Tierärztliche Hochschule Hannover Vergleichende Analyse von
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Tierärztliche Hochschule Hannover Vergleichende Analyse von aviären Coronavirusstämmen in primären Hühnerovidukt Zellkultursystemen INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae ( Dr. med. vet. ) vorgelegt von Ann-Kathrin Mork (geb. Dirks) Leer Hannover 2015 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Georg Herrler Institut für Virologie, Tierärztliche Hochschule Hannover 1. Gutachter: Prof. Dr. Georg Herrler Institut für Virologie, Tierärztliche Hochschule Hannover 2. Gutachter: Prof. Dr. Silke Rautenschlein, PhD Klinik für Geflügel, Tierärztliche Hochschule Hannover Tag der mündlichen Prüfung: 20.04.2015 Teile dieser Arbeit wurden durch ein Stipendium der „Hannover Graduate School for Veterinary Pathobiology, Neuroinfectiology, and Translational Medicine“ (HGNI), gefördert, finanziert durch Boehringer Ingelheim Meiner Familie Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................................... IX Abbildungsverzeichnis .................................................................................................... XIII Tabellenverzeichnis ......................................................................................................... XIV Wissenschaftliche Beiträge ............................................................................................. XVI 1. Einleitung und Zielformulierung ................................................................................. 1 2. Literaturübersicht......................................................................................................... 3 2.1. Coronaviren ........................................................................................................ 3 2.1.1. Taxonomie.............................................................................................. 3 2.1.2. Virusmorphologie und Genomstruktur .................................................... 5 2.1.3. Strukturproteine der Coronaviren ............................................................ 6 2.1.4. 2.2. 3. 2.1.3.1. Das Spike-Protein (S) ............................................................ 6 2.1.3.2. Rolle des Spike-Proteins für den Speziestropismus von Coronaviren ........................................................................... 8 2.1.3.3. Das Membran-Protein (M) ..................................................... 9 2.1.3.4. Das Nukleokapsid-Protein (N) ..............................................10 2.1.3.5. Das Envelope-Protein (E) .....................................................10 2.1.3.6. Das Hämagglutinin-Esterase-Protein (HE) ............................10 Replikation............................................................................................ 11 Das aviäre Coronavirus ......................................................................................12 2.2.1. Ätiologie ............................................................................................... 12 2.2.2. Epidemiologie und Pathogenese .......................................................... 13 2.2.3. Klinisches Erscheinungsbild ................................................................. 14 2.2.4. Bekämpfung ......................................................................................... 15 2.3. Sialinsäuren als Rezeptordeterminanten ............................................................17 2.4. Aufbau und Funktion des galliformen Ovidukts...................................................18 2.4.1. Infundibulum ......................................................................................... 19 2.4.2. Magnum ............................................................................................... 20 2.4.3. Isthmus................................................................................................. 20 2.4.4. Uterus................................................................................................... 20 2.4.5. Vagina .................................................................................................. 