Zusammenfassung englisch/deutsch - OvGU

M.Sc. Tobias Lübke - Influence of c-FLIP and A20 on apoptosis regulation
Summary
Programmed cell death mechanisms are essential for multicellular organisms. Apoptosis
plays an important role during embryonic development, in immune homeostasis and the
clearance of altered cells. This type of cell death is tightly regulated by pro- and antiapoptotic proteins, which is necessary to prevent excessive or insufficient killing of cells.
Dysregulated apoptosis leads to various diseases, such as immunodeficiency,
autoimmunity or cancer. c-FLIP proteins are the main inhibitors of receptor-mediated
apoptosis by blocking caspase-8 activation at the level of the death-inducing signalling
complex (DISC). The aim of this thesis was to identify the role of c-FLIP splice variants in
mediating resistance against CD95L-induced apoptosis in renal cell carcinomas and to
characterise the role of A20 in receptor-mediated caspase-8 activation.
Apoptosis is often impaired in tumours due to increased expression of anti-apoptotic
proteins. The role of the anti-apoptotic protein c-FLIP in renal cell carcinoma cell lines was
characterised within this thesis. Strikingly, concurrent loss of all c-FLIP isoforms, by
introduction of shRNA, induced spontaneous apoptosis in all cell lines. Re-expression of
c-FLIPL was sufficient to restore viability, demonstrating the importance of c-FLIP for
mediating survival functions in renal cell carcinoma. CD95 and its ligand CD95L were highly
expressed in all RCC cell lines, compared to TRAIL-R1, TRAIL-R2, TNF-R1 and TRAIL. Further
characterisation of clearCa-4 revealed CD95 aggregation upon cell-cell-contact events.
Blocking of CD95L resulted in spontaneous caspase-dependent cell death. NF- B was
activated in steady-state-conditions and inducible by CD95L. The findings reveal that renal
cell carcinoma cell lines are dependent on c-FLIP expression and CD95 signalling.
The ubiquitin-editing enzyme A20 was previously identified as a binding partner of the
TRAIL-DISC was has also been shown to play a role in caspase activation. In this thesis, the
function of A20 in CD95L-induced apoptosis and its supposed role in the CD95-DISC was
examined. The recently established CRISPR/Cas9 technology was successfully used to
generate of A20 knockout Jurkat cell lines. These cell lines were used to demonstrate that
A20 reduces CD95L-induced apoptosis. While activation of caspase-8 at the level of the
DISC was not impaired, active caspase-8 was targeted for proteasomal degradation by a so
far unknown mechanism. A direct interaction between A20 and caspase-8 was not
identified, proposing an indirect mechanism of A20 on active caspase-8
M.Sc. Tobias Lübke - Influence of c-FLIP and A20 on apoptosis regulation
Zusammenfassung
Der programmierte Zelltod ist ein wesentlicher Bestandteil von mehrzelligen Organismen,
um veränderte oder von Pathogenen infizierte Zellen zu entfernen. Er kann anhand von
biochemischen und phänotypischen Merkmalen in verschiedene Arten unterteilt werden,
unter anderem Apoptose, Pyroptose, autophagischer Zelltod und Nekroptose. Dabei ist
die Apoptose unter anderem während der Embryoentwicklung und bei der
Herunterregulierung der Immunantwort nach einer Infektion essentiell. Apoptose ist ein
streng kontrollierter Zelltod-Mechanismus, der durch extrinsische und intrinsische Signale
ausgelöst werden kann. Zu den intrinsischen Signalen gehören z.B. DNA-Schäden und UVStrahlung. Extrinsische Apoptose wird durch Todesliganden initiiert, welche an ihre
entsprechenden Rezeptoren binden. Dabei wird der Tod-induzierende Signalkomplex
(death-inducing signalling complex (DISC)) formiert, welcher aus Todesrezeptor (z.B. CD95),
Adaptermolekühl (z.B. FADD) und Caspase-8 oder Caspase-10 besteht. Beide Signalwege
führen zur Aktivierung von Caspasen und schließlich zum Tod der Zelle durch DNAFragmentierung und den Abbau der Mitochondrien. Im Gegensatz zu anderen Zelltodarten,
generieren apoptotische Zellen durch die Ausschüttung von anti-inflammatorischen
Cytokinen ein Umfeld, welches die Aktivierung des Immunsystems verhindert. Die
Rezeptor-vermittelte Apoptose wird vor allem am DISC durch das anti-apoptotische Protein
c-FLIP reguliert. c-FLIP wird in menschlichen Zellen als drei verschiedene Isoformen, c-FLIPL,
c-FLIPS und c-FLIPR, exprimiert. Alle Isoformen verhindern die Caspase-Aktivierung,
während c-FLIPL jedoch auch pro-apoptotische Eigenschaften aufweist und zusätzlich den
NF- B-Signalweg aktiviert. Fehlregulationen des apoptotischen Signalweges führen zu
Krankheiten wie erworbenes Immundefektsyndrom (acquired immunodeficiency
syndrome (AIDS)), autoimmunes lymphoproliferatives Syndrom (ALPS) und zur Ausbildung
von Tumoren. Tumorerkrankungen sind das Ergebnis verminderter Ausführung von
Apoptose, häufig im Zusammenhang mit erhöhter Expression von anti-apoptotischen
Proteinen wie c-FLIP. Veränderte Zellen verhindern dadurch die Auslösung der Apoptose
durch Immunzellen und entwickeln sich so zu Tumoren.
