Mutifuge 1 S-R; Heraeus, Kendro Laboratory Products GmbH,
Langenselbold, D). Danach wurden die Lösungen dekantiert und die Pellets in 3 ml PBS
resuspendiert. IG |il der jeweiligen Lösungen wurden in Eppendorfröhrchen verbracht. Es
29
erfolgte eine Färbung mit 90 ^1 Trypan Blau je Tube und danach eine Auszählung der Zellen
in einer Zählkammer.
Die restlichen Zellsuspensionen wurden je nach errechneter Menge unter Zugabe von 1 ml
PBS in FACS Röhrchen aufgeteilt. Die Zellen wurden erneut bei 1000 U/min fur 5 Minuten
zentriftjgiert und der Überstand wurde wieder dekantiert.
Am Ende der verschiedenen Inkubationszeiten mit dem Toxin und nach den eben erwähnten
Vorbereitungen fiir die Markierung wurden die Zellen nach den Herstellerinstruktionen der
Firma Roche mit Annexin V und Propidium lodid (PI), Annexin V alleine oder nur mit dem
Puffer vermischt und fur 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert Unmittelbar danach
wurden die Zellen im Durchflusszytometer (FACSAria, BD Biosciences) analysiert.
Das im Annexin-V-Fluos Staining Kh (Kat. Nr.: 1858777; Roche, D) enthaltene Annexin V
war mit Fluorescein konjugiert und emittierte dadurch Licht im Wellenlängenbereich von 500
- 540 nm. Dementsprechend wurde die Fluoresceinfluoreszenz mit einem 530/30
Bandpassfilter gemessen. Parallel dazu wurde die Fluoreszenz des DNA-gebundenen PI mit
einem 590/40 Bandpassfilter gemessen. Je Probe wurden mindestens 5000 Zellen analysiert.
Eine maximale Apoptoserate bei minimaler Nekroserate wurde durch eine 16 stündige
Inkubation bei 37 "C und 5 % CO2 mit einer Arbeitslösung von 8 ng/ml Camptothecin
erreicht.
Aufbereitung der ZellkuUuren für die Parafrinfixierung
Nach dem die fur die FCM errechnete Menge an Zellen auf die FACS Röhrchen aufgeteilt
wurde, wurden die übrigen Zellen in Eppendorfröhrchen pipettiert und mit 0,5 ml PBS
versetzt. Danach wurden die Tubes bei 1300 U/min fur 10 Minuten zentrifugiert. Daraufhin
wurde der Überstand vorsichtig abgenommen und die in den Röhrchen verbleibenden
Zellpellets wurden mit einer 4 %igen gepufferten Paraformaldehydlösung überschichtet. Es
erfolgte eine Fixierung der Pellets über Nacht. Am nächsten Tag wurden die Pellets in den
Tissue-Tek-Infiltrationsprozessor (Firma Medical Systems, Sanova Pharma, Wien, A)
verbracht und nach dem Standardprotokoll in Paraffin eingebettet.
30
3.3.2 Gewebevorbereitung für die Färbungen
Die Gehirnpräparate wurden für mindestens 48 h in 7 % Formalin eingelegt, danach in den
Tissue-Tek-Infiltrationsprozessor verbracht und in Paraffin eingebettet.
Aus diesen Paraffinblöcken wurde der Schnitt mit der größten Hippokampusdarstellung für
die weiteren Untersuchungen ausgewählt.
Von allen in Paraffin eingebetteten Geweben (Zellpellets, Thymus, Lymphknoten, Lunge und
Gehirn) wurden mit einem Mikrotom (HM 440 E; Ser Nr.: 4938, Microm GmbH, Walldorf,
D.) 3 i^m dicke Schnitte angefertigt, welche auf beschichtete Objektträger aufgezogen
wurden. Um die Anhaftung der Schnitte zu verbessern, wurden die Objektträger bei ca. 50 ''C
über Nacht inkubiert.
3.3.3 Hämatoxylin - Eosin Färbung
Von allen Präparaten wurde jeweils ein Schnitt nach Standardprotokoll mit HE gefärbt.
3.3.4 TUNEL Färbung
Die Färbung wurde nach den Herstellerinstruktionen wie folgt durchgeführt:
Nach dem Entparaffinieren durch eine 2 x Sminütige Immersion in Neo-Clear* (Xylol-Ersatz,
Kat. Nr : 09843, Merck, Darmstadt, D) und anschließender Rehydrierung der Schnitte in einer
absteigenden Alkoholreihe (2 x 100 %, 1 x 96 % und 70 % für jeweils 5 Minuten) wurden die
Schnitte fur 2 x 5 Minuten in Aqua dest. und dann für weitere 5 Minuten in eine 0,9 %ige
NaCl Lösung eingestellt. Danach wurden die Schnitte für 5 Minuten in PBS verbracht, um
dann tür 15 Minuten in 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur inkubiert zu werden. Nach
einer 2 x 5minütigen Immersion in PBS wurde die Lösung abgeschleudert und die
Objektträger wurden mit der Proteinase K - Lösung aus dem Kit (20 ng/ml) für 20 Minuten in
einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wurden die Objekträger in eine Küvette mit PBS, dann mit 4 %
Paraformaldehyd und wiederum 2 x in PBS für jeweils 5 Minuten eingestellt
31
Nach dem Abschleudern des PBS wurde der Aquilibrierungspuffer (100 |jl/Schnitt)
aufgetropfl und die Schnitte wurden für 5 - 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem
Dekantieren des Aquilibrierungspuffers wurde überschüssiger Puffer mit einem Zellstoff
abgetupft, um den TdT - Mix aus dem Kit auftragen zu können.
Die Negativkontrolle wurde durch Weglassen des TdT - Enzymes hergestellt.
Anschließend wurden die Schnitte mit Cover - Slips bedeckt und für 60 Minuten bei 37 °C in
einer feuchten Kammer inkubiert (Wärmeschrank Binder, WTB-Binder; Tuttlingen, D).
Nach Einstellen für 15 Minuten in 2x SSC (20x SSC 1:10 in PBS verdünnt) erfolgte
wiederum ein Waschgang in PBS für 2 x 5 Minuten. Die endogene Peroxidase wurde durch
eine Inkubation in 0,3 %iger H2O2 - Lösung in PBS für 5 Minuten bei Raumtemperatur
inaktiviert. Anschließend wurden die Schnitte für 2 x 5 Minuten in PBS gespült.
Streptavidin HRP aus dem Kit wurde 1:500 in PBS verdünnt und für 30 Minuten bei
Raumtemperatur auf den Schnitten (100 ul/Schnitt) belassen. Danach erfolgte wieder ein
Einstellen der Schnitte in PBS fiir 2 x 5 Minuten.
Unmittelbar vor Gebrauch wurde das DAB - Entwicklerreagenz hergestellt und nach
sorgfältigem Abtupfen der Schnitte davon jeweils etwa 100 pVSchnitt aufgetropft. Nach
mikroskopischer Kontrolle der Entwicklung wurde nach 2-5 Minuten die Reaktion durch
lOminütiges Spülen mit Leitungswasser gestoppt.
Abschließend wurden die Schnitte mit Hämalaun gegengefärbt und 10 Minuten in
Leitungswasser gebläut. Nach 5minütigem Einstellen in Aqua dest wurden die Schnitte mit
Aquatex* (Kat. Nr. HC600763, Firma Merck, D) eingedeckt
32
3.3.5 Immunhistochemie
Als weitere Apoptosenachweis wurden 2 immunhistologische Färbemethoden gewählt. Dabei
wurden die aktive Caspase 3 bzw. Fraktin (siehe 3.2.4) durch entsprechende Antikörper
nachgewiesen. Um eine optimale Antikörperkonzentration zu ermitteln, wurde die
Arbeitskonzentration durch Verdünnungsreihen festgestellt.
Das Färbeprotokoll lautet wie folgt:
Nach Entparaffinieren durch eine 2 x 5minütige Immersion in Neo-Clear* und anschließender
Rehydrierung der Schnitte in einer absteigenden Alkoholreihe (2 x 100 %, 1 x 96 % und 70 %
für jeweils 5 Minuten) wurden die Schnitte fiir 2 x 5 Minuten in Aqua dest. eingestellt.
Anschließend erfolgte eine Mikrowellenbehandlung (Jet 900 W, Whirlpool VIP 20, DES., S)
wobei die Schnitte nach einem 5minütigem Bad in Aqua dest. in eine Küvette mit Citratpuffer
umgestellt und bei 750 Watt fiir 4 Minuten gekocht wurden. Danach wurde der verdampfte
Puffer mit Aqua dest. aufgefulh und die Lösung nochmals zum Kochen gebracht. Zum
langsamen Abkühlen wurden die Schnitte für 20 Minuten bei Raumtemperatur in derselben
Küvette stehen gelassen, um dann für 5 Minuten in PBS verbracht zu werden.
Danach erfolgte ein Umstellen für 3 und 5 Minuten in eine jeweils frische PBS - Lösung. Um
die endogene Peroxidase zu blockieren wurden die Schnitte in 1,5 %igem H2O2
(Wasserstoffperoxid 30%, Kat Nr.: 07209; Merck KGaA, Darmstadt, D) in Methanol (Prod.
Nr.: 06009; Merck KGaA, Darmstadt, D) 30 Minuten lang inkubiert.
Danach wurden die Schnitte durch Einstellen in PBS gespült und weitere 20 Minuten in PBS
inkubiert.
Zur Reduktion unspezifischer Bindungen wurden die Schnitte mit einem Ziege-Normalserum
(Goat - Normalserum, siehe Pkt. 3.2.4) überschichtet und für 60 Minuten bei Raumtemperatur
in einer feuchten Kammer inkubiert. Nach dem Dekantieren des Serums wurde der
33
polyklonalen Primärantikörper in PBS aufgetropft und bei 4 "C über Nacht in der feuchten
Kammer inkubiert. Folgende Antikörperverdünnungen haben sich als günstig erwiesen:
Anti - Caspase 3 Antikörper: 1:500
Anti - Fraktin Antikörper:
1:1500
Zum Entfernen nicht gebundener Antikörper wurden die Schnitte fiir 4 x 5 Minuten in PBS
eingestellt. Anschließend wurden die Schnitte wieder sorgfältig abgetropft und der
biotinylierte Sekundärantikörper (biotinylierter anti-rabbit IgG (H+L), Kat. Nr.: BA-1000,
Vector Laboratories, Burlingame, USA) in einer Verdünnung von 1:200 aufgetropft (ca. 200
Hl/Schnitt).
