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University of Groningen Engineering approaches to investigate pneumococcal gene expression regulation and antibiotic resistance development Sorg, Robin IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2016 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Sorg, R. (2016). Engineering approaches to investigate pneumococcal gene expression regulation and antibiotic resistance development [Groningen]: Rijksuniversiteit Groningen Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date: 18-05-2017 Dutch Summary Nederlandse Samenvatting Bacteriën en microbiota Bacteriën zijn de meest oorspronkelijke vorm van leven, maar desalniettemin veruit de succesvolste. Het gebruik van de verzamelterm bacteriën is misleidend, omdat de verwantschap tussen twee willekeurig gekozen bacteriestammen vaak kleiner is dan de verwantschap tussen mens en cactus. Bacteriën worden vooral waargenomen wanneer zij problemen als infectieziekten veroorzaken, maar desondanks spelen ze in het algemeen een positieve rol bij de menselijke gezondheid. Op de huid en slijmvliezen en in het spijsverteringskanaal leeft een verscheidenheid aan bacteriën die qua aantallen gelijkwaardig zijn aan de lichaamseigen cellen. Deze bacteriën, de zogenaamde microbiota, leveren een bijdrage aan vitale processen als de spijsvertering, de verdediging tegen pathogenen en de stimulatie van het immuunsysteem. De coëxistentie van mens en microbiota is het resultaat van een millennia durende evolutionaire wisselwerking. Enerzijds worden bacteriën die zich niet kunnen verdedigen tegen het immuunsysteem geleidelijk uitgeroeid. Anderzijds zorgen de bacteriën die het immuunsysteem permanent overbelasten voor het overlijden van de drager en verkleinen daarmee hun eigen kans op voortbestaan. De beschreven selectieprocedure moet niet gezien worden als een afgerond proces, maar als een voortdurend uitbalanceren van de machtsverhoudingen tussen mens en microbiota. Pneumokokken en infectieziekten De pneumokok is een voorbeeld van een dergelijke bacterie die zich reeds gedurende millennia in een wisselwerking van wederzijdse aanpassingen met de mens bevindt. Ze leven in de nasofarynx (de neuskeelholte) en komen voor bij bijna alle kinderen en bij ongeveer één op de tien volwassenen. Pneumokokken kunnen van mens op mens worden overgedragen via druppels speeksel, bijvoorbeeld bij hoesten of niezen. Over het algemeen veroorzaken ze geen problemen; dragers zijn zich niet bewust van hun aanwezigheid en hebben geen klachten. Bij een onontwikkeld immuunsysteem, of bij een immuundeficiëntie kan de pneumokok echter van een onschuldige bewoner in een potentieel dodelijk pathogeen veranderen. Hierbij is het cruciaal dat de bacterie niet voldoende wordt - 163 - MISCELLANEOUS gehinderd tijdens zijn verspreiding in de drager. In dat geval kan hij vanuit de nasofarynx ook de steriele aangrenzende weefsels en organen als het middenoor (otitis media, middenoorontsteking), de sinus (sinusitis, bijholteontsteking) en via de luchtwegen ook de longen (pneumonia, longontsteking) bereiken. Bovendien kan de bloedstroom besmet raken (sepsis, bloedvergiftiging) en via deze weg ook de hersenvliezen (meningitis, hersenvliesontsteking). Interessant is dat geen van de beschreven ziektebeelden een verdere verspreiding van de bacterie bevordert. Acute infecties met pneumokokken veroorzaken elk jaar meer dan een miljoen doden, die vooral bij zuigelingen in derdewereldlanden worden waargenomen. Antibiotica en weerstand In westerse landen worden pneumokokken voor een aanzienlijk lager aantal sterfgevallen verantwoordelijk gehouden. Dit is vooral te verklaren door een betere toegang tot preventie en behandeling, zoals vaccinatieprogramma's en antibioticaverstrekking. Echter, juist antibiotica worden steeds minder effectief vanwege een dramatische toename van resistentie in vele pathogenen, waaronder de pneumokok. Er wordt voorspeld dat antibioticaresistentie de menselijke gezondheid in acuut gevaar zal brengen wanneer we in de nabije toekomst geen gebruik meer kunnen maken van behandelingsmethoden die tegenwoordig nog effectief zijn. Het begrijpen van resistentie en de verspreiding ervan is dan ook een wetenschapsgebied van groot belang