21 Material ........................................................................................................................23 3.1. Zelllinien .............................................................................................................23 3.2. Viren ..................................................................................................................24 3.3. Bakterien ............................................................................................................24 V 3.4. Plasmide ............................................................................................................24 3.5. cDNA .................................................................................................................25 3.6. Embryonierte Hühnereier ...................................................................................25 3.7. Hühner ...............................................................................................................25 3.8. Zellkulturmedien .................................................................................................26 3.9. Bakterienkulturmedien........................................................................................28 3.10. Puffer und Lösungen ..........................................................................................29 3.11. Transfektionsreagenzien ....................................................................................34 3.12. Synthetische Oligonukleotide .............................................................................34 3.13. Restriktionsendonukleasen ................................................................................35 3.14. Enzyme ..............................................................................................................35 3.15. Substrate............................................................................................................35 3.16. DNA- und Proteinmarker ....................................................................................35 3.17. Antikörper...........................................................................................................36 3.18. Lektine ...............................................................................................................37 3.19. Kits .....................................................................................................................37 3.20. Weitere Chemikalien ..........................................................................................38 3.21. Geräte und sonstige Materialien .........................................................................38 3.22. Verbrauchsmaterialien .......................................................................................40 3.23. Software .............................................................................................................40 4. Methoden .....................................................................................................................41 4.1. Zellkulturtechnik .................................................................................................41 4.1.1. Zellkultur ............................................................................................... 41 4.1.2. Kryokonservierung und Auftauen von Zellen ........................................ 41 4.1.3. DAPI-Test ............................................................................................. 41 4.1.4. Bestimmung der Zellzahl ...................................................................... 42 4.1.5. Herstellung primärer Hühnernierenzellkulturen ..................................... 42 4.1.6. Isolierung des Oviduktes für Organschnitte .......................................... 43 4.1.7. Lebend-/Totfärbung .............................................................................. 43 4.1.8. Isolierung von Epithelzellen des Ovidukts ............................................. 43 4.1.9. Aussäen der Oviduktzellen auf Deckgläschen ...................................... 44 4.1.10. Infektionsversuche mit Oviduktringen ................................................... 44 4.1.11. Herstellung von Kryoschnitten .............................................................. 45 4.1.12. Infektionsversuche mit isolierten COEC ................................................ 45 4.1.13. Lektinfärbungen .................................................................................... 46 4.1.14. Virusanzucht ......................................................................................... 46 4.2. Bindungstests mit löslichen AvCoV-S-Proteinen ................................................47 VI 4.3. 4.2.1. Neuraminidase-Behandlung ................................................................. 47 4.2.2. Durchflusszytometrie ............................................................................ 47 4.2.3. Bindungstest löslicher Proteine mit Kryoschnitten des Ovidukts ........... 48 Virustiterbestimmung..........................................................................................48 4.3.1. 4.4. Transiente Transfektion eukaryotischer Zellen ...................................................50 4.4.1. 4.5. 4.6. Foci forming units, Endpunktverdünnungsmethode .............................. 48 Transiente Transfektion von BHK-21-Zellen ......................................... 50 Biochemische und immunologische Methoden ...................................................51 4.5.1. Immunfluoreszenztest .......................................................................... 