Verfahren zur Herstellung von enantiomerenangereichten Aminen
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*DE102007042600A120090312* (19) Bundesrepublik Deutschland Deutsches Patent- und Markenamt (10) DE 10 2007 042 600 A1 2009.03.12 Offenlegungsschrift (12) C12P 13/00 (2006.01) (21) Aktenzeichen: 10 2007 042 600.5 (22) Anmeldetag: 07.09.2007 (43) Offenlegungstag: 12.03.2009 (51) Int Cl.8: (71) Anmelder: Evonik Degussa GmbH, 45128 Essen, DE (72) Erfinder: Doderer, Kai, Dr., 63110 Rodgau, DE; Wienand, Wolfgang, Dr., 60385 Frankfurt, DE; Gröger, Harald, Prof., 91056 Erlangen, DE; Rollmann, Claudia, 63755 Alzenau, DE C12P 41/00 (2006.01) Die folgenden Angaben sind den vom Anmelder eingereichten Unterlagen entnommen (54) Bezeichnung: Verfahren zur Herstellung von enantiomerenangereichten Aminen (57) Zusammenfassung: Verfahren zur Herstellung von enantiomerenangereicherten Aminen durch Umsetzung eines Ketons mit Ammoniak oder einem Ammoniumsalz und einem Reduktionsmittel in Gegenwart eines katalytischen Systems mit den Komponenten: a) eine Aminosäuretransaminase, b) eine alpha-Aminosäure, die ein Substrat der Aminosäuretransaminase ist, c) eine zur Herstellung der alpha-Aminosäure geeignete Aminosäuredehydrogenase, d) NAD(P)+ und e) ein NAD(P)+ reduzierendes Enzym, das NAD(P)+ mit dem Reduktionsmittel zu NAD(P)H umsetzt. Das Verfahren kann mit katalytischen Mengen an alpha-Aminosäure und NAD(P)+ durchgeführt werden und ermöglicht eine enantioselektive reduktive Aminierung von Ketonen. 1/9 DE 10 2007 042 600 A1 2009.03.12 Beschreibung [0001] Enantiomerenreine Amine finden Anwendung als chirale Bausteine, sogenannte „Chiral Building Blocks", bei der Herstellung von pharmazeutischen und Agrowirkstoffen. Prominente Beispiele dafür sind Rivastigmin, Chephalosporin und chirale 1-Amino-1-arylalkane. Einzelne Vertreter dieser Verbindungen werden bereits in Mengen von mehr als 1000 Tonnen produziert. Für die Herstellung von pharmazeutischen und Agrowirkstoffen werden optisch reine Amine benötigt, da nur entweder das (R)- oder das (S)-Enantiomer die erwünschte Wirkung erzielt. In einigen Fällen kann von dem nicht erwünschten Enantiomer sogar eine schädliche Wirkung ausgehen. Deshalb besteht ein Bedarf an Verfahren zur Herstellung von enantiomerenangereicherten Aminen. [0002] Der bisher am meisten genutzte Weg zu enantiomerenangereicherten oder enantiomerenreinen Aminen ist die Racematspaltung ausgehend vom Amin in racemischer Form. Klassisch erfolgt die Racemtspaltung über diastereomere Salze. Dazu werden stöchiometrische Mengen einer chiralen Carbonsäure zum Amin in racemischer Form gegeben und die resultierenden diastereomeren Salze werden dann durch fraktionierende Kristallisation getrennt. Danach muss die chirale Carbonsäure wieder abtrennt werden und in der Regel aus Kostengründen recycliert werden. Das unerwünschte Enantiomer muss entweder entsorgt oder in das Racemat überführt und in den Produktionsprozeß zurückgeführt werden. Diese Schritte sind mit erheblichem Aufwand und Kosten verbunden. [0003] Eine Alternative zur Racematspaltung über diastereomere Salze ist die biokatalytische Racematspaltung, bei der mittels eines Enzyms aus einem racemischen Amin enantioselektiv ein Aminderivat erzeugt wird oder aus einem racemischen Aminderivat enantioselektiv Amin freigesetzt wird. Hierzu können Lipasen, Acylasen, Proteasen und viele andere Hydrolasen eingesetzt werden, von denen bekannt ist, dass sie Racemate stereospezifisch spalten können. Solche Verfahren sind bekannt aus Bornscheuer und Kazlauskas, Hydrolases in Organic Synthesis (2005), Wiley-VCH Weinheim, sowie Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, 2nd Edition(2002), ed. Drauz und Waldmann, Wiley-VCH