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BIOCHEMIEPRAKTIKUM I: ANALYSE VON BIOMOLEKÜLEN
PLATZ 1:
MESSUNG VON ENZYMAKTIVITÄTEN UND METABOLITKONZENTRATIONEN
Die Messung von Enzymaktivitäten und Metabolitkonzentrationen mit Hilfe des optischen Tests nach
Warburg ist eine Routinemethode im biochemischen und klinisch-chemischen Labor. Auch Enzymreaktionen, an denen NADH und NAD+ bzw. NADPH und NADP+ nicht direkt beteiligt sind,
können via Hilfsreaktionen mit den photometrisch messbaren Redoxreaktionen gekoppelt werden
(gekoppelter Enzymassay im Exp. 1.8). Auf diese Weise wird der Anwendungsbereich des optischen
Tests wesentlich vergrössert.
Aktivitätsbestimmungen von Enzymen, die in Zellen vorhanden sind und die normalerweise im Serum
nur in geringer Menge vorkommen, spielen in der Medizin bei der sogenannten Enzymdiagnostik
eine bedeutende Rolle. Das Auftreten organspezifischer Enzyme im Serum kann eine Schädigung
dieser Organe anzeigen. Bei leichten, reversiblen Zellschädigungen kommt es bevorzugt zu einem
Austritt von Enzymen des cytoplasmatischen Raumes. Mitochondriale Enzyme in grösserer Menge
im Serum findet man bei absterbenden Zellen (Zellnekrosen). Durch sorgfältige Interpretation von
sogenannten "Enzymmustern", bei denen das Verhältnis der Aktivitäten verschiedener Enzyme
zueinander beachtet wird, kann man in gewissen Fällen den Grad der Einzelzellschädigung, die Ausdehnung des Schadens und die Geschwindigkeit des ablaufenden Krankheitsprozesses (fulminant,
akut, chronisch) beurteilen.
Die Aufnahme der UV-Spektren von NAD+ und NADH soll die Grundlage für den sog. optischen
Test zur Bestimmung von Enzymaktivitäten und Metabolitkonzentrationen aufzeigen.
Die Bestimmung der Geschwindigkeiten des Umsatzes verschiedener Alkohole durch die Alkoholdehydrogenase in Exp. 1.6 soll die Substratspezifität der Enzyme demonstrieren.
Theoretische Grundlagen:
Photometrie (S. 31)
UV-Spektren von Pyridinnucleotiden (S. 20)
Optischer Test nach Warburg (S. 43)
Enzymreaktionen (S. 34)
Kenntnisse über Glykolyse und alkoholische Gärung
Bezug zu anderen Plätzen:
Substratspezifität von Trypsin und Chymotrypsin, Exp. 10.4
Messung von Enzymaktivität, Exp. 9.1
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Experiment 1.6:
UV-Spektren von NAD+ UND NADH
In je eine Quarzküvette (teuer, sorgfältig zu behandeln!) NAD+ und NADH (50 µM in 50 mM
Phosphatpuffer) sowie 50 mM Phosphatpuffer pH 7 (Blindwert) füllen. Die Extinktion der NAD+und NADH-Lösungen gegen den Blindwert zwischen 230 nm und 400 nm in 10 nm-Intervallen
ablesen (5 nm-Intervalle im Bereich der Absorptionsmaxima) und tabellarisch festhalten. Die
Extinktion des Blindwertes, definitionsgemäss Null, muss nach jeder Änderung der Wellenlänge
kontrolliert und wenn nötig wieder auf Null abgeglichen werden (warum? siehe Theorieteil). Die
gemessenen Extinktionswerte als Funktion der Wellenlänge auf Millimeterpapier aufzeichnen
(Abszisse: Wellenlänge in nm, Ordinate: Extinktion) und millimolaren Extinktionskoeffizienten von
NAD+ und NADH bei 260 und 340 nm berechnen.
S
Welche praktische Bedeutung haben die unterschiedlichen Spektren von NAD+ und NADH?