Nach 30 Minuten in einer feuchten Kammer wurden die Schnitte wiederum fiir 10 Minuten in
PBS eingestellt. Während dessen wurde die ABC-Reagenz-Gebrauchslösung hergestellt und
fiir 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Anschließend wurde die Lösung auf die Schnitte aufgebracht (ca. 200 ^jJ/Schnitt) und fiir 60
Minuten bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer inkubiert. Nach Spülen mit PBS fiir
10 Minuten wurde das unmittelbar vor Gebrauch hergestellte Substrat aufgebracht und die
Schnitte wurden unter Mikroskopkontrolle 1,5 Minuten lang entwickelt.
Die Enzymreaktion wurde durch eine Spülung mit Leitungswasser für mindestens 5 Minuten
gestoppt. Danach wurden die Objektträger nochmals fiir 5 Minuten in Aqua dest. eingestellt,
um dann mit Hämalaun gegengefärbt zu werden Nach einer Wässerung mit fließendem
Leitungswasser fiir 10 Minuten wurden die Schnitte erneut in Aqua dest. fiir 5 Minuten
eingestellt, um dann mit Aquadex* eingedeckt zu werden.
34
3.3.6 Lichtmikroskopische Auswertung
Jedes Präparat wurde, ohne Kenntnis der Gruppenzugehörigkeit, lichtmikroskopisch
ausgewertet.
In der Hämatoxylin-Eoisinfärbung wurde das Vorhandensein bzw. das Ausmaß von
histologisch erfassbaren Veränderungen beurteilt. Besondere Beachtung fanden eosinophile
Nervenzellnekrosen,
Gefäßproliferationen
sowie das
Vorhandensein
von
aktivierten
Mikroghazellen bzw. einer allgemeinen Gliose. Das Nervenzellband des Hippokampus wurde
im Gesamten beurteih und auf Breite und Vollständigkeit überprüft
Bei der TUNEL Färbung wurden nur intensiv braun gefärbte Zellanschnitte als positiv
gewertet; wenn keinerlei Hintergrundfärbung vorlag, wurde auch eine etwas weniger
intensive Braunfärbungen positiv gewertet. Nicht als positiv beurteilt wurden dagegen Zellen
mit einer grauen oder einer diffus beigen Anförbung.
Bei der immunhistochemischen Darstellung der aktiven Caspase 3 und von Fraktin wurden
die Zellen als positiv gewertet, die sich intensiv braun darstellten und auch bei einer
anfälligen Hintergrundfärbung deutlich hervorgehoben waren.
3.3.7 Semiquantitative Erfassung aller TUNEL - positiven Zellanschnitte in der
CAl Region des linken Hippokampus
Um die Resultate besser vergleichen bzw. statistisch auswerten zu können, wurde
mit Hilfe des CAST Systems (Art. Nr.: E38233609; Visiopharm, Hoersholm, Dänemark)
und der DP-70 Software von Olympus Austria (Nil56082, N157900; Visiopharm,
Hoersholm, Dänemark) bei allen Schnitten die Hippokampusregion zunächst markiert und
ihre Fläche bestimmt. Daraufhin wurden bei 20facher Objektiwergrößening alle positiv
markierten Zellprofile gezählt Die Ergebnisse wurden anschließend als Anzahl positiv
markierter Zellanschnitte/mm^ erfasst. Die Auswertung beschränkte sich ausschließlich auf
die CAl Region.
35
3.3.8 Statistische Auswertung
Die quantitativen Daten wurden Welchs T-Test (R DEVELOPMENT CORE TEAM, 2008)
unterzogen, nachdem die Hypothese der Varianzhomogenität mittels F-Test verworfen wurde
und mit Hilfe des Jarque-Bera Tests und des Liüiefors-Test, eine Weiterentwicklung des
Kolmogorov-Smirnov-Tests, die Normalverteilungsannahme überprüft wurde (Zusatzpakete
nortest und outlier). Nach GROSS (2008) weisen beide Tests jedoch eine niedrige Macht bei
kleinen Stichproben auf
Aufgrund des durchgeftihrten Dixons Q-Test (KOMSTA, 2007) wurde die Probe SA 234 als
Ausreißer deklariert und deshalb in die weitere Analyse nicht miteinbezogen.
36
4 Ergebnisse
4.1 Ergebnisse der Durchflusszytometrie
Für die Etablierung der histologischen Nachweismethode zur Darstellung apoptotischer
Zellen wurden Zellkulturpräparate hergestellt, die unter standardisierten Bedingungen
kultiviert worden waren. Dabei wurde die Apoptose, wie unter Methode (3.3.1) beschrieben,
mit Camptothecin induziert. Der Nachweis der so erhahenen apoptotischen Zellen erfolgte
mitteis Durchflusszytometrie. Aus Abbildung 2 wird ersichtlich, dass es nach Induktion mit
Camptothecin (rechte Seite) neben nekrotischen Zellen (Q2-1; 6,2 % —^ 11,1 %) auch zu einer
deutlichen Zunahme an apoptotischen Zellen (Q4-1; 3,7 % —*• 16,7 %) kam.
Nach löstündiger Inkubation mit 8 |ig Camptothecin konnten rund 17 - 35 % apoptotische
und 10 - 18 % nekrotische Zellen in den Kulturen nachgewiesen werden; 30 - 70 % der
Zellen blieben intakt, während bis zu 15 % Zelldetritus festzustellen war
Die Abbildung auf der linken Seite zeigt die graphische Darstellung der unterschiedlich
markierten Zellen der unbehandelten Kultur. Die rechte Abbildung zeigt die Veränderung in
der Zellpopulation nach der Behandlung mit Camptothecin
Q2-1
Q1-1
Q2-1
Q1-1
Q3-1
•- •
iT'ny'''^'rfirnT|—rrr
10
10
TTTTTIl—I I llllll|—TTT
10'
10
10^
10^
10'
Abb. 2: Graphische Darstellung der FCM - Analyseergebnisse: Quadrant Q3-I zeigt die lebenden
Zellen (Annexin V , PI), Q4-1 zeigt dieapoptotischen Zellen (Annexin V*, PI) und Q2-I
die nekrotischen Zellen (Annexin V*, Pr)
37
4.2 Ergebnisse der Hämatoxylin-Eosin Färbung
4.2.1 Zellkultur
In den Paraffinschnitten der Kontrollkultur der MAX B Zellen waren die Zellen mehrheitlich
rund, mit exzentrischem Zellkern und 2-3 Kemkörperchen. Weiters konnte man einige
Mitosestadien sehen. Einige Zellen wiesen einen pyknotischen Zellkern auf und ihr
Zytoplasma war schollig, bei anderen Zellen wirkte der Zellkern zerfallen Im Gesamten
wirkte das Bild aber relativ homogen (Abb. 4, S. 50).
Bei den Schnitten der mit Camptothecin induzierten Zellkultur war das Bild in der
Überblicksvergrößemng sehr unruhig. Es war eine deutliche Zunahme an pyknotischen
Kernen zu sehen, ebenso wie an apoptotischen Körpern (Abb. 5, S. 50). Weiters hatten viele
Zellen ihre Zellmembran verloren. Einige Zellen zeigten ein Zellödem, wobei das Zytoplasma
wabig wirkte, während andere geschrumpft wirkten, und sich deutlicher eosinophil anfärbten
4.2.2 Thymus, Lymphknoten und Lunge
Alle 3 Organe stellten sich in der HE-Färbung unaufTällig dar. Die bei den Thymusschnitten
zusätzlich durchgeführte Berliner Blau Färbung ergab eine geringe, aber deutliche Anfarbung
in den Randbereichen.
4.2.3 Hippokampus
4.2.3.1
Vorgefundene Veränderungen
Grundsätzlich konnten im Hippokampus folgende Befunde quahfiziert und quantifiziert
werden: unveränderte Nervenzellen, eosinophile Nervenzellnekrosen, sog „dark neurons",
aktivierte Kapillarendothelien und eine gering - hochgradige Gliose, zu welcher auch die
neuronale Satellitose und aktivierte Mikroglia gezählt wurde. Diese Beftinde waren in allen
Präparaten der Hypothermie- und der Kontrollgruppe zu finden, wenngleich in einem
unterschiedlichen Ausmaß.
38
Unveränderte Nervenzellen:
Intakte Nervenzellen stellten sich basophil mit einem exzentischen Kern und einem gut
sichtbaren Nukleolus dar Das Zytoplasma hatte eine kömige Struktur, welche auf die im
endoplasmatischen Retikulum liegenden Nissl-Schollen schließen ließ.
Die Präparate wurden auf das Vorhandensein von unbeschädigten Nervenzellen untersucht.
Wobei aus der Hypothermiegruppe die Schnitte der Tiere SA 232, SA 234 und aus der
Kontrollgruppe die Schnitte der Tiere SA 214 und SA 221 nur mehr sehr vereinzelt intakte
Nervenzellen aufwiesen. Bei der Nummer SA 215 der Hypothermiegruppe und der gesamten
restlichen Kontrollgruppe konnten nur geringgradig intakte Nervenzellen vorgefunden
werden. Hingegen hatten die Präparate aus der Hypothermiegruppe mit den Nummern SA
212, SA 213, SA 222, SA 228 (Abb. 22, S, 53) und SA 238 eine relativ große Anzahl an
unbeschädigten Nervenzellen im Hippokampusband.
Dark Neurons:
Die als „dark neurons" bezeichneten Zellen, die im Allgemeinen als Artefakte bzw.
beginnende neuronale Degenerationsstadien gewertet werden, hoben sich deutlich vom
Neurophil ab, sie hatten ein intensiv basophil gefärbtes Zytoplasma und erschienen insgesamt
etwas geschrumpft
Oft war ihr korkenzieherartig veränderter apikaler Dentrit zu sehen. Diese Art der
Zellveränderung war besonders deutlich in den Präparaten SA 212, SA 224 und SA 229 zu
finden (Abb. 25, S. 53), Andere Präparate zeigten diese Veränderung nur vereinzelt in der
CA4 Region bzw. im Gyrus dentatus (SA 223, SA 225, SA 231, SA 232).
Eosinophile Nervenzellnekrose:
In der HE-Färbung stellten sich intakte Nervenzellen basophil dar (Abb. 22, S 53) Sie
besaßen einen leicht exzentrischen Kern und einen gut erkennbaren Nukleolus, sowie eine
leicht kömige Struktur, welche durch die Nissl Schollen im endoplasmatischen Retikulum
entstand. Zugrundegehende Neurone zeigten hingegen ein deutlich eosinophil gefärbtes
Zytoplasma und die Zellkörper wie auch die Zellkerne erschienen geschrumpft (Abb. 23, S.
53). Ebenso ging die kömige Struktur des Zytoplasmas verloren. Die Zellkernform wurde mit
39
zunehmendem Maß der Schädigung dreieckig. Weiters wurde der Kern hyperchromatisch und
es war kein Nukleolus mehr zu erkennen. Derartige Veränderungen konnten in allen
Hippocampi gefunden werden. Das Ausmaß reichte von vereinzelten eosinophilen
Nervenzellen bis zu einer massiven Ausprägung dieser Veränderung.
