Versuchsprotokoll: Leitenzyme Aufschluss von Lebergewebe

Versuchsprotokoll: Leitenzyme
Aufschluss von Lebergewebe / Fraktionierte Zentrifugation / Aufschluss von
Mitochondrien / Nachweis von Leitenzymen im Cytosol und
Mitochondrienplasma
1.1. Einleitung
Für die Trennung der Organellen und des Cytosols benutzt man die Fraktionierte Zentrifugation.
Vorher wird das Lebergewebe zerkleinert und dann homogenisiert.
Durch die Zentrifugation mit immer steigender Rotationsgeschwindigkeit werden die durch das
Homogenisieren freigesetzten Organellen bzw. Plasma voneinander getrennt.
Durch die Nachweise von sogenannten Leitenzymen kann man erstens nachweisen, ob die
gewonnenen Fraktionen frei von anderen Bestandteilen sind und zweitens, um welche Organellen bzw.
um welches Plasma es sich handelt.
Daher benutzt man zum Nachweis nur Enzyme, die in einem Kompartiment vorkommen, in einem
anderen nicht (hier die Glutamat-Dehydrogenase und die Lactat-Dehydrogenase). Allerdings kann
man zur Probe auch ein Enzym benutzten, dass in beiden Kompartimenten vorkommt (hier: die
NADP- abhängige Isocitrat-Dehydrogenase).
Die gesamte Trennung wird unter ständiger Kühlung durchgeführt, um Abbauprozesse zu verhindern.
1.2. Material und Methode
Die in diesem Versuchsteil benutzten Materialien sind im Skript auf den Seiten 20 und 21 angegeben.
Die Methode der Zentrifugation ist in folgender Abbildung dargestellt:
Abb. 1:
Fraktionierte
Zentrifugation, aus
Skript Seite 22
Seite 1 von 7
Bei der sich daran anschließenden Photometrie wird ausschließlich die Extinktion von NADH bzw.
NADPH gemessen. NAD(P)H besitzt Absorptionsmaxima bei 260nm und bei 340nm. NAD(P)
dagegen weißt bei 340nm kein Absorptionsmaximum auf, da die Mesomerie im Pyrimidinring
aufgehoben wurde. Wird nun NAD(P)H verbraucht, sinkt die Extinktion.
Da das NAD(P)H bzw. NAD(P) bei allen drei Reaktionen als Coenzym oxidiert bzw. reduziert wird,
macht die Photometrie bei ca. 340nm eine quantitative Aussage über die Enzymkonzentrationen im
jeweiligen Plasma.
O
O
H
H
H
C
C
NH2
NH2
N
N
R
R
2 [H]
NAD(P)H + H*
NAD(P)+
Extinktion bei 340 nm
keine Extinktion bei 340 nm
Abb.2: Reaktive Gruppel von NAD(P)
1.3. Versuchsdurchführung
Siehe Skript Seiten 20 und 21
1.4. Versuchsergebnisse
1.4.1 Glutamat-DH-Test
Mitochondrienplasma (0,02ml)
Zeit in s
Extinktion
20
0,8
40
0,69
60
0,6
80
100
0,48 0,385
120
140
0,3 0,225
260
280
320
0,035 0,025
300
160
180 200
220 240
0,17 0,125 0,09 0,065 0,05
340
0,02 0,016 0,014
Cytoplasma
(0,02ml)
Zeit in s
Extinktion
30
60
90
1,065 1,065 1,005
120
150
180
210
240
1 0,995 0,995 0,995 0,995
Seite 2 von 7
Glutamat-DH-Test
1,2
1
Extinktion
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Zeit in s
Mitochondrienplasma
Cytoplasma
1.4.2. Isocitrat-DH-Test
Mitochondrienplasma (0,8ml)
Zeit in s
Extinktion
30
60
90
120 150 180
210 240
270 300
0,12 0,215 0,315 0,395 0,47 0,52 0,545 0,55 0,555 0,56
330 360 390 420
0,56 0,56 0,56 0,56
Cytoplasma (0,8ml)
Zeit in s
Extinktion
30
0,14
60
90
0,23 0,325
120 150 180
0,4 0,47 0,52
210 240
0,55 0,58
270 300
330 360 390 420
0,6 0,61 0,615 0,62 0,62 0,62
Isocitrat_DH-Test
0,7
0,6
Extinktion
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Zeit in s
Mitochondrienplasma
Cytoplasma
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1.4.3. Lactat-DH-Test
Mitochondrienplasma (0,05ml)
Zeit in s
Extinktion
30 60
90 120 150 180 210 240 270 300 330
360 390 420
0,74 0,7 0,68 0,65 0,62 0,6 0,57 0,54 0,52 0,5 0,47 0,445 0,42 0,4
Cytoplasma (0,05ml)
Zeit in s
Extinktion
30 60
90 120 150 180 210 240 270 300 330
0,95 0,7 0,53 0,38 0,23 0,1 0,08 0,04 0,02
0
0
360 390
0
0
Lactat-DH-Test
1
0,9
0,8
Extinktion
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Zeit in s
Mitochondrienplasma
Cytoplasma
Die Extinktionswerte des Cytoplasmas wurden angehoben, um eine negative Extinktion zu umgehen.