en een deel van dit proefschrift is gewijd aan dit onderwerp. Resistenties verrijken zich in een specifiek venster van antibioticumconcentraties, waarin de meerderheid van de bacteriën onderdrukt wordt en alleen bacteriën met een gunstige mutatie kunnen groeien. We hebben het effect van deze concentratievensters op pneumokokken systematisch onderzocht met verscheidene gangbare antibiotica. Met behulp van microscopie waren we in staat om de fatale gevolgen van de behandeling met antibiotica te volgen in time-lapse video’s. We ontdekten daarbij dat bacteriën met dezelfde genetisch oorsprong een verschillende antibioticagevoeligheid kunnen hebben en dat het voorkomen van individuele tolerante bacteriën een beslissende invloed op de ontwikkeling van genetische resistentie hebben. Voorts konden we een speciaal resistentiemechanisme identificeren, waarbij in gemengde bacteriepopulaties, genetisch gevoelige bacteriën beschermd worden door genetisch resistente bacteriën. Dit resulteert in het risico dat de aanwezigheid van resistentie bij schadeloze bacteriën in de microbiota de behandeling van niet-resistente pathogenen bemoeilijkt. - 164 - DUTCH SUMMARY Synthetische biologie Daarnaast focust dit proefschrift zich op fundamenteel onderzoek om genregulatie door pneumokokken te begrijpen, onder andere met betrekking tot de ontwikkeling van pathogene verschijningsvormen. Ziekmakende bacteriën van de lichaamseigen microbiota zijn eigenlijk paradoxaal, omdat verzwakte dragers minder sociale contacten onderhouden waardoor de kans op verspreiding van de bacteriën kleiner wordt. Niettemin moeten bacteriën van de microbiota tot op zekere hoogte in staat zijn het immuunsysteem te weerstaan om te overleven in het menselijk lichaam. Dit wordt gewaarborgd door specifieke genen die als virulentiefactoren worden aangemerkt. Pneumokokken kunnen deze genen "aan- en uitzetten", zodat een veelvoud aan onderscheidbare individuele cellen geproduceerd wordt, die door het immuunsysteem op verschillende manieren bestreden moet worden. In het laboratorium is het moeilijk om de invloed van dergelijke differentiatiepatronen te onderzoeken, omdat het onmogelijk is het complexe milieu in het menselijk lichaam exact na te bootsen. Een alternatieve benadering is om kunstmatig regulerende netwerken te bouwen die reageren op signalen die gemakkelijk in het laboratorium te controleren zijn. Deze benadering vertegenwoordigt een ingenieursaanpak binnen de moleculaire biologie en valt onder de synthetische biologie. In dit proefschrift beschrijven we de opbouw van eenvoudige kunstmatige reguleringseenheden en hun functionaliteit. Hiermee is een basis voor de synthetische biologie in pneumokokken gelegd, waarop andere studies kunnen voortbouwen. In het kader van het beter begrijpen van ziekteverwekkers kunnen zo effectievere behandelmethodes worden ontwikkeld. - 165 - - 166 - German Summary Deutsche Zusammenfassung Bakterien und Mikrobiota Bakterien stellen die ursprünglichste und nach wie vor die bei weitem erfolgreichste Form des Lebens dar. Der Sammelbegriff Bakterien ist dabei irreführend, da der Verwandtschaftsgrad zwischen zwei zufällig ausgewählten Bakterienstämmen oftmals weniger groß ist als zwischen Mensch und Kaktus. Bakterien werden vor allem wahrgenommen wenn sie Probleme verursachen, wie zum Beispiel im Falle von Infektionskrankheiten. Im Allgemeinen spielen Bakterien jedoch eine positive Rolle für die menschliche Gesundheit. Auf der Haut, den Schleimhäuten und innerhalb des Verdauungstraktes beherbergen wir eine Vielzahl von Bakterien, die in ihrer Gesamtzahl sogar die körpereigenen Zellen übertreffen. Diese Bakterien, Mikrobiota genannt, tragen zu wichtigen Prozessen bei, wie zum Beispiel zur Verdauung, zur Abwehr von Krankheitserregern und zur Stimulierung des Immunsystems. Die Koexistenz von Mensch und Mikrobiota ist das Ergebnis einer Jahrtausende andauernden evolutionären Gratwanderung. Auf der einen Seite wurden Bakterien, die sich dem Immunsystem nicht widersetzen konnten, nach und nach eliminiert. Auf der anderen Seite führten Bakterien, die das Immunsystem dauerhaft überforderten, zum Versterben ihrer Träger, und somit auch zu einer verringerten eigenen Ausbreitung. Der so beschriebene Selektionsprozess ist dabei