Kinetische Betrachtungen über die enzymatische Dextransynthese
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738 K. H. EBERT UND F. PATAT w erden, was jedoch au f die Schw ierigkeit stieß, daß aus solchen L ösungen das Enzym leicht ag g reg iert und ausfällt. So w aren U ltrazentrifugen-S edim entationsgeschw indigkeits- und Sedim entationsgleichgew ichtsläufe m it L ösungen, die einen R einheits­ w ert von besser als 2 5 0 E /m g D ex tran hatten, nicht erfolgreich. M eist ergaben sich ü b erh a u p t keine D ia­ gram m e, obw ohl am E nde des V ersuches das ge­ sam te Enzym sich am Boden der Zelle befand. D a­ gegen erhielten w ir aus Sedim entationsgeschw indigkeits-Läufen m it E nzym lösungen von einem R ein ­ heitsw ert 80 bzw. 15 E /m g D extran, die zu einem frü h eren Z eitpunkt d er A rbeit durchgeführt w urden, sehr gut ausw ertbare D iagram m e. D ie sehr scharfen S edim entationsm axim a weisen au f das V o rh an d en ­ sein einer m olekulareinheitlichen Substanz hin, die Ü bereinstim m ung d er Sedim entationskoeffizienten aus 3 V ersuchen w ar ausgezeichnet. E rrechnet m an das Mol.-Gew. u n te r V erw endung des partiellen sp e­ zifischen V olum ens fü r P ro tein u n te r der A nnahm e, daß die M oleküle u nsolvatisierte K ugelm oleküle sind, so erh ält m an fü r das Mol.-Gew. des Enzym s den W ert von 284 000. D ieser W ert liegt in n erh alb der G renzen der Mol.-Gew. (1 0 4 — 106) von E nzy­ men, die bisher bekannt gew orden sind. Z ur B estim m ung d er m olekularen W irk sam k eit ben ö tig t m an au ß er dem Mol.-Gew. noch den P ro ­ teingehalt einer Enzym einheit. D ieser w u rd e nach drei u nabhängigen M ethoden bestim m t. D ie Biuretund die N e s s l e r - W i n k l e r - M ethode, denen von vorneherein ein h ö h erer A ussagew ert zuzu­ schreiben ist, ergaben dabei gut ü b ereinstim m ende W erte von 8 —11 jug P ro te in /E und m it diesem W ert errechnete sich die m olekulare W irk sam k eit zu 32 000. D ieser relativ hohe W ert w ird verständlich, wenn m an bedenkt, daß durch die p erm an en te V er­ b in d u n g von Enzym und w achsender K ette w äh ren d des A ufbaus der D extranm oleküle das R eak tio n s­ geschehen wesentlich vereinfacht w ird 14. Herrn Prof. F. P a t a t danken wir für sein förderndes Interesse an der Arbeit, dem B u n d e s m i n i s t e ­ r i u m f ü r A t o m e n e r g i e und der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t für die Bereitstel­ lung von Sachmitteln. F e rm e n t p o ly m e risatio n IV * Kinetische Betrachtungen über die enzymatische D extransynthese V on K. H . E bert und F. P atat Aus dem In stitut für Chemische Technologie der T.H. München (Z. Naturforschg. 17 b, 738— 748 [1962] ; eingegangen am 2. August 1962) Die enzymatische Dextransynthese, wie sie von Dextransaccharase aus Leuconostoc mesenteroides B 512 F katalysiert wird, führt bekanntlich schon im Anfang der Reaktion zu Produkten mit sehr hohen M olekulargewichten. F ü r diese R eaktion wird ein einfacher Reaktionsmechanismus form u­ liert, in dem das Enzym w ährend des gesam ten Aufbaus der K ette mit dieser in Verbindung b leibt; dabei ist die W achstumsgeschwindigkeit von der Länge der K ette abhängig. Dieser Mechanismus wird an einem R eaktionsbild näher erläutert. F ü r die Bildung der kürzeren Dextranm oleküle, die bei Zusatz von Akzeptoren entstehen, wird der gleiche W achstumsmechanismus angenommen, die kürzeren K etten kommen durch eine R eaktion des Akzeptormoleküls mit dem Wachstumskomplex, bei der die K ette vom Enzym getrennt wird, zustande. Dabei wird das Akzeptorm olekül an das K ettenende ankondensiert. D extranm oleküle können ebenfalls als Akzeptor w irken; dabei bildet sich eine Langkettenverzweigung. Die Reaktionsgeschw indigkeit wird in A bhängigkeit von der Saccharosekonzentration aus dem vorgeschlagenen M echanismus berechnet und eine quantitative Übereinstim mung m it den experim en­ tellen W erten erhalten. Die enzymatische Bildung von Dextran aus Sac­ charose ist eine der am längsten bekannten und best untersuchten enzymatischen Polyreaktionen. Das be­ sondere Interesse, das die Dextranbildung in den letz­ ten zwei Jahrzehnten gefunden hat, ist darauf zurück­ zuführen, daß Dextrane in einem bestimmten Mol.Gew.-Bereich als Blutplasmaersatzmittel klinisch ver­ wendet werden. Bekanntlich sind Dextrane überwiegend a-1.6-verknüpfte Polyglucoside, deren besonderes Merkmal es ist, daß sie zu extrem hohen Mol.-Gew. auswachsen ( > 1 0 8); dabei treten diese hohen Mol.-Gew. be­ reits am Beginn der Reaktion, also schon nach sehr nie­ drigen Umsätzen, auf. Im weiteren Verlauf der Reaktion vergrößert sich das Mol.-Gew. nur noch wesentlich weni- * III. K. H. E b e r t u . G. Schenk , Z. Naturforschg. 17 b , 732 [1962]. Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschung in Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht: Creative Commons Namensnennung-Keine Bearbeitung 3.0 Deutschland Lizenz. This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution-NoDerivs 3.0 Germany License. Zum 01.01.2015 ist eine Anpassung der Lizenzbedingungen (Entfall der Creative Commons Lizenzbedingung „Keine Bearbeitung“) beabsichtigt, um eine Nachnutzung auch im Rahmen zukünftiger wissenschaftlicher Nutzungsformen zu ermöglichen. On 01.01.2015 it is planned to change the License Conditions (the removal of the Creative Commons License condition “no derivative works”). This is to allow reuse in the area of future scientific usage. FERMENTPOLYMERISATION IV ger. Diese Tatsache, die schon relativ früh gefunden 1 und von verschiedenen Autoren bestätigt w urd e2- 3, kann mit den bisher üblichen Vorstellungen über den Mecha­ nismus von Aufbaureaktionen zu Polymeren nicht er­ klärt werden. H e h r e hat in einem zusammenfassenden R e fe rat4 schon früher vermutet, daß die enzymatische D extranbildung nach einem speziellen Reaktionstyp verläuft, der sich von den klassischen Additions- und Polymerisationstypen prinzipiell unterscheidet. Allge­ meine Vorschläge dazu sprachen die Vermutung aus, daß das die Reaktion katalysierende Enzymmolekül und die wadisende Kette während des Aufbaus der Kette m iteinander in Verbindung bleiben5. Diese A rt von A ufbaureaktion bei Polyreaktionen wurde von P a t a t als neuer Reaktionstyp e rk a n n t6, und vorerst als Prägetyp bezeichnet. Dabei soll das Kettenwachstum in der Weise vor sich gehen, daß die Polymerkette aus dem Enzymmolekül herauswächst, das