Um die Werte mit dem Mitochondrienplasma zu vergleichen, muss der Wert von 0,48 abgezogen
werden. Da es aber bei dem Versuch nicht auf den unmittelbaren Extinktionsvergleich ankommt,
sonder eher auf den Verlauf der Extinktion, ist diese Manipulation vollkommen legitim.
1.5. Auswertung / Diskussion
1.5.1. Glutamat-DH-Test
Die Glutamat-Dehydrogenase (GDH) ist ein weitgehend spezifisches Leberenzym. Die GDH
katalysiert folgende Reaktion: Glutamat entsteht in den Mitochondrien bei einer Nebenreaktion des
Citratzykluses aus alpha-Ketoglutarat und NH4+:
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Glutamat-DH
+
+
alpha-Ketoglutarat + NH4 + NAD(P)H + H
Glutamat + H2O + NAD(P)+
Das NADH + H+ ist, wie eingangs schon erwähnt, das Coenzym und wird hier oxidiert.
Bei Leberschäden kann das Enzym auch im Blut festgestellt werden und weist somit auf eine
Erkrankung hin.
Durch die Abnahme der NADH + H+ -Konzentration sinkt die Extinktion im Laufe der Versuchszeit
wegen der Umsetzung in NAD+ ab. Dies liegt an der, unter Punkt 1.2 (Seite 2) bereits beschrieben,
veränderten Mesomerie des Pyrimidinrings des Nicotinamids.
Die Abnahme der Konzentration erfolgt jedoch nur bei der Zugabe von Mitochondrienplasma. Somit
liegt eine fast saubere Trennung vom Cytoplasma vor, welches keine enzymatische Aktivität aufweist.
Da der Citratzyklus ausschließlich in den Mitochondrien lokalisiert ist und somit auch die Umsetzung
von alpha-Ketoglutarat in Glutamat stimmen diese Beobachtung und das erwartete Ergebnis überein.
1.5.2. Isocitrat-DH-Test
Die NADP-abhängige Isocitrat-Dehydrogenase (NADP-ICD) kommt in beiden Kompartimenten vor.
Dies ist eindeutig an den fast gleichen Extinktionskurven abzulesen.
Die Isocitrat-Dehydrogenase (IDH) katatlysiert folgende Reaktion:
Isocitrat + NADP+
NADP-ICD
alpha-Ketoglutarat + CO2 + NADPH + H+
(Abb. 3, 1.5.2.)
„Die IDH ist entweder NAD oder NADP abhängig. In Eukaryonten gibt es mindestens drei Isoformen
der IDH: zwei befinden sich in der Mitochondrialen Matrix (eine ist NAD abhängig, die andere NADP
abhängig), während die dritte (auch NADP abhänging) im Cytoplasma lokalisiert ist.“ (EMBL EBI,
European Bioinformatics Institut, http://www.ebi.ac.uk/interpro/IEntry?ac=IPR001804 )
Somit ist verständlich, dass auch im Cytoplasma eine NADP-ICDH-Funktion festzustellen ist.
Die Aufgabe, der NADP-ICD in dem Cytoplasma ist einmal die oben aufgezeigte Reaktion zu
katalysieren und somit zweitens auch eine NADPH+H+ -Quelle darzustellen, besonders dann, wenn
eine Glucose-6-phosphat dehydrogenase deficiency vorliegt. (Geisbrecht BV, Gould SJ. (1999): The
human PICD gene encodes a cytoplasmic and peroxisomal NADP+-dependent isocitrate
dehydrogenase. – J Biol Chem.274 (43): 30527-33.)
