Übungen zur Vorlesung „Chemie für Biotechnologen“

Übungen zur Vorlesung „Chemie für Biotechnologen“
Lösungen zu Blatt 1
Aufgabe 1 :
a) Aminosäuren mit unpolaren Resten :
Î aliphatische oder aromatische Kohlenwasserstoffreste
Î Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan, Methionin
b) Aminosäuren mit ungeladenen polaren Resten :
Î polare Gruppen im Rest (z.B. Hydroxy- (-OH), Thiol- (-SH) oder Amidogruppen (-C(O)NH2)), dadurch
z.B. erhöhte Wasserlöslichkeit
Î Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin, Glutamin
c) Aminosäuren mit (bei pH 6-7) positiv geladenen Resten :
Î basische Funktionen liegen bei pH 6-7 protoniert vor, das Molekül ist insgesamt positiv geladen (z.B.
Aminogruppen : -NH2 + H+ -> -NH3+ )
Î Lysin, Arginin, Histidin
d) Aminosäuren mit (bei pH 6-7) negativ geladenen Resten (saure Aminosäuren) :
Î Die zusätzlichen Carboxylgruppen der beiden Vertreter dieser Gruppe sind bei pH 6-7 vollständig
ionisiert und damit negativ geladen
Î Asparaginsäure, Glutaminsäure
Aufgabe 2 :
In der FISCHERProjektion bei der die C-Kette senkrecht und das C-Atom mit der niedrigsten Positionsnummer
oben steht, ist die Aminogruppe der L-Aminosäuren links, die der D-Aminosäuren rechts angeordnet. Dabei
entspricht die L-Konfiguration der (S)-Konfiguration nach CAHN-INGOLD-PRELOG [CIP-Regeln, absolute
Konfiguration], ausgenommen L-Cystein (s.u.), das aufgrund der Prioritätsregeln der (R)-Konfiguration
entspricht. Isoleucin und Threonin besitzen ein weiteres Chiralitätszentrum und kommen in der Natur
hauptsächlich nur als ein Diastereomer, (2S,3S)-Isoleucin und (2S,3R)-Threonin, vor.
H
N
COOH
COOH
H2N
3
1 : Tryptophan
HO
H
1
2
H
O
H2N
H
CH2
CH2
NH2
4
NH
NH
CIP : (S)
L
H
4
1
H
COOH
N
H
COOH
COOH
3
2 : Prolin
NH
H
NH
H2C
H2C
2
D
CIP : (R)
HO
2
O
OH
3 : Tyrosin
H
NH2
3
COOH
COOH
H2N
4
H2N
H
H
CH2
CH2
OH
OH
1
CIP : (S)
2
4 : Cystein
SH
4
H2N
1
H
COOH
3
CIP : (R) !!!
COOH
COOH
H2N
H
L
H2N
H
CH2
CH2
SH
SH
L
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Lösungen zu Blatt 1
Aufgabe 3 :
Bei der Titration von Alanin mit Natronlauge treten folgende Protonierungsgleichgewichte auf :
O
OH
C
H3N
H
CH3
Kation (H2A+)
pK'1
- H+
+ H+
O
O
C
H3N
H
CH3
Zwitterion (HA)
pK'2
- H+
+ H+
O
O
C
H2N
H
CH3
Anion (A-)
Der pK-Wert für die erste Dissoziationsstufe, die Deprotonierung der α-Carboxylfunktion, wird mit pK‘1
bezeichnet, der für die α-Aminofunktion mit pK‘2. Für verdünnte Lösungen lässt sich der pH-Wert in guter
Näherung mit der Henderson-Hasselbalch-Gleichung annähern :
Für die erste Deprotonierung :
Für die zweite Deprotonierung :
Damit lässt sich der pH-Wert an jedem Punkt der Titrationskurve berechnen. Bei Zugabe von 0,5 und 1,5
Äquivalenten Natronlauge gilt pH=pK, da protonierte und deprotonierte Form jeweils zu gleichen Teilen
vorliegen und der Logarithmusterm der Gleichung wegfällt.
Der isoelektrische Punkt, pHIP ist der pH-Wert, bei dem die Anzahl der positiven Ladungen im Molekül gleich
der Anzahl der negativen ist und das Molekül eine Nettoladung von 0 besitzt. Durch Auflösen der obigen H-HGleichungen nach [H2A+] und [A-] und Gleichsetzen erhält man folgende Beziehung für den Isoelektischen
Punkt :
Damit ergibt sich mit Hilfe der tabellieten pK-Werte für die Titrationskurve der folgende Verlauf :
Zum « zkizzieren » des Verlaufes reicht die Kenntnis der Wendepunkte bei 0,5 und 1,5 Äq. NaOH und des pHI
und des Titrationskurvenverlaufes einer schwachen zweibasigen Säure.