zuerst reagierte Monomere sitzt also stets am enzymentfernten Ende der Polymerkette, und die neu hinzutretenden sollen sich zwischen Enzym und wachsende Kette einschieben. Diese Vorstellung stellt ziemlich komplizierte Forderun­ gen an die Bindung zwischen Enzym und Dextrankette: sie muß einerseits so fest sein, daß der Reaktionskom­ plex eine genügend hohe Lebensdauer hat, damit Poly­ merketten mit einem Polymerisationsgrad von etwa einer Million gebildet werden können, andererseits muß sie so elastisch sein, daß sich beim Kettenwachstum neue Mono­ mere zwischen die wachsende Kette und Enzym einschie­ ben können. Inzwischen wurde dieser Reaktionstyp auch bei anderen Polyreaktionen gefunden, insbesondere bei der Olefinpolymerisation mit bestimmten metallorgani­ schen Katalysatoren 7. Nach P a t a t und S in n 8, die dafür ein Reaktionsschema angegeben haben, ist dabei ty­ pisch, daß der K atalysator und die wachsende Kette in einem Komplex gebunden sind, der in diesem speziel­ len Fall, durch das Vorhandensein von Elektronen­ M angelbindungen charakterisiert ist. In einem ausführ­ lichen R e fe ra t9 hat P a t a t kürzlich den neuen Reak­ tionstyp eingehend diskutiert und für diesen die Be­ zeichnung „Einschiebungstyp“ (insertion type) vorge­ schlagen. Ähnliche elektronentheoretische Überlegun­ gen wie sie P a t a t und S i n n mit ihren Systemen ange­ stellt haben, sind bei Enzymreaktionen noch nicht mög­ lich, da über die Struktur und die sterische Konfigura­ tion der Enzyme viel zu wenig bekannt ist. Ein zweiter wichtiger experimenteller Befund der enzymatischen Dextransynthese ist, daß durch Zusatz bestimmter Substanzen — sog. Akzeptoren — wie Glu­ cose, a-Methylglucosid, Maltose, Isomaltose und andere 1 2 3 4 5 6 7 M. T s u c h iy a , N. N. H e l l m a n , H . J. K o e p s e l l u. M itarbb., J. Amer. chem. Soc. 77, 2412 [1955]. K . F r ö m b l in g u . F . P a t a t , M akrom olekulare Chem. 25, 41 [1957]. F. A. B o v e y , J. Polymer. Sei. 3 5, 167 [1959]. E. H e h r e , in : Advances in Enzymol. 11, 298 [1951]. M. S t a c e y , Chem. u. Ind. 62, 110 [1943]. F. P a t a t , Mh. Chem. 88, 560 [1957]. H j. S in n , H. W in t e r u. W . v. T i r p i t z , M akrom olekulare Chem. 48, 59 [1961], H. 739 Zucker aber auch mehrwertiger Alkohole wie Glycerin, M annit usw. die D extranbildung in zweifacher Weise beeinflußt wird ** 10~ 12. Einmal wird die Reaktions­ geschwindigkeit verändert, beschleunigt oder gehemmt, zum anderen treten neben dem Dextran mit sehr hohem Mol.-Gew. Anteile mit gleicher S truktur aber von we­ sentlich kleinerem Mol.-Gew. auf, deren Mengen und deren Mol.-Gew. von der A rt des Akzeptors selbst und dessen Konzentration abhängen. Reaktionshemmung und A uftreten von niedermole­ kularen Anteilen findet man auch bei höheren Substrat­ konzentrationen. T s u c h i y a 1 hat diesen Effekt den Ak­ zeptoreigenschaften der bei der Reaktion entstehenden Fructose zugeschrieben. Das kann jedoch nicht zutref­ fen, da man auch schon am Anfang der Reaktion diese Hemmung findet; zu diesem Zeitpunkt hat sich aber erst eine sehr geringe Menge Fructose gebildet. P a t a t und M e y e r 13 haben andererseits gefunden, daß die Akzeptoreigenschaften der Fructose nur sehr gering sind. Die niedermolekularen Anteile an Dextran, die sich bei Reaktionen unter Akzeptorzusatz bilden, haben ein Mol.-Gew. von höchstens 100 0 0 0 1,11. Diese Mol.-Gew. werden um so kleiner, je höher die Akzeptorkonzentra­ tion ist; das geht so weit, daß bei extrem hohen Akzep­ torkonzentrationen größere Mengen Oligosaccharide ge­ bildet werden 10. Daneben werden aber auch mehr oder weniger große Anteile von hochmolekularen Dex­ tranen gebildet, so daß Dextran, das in einer Reaktion unter Akzeptorzusatz gebildet wird, eine bimodale Mol.Gew.-Verteilung 1 aufweist. Der Einfluß der Akzeptoren auf die Dextranbildung wurde zuerst von T s u c h i y a und S t r i n g e r quantitativ u ntersucht14, sie haben als Akzeptor a-Methylglucosid verwendet. Das wichtigste Ergebnis ihrer Arbeiten für die Kinetik der Reaktion ist, daß der Akzeptor nicht in Konkurrenz mit dem Substrat in Bezug auf eine Reak­ tion mit dem Enzym tritt, sondern nur mit einem Zwi­ schenprodukt der D extranbildung reagieren kann. Die Substratwirkung des Enzyms ist sehr spezifisch. Außer Saccharose ist kein Zucker bekannt, der als Sub­ strat wirken kann 10, auch nicht Disaccharide mit Dicarbonylbindung wie Trehalose oder im Fructoseteil substituierte Saccharosen wie Melezitose und methylierte Saccharosen 15. Die Akzeptorwirkgruppe dagegen hat diese hohe Spezifität nicht. Besondere Strukturm erk­ male, die eine gute Akzeptoreigenschaft hervorrufen, wurden bisher nicht festgestellt. Das Reaktionsprodukt Dextran, das von Dextran­ saccharose aus Leuconostoc mesenteroides B 512 F ge8 9 10 11 12 13 14 F. F. u . H j . S i n n , Angew. Chem. 70, 496 [1958]. P ure appl. Chem. 4, 433 [1 9 6 2 ] . H . J. K o e p s e l l , H . M. T s u c h iy a , N. N. H e l l m a n u. M itarbb., J. biol. Chemistry 200, 793 [1953]. H . M . T s u c h iy a , N. N. H e l l m a n u . H . J. K o e p s e l l , J. Amer. chem. Soc. 75, 757 [1953]. N. N. H e l l m a n , H . M. T s u c h iy a , S . P . R o g o v in u . M itarbb., Ind. Eng. Chem. 47, 1953 [1955]. F. P a t a t u . H . M e y e r , Biochem. Z. 330, 209 [1958]. B. C. S t r i n g e r u . H . M . T s u c h iy a , J. Amer. chem. Soc. 80, 6620 [1958], P ata t P a ta t, K. H. EBERT UND F. PATAT 740 bildet wird, hat eine relativ einheitliche Struktur. 95% aller glucosidisdien Bindungen sind a-l.