nicht als abgeschlossenes Ereignis zu verstehen, sondern als ein beständig fortlaufendes Austarieren der Kräfteverhältnisse zwischen Mensch und Mikrobiota. Pneumokokken und Infektionskrankheiten Pneumokokken sind ein Beispiel für ein solches, sich über Jahrtausende mit dem Menschen gegenseitig anpassendes Bakterium. Sie besiedeln den oberen Nasenrachenraum und kommen in fast allen Kindern und zudem in etwa einem von zehn Erwachsenen vor. Die Weitergabe von Mensch zu Mensch erfolgt über Tröpfcheninfektion. Pneumokokken verursachen im Allgemeinen keine Probleme; Träger sind sich ihrer Anwesenheit nicht bewusst und haben keinerlei Beschwerden. Im Falle eines nicht ausgereiften Immunsystems oder bei einer Immunschwäche können sich Pneumokokken jedoch vom harmlosen Bewohner zum potentiell tödlichen Pathogen wandeln. Entscheidend ist dafür, dass das Bakterium nicht ausreichend an seiner Ausbreitung innerhalb des Trägers gehindert wird - 167 - MISCELLANEOUS und von seinem natürlichen Habitat des Nasenrachenraumes aus in steriles Gewebe vordringen kann. Die angrenzenden Gewebe und Organe sind dabei das Mittelohr (otitis media, Mittelohrentzündung), der Sinus (sinusitis, Nebenhöhlenentzündung) und über die Atemwege zudem die Lunge (pneumonia, Lungenentzündung). Des Weiteren kann die Blutbahn befallen werden (sepsis, Blutvergiftung) und auf diesem Wege auch die Hirnhaut (meningitis, Hirnhautentzündung). Interessanterweise fördert keines der beschriebenen Krankheitsbilder eine weitere Verbreitung des Bakteriums. Akute Infektionen mit Pneumokokken verursachen jährlich über eine Million Todesfälle, welche vor allem in Dritte-Welt-Ländern bei Kleinkindern zu verzeichnen sind. Antibiotika und Resistenzen In westlichen Ländern werden Pneumokokken für eine deutlich geringere Anzahl an Todesfällen verantwortlich gemacht. Dies lässt sich vor allem mit einem besseren Zugang zu Präventions- und Behandlungsmethoden erklären, wie zum Beispiel Impfprogramme und Antibiotikavergabe. Gerade Antibiotika zeigen allerdings eine zunehmend geringere Wirksamkeit, die durch einen dramatischen Anstieg an Resistenzen in vielen Pathogenen, einschließlich der Pneumokokken, verursacht wird. Es wird prognostiziert, dass Antibiotikaresistenzen die menschliche Gesundheit in eine akute Gefahrenlage bringen könnten wenn auf die derzeit effektiven Behandlungsmöglichkeiten in naher Zukunft kein Verlass mehr sein wird. Das Verständnis von Resistenzen und ihrer Ausbreitung ist daher ein wissenschaftliches Feld von großer Bedeutung und ein Teil dieser Doktorarbeit widmet sich dieser Thematik. Resistenzen reichern sich in einem speziellen Antibiotikakonzentrationsfenster an, in welchem ein Großteil der Bakterien unterdrückt wird, und nur Bakterien mit einer vorteilhaften Mutation wachsen können. Die Auswirkungen dieses Konzentrationsfensters auf Pneumokokken haben wir systematisch mit einer Vielzahl gängiger Antibiotika untersucht. Anhand von Mikroskopie konnten wir die fatalen Auswirkungen einer Antibiotikabehandlung in Zeitraffervideos verfolgen. Dabei entdeckten wir, dass Bakterien des selben genetischen Ursprungs unterschiedliche Antibiotikaempfindlichkeiten aufweisen können, und dass das Auftreten einzelner toleranter Bakterien entscheidend die Entwicklung genetischer Resistenzen beeinflusst. Des Weiteren konnten wir einen speziellen Resistenzmechanismus identifizieren, bei welchem innerhalb gemischter Bakterienpopulationen genetisch anfällige Bakterien von genetisch resistenten Bakterien mit beschützt werden. Dadurch ergibt sich die Gefahr, dass die Präsenz von Resistenzen in harmlosen Bakterien der Mikrobiota die Behandlung von nicht-resistenten Pathogenen erschwert. - 168 - GERMAN SUMMARY Synthetische Biologie Das zweite Augenmerk dieser Doktorarbeit liegt auf Grundlagenstudien zum Verständnis der Genregulation von Pneumokokken, unter anderem in Bezug auf die Entwicklung des pathogenen Erscheinungsbildes. Krankmachende Bakterien der körpereigenen Mikrobiota sind eigentlich ein Paradox, da geschwächte Träger weniger Sozialkontakte pflegen und sich somit auch die Ausbreitungsmöglichkeiten des Bakteriums verringern. Nichtsdestotrotz müssen sich Bakterien der Mikrobiota dem Immunsystem ein Stück weit widersetzen können um innerhalb des