51 4.5.2. SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) ........................... 52 4.5.3. Western Blot ......................................................................................... 52 4.5.4. Immunologische Detektion von Proteinen ............................................. 52 Molekularbiologische Methoden .........................................................................53 4.6.1. Isolierung viraler RNA ........................................................................... 53 4.6.2. RT-PCR................................................................................................ 53 4.6.3. Herstellung löslicher Spike-Proteine ..................................................... 53 4.6.4. Polymerasekettenreaktion (PCR) ......................................................... 54 4.6.5. Reinigung von DNA-Fragmenten .......................................................... 55 4.6.6. Spaltung der DNA mittels Restriktionsendonukleasen .......................... 55 4.6.7. Agarosegelelektrophorese .................................................................... 56 4.6.8. Isolierung von DNA aus Agarosegelen ................................................. 56 4.6.9. Bestimmung der DNA-Konzentration .................................................... 57 4.6.10. Ligation................................................................................................. 57 4.6.11. Hitzeschock-Transformation chemisch kompetenter E. coli XL1-Blue... 58 4.6.12. Kolonie-PCR......................................................................................... 58 4.6.13. Präparation von Plasmid-DNA .............................................................. 59 4.6.14. Sequenzierung ..................................................................................... 60 5. 6. Publikation ...................................................................................................................61 5.1. Manuskript I .......................................................................................................61 5.2. Manuskript II ......................................................................................................63 Diskussion ...................................................................................................................75 6.1. Bewertung der Etablierung von primären Hühnerovidukt-Zellkultursystemen .....75 6.2. Bedeutung der Sialinsäureexpression im Ovidukt für eine AvCoV-Infektion .......76 6.3. Bedeutung der S-Protein-Bindung für den Gewebetropismus des AvCoV ..........78 7. Literaturverzeichnis ....................................................................................................81 8. Zusammenfassung......................................................................................................96 9. Summary ......................................................................................................................99 VII 10. Anhang .......................................................................................................................101 11. Danksagung...............................................................................................................102 VIII Abkürzungsverzeichnis AA Aminosäuren (amino acids) Abk. Abkürzung AK Antikörper AP Alkalische Phosphatase APN Aminopeptidase N Aqua bidest. zweifach destilliertes Wasser (Aqua bidestillata) AS Aminosäure oder Antisense-Primer AvCoV Aviäres Coronavirus bp Basenpaare BCoV Bovines Coronavirus BHK Baby hamster kidney BSA Bovines Serumalbumin bzw. beziehungsweise cDNA complementary DNA COEC Chicken oviduct epithelial cell CoV Coronavirus CPE zytopathischer Effekt C-Terminus Carboxyterminus Cy3 Carbocyanin-3 DAPI 4’,6-Diamidin-2’-phenylindoldihydrochlorid DEPC Diethylpyrocarbonat DMEM Dulbecco´s modified Eagle medium DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxynukleotidtriphosphat eCKC embryonale Hühnernierenzellen E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EGF Epidermal growth factor EMEM Eagle´s Minimum Essential Medium IX ER Endoplasmatisches Retikulum ERGIC Endoplasmatisches Retikulum-Golgi-intermediäres Kompartiment (Endoplasmic reticulum golgi intermediate compartment) et al. und andere (et alli) FcoV Felines Coronavirus FIPV Feline infectious peritonitis virus FITC Fluoresceinisothiocyanat FKS Fetales Kälberserum g Gramm (bezogen auf die Masse) oder Erdbeschleunigung HCoV Humanes Coronavirus HE-Protein Hämagglutinin-Esterase-Protein IBV Infektiöses Bronchitisvirus (Infectious bronchitis virus) ICTV International Committee for the Taxonomy of Viruses IFA Immunfluoreszenzanalyse Ig Immunglobulin kb Kilobasen kDa Kilodalton l Liter LB Luria Bertani M Molar mA Milliampere mAK monoklonaler Antikörper MCS Multiple Cloning Site MERS