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BIO-FLASH Chagas
3000-8599
100 Tests
BIO-FLASH Chagas ist ein vollautomatisiertes, chemolumineszentes, zweistufiges Immunassay für die
qualitative Bestimmung von Antikörpern IgG und IgM gegen Trypanosoma cruzi im humanen Serum und
Plasma mit dem Instrument BIO-FLASH.
1-4
Zusammenfassung
Die Chagas-Krankheit ist eine chronische vom flagellaten Protozoen Trypanosoma cruzi verursachte parasitäre
Infektionskrankheit. Dieser Parasit wird normalerweise von Raubwanzen der Reduviidae-Familie auf Menschen und
andere Säugetiere übertragen. T. cruzi können auch von der erkrankten Mutter auf ihr Kind oder durch Bluttransfusionen
oder die Transplantation von Organen bereits Erkrankter übertragen werden. Transmission durch die Einnahme von
kontaminierten Lebensmitteln wird auch in der Bibliographie beschrieben. Der Lebenszyklus des Parasiten ist lang und
komplex mit mehreren Entwicklungsstadien sowohl beim Überträger als auch bei dem befallenen Wirbeltier. Bei der
Chagas-Krankheit werden drei Stadien unterschieden: eine kurze akute Phase und eine lang andauernde chronische
Phase, zwischen denen eine lange klinisch symptomfreie Phase liegt, die als Latenzphase bezeichnet wird. In der ersten
und dritten Phase können jederzeit verschiedene Organe befallen werden und die Krankheit kann in beiden tödlich
verlaufen. Es wird geschätzt, dass bis zu 30% der Personen in der latenten Form der Infektion 10-20 Jahre nach der
Erkrankung Herz, Verdauungs- oder neurologische Schädigungen aufweisen. Die Antikörper entstehen kurz nach der
Infektion und erreichen hohe Niveaus und können mit der Erkrankung viele Jahre weiterbestehen. BIO-FLASH Chagas
erlaubt einen sehr sensitiven und spezifischen Nachweis von Antikörpern gegen T. cruzi in den akuten und chronischen
Phasen der Infektion dank der Verwendung von rekombinanten Antigenen.
Das Erkennen von T. cruzi-Infektionen ist für die Diagnose der Chagas-Krankheit, die Prävention, Behandlung
und Einzelprognose von großer Bedeutung.
Prinzip
Werden in der Probe, nachdem die paramagnetischen Mikropartikel von BIO-FLASH Chagas mit der Probe
vermischt und inkubiert wurden, spezifische T. cruzi-Antikörper festgestellt, so binden diese an die mit den
spezifischen T. cruzi-Antigenen überzogenen Mikropartikel. Danach erfolgt eine magnetische Trennung mit
anschließendem Waschvorgang, um die Probenreste zu entfernen. Direkt danach wird ein Tracer aus
Isoluminol-markierten Anti-Human-IgG- und Anti-Human-IgM-Antikörpern zugegeben, der dann an das von den
Mikropartikeln aufgefangene T. cruzi binden kann. Nach einem zweiten Durchgang mit Inkubation, magnetischer
Trennung und Waschvorgang werden die Reagenzien zugegeben, die die chemolumineszente Reaktion
auslösen. Die Lichtemission wird vom Luminometer von BIO-FLASH in relativen Lichteinheiten (RLU)
gemessen. Die RLUs sind direkt proportional zur Antikörper-Konzentration speziell gegen T. cruzi in der Probe.
BIO-FLASH nutzt eine Methode zur Datenreduktion mit Anpassung an eine 4-Parameter-logistische Kurve (4PLC),
um eine Masterkalibrationskurve zu erzeugen. Diese Kurve ist vordefiniert, hängt von der Charge ab und wird in
dem Instrument durch den Strichcode der Kassette eingelesen. Mit der Messung der Kalibratoren (die in einem
separaten Kit vertrieben werden) verwandelt sich die vordefinierte Masterkalibrationskurve in eine neue
instrumentenspezifische Kalibrationskurve. Die Konzentrationen der Kalibratoren sind in den Strichcodes der
Kalibratorenröhrchen enthalten.