ö'-V erknüpfungen 16, die für Dextrane charakteristische Verknüpfungs­ art. Ein weiterer sehr wichtiger Befund war, daß die übrigen 5% „nicht 1.6-B indungen“, nicht in der H aupt­ kette vorliegen, sondern daß sie die Ansatzpunkte von mehr oder weniger langen Seitenketten an der H aupt­ kette sind. Die Seitenketten selbst bestehen wieder aus Glucosebausteinen, die in gleicher Weise wie die H aupt­ ketten aufgebaut sind. Statistisch gesehen, bildet sich im M ittel nach jeweils 20 Glucosebausteinen der H aupt­ kette eine Seitenkette. J e a n e s und M itarb b .17 glauben aus experimentellen Ergebnissen von Hydrolysen und Perjodatoxydation schließen zu können, daß 80% aller Verzweigungen nur eine Glucoseeinheit lang sind (Kurzkettenverzweigung), die übrigen aber eine erheb­ liche Länge erreichen können (Langkettenverzweigung). Das Vorhandensein von Langkettenverzweigung konnte von B o v e y 3 mit Hilfe von Lichtstreuungsmessungen bestätigt werden. Durch Verfolgung der Assymetriefaktoren während einer Reaktion konnte er außer­ dem wahrscheinlich machen, daß der Verzweigungsgrad im Verlauf des Umsatzes zunimmt. Die Frage der Entstehung der Langkettenverzweigungen, die für die Kinetik der D extranbildung von großer Wichtigkeit ist, wurde von B o v e y eingehend dis­ kutiert 18. Er nimmt ein Verzweigungsenzym an, das be­ reits gebildete Dextranketten aufspaltet und das Bruch­ stück an eine andere D extrankette anknüpft. Kurz­ kettenverzweigung kann nach seiner Meinung durch das gleiche Enzym gebildet werden, das den Aufbau der Dextranketten katalysiert. Die enzymatische D extranbildung ist also folgender­ maßen charakterisiert. Bei niedrigen Substratkonzen­ trationen entstehen sehr hochmolekulare Dextrane in der sog. Aufbaureaktion. Bei höheren Substratkonzen­ trationen, oder wenn der Reaktion Akzeptoren zugesetzt waren, werden daneben niedermolekulare Dextrane ge­ bildet, die die gleiche Struktur haben wie die hochpoly­ meren Dextrane. Die Verzweigungen im Dextran sind teilweise von erheblicher Länge und haben daher einen großen Einfluß auf das Mol.-Gew. und auf makroskopi­ sche Eigenschaften wie Löslichkeit, Viskosität und ande­ res mehr. Es erscheint uns zweckmäßig, diese drei Reaktionen Aufbaureaktion, Akzeptorreaktion, die zur Bildung der kurzen Dextranketten führt und die Bildung von Ver­ zweigungen, insbesondere der Langkettenverzweigungen, getrennt zu diskutieren. Aufbaureaktion Die A ufbau- oder W achstum sreaktion ist die R eaktion, die die 2-1.6 r-V erknüpfungen d er einzel­ 15 K. H. E b e r t , G. R u p p r e c h t u . G. S c h e n k , in Vorbereitung. 16 A. J e a n e s , W . C. H a y n e s , C. A. W i l h a m u . M itarbb., J . Amer. chem. Soc. 76, 5041 [1954]. 17 R. W . J e a n e s , R. J . D i m l e r , A. J e a n e s , C. A. W il h a m u . nen G lucosebausteine an ein an d er bew irkt, u n d so die hochpolym eren D extranketten aufbaut. D ie n ie­ derm olekularen D extrane, die bei A kzeptorzusatz entstehen, haben die gleiche S tru k tu r, wie die hoch­ m olekularen D e x tra n e 10. Das legt die A nnahm e nahe, daß die hochm olekularen und die nied erm o le­ kularen D extrane durch die gleiche R eaktion g eb il­ det w erden. D er A ufbaum echanism us soll durch einen W achstum szyklus ausgedrückt w erden, in n e r­ halb dessen ein G lucosylrest aus einem S accharose­ m olekül an eine bereits bestehende D extrankette so angeknüpft w ird, daß dabei eine 1 .ö ^V erk n ü p fu n g entsteht. Zum gesam ten A ufbau eines lin earen P o ly ­ m erm oleküls w iederholt sich der W achstum szyklus n-m al. D a nun die überw iegende A nzahl d er B in ­ dungen in einem D extranm olekül l.ö '-B in d u n g en sind, u n d fü r jede gebildete l.ö ^ B in d u n g ein F ru c ­ tosem olekül in F reih eit gesetzt w ird, drückt die Reaktionsgeschw indigkeit, die aus der freigesetzten Fructosem enge errechnet w ird, n u r die A u fb au reak ­ tio n aus. M it anderen W orten beziehen sich alle kinetischen M essungen, die sich d er so definierten R eaktionsgeschw indigkeit bedienen, n u r auf diese R eaktion. Die A bhängigkeit der Reaktionsgeschw indigkeit von der S ubstratk o n zen tratio n folgt im Bereich klei­ n er S accharosekonzentrationen stren g der G leichung von M i c h a e l i s und M e n t e n 19, oberhalb ein er K on­ zen tratio n von 150 m M ole// fällt die K urve d ann p ro p o rtio n al der S ubstrak o n zen tratio n a b 13. A uf diesen A bfall w ird noch n äh er eingegangen w erden. Bei der F o rm u lieru n g eines W achstum sm echanis­ mus m uß der schon einleitend erw ähnte ex p erim en ­ telle Befund berücksichtigt w erden, daß schon am Beginn der R eaktion sehr hohe Mol.-Gew. auftret e n 1-3. W erden lineare K etten gebildet, so erh ä lt m an dann m axim ale Mol.-Gew., wenn m an a n ­ nim m t, daß das Enzym und die wachsende D ex tra n ­ kette stets m itein an d er in V erbindung bleiben, d. h. die ganze K ette von einem einzigen Enzym m olekül au fg eb au t w ird. D abei w ird die Zahl der D ex tra n ­ ketten gleich der Zahl der Enzym m oleküle sein, w enn nicht die K etten irgendw ie vom Enzym ge­ tren n t w erden und die Enzym m oleküle d an n neue K etten aufbauen können. C. E. R i s t , 126th M eeting Amer. Chem. Soc. New York, Sept. 12 — 17, 1954, Abstracts of papers p 13 D. 18 F. A. B o v e y . J. Polymer. Sei. 35,183 [1959]. 19 Siehe z . B . K. J. L a i d l e r , The Chemical Kinetics of E n ­ zyme Action, Oxford 1958. 741 FERMENTPOLYMERISATION IV F ü r die q u an titativ e B ehandlung der A ufbau­ reak tio n ist d ah er neben der M essung der R eaktions­ geschw indigkeit die B estim m ung der Mol.-Gew. und d er M ol.-G ew .-V erteilungen der gebildeten D extrane im V erlaufe d er R eaktion von g roßer Bedeutung. D afü r kom m t w egen d er au ß e ro rd e n tlic h e n Größe d er M ol.-Gew. d er nativen D extrane n u r die Lichtstreu u n g sm ethode in F ra g e ; m an erh ält m it dieser M ethode G ew ichtsm ittelw erte, die gegenüber dem für kinetische B etrachtungen vor allem interessierenden Z ahlenm ittel des M ol.-Gew. den system atischen F eh­ ler haben, bei nicht polym ereinheitlichen Substanzen die g rö ß eren M ol.-Gew. zu begünstigen. fried ig en d angesehen w erden, noch dazu, da die m olekulare W irksam keit des Enzym s nicht m it sehr h o h er G enauigkeit b ekannt ist, und die A bw eichun­ gen in der erw arteten Richtung liegen. Als einfachste F o rm u lieru n g fü r einen W achs­ tum szyklus der A u fb au reak tio n ergeben sich die R eaktionen: EPn+ S J Ki SEP,, SEP« ^ E P n + i + F. (1) (2) D ie q uantitativ e V erfolgung der Mol.