Middle East Respiratory Syndrome MHV Maus-Hepatitisvirus (Murine hepatitis virus) min Minute ml Milliliter mM Millimolar mRNA messenger RNA nm Nanometer X N-Terminus Aminoterminus Neu5AC N-Acetylneuraminsäure Neu5,9 Ac2 N-acetyl-9-O-Acetylneuraminsäure nsp Nicht-Strukturprotein ORF Offener Leserahmen (open reading frame) PAGE Polyacrylamidgel-Elektrophorese pAPN porzine Aminopeptidase PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung PBSM PBS ohne Calcium und Magnesium PCR Polymerasekettenreaktion (Polymerase chain reaction) PFA Paraformaldehyd Pfu Pyrococcus furiosus pH negativer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration pp Polyprotein RNA Ribonukleinsäure rpm Umdrehungen pro Minute (revolutions per minute) RT Raumtemperatur RT-PCR Reverse Transkriptase-PCR S Sense-Primer SARS schweres akutes Atemwegssyndrom SDS Natriumdodecylsulfat S-Protein Spike-Protein (+)ss-RNA Positiv-orientierte Einzelstrang-RNA TAE Tris-Acetat-EDTA Taq Thermus aquaticus TBE Tris-Borat-EDTA TEMED N, N´, N´-Tetramethylethylendiamin TGEV Virus der übertragbaren Gastroenteris der Schweine (Transmissible gastroenteritis virus) TMD Transmembrandomäne U Einheit (Unit) XI UV Ultraviolett V Volt v/v Volumen zu Volumen WB Westernblotanalyse well Vertiefung wt Wildtyp w/v Masse zu Volumen α entgegengerichtet (bei Antikörpern) °C Grad Celsius µg Mikrogramm µl Mikroliter µM Mikromolar XII Abbildungsverzeichnis Abbildung 1 Abbildung 2 Abbildung 3 Abbildung 4 Abbildung 5 Abbildung 6 Abbildung 7 Abbildung 8 Schematischer Überblick über die taxonomische Einteilung der Familie der Coronaviridae (Datenquelle International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV), 2014) .................................................................................................. 4 Schematische Darstellung eines Coronaviruspartikels. S= Spike-Protein, M= Membran-Protein, E= Envelope-Protein, N= Nukleokapsid-Protein, HE= Hämagglutinin-Esterase-Protein (nur bei einigen Vertretern der Betacoronaviren vorhanden). Das virale Genom trägt am 5´Ende eine CapStruktur und ist am 3´Ende polyadenyliert. ..................................................... 6 Ovidukt eines juvenilen (18 Wochen) alten Huhnes direkt nach der Präparation. Das entnommene Ovidukt wird in die vier Abschnitte Infundibulum, Magnum, Isthmus und Uterus unterteilt. ..................................19 Lichtmikroskopaufnahme isolierter COEC, die sich zu einer „Epithelzellinsel“ formiert haben und von Zellen, die ihre Differenzierung verloren haben, umrandet werden...........................................................................................67 Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme einer Epithelzellinsel. Zilientragende Zellen wurden mit einem anti-ß-Tubulin Antikörper (rot) gefärbt, Muzin produzierende Zellen wurden mit einem anti-Muc5Ac Antikörper gefärbt (grün). Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt...........................................68 Charakterisierung isolierter COEC mittels Lektinfärbung (Konfokalmikroskopie). Die isolierten COEC wurden mit Lektinen (A) SNA (Roche), (B) MAA I (Vector Labs), (C) MAA (Roche), (D) MAAII (Vektor Labs), (E) SNA (Vector Labs) inkubiert. Die Zellkerne wurden mit DAPI gefärbt (blau). ......................................................................................................................69 Immunfluoreszenzanalyse infizierter COEC mittels Konfokalmikroskopie. Die isolierten COEC wurden mit den AvCoV-Stämmen (A) QX, (B) B1648, (C) Bd, infiziert. Zur Detektion des Virusantigens wurde ein monoklonaler IBV Antikörper, gerichtet gegen das N-Protein verwendet und mit einem FITCgekoppelten anti-mouse-Fitc Antikörper sichtbar gemacht (grün). Die Zellkerne wurden mit DAPI gefärbt (blau). (D) diente als Negativkontrolle und wurde nur mit dem sekundären anti-mouse-Fitc Antikörper inkubiert. ............................70 Immunfluoreszenzanalyse infizierter Kryoschnitte. Die verschiedenen Segmente des Ovidukts Infundibulum, Magnum, Isthmus und Uterus wurden mit den AvCoV-Stamm Beaudette infiziert. Zur Detektion des Virusantigens wurde ein monoklonaler IBV Antikörper, gerichtet gegen das N-Protein verwendet und mit einem FITC-gekoppelten anti-mouse-FITC Antikörper sichtbar gemacht (grün). Die Zellkerne wurden mit DAPI gefärbt (blau). ......101 XIII Tabellenverzeichnis Tabelle 1 Tabelle 2 Tabelle 3 Tabelle 4 Tabelle 5 Tabelle 6 Tabelle 7 Tabelle 8 Tabelle 9 Tabelle 10 Tabelle 11 Tabelle 12 Tabelle 13 Tabelle 14 Tabelle 15 Tabelle 16 Tabelle 17 Tabelle 18 Tabelle 19 Tabelle 20 Tabelle 21 Tabelle 22 Tabelle 23 Tabelle 24 Tabelle 25 Tabelle 26 Tabelle 27 Tabelle 28 Tabelle 29 Tabelle 30 Tabelle 31 Tabelle 32 Tabelle 33 Tabelle 34 Tabelle 35 Tabelle 36 Tabelle 37 EMEM (Eagle’s Minimum Essential Medium), pH 7,0 ....................................26 DMEM (Dulbecco`s modified Eagel