Reaktionsschema:
Aktivatoren
(Triggers)
RLU
Magnetisches Partikel
Probe
Tracer
BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN
Lichtemission
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Komponenten
Reagenzkartusche
Das Kit BIO-FLASH Chagas enthält eine Reagenzkassette für 100 Auswertungen (REF 3000-8599).
HINWEIS: Das Design der Kassette ist patentgeschützt (US D565,741 / Design CE 000762992-0001)
Aufbau der Reagenzkassette:
Die Kassette besteht aus 3 Ampullen mit folgendem Inhalt:
A.
1 zylindrische Ampulle mit einer Lösung mit Mikropartikeln,
die mit purifizierten rekombinanten T. cruzi-Antigenen
überzogen sind. Enthält < 0,1% Natriumazid und 0,15%
ProClin 950.
B.
1 Ampulle mit Assay-Puffer. Enthält < 0,1% Natriumazid
und 0,05% Triton-X 100.
C.
1 opake Ampulle mit Tracer, der aus Isoluminolmarkiertem monoklonalem Maus Anti-Human-IgG und
Anti-Human-IgM besteht. Enthält < 0,1% Natriumazid und
8,0% Ethylenglykol.
D.
1 leere Ampulle.
Vorbereitung
Siehe Abbildung unten.
Kassette: Die Mikropartikel sedimentieren während Transport und Lagerung, weshalb sie zur Verteilung erneut
gemischt werden müssen.
 Kippen Sie die Kassette bei der ersten Nutzung vorsichtig 30 Mal hin und her, ohne dass dabei Schaum
entsteht. Blasen können die Flüssigkeitssensoren des Instrumentes beeinflussen.
 Stellen Sie sicher, dass die Mikropartikel sich vollständig verteilt haben. Ist dies nicht der Fall, kippen Sie
die Kassette weiter hin und her, bis sie sich vollständig verteilt haben.
 Wenn die Mikropartikel nicht resuspendieren oder Sie feststellen, dass der Reagenzbehälter beschädigt ist,
VERWENDEN SIE DIE KASSETTE NICHT.
 Haben sich die Mikropartikel verteilt, dann stellen Sie die Kassette auf eine feste Oberfläche und entfernen
Sie vorsichtig die rote Transportsicherung.
 Lassen Sie die Kassette auf der festen Oberfläche stehen, drücken Sie die zwei Laschen, die sich seitlich
an der Behälterkappe (graues Teil) befinden, zusammen und drücken Sie so lange auf den oberen
Kassettenteil, bis er blockiert. Die Laschen sind nicht mehr sichtbar, wenn dies der Fall ist. Die geöffnete
Kassette nicht umdrehen.
 Lassen Sie die Kassette 5 Minuten stehen, bevor Sie sie in das Instrument einsetzen.
 Wenn die Kassette eingesetzt ist, mischt das Instrument den Inhalt automatisch und in periodischen Intervallen.
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Vorsichtsmaßnahmen
Die Reagenzien BIO-FLASH sind für die IN VITRO-Diagnostik bestimmt.
Für den ausschließlichen Gebrauch durch Fachpersonal.
Komponenten enthalten <0,1% Natriumazid, Triton-X 100 (Assay-Puffer), 8,0% Ethylenglykol (Tracer) und ProClin
950 (Mikropartikeln). Gesundheitsschädlich beim Verschlucken (R22). Bei Verschlucken sofort ärztlichen Rat
einholen und Verpackung oder Etikett vorzeigen (S46). Schädlich für Wasserorganismen, kann in Gewässern
längerfristig schädliche Wirkungen haben (R52/53).
Das Natriumazid kann mit Rohren und Abflüssen aus Blei oder Kupfer reagieren und dadurch hochexplosive
Metallazide bilden. Bei der Entsorgung von Resten der Reagenzien reichlich Wasser nachfließen lassen.
WARNUNG: BIOGEFÄHRDUNG.