-Gew. w äh­ ren d d er R eaktion liefert n u r dann richtige E rgeb­ nisse, w enn das Enzym in der P rä p a ra tio n vorw ie­ gend in fre ie r F orm vorliegt, was am besten dann realisie rt ist, w enn die E nzym präparation m öglichst vollständig von D ex tran gereinigt ist. In III w urde gezeigt, daß das in so hochgereinigten E nzym präpa­ ratio n en , wie sie B ovey zur V erfügung hatte, w eit­ gehend d er F all w ar. D ie Ü bereinstim m ung in n er­ halb d er G rößen o rd n u n g zwischen experim entellen und theoretischen W erten fü r den A nstieg des Mol.Gew. im V erlauf der R eaktion kann dam it als be­ E P n ist der erw ähnte E nzym -D extrankom plex, er rea g iert m it Saccharose als S u b strat in ein er Gleich­ gew ichtsreaktion zu dem W achstum skom plex S E P n , der dann in ein er geschw indigkeitsbestim m enden R eaktion so ab reag iert, daß die K ette um eine G lu­ coseeinheit wächst und ein F ructosem olekül frei w ird. Ist die G leichgew ichtseinstellung der R eak­ tion 1 schnell gegenüber d er Z erfallsreak tio n 2, h at m an einen M i c h a e l i s - M e n t e n - M echanism us vorliegen, wie er bei n ied rig en Saccharose-K onzen­ tratio n en auch experim entell gefunden w urde 13, 21. E ine hypothetische schematische V orstellung über den A blauf dieses W achstum szyklusses ist in Abb. 1 dargestellt. Im E P n-Kom plex (I) ist die D ex tran ­ kette ü b er m eh rere H aftstellen m it dem Enzym v er­ b u n d en ; diese H aftstellen sollen zur W irk g ru p p e des Enzym s h in energiereicher w erden, was durch die W ellenlinie im B ild an g edeutet sein soll. A n der W irk g ru p p e selbst ist die offene V alenz am C-Atom 1 des letzten K ettengliedes abgesättigt, E ine solche V erb in d u n g erg ib t sich schon d arau s, d aß der Brükkensauerstoff in d er D ex tran k ette von d er H y d ro x y l­ g ru p p e des C-Atoms 6 s ta m m t22. V on dieser W irk ­ g ru p p e w ird n u n in einer seh r spezifischen R eaktion ein Saccharosem olekül ad so rb iert, das seinen H ydroxylw asserstoff am C-Atom 6 des G lucoseteils an das E nzym abgibt, w odurch die oben erw ähnte B indung zwischen Enzym u n d K ohlenstoffatom 1 des letzten K ettengliedes gelockert w ird u n d eine W echselw ir­ kung zwischen dem H ydroxylsauerstoff der Saccha­ rose und diesem C-Atom en tsteh t; gleichzeitig bildet sich eine W echselw irkung des Enzym s m it dem B rückensauerstoff d er Saccharose. D ieser so en tstan ­ dene M i c h a e l i s - M e n t e n - o der W achstum s­ kom plex S E P n (II) ist recht stabil u n d liegt d aher von allen enzym haltigen V erb in d u n g en relativ in g rö ß ter K o n zen tratio n vor. E r ist fü r die Akzeptor- 20 G. S c h e n k , Dissertation, T.H. München 1962. 21 E. J. H e h r e , J. biol. Chemistry 163, 221 [1946]. 22 S. H e s t r i n , Biol. S tructure and Function I, S. 316, Aca­ demic Press, London —New York 1961. B ovey 3 h a t die Mol.-Gew. von nativen D extranen, die in ein er 1-mM ol. S accharoselösung (0,095 E/m l) gebildet w erden, m ittels Lichtstreuungsm essungen vom B eginn d er R eaktion an verfolgt und erhielt eine K urve, die am A nfang der R eaktion linear an ­ steigt u n d bei g rö ß eren U m sätzen zu einem konstan­ ten W ert abbiegt. D iese Versuche haben w ir m it h ochgereinigten E n zym p räparaten w iederholt und im P rin z ip gleiche E rg bnisse e rh a lte n 20. In III w urde das M ol.-Gew. und die m olekulare W irksam keit der D ex transaccharase bestim m t und d afü r die W erte 2 8 0 0 0 0 bzw. 32 0 0 0 erhalten. Aus den experim entel­ len M ol.-G ew .-A ngaben kann m an die m olekulare W irk sam keit des Enzym s beredinen, und m an erhält, wenn m an d er A ufbau reak tio n einen Insertio n s­ m echanism us zugrundelegt, einen W ert von etwa 50 00 0 . D ieser W ert ist sicherlich zu hoch: einer­ seits erh ä lt m an, wie erw ähnt, aus systematischen G ründen m it d er L ichtstreuungsm ethode stets zu hohe W erte, an d ererseits w ar die G rundstreuung der E n zy m p räp aratio n relativ groß und w urde über die Zeit d er R eaktion als k onstant angesehen. 742 K. H. EBERT UND F. PATAT E nzym S + EPn SEPn SE P r EPn * F reaktion von besonderer Bedeutung, worauf später noch näher eingegangen wird. In einem langsamen, daher für die Gesamtreaktion geschwindigkeits­ bestimmenden Schritt wird durch Erhöhung der Wechselwirkung der wasserstoffhaltigen Wirkgruppe am Enzym mit dem Brückensauerstoff der Saccharose unter Ausnutzung der bei der Saccharosespaltung freiwerdenden Energie die Kette nach rechts verscho­ ben und der Ubergangskom plex III gebildet. Dieser zerfällt nun schnell in den EPn + i-Komplex; die am Enzym anhaftende Kette ist also um eine Monomer­ einheit verlängert worden. Der gesamte Wachstums­ zyklus läßt sich so relativ einfach durch Übertragung eines Wasserstoffatoms und das Weiterschieben der Kette um eine M onomereinheit am Enzym darstellen. Für die Startreaktion kann der gleiche Mecha­ nismus angenommen werden, w ie er oben formuliert wurde, nur reagiert in diesem Fall statt dem Enzym- Dextran-Komplex freies Enzym, das auch das erste Wasserstoff atom zur Spaltung der Saccharose lie­ fert. Das Wachstum der Kette kann nur dann auf­ hören, wenn die Bindung zwischen dem Enzym und der wachsenden Kette sich auf irgendeine W eise löst. Über die Stabilität des EPn-Komplexes kann aus Versuchen zur Reinigung von Enzympräparationen etwas ausgesagt werden. Darauf ist in III näher eingegangen worden. Die Versuche zeigen deutlich, daß in hochgereinigten Enzympräparationen die Enzymmoleküle überwiegend in freier Form vorliegen, bei der Reinigungsoperation demnach eine Dissoziation des Enzym-Dextran-Komplexes statt­ gefunden hat. Die extrem hohen Mol.-Gew., die man bei der Dextransynthese erhält, zeigen, daß der SEPn-Komplex eine hohe Stabilität besitzen muß. Es erhebt sich die Frage, ob die Enzymmoleküle überhaupt FERMENTPOLYMERISATION IV n u r eine einzige K ette aufbauen können, eine D is­ soziation des W achstum skom plexes im M ilieu der R eaktionslösung also nicht vorkom m t. In P roduktionslösungen, denen w ir eine sehr ge­ rin g e Menge Enzym zugesetzt haben, w urden je ­ doch stets vollständige Um sätze erzielt. M it d er M o­ la rität der E nzym einheit und u n te r A nnahm e der G ültigkeit unseres A ufbaum echanism us errechnen sich die m ittleren Mol.-Gew. bei diesen V ersuchen zu g rö ß er als IO 10, W erte, die sicher nicht real sind. Also m uß ein Enzym m olekül an dem A ufbau von m ehreren D extranm olekülen b eteiligt sein, das ent­ w eder durch eine D issoziation des W achstum skom ­ plexes oder durch den Bruch d er D extrankette, wenn diese ihre therm odynam ische M axim algröße erreicht hat, geschehen kann. Eine andere M öglichkeit dazu erg ib t sich aus der A kzeptorreaktion auf die w eiter unten n äh er eingegangen w ird. E ine sehr w ichtige F rage fü r die K inetik der R eaktion ist, ob die W achstum sgeschw indigkeit von d er G röße der w achsenden K ette abhängig ist, d. h. ob die K ette stets gleichschnell wächst, unab h än g ig davon, ob sie erst sehr kurz ist oder schon eine b e­ trächtliche L änge hat. Falls es U nterschiede im K et­ tenwachstum gibt, ist wohl anzunehm en, daß kurze K etten schneller wachsen als lange, schon allein aus dem G rund, weil kurze K etten w eniger H aftstellen m it dem Enzym haben als längere. Die W achstum s­ geschw indigkeit w ird also m it g rö ß er w erdender K ettenlänge zuerst schneller, dan n langsam er a b ­ nehm en, und zw ar so lange b is die K etten eine be­ stim m te G röße haben, die in d er gleichen G rößen­ o rd n u n g liegen w ird wie das E nzym m olekül. D ann — etwa von einem Mol.