Experiment 1.7:
Aktivität und Substratspezifität der Alkoholdehydrogenase
Prinzip: Alkoholdehydrogenase katalysiert die Reaktion:
Ethanol + NAD+
º Acetaldehyd + NADH + H+
In diesem Versuch wird die Geschwindigkeit der Oxidation des Alkohols bei Substratsättigung
gemessen. Damit die Reaktion vollständig nach rechts abläuft, wird der entstehende Acetaldehyd
durch das Carbonylreagens Semikarbazid abgefangen. Die Enzymaktivität wird aus der Bildungsgeschwindigkeit von NADH ermittelt. Zur Illustration der Substratspezifität wird ferner die
Enzymaktivität mit n-Propylalkohol und Isopropylalkohol bestimmt.
Lösungen:
1
2
2a
2b
3
NAD+, 0.04 M
Ethanol (0.21 M) und Semikarbazid (0.053 M) in Glycin/Natriumpyrophosphatpuffer, pH 8.7
n-Propylalkohol (0.21 M), sonst wie 2
Isopropylalkohol (0.21 M), sonst wie 2
Alkoholdehydrogenase (60 µg/ml) aus Hefe
Ausführung:
1. In eine Küvette zuerst 0.1 ml Lösung 1, dann 1.89 ml Lösung 2 pipettieren, sorgfältig mischen
durch Eintauchen des Rührstäbchens.
2. Küvette in den Lichtweg des Photometers bringen; Lichtweg öffnen und Extinktionsanzeige auf
E = 0.0 einstellen.
3. 10 µ1 verdünnte Enzymlösung (Lösung 3) auf Rührstäbchen aufpipettieren und Reaktion durch
3-maliges sorgfältiges Eintauchen des Rührstäbchens in die Küvette auslösen.
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4. Registrierschreiber (Papiergeschwindigkeit: 2mm/Sekunde; der Skalabereich der Ordinate von
0 bis 100 entspricht einer Extinktion von 1.0) starten und die Extinktion gegen die Zeit
aufzeichnen bis die Extinktion ca. 0.7 oder der Papiervorschub 20-25 cm erreicht hat, dann
Schreiber stoppen.
Test mit n-Propylalkohol und Isopropylalkohol wiederholen.
Auswertung:
Extinktionsänderungen pro Minute ()E/min) aus der Anfangssteigung bestimmen. Aktivitätskonzentrationen, spezifische Aktivität und molekulare Aktivität berechnen (siehe Theorieteil, Einheiten
der Enzymaktivität). Der millimolare Extinktionskoeffizient von NADH bei 340 nm beträgt 6.22
mM-1 cm-1. Alkoholdehydrogenase hat eine Molekularmasse von 150'000 Da.
Ethanol
n-Propyl
alkohol*)
Isopropylalkohol*)
)E/min
........
........
........
Aktivitätskonz. in der
Messküvette (U/ml)
........
........
........
Aktivitätskonz. der
Enzymlösung (U/ml)
........
........
........
Spezifische
Aktivität (U/mg)
........
........
........
Molekulare
Aktivität (min-1)
........
........
........
*) Falls nicht beide Substrate untersucht werden, Resultate zwischen den Kursteilnehmern
austauschen.
S Wie liesse sich feststellen, ob die geringere Aktivität mit den C3-Alkoholen auf schlechtere
Bindung der Substrate ans Enzym oder auf langsamere Oxidation zum Aldehyd zurückzuführen
ist?
S Wovon hängt die Enzymaktivität bei gegebener Substratkonzentration ab?
S Wie lange dauert ein Reaktionszyklus der Alkoholdehydrogenase mit Ethanol als Substrat?
S Welche praktische Bedeutung hat die Bestimmung der spezifischen Aktivität?
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Experiment 1.8: Messung der Aktivität von Kreatinkinase im Plasma mit
"Trockenchemie"
Der folgende Versuch soll eine wichtige Entwicklung der klinischen Chemie demonstrieren. Mit
"Trockenchemie" können in jeder Arztpraxis ohne Aufwand einige wichtige Substanzen und
Enzymaktivitäten im Blut gemessen werden.