Weinheim. [0004] Bei diesen Verfahren entfällt der Einsatz stöchiometrischer Mengen an chiralen Hilfsreagenzien. Es bleibt aber der Nachteil einer Limitierung der theoretischen Ausbeute auf 50% bezogen auf den als Racemat vorliegenden Ausgangsstoff und gegebenenfalls der zusätzliche Arbeitsschritt für das Recycling des ungewünschten Enantiomers mit den damit verbundenen Kosten. [0005] Diese Nachteile, die prinzipiell für alle Racematspaltungstrategien gelten, lassen sich durch eine asymmetrische Synthese unter Verwendung von prochiralen Ausgangsverbindungen vermeiden. Die bekannten asymmetrischen Synthesen unter Verwendung von übergangsmetallhaltigen Katalysatoren erreichen allerdings oft nicht die erforderliche Enantioselektivität. Darüber hinaus können sich aus der Verwendung der übergangsmetallhaltigen Katalysatoren auch für pharmazeutische Anwendungen unerwünschte Gehalte an Übergangsmetallen im resultierenden Produkt ergeben. [0006] Ein weiterer bekannter enzymatischer Weg zu enantiomerenangereicherten Aminen ist der durch Transaminasen katalysierte Austausch von Ketogruppe und Aminogruppe zwischen zwei Substraten. [0007] Die bekannten Transaminasen sind enantioselektiv sowohl hinsichtlich des eingesetzten Amingruppendonors als auch hinsichtlich des gebildeten Amins. Ausgehend von prochiralen Ketonen werden bei der Reaktion deshalb enantiomerenangereicherte Amine gebildet. Nachteilig ist allerdings, dass es sich bei der Umsetzung um eine Gleichgewichtsreaktion handelt und deshalb in der Regel nur ein Teil des eingesetzten prochiralen Ketons in das gewünschte enantiomerenangereicherte Amin umgesetzt wird. [0008] Aus Matcham et al., Chimica Oggi 14 (1996) 20–24; Matcham et al., Chimia 53 (1999) 584–589; sowie WO99/46398 ist bekannt, dass sich das Gleichgewicht der Reaktion auf die gewünschte Produktseite verschieben lässt, wenn Isopropylamin als Aminsubstrat verwendet wird (R3, R4 = CR3) und das bei der Reaktion gebildete Aceton destillativ aus der Reaktionsmischung entfernt wird. Das verfahren kann allerdings nur mit Transaminasen durchgeführt werden, die Isopropylamin als Amingruppendonor akzeptieren. Unter den Prozessbedingungen, die für die Entfernung von Aceton erforderlich sind, sind allerdings nur wenige Transaminasen ausreichend stabil. 2/9 DE 10 2007 042 600 A1 2009.03.12 [0009] In Shin et al., Biotechnology and Bioengineering 65 (1999) 206–211 und EP 1 818 411 wird vorgeschlagen, das Gleichgewicht durch die Entfernung des gebildeten Ketons zu verschieben, indem Alanin als Aminsubstrat eingesetzt wird und das daraus gebildete Pyruvat enzymatisch mit einer gleichzeitig eingesetzten Pyruvatdecarboxylase, Lactatdehydrogenase oder Acetolactatsynthase weiter umgesetzt wird. Die Beschränkung auf Alanin als Aminsubstrat schränkt die Wahl der Transaminasen allerdings deutlich ein. Um enantiomerenangereicherte Amine mit (R)-Konfiguration herzustellen, sind (R)-selektive Transaminasen erforderlich und das Aminsubstrat muss ebenfalls in der (R)-Form vorliegen. Das setzt bei diesem Verfahren die Verwendung von D-Alanin voraus, welches nur mit zusätzlichem Aufwand zugänglich ist. Die Alternative ist die Verwendung von DL-Alanin, dabei verbleibt aber L-Alanin im Reaktionsgemisch und muss abgetrennt und entsorgt werden. [0010] US 3,183,170 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren durch Umsetzung einer alpha-Ketocarbonsäure mit L-Glutaminsäure in Gegenwart einer L-Glutaminsäuredehydrogenase, einer Hydrogenase, einer Transaminase, eines Wasserstoffakzeptorfarbstoffs, eines Elektronentransportsystems, einer Stickstoffquelle und von gasförmigem Wasserstoff. Das Verfahren hat den Nachteil, dass die verwendeten Wasserstoffakzeptorfarbstoffe starke Zellgifte sind. Außerdem ist das