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Lösungen zu Blatt 1
Die Titrationskurven von Aminosäuren mit einem ionisierbaren Rest sind komplizierter. Die Dissoziation am
Rest wird mit dem pKR-Wert beschrieben. Durch die elektronische Wechselwirkung der Amino- und
Carboxylgruppe am α-C-Atom ist die α-Carboxylgruppe « saurer » als eine Carboxylgruppe im Rest, umgekehrt
ist eine Aminogruppe im Rest « basischer » als die am α-C-Atom.
Dementsprechend wird bei Aminosäuren mit Carbonsäurefunktion im Rest zunächst die a-Carboxylgruppe, dann
die im Rest deprotoniert :
durch Nachbarschaft zur Aminogruppe saurer als die Carboxylgruppe im Rest
O
pK'1
OH
C
O
C
+
H3N
H
CH2
O
pK'R
O
-H
H3N
+ H+
H
-H
H3N
+ H+
O
H
-H
H2N
+ H+
H
CH2
O
O
O
C
+
CH2
OH
O
pK'2
O
C
+
CH2
OH
O
O
O
Bei basischen Aminosäuren wird nach der Carboxylgruppe zunächst die αAminogruppe deprotoniert :
durch Nachbarschaft zur Carboxylgruppe weniger basisch als die Aminogruppe im Rest
O
OH
C
H3N
pK'1
O
C
+
H
CH2
NH3
-H
+ H+
O
H3N
pK'2
O
C
+
H
CH2
-H
+ H+
NH3
O
H2N
pK'R
O
H
CH2
NH3
-H
+ H+
O
C
+
H2N
H
CH2
NH2
Aufgabe 4 :
a) Nachweis von Aminosäuren allgemein :
1. Markieren als gelbes 2,4-Dinitrophenyl-(DNP)-Derivat (Sanger-Methode) durch SNAr-Reaktion mit 2,4Dinitrofluorbenzol. Identifizierung z.B. durch dünnschichtchromatographischen Vergleich mit den
bekannten DNP-Derivaten der Aminosäuren :
2. Markieren als intensiv fluoreszierende Dansylderivate durch Reaktion mit Dansylchlorid. Trennung und
quantitative Bestimmung z.B. mittels HPLC :
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Lösungen zu Blatt 1
3. Reaktion mit Ninhydrin ergibt einen blauvioletten Farbstoff :
Ninhydrin bildet das im Schema dargestellte stabile Hydrat (der Carbonylverbindung), der erste
Reaktionschritt ist eine Iminbildung (s. Aufgabe 5). Nach Decarboxylierung wird im dritten Schritt der
Teil der ursprünglichen Aminosäure als Aldehyd abgespalten, der den (individuellen) Rest der trägt.
Damit ist der aus dem entstandenen Amin durch neuerliche Iminbildung mit einem weiteren
Ninhydrinmolekül entstehende Farbstoff nicht aminosäurespezifisch, was für photometrische
Bestimmungen von Vorteil ist. (Zu photometrischer Konzentrationsbestimmung siehe Anhang zum
Lambert-Beer’schen Gesetz)
b) Analyse der Aminosäuresequenz in Peptiden :
1. Reduzieren aller Disulfid-Gruppen (z.B. mit Thioethanol), Alkylieren der entstehenden Sulfhydrylgruppen (z.B. mit Jodessigsäure)
2. Kopletthydrolyse einer Probe des Peptides, Bestimmung der Aminosäure-Zusammensetzung (z.B.
Ionenaustauschchromatographie)
3. Bestimmung der N- und C-terminalen AS in einer Probe des Peptides.
4. Chemische oder enzymatische Zerlegung des Peptides in kleinere Peptide, Bestimmung deren
Zusammensetzung (s.o.) und Sequenz (z.B. EDMAN-ABBAU s. nach)
5. Erneute Zerlegung des ursprünglichen Peptides durch andere chemische oder enzymatische Verfahren an
anderen Stellen. Bestimmung der Zusammensetzung und Sequenz.
6. Vergleich der beiden Gruppen von Bruchstücken, Identifizierung von Überlappungen zur Bestimmung
der Gesamtzsequenz.
7. Bestimmung der Position der Disulfidbrücken im Peptid.
EDMAN-Abbau : Methode zum schrittweisen Abbau von Peptiden durch Reaktion der N-terminalen
Aminosäure mit Phenylisothiocyanat (1) unter leicht basischen Bedingungen. Das entstehende
Phenylthiocarbamyl-Derivat (2) des Peptides zerfällt beim Ansäuern in das Phenylthiohydantin-Derivat (3) der
N-terminalen Aminosäure und das intakte Restpeptid. Das Phenylhydantoin lässt sich basisch wieder in
Phenylisothiocyanat und N-terminale Aminosäure spalten.
NH2
NH
−
Nδ
C
δ+ C
S
1
NH2
pH=8
R1
R1
R1
O
O
H
S
HN
H
N
O
N
S
O
NH
Peptid
3
OH-
N
NH2
R2
R2
R1
O
O
Peptid
R2
+
Peptid
2
+
O
OH
N
C
S
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Lösungen zu Blatt 1
c) Zur Trennung von Aminosäuren.