Inkomplettes Nervenzellband bzw. fehlende Nervenzellen:
Das Nervenzellband des Hippokampus wurde auf einen lückenlosen Verlauf kontrolliert. Bei
keinem einzigen Präparat konnte ein durchgehendes Band ohne Lücken vorgefunden werden.
Die Veränderungen reichten von sehr kleinen Unterbrechungen (Abb 20, S. 53) bis zu einem
fast vollständigen Verlust des gesamten Zellbandes (Abb. 24, S. 53).
Gliose:
In allen untersuchten Schweinehippocampi kam es zu einer deutlichen Hyperthrophie bzw.
Proliferation von Gliazellen. Bei einem Teil dieser Zellen handelte es sich um aktivierte
Mikrogliazellen welche sich als stäbchenfbrmige Zellen (rod-shaped) mit schlanken,
länglichen und heterochromatischen Kernen darstellten (Abb. 24, S 53) Weiters konnten in
den Präparaten SA 213, SA 214, SA 229 und SA 231 Gliaknötchen gefunden werden. Auch
kam es zur Ausbildung neuronaler Sateltitosen, wobei proliferierte Oligodendrozyten
kettenförmig degenerierte Nervenzellen umgaben (Abb 12, S. 51).
Aktivierte Kapillarendothelien:
In den untersuchten Lokali sat ionen war mitunter eine besonders deutliche Darstellung der
kapillaren Blutgefäße erkennbar, welche durch eine Verdickung der endothelialen
Auskleidung gekennzeichnet war. Femer erschien die Gesamtzahl der Gefäßprofile erhöht,
wobei neben gestreckten auch verzweigte Gefäßanschnitte zu Tage traten. Diese
Veränderungen waren auch an Lokalisationen erkennbar, die nur eine geringe Ausprägung an
Nervenzelluntergängen aufwiesen.
40
4.2.3.2 Verteilung dieser Veränderungen im Hippokampus
Die als selektiv vutnerabel geltende CAl Region war in allen Präparaten beider Gruppen
mehr oder weniger stark geschädigt, wobei sie im Präparat der Nummer SA 228 am wenigsten
geschädigt war.
Je größer die Schädigung in der CAl Region war, desto mehr auffällige Befunde konnten
auch in der CA2/3 und CA4 Region erhoben werden.
Im Gyrus dentatus konnten bei einigen Präparaten auch „dark neurons" vorgefunden werden
(SA 223, SA 225, SA 231, SA 232), ebenso wie eosinophile Nervenzellnekrosen (SA 214, SA
221, SA 229, SA 231, SA 232), welche am stärksten bei dem Präparat der Nummer SA 214
ausgeprägt waren
Prinzipiell zeigten sich im Gyrus dentatus relativ wenige Veränderungen, welche positiv
korrelierten mit dem Schweregrad der Veränderungen im restlichen Hippokampus.
41
4.2.3.3 Unterschiedliche Grade der vorliegenden Befunde und ihre tabellarische
Darstellung
Die eben beschriebenen Beflinde wurden nach ihrer Ausprägung bzw. Anhäufung im
Hippokampus in unterschiedliche Grade eingeteilt. So wurde unterschieden zwischen
geringst- über gering und mittelgradig bis hochgradig Vorhanden.
Bei der Bewertung des Vorhandenseins der „dark neurons" wurden diese Grade ergänzt durch
die Beurteilung „nicht vorhanden".
SA
Hypothermieg nippe 212
unveränderte NZ
XX
Dark Neurons
X
eosinophile NZN
X
Fehlen von NZ
XX
Gliose
XX
Gefaßakti vieru ng
XX
SA
213
SA
215
SA
222
SA
228
SA
232
SA
234
SA
238
XXX
X
XXX
XXX
(X)
(X)
XX
—
—
(X)
Kontrollgnippe
unveränderte NZ
Dark Neurons
Fehlen von NZ
eosinophile NZN
Gliose
Gefaßakt i vi eru ng
—
w
(X)
XXX
X
(X)
X
(X)
XXX
XX
(X)
(X)
XXX
X
X
XX
X
XXX
XX
X
XX
XX
XXX
XX
XX
SA
221
SA
223
SA
224
SA
225
SA
229
SA
231
W
X
X
X
X
X
(X)
X
(X)
XX
(X)
XXX
XX
XXX
XXX
(X)
XX
X
X
XXX
X
X
(X)
XX
X
XX
XX
SA
214
SA
218
CO
X
—
XX
X
XXX
XXX
(X)
XX
XXX
XX
XXX
XXX
XXX
XX
XXX
XX
XX
XXX
XXX
XX
XX
XXX
XXX
XXX
Tabelle I: Tabellarische Darstellung der Häufungsgrade der verschiedenen Befunde
NZ: Nervenzelle; NZN: Nervcnzellnekrose. - : in diesem Präparat nicht darstellbar;
(x): geringstgradig; x: geringgradig; xx: mittelgradig: xxx: hochgradig
42
4.2.3.4 Vergleichende
Auswertung
unter
Berücksichtigung
der
beiden
Untersuchungsgruppen
Wie schon unter 4.2.3.2 erwähnt, kam es bei allen Präparaten, unabhängig ihrer
Gruppenzugehörigkeit zu einer mehr oder weniger massiven Schädigung in der CAl Region
des Nervenzellbandes. Weiterführend konnte auch eine mehr oder weniger starke Schädigung
in der CA2, CA3 und CA4 Region, bzw im Gyrus dentatus nachgewiesen werden
In 4/8 Präparaten der Hypothermiegruppe konnten normale Nervenzellen in relativ großer
Zahl vorgefunden werden, wohingegen bei den Nummern SA 215, SA 232 und SA 234 diese
nur im geringen Ausmaß bis vereinzelt vorhanden waren. In 4/8 Tieren konnten gar keine,
und in weiteren 3 Präparaten nur ganz vereinzelt „dark neurons" vorgefunden werden. Einzig
bei dem Tier mit der Nummer SA 212 waren geringgradig „dark neurons" zu finden.
Im Durchschnitt kam es bei der Hypothermiegruppe zu einer geringeren Ausprägung der
eosinophilen Nervenzellnekrose als bei der Kontrollgruppe. Vor allem der Gyrus dentatus
zeigte bei 6 von 8 Tieren keinen besonderen Befund Auch die CA4 Regionen waren bei 4/8
Tieren unauffällig. Bei der Hypothermiegruppe zeigte sich auch durchwegs ein relativ
komplettes Nervenzellband (Abb. 20, S 53) Außer bei dem Präparat mit der Nummer SA 232
wo über weite Strecken Nervenzellen fehlten, wobei vor allem die CAl Region, aber auch die
CA3 Region betroffen waren.
Die Gliose wurde bei der Hypothermiegnippe zwischen geringst - mittelgradig eingestuft,
wobei jedoch das Präparat mit der Nummer SA 232 eine hochgradige Vermehrung von
Gliazellen aufwiesen. Die Gefäßproliferation wurde als mittelgradig eingestuft, wobei das
Präparat mit der Nummer SA 232 wiederum eine hochgradige Veränderung zeigte.
Im Gegensatz dazu, konnten in allen Kontrollgruppenpräparaten nur mehr eine geringe bis
vereinzelte Zahl an intakten Nervenzellen dargestellt werden (Abb. 21, S. 53). Es kam bei 5/8
Präparaten zur Ausbildung von „dark neurons", wobei es zu einer besonders auffälligen
Anhäufung im Präparat der Nummer SA 229 kam (Abb. 25, S. 53).
In allen Präparaten konnten eosinophile Nervenzellnekrosen dargestelh werden, wobei es bei
den Präparaten der Nummern SA 214, SA 218 und SA 229 (Abb. 23, S 53) zu einer massiven
Ansammlung derselben kam. Auch zeigten sich diese Veränderungen - zum Teil ebenso
43
massiv - in den CA2/3 und CA4 Regionen. Auch im Gyrus dentatus konnten eosinophile
Nervenzellnekrosen nachgewiesen werden, außer beim Präparat des Tieres SA 224, wo es in
dieser Region nur zu einer Zunahme von „dark neurons" kam.
Bei allen Präparaten konnte ein mittelgradiges bis hochgradiges Fehlen von Nervenzellen
beobachtet werden. Einzig die Präparate mit den Nummern SA 218 und SA 229 zeigte nur
vereinzelt Unterbrechungen im Nervenzellband.
Bei allen Präparaten konnte eine mittel - hochgradige Vermehrung von Gliazellen
vorgefunden werden Auch kam es bei allen Tieren dieser Gruppe zu einer mittel hochgradigen Gefäßproliferation.
4.2.3.5 Nachweis von Apoptoseflguren bei degenerierten Nervenzellen in der HE
Färbung
Bei einigen Nervenzellen konnte schon in der HE Färbung der Eindruck eines apototischen
Zellunterganges gefunden werden Es konnte die Bildung von „apoptotic bodies" beobachtet
werden, bzw erweckten viele Zellen den Eindruck als wären sie geschrumpft. Auch konnte
bei einigen Zellen eine Kondensation des Chromatins beobachtet werden.
44
4.3 Ergebnisse der Immunhistochemie
Für die Befundung der Caspase und Fraktin Markierung wurden die Kriterien für die
Beurteilung von immunhistochemichen Anfärbungen, wie unter 3.3.6 aufgelistet und
beschrieben, herangezogen.
4.3.1 Zellkultur
In der apoptoseinduzierten Kultur konnten bei der Caspase Reaktion (Abb 7, S. 50) etwa
doppelt so viele markierte Zellen wie in der Kontrollkultur (Abb. 6, S. 50) gesehen werden,
wohingegen mittels der Fraktinfärbung (Abb. 8, Abb 9, S 50) doch eine deutliche Zunahme
an markierten Zellen dargestellt werden konnte Bei der Caspasemarkierung konnte weiters
eine deutliche Hintergrundfärbung des gesamten Präparates beobachtet werden, welche sich
bei der Fraktinfärbung noch verstärkte. Einige Zellen stellten sich dunkelbraun angefärbt dar,
einige waren etwas heller gefärbt.
Weiters zeigte sich bei der Caspasefärbung eine doch deutlich braune Färbung des
Präparatrandes und die Markierungen im Präparatinneren wiesen keinen deutlichen
Unterschied zur Hint ergrund färbung auf
4.3.2 Thymus, Lymphknoten und Lunge
Bei der Caspasefärbung im Thymus war eine positive Anfärbung einzelner Zellen eher
spärlich zu beobachten, aber vor allem im Präparat F 1285/04 konnten auch einige deutliche
Anfärbungen beobachtet werden (Abb. 16, S. 52). Weiters kam es zu keiner nennenswerten
Hintergrund färbung.