-Gew. von 200 0 0 0 ab — w ird die L änge der Kette kaum noch einen Einfluß auf die R eaktionsgeschw indigkeit haben. W ird das P olym erm olekül sehr groß (Mol.-Gew. ~ 1 0 8), so w ird in der N achbarschaft des E nzym s hauptsächlich das ausgedehnte P olym erm olekül anzutreffen sein, die V iskosität w ird do rt steigen und die H indiffusion von S u bstrat erschwert, som it w ird dann die R eak­ tionsgeschw indigkeit w ieder abnehm en. 743 m uß die R eaktionsgeschw indigkeit im A nfang der R eaktion g rö ß er sein. Beide Effekte w urden g efun­ den: Die Bruttogeschw indigkeit w ird durch v er­ schiedene A kzeptoren erhöht, w o rau f im nächsten K apitel n äh er eingegangen w ird. Bei der sehr ge­ nauen V erfolgung der B ruttogeschw indigkeit bei R eaktionen, bei denen extrem hochgereinigte E n ­ zym lösungen verw endet w urden, w urden am Beginn d er R eaktion höhere G eschw indigkeitsw erte b eo b ­ achtet 20. Akzeptorreaktion W ie einleitend erw ähnt, w urde experim entell ge­ funden, daß die A kzeptoren die D ex tran b ild u n g in zweifacher W eise beeinflussen. E inm al w ird die R eaktionsgeschw indigkeit v erän d ert — v erk lein ert oder erh ö h t — zum anderen treten A nteile von niederm olekularen D extranen (Mol.-Gew. um 100 0 0 0 ) auf. Die A nnahm e, daß die W achstum sgeschw indigkeit von der G röße der wachsenden K ette abhängt, zieht einige K onsequenzen nach sich. E inm al m uß die B ruttogeschw indigkeit erhöht w erden, w enn n ie d er­ m olekulare D extrane gebildet w erden, zum anderen B em erkensw ert dabei ist, daß d er E influß d er A k­ zeptoren auf die R eaktionsgeschw indigkeit relativ ist, d. h. er hem m t bzw. ak tiv iert stets um den glei­ chen Prozentsatz ganz gleich wie g ro ß die S u b stra t­ konzentration i s t 14,23. T rä g t m an also die R eak­ tionsgeschw indigkeit gegen die S u b stratk o n zen tratio n bei verschiedenen A kzeptorkonzentrationen als P a r a ­ m eter auf, so erh ält m an eine K urvenschar von M i c h a e 1 i s - M e n t e n - K urven. Schon T s u c h iy a machte d ara u f aufm erksam , daß sich dabei die lin e­ aren A bfälle bei höheren S u b stratk o n zen tratio n en verrin g ern , und zw ar um so m ehr, je h ö h er die A k­ zeptorkonzentration ist. Beim Zusatz von 0 ,4 Mol/Z a-M ethylglucosid w ar der A bfall verschw unden und es w urde eine exakte M i c h a e l i s - M e n t e n K urve erhalten. W ährend des U m satzes än d e rt sich d er Q uotient aus dem gebildeten hochm olekularen zu niederm olekularem D extran nicht o der n u r sehr w enig 23. Q ualitative V ergleichskurven fü r die Mol.G ew .-V erteilungen der n iederm olekularen A nteile einer 35-proz. Saccharoselösung nach verschiedenen U m sätzen haben w ir m it einer K o lo n n en frak tio n ie­ ru n g 24 gemessen. D anach w erden die Mol.-Gew. m it steigendem U m satz zu kleineren W erten h in v er­ schoben (Abb. 2 ) . M it steigendem A kzeptorzusatz w ird also der A nteil von niederm olekularem D ex­ tran g rößer, die Mol.-Gew. der n iederm olekularen D extrane w erden gleichzeitig kleiner 1. 23 F. A. B ovey, J. Polymer. Sei. 35, 191 [1959]. 24 K. H. E b e rt u. E. E r n st, Makromolekulare Chem. 56, 88 [1962], K. H. EBERT UND F. PATAT Es ist also durchaus m öglich, R eaktionslösungen m it Zusätzen herzustellen, die die gleiche R eaktions­ geschw indigkeit besitzen wie reine Saccharose-Reaktionslösungen. Die A nw esenheit von A kzeptoren e r­ kennt m an n u r noch an dem A uftreten von n ied er­ m olekularen D extranen. D ie W irkung d er A kzepto­ ren ist so p r i m ä r m it der E rzeugung von n ied er­ m olekularen D extranketten verbunden, die R eak­ tionsgeschw indigkeit k an n dabei sowohl v erg rö ß ert als auch v errin g ert w erden, oder sie k an n u n v erän ­ d ert bleiben. Abb. 2. Fraktionskurven von Dextranen nach verschiedenen Umsätzen aus einer 35-proz. Saccharoselösung. (Die Angaben auf der Abszisse geben den Ä thanolgehalt des Eluiergemisches a n ) . Q uantitative A ngaben über die A kzeptorw irkung sind erst sehr w enige b ekannt gew orden, von die­ sen betreffen die m eisten n u r die V eränderung der R eaktionsgeschw indigkeit, nicht aber eine C harakte­ risie ru n g d er R eaktionsprodukte. D ie Zahl der S u b ­ stanzen, die A kzeptoreigenschaften besitzen, ist ziem ­ lich groß. D abei w ird zweckmäßig unterschieden in solche, die die R eaktion beschleunigen wie Iso­ m altose, M altose, a-M ethylglucosid und Glucose und solche, die hem m end w irken wie Glycerin, Fructose, Saccharose und andere m ehr 10. D ie W irk u n g der A kzeptoren ist bei nicht zu h ohen K onzentrationen reversibel und additiv, dies geht aus einem V ersuch h e r v o r 20, bei dem der R eaktion a-M ethylglucosid zugesetzt w ar und durch Zusatz von S u b strat die A kzeptorw irkung w ieder herabgesetzt w urde. D abei w urde der gleiche W ert fü r die R eaktionsgeschw indigkeit gefunden, wie fü r ein R eaktionsgem isch, das von A nfang der R eaktion an diese nied rig e A kzeptorkonzentration enthielt. Setzt m an einen aktivierenden und hem m enden A kzeptor gleichzeitig zu, so addieren sich die Akzep­ torw irkungen in bezug auf die R eaktionsgeschw in­ digkeit. So können sich bei einem bestim m ten V er­ hältnis der beiden A kzeptoren entgegengesetzte E in ­ flüsse auf die R eaktionsgeschw indigkeit gerade aufheben. So erhielten w ir bei Zusätzen von 5 Tin. Gly­ cerin und 2 T in. a-M ethylglucosid die gleiche R eak­ tionsgeschw indigkeit wie bei einer reinen Saccha­ roselösung. Ganz deutlich aber nahm dabei die T rü ­ bung der R eaktionslösung ab, und zw ar um so m ehr, je höher die K onzentrationen der Zusätze w aren. D ies läßt auf das A uftreten von niederm olekularen D extranen schließen. Die Rolle des A kzeptorm oleküls bei d er R eak­ tion ist nicht n äh er bek an n t. B ovey 23 nim m t an, daß das A kzeptorm olekül m it dem Enzym saccha­ rose-K om plex (ES) der S tartrea k tio n rea g iert und dabei ein G lucosylrest au f den A kzeptor ü b ertrag en w ird. Dieses n eu entstandene O ligosaccharid soll die gleichen E