Verfahren beschränkt auf die aminosäurespezifische L-Glutaminsäuredehydrogenase und kann nicht mit Aminosäuredehydrogenasen angewendet werden, die unterschiedliche Aminosäuren als Substrat tolerieren. [0011] Es besteht deshalb Bedarf an einem Verfahren, mit dem sich enantiomerenangereicherte Amine aus Ketonen herstellen lassen und das nicht die Nachteile der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren aufweist. [0012] Diese Aufgabe wird gelöst durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines enantiomerenangereicherten Amins, bei dem ein Keton mit Ammoniak oder einem Ammoniumsalz und einem Reduktionsmittel umgesetzt wird in Gegenwart eines katalytischen Systems, das folgende Komponenten umfasst: a) eine Aminosäuretransaminase, b) eine alpha-Aminosäure, die ein Substrat der Aminosäuretransaminase ist, c) eine zur Herstellung der alpha-Aminosäure geeignete Aminosäuredehydrogenase, d) NAD(P)+ und e) ein NAD(P)+ reduzierendes Enzym, das NAD(P)+ mit dem Reduktionsmittel zu NAD(P)H umsetzt. [0013] Aminosäuretransaminasen im Sinne der Erfindung sind amingruppentransferierende Enzyme der Enzymklasse E.C. 2.6.1.X, die eine alpha-Aminosäure als Substrat akzeptieren. [0014] Aminosäuredehydrogenasen im Sinne der Erfindung sind Enzyme, die alpha-Ketocarbonsäuren mit Ammoniak zu alpha-Aminosäuren umsetzen und gleichzeitig NAD(P)H zu NAD(P)+ oxidieren. [0015] NAD(P)+ steht sowohl für Nicotinamidadenindinucleotid (NAD+) und dessen Salze als auch für Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADP+) und dessen Salze. In gleicher Weise steht NAD(P)H sowohl für Dihydronicotinamidadenindinucleotid (NADH) und dessen Salze als auch für Dihydronicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADPH) und dessen Salze. [0016] Das erfindungsgemäße Verfahren koppelt drei enzymatisch katalysierte Reaktionen zu einem Gesamtverfahren. In einer ersten durch eine Aminosäuretransaminase katalysierten, Reaktion wird das Keton mit einer alpha-Aminosäure zum enantiomerenangereicherten Amin und der der alpha-Aminosäure entsprechenden alpha-Ketocarbonsäure umgesetzt. In einer zweiten durch eine Aminosäuredehydrogenase katalysierten Reaktion wird die alpha-Ketocarbonsäure mit Ammoniak oder einem Ammoniumsalz sowie NAD(P)H umgesetzt unter Rückbildung der alpha-Aminosäure und Bildung von NAD(P)+. In einer dritten durch ein NAD(P)+ reduzierendes Enzym katalysierten Reaktion wird NAD(P)+ mit einem Reduktionsmittel umgesetzt und so NAD(P)H zurückgebildet. Als Gesamtreaktion resultiert eine enantioselektive reduktive Aminierung des Ketons, bei der die alpha-Aminosäure und NAD(P)+ nur in katalytischen Mengen benötigt werden und für die Herstellung des enantiomerenangereicherten Amins nicht verbraucht werden. [0017] Das nachfolgende Formelschema zeigt die Kopplung der drei enzymatischen Reaktionen zum erfindungsgemäßen Verfahren am Beispiel von Ammoniumformiat als Reduktionsmittel und Ammoniumsalz und Formiatdehydrogenase als NAD+ reduzierendem Enzym. Dabei bezeichnet ASTA eine Aminosäuretransaminase, ASDH eine Aminosäuredehydrogenase und FDH eine Formiatdehydrogenase. 3/9 DE 10 2007 042 600 A1 2009.03.12 [0018] Für das erfindungsgemäße Verfahren können prinzipiell alle zur Umsetzung von Ketonen geeigneten Transaminasen verwendet werden. Geeignete Aminosäuretransaminasen sind aus Yun et al., Applied and Environmental Microbiology 70 (2004) 2529–2534; Shin et al., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 65 (2001) 1782–1788; Kaulmann et al., Enzyme and Microbial Technology 41 (2007) 628–637; Shin et al., Applied Microbiology and Biotechnology 61 (2003) 463–471; Shin et al., Biotechnology and Bioengineering 65 (1999) 206–211; Matcham et al., Chimia 53 (1999) 584–589; sowie WO 99/46398 