Auch bei der Fraktinfärbung waren nur sehr vereinzelt deutlich markierte Zellen zu sehen. Bei
der Häufung der markierten Zellen gab es keinen so deutlichen Unterschied zwischen den
Präparaten wie bei der Caspasefärbung, obwohl es auch im Gegensatz zu den anderen zwei
Präparaten im Präparat F 1285/04 ebenfalls ein gehäuftes Auftreten von markierten Zellen
gab (Abb. 18, S. 52). Der Hintergrund zeigte eine zum Teil deutliche unspezifische
Braunfärbung.
45
Beide Färbungen zeigten im Lymphknotenpräparat eine deuthche Markierungen von Zellen
(Abb 17, Abb. 19, S, 52), wobei einige Anfärbungen nach unspezifischem DAB Niederschlag
(„Körner") aussahen. Es waren deutlich weniger Zellen angefärbt als bei der TUNELFärbung. Auch konnte im Caspasepräparat keine Hintergrundfärbung vorgefunden werden,
wohingegen es im Fraktinpräparat wiederum doch zu einer gewissen unspezifischen
Hintergrundfärbung kam.
Beim Lungenpräparat wurde nur ein Caspasenachweis durchgeführt. Dieser erbrachte ein sehr
ähnliches Bild wie im Lymphknotenpräparat, Es gab einige markierte Zellen, wobei auch hier
manche Markierungen als unspezifisch bewertet werden mussten, da sie um die Zellen lagen,
bzw. sehr kugelig/plastisch wirkten oder eine bronzene Färb Schattierung aufwiesen.
Es kam zu keiner nennenswerten unspezifischen Hintergrundfärbung.
4.3.3 Hippokampusregion
Bei der Caspasefärbung kam es im Großen und Ganzen zu keiner spezifischen Anfärbung von
Nervenzellen oder Gliazellen. Bei den Präparaten mit der Nummer SA 225 und SA 229 beide aus der Kontrollgruppe - gab es einige wenige fragliche Markierungen, welche sich aber
im Vergleich zur Positivkontrolle als deutlich hellere Anfärbung darstellten. Bei den
Präparaten der Nummern SA 224, SA 225, SA 232, SA 234 und SA 238 kam es zu einer mehr
oder weniger starken Hintergrundfärbung und zu einer unspezifischen Bindung des DAB
Auch
bei
der Faktinmarkierung kam
es zu
einer mehr oder weniger
starken
Hintergrundfärbung, welche bei manchen Präparaten nur stellenweise auftrat Bei den Tieren
der Kontrollgruppe mit den Nummern SA 214, SA 218, SA 223, SA 225, SA 229 und SA 231
und dem Tier SA 212 der Hypothermiegruppe stellten sich einige wenige Zellen deutlich
braun markiert dar, obwohl die Farbintensität der Positivkontrolle nicht erreicht wurde. In den
Präparaten mit der Nummer SA 228 und SA 238 stellten sich sehr vereinzelt markierte Zellen
nach
dem
Umschlag
von
Hippokampus
in
den
Gyrus
callosus
markiert
dar
(Hypothermiegruppe). Bei den Nummern SA 221, SA 228 und SA 229 stellten sich die
Gliazellen im schräg geschnittenen Teil des Ammonshoms dunkelbraun dar.
46
Einige Präparate wiesen Nervenzellen mit einem intensiv blauen Zellkern und bräunlich
gefärbten Zytoplasma auf, wobei dieses Phänomen am auffälligsten im Präparat der Nummer
SA 232 war.
4.4 Ergebnisse der TUNEL Färbung
Für die Befundung der TUNEL Methode wurden ebenfalls die Kriterien für die Beurteilung
von Immunhistochemichen Anfärbungen, wie unter 3.3.6 aufgelistet und beschrieben,
herangezogen.
4.4.1 Zellkultur
In den Kontrollkulturschnitten kam es nur vereinzelt zu einer Markierung von Zellen (Abb
10, S. 51), während in den Schnitten der apoptoseinduzierten Kultur eine massive Anfärbung
zu beobachten war (Abb. 11, S. 51).
Einige der markierten Zellen zeigten gleichzeitig deutliche lichtmikroskopische Merkmale der
Apoptose, andere wiederum waren markiert, zeigten aber doch Merkmale des nekrotischen
Zelltodes, wie ein Zellödem oder ein Zerfallen der Zelle durch Auflösung der Zellmembran.
4.4.2 Thymus, Lymphknoten und Lunge
In den Thymusschnitten konnten einige deutlich markierte Zellen dargestellt werden (Abb.
14, S. 52). In einigen Präparatbereichen kam es aber auch zu einer mehr oder weniger starken
unspezifischen Färbung. In den Randbezirken gab es eine untypische braune kömige
Anfärbung, welche sich nach dem Vergleich mit der Berliner Blau Färbung als Hämosiderin
bestätigte.
Im Lymphknotenpräparat kam es zu einer deutlichen, intensiv-braunen, Markierung von
Zellen (Abb. 15, S. 52). Eine unspezifische Hintergrundfärbung konnte nur sehr vereinzelt
und punktuell vorgefunden werden. Auch kam es zu einigen unspezifischen Anfärbungen
zwischen den Zellen.
Dieses Präparat wurde neben den Zellkulturpräparaten als
Positivkontrolle verwendet
47
Auch die Lungenschnitte zeigten eine deutliche Markierung einiger Zellen Im Präparat waren
sehr viele Erythrozyten vorhanden, welche in der Übersichtsvergrößerung eine doch
bräunliche Hintergrundfärbung ausmachten. Noch deutlicher als im Lymphknotenpräparat
kam es zu einer punktuellen, zwischen den Zellen liegenden unspezifischen Anfärbung, bzw.
zu einer bräunlichen Färbung ganzer Areale.
4.4.3 Hippokampus
Alle Schnitte wurden unabhängig ihrer Gruppeneinteilung lichtmikroskopisch untersucht.
Beurteilt wurde das Ausmaß an TUNEL positiven Zellanschnitten. Da eine eindeutige
Differenzierung zwischen Glia- und Nervenzellen nicht immer zweifelsfrei möglich war,
wurden alle markierten Zellen im Hippokampus bewertet.
4.4.3.1 Vergleichende Auswertung aller Präparate unter Berücksichtigung
ihrer
Gruppenzugehörigkeit
Im Durchschnitt zeigten sich bei der Hypothermiegruppe deutlich weniger positive
Zellanschnitte als in den Präparaten der Kontrollgruppe.
Die Präparate der Nummern SA 213, SA 215, SA 222, SA 228 (Abb. 12, S. 51) und SA 238
zeigten nur sehr vereinzelt, die Präparate der Nummern SA 212 und SÄ 232 nur wenige
positive Markierungen Einzig der Schnitt der Nummer SA 234 enthielt eine große Anzahl an
TUNEL positiven Zellen.
In der Kontrollgruppe zeigten alle Schnitte eine mittelgradig bis hochgradige Anhäufung von
TUNEL positiven Zellen (Abb. 13, S 51). Lediglich das Präparat der Nummer SA 224
enthielt nur vereinzelt markierte Zellen.
48
4.5 Ergebnisse der semiquantitativen TUNEL positiven
Zellanschnittzählung in der CAl Region
Nachdem mit Hilfe des CAST - Systems die CAl Region eines jeden Präparates markiert
worden war, wurde die Region rasterfbrmig abgefahren und jeder positive Zellanschnitt im
Hippokampusband gezählt Wiederum war eine eindeutige Differenzierung zwischen Gliaund Nervenzellen nicht immer möglich und so wurden alle markierten Zellanschnitte im
Nervenzellband der CAl Region des Hippokampus gezählt.
Zunächst wurde die Absolutzahl an positiven Markierungen im Schnitt ermittelt Damit die
unterschiedlichen Präparate miteinander verglichen werden konnten, wurde die Anzahl
positiver Anschnitte unabhängig ihrer Verteilung in der CAl Region pro Flächenanteil (mm^)
definiert.
Hypothermiegruppe
Kontrollgruppe
Tier
Tier
Fläche in mm2 pos./mm2
Fläche in mm2 pos./mm2
SA 212
3,90
2,05
SA 214
3,418
311,58
SA 213
3,692
2,17
SA 218
3,139
129,02
SA 215
3,93
1,53
SA 221
3,687
84,35
SA 222
4,729
2,11
SA 223
2,167
399,63
SA 228
3,626
0,28
SA 224
2,616
11,45
SA 232
1,679
13,69
SA 225
2,234
117,73
SA 234
1,388
425,9
SA 229
3,244
277,16
SA 238
3,272
0,92
SA 231
2,234
186,99
Tabelle 2: Fläche des ausgewerteten Nervenzellbandes (mm^) des Hippokampus und
Anzahl TUNEL-positivcr Zellprofilc/mni" pro Tier
49
4.6 Statistische
Auswertung
der
Zelianschnittzählung
unter
Berücksichtigung der Gruppeneinteilung
In der Hypothermiegruppe konnte ein Mittelwert von 3,25 TUNEL-positiver Zellprofile je
mm^ CAl Region des Nervenzellbandes ermittelt werden. Wobei bei der Berechnung des
Mittelwertes dieser Gruppe das Tier SA 234 nicht berücksichtigt wurde, da es aufgrund der
starken Abweichung als Ausreißer und somit als nicht repräsentativ gewertet wurde.
In der Kontrollgruppe wurde hingegen ein Mittelwert von 189,7 TUNEL-positiver Zellen pro
mm ermittelt.
Der Vergleich der Mittelwerte beider Gruppen (ohne den Ausreißer SA 234) zeigt einen
hochsignifikanten Unterschied im Welchs T-Test von p = 0,005, oder 0,5 %.
Die Hypothermiegruppe hat weiters eine Standardabweichung von 4,
wobei die
Kontrollgruppe allerdings eine Standartabweichung von 130 aufweist. Auch bedingt durch
das Tier mit der Nummer SA 224, welches eine so starke Nervenzellbandschädigung
aufweist, dass einfach keine Zellen mehr für eine Anfärbung zu Verfügung standen (Abb. 24,
S. 53).
o
o -
o
o -
o
o
es -
8-
o 1
Abb 4: Darstellung beider Gruppen als Box und Whiskerplot.
X-Achse: 1 Hypothermiegruppe, 2 Kontrollgruppe. Y-Achse: Anzahl positiver Zellanschnitte/mm^.
Der Punkt in der Graphik ist der als Ausreißer definierter Wert des Tieres SA 234.
Schwarze Balken stellen die Mittelwerte beider Gruppen dar.