Trockenchemie:
Die Weiterentwicklung der Teststreifenmethodik (Exp. 5.7 spezifischer Nachweis von Glucose mit
Diabur-Test) hat zu neuen Reagenzträgern mit mehrschichtigem Aufbau geführt. Die Reagenzien
sind in haltbarem Zustand in verschiedenen Schichten enthalten. Aufeinanderfolgende Reaktionsschritte können durch die Diffusion der Probe und der dabei aufgelösten Hilfsreagenzien auf dem
Weg in tiefere Schichten getrennt stattfinden. Der Begriff "Trockenchemie" hat sich zur Bezeichnung
durchgesetzt, da im Testträger die Reagenzien in getrocknetem Zustand vorhanden sind.
Blut
Transparente Folie
Schutznetz
Reaktionschicht
Trennvlies
TrŠgerfolie
Glasfasertransportvlies
Magnetcode
Querschnitt durch einen Reagenzträger, der mit Vollblut funktionsfähig ist.
Die Erythrozyten der auf dem Schutznetz aufgetragenen Vollblutprobe werden im Trennvlies
vollständig und ohne Hämolyse zurückbehalten. Durch Diffusion erreicht das Plasma ein Glasfasertransportvlies, das als Plasmareservoir dient und Plasma unter die Reaktionszone bringt. Bei
Reaktionsstart wird die Reaktionszone ins Plasmaresevoir gedrückt und entnimmt die benötigte Menge
Plasma. Die spezifische Reaktionskette führt zur Bildung eines Farbstoffs, der in die transparente
Folie diffundiert. Die Konzentration des Farbstoffs wird durch Reflexion von Licht geeigneter
Wellenlänge an der transparenten Folie photometrisch gemessen. Je mehr Farbstoff gebildet wird,
desto mehr wird vom auffallenden Licht absobiert und desto weniger Licht wird von der Folie
reflektiert und kann im Reflexionsphotometer gemessen werden. Der Magnetstreifen enthält alle testund methodenspezifischen Informationen, die zur Durchführung des Tests und zur Berechnung der
gesuchten Konzentration durch den Mikroprozessor des Photometers notwendig sind. Enzymaktivitäten werden aus dem zeitlichen Verlauf der Farbintensität automatisch berechnet.
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Prinzip:
Kreatinkinase kommt in Skelettmuskeln, im Herz, Gehirn und in glatten Muskelzellen vor. Drei
dimere Isoenzyme kommen vor: CK-MM (Skelettmuskeltyp), CK-MB (Herzmuskeltyp) und CK-BB
(Gehirntyp). In glatten Muskelzellen findet sich hauptsächlich CK-BB. Diagnostische Bedeutung
hat nur die Bestimmung der Herzmuskel- und Skeletmuskelenzyme.
Die Kreatinkinase katalysiert die Reaktion
Kreatin + ATP º Kreatinphosphat + ADP
(1)
Die Reaktion von rechts nach links dient der raschen Bereitstellung von ATP für die Muskelkontraktion. Die Kreatinkinase kommt im Herz- und Skelettmuskel in hoher Konzentration vor. Werden
Muskelfasern geschädigt (z.B. bei 02-Mangelversorgung des Myocards infolge Verschlusses einer
Coronararterie), so gelangt Kreatinkinase ins Blut. Die Bestimmung der Kreatinkinase-Aktivität im
Serum ist darum von grosser klinisch-diagnostischer Bedeutung.
In diesem Experiment wird die Aktivität der Kreatinkinase aus der Geschwindigkeit der Bildung von
ATP gemessen (Reaktion (1) von rechts nach links). Da die Geschwindigkeit der Bildung von Kreatin
und ATP nicht direkt mit einer optischen Methode bestimmt werden kann, wird die Reaktion (l) mit
den Hilfsreaktionen (2), (3) und (4) gekoppelt:
Kreatinphosphat + ADP
º
Kreatin + ATP
(l)
ATP + Glycerin
6
Glycerin-3-phosphat + ADP
(2)
Glycerin-3-phosphat + O2
6
Dihydroxyacetonphosphat + H2O2
(3)
H2O2 + Chromogen
6
Farbstoff + H2O
(4)
Kreatin + Dihydroxyacetonphosphat +
Farbstoff + H2O
(1-4)
Kreatinphosphat + Glycerin
+ O2 + Chromogen
6
Reaktion (2) wird durch Glycerokinase, Reaktion (3) durch Glycerinphosphatoxidase und Reaktion
(4) durch eine Peroxidase katalysiert. Die gesuchte Geschwindigkeit der Reaktion (1) ist gleich der
gemessenen Geschwindigkeit der Reaktion (4), sofern die gekoppelten Hilfsreaktionen (2)-(4) viel
schneller als die Reaktion (1) ablaufen und ihre Gleichgewichte rechts liegen. Alle Enzyme sowie
die im System nicht erzeugten Substrate müssen in trockenem Zustand in der Reaktionszone des
Reagenzträgers enthalten sein (siehe vorne).