bekannt. [0019] Vorzugsweise werden Omega-Transaminasen verwendet, die aus EP 0 404 146 bekannt sind. Besonders geeignet sind omega-Transaminasen aus Vibrio fluvialis, insbesondere Vibrio fluvialis Stamm JS17; Alcaligenes denitrificans, insbesondere Alcaligenes denitrificans Stamm Y2K-2; Klebsiella pneumoniae, insbesondere Klebsiella pneumoniae Stamm YS2F; sowie Bacillus thuringiensis, insbesondere Bacillus thuringiensis Stamm JS64. [0020] Als alpha-Aminosäure kann jede alpha-Aminosäure eingesetzt werden, die ein Substrat der Aminosäuretransaminase ist. Vorzugsweise wird als alpha-Aminosäure eine proteinogene Aminosäure verwendet, wobei sowohl die natürlichen L-Aminosäuren als auch deren D-Enantiomere oder beliebige Mischungen der Enantiomere, wie z. B. eine racemische Mischung, verwendet werden können. Besonders bevorzugte Aminosäuren sind Leucin, Alanin, Phenylalanin und Glutaminsäure. [0021] Die alpha-Aminosäure kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in einer katalytischen Menge eingesetzt werden. Vorzugsweise liegt die Gesamtmenge an alpha-Aminosäure und der alpha-Aminosäure entsprechender alpha-Ketosäure, bezogen auf die Gesamtmenge an Keton, im Bereich von 1 bis 50 mol-%, vorzugsweise 2 bis 10 mol-%. [0022] In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zu Beginn der Umsetzung nicht die alpha-Aminosäure vorgelegt, sondern die der alpha-Aminosäure entsprechende alpha-Ketocarbonsäure, die an Stelle der Aminogruppe eine Ketogruppe aufweist. Diese Ausführungsform ist besonders vorteilhaft für die Herstellung von enantiomerenangereicherten Aminen, die unter Verwendung einer D-Aminosäure oder einer nicht proteinogenen L-Aminosäure hergestellt werden müssen, da an Stelle einer schwer zugänglichen Aminosäure die der Aminosäure entsprechende leichter zugängliche alpha-Ketocarbonsäure für das Verfahren eingesetzt werden kann. [0023] Als Aminosäuredehydrogenase kann jede NAD(P)H-Cofaktorabhängige Dehydrogenase verwendet werden, mit der sich die alpha-Aminosäure aus der der alpha-Aminosäure entsprechenden alpha-Ketocarbonsäure herstellen lässt. Geeignete Aminosäuredehydrogenasen sind aus Oshima et al, International Industrial Biotechnology 9 (1989) 5–11; Ohsima et al., European Journal of Biochemistry 191 (1990) 715–720; Khan et al., Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 69 (2005) 1861–1870; Hummel et al., Applied Microbiology and Biotechnology 26 (1987) 409–416 und Bommarius in Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, 2nd Edition(2002), ed. Drauz und Waldmann, Wiley-VCH Weinheim bekannt. [0024] Vorzugsweise ist die Aminosäuredehydrogenase eine Leucindehydrogenase, eine Alanindehydrogenase, eine Phenylalanindehydrogenase oder eine Glutamatdehydrogenase. Besonders geeignet sind Alanin- 4/9 DE 10 2007 042 600 A1 2009.03.12 dehydrogenasen aus Bacillus sphaericus, insbesondere Bacillus sphaericus Stamm DSM642; Glutamatdehydrogenasen aus Bacillus subtilis, insbesondere Bacillus subtilis Stamm ISW1214; Phenylalanindehydrogenasen aus Rhodococcus sp., insbesondere Rhodococcus sp.Stamm M4, Bacillus sphaericus und Thermoactinomyces intermedius. Besonders bevorzugt wird eine Leucindehydrogenase aus Bacillus cereus verwendet. Für die Herstellung von D-Aminosäuren wird vorzugsweise eine D-Aminosäuredehydrogenase verwendet, die in Vedha-Peters et al., Journal of the American Chemical Society 128 (2006) 10923–10929 beschrieben ist als Mutante der meso-Diaminopimelinsäure-D-dehydrogenase von Corynebacterium glutamicum. [0025] Vorzugsweise werden eine Aminosäuretransaminase und eine Aminosäuredehydrogenase in Kombination verwendet, die in ihrer Stereoselektivität bezüglich der alpha-Aminosäure aufeinander abgestimmt sind, d. h. dass entweder die