Medium), pH 6,9 ....................................26 Ham’s F12, pH 7,0-7,5...................................................................................26 Versen-Trypsin 0,125 %, pH 7,0 ....................................................................27 Zellkulturzusätze............................................................................................27 Einfriermedium ..............................................................................................27 CLEC213 Medium, pH 6,9 .............................................................................28 COEC Medium (Chicken oviduct epithelial cell medium), modifiziert nach Jung et al., (2011a) ................................................................................................28 Luria-Bertani (LB-Medium), pH 7,0 ................................................................28 LB-Agar, pH 7,0 .............................................................................................29 10 x TBE-Puffer .............................................................................................29 10 x TAE-Puffer, pH 8....................................................................................29 Ethidiumbromid-Färbebad .............................................................................30 10 x SDS-Laufpuffer ......................................................................................30 Sammelgellösung (5 ml) ................................................................................30 Trenngellösung (12 %) (5 ml) ........................................................................31 20 x MOPS Laufpuffer, pH 7,0 .......................................................................31 Anodenpuffer I, pH 9......................................................................................31 Anodenpuffer II, pH 7,4..................................................................................31 Kathodenpuffer, pH 9.....................................................................................32 PBS, pH 7,5 ...................................................................................................32 PBSM, pH 7,5 ................................................................................................32 PBSM 0,1 % Tween.......................................................................................32 3 % Paraformaldehyd ....................................................................................33 0,1 M Glycin in PBSM ....................................................................................33 0,2 % TRITON-X-100 in PBSM......................................................................33 1 % BSA in PBS ............................................................................................33 Mowiol ...........................................................................................................33 Mykoplasmen-Detektionstest .........................................................................34 Synthetische Oligonukleotide.........................................................................34 Antikörper ......................................................................................................36 Lektine ...........................................................................................................37 Bedingungen für eine Transfektion mit PEI ....................................................51 Ansatz der PfU-PCR ......................................................................................54 Bedingungen der PfU-PCR ............................................................................55 Restriktionsansatz .........................................................................................56 Ligationsansatz..............................................................................................58 XIV Tabelle 38 Tabelle 39 Tabelle 40 Ansatz für eine Kolonie-PCR .........................................................................59 Bedingungen der Kolonie-PCR ......................................................................59 Zusammenfassung der Lektinbindung auf Organexplantaten des adulten Ovidukts ......................................................................................................101 XV Wissenschaftliche Beiträge Veröffentlichungen: Shahwan, K., Hesse, M., Mork, A.-K., Herrler, G., and Winter, C. (2013). Sialic acid binding properties of soluble coronavirus spike (S1) proteins: Differences between infectious bronchitis virus and transmissible gastroenteritis virus. Viruses 5, 1924–1933. Mork, A.-K., Hesse, M., Abd El Rahman, S., Rautenschlein, S., Herrler, G., and Winter, C. (2014). Differences in the tissue tropism to chicken oviduct epithelial cells between avian coronavirus IBV strains QX and B1648 are not related to the sialic acid binding properties of their spike proteins. Vet. Res. 45, 67. Punyadarsaniya, D., Winter, C., Mork, A.