50
^:
^^^^v-^^^
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Abb. 4: Zellkultur Kontrolle; intakte Zelle (-^);
Mitosestadium (-»•); Zelle in Nekrosc (-*);
HE-Färbung; Balkcnlänge 50 ^im
Abb. 5: Zellkultur nach Apoptoscinduktion;
Zelle in Apoptose (-*•); intakte Zelle (-*-);
Zelle in Nekrose (-*);
HE-Färbung; Balkcnlänge 50 ^m
Abb. 6; Zcllkultur Kontrolle;
Immunhistochemischer Nachweis der
aktivierten Caspase 3 (braun);
Balkenlänge 50 |im
Abb. 7: Zcllkultur nach Apoptoscinduktion;
Immunhistochemischer Nachweis der
aktivierten Caspase 3 (braun);
Balkcnlänge 50 ^m
^
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Abb. 8: Zcllkultur Kontrolle;
Immunhistochemischer Nachweis von
Fraktin (braun);
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Abb. 9; Zellkultur nach Apoptoseinduktion.
Immunhistochemischer Nachweis von
Fraktin (braun);
Balkenlänge 50 (im
51
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Abb. 10: Zcllkultur Kontrolle;
TUNEL-Markicrung (braun);
Balkcnlängc 50 |im
t z
Abb. 11: Zellkultur nach Apoploscinduktion;
TUNEL-Markierung (braun);
Balkcnlängc 50 (im
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Abb. 12: Hippokampus SA 228; CAI Region;
intakte Nervenzellen (-*-); Satellitose (-•);
TUNEL-Markicrung (negativ);
Balkenlänge 100 ^im
Abb. 13: Hippokampus SA 229; CAI Region;
hgr. TUNEL-Markicrung (braun);
Balkenlängc 100 ^m
•'-^i'
52
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•
Abb. l4:ThymusF 12S5/04;
TUNEL-Markicrung (braun);
Balkenlängc 50 um
•
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Abb. 15: Lymphknoten W 1713/02
(PRRSV Infeklion);
TUNEL-Markicrung (braun);
Balkenlänge 50 ^mi
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Abb. 16:ThymusF 1285/04;
Immunhistochcmischcr Nachweis der
aktivierten Caspase 3 (braun);
Balkenlängc 50 ^im
Abb. 17: Lymphknoten W 1713/02
(PRRSV Infektion); Immunhistochcmischcr Nachweis der aktivierten
Caspase 3 (braun); Balkenlänge 50 ^m
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^ '^ *.»
Abb. 18;ThymusF 12K5/04;
Immunhistochcmischcr Nachweis von
Fraktin (braun);
Balkenlänge 50 pm
Abb. 19: Lymphknoten W 1713/02
(PRRSV Infektion); Immunhistochemischer Nachweis von Fraktin (braun);
Balkenlänge 50 ^m
53
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Abb. 20: Hippokampus SA 228; CAl Region {o);
vereinzeile eosinophile Nervenzcllnckroscn (-*); Gyrus dentatus (*);
HE-Färbung; Balkenlänge 250 ^m
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Abb. 21: Hippokampus SA 229; CA1 Region (^);
hgr. eosinophile Nervenzellnekroscn {-*);
Gyrus dentatus (*);
HE-Färbung; Balkcnlänge 250 ^m
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Abb. 23: Hippokampus SA 229; CAl Region;
hgr. eosinophile Nervenzellnekroscn (-^);
keine intakte Nervenzellen;
HE-Färbung; Balkcnlänge 50 um
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Abb. 22: Hippokampus SA 228; CAl Region;
vereinzelte eosinophile Nervenzellnekroscn (-*); intakte Nervenzellen (-«-);
HE-Färbung; Balkcnlänge 50 (im
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Abb. 24: Hippokampus SA 224; CAl Region (•<]);
eosinophile Nervenzellnekrosen (-^);
aktivierte Mikroglia (-••):
HE-Färbung; Balkcnlänge 50 ^m
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Abb. 25: Hippokampus SA 229;
„dark neurons" (-<-);
HE-Färbung; Balkenlänge 25 ^im
i I
54
5 Diskussion
Hypoxisch-ischämische InsuUe nach Herzstillständen bzw, eine Minderdurchblutung des
Gehirns aufgrund kardiovaskulärer Erkrankungen stellen ein großes Problem unserer
Gesellschaft dar Nur wenige Patienten überleben einen Herz-Kreislauf-Stillstand ohne
neurologische Defizite, trotz schnell einsetzender lebensrettender Sofortmassnahmen
(HOLZER u. BEHRINGER, 2005; JANATA et al., 2008).
Verschiedenste Forschungsgruppen versuchen Wege aufzuzeigen, um diese Schäden zu
verhindern bzw, in einem möglichst geringen Ausmaß zu halten. Eine Methode stellt die
milde Hypothermie dar, wobei es mehrere mögliche Wege der Abkühlung gibt. In dieser
Arbeit wurde die Auswirkung der Kühlung mittels LRS ThermoSuit* im Vergleich zu einer
normothermen Kontrollgruppe untersucht. Als Indikatorregion wurde der Hippokampus
gewählt
Weiters wurde versucht, eine Differenzierung zwischen nekrotischem und
apoptotischem Zelltod vorzunehmen, da in die aktive Form des Zeil Unterganges mit
zusätzlichen therapeutischen Maßnahmen eingegriffen werden könnte.
Alle Versuchstiere wurden nach demselben Protokoll narkotisiert und diverse Sonden ftir die
Probenentnahme und die Überwachung wurden bei allen Tieren auf dieselbe Art und Weise
platziert. Nach Stabilisierung der Kreislauffunktion wurde ein Herzstillstand ausgelöst und die
Tiere wurden fur 10 Minuten nicht therapiert. Danach wurden die Tiere wiederbelebt und
nach Erreichen von ROSC per Ziehung einer der beiden Gruppen zugeteilt. Für die weiteren
Untersuchungen blieben von den insgesamt 22 Schweinen 16 Tiere übrig. Vier Tiere
erreichten ROSC nicht, ein weiteres Tier schied wegen technischer Probleme mit dem
Thermosuit* aus dem Versuch aus und ein Schwein verstarb einen Tag nach Erreichen von
ROSC aufgrund einer, bei der anschließenden Sektion festgestellten, massiven chronischen
Entzündung der Pleura mit Pleuraerguss (JANATA et al., 2008).
55
In der vorliegenden Arbeit konzentrierten sich die Beobachtungen ausschließlich auf die
Hippokampusregion, da diese bezüglich hypoxischer Einflüsse als selektiv vulnerabel gilt
(WHITE et al., 1996; ANANIADOU et al, 2005; EBNER, 2005) und deshalb als
Indikatorregion gewählt wurde. YUE et al. (1997) stellten fest, dass bei der geringsten
Hypoxie schon apoptotische Zellen mittels Licht- und Elektronenmikroskopie im
Hippokampus nachweisbar sind, auch wenn sonst im Gehirn keine zu finden sind.
5.1 Diskussion der Ergebnisse
In beiden Gruppen kam es zu einer mehr oder weniger massiven Schädigung der CAl Region
des Hippokampus,
wobei
die
normotherme Kontrollgruppe deutlich ausgeprägtere
eosinophile Nervenzellnekrosen aufwies. Auch fehlten in der Kontrollgnappe über weite
Strecken intakte Nervenzellen im Nervenzellband des Ammonshoms. Alle Präparate wiesen
eine Gliose auf, wobei es auch hier zu einer stärkeren Ausprägung in der Kontrollgruppe kam.
Zwar konnten viele Zellen mit länglichen und dünnen Zellkernen gesichtet werden, also mit
dem charakteristischen Aussehen aktivierter Mikroglia (SUMMERS et al, 1995), jedoch
wurde in dieser Arbeit keine Differenzierung der unterschiedlichen Gliazellen vorgenommen.
Im Gyrus dentatus konnten nur bei einigen Tieren eosinophile Nervenzellnekrosen gesichtet
werden. Hier handelte es sich sowohl um Tiere der Hypothermiegruppe (SA 215, SA 232) als
auch der Kontrollgruppe (SA 214, SA 218, SA 221, SA 229, SA 231). Auch die CA2, CA3
und CA4 Regionen wiesen bei allen Tieren eine mehr oder weniger starke Schädigung auf In
der CA4 Region konnten bei einigen Tieren deutliche eosinophile Nervenzellnekrosen und
auch Gliose dargestellt werden. Unabhängig von der Gruppenzugehörigkeit ware prinzipiell
die CAl Region am stärksten und die CA4 Region und der Gyrus dentatus am geringsten
betroffen.
Diese Befunde gehen konform mit der Literatur, in welcher die CAl Region als die
empfindlichste gilt (AUER u. BENVENISTE, 1997; IWATA et al., 2005, PADOSCH et al.,
2001) Eine besondere Empfindlichkeit der CA4 Region, wie von WHITE et al. (1996)
beschrieben, konnte dagegen nicht festgestellt werden. Auch wollen MAITI et al. (2007) die
CA3 Region als empfindlichste nachgewiesen haben, was hier ebenso wenig dargestellt
56
werden konnte. Allerdings lag in der angesprochenen Arbeit eine hypobarische Hypoxie vor,
sodass ein Unterschied zum ischämisch-reperftisions-bedingten Schaden zu sehen ist.
Die meisten Arbeiten auf diesem Gebiet konzentrieren sich auf die CAl Region. Die CA2
Region ist relativ klein und die Abgrenzung von CAl und CA3 ist trotz der deutlich
geringeren Größe der Neuronen schwierig (IWAI et al., 2000). TOWFIGHl et al. (1997)
beurteilten deshalb die CA2 Region gemeinsam mit der lateralen CA3 Region, da nur der
Übergang zur CAl Region leicht definiert werden kann. Die CA3 Region wiederum ist sehr
klein, vor allem bei Mäusen- und Rattenhirnen in der üblichen Schnittebene. IWATA et al.
(2005) konnten ebenfalls nur eine geringe Schädigung des Gyrus dentatus nach hypoxischischämischen Insult beobachten Laut AUER u. BENVENISTE (1997) verlieren jedoch die
Regionen bei sehr schweren Insulten ihre selektive Empfindlichkeit und ausgeprägte
Nekrosen können dann auch in anderen Regionen wie der CA3 Region und sogar im Gyrus
dentatus gesehen werden.
IWATA et al. (2005) konnten, im Gegensatz zur vorliegende Arbeit, nur eine geringe
Aktivierung von Mikroglia beobachten, ebenso wie eine mäßige Schwellung der
Endothelzellen. Der Grund hierfür könnte in der deutlich kürzeren Überlebenszeit (48 h) und
im deutlich jüngeren Alter der neugeborenen Ferkel zu suchen sein.