Î Chromatographische Methoden, Elektrophorese, ... (s. Vorlesung)
Aufgabe 5 :
Synthese von Valin nach Strecker :
O
NH
+ NH3
H
- H2O
HCN
H
Aldehyd
NH2
CN
H+ / H2 O
H
Imin
NH2
COOH
H
2-Amino-nitril
α-Aminosäure
Im ersten Schritt addiert sich der Ammoniak mit seinem freien Elektromenpaar an den elektrophilen Kohlenstoff
der Carbonylgruppe. Das zwitterionische Produkt kann sich durch Deprotonierung am Stichstoff und
Reprotonierung am Sauerstoff neutralisieren, durch Eliminierung von Wasser entsteht das Imin :
O
δ+
H
δ−
O
OH
NH3
+ NH3
NH
NH2
H
H
- H2O
H
Durch Addition von Cyanwasserstoff entsteht ein 2-Aminonitril. In diesem Schritt wird die Stereochemie am αKohlenstoff festgelegt. Da der Angriff auf beide Seiten des trigonal planaren Imins geleich warscheinlich ist,
entsteht ein Racemat.
NH
H+
CN
H
NH2
NH2
CN
H
+
H
CN
Nitrile (Cyanoverbindungen) lassen sich säurekatalysiert zu Carbonsäuren Hydrolysieren :
Trennung von Aminosäureracematen z.B.:
• Umsetzung mit chiralen Basen, Fraktionierte Kristallisation
• N-Acetylierung des Racemates, Enzymatische Abspaltung der Acetylgruppe nur an der L-Aminosäure,
Abtrennung der acetylierten D-Aminosäure, Durch Kochen mit Säure Racemisierung, Wiederholen des
Vorganges -> s. Vorlesung
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Lösungen zu Blatt 1 - Anhang
Quantitative Behandlung der Absorption: Lambert-Beer'sches Gesetz
Ein monochromatisches Strahlenbündel hinreichender Querausdehnung mit der Ausgangsintensität I0
durchdringe eine verdünnte Lösung der Dicke d eines absorbierenden Stoffs in einem nicht absorbierenden
Lösungsmittel.
Die
durchgelassene
Lichtintensität
I
Transmission = —
I0
nimmt exponentiell mit steigender Konzentration des gelösten Stoffes oder bei konstanterKonzentration mit
zunehmender Schichtdicke der Küvette ab:
I = I0 · exp (- ε · d · c)
Nach Logarithmieren und Umformen der Gleichung gilt:
I0
2,3 · log — = ε · d · c = E
I
(2)
Diese Gleichung drückt das Lambert-Beer-Gesetz aus, wobei
I0: Intensität der Strahlung vor Eintritt in die Lösung
I : Intensität der Strahlung nach Durchdringen der Schichtdicke d
d : Schichtdicke der Lösung (z.B. Küvettenmaß) in cm
c : Konzentration der absorbierenden Substanz in mol · l-1
ε : molarer Extinktionskoeffizient in l · mol-1 · cm-1
E : Extinktion
Die durch die Gleichung (2) definierte physikalische Größe ε wird molarer Extinktionskoeffizient der
absorbierenden Substanz bei der Wellenlänge l genannt und in der Einheit l · mol-1 · cm-1 angegeben. Im
Idealfall ist ε eine unter definierten Meßbedingungen (Temperatur, Lösungsmittel, pH usw.) nur von der
absorbierenden Substanz und der Wellenlänge l der monochromatischen Strahlung, nicht aber von c und d
abhängige Konstante. Sie ist als Stoffkonstante für zahlreiche Substanzen tabelliert. Die Tatsache, daß viele
organische Stoffe hohe ε-Werte haben, ermöglicht die Bestimmung von extrem niedrigen Konzentrationen.
Dieser physikalische Vorteil wird in der Biochemie ausgenutzt und bildet die Grundlage der Spektrophotometrie.
Gültigkeit des LAMBERT BEER'schen Gesetzes:
a)
nur für monochromatische Strahlung, d.h. die zur Messung der Lichtabsorption in der Probe verwendete
elektromagnetische Strahlung darf nur eine Wellenlänge haben,
b) nur für verdünnte Lösungen. Bei höheren Konzentrationen des absorbierenden Stoffes treten bei allen
Stoffen Abweichungen vom linearen Zusammenhang zwischen E und c auf; diese Kurven sind gekrümmt,
d.h. E ist dann auch von c abhängig. Ursache dieses Verhaltens sind Wechselwirkungen zwischen den
absorbierenden Teilchen (Aggregation, Dissoziation u.ä.), veränderte Wechselwirkungen mit dem
Lösungsmittel (Solvationsgrad u.ä.).
Der Gültigkeitsbereich des linearen Zusammenhangs zwischen E und c muß im Einzelfall empirisch ermittelt
werden. Aufgrund der großen Empfindlichkeit, des geringen Zeitaufwandes und der breiten Anwendbarkeit
gehört die Spektrophotometrie als Analysemethode zu den im biochemischen Labor am häufigsten benutzten
Techniken