-K., Amiri, M., Naim, H.Y., Rautenschlein, S., and Herrler, G. (2015). Precision-cut intestinal slices as a culture system to analyze the infection of differentiated intestinal epithelial cells by avian influenza viruses. J. Virol. Methods 212, 71–75. Teile dieser Arbeit wurden auf folgenden Kongressen präsentiert: A.-K. MORK, C.WINTER, G. HERRLER Comparative analysis of infections by current IBV field strains in primary chicken oviduct cell cultures. VII. Symposium on Avian Corona- & Pneumoviruses, Rauischholzhausen, Germany, June 2012 Ann-Kathrin Mork, Georg Herrler, Christine Winter Comparative analysis of infections by current IBV field strains in primary chicken oviduct cell cultures 5th Graduate School Day, Hannover, 24th November 2012 XVI A.-K. Mork, M. Hesse, S. Abd El Rahman, S. Rautenschlein, G. Herrler und C. Winter Unterschiede im Organ Tropismus der IBV Stämme QX, Beaudette und B1648 im in vitro Modell. 86. Fachgespräch über Geflügelkrankheiten, 24.-25. April 2014, Maritim Airport Hannover Posterpräsentationen: A.-K. Mork , G. Herrler , C. Winter Different sensitivity of primary chicken oviduct epithelial cells for the coronavirus IBV strains QX, B1648 and Beaudette is not related to the binding properties of their spike proteins. Gesellschaft für Virologie, 23rd Annual Meeting, Kiel, 2013 A.-K. Mork , G. Herrler , C. Winter Comparative analysis of infections by current IBV field strains in primary chicken oviduct cell cultures. Gesellschaft für Virologie, 22nd Annual Meeting, Essen, 2012 XVII 1. Einleitung und Zielformulierung 1. Einleitung und Zielformulierung Das aviäre Coronavirus ist einer der bedeutendsten Krankheitserreger in der Geflügelindustrie. Trotz bestehender Impfprogramme kommt es immer wieder zu Krankheitsausbrüchen in Virusvarianten kompletten einen Geflügelbeständen, Impfschutz da das Auftreten schwierig von macht. neuen Besondere wirtschaftliche Bedeutung kommt der Erkrankung in Legehennenbeständen zu, da das Virus neben dem Respirationstrakt und den Nieren, auch im Legedarm pathologische Veränderungen verursachen kann. Bei betroffenen Hühnern äußert sich die Infektion durch einen Legerückgang und eine deutliche Qualitätsminderung der Eier. Diesem Projekt liegt die Hypothese zugrunde, dass die unterschiedlich pathogene Wirkung von aviären Coronavirus-Stämmen auf das Ovidukt des Huhnes damit zusammenhängt, dass die betreffenden Viren die Epithelzellen des Ovidukts unterschiedlich effizient infizieren. Deshalb ist es das Ziel dieses Projekts, die Epithelzellen des Ovidukts von Hühnern hinsichtlich ihrer Empfänglichkeit für eine Infektion durch die aviären Coronavirusstämme QX, B1648 und Beaudette zu untersuchen. Zu diesem Zweck sollen primäre Organ-Kultursysteme mit Epithelzellen des Ovidukts etabliert werden. In einem ersten Charakterisierungsprozess sollen Ovidukt-Explantate zunächst auf ihre Lebensdauer unter in vitro-Bedingungen untersucht werden. Hierfür werden die Explantate mit Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt, wodurch eine Unterscheidung der toten von den lebenden Zellen möglich ist. Für Infektionsversuche ist eine minimale Lebensdauer der Explantate von ca. 2 Tagen notwendig. Ein großer Vorteil dieser Explantate ist, dass die Epithelzellen in ihrem ausdifferenzierten Zustand bleiben und die Zusammensetzung des Epithels derjenigen entspricht, die auch im lebenden Organismus besteht. Wenn dieses Kulturverfahren etabliert ist, können die Explantate für Infektionsversuche genutzt werden. Gefrierschnitte dieser Explantate werden für Lektinfärbungen und zur Anfärbung von Virusantigen genutzt. Vorversuche zur Kultivierung von Ovidukt Epithelzellen haben gezeigt, dass sich ringförmige Explantate von 16-18 Wochen 1 alten Tieren gut eignen, um 1. Einleitung und Zielformulierung Infektionsversuche in vitro durchzuführen. Um die Virulenz der Viren für das Oviduktepithel zu vergleichen, sollen folgende Parameter untersucht werden: • die Anzahl der infizierten Zellen wird mit Hilfe von Gefrierschnitten verglichen, indem die Anzahl Antigen-positiver Zellen pro Epithelabschnitt analysiert wird. • Der Tropismus der Viren zu bestimmten Zelltypen im Epithel (zilientragende, schleimproduzierende– oder basale Zellen) soll durch Doppelfärbungen mit Antikörpern gegen Marker-Proteine bestimmt werden. Außerdem soll die Expression von Sialinsäuren, der Rezeptordeterminante des aviären Coronavirus, auf den Epithelzellen durch Lektinfärbungen analysiert werden. Die Anfertigung von Gefrierschnitten aus den einzelnen Ovidukt-Abschnitten ermöglicht das Sichtbarmachen der Sialinsäuren auf der Oberfläche der Epithelzellen. Zu diesem Zweck werden intakte Zellen mit Lektinen und entsprechenden Fluoreszenfarbstoff-markierten Konjugaten inkubiert. Hier wird vor allem mit den Lektinen MAAI, MAAII und SNA die alpha-2,3- (MAA), bzw. alpha-2,6gebundene (SNA) Sialinsäure detektiert. Folgende Fragen sollen so beantwortet werden: 1. Gibt es Unterschiede im Expressionsmuster der Sialinsäuren entlang des Ovidukts? 