Mit der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Induktion einer Hypothermie
nach Einleitung der Reperfxjsion zu einer deutlichen Reduktion der Zellschäden fuhrt. Dies
wurde auch schon von anderen Wissenschaftlern aufgezeigt (BERNARD et al, 2002;
PHANITHI et al., 2000; The Hypothermia After Cardiac Arrest Study Group, 2002) Auch
SPRINGLER et al. (2007) konnten in verschiedenen Hirnregionen eine Verminderung der
histologisch fassbaren Schäden nach induzierter Hypothermie feststellen
Für weitere therapeutische Interventionen stellt sich die Frage nach der Art des
Zellunterganges, da der verzögerte Ablauf des apoptotischen Zelltodes ein zusätzliches
Zeitfenster bietet, das flir weitere therapeutische Maßnahmen genutzt werden könnte (MATZ,
2003). In der HE Färbung konnten einige Zellen mit apoptotischem Charakter wie
Kondensation des Chromatins und Zellschrumpfung und z T. auch „apoptotic bodies"
vorgefunden werden.
57
Nach
HACKER
(2000)
ist
der
lichtmikroskopische
und
elekronenmikroskopische
Apoptosenachweis die wichtigste und sicherste Nachweismethode und schon RENVOIZE et
al (1998) empfahlen, bei jeder Färbetechnik immer die Zellmorphologie zu beurteilen, da es
bei allen Nachweisverfahren zu unspezifischen Reaktionen kommen kann. Auch FUJIKAWA
(2000) empfiehlt die lichtmikroskopischen Ergebnisse mit ultrastrukturellen Untersuchungen
in Einklang zu bringen. In der vorliegenden Arbeit konnte allerdings versuchsbedingt keine
elektronenmikroskopische Untersuchung stattfinden.
So wurden ftir diese Arbeit die TUNEL Methode und zwei immunhistochemische
Färbemethoden gewählt, um apoptotische Zellen deutlicher zu markieren.
Mit Hilfe der TUNEL („terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP-biotin
nick end-labeling") Methode können spezielle DNA Einzelstrangbruche, welche während der
Apoptose entstehen, markiert werden Durch aktivierte EfFektorcaspasen werden nämlich
Endonukleasen wie DFF („DNA fragmentation factor") aktiviert, die zu DNA Brüchen mit
3'-0H-Gruppen fuhren (HUPPERTZ et al., 1999). An diese Enden bindet dann TdT selektiv.
Die TUNEL Methode wird von vielen Forschungsgruppen zur Apoptosedetektion
herangezogen (ANANIADOU et al., 2005; ANANIADOU et al, 2008; MAITI et al., 2007;
PHANITHI et al, 2000). Von anderen Autoren wiederum wird sie kontrovers diskutiert
(BANASIAK et al., 2000; FUJIKAWA, 2000; LABAT-MOLEUR et al, 1998; HUPPERTZ
et al-, 1999), da Briiche mit 3'-OH-Ende auch durch Zufall während der Nekrose entstehen
können.
HUPPERTZ et al (1999) empfehlen, die Methode zunächst in Vorversuchen zu evaluieren
und ebenso wie MACHAALANI u. WATERS (2003) einen weiteren Apoptosenachweis
mittels einer anderen Technik zur Absicherung des Ergebnisses durchzuführen Dieses
Vorgehen wurde auch von LABAT-MOLEUR et al. (1998) vertreten.
58
Aus diesem Grund wurden für die vorliegende Arbeit immunhistochemische Färbemethoden
gesucht, um eine zusätzliche Differenzierung zwischen Nekrose und Apoptose zu erzielen.
Viele Studien vergleichen die TUNEL-Methode mit dem immunhistologischen Nachweis der
Caspase 3 (HUPPERTZ et al., 1999, MACHAALANl u. WATERS, 2003; MACHAALANl
et al, 2005; PARIKH et al., 2003; PHANITHI et al., 2000, RESENDES et al,, 2004;;
TISCHKAU et al., 2007). Die Caspase 3 zählt zu den Effektorcaspasen sowohl der
extrinsischen als auch der intrinsischen Apoptosekaskade Mit ihrer Aktivierung ist laut
HUPPERTZ et al. (1999) der „point of no return" erreicht. Sie wird auch für viele
morphologische Veränderungen der Zelle während der Apoptose verantwortlich gemacht
(MACHAALANl u. WATERS, 2003).
Als weitere immunhistochemische Methode wurde der Nachweis von Fraktin gewählt
Fraktin entsteht durch die Spaltung von ß-Aktin durch die Caspase 3, und stellt somit einen
späteren Marker der Apoptose dar (SUURMEIJER et al., 1999).
Um die genannten Methoden unter standardisierten Bedingungen zu etablieren und
anschließend vergleichen zu können, wurden zunächst Zellkulturversuche durchgeführt. Zur
Apoptoseinduktion in den Zellkulturen wurde Camptothecin, ein Extrakt aus dem
chinesischem Baum Camptotheca acumitiata verwendet (FISHBANE et al., 2004;
KOZLOWSKA et al., 2002). Camptothecin bindet an die Topoisomerase 1, die ein wichtiges
Molekül für die DNA Synthese ist Durch diese Hemmung kommt es zu doppelsträngigen
DNA Brüchen und
somit
zur Induktion
der Apoptose (KING u.
RADICCHI-
MASTROIANNT, 2002).
Für die Evaluierung der Färbemethoden an den Zellkulturschnitten war es wichtig, die
Apoptose- bzw. Nekroserate quantitativ zu ermitteln, wobei die Zellsuspension nach der
Markierung mit Annexin und Propidiumiodid (PI) mittels Durchflußzylometrie analysiert
wurde.
Bei der Unterscheidung zwischen Apoptose und Nekrose an lebenden Zellen sind
charakteristische Veränderungen an der Zellmembran apoptotischer Zellen, wie z.B die
Translokation von Phosphatidylserin (PS) hilfreich (HUPPERTZ et al., 1999). Annexin V ist
ein Ca^^ abhängiges phospholipidbindendes Protein mit hoher Affinität zu PS. Da auch
59
nekrotische Zellen PS exprimieren können, müssen diese von den apoptotischen Zellen
zusätzlich durch die Aufnahme von PI unterschieden werden. Propidiumiodid kann durch eine
zerstörte Kemmembran an DNA Fragmente binden (SCHUTTE et al., 1998; VERMES et al.,
1995) und somit in nekrotischen Zellen nachgewiesen werden.
Für die weitere Arbeit war von Interesse, ob in der Zellkuhur ausreichend apoptotische
Veränderungen induziert werden können, um die immunhistochemischen Methoden daran
etablieren zu können. Es stellte sich heraus, dass rund 17 - 35 % apoptotische und somit um
ein Drittel bis doppelt so viele wie nekrotische Zellen in den Kulturen nachweisbar waren.
BANASIAK et al. (2000) und KOZLOWSKA et al (2002) behaupten jedoch, dass während
der späten Apoptose Zellen auch mit Annexin V und PI markiert werden können, sodass in
diesem Stadium eine eindeutige Differenzierung nicht immer möglich ist.
In den HE Färbungen der Zellpellets entstand der Eindruck, es handele sich um deutlich mehr
geschädigte Zellen als mittels Durchflusszytometrie quantifiziert wurden, wobei zusätzlich
der Anteil der nach morphologischen Kriterien nekrotisch aussehenden Zellen als relativ hoch
eingestuft wurde. Eine mögliche Erklärung für diese abweichende Verteilung stellt unter
Umständen die Präparation der Zellsuspension zur Pelletherstellung dar. Aufgrund der
unterschiedlichen Größe und Dichte der Zellen könnte es bei der Zentrifligation zu einer
Schichtung und somit zu schnittbedingten Unterschieden gekommen sein.
Dennoch konnten zahlreiche Zellkerne mit kondensiertem Chromatin oder geschrumpfte
Zellen vorgefunden werden, ebenso wie zahlreiche „apoptotic bodies", wobei das Ausmaß
ausreichend schien, um die gewählten Methoden evaluieren zu können.
Der Vergleich dieser 3 Nachweis verfahren in der Zellkultur ergab deutlich mehr markierte
Zellen mit der TUNEL Methode Die Caspase 3 und Fraktin Färbung erbrachte ein etwas
unterschiedliches Bild. Die Caspase 3 färbte einige Zellen deutlich positiv an, wobei
insgesamt weniger Zellen als in der TUNEL Methode markiert waren.
Bei der Fraktin Reaktion konnte eine deutlich höhere Zahl an positiv gefärbten Zellen in der
mit
Camptothecin
induzierten
Kultur
gesehen
werden,
jedoch
augenscheinlich weniger Zellen angefärbt als bei der TUNEL Methode.
waren
ebenfalls
60
Mit allen 3 Methoden konnten auch in der Kontrollgruppe einzelne deutlich positiv markierte
Zellen gefunden werden, welche in der Durchflußzytometrie mittels der Annexin V/PI
Färbung ebenfalls nachweisbar waren Dies ist vermutlich auf die Manipulation der Kultur,
den Zusatz von DMSO zum Kulturmedium während des Versuchs zurückzufuhren und eine
geringe Anzahl von physiologischer Apoptose.
Zur weiteren Absicherung wurden die immunhistochemischen Färbungen an anderen
Gewebeproben, bei denen mit Apoptose zu rechnen war, durchgeführt. Im Thymus juveniler
Schweine konnten einige deutlich markierte Zellen gefunden werden. Ebenfalls konnten in
Lymphkoten und Lungenpräparaten von Schweinen mit PRRS positiv markierte Zellen
gefunden werden, da das PRRS-Virus bekanntermaßen Apoptose induzieren kann (SUAREZ,
2000; SUÄREZ et al, 1996; SUR et al., 1998). Wie bei der Zellkultur kam es auch hier bei
der Caspase 3 - und Fraktin - Färbung zu einer deutlich geringeren Anzahl an markierten
Zellen als bei der TUNEL Reaktion.
Auch RESENDES et al (2004) konnten in ihrer Arbeit mit Lymphgewebe von gesunden
juvenilen Schweinen deutlich mehr TUNEL-positive als Caspase3-positive Zellen feststellen.
Die Erklärung von RESENDES et al. (2004) zu diesem Phänomen war, dass es zu falsch
TUNEL-positiven Zellen aufgrund von Mitose, Nekrose, DNA-Reperatur und Fixierung
kommen kann In der vorliegenden Arbeit konnten in den Zellkulturen ebenfalls zahlreiche
Mitosestadien gefunden werden.
In den Hippokampusschnitten konnte mit Hilfe der TUNEL Methode, v.a. in der
normothermen Kontrollgruppe, eine große Zahl an Zellen markiert werden. Dabei stellten sich
die positiven Zellen einheitlich dunkelbraun markiert dar und wiesen zusätzlich zum Teil
auch deutliche morphologische Kriterien der Apoptose auf. Bei einzelnen Schnitten konnte
eine vergleichsweise intensive Hintergrundfärbung beobachtet werden, welche aber durch die
deutliche Markierung positiver Zellen keinen Einfluss auf die Beurteilung der Schnitte hatte.