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In dieser Arbeit wurde der Einfluss des anti-apoptotischen Proteins c-FLIP auf CD95Linduzierte Apoptose in vier Nierenkarzinom-Zelllinien untersucht. Die Stimulation mit
CD95L war nicht ausreichend um Apoptose in den Zelllinien auszulösen. Der
Translationsinhibitor Cycloheximid reduzierte die Expression von c-FLIP und teilweise auch
Bcl-x und sensibilisierte alle Zelllinien für CD95L-induzierte Apoptose. Bei spezifischer
Herunterregulierung der c-FLIP-Proteine c-FLIPL, c-FLIPS und c-FLIPR durch lentiviralvermittelte shRNA wurde ein seltener Phänotyp beobachtet. Zellen, die kein c-FLIP mehr
exprimierten, starben innerhalb weniger Tage und ohne weitere Stimulation durch
Caspase-vermittelte Apoptose. Der Zelltod wurde unter anderem mittels Färbung aktiver
Caspase-3, dem Nachweis von DNA-Fragmentierung und durch AnnexinV/7AAD-Färbung
bestätigt. Der Verlust von nur einer c-FLIP-Isoform (c-FLIPL oder c-FLIPS) löste diesen
spontanen Tod nicht aus. Die Zugabe eines Caspaseinhibitors sowie die Re-Expression einer
mutierten c-FLIPL-Variante waren ausreichend, damit Zellen ohne natürlich exprimiertes
c-FLIP überlebten. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass c-FLIP essentiell für
Nierenkarzinomzellen ist und die Expression einer Isoform ausreichend ist. Der
Todesrezeptor CD95 und sein Ligand CD95L wurden an der Oberfläche aller
Nierenkarzinom-Zelllinien in hohem Maße exprimiert. Im Gegensatz dazu war eine
Expression der Todesrezeptoren TRAIL-R1, TRAIL-R2, TNF-R1 sowie des Todesliganden
TRAIL nicht einheitlich und meist gering. Fluoreszenzmikroskopische Analysen zeigten auf,
dass CD95 bei Zell-Zell-Kontakten aggregierte, welche im stationären Zustand jedoch nicht
zu einer nachweisbaren Ausbildung des CD95-DISC führte. Eine Analyse des NF- BS
N
I B
dieser im stationären Zustand bereits aktiviert war und durch Stimulation mit
rekombinantem CD95L zusätzlich aktiviert wurde. Die Blockierung des CD95-Signalweges
durch funktionelle Antikörper induzierte, ähnlich wie beim Verlust von c-FLIP, einen
Caspase-vermittelten Zelltod innerhalb weniger Stunden, welcher ebenfalls durch die
Blockade von Caspaseaktivität verhindert wurde. Zusammenfassend wurde aufgezeigt,
dass c-FLIP und der CD95-Signalweg essentiell für das Überleben der in dieser Arbeit
untersuchten Nierenkrebs-Zelllinien sind. Die Ergebnisse dieser Arbeit können dazu
beitragen neue Therapieformen für Nierenkrebs zu entwickeln, indem man den CD95Signalweg oder die Expression bzw. Wirkungsweise von c-FLIP blockiert.
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Das Ubiquitin-modifizierende Protein A20 wurde vor Kurzem mit der Rezeptor-vermittelten
Apoptose in Verbindung gebracht. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von A20 auf den
CD95-Signalweg untersucht. Eine spezifische Translokation von A20 an den CD95-DISC
konnte nicht nachgewiesen werden. Jedoch hatten Zelllinien, in denen die Expression von
A20
mittels
CRISPR/Cas9-Technologie
ausgeschaltet
worden
ist,
eine
höhere
Sterblichkeitsrate als Wildtyp-Zellen. Während in Wildtyp- und A20-defizienten Zellen die
Abnahme von Pro-Caspase-8 einheitlich war, wurde in den A20-defizienten Zellen mehr
aktive Caspase-8 und aktive Caspase-3 nachgewiesen als in Wildtyp-Zellen. Außerdem war
die Spaltung von c-FLIPL zu p43-FLIP in beiden Zelllinien gleich, welches ebenfalls auf eine
unveränderte Caspase-Aktivierung schließen lässt. Die Blockade des 26S-Proteasoms,
welches K48-ubiquitinierte Proteine abbaut, erhöhte die Menge von aktiver Caspase-8 und
aktiver Caspase-3 in Wildtyp-Zellen auf das Niveau der A20-defizienten Zellen. Eine
Bindung von A20 an Caspase-8 und dessen Spaltungsprodukte konnte weder im
stationären Zustand noch nach CD95L-Stimulation nachgewiesen werden. Auch
Unterschiede im Ubiquitinierungsmuster von Caspase-8 und aktiver Caspase-8 wurden
nicht dokumentiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen auf, dass A20 einen negativregulierenden Einfluss auf CD95L-vermittelte Apoptose hat. Dieser Einfluss beruht
wahrscheinlich auf einer indirekten Einwirkung auf aktivierte Caspase-8, jedoch nicht auf
die Proform von Caspase-8. Weitere Untersuchungen sind nötig, um die Wirkungsweise
von A20 in CD95-induzierter Apoptose und Caspase-Aktivierung aufzuschlüsseln.
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