Entsorgen Sie alle verwendeten Materialien in für biogefährliche Materialien geeigneten Behältern.
Bitte kein Reagenz wiederverwenden oder wiederholt in die Kassetten oder Ampullen einfüllen.
Entnahme und Aufbewahren von Proben
Verwenden Sie frisches Serum (es können auch Serumröhrchen mit Trenngel verwendet werden) oder Plasma
(EDTA, Li-Heparin, Na-Heparin, Na-Citrat und ACD). Andere Antikoagulantia müssen vor Anwendung geprüft
werden. Flüssige Antikoagulantia wie Na-Citrat haben eine verdünnende Wirkung und könnten die Konzentration der
Patientenproben herabsetzen. Die Proben dürfen nicht durch Erhitzen inaktiviert worden sein. Die Partikel in der
Suspension müssen durch Zentrifugieren beseitigt werden. In den Richtlinien CLSI H18-A3 und H21-A5 finden Sie
weitere Informationen über die Handhabung, den Transport, das Verarbeiten und die Aufbewahrung der Proben.
Serum
Die Serumproben können 8 Tage lang bei 2-8°C gelagert werden. Werden sie länger gelagert, müssen sie
bei -20°C oder darunter eingefroren werden. Die Proben können maximal 3 Mal eingefroren/aufgetaut werden.
Nach dem Auftauen gut vermischen. Stellen Sie bei Proben sicher, dass sich keine Luftblasen darin befinden;
sollte dies doch der Fall sein, entfernen Sie vor der Analyse alle Luftblasen.
Plasma
Plasmaproben können 8 Tage lang bei 2-8°C gelagert werden. Wenn sie länger gelagert werden, müssen sie
bei -20°C oder darunter eingefroren werden. Das Plasma bei 37°C auftauen. Die Proben nur einmal auftauen.
Nach dem Auftauen gut vermischen. Stellen Sie bei Proben sicher, dass sich keine Luftblasen darin befinden;
sollte dies doch der Fall sein, entfernen Sie vor der Analyse alle Luftblasen.
Probenumfang
Der Probenumfang, der notwendig ist, um einen einzelnen BIO-FLASH Chagas Test durchführen zu können,
variiert je nach Probenbehälter. Für eine Untersuchung sind mindestens 10 µL plus das Totvolumen, das bei
200 µL liegt, wenn die empfohlene Probenschale verwendet wird (REF 3000-8209), notwendig.
Andere Materialien
Die folgenden Materialien sind nicht in der Reagenzkassette enthalten und müssen separat erworben werden.
REF 3000-8600
BIO-FLASH Chagas Calibrators (Kalibratoren)
REF 3000-6001
BIO-FLASH Chagas Controls (Kontrollen)
Für weitere Informationen lesen Sie die jeweiligen Gebrauchsinformationen aufmerksam.
Keine anderen Kalibratoren verwenden. Die Information, die das Instrument BIO-FLASH zur Kalibrierung des
BIO-FLASH Chagas-Assay benötigt, ist in den Strichcodes der Ampullen enthalten.
Das Verwenden von Kontrollen anderer Hersteller kann zu unerwarteten Ergebnissen führen.
Stellen Sie sicher, dass sich in dem Instrument BIO-FLASH ausreichende Mengen der folgenden
Verbrauchsmaterialien befinden, bevor Proben, Kalibrierung oder Kontrollen durchgeführt werden:
REF 3000-8206
BIO-FLASH Cuvettes (Küvetten)
Hinweis: Das Design der Küvetten ist patentgeschützt (US D560, 816 / Design CE 000762984-0001)
REF 3000-8204
BIO-FLASH Triggers (Aktivatoren)
REF 3000-8205
BIO-FLASH System Rinse (Systemlösung)
Instrument / Testdurchführung
Im Benutzerhandbuch von BIO-FLASH finden Sie die kompletten Anweisungen zur Durchführung eines Tests.
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Kalibrierung
Der Strichcode der Kassette enthält eine für die Reagenziencharge gültige Masterkalibrationskurve. Dennoch wird
für alle Reagenzien eine chargenspezifische Kalibrationskurve benötigt, die bis zum Verfalldatum der Charge gilt.