igenschaften w ie der A kzeptor selbst haben und durch die R eaktion m it an d eren ESK om plexen w eitere G lucosylreste ü b ertrag en erh a l­ ten. Diese R eaktion soll also nach ein er norm alen Ü b ertrag u n g sreak tio n verlaufen. Nach diesem M e­ chanism us ist das A u ftreten von M olekülen, die g rö ­ ß er als O ligosaccharide sin d nicht zu erk lären . Die W ahrscheinlichkeit, daß ein A kzeptorm olekül einen G lucoserest ü b ertrag e n bekom m t, ist fü r alle A kzep­ torm oleküle gleich groß. H a t m an in ein er L ösung gleiche K onzentrationen an S u b strat und A kzeptor, so sollte, selbst w enn alle S ubstratm olekel der A k­ zeptorreaktion unterliegen, jedes A kzeptorm olekül im M ittel einen G lucosylrest ü b ertrag en erhalten. M an sollte also als H auptm enge ein D isaccharid aus A kzeptor und Glucose erh alten . In W irklichkeit je ­ doch findet m an bei den n iederm olekularen A nteilen P o ly m erisatio n sg rad e um 5 0 0 . A ußerdem w äre zu erw arten, daß die Mol.-Gew. m it dem U m satz stei­ gen. Genau das G egenteil findet m an experim entell, die Mol.-Gew. der n iederm olekularen D ex tran e w er­ den m it dem U m satz im m er kleiner, wie das in A bb. 2 am B eispiel einer 35-proz. Saccharoselösung dargestellt ist. Zum an d eren reagieren nach B ovey die A kzeptorm oleküle n u r m it dem ES-K om plex der S tartreak tio n . H a t ES einm al nach der A u fb au reak ­ tion w eiterreagiert, so kom m t es fü r die A kzeptor­ reak tio n solange nicht m ehr in F rage, solange es eben die K ette au fb au t. Es ist leicht einzusehen, daß die K onzentration an ES bei gleichm äßiger V ertei­ lung des Enzym s ü b er alle E P n-Kom plexe gleich E /n (n = m ittlerer P o ly m erisatio n sg rad ) und d a ­ her äußerst g erin g ist. Es ist also m it diesem Me- 745 F E R M E N T P O L Y M E R I S A T IO N IV tional, wie die in der E inleitung erw ähnten k in e ti­ schen M essungen von T suchiya u n d S tringer 14 ge­ zeigt haben. In ihnen w urde gefunden, daß die re la ­ tive G eschw indigkeitsänderung bei A kzeptorzusatz sich nicht wesentlich ändert, selbst w enn das Saccharose-A kzeptorverhältnis um den 300-fachen W ert v ariiert w ird. Die entstandenen m ehr o der w eniger n ied erm o le­ kularen D extrane haben ebenso wie die hochm ole­ k u laren keine reduzierende E n d g ru p p e. D ies k ann am besten so erk lä rt w erden, daß sich das A kzeptor­ m olekül an das letzte M onom ere d er K ette an k o n ­ densiert. V orversuche m it rad io ak tiv m ark ierten A kzeptoren, haben diese A nnahm e in qu alitativ er H insicht bestätigt. chanism us völlig unk lar, w ie so große A nteile von niederm olekularen D extranen gebildet w erden. Im ü b rig en erscheint es unw ahrscheinlich, d aß D ex­ trane, die die gleiche S tru k tu r haben u n d sich n u r durch die G röße des M ol.-Gew. unterscheiden, nach zwei völlig verschiedenen W achstum sm echanism en au fg eb aut w erden sollten. Es w ürde w ohl sicher nicht zu um gehen sein, d a fü r auch zwei Enzym e an ­ zunehm en, doch konnten w ir in III, die sich au s­ führlich m it diesem P ro b lem beschäftigt, keinerlei A nhaltspunkte fü r das V o rhandensein von m ehr als einem Enzym erhalten. W ir nehm en dah er an, daß sich die niederm oleku­ laren D extrane, die sich bei A kzeptorzusatz bilden, nach d er gleichen A u fbaureaktion gebildet w erden, wie die hochm olekularen. D ie W irkung d er A kzepto­ ren soll nun d arin bestehen, daß sie m it dem S E P nK om plex der A ufbaureaktion (Gl. 1) in d er W eise reagieren, daß die wachsende K ette vom Enzym ge­ tren n t w ird und d am it ein w eiterer A ufbau dieser K ette v erh in d ert w ir d : SEPn + A - ^ A Pn-fE S . (3) Die K onzentration des A kzeptors ist im allgem ei­ nen wesentlich grö ß er als die des Enzym -A kzeptorK om plexes, die nach unserem R eaktionsschem a w ährend der R eaktion sta tio n ä r ist. D a n u r sehr geringe A nteile des A kzeptors w ährend d er R eaktion ab reag ieren — pro D extrankette ein A kzeptorm ole­ kül — w ird dessen K onzentration w äh ren d des ge­ sam ten U m satzes praktisch konstan t bleiben. D ie Geschw indigkeit d er A kzeptorreaktion ist der A kzeptor- und E nzym konzentration d irek t p ro p o r­ r - O -i E. i O CHfOH M it unserem R eaktionsbild der A u fb au reak tio n (A bb. 1) läß t sich die A kzeptorreaktion einfach d a r ­ stellen, so wie es die A bb. 3 zeigt. Im S E P n-Komplex II ist die B indung des C-Atoms 1 des letzten K ettengliedes m it dem Sauerstoff des C-Atoms 6 des neu hinzutretenden G lucosylrestes noch nicht h erg e­ stellt, die B indung zwischen diesem C-Atom und dem Enzym der V erb in d u n g I ab er schon w eit­ gehend gelockert. So k an n ein A kzeptorm olekül m it diesem K om plex in d er W eise reagieren, d aß das W asserstoff atom des A kzeptors sich m it dem S au er­ stoffatom der Saccharose v erbindet u n d eine B in­ dung zwischen dem Sauerstoffatom des A kzeptor­ m oleküls m it dem C-Atom 1 der letzten K etten­ glucose hergestellt w ird. Die fast schon vollzogene B rückenbindung w ird w ieder zerstört, das W asser­ stoffatom im Enzym b eh ält ab er seine W irk u n g bei C H , ------ "Q ÖH2— t> dhh— Ö l'®-\ Lo-V u>-v u°- ÖH, SEPn + A I CW2 0W Ö H ,— 0 CH?— Ö ES + APn CH2 OH CH20H 0 Abb. 3. Reaktionsbild der Akzeptorreaktion. C H ,— 0 W. CH2OH CH2 0H CHy— O CHyOH O O O C H ,- S E P m + AP,n 746 K. H. EBERT UND F. PATAT und schiebt die Kette, die nun unterbrochen ist, w ei­ ter. Die A kzeptorkette w ird vom Enzym abfallen, Avenn sie auß erh alb der Reichweite der H aftstellen am Enzym ist. S olange die A kzeptorkette noch am Enzym haftet, kann sie einen verzögernden Einfluß auf die W achstum sgeschw indigkeit ausüben. W ährend die A u fbaureaktion sehr spezifisch in bezug auf das S u b strat v erläuft und das Enzym d a­ bei eine kom plizierte Rolle spielt, ist die A kzeptor­ reak tio n nach dieser V orstellung wesentlich allge­ m einer, da das Enzym selbst an der R eaktion direkt nicht beteiligt ist. E ine solche H em m ung fo rm u liert m an kinetisch zw eckm äßigerw eise indem m an die R eaktion über einen K om plex verlaufen läßt, der in einer lan g ­ sam en R eaktion w ieder zerfällt: SEPn + A -> [A S E P n] -> A P n + E S . (3 a) D ie Enzym m enge, die im [A S E P n] -Komplex ge­ bunden ist, ist dabei der W achstum sreaktion entzo­ gen, die daher gehem m t w ird. D en reaktio n s­ beschleunigenden Effekt, der bei einigen A kzeptoren beobachtet w urde, füh ren w ir auf unsere A nnahm e zurück, daß die D extranketten im A nfang ihres A uf­ b aus schneller wachsen, wie dies w eiter oben au s­ führlich dargelegt w urde. Je niederm olekularer die D extrane sind, desto stä rk e r sollte auch die E r­ h öh u n g der R eaktionsgeschw indigkeit sein. Die A k­ zeptorreaktion besteht also nach unserer Ansicht in einer R eaktion, die einen Bruch der D extrankette b ew irkt. D abei entstehen D extrane m it gleicher S tru k tu r, jedoch m it kleinerem Mol.