Aminosäuredehydrogenase die der alpha-Aminosäure entsprechende alpha-Ketosäure selektiv zum S-Enantiomer der alpha-Aminosäure umsetzt und die Aminosäuretransaminase selektiv das S-Enantiomer der alpha-Aminosäure mit dem Keton umsetzt oder dass die Aminosäuredehydrogenase die der alpha-Aminosäure entsprechende alpha-Ketosäure selektiv zum R-Enantiomer der alpha-Aminosäure umsetzt und die Aminosäuretransaminase selektiv das R-Enantiomer der alpha-Aminosäure mit dem Keton umsetzt. [0026] Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird außerdem ein Reduktionsmittel eingesetzt in Kombination mit einem NAD(P)+ reduzierenden Enzym, das NAD(P)+ mit dem Reduktionsmittel zu NAD(P)H umsetzt. Geeignete NAD(P)+ reduzierende Enzyme sind aus Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, 2nd Edition(2002), ed. Drauz und Waldmann, Wiley-VCH Weinheim bekannt. [0027] In einer bevorzugten Ausführungsform wird als Reduktionsmittel ein Salz der Ameisensäure und als NAD(P)+ reduzierendes Enzym eine Formiatdehydrogenase verwendet. Besonders bevorzugt ist das Reduktionsmittel Ammoniumformiat, das auch in situ aus Ameisensäure und Ammoniak erzeugt werden kann. Vorzugsweise wird eine Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii oder eine davon abgeleitete Mutante verwendet. Ebenfalls geeignet sind die von Tishkov et al. in Biomolecular. Engineering 23 (2006) 89–11 beschriebenen Formiatdehydrogenasen. Diese Ausführungsform hat den Vorteil, dass als Reaktionsprbdukt des Reduktionsmittels nur Kohlendioxid entsteht, was die Aufarbeitung der Reaktionsmischung vereinfacht. [0028] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird als Reduktionsmittel Glucose und als NAD(P)+ reduzierendes Enzym eine Glucosedehydrogenase verwendet. Besonders geeignet sind Glukosedehydrogenasen aus Bacillus subtilis, Bacillus megaterium und Thermoplasma acidophilum. [0029] Alternativ kann als Reduktionsmittel ein Salz der phosphorigen Säure und als NAD(P)+ reduzierendes Enzym eine Phosphitdehydrogenase verwendet werden. Geeignete Phosphitdehydrogenasen sind aus Relyea et al., Bioorganic Chemistry 33 (2005) 171–189 bekannt. [0030] Ebenfalls geeignet ist Glucose-6-phosphat als Reduktionsmittel in Kombination mit einer Glucose-6-phosphatdehydrogenase als NAD(P)+ reduzierendem Enzym. [0031] Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können NAD(P)+ bzw. NAD(P)H in katalytischen Mengen eingesetzt werden. Vorzugsweise liegt die Gesamtmenge an NAD(P)+ und NAD(P)H, bezogen auf die Gesamtmenge an Keton, im Bereich von 0,001 bis 5 mol-%, vorzugsweise 0,01 bis 1 mol-%. Zu Beginn der Umsetzung kann wahlweise sowohl NAD(P)+ als auch NAD(P)H vorgelegt werden. [0032] Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Enzyme, d. h. die Aminosäuretransaminase, Aminosäuredehydrogenase und das NAD(P)+ reduzierende Enzym können im Verfahren sowohl gelöst als auch auf einem Träger immobilisiert eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Enzyme in Form eines Ganzzellkatalysators eingesetzt, d. h. in Form einer Zelle, die alle drei Enzyme exprimiert. Vorzugsweise wird ein rekombinanter Ganzzellkatalysators verwendet, d. h. eine Zelle, die gentechnisch so verändert wurde, dass sie mindestens eines der drei Enzyme aus einer nicht nativen Gensequenz exprimiert. Besonders bevorzugt wird als rekombinanter Ganzzellkatalysator ein Bakterium, insbesondere ein Escherichia coli Bakterium, verwendet, das Aminosäuretransaminase, Aminosäuredehydrogenase und das NAD(P)+ reduzierende Enzym überexprimiert. [0033] Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Umsetzung vorzugsweise in einem wässrigen Reaktionsmedium. Die wässrige Phase kann zusätzlich ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel enthalten, vorzugsweise in einer Menge von 1 bis 20 Gew.