Immunhistochemisch konnte dagegen im Ammonshom keine nennenswerte Anfarbung der
aktivierten Caspase 3 oder von Fraktin gefunden werden. Bei beiden immunhistochemischen
Methoden war zudem eine deutlich ausgeprägte Hint ergrund färbung zu beobachten, die beim
Fraktinnachweis besonders stark war.
61
Aufgrund
dessen
wurde
bei
der
Fraktin-Immunhistochemie
nur
mit
einer
Arbeitskonzentration von 1:1500 anstatt von 1:1000, wie von SUURMEIJER et al. (1999)
beschrieben, gearbeitet Auch beim Nachweis der aktiven Caspase 3 musste statt der
Verdünnung von 1:250 (PARIKH et al., 2003) die Verdünnung von 1:500 gewählt werden
Noch höhere Verdünnungen führten zu keinen deutlichen Markierungen
in den
Positivkontrollen der Zellkulturen.
Ein weiterer Grund für die deutliche Hintergrundfärbung könnte in der Art der AntigenDemaskierung zu suchen sein Für diese Arbeit wurde die Mikrowellenbehandlung mit
Citratpuffer gewählt, da sie, neben der Andauung mit Pronase, die Standardbehandlung am
Institut darstellt.
Von PILERI et al. (1997) wurden verschiedene „antigenfreilegende" (AR, antigen retrieval)
Methoden evaluiert. Diese Arbeitsgruppe konnte unter anderem zeigen, dass eine
Hitzeexposition die zeitabhängigen Unterschiede in Präparaten, welche 24 Stunden bzw. eine
Woche in Formalin fixiert wurden, minimieren bzw. aufheben konnte. Auch zeigte sich in
dieser Studie, dass es keinen signifikanten Unterschied zwischen der Benützung eines
Druckkochtopfes
und
der
Mikrowellenbehandlung
gab.
Die
Verwendung
eines
Druckkochtopfes würde zwar laut PILERI et al. (1997) einige Vorteile bringen, wie die
kürzere Prozedurdauer und die Möglichkeit der gleichzeitigen Behandlung einer größeren
Anzahl von Objektträgern, da es aufgrund der gleichmäßigen Hitze im Druckkochtopf zu
keiner Bildung von sog. „hot spots" komme. Aufgrund der Tatsache, dass in der vorliegenden
Arbeit jeweils nur eine Küvette pro Durchgang in der Mikrowelle behandelt wurde und
weiters das verwendete Gerät eine Drehtellerfunktion aufwies, wurde die „hot spot"Problematik von uns als vernachlässigbar angesehen. Eine weitere Erklärung für die starke
H int ergrund reakt ion könnte in dem verwendeten Puffer während der Mikrowellenbehandlung
liegen. Von PILERI et al. (1997) und SURRMEIJER et al. (1999) wurden der EDTA Puffer
vor dem Tris-HCl-Puffer und dem Citratpuffer favorisiert, da damit eine intensivere
spezifische Anfärbung erreicht werden konnte, jedoch wurde die Hintergrundfärbung in
beiden Arbeiten nicht evaluiert. Andererseits verwendeten LOVE et al. (2000) den
Citratpuffer mit Erfolg beim Nachweis der Caspase 3 Somit wurde in der voHiegenden
Arbeit auch aufgrund der Ergebnisse in der Zellkultur und den anderen Gewebeproben, bei
62
denen es zu deutlichen und intensiven positiven Markierungen kam, keine Änderung in der
Pufferlösung während der Mikrowellenbehandlung vorgenommen.
Die zum Teil sehr deutliche Hint ergrund färbung wurde in der vorliegenden Arbeit vor allem
bei den immunhistochemischen Färbetechniken beobachtet, jedoch konnte sie teilweise auch
bei der TUNEL Methode gesehen werden. Dadurch, dass die Schnitte einzeln mit dem DAB
Reagenz behandelt und
unter Mikroskopkontrolle
entwickelt wurden,
konnte die
Hintergrundfärbung bei dieser Methode jedoch stark reduziert bzw. verhindert werden.
Die deutliche Markierung zahlreicher Zellen mit der TUNEL Methode bei fehlender Caspase
3 und Fraktin Detektion wirft die Frage auf, ob diese Methode in der vorliegenden Arbeit
tatsächlich als sicherer Apoptoseindikator herangezogen werden kann.
Ein Erklärung für die deutliche TUNEL Färbung und die sehr schwache bis nicht vorhandene
Caspase 3 und Fraktin Färbung könnten Caspase - unabhängige Formen des Zelltodes
darstellen (LEIST u. JÄÄTTELÄ, 2001, LORENZO et al, 1999). So kann zum Beispiel AIF
(„apoptosis inducing faktor") zu ähnlichen wie durch Caspasen hervorgerufenen DNA
Briichen fuhren. Diese sind zwar nicht so exakt wie bei denen durch Caspasen induzierten
Brüchen (LAWEN, 2003), aber eventuell doch so ähnlich, sodass das TdT-Enzym der
TUNEL Methode daran binden kann.
Auch TEZEL u. YANG (2004) konnten bei Ganglienzellen in der Retina einen Caspaseunabhängigen Zelltod nachgewiesen Weiters beschreiben FORMIGLI et al (2000) die
Aponekrose als Zelltod mit apoptotischen und nekrotischen Elementen und KITANAKA u.
KUCHINO (1999) einen Caspase-unabhängigen programmierten Zelltod mit nekrotischer
Morphologie
Diese Formen des Zellunterganges sind der caspaseinduzierten echten
Apoptose insofern ähnlich, als dass sie zumindest anfangs einen aktiven Prozess darstellen
und somit ebenfalls ein therapeutisches Zeitfenster gegeben sein könnte.
63
Für den nicht vorhandenen immunhistochemischen Apoptosenachweis mittels Caspase 3 und
Fraktin Antikörper können jedoch auch andere Gründe aufgezeigt werden. So könnten für die
fehlenden Markierungen von Caspase 3 und Fraktin in den Neuronen des Hippokampus die
zum Teil sehr langen Fixierzeiten in Formalin verantwortlich sein. Prinzipiell wird
empfohlen, die Formalinfixierungen flir eine anschließende immunhistochemische Färbung
möglichst kurz zu hahen, damit Schäden an den nachzuweisenden Epitopen vermieden
werden.
Für die Fixierung der Zellkultur wurde dagegen eine optimale Fixierung mit rascher
Paraffineinbettung gewährleistet (nicht über 24 h). Bei den Gehirnproben konnten diese
kurzen Fixierzeiten im Formalin aus organisatorischen Gründen zum Teil oft nicht
eingehalten werden. MACHAALANI u. WATERS (2003) gaben allerdings ebenfalls eine
deutlich längere Fixierung von 15 Tagen in ihrem Protokoll an. Ebenso fixierten PILERI et al.
(1997) ihre Proben zwischen 24 h und einer Woche in Formalin, bevor sie 61 verschiedene
Antikörper testeten und dabei keine nennenswerte Beeinträchtigungen feststellten.
SUURMEIJER et al. (1999) wiederum hahen kurze Fixierungen bis 24 h für einen Vorteil
beim Nachweis von Fraktin. In der vorliegenden Untersuchung konnten aber auch bei
unterschiedlich lang fixierten Gehirnen keine Unterschiede in der Markierung beider
Antikörper festgestellt werden.
Eine weitere Ursache fur die schlechte Markierung der Caspase 3 und von Fraktin könnte in
der Sensitivität der immunhistochemischen Methode zu suchen sein. Wie MATZ (2003) in
ihrer Arbeit feststellte, konnte bei der Detektion aktivierter Caspase 3 nur eine der von ihr
untersuchten 7 Antikörperpräparationen ein aussagekräftiges und deutliches Ergebnis
erzielen.
Aus diesem Grund wurden jedoch die Vorversuche an Zellkultur und
Gewebeschnitten durchgeführt. Die Negativkontrollen waren bei beiden Antikörpern stets
negativ, und mit beiden Antikörpern konnten in der Zellkultur und in den unterschiedlichen
anderen Geweben, das Gehirn ausgenommen, Zellen markiert werden.
64
Ein anderer Grund fiir die verminderte Markierung mittels Caspase 3 Antikörper könnte darin
bestehen, dass es bei der Apoptose reifer Neuronen nicht unbedingt zu einer Aktivierung der
Caspase 3 kommen muss So untersuchten HU et al. (2000) die Apopotseinduktion durch
Hypoxie/Ischämie in Neuronen unterschiedlich alter Ratten und konnten die Caspase 3
lediglich in den Neuronen sehr junger Tiere nachweisen, während ihnen mit zunehmendem
Alter (Tag 60 post partum) eine hochgradige Reduktion derselben in geschädigten Neuronen
auffiel HU et al. (2000) schlussfolgerten, dass die Apoptose in postmitotischen Neuronen
einen Caspase 3 unabhängigen Aktivierungsweg beschreitet.
Für den vorliegenden Versuch waren die Schweine ca. 80 - 90 Tage alt, und es könnte somit
von einer sistierten Caspase 3 Aktivität ausgegangen werden Da die Spaltung von Actin zu
Fraktin durch die aktivierte Caspase 3 erfolgt, könnte somit der Schluss gezogen werden, dass
aus diesem Grund auch kein Fraktin vorhanden sein dürfte, was sich im Ergebnis der
vorHegenden Arbeit widerspiegeln würde.
Im Gegensatz dazu konnten jedoch LOVE et al. (2000) sehr wohl in Gehirnen älterer
Menschen nach Infarkten Caspase 3 nachweisen.
Eine andere Ursache fiir die vergleichsweise geringe Zahl markierter Zellen mit aktivierter
Caspase 3 könnte sein, dass in der vorliegenden Studie keine Caspase 3 Aktivität mehr
vorliegt, da sich dieses Enzyms im Gegensatz zur TUNEL Methode zu einem früheren
Zeitpunkt der Apoptose nachweisen lässt (LOVE et al., 2000). Diese Annahme spiegelt sich
auch in den Ergebnissen anderer Arbeiten wider, wobei zum Teil sehr unterschiedliche
Höhepunkte der Caspase 3 Aktivierung gefunden wurden.
So beobachteten
MACHAALANI
u,
WATERS
(2003)
in
ihrem
Versuch
nach
intermittierender hyperkapnischer Hypoxie an Neuronen im Gehirnstamm von Ferkeln einen
Peak der aktiven Caspase 3 bei 8 - 12 h, und konnten nach 16 - 24 h keine aktivierte Caspase
mehr nachweisen Hingegen konnten LOVE et al. (2000) nach Hirninfarkten beim Menschen
Caspase 3 in Neuronen nur zwischen 18-24 Stunden nachweisen, und DITSWORTH et at.