-Gewicht. Die relative H äufigkeit dieser R eaktion ist der K onzen­ tratio n des A kzeptors p ro p o rtio n al, darau s folgt, daß die m ittleren Mol.-Gew. der niederm olekularen D extrane m it steigender A kzeptorkonzentration im ­ m er kleiner w erden m üssen, dasselbe m uß auch im V erlauf der R eaktion geschehen, da die S u b strat­ konzentration linear m it dem U m satz abnim m t, die A kzeptorkonzentration aber praktisch konstant bleibt. Nach diesen Ü berlegungen drückt sich die Akzep­ to rw irk u n g in erster Linie durch die M enge und die G röße der niederm olekularen D extrane aus. E rst sekundär ist d am it auch eine V eränderung der R eak­ tionsgeschw indigkeit verbunden. Diese setzt sich aus zwei K om ponenten additiv zusam m en: erstens kann die G esam treaktion durch die A kzeptorreaktion ge­ hem m t w erden, zw eitens w ird sie durch das ver­ m ehrte A uftreten von niederm olekularen D ex tra­ nen v erg rö ß ert. Je nachdem ob der erste oder der zweite Effekt überw iegt, w ird die G esam treaktion gehem m t oder beschleunigt. A uf diese W eise e rk lä rt sich auch zw anglos der lineare A bfall d er R eak tio n sg esch w in d ig k eit13 bei hohen S accharose-K onzentrationen, w enn m an a n ­ nim m t, daß die S accharose ein hem m ender A kzeptor ist. Die relative A kzeptorw irkung ist fü r verschie­ dene A kzeptoren unterschiedlich, so überw iegt die von a-M ethylglucosid die von Saccharose, d. h. a-M ethylglucosid w ird bevorzugt reag ieren und die Saccharose als A kzeptor v erd rän g en , d aher v errin ­ g ert sich auch d er lin eare A bfall der R eaktionsge­ schw indigkeit bei höheren Saccharose-K onzentra­ tionen m it steigender a-M ethylglucosid-K onzentration, wie es auch experim entell gefunden w urde 14, 23. Um die T h eorie ü b er die A kzeptorw irkung q u a n ­ titativ zu entwickeln, ist es erforderlich, die genauen M ol.-G ew .-V erteilungen der n iederm olekularen D ex­ tran e zu kennen. D abei sind die E rgebnisse nicht einfach zu disk u tieren , da S accharose stets als A k­ zeptor und S u b strat w irkt, u n d dem nach die A ufbau­ reaktion iso liert nicht untersucht w erden kann. Verzweigungsreaktion Ü ber die Zahl u n d G röße der V erzw eigungen an den D extranketten ist relativ sehr w enig bekannt. Aus M ethylierungs-E xperim enten 16, P erjo d ato x y d ationen 2’ 25 sowie H ydrolyseversuchen 16 fan d m an, daß in m it D extransaccharase aus L eu co no sto c mesenteroides B 512 F erzeugten D ex tran en etwa alle 20 G lucosebausteine eine Seitenkette abzweigt, von denen 80% n u r eine G lucoseeinheit lan g sein sollen, w ährend die ü b rig en oft eine sehr erhebliche Länge haben können. D iese beiden A rten von Seitenketten m üssen p rinzipiell unterschieden w erden. L eider sind die A rbeiten, die zu d er A uffassung d er v er­ schiedenen L änge d er S eitenketten fü h ren , n u r aus einem V o rtra g sb e ric h t16 bekannt, eine ausführliche P u b lik atio n ist d a rü b e r nicht erschienen. Die B ildung d er kurzen S eitenketten erk lä rt B ovey 23 durch eine G lu cosylübertragung auf die H ydro x y lg ru p p e am K ohlenstoffatom 3 eines G lu­ cosebausteins in d er K ette, ein V organg, der seiner A kzeptorreaktion an alo g ist und der von dem glei­ chen Enzym b ew irkt w erden soll, das den A ufbau d er K etten k ataly siert. Ist diese A nsicht richtig, so 25 J. C. R a n k in u . [1954], A. Jean es, J. Amer. chem. Soc. 76, 4435 747 FERMENTPOLYMERISATION IV m üßte bei R eaktionen ohne A kzeptorzusatz die Zahl d er K urzkettenverzw eigungen sehr gering sein, da die K onzentration des EG -K om plexes, der die Glucosy lü b ertragung bew irken soll, äu ß erst g erin g b le i­ ben m uß, dam it ü b erh a u p t D extranm oleküle m it hohem Mol.-Gew. entstehen können. D urch den Z u­ satz von A kzeptoren m üßte die Z ahl der kurzen V er­ zw eigungen heraufgesetzt w erden, da die S ta rtre a k ­ tion nun öfters durchlaufen, die K onzentration des EG-Komplexes also g rö ß er w ird. Versuche, die w ir in letzter Zeit d u rchgeführt haben 26 zeigen, daß dies nicht d er F all ist. D extrane aus R eaktionen m it A k­ zeptorzusatz haben die gleichen V erzw eigungsgrade wie solche, die ohne Zusätze erzeugt w erden. F ü r die B ildung d er S eitenketten, die n u r eine G lucoseeinheit lang sind, haben w ir keine b e frie d i­ gende E rk läru n g . D ie einzige M öglichkeit, die w ir sehen ist die, daß bei der W achstum sreaktion ein G lucosylrest m it seiner glycosidischen G ruppe m it der H y d roxylgruppe des K ohlenstoffatom s 3 oder 4 des letzten K ettengliedes rea g iert. E ine solche R eak ­ tion ist aber nicht im E inklang m it unserem Schem a der A bb. 1, da in diesem zuerst die B indung des G lucosylrestes der S accharose hergestellt w ird, be­ vor die D icarb o n y lb in d u n g aufgeht. Eine solche „F eh lre ak tio n “ m üßte ab er so ablaufen, d aß die K ette nicht abbricht, sondern w eiterw achsen kann. E ine eingehendere D iskussion dieser R eaktion ist ab er erst dann zw eckm äßig, w enn genaue an a ly ti­ sche M eßergebnisse ü b e r Zahl und V orkom m en der K urzkettenverzw eigung b ek a n n t sind. L angkettenverzw eigungen können auf diese W eise nicht entstehen; B o v e y 3, 27 m acht fü r deren B ildung ein eigenes Enzym verantw ortlich, das fertige D ex­ tran k etten aufbricht und diese Bruchstücke an andere K etten w ieder anknüpft. D abei stützt er sich auf eigene V ersuche, bei denen das M ol.-Gew. von D extran, das er nach der L ichtstreuungsm ethode ge­ m essen hat, noch zunim m t, w enn die A u fb a u re ak ­ tion bereits beendet ist. So verfolgte er die Mol.Gew. der D extrane nach 100-proz. U m satz bzw. nach dem die A u fb au reak tio n durch T em p eratu r­ beh an d lung in h ib iert w ar. In beiden V ersuchen e r­ hielt er noch m erkliche A nstiege des M olekular­ gewichtes. D iese V ersuche haben w ir w iederholt und konnten die E rgebnisse nicht bestätigen. In III haben w ir die R eaktivität verschieden hoch g erein ig ­ 26 Versuche m i t M. B r o s c h e . 