-% bezogen auf die gesamte Reaktionsmischung. Geeignete Lösungsmittel sind Alkohole, insbesondere Methanol, Ethanol und Isopropanol, Glykole, insbesondere Ethylenglykol und Propylenglykol, sowie Tetrahydrofuran, Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid. 5/9 DE 10 2007 042 600 A1 2009.03.12 [0034] Das wässrige Reaktionsmedium weist vorzugsweise einen pH-Wert im Bereich von 6 bis 9, besonders bevorzugt 7 bis 8, auf. Vorzugsweise wird ein pH-Wert in diesem Bereich durch einen Puffer aus einer geeigneten anorganischen oder organischen Säure und deren Ammoniumsalz eingestellt. Beispielsweise kann die Einstellung des pH-Werts durch Puffer aus Phosphorsäure und einem Ammoniumphosphat oder Puffer aus einer Carbonsäure und deren Ammoniumcarboxylat erfolgen. Alternativ kann der pH-Wert auch durch pH-geregelte Zudosierung von Ammoniak oder einer anorganischen oder organischem Säure zum Reaktionsmedium eingestellt werden. [0035] In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Umsetzung in einem Zweiphasensystem aus einer wässrigen und einer organischen Phase. Die organische Phase kann dabei aus dem eingesetzten Keton und/oder dem gebildeten Amin bestehen. Vorzugsweise wird aber zur Bildung einer organischen Phase ein mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel zugesetzt. Geeignete Lösungsmittel sind aliphatische Kohlenwasserstoffe, insbesondere Hexan und Heptan, aromatische Kohlenwasserstoffe, insbesondere Toluol und Xylole, Dialkylether, insbesondere Methyl-tert-butylether und Ethyl-tert-butylether, sowie Carbonsäureester, insbesondere Essigsäureethylester. Die Umsetzung in einem Zweiphasensystem ermöglicht auch bei Einsatz von schlecht wasserlöslichen Ketonen oder bei der Herstellung von schlecht wasserlöslichen Aminen eine hohe Volumenausbeute, die nicht durch die Löslichkeit von Keton oder Amin limitiert ist. Darüber hinaus lassen sich bei der Umsetzung in einem Zweiphasensystem auch Inhibierungen eines der verwendeten Enzyme durch das eingesetzte Keton oder das gebildete Amin vermeiden. Die Umsetzung in einem Zweiphasensystem ermöglicht außerdem eine einfache Abtrennung des Aminprodukts von den eingesetzten Enzymen und deren Rückgewinnung durch eine Phasentrennung, gegebenenfalls nach vorheriger Einstellung eines pH-Werts im Bereich von 9 bis 11. [0036] Als Keton werden vorzugsweise Dialkylketone, Alkylarylketone, Alkylheteroarylketone und Alkylaralkylketone eingesetzt, wobei die Alkylgruppen, Arylgruppen und Heteroarylgruppen mit nicht enzyminhibierenden Gruppen substituiert sein können. Das Keton kann im erfindungsgemäßen Verfahren zu Beginn der Umsetzung vorgelegt werden. Vorzugsweise wird aber zu Beginn der Umsetzung nur ein Teil des umzusetzenden Ketons vorgelegt und der restliche Teil des umzusetzenden Ketons entsprechend dem Umsatz an Keton zudosiert. Durch eine solche Zudosierung des Ketons lässt sich eine Inhibierung der verwendeten Enzyme durch das Keton vermeiden. Ketone mit einem Schmelzpunkt von mehr als 30°C werden vorzugsweise als Lösungen in einem Lösungsmittel eingesetzt, wobei sowohl die zuvor beschriebenen mit Wasser mischbaren Lösungsmittel als auch die zuvor beschriebenen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel verwendet werden können. Vorzugsweise beträgt die Gesamtmenge an Keton bezogen auf das Reaktionsvolumen mehr als 10 g/l, besonders bevorzugt mehr als 50 g/l und insbesondere mehr als 100 g/l. Die obere Grenze für die Gesamtmenge an Keton bezogen auf das Reaktionsvolumen ergibt sich aus den Löslichkeiten von eingesetztem Keton und gebildetem Amin, insbesondere aus der Löslichkeit des dem Amin entsprechenden Ammoniumsalzes, wenn die Umsetzung bei einem pH-Wert