Auch in Peroxisomen ist die NADP-ICD anzutreffen. Da bei der Fraktionierten Zentrifugation
Mitochondrien und Peroxisomen gemeinsam „geknackt“ wurden, kann man somit auch annehmen,
dass die NADP-ICD aus den Peroxisomen stammt.
Dort hat sie die Aufgabe durch die oben bereits gezeigte Reaktion (Abb. 1,1.5.2.) die NADPHKonzentration für intrazelluläre Reduktionen zu regenerieren. (Geisbrecht BV, Gould SJ. (1999): The
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human PICD gene encodes a cytoplasmic and peroxisomal NADP+-dependent isocitrate
dehydrogenase. – J Biol Chem.274 (43): 30527-33.)
In anderen Geweben, wie besonders Muskel und Herz, wo es keine großen NADPH – Konsumenten
gibt, hat die NADP-ICD in der Mitochondrienmatrix wahrscheinlich die Aufgabe zusammen mit der
H+-Transhydrogenase die Aktivität des Tricarbonsäurezykluses in Abhängigkeit der Energienachfrage
zu regulieren.
Diese beiden Enzyme regulieren sozusagen die NAD-ICD. Die NAD-ICD treibt den
Tricarbonsäurezyklus an, während die NADP-ICD ihn verlangsamt. Die NADP-ICD erhöht den
NADPH-Spiegel (in Abhängigkeit der Aktivität der H+-Transhydrogenase). NADPH ist genauso wie
ATP ein allosterischer Effektor der NAD-ICD. (Sazanov LA, Jackson JB. (1994): Proton-translocation
transhydrogenase and NAD- and NADP-linked isocitrate dehydrogenases operate in a substrate cycle
which contributes to fine regulation of the tricarboxylic acid cycle activity in mitochondria. – FEBS
Lett: 344 (2-3): 109-16.)
Somit wurde die Funktion der NADP-abhängigen ICD in der Mitochondrienmatrix aufgezeigt.
1.5.3. Lactat-DH-Test
Die Lactat-Dehydrogenase (LDH) katalysiert die Umsetzung von Pyruvat zu Lactat. Dabei ist die
Entstehung des Lactats nicht entscheidend, sondern die Regeneration des NAD+. Die Regeneration des
NAD+ erfolgt jedoch nur im anaeroben Stoffwechsel oder bei einer Sauerstoffunterversorgung im
Skelettmuskel über die LDH, da NADH + H+ ansonsten in der Atmungskette regeneriert wird.
Cytoplasma
Lactat-DH
Pyruvat
Lactat
NADH + H+
NAD+
5. Schritt d.
Glycerinaldehyd-3-phosphat
1,3-Bisphosphoglycerat
Glycolyse
GAP-DH
Das NADH + H+ ist, wie eingangs schon erwähnt, das Coenzym und wird hier oxidiert.
Durch die Abnahme der NADH + H+ -Konzentration sinkt die Extinktion im Laufe der Versuchszeit
wegen der Umsetzung in NAD+ ab. Dies liegt an der, unter Punkt 1.2 (Seite 2) bereits beschrieben,
veränderten Mesomerie des Pyrimidinrings des Nicotinamids.
Die Abnahme der Konzentration erfolgt jedoch maßgeblich nur bei der Zugabe von Cytoplasmalösung,
was auch der Theorie entspricht, da die Glycolyse nur in dem Cytoplasma abläuft.
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Die Abnahme bei Zugabe von Mitochondrienplasma kann durch eine Verunreinigung hervorgerufen
worden sein, bzw. eine nicht einwandfreie Trennung von Cytosol und Mitochondrienplasma.
Allerdings ist die Abnahme der Extinktion sehr flach und im Gegensatz zu der Cytoplasmazugabe
gering.
Da die Extinktion von NADH + H+ gemessen wird, könnte es sein, dass ein anderes Enzym, welches
in der Mitochondrienplasma vorkommt das NADH + H+ oxidiert und somit eine Abnahme der
Extinktion zustande kommt. Allerdings lässt sich dies hier nicht nachweisen.
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