menschlichen Körpers zu überleben. Dies wird durch spezielle Gene gewährleistet welche als Virulenzfaktoren bezeichnet werden. Pneumokokken können diese Gene „an- und ausschalten“, wodurch eine Vielzahl unterschiedlich ausgeprägter Einzelzellen entsteht, welche vom Immunsystem auch unterschiedlich bekämpft werden müssen. Im Labor kann der Einfluss solcher Differenzierungsmuster nur schwer untersucht werden, da es unmöglich ist die komplexen Umweltbedingungen innerhalb des menschlichen Körpers vollständig nachzubilden. Ein alternativer Ansatz dazu ist es, künstliche Regulationsnetzwerke aufzubauen, die auf Signale reagieren welche im Labor einfach zu kontrollieren sind. Diese Herangehensweise stellt einen ingenieurswissenschaftlichen Ansatz innerhalb der Molekularbiologie dar und ist dem Feld der Synthetischen Biologie zuzuordnen. In dieser Doktorarbeit beschreiben wir den Aufbau einfacher künstlicher Regulationseinheiten und deren Funktionalität. Damit ist ein Grundstein für Synthetische Biologie in Pneumokokken gelegt, auf den weitere Studien aufbauen können. Im Zuge eines besseren Verständnisses des Krankheitserregers können so effektivere Behandlungsmethoden entwickelt werden. - 169 - - 170 - Acknowledgements Dankwoord Behind every PhD thesis there is a story. Here I would like to tell mine. And thank the many people involved along the way. The first scientific experiments I carried out, or in other words the first bricks of the foundation of this thesis, took place during my undergraduate studies at the University of Freiburg. My lab partner of that time, Stefan Zoufaly, would still be my first choice for investigating any phenomenon, natural or supernatural. I am equally grateful for the reliable example provided by Adam Hilfrich of how to better not carry out an experiment, and yet obtain the same result. These first practical experiences were extended during my Erasmus exchange year at the University of Manchester, where I signed up for a project in the lab of Cay Kielty. Under the entertaining supervision of the very patient Simon Stephan I learned how to genetically engineer mammalian cells towards expressing elastin fragments, and furthermore how to accustom human cells to English beer (mostly unsupervised). I followed up on working with mammalian cells during a summer internship at the University of Dundee in the lab of Angus Lammond, whom I am grateful for providing free accommodation and a set of juggling balls. My great teacher there, Andrea Pawellek, introduced me to RNA interference as a tool to study the activity of splicing factors. For both mentioned projects my contributions were quite certainly more harm- than helpful, so many thanks for enabling me these first-hand experiences of how to explore the multitude of things that can go wrong during a scientific experiment. In the following I was accepted for a master of biotechnology at the ESBS in Strasbourg and teamed up for this French rollercoaster of experimentation with my tandem partner (binôme) Albin Simoni (Al-binôme and Ro-binôme). I would also like to acknowledge our great journal club from the time in Strasbourg, Le Castellet, with the permanent members Pierre Boccon-Gibod and François Cesbron, and temporary members including Johannes Kuegler. One day on campus, Randy Rettberg gave a lecture about iGEM and Synthetic Biology, and we were immediately hooked. The next year we formed a student-run team including Manuel Gersbacher, Marius Müller, Katja Karstens and Paul Bourgine, and developed a concept for a cell division counter in baking yeast. We presented this project at the MIT in Boston and were awarded a bronze medal, which our professors - 171 - MISCELLANEOUS back home interpreted as a third place (a misunderstanding we did not resolve). Also, we were awarded the brick stone-colored biobrick from MIT. It was the same year that Groningen participated for the first time in iGEM, with a team including five future MolGen PhD candidates. For my master’s thesis I joined the lab of Massimo Morbidelli at the ETH Zürich, whom I am grateful for support in many ways. I spent one year at the Institute for Chemical and Bioengineering, which offers a fantastic environment for doing science, and also beyond science, and even