unterhalb des pKa-Werts dieses Ammoniumsalzes durchgeführt wird. Vorzugsweise beträgt die Gesamtmenge an Keton bezogen auf das Reaktionsvolumen weniger als 500 g/l. [0037] Der im erfindungsgemäßen Verfahren benötigte Ammoniak oder das Ammoniumsalz können sowohl zu Beginn vorgelegt als auch während der Umsetzung entsprechend dem Umsatz an Keton zudosiert werden. Vorzugsweise werden Ammoniak oder Ammoniumsalz so vorgelegt und gegebenenfalls zudosiert, dass während der Umsetzung die Gesamtmenge an Ammoniak und Ammoniumsalz stets in einem stöchiometrischen Überschuß zum Keton vorliegt. [0038] Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl im Batch als auch kontinuierlich durchgeführt werden. Bei einer Reaktionsführung im Batch erfolgt die Umsetzung vorzugsweise in einem Rührkesselreaktor oder in einem Membranreaktor. Bei einer kontinuierlichen Reaktionsführung erfolgt die Umsetzung vorzugsweise in einem Membranreaktor oder mit einem auf einem festen Träger immobilisierten Enzym in einem Festbettreaktor. Die Umsetzung in einem Membranreaktor ermöglicht eine einfache Rückhaltung der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Enzyme im Reaktor. Bei Verwendung eines rekombinanten Ganzzellkatalysators können die Enzyme auch durch Abtrennung der Zellen mittels Filtration oder Zentrifugation zurückgewonnen werden. [0039] Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Herstellung von enantiomerenangereicherten Aminen aus Ketonen, ohne dass dazu stöchiometrische Mengen eines chiralen Hilfsstoffs erforderlich wären und hat gegenüber den bekannten Verfahren den Vorteil, dass durch eine geeignete Kombination von alpha-Aminosäure bzw. alpha-Ketosäure und Aminosäuredehydrogenase praktisch jede Aminosäuretransaminase für die Umsetzung des Ketons verwendet werden kann, so dass für jedes Keton jeweils die Aminosäuretransaminase eingesetzt werden kann, mit der sich die beste Enantioselektivität erzielen lässt. 6/9 DE 10 2007 042 600 A1 2009.03.12 ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen. Zitierte Patentliteratur - WO 99/46398 [0008, 0018] - EP 1818411 [0009] - US 3183170 [0010] - EP 0404146 [0019] Zitierte Nicht-Patentliteratur - Bornscheuer und Kazlauskas, Hydrolases in Organic Synthesis (2005), Wiley-VCH Weinheim [0003] - Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, 2nd Edition(2002), ed. Drauz und Waldmann, Wiley-VCH Weinheim [0003] - Matcham et al., Chimica Oggi 14 (1996) 20–24 [0008] - Matcham et al., Chimia 53 (1999) 584–589 [0008] - Shin et al., Biotechnology and Bioengineering 65 (1999) 206–211 [0009] - Yun et al., Applied and Environmental Microbiology 70 (2004) 2529–2534 [0018] - Shin et al., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 65 (2001) 1782–1788 [0018] - Kaulmann et al., Enzyme and Microbial Technology 41 (2007) 628–637 [0018] - Shin et al., Applied Microbiology and Biotechnology 61 (2003) 463–471 [0018] - Shin et al., Biotechnology and Bioengineering 65 (1999) 206–211 [0018] - Matcham et al., Chimia 53 (1999) 584–589 [0018] - Oshima et al, International Industrial Biotechnology 9 (1989) 5–11 [0023] - Ohsima et al., European Journal of Biochemistry 191 (1990) 715–720 [0023] - Khan et al., Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 69 (2005) 1861–1870 [0023] - Hummel et al., Applied Microbiology and Biotechnology 26 (1987) 409–416 [0023] - Bommarius in Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, 2nd Edition(2002), ed. Drauz und Waldmann, Wiley-VCH Weinheim [0023] - Vedha-Peters et al., Journal of the American Chemical Society 128 (2006) 10923–10929 [0024] - Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, 2nd Edition(2002), ed. Drauz und Waldmann, Wiley-VCH Weinheim [0026] - Tishkov et al. in Biomolecular. Engineering 