S
Nennen Sie die Substrate, die im Reagenzträger enthalten sein müssen.
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Lösungen und Angaben zu den Blutproben:
1. Puffer für Verdünnung (falls notwendig)
2. Proben 1-3: Kreatinkinase enthaltendes Plasma eines Schweins mit Enzymaktivitäten, wie sie im
Verlauf eines Herzinfarkts (= Nekrose eines Teils des Herzmuskels infolge eines akuten
Sauerstoffmangels durch den plötzlichen Gefässverschluss im Bereich einer Herzkranzarterie)
beim Mensch gemessen werden.
Ausführung:
An Stelle von Vollblut wird hier Plasma verwendet, weil Plasma zur Aufbewahrung eingefroren
werden kann.
Die Messbereitschaft des Geräts wird auf der Anzeige angegeben. Alle hundert Messungen muss das
Reflexionsphotometer geeicht werden und es erscheint "CHEK" auf der Anzeige.
- In diesem Fall den Teststreifen aus dem CHEK-Behälter nehmen und flach so halten, dass der
Magnetstreifen auf der Unterseite liegt und das Graufeld gegen das Gerät hin weist.
- Messkammer öffnen und den Streifen waagrecht auf der Mitte der Lade bis zum Einrasten
einführen. Die drei Messwerte auf der Anzeige sollen innerhalb der Grenzen, die auf dem CHEKBehälter angegeben sind,liegen. Sonst der Kurslaborantin (via Assistierende) melden.
- Teststreifen durch vorsichtiges Ziehen entfernen und in den CHEK-Behälter zurücklegen.
Messkammer schliessen.
Messung der Proben:
1. Testträger aus dem CK-Behälter entnehmen und die Schutzfolie vom nicht gelochten Ende
abziehen und verwerfen.
2. Das vordere Ende mit der Reaktionszone des Reagenzträgers flach in den Halteschlitz der
Pipettenhalterung einführen.
3. Mit der bereitgestellten Pipette 32 µl der Plasmaprobe in die Plastikspitze aufziehen und
überschüssige Probe mit einem Papiertüchlein wegwischen.
4. Probe auf das Zentrum des roten Netzes auftragen ohne das Netz zu berühren.
Wichtig: unter keinen Umständen darf mehr als das vorgegebene Volumen aufgetragen werden,
da sonst überschüssiges Plasma aus dem Reagenzträger gepresst wird und das Messgerät beschädigt
wird.
5. Innerhalb von 15 Sekunden muss der Teststreifen mit der Reaktionszone voran waagrecht auf der
Mitte der Lade in die Messkammer bis zum Einrasten eingeführt werden. Messkammer schliessen.
6. Anzeige verfolgen und warten bis das Resultat auf der Anzeige erscheint und ausgedruckt wird.
Papiervorschub betätigen, Papierstreifen mit Resultat abreissen und beschriften. Das Resultat ist
bereits in U/Liter ausgerechnet. Falls die Enzymaktivität den Messbereich überschreitet, 0.1 ml
der Probe mit 2.9 ml Puffer verdünnen und erneut messen. Resultat mit dem Verdünnungsfaktor
multiplizieren.
7. Testträger durch vorsichtiges Ziehen aus der Messkammer entfernen und kontrollieren, ob eine
Farbveränderung auf dem oberen Teil des Testträgers stattgefunden hat.
8. Messkammer schliessen. Resultate tabellarisch unten festhalten.
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Es wird angenommen, dass die Blutproben von einem 61-jährigen Patienten stammen, der mit
Verdacht auf Herzinfarkt als Notfall ins Spital eingewiesen wird (siehe Lösungen).