the combination, such as the annual skiing lab retreat in the Swiss Alps. My project there, under the supervision of the very helpful Timm Tanzeglock and Miroslav Soos, focused on shear stress during cell culture and its influence on the efficiency and quality of monoclonal antibody production. This was done with a novel reactor type of remarkable design, the Lobed Taylor-Couette Bioreactor (resembling a Wankel rotary engine), and in collaboration with an industrial partner close to Lausanne. My third supervisor at the ETH, Thomas Müller-Späth, introduced me to HPLC as a technique to analyze the glycosylation patterns of antibodies, and furthermore to the art of joyfully diving into any scientific riddle without hesitation in search for creative solutions. Thanks a lot Tomek, for the ‘Jugend forscht’ spirit and much more. After the impressive experience in Zürich I had no doubts about continuing in research. I was especially amazed by the idea of genetically engineering organisms towards new functions and searched for a PhD position that would allow for potential real-life applications. I finally decided to join the Molecular Genetics group at the University of Groningen, where I would have the opportunity to work with a major bacterial pathogen, the pneumococcus, and on the basis of a freely interpretable project description, “do something with Streptococcus pneumoniae”. My supervisor there was going to be the new and highly praised tenure tracker Jan-Willem Veening. Looking back, it was an excellent decision to join MolGen, and JW delivered on the promise, more than that. It has been an exciting time JW, I enjoyed it a lot working with you. You have been a great PI and guided many of my projects with your splendid scientific Fingerspitzengefühl into safe harbor. Also, I think we were a very good team, whenever there were two possible perceptions of an issue we most often had both of them covered. Nevertheless, we always found a good solution in the end, even if we had to play rock-paper-scissors for some minor decisions that we could not resolve in any other way. Thank you very much for all your support. I would also like to express my gratitude to Oscar Kuipers, for the initial invitation to come to Groningen and join the Molecular Genetics group. MolGen provides a fantastic environment, not only for doing research, but also as an international community of people - 172 - ACKNOWLEDGEMENTS from all around the world becoming friends. This is made possible because of you Oscar, I am not sure how you do it but you are clearly pulling the strings. Your enthusiasm seems unstoppable and I always enjoyed our discussions. I would furthermore like to acknowledge the other key members who make MolGen such a successful group and pleasant working environment, thank you very much Jan Kok, Gert Moll, Anne Hesseling, Harma Karsens, Siger Holsappel and Anne de Jong. And also a big thank you to our great secretaries and kitchen staff who do a fantastic job in keeping our group running on smoothly. A great deal of things I learned during my time in Groningen I learned from my students. Being able to explain really forces you to understand, and Melinde Wijers, Marlies Oomen, my younger brother Moritz Sorg and Stefany Moreno made sure that I really understood (even the things I did not notice being there in the first place). The same accounts for the iGEM teams I helped supervising. My own iGEM participation, as a student, played an important role in shaping my research interest, and it was great to be continuously involved in this community, and even to have the opportunity of acting as a judge during the European Jamborees. Some of the projects I was involved in were part of multidisciplinary collaborations, and I would like to acknowledge our collaborators. Thank you Prasanna Bhogale, Johannes Berg, Sander van Doorn, Leo Lin and Victor Nizet. It has been a great learning experience and a great pleasure seeing our projects develop over time. I would furthermore like to thank all anonymous reviewers. We did not always have a perfect (unilateral) relationship, but in the end I must confess that most of your comments were perfectly justified, and I am thankful for your effort of creating valuable feedback. Thank