23 (2006) 89–11 [0027] - Relyea et al., Bioorganic Chemistry 33 (2005) 171–189 [0029] 7/9 DE 10 2007 042 600 A1 2009.03.12 Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung eines enantiomerenangereicherten Amins aus einem Keton, dadurch gekennzeichnet, dass ein Keton mit Ammoniak oder einem Ammoniumsalz und einem Reduktionsmittel umgesetzt wird in Gegenwart eines katalytischen Systems, umfassend a) eine Aminosäuretransaminase, b) eine alpha-Aminosäure, die ein Substrat der Aminosäuretransaminase ist, c) eine zur Herstellung der alpha-Aminosäure geeignete Aminosäuredehydrogenase, d) NAD(P)+ und e) ein NAD(P)+ reduzierendes Enzym, das NAD(P)+ mit dem Reduktionsmittel zu NAD(P)H umsetzt. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuredehydrogenase die der alpha-Aminosäure entsprechende alpha-Ketosäure selektiv zum S-Enantiomer der alpha-Aminosäure umsetzt und die Aminosäuretransaminase selektiv das S-Enantiomer der alpha-Aminosäure mit dem Keton umsetzt. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuredehydrogenase die der alpha-Aminosäure entsprechende alpha-Ketosäure selektiv zum R-Enantiomer der alpha-Aminosäure umsetzt und die Aminosäuretransaminase selektiv das R-Enantiomer der alpha-Aminosäure mit dem Keton umsetzt. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Reduktionsmittel eine Salz der Ameisensäure und das NAD(P)+ reduzierende Enzym eine Formiatdehydrogenase ist. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Reduktionsmittel Glucose und das NAD(P)+ reduzierende Enzym eine Glucosedehydrogenase ist. 6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuredehydrogenase ausgewählt ist aus Leucindehydrogenasen, Alanindehydrogenasen, Phenylalanindehydrogenasen und Glutamatdehydrogenasen. 7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass Aminosäuretransaminase, Aminosäuredehydrogenase und das NAD(P)+ reduzierende Enzym in Form eines rekombinanten Ganzzellkatalysators eingesetzt werden. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Ganzzellkatalysator ein Bakterium, vorzugsweise ein Escherichia coli Bakterium, ist, das Aminosäuretransaminase, Aminosäuredehydrogenase und das NAD(P) reduzierende Enzym überexprimiert. 9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass das Keton ausgewählt ist aus Dialkylketonen, Alkylarylketonen, Alkylheteroarylketonen und Alkylaralkylketonen, wobei die Alkylgruppen, Arylgruppen und Heteroarylgruppen mit nicht enzyminhibierenden Gruppen substituiert sein können. 10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass zu Beginn der Umsetzung an Stelle der alpha-Aminosäure die der alpha-Aminosäure entsprechende alpha-Ketosäure vorgelegt wird. 11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung in einem wässrigen Reaktionsmedium bei einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 9 erfolgt. 12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung in einem Zweiphasensystem aus einer wässrigen und einer organischen Phase erfolgt. 13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass zu Beginn der Umsetzung nur ein Teil des umzusetzenden Ketons vorgelegt wird und der restliche Teil des umzusetzenden Ketons entsprechend dem Umsatz an Keton zudosiert wird. 14. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamtmenge an alpha-Aminosäure und der alpha-Aminosäure entsprechender alpha-Ketosäure, bezogen auf die Gesamtmenge an Keton, im Bereich von 1 bis 50 mol-%, vorzugsweise 2 bis 10 mol-%, liegt. 8/9 DE 10 2007 042 600 A1 2009.03.12 15. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamtmenge an NAD(P)+ und NAD(P)H, bezogen auf die Gesamtmenge an Keton, im Bereich von 0,001 bis 5 mol-%, vorzugsweise 0,01 bis 1 mol-% liegt. Es folgt kein Blatt Zeichnungen 9/9