Eine neue Kalibrationskurve ist nötig, wenn die Kontrollergebnisse außerhalb des Akzeptanzbereiches liegen und
wenn Anpassungen am Instrument vorgenommen wurden.
Zur Konfigurierung einer Kalibrationskurve schlagen Sie im Benutzerhandbuch von BIO-FLASH nach.
Qualitätskontrolle
Für eine vollständige Qualitätsprüfung werden zwei Kontrollstufen empfohlen. Dafür sind die BIO-FLASH Chagas
Negativ- und Positivkontrollen vorgesehen. An jedem Anwendungstag sollen die Kontrollen mindestens alle
24 Stunden analysiert werden. Stellen Sie sicher, dass sich die Kontrollergebnisse innerhalb der
Akzeptanzbereiche befinden. Liegt ein Kontrollergebnis außerhalb des Akzeptanzbereiches, kann dies auf
ungültige Testergebnisse hinweisen und der Anwender muss Korrekturmaßnahmen vornehmen. In diesem Fall
müssen alle Ergebnisse, die seit der letzten akzeptablen Qualitätskontrolle des entsprechenden Analyts erhalten
wurden, geprüft werden. Eine erneute Kalibrierung des Instrumentes kann erforderlich werden. Weitere
Informationen siehe Benutzerhandbuch des Instrumentes. Zur Identifizierung und Lösung von ungewöhnlichen
Situationen bei der Qualitätskontrolle wenden Sie sich bitte an Westgard et al.5
Aufbewahrung und Stabilität
Die ungeöffneten Reagenzien bleiben bis zum auf dem Kassettenetikett angegebenen Haltbarkeitsdatum stabil,
wenn sie bei 2-8°C und in vertikaler Lage aufbewahrt werden.
Nach dem Öffnen bleibt die ins Instrument BIO-FLASH eingesetzte oder bei 2-8°C aufbewahrte Kassette
14 Wochen stabil.
Interpretation der Ergebnisse
Die Menge des Analyts in jeder Probe wird durch die Lichtemission (RLU) mittels Interpolation in der eingelesenen
Kalibrationskurve bestimmt. Die Ergebnisse des BIO-FLASH Chagas werden in S/CO (Signal/Cut-Off Verhältnis)
angegeben. Dabei handelt es sich um einen Qualitätstest; die Zahlenwerte des Ergebnisses werden nur für die
Menge der vorhandenen Antikörper angegeben. Die Bestimmung des Anti-Trypanosoma cruzi-Antikörper mit dem
BIO-FLASH Chagas Test wird wie folgt interpretiert:



Proben mit einem Ergebnis < 0,90 S/CO werden als nicht reaktiv (negativ) betrachtet.
Proben mit einem Ergebnis ≥ 0,90 und < 1,00 S/CO werden als unbestimmt (Grauzone) betrachtet.
Proben mit einem Ergebnis ≥ 1,00 S/CO werden als reaktiv (positiv) bewertet.
Proben mit anfänglich reaktiven oder unbestimmten Ergebnissen müssen im Duplikat ein zweites Mal analysiert
werden. Wenn beide Werte der erneuten Prüfung unter 0,90 liegen, ist die abschließende Bewertung des Tests
hinsichtlich Anti-T. cruzi-Antikörpern negativ. Wenn eines der Ergebnisse im Wiederholungstest positiv oder
unbestimmt ist, muss die Probe weiter mit zusätzlichen Tests untersucht werden, um das Ergebnis zu bestätigen.
Ein wiederholt positives Ergebnis deutet auf eine T. cruzi-Infektion hin. Proben mit einer Konzentration von
Anti-T. cruzi-Antikörpern über 400,00 S/CO werden als >400,00 S/CO berichtet.
Einschränkungen
Das Ergebnis einer einzelnen Probe ist nicht ausreichend, um die Chagas-Krankheit zu diagnostizieren. Deshalb
sollten neben den Ergebnissen des BIO-FLASH Chagas andere Daten berücksichtigt werden, wie etwa klinische
Anzeichen, Anamnese, Ergebnisse anderer Untersuchungen und weitere relevante Informationen.