Blutentnahmen *)
Kreatinkinaseaktivität (U/Liter)
ca. 1 Stunde
.........
ca. 7 Stunden
.........
24 Stunden
.........
5 Tage
59 U/l
*) Zeitpunkt nach Spitaleinlieferung des Patienten
Der Normalwert der Kreatinkinaseaktivität ist mit der hier verwendeten Messmethode 10-80 U/Liter.
Der zeitliche Verlauf der gemessenen Enzymaktivität ist beispielhaft für den Verlauf eines
(komplikationslosen) Herzinfarkts. Die Aktivität der Kreatinkinase im Blut steigt spätestens 6 Stunden
nach dem Infarktereignis im Blut an, erreicht nach ca. 24 Stunden ein Maximum und kehrt meist nach
5-6 Tagen in den Bereich der Norm zurück.
S
In einer Blutprobe wird ein erhöhter Gehalt an Kreatinkinase gemessen. Aus welchen
Organen/Geweben kann die Kreatinkinase stammen? Welche Ursache für einen solchen
Befund könnten Sie sich vorstellen?
S
Nennen Sie die Vorteile eines "Trockenchemie-Tests".
S
Wie könnte man einen Testträger zur Messung der Blutglucose entwickeln? Welche Reaktionskette schlagen Sie vor? (siehe Exp. 5.6)
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Experiment 1.9
Messung der Pyruvatkonzentration mit Lactatdehydrogenase
Prinzip:
Lactatdehydrogenase katalysiert die Reaktion
Pyruvat + NADH + H+ º Lactat + NAD+
Unter den gewählten Bedingungen liegt das Gleichgewicht stark rechts, d.h. nach Zugabe des Enzyms
werden Pyruvat und NADH nahezu vollständig in Lactat und NAD+ umgewandelt. Die Abnahme
von im Überschuss vorhandenem NADH ist deshalb ein Mass für die Menge des vorhandenen
Pyruvats.
Lösungen:
NADH (3.75 mM); Tris-HCl-Puffer (0.06 M), pH 7.6; Natriumpyruvat, unbekannte Konzentration;
Lactatdehydrogenase (ca. 100 µg/ml).
Ausführung:
In die Küvette werden in untenstehender Reihenfolge einpipettiert und durch Eintauchen des
Rührstäbchens sorgfältig gemischt:
NADH
Puffer
Substrat
0.1 ml
2.29 ml
0.1 ml
1. Photometeranzeige ohne Küvette im Lichtweg auf E340 nm = 0.0 einstellen. Registrierschreiber
ebenfalls mit "Zero-Knopf" auf 0-Linie einstellen (rechte Grundlinie).
2. Testküvette in den Lichtweg schieben und Extinktion ablesen.
3. 10 µl Enzymlösung auf Rührstäbchen pipettieren und Reaktion durch 3maliges Eintauchen des
Stäbchens in die Küvette auslösen.
4. Registrierschreiber starten (Papiergeschwindigkeit: 1 cm/Minute; der Skalabereich der Ordinate
von 0 bis 100 entspricht einer Extinktion von 1.0) und die Extinktion gegen die Zeit aufzeichnen
bis die Extinktion konstant bleibt, d.h. für ca. 10-15 Minuten. Schreiber stoppen.
5. Extinktion ablesen und Extinktionsabnahme, )E340, aus Anfangs- und Endwert bestimmen.
Berechnung der Pyruvatkonzentration:
Aus )E340 die umgesetzte Pyruvat-Konzentration in der Messküvette berechnen (g340nm = 6.22 mM-1
cm-1), dann die millimolare Pyruvatkonzentration in der untersuchten Lösung berechnen und in mg/ml
umrechnen (Mr 88).
S Welche Voraussetzungen müssen erfüllt sein, damit der optische Test zur Konzentrationsbestimmung von Substraten verwendet werden kann?
S In welcher Weise beeinflusst der pH-Wert das Gleichgewicht der Lactatdehydrogenase-Reaktion?
S Wie beeinflusst die zugegebene Enzymmenge den Verlauf der Kurve?
S Können Lactatkonzentrationen mit Hilfe dieser Reaktion bestimmt werden?