you for enabling us to publish much better and far more solid stories than the initial submissions. Life in Groningen can be tough, especially when you are new in town, the winter is cold and you are looking for a place to stay. But everything becomes much brighter with a fun person to share a house with. Katrin, we had quite a ride over the years, this entire experience would have been quite different without you. Thank you for many extensive discussions about the richness and diversity of Dutch culture, for great food and company, for this exclusive insight into a squirrel’s life. Also a big thanks to my other house mate Yoshi. Thank you for your reliability and patience, for your humor in handling lost-intranslation moments, and especially for complimenting my Kartoffelsalat and having it for breakfast. The times at work that I enjoyed the most were probably when we skipped out to do sports. Thanks a lot to all my sport mates, to the tennis champion (and translation artist) Jelle, to the squash talent Auke, to the racing bike aces Ruud and Martijn, and to all - 173 - MISCELLANEOUS members of our Eurasian table tennis club including Chenxi, Yi and Zhibo. And a big thank you to my (beach) volleyball buddy Tom, for all the integration efforts, for dressing up as Batman and taking me along as Robin, and most importantly for making me a member of De Koningen uit Groningen. Of course I enjoyed the time of serious work just as much, especially in the higher spheres of the 8th floor. I was lucky to have found great office mates, including Dimitra, Xue, Clement and Sulman. It was a pleasure sharing an office with you, thank you so much for sweets, coffee and tea, for helping me choosing the right color of figures and pretending to notice a difference since the last time I asked. I really enjoyed sharing an office with you. It is a pity that we never really had the chance of getting to know each other, but the rules were just very strict – no talking in office! Whenever the silence in the office became unbearable it was great to interact with people in the lab, and I remember many amazing conversations that left few topics untouched. I always appreciated it to be surrounded by friends instead of merely colleagues, so a big thank you for creating a fantastic atmosphere to Laeti, Morten, Pamela, Rieza, Arnau, Renske, Lance, Stefano, Mikkel, and to all the other pneumos. And of course also to our Bollywood/Lollywood dream team Afzal and Irfan. Thank you for great company during many working weekends, and for helping out whenever help was needed. When I started at MolGen, I had the feeling of joining an essentially Dutch group, spiced up with many international additions. It was a time when social activities where often spearheaded by our PIs, such as the daily ritual of playing the infamous coffee game (that I lost on my very first day), the Bier und Gemütlichkeit (BUG) journal club on Friday afternoons, building an igloo when we once had tons of snow (during half a working day), celebrating Sinterklaas together in private homes, etc. The group spirit was amazing and it seemed to me, as a newcomer, as if everybody would have always been there already, including Wout, Julio, Imke, Robyn, Tomas, Ana, Akos, Bogusia, Ganesh, Claire, Rustem, Tariq and Joao. With myself, and “shortly” after me, another group of legendary MolGen characters arrived, including Jeroen, Manolo, Lieke, Tonia, Mirjam, Sjoerd, Marielle, Andrius, Liang and Dongdong. I have great memories of that time, of bad-film-nights, of pub quizzes in Assen, of barbeques at the Hoornse Plas, of Koninginne Nights and Days, of having sushi all-you-can-eat, of going to the Sneak Preview. Many things have changed since then, but luckily the Twaalf Uurtje has not. Also, with –from my perspective– all the later upcoming group additions the atmosphere continued staying spectacular, and many anecdotes could be told, such as “everyone bring a barbeque” or “the chemical banana flavor originates from an extinct - 174 - ACKNOWLEDGEMENTS banana species”. Thank you for many hilarious moments Barbara, Angel, Patri, Maike, Ard Jan, Anne-Stéphanie, Elrike, Luiza, Taketo, Jingjing, Jason, Qian, Xin, and also our latest group additions Jhonatan and Chunxu. I