Ein negatives Ergebnis schließt eine T. cruzi-Infektion nicht vollständig aus. Wie bei allen sensitiven Immunassays
können nicht wiederholbare positive Ergebnisse auftreten.
Erwartete Ergebnisse
Die Chagas-Krankheit, die durch den Parasit Trypanosoma cruzi verursacht wird, ist in Lateinamerika beheimatet.
Laut der Weltgesundheitsorganisation (WHO) sind derzeit geschätzte 10 Millionen Menschen mit T. cruzi infiziert,
für mehr als 25 Millionen besteht das Risiko, sich zu infizieren, und mehr als 15.000 sterben jedes Jahr daran. Die
Prävalenzraten von Anti-T.cruzi-Antikörpern variiert in den endemischen Bereichen deutlich. 2005 lagen die Zahlen
zwischen 0,01% in Ecuador und 0.09% in Costa Rica, zwei Ländern, deren gemeldete Ergebnisse durch
Bestätigungstests erhalten wurden, und 8,61% in Bolivien.
Die Prävalenzraten sinken mit der Zeit in allen endemischen Ländern, doch aufgrund der starken Migration der
Bevölkerung und der Tatsache, dass die Menschen nach Europa (hauptsächlich Spanien und Portugal) und
4
Nordamerika strömen, hat sich die Chagas-Krankheit ausgebreitet und ist nun eine globale Angelegenheit.
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Leistungsdaten
HINWEIS: Die folgenden Daten sind repräsentativ; Ergebnisse von Einzelexperimenten können von diesen Daten
abweichen.
Spezifität
Die Bewertung der Spezifität basiert auf Tests von insgesamt 6576 Proben von Blutspendern, einschließlich Serum
und EDTA-Plasma von zwei Blutbanken.
-
2799 Proben stammen von der Banc de Sang i Teixits de Catalunya (Spanien), wobei 1000 von Spendern aus
endemischen Ländern kamen und 1799 nicht nach Herkunftsland ausgewählt wurden.
3478 Proben wurden in Colsan Hemocentro de São Paulo (Brasilien) mit Routinespendern durchgeführt.
Darüber hinaus wurden auch 300 nicht ausgewählte Serumproben aus der Routine eines Krankenhauslabors in
Barcelona (Spanien) ausgewertet.
Die Proben, die wiederholt reaktiv waren, wurden mit zwei kommerziellen Tests erneut geprüft. Dann wurde die
Spezifität bewertet. Die Ergebnisse befinden sich in der unten stehenden Tabelle:
Getestete
Proben
Anfangs
reaktiv
(IR)
wiederholt
Reaktiv
(RR)
RR,
die positiv
bestätigt
wurden
Spezifität
n
n
n
n
%
1000
3
3
0
99,7
1799
5
5
0
99,7
Blutspender aus Colsan Hemocentro
de São Paulo (Brasilien)
3478
8
7
1
99,8
Routineproben von einem
Krankenhauslabor (Barcelona,
Spanien)
300
0
0
0
100,0
Blutspender aus endemischen
Ländern (Banc de Sang i Teixits de
Catalunya, Spanien)
Nicht ausgewählte Blutspender (Banc
de Sang i Teixits de Catalunya, Spanien)
Sensitivität
Die Sensitivität wurde in zwei verschiedenen Bewertungen geprüft:
-
669 Chagas-positive Proben von verschiedenen Gesundheitszentren in Barcelona, von Patienten aus
endemischen Ländern (Guatemala, Honduras, Mexiko, Nicaragua, Argentinien, Bolivien und Brasilien).
Eine Reihe von 300 Proben, von denen 191 positiv und 109 negativ auf Chagas-Antikörper getestet wurden,
wurde im PNCQ (Programa Nacional de Controle de Qualidade, Rio de Janeiro, Brazil) ausgewertet. Diese
Proben stammten aus Brasilien und Bolivien.