27 F. A. B o v e y , J. Polym er. Sei. 35,191 [1959]. ter E n zym präparationen untersucht u n d aus diesen V ersuchen keine A nhaltspunkte fü r das V o rh an d en ­ sein zw eier oder m eh rerer Enzym e erh alten können. E inleitend w urde erw ähnt, daß auch D extrane eine gewisse A kzeptorw irkung besitzen, die R eak­ tionsgeschw indigkeit w ird g erin g fü g ig erh ö h t und gleichzeitig w erden niederm olekulare D extrane ge­ bildet. P atat und M eyer 13 fanden, daß die q u an ti­ tative Ä nderung der R eaktionsgeschw indigkeit vom Mol.-Gew. des zugesetzten D extrans u n ab h än g ig ist, vielm ehr ist sie der Gewichtsmenge des zugesetz­ ten D extrans p ro p o rtio n al. Betrachtet m an n u n D ex­ tra n als A kzeptor und beachtet das ü b er die A kzep­ to rreak tio n Gesagte (insbesondere A bb. 3 ) , so v er­ einigt sich die wachsende D extrankette m it dem A k­ zeptordextran unter B ildung ein er V erzw eigung: SEPn + D - + D P n + E + S . (3 b ) D iese R eaktion, die insbesondere zur B ildung von L angkettenverzw eigungen fü h rt, ist also ein S pezial­ fall der A kzeptorreaktion, dabei kann das A kzeptor­ d extran natürlich selbst auch eine w achsende D ex­ trankette sein. Versuche m it rad io ak tiv m arkiertem D extran sind im Gange um diese R eaktion n äh e r zu studieren. Schlußbemerkung Die V orstellungen, die in dieser A rb eit ü b er die enzym atische D ex tran b ild u n g entwickelt u n d au s­ führlich dargelegt w urden, lassen fü r die kinetischen M essungen n u r noch einen beschränkten A ussage­ w ert zu. D er G rund d a fü r liegt in u n serer H ypo­ these, daß die R eaktionsgeschw indigkeit d er A uf­ b au reak tio n , die allein bei experim entellen M essun­ gen zugängig ist, nicht ü b er den gesam ten U m satz k o n stan t ist, sondern eine A bhängigkeit aufw eist, wie sie oben n äh er erlä u tert w urde. U m zu ver­ gleichbaren G eschw indigkeitsw erten zu kom m en, haben w ir jew eils die T angenten an die Z eitum satz­ kurven bestim m t, bei der das Enzym g erade eine D extrankette von 15 M illionen Mol.-Gew. h a t und diese W erte m itein an d er verglichen. F ü r unsere G esam treaktion erh alten w ir aus den Gleichungen 1, 2, 3 a das folgende R eaktionsschem a: Aufbauk reaktion E P n + S * 1 [SEPn] h E P n+i + F Jfc, 1 +A [ASEPn] » Akzeptorreaktion A r n ~f"-to 748 FERMENTPOLYMERISATION IV D abei ist die A breaktion des W achstum skom plexes S E P n die geschw indigkeitsbestim m ende Reaktion. E ine H em m ung der A u fbaureaktion bei A nw esen­ h eit von A kzeptoren erg ib t sich aus der A nnahm e des A kzeptorkom plexes (A S E P n) , der der A ufb au ­ reak tio n Enzym entzieht. Die B ruttogeschw indigkeit d er R eaktion ist d em nach: (4) i;Br = V ( [ S E P n] o -[ A S E P n ]) , w obei [S E P n] 0 die K onzentration des W achstum s­ kom plexes bei A bw esenheit des A kzeptors ist, eine G röße, die experim entell prinzipiell nicht zugängig ist, da die Saccharose gleichzeitig als S ubstrat und A kzeptor w irkt. N im m t m an die enzym haltigen Zw ischenverbin­ dungen als w ährend der R eaktion stationär an, was trotz der A bw eichung der U m satzkurven bei R eak­ tionsbeginn in w eitem R eaktionsbereich sicher sta tt­ h aft ist, so erg ib t sich aus der T heorie von M i c h a e l i s - M e n t e n und der G leichung: (5) *4 * - ( E° ' S k. (6) ( K ju - S Setzt m an fü r die R eaktionsgeschw indigkeit bei A b­ w esenheit von A kzeptor ^A=0 — Jin En•S 2 K m + S , ... und für --------- einstim m ung m it der F o rd e ru n g u n serer T heorie im L i n e w e a v e r - B u r k - D iag ram m 19 aufgetragen über den gesam ten K onzenrationsbereich eine Ge­ rade, aus d eren N eigung u n d O rd in aten ab sch n itt die M i c h a e l i s - M e n t e n - K onstante u n d die M axi­ m algeschw indigkeit fü r die A u fb au reak tio n b e­ stim m t w erden kann. D a fü r ergeben sich: (Fjiax) A=o = 1,20 ^M ole • 5• m in-1 •E ~ x , (Xu) a = o —18 fü r die B ruttogeschw indigkeit: ! Br Abb. 4. Reaktionsgeschw indigkeit der Dextransynthese bei verschiedenen Saccharose-Konzentrationen und 25 °C. (N ähere E rläuterung im Text.) jfc. h kA so vereinfacht sich die Gleichung zu: ^Br = ^A=0 (1 —&A* [ A ] ) . (7) Es ist zu beachten, daß Saccharose stets als S u b ­ stra t und als A kzeptor w irkt, daß also bei Zusätzen von A kzeptoren die A kzeptorw irkung der Saccharose m itberücksichtigt w erden m uß. D ie A kzeptorkon­ stante k x von Saccharose kann aus dem linearen A bfall d er experim entellen G eschw indigkeitskurve bei hohen Saccharose-K onzentrationen erm ittelt w er­ den, in unserem F all der A bb. 4 erg ib t sich diese zu 0 ,4 6 5 ’ 1 0 -3 //M ol/m l. In diesem Bereich ist die Ge­ schw indigkeit der A u fbaureaktion von der Sac­ charose-K onzentration praktisch unabhängig, also konstant. M it dem W ert von k \ kann m an fü r alle experim entellen P unkte die W erte errechnen, die die R eaktion ohne die A kzeptorreaktion haben w ürde, und die nun allein die A u fbaureaktion charak teri­ sieren. D iese theoretischen W erte ergeben in Ü b er­ ^ M o le -5 -m l- 1 . N un w urde m it den oben angegebenen K o n stan ­ ten u n d u n te r B enutzung des experim entellen kxW ertes m it H ilfe von Gl. (7) die reale K urve zu­ rückgerechnet, w obei sich, wie aus A bb. 4 ersicht­ lich, eine ausgezeichnete Ü berein stim m u n g m it der experim entellen K urve erg ab . D ies k an n als eine gute Stütze fü r den p o stu lierten R eaktionsm echanis­ m us angesehen w erden. Q uantitative B erechnungen d er R eaktionsgeschw in­ digkeit bei Zusatz von A kzeptoren w erden schwierig, da m an die relativen A kzeptorw irkungen von S ac­ charose und den zugesetzten A kzeptoren kennen m uß. Solche A n gaben sind ab er n u r m it H ilfe von v er­ schieden rad io ak tiv m a rk ierten A kzeptoren u n d der genauen A nalyse der en tstan d en en D extrane möglich. Es soll nicht übersehen w erden, daß eine q u a n ti­ tative K inetik von P o ly reak tio n en , neben d er R eak­ tionsgeschw indigkeit auch die G röße u n d V erteilung der Mol.-Gew. d er P ro d u k te richtig w iedergeben m uß. Um dies zu erreichen, m üssen ab e r die en tsp re­ chenden A ngaben m it h o h er G enauigkeit experim en­ tell zugänglich s e in 24, d am it die A bsolutw erte der R eaktio n sk o n stan ten insbesondere von k s und k 4 und nicht n u r ih r V erh ältn is berechnet w erden k ö n ­ nen.