(2003) konnten andererseits wiederum eine erhöhte Caspase 3 Aktivität 8 - 72 h nach DHCA
(„Deep Hypothermie Circulatory Arrest") bei Ferkeln nachweisen Nach BENJELLOUN et
al. (2003) ist sogar in Homogenaten des gesamten Gehirns bei Ratten nach neonataler HI die
Caspase 3 nur zwischen 6 und 48 h nach der Reperfijsion aktiviert.
65
DITSWORTH et al. (2003) und NAKAJIMA et ai (2000) gehen jedoch insofern konform,
indem sie eine deutliche Abnahme der Aktivität 1 Woche nach Reperfusion nachweisen
konnten.
NAKAJTMA et al. (2000) konnten in derselben Studie nach Hypoxie-Ischämie (HT) in
neugeborenen Ratten TUNEL positive Nuklei ab 4 h bis 30 Tage nach der Reperfusion
darstellen. Diese Gruppe konnte auch feststellen, dass Regionen mit erhöhten Anteilen an
degenerierten Zellen eine ebenso lang erhöhte Caspase Immunoreaktivität zeigten. Dabei
stellte die CAl Region insofern eine bemerkenswerte Ausnahme dar, als bei ihr trotz einer
massiven Anzahl an apoptotischen Zellen (morphologische Kriterien und TUNEL Methode)
am Tag 7, nur eine geringe Anzahl an Caspase 3 Markierungen vorgefunden werden konnte.
In der vorliegenden Studie wurden die Tiere sogar erst 9 Tage nach HI/Reperfusion getötet
Der fehlende Caspase-Nachweis ist somit möglicherweise auf diese vergleichsweise lange
Zeitdauer nach dem Insuh zurückzuführen und unterstreicht die Ergebnisse der angeführten
Arbeiten, dass die aktivierte Caspase 3 eher in frühen Phasen der Apoptose aufiritt.
Aufgrund der vorliegenden Erkenntnisse wurde zur quantitativen Auswertung der
Hippokampusregionen die TUNEL Methode als Apoptosenachweis herangezogen.
Durchschnittlich zeigten sich bei der Hypothermiegruppe deutlich weniger TUNEL-positive
Zellanschnitte als in den Präparaten der Kontrollgruppe. Der quantitative Unterschied
zwischen den beiden Gruppen erwies sich im Welchs T-Test als statistisch signifikant und
bestätigt somit den Eindruck, der bei der morphologischen Untersuchung der Schnitte
gewonnen werden konnte.
Einzig im Hippokampus des Tieres mit der Nummer SA 234 wurde eine große Anzahl an
Zellen mittels der TUNEL Methode markiert. Dieses Tier wurde jedoch durch Dixons Q-Test
als eindeutiger Ausreißer erkannt (KOMSTA, 2007). Da bei diesem Tier das Ergebnis nach
der Zählung positiver Zellanschnitte 77 Standardabweichungen vom Ausreißerbereinigten
Mittelwert entfernt lag, war dies jedoch zu erwarten. Dieses Tier zeigte zudem bei der
pathologisch-anatomischen Untersuchung einen zusätzlichen Befund an der Lunge in Form
eines kleinen Abszesses (JANATA, 2008).
66
In der Kontrollgruppe zeigten alle Schnitte eine mittelgradig bis hochgradige Anhäufung von
TUNEL-positiven Zellen. Lediglich das Präparat der Nummer SA 224 wies nur vereinzelt
markierte Zellen auf Bei diesem Tier war allerdings das Nervenzellband des Ammonshom so
stark geschädigt, dass überhaupt nur noch vereinzelt Nervenzellen sichtbar waren.
Der signifikante Unterschied zwischen der hypothermen und der normothermen Gruppe in der
vorliegenden Studie lässt sich mit den bekannten Mechanismen einer Hypothermie erklären.
So beruht nach HOLZER u. BEHRINGER (2005) die Zellprotektion z.B. auf dem
verringerten Glucose- und SauerstoffVerbauch, einer Hemmung der Lipidperoxidation und,
wie auch von POPP et al. (2005) beschrieben, auf einer Minimierung von freien
Sauerstofiradikalen Dies fuhrt nach HOLZER u. BEHRINGER (2005) und POPP et al
(2005) unter anderem zu einer verringerten mitochondrialen Dysfunktion und somit zu einer
verminderten Aktivierung von Caspasen, wobei deren direkte Hemmung durch eine
Hypothermie ebenfalls schon nachgewiesen werden konnte.
67
5.2 Schlussfolgerung
Die vorliegenden Ergebnisse zeigen zusammenfassend eine sehr deutliche neuroprotektive
Wirkung einer induzierten Hypothermie nach einer erfolgreichen Wiederbelebung („late
resuscitative hypothermia") Der neuroprotektive Effekt wird offensichtlich in der späten
Reperfusionsphase wirksam, da die hypoxische Phase und die Reanimation bei beiden
untersuchten Gruppen unter identischen Bedingungen verliefen. Diese neuroprotektive
Wirkung der Hypothermie ließ sich in erster Linie an der hochgradigen Reduktion der
Nervenzellnekrosen sichtbar machen, da die nekrotischen Zellveränderungen bei der
Kontrollgruppe im Vordergrund standen
Darüber hinaus spielten offensichtlich auch
apoptotische Mechanismen beim neuronalen Schaden infolge Hypoxie/Reperilision eine
wichtige Rolle. Diese Mechanismen konnten durch die induzierte Hypothermie nach der
Reperfijsion ebenfalls signifikant reduziert werden. Die Frage, ob der zusätzliche Einsatz
spezifischer apoptosehemmender Arzneimittel eine weitere Schutzwirkung bei bzw. nach der
Reanimation bewirken könnte, kann abschließend allerdings nicht schlüssig beantwortet
werden. Die vorliegenden Ergebnisse der morphologischen Untersuchungen spiegeln nämlich
ausschließlich den Status zum vergleichsweise späten Zeitpunkt von 9 Tagen nach dem Insult
wider, so dass sich hier nicht abschätzen lässt, in welchem Ausmaß die Apoptose in den
früheren Phasen wirksam ist.
68
6 Zusammenfassung
Die Folgen von Herz-Kreislaufstillständen stellen ein großes gesundheitliches Problem
unserer Gesellschaft dar. So können von den rund 35.000 erfolgreich wiederbelebten
Patienten nur 2 - 10% ohne neurologische Defizite aus dem Krankenhaus entlassen werden.
Für diese schlechte Erfolgsrate wird die Hypoxie-Ischämieintoleranz der Neuronen
verantwortlich gemacht, wobei die Schädigung entweder zu einem passiven nekrotischen oder
einem verzögerten, aktiven apoptotischen Zelltod fuhrt. Für die vorliegende Studie wurden 16
Schweine in 2 Gruppen randomisiert nachdem sie nach einem lOminütigem Herzstillstand
erfolgreich wiederbelebt wurden Die Körpertemperatur der Tiere der hypothermen Gruppe
wurde daraufhin mittels LRS ThermoSuit® für 16 Stunden auf 33 "^C abgekühh 9 Tage nach
der Reperflision wurden alle Tiere getötet und die Gehirne fixiert. Ziel der vorliegenden
Arbeit war es, die unterschiedlichen Schädigungen im Hippokampus, der als selektiv
vulnerable Region gilt, histologisch zu evaluieren. Insbesondere sollte untersucht werden,
welche Rolle dabei der nekrotische bzw der apoptotische Zelluntergang spielt. Um die Art
des Zellunterganges näher zu untersuchen wurden die TUNEL Methode und zwei
immunhistochemische Färbungen an der Zellkultur und an verschiedenen Gewebeschnitten
erprobt, wobei mit allen 3 Verfahren reproduzierbare Markierungen von apoptotischen Zellen
erzielt werden konnten. Mittels der TUNEL Methode und anschliessender semiquantitativer
Auszählung konnte in der CAl Region des Hippokampus bei den Tieren der hypothermen
Untersuchungsgruppe
eine
hoch signifikante
(p
-
0,005)
Reduktion
apoptotischer
Nervenzellen festgestelk werden Mit Hilfe der immunhistochemischen Färbungen war es in
der vorliegenden Arbeit allerdings nicht möglich eine nennenswerte Markierung im
Hippokampus zu erzielen. Verantwortlich hierfür könnten unter anderem methodisch bedingte
Ursachen oder die zeitliche Abfolge der Ereignisse während der Apoptosekaskade sein.
Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse der HE Färbung und der TUNEL Methode konnte
jedoch eindeutig der positive Effekt einer Hypothermie mittels LRS ThermoSuit® dargestellt
werden.
Schlüsselwörter: Hypoxie, Reperfusion, Hippokampus, Hypothermie Schwein, Nekrose,
Apoptose, TUNEL, Caspase 3, Fraktin
69
7 Summary
The consequences of cardiovascular arrests pose a huge health problem in our society. From
the approximately 35,000 successfully resuscitated patients, only 2 - 10% can be released
from the hospital without neurological deficits. The hypoxic ischemic intolerance of the
neurons has been singled out as the reason for the poor success rate, in which this damage
either leads to a passive, necrotic cell death, or a delayed, active apoptotic cell death. For this
study, 16 pigs were randomized in 2 groups after they had been successfully resuscitated after
a 10-minute cardiac arrest. Thereafter the body temperature of each of the animals in the
hypothermia group was cooled down to 33 °C for 16 hours using LRS ThermoSuit*. 9 days
after the reperfiision, all the animals were sacrificed and their brains preserved. The goal of
this thesis was to histologically evaluate the different damage in the hippocampus, which is
considered to be a selective vulnerable region. It was especially important to examine which
role the necrotic or the apoptotic cell death played. In order to analyze the type of cell death
more closely, the TUNEL method and two immunhistochemical stains were performed on cell
culture and on different tissues. In all 3 techniques, the reproducible markings of apoptotic
ceils could be achieved. By using the TUNEL method and subsequent semi-quantitative
computation, a highly significant (p = 0,005) reduction of apoptotic nerve cells could be
determined in the CAl region of the hippocampus of the animals in the hypothermia group.
With the immunhistochemical stains, it was not possible, however, to achieve a notable
marking in the hippocampus in this thesis. The reason for this could be due to methodical
related causes or due to the chronological sequence of the experiments during the cascade of
apoptosis In spite of this, the positive effect of the hypothermia using LRS ThermoSuit*
could be unambiguously proved, due to the results of the HE stain and the TUNEL Method.
Keywords: hypoxia, reperfiision, hypothermia, hippocampus, porcine, necrosis, apoptosis,
TUNEL, Caspase 3, Fractin
70
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