Die Sensitivitätsergebnisse werden in der folgenden Tabelle dargestellt:
Getestete
Proben
n
Positiv
Unbestimmt
Negativ
Sensitivität
n
n
n
%
Erste Auswertung
669
660
2
7
99,0
Zweite Auswertung
191
191
0
0
100,0
Präzision
In Übereinstimmung mit den Richtlinien CLSI EP05-A2 wurde die Präzision in den Tests und gesamt (Test zu Test
und Tag zu Tag) in zahlreichen Untersuchungen geprüft. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle
zusammengefasst:
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Mittel (S/CO)
0,30
2,86
0,48
0,85
3,99
Negativkontrolle
Positivkontrolle
Negativprobe
Probe um den Cut-off-Wert
Positivprobe
Im Test
0,01 SD
2,5% CV
0,02 SD
5,7% CV
3,7% CV
Gesamt
0,01 SD
3,1% CV
0,04 SD
7,4% CV
3,9% CV
Reproduzierbarkeit
Wir untersuchten die Reproduzierbarkeit zwischen den Chargen und zwischen Instrumenten mit 50 Proben. Die
folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse:
Charge 2 vs. Charge 1
Instrument 2 vs. Instrument 1
N
Wert
Gefälle
95% KI
Schnittstelle
Wert
95% KI
50
50
0,943
1,041
0,927 bis 0,959
1,027 bis 1,053
-0,242
0,012
-0,658 bis -0,075
-0,010 bis 0,604
Wert
R
95% KI
0,998
0,999
0,997 bis 0,999
0,998 bis 0,999
Interferenzen
Studien in Übereinstimmung mit den Richtlinien CLSI EP7-A haben bewiesen, dass die folgenden potenziell
störenden Substanzen die Ergebnisse des BIO-FLASH Chagas nicht beeinflussen:
Potenziell störende Substanz
Hämoglobin
Indirektes Bilirubin
Direktes Bilirubin
Triglyzeride
Rheumafaktor
Konzentration
500 mg/dL
18 mg/dL
18 mg/dL
1300 mg/dL
800 UI/mL
% Interferenz
≤ 10
≤ 10
≤ 10
≤ 10
≤ 10
Kreuzreaktivität
Es wurden mit BIO-FLASH Chagas insgesamt 105 positive Proben auf eine Reihe Kreuzreagenzien
analysiert. Ein potenzielles Kreuzreagenz ruft eine Kreuzreaktion hervor, wenn die Diagnose von negativ zu
positiv wechselt oder umgekehrt. Die reaktiven Proben wurden mit einem Referenzassay verglichen, bei dem
keine Kreuzreaktionen mit der potenziell beeinflussenden Substanz nachgewiesen wurden. Die Ergebnisse
sind in der unten stehenden Tabelle zusammengefasst:
Potenzielle Kreuzreaktion
ANA (Antinukleäre Antikörper)
anti-HCV (Hepatitis C-Virus)
anti-E.coli
anti-HTLV (Humanes T-lymphotropes Virus)
anti-HBc (Antikörper gegen das Kernantigen der Hepatitis B)
anti-HIV-1 (Humanes-Immundefizienz-Virus)
Malaria
Leishmania
Syphilis
Crithidia lucilliae
Übereinstimmung
15/15
15/15
10/10
15/15
14/15
15/15
24/24
10/11
15/15
14/15
Analytische Sensitivität
Die erzielte analytische Sensitivität betrug < 0,20 IU/mL. Diese wurde bestimmt, indem der Assay-Cut-Off in die
Regressionsgerade eingebunden wurde, der durch den Test serieller Lösungen des WHO First International
Standard für Chagas (TcII)-Antikörper im Humanplasma (NIBSC-Code: 09/186) und des WHO First International
Standard für Chagas (TcI)-Antikörper im Humanplasma (NIBSC-Code: 09/188) erhalten wurde. Die erzielten
Ergebnisse, die anhand zweier verschiedener Chargen erzielt wurden, lagen bei 0,13 bzw. 0,14 IU/mL.
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