would furthermore like to thank the many students and guests that left a mark on the group, especially the (former) students of the pneumo team including Vijay, Sebastiaan, Chris, and many more. In and around University, I would like to thank a couple of friends I enjoyed spending time with, including our Tatort team Hajö and Markus, Rama, Gosia, Matt, Bastian, Brenda, and also my friends from the Noord Nederlands Orkest – Kirsche, Lianne and Justyna. And, of course, I would like to say a big thank you accompanied by a big kiss to Suzi. Thank you for bearing me. And for all the soup. Finally, I want to thank my bikes. Blue Flash, you gave me wings. You were the dearest bike I ever had. I hope you will treat your new owner, the one who ‘found’ you, no better than you treated me. Yellow Flash, I see a shiny future ahead of us. Coming towards the end brings me back to the beginning. I want to thank my friends from back home, for taking me out of this splendid village I grew up in and out of this beautiful city nearby, for enabling me to discover what lies beyond the Black Forest. Thank you Adrien, my French partner in crime. Thank you Wendelin, my Dutch partner in crime. Thank you Hannes, my American partner in crime. And thank you Elias, my round-theworld partner in crime. And one more thanks to my oldest friend Stephan, for taking me back to where I come from, and for the numerous visits up in the flat lands. Last but not least, I want to thank my family, my parents and my three brothers and my Oma from Freiburg. You happen to be the best family I have ever seen or heard of, and I consider myself extremely lucky for being a part of it. Without you, this thesis could not have been written. Also, please stop asking questions and start reading the thesis already. - 175 - MISCELLANEOUS List of Publications Thesis Publications Sorg R.A. & Veening J.-W. Synthetic biology tools to control gene expression in Streptococcus pneumoniae. In preparation for submission. Sorg R.A., Lin L., van Doorn G.S., Sorg M., Olson J., Nizet V. & Veening J.-W. Collective resistance in microbial communities by intracellular antibiotic deactivation. Under revision for PLoS Biology. Sorg R.A. & Veening J.-W. Microscale insights into pneumococcal antibiotic mutant selection windows. Nature Communications, Vol. 6, No. 8773 (2015). Sorg R.A., Kuipers O.P. & Veening J.-W. Gene expression platform for synthetic biology in the human pathogen Streptococcus pneumoniae. ACS Synthetic Biology, Vol. 4, No. 3 (2015). Bhogale P.*, Sorg R.A.*, Veening J.-W. & Berg J. What makes the lac-pathway switch: identifying the fluctuations that trigger phenotype switching in gene regulatory networks. Nucleic Acid Research, Vol. 42, No. 18 (2014). *These authors contributed equally to this work. Siebring J., Sorg R.A., Herber M. & Kuipers O.P. Take it or leave it: mechanisms underlying bacterial bistable regulatory networks. Bacterial Regulatory Networks, edited by Filloux A.A.M., Horizon Scientific Press (2012). Other Publications Jørgensen M.G., Sorg R.A. & Veening J.-W. Gene expression noise in Streptococcus pneumoniae. In preparation for submission. Liu X., Gallay C., Kjos M., Domenech A., Slager J., van Kessel S.P., Knoops K., Sorg R.A., Zhang J.-R. & Veening J.-W. Assigning function to essential genes in Streptococcus pneumoniae using CRISPRi. In preparation for submission. - 176 - LIST OF PUBLICATIONS Moreno-Gámez S., Sorg R.A., Kjos M., Weissing F.J., van Doorn G.S. & Veening J.-W. Quorum sensing integrates environmental cues, cell density and cell history to control bacterial competence. Under review for Nature Communications. Daszczuk A., Dessalegne Y., Drenth I., Hendriks E., Jo E., van Lente T., Oldebesten A., Parrish J., Poljakova W., Purwanto A.A., van Raaphorst R., Boonstra M., van Heel A., Herber M., van der Meulen S., Siebring J., Sorg R.A., Heinemann M., Kuipers O.P. & Veening J.-W. Bacillus subtilis biosensor engineered to assess meat spoilage. ACS Synthetic Biology, Vol. 3, No. 12 (2014). Sorg R.A., Tanzeglock T., Soos M., Morbidelli M., Périlleux A., Solacroup T. & Broly H. Minimizing hydrodynamic stress in mammalian cell culture through the lobed TaylorCouette bioreactor. Biotechnology Journal, Vol. 6, No. 12 (2011). - 177 -