2. Korreliert die Empfänglichkeit der einzelnen Bereiche für eine AvCoV-Infektion mit der Expression von alpha-2,3-gebundenen Sialinsäuren? 2 2. Literaturübersicht 2. Literaturübersicht 2.1. Coronaviren 2.1.1. Taxonomie Das aviäre Coronavirus (AvCoV) gehört zur Familie Coronaviridae (Abbildung 1), die zusammen mit den Familien Arteriviridae, Mesoniviridae und Roniviridae der Ordnung Nidovirales zugeordnet wird (Cavanagh, 1997; Lauber et al., 2012). Der Ordnungsname Nidovirales ist auf das lateinische Wort nidus (Nest) zurückzuführen und bezieht sich auf die für Mitglieder der Ordnung Nidovirales charakteristische Repilkationsstrategie, die Bildung eines sogenannten „nested set“, bestehend aus subgenomischen mRNAs, die alle die gleichen 3´-Enden aufweisen (Lai and Cavanagh, 1997; van Vliet et al., 2002). Die Familie Coronaviridae wird in zwei Subfamilien unterteilt, Coronavirinae und Torovirinae. Die Subfamilie der Coronavirinae wurde bis zum Jahr 2009 in drei Gruppen, (I, II und III) unterteilt. Die ICTV (International Committee of Taxonomy of Viruses) hat diese Einteilung jedoch geändert und die Subfamilie Coronavirinae in die drei Gattungen, Alpha-, Beta-, und Gammacoronavirus eingeteilt (de Groot, et al., 2012). Eine weitere Gattung, Deltacoronavirus wird der Subfamilie Coronavirinae seit kurzem ebenfalls zugeordnet (Adams und Carstens, 2012; Woo et al., 2010). Coronaviren weisen eine große Wirtsspezifität auf und werden häufig mit respiratorischen Erkrankungen (van der Hoek et al., 2005; Tyrrell und Bynoe, 1965; Woo et al., 2005), Erkrankungen des Gastrointestinaltrakts (Dea und Tijssen, 1989; Okaniwa and Maeda, 1965; Zhang et al., 1994) und Erkrankungen des zentralen Nervensystems in Verbindung gebracht (Goto et al., 1979; Weiner, 1973). Vertreter der Gattungen Alpha- und Betacoronavirus infizieren ausschließlich Säugetiere. Vertreter der Gattung Gammacoronavirus infizieren aviäre Spezies und beim Beluga Wal wurde ebenfalls ein Virus dieser Gattung nachgewiesen, das Beluga-Wal-CoV (BWCoV). Den Deltacoronaviren werden ausschließlich aviäre Spezies zugeordnet. Veterinärmedizinisch relevante Vertreter der Gattung Alphacoronavirus sind das feline infektiöse Peritonitisvirus (FIPV) und das Virus der übertragbaren Gastroenteritis der Schweine (TGEV). Als Erkältungserreger des Menschen gehört 3 2. Literaturübersicht das humanpathogene Coronavirus-229E (HCoV-229E) ebenfalls zur Gattung der Alphacoronaviren. Als veterinärmedizinisch wichtiger Vertreter der Betacoronaviren sind das Bovine Coronavirus (BCoV) und das Maus Hepatitisvirus (MHV), das häufig als Modell-Virus bei der Forschung an Coronaviren eingesetzt wird, zu nennen. Zu den wichtigen Vertretern der humanpathogenen Betacoronaviren gehören unter anderem das Virus des schweren akuten respiratorischen Syndroms (SARS-CoV) und das Virus des Middle-East respiratorischen Syndroms (MERS-CoV). Zu den Gammacoronaviren gehört das in dieser Arbeit untersuchte aviäre Coronavirus (bis 2009 Bezeichnung als Virus der infektiösen Bronchitis). Vertreter der Gattung Deltacoronavirus sind u.a. das Drossel-CoV (ThCoV-HKU12) und das Bulbul coronavirus HKU11 (BulbulCoV-HKU11). Ordnung Familie Sub-Familie Gattung Nidovirales Arteriviridae Coronaviridae Coronavirinae Mesoniviridae Roniviridae Torovirinae Alphacoronavirus Betacoronavirus Gammacoronavirus Deltacoronavirus Abbildung 1 Schematischer Überblick über die taxonomische Einteilung der Familie der Coronaviridae (Datenquelle International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV), 2014) 4 2. Literaturübersicht 2.1.2. Virusmorphologie und Genomstruktur Coronaviren (CoV) sind behüllte Viren und von pleomorpher, meist sphärischer Gestalt mit einem Durchmesser von 60-200 nm. Die Oberfläche des Viruspartikels weist ca. 20 nm große keulenförmige Projektionen auf, die das Viruspartikel scheinbar wie einen Kranz umgeben (Siddell et al., 1983). Bei diesem Kranz (lat.: corona) handelt es sich um das Spike-Protein (S-Protein), welches für die Namensgebung der Viren ausschlaggebend war. Das RNA-Genom ist einzelsträngig, nicht segmentiert und von positiver Polarität. Zusammen mit dem NukleokapsidProtein (N-Protein) bildet das virale Genom das Nukleokapsid, das von der Virushülle umgeben ist. Die Anordnung des Nukleokapsids ist helikal (Risco et al., 1996). In die äußere Lipiddoppelschicht der Virusmembran sind die viralen Strukturproteine Spike-Protein (S-), Membran-Protein (M-), welches mit der Innenseite der Virusmembran assoziiert ist, Envelope-Protein (E-), und das HämagglutininEsterase-Protein (HE-Protein), das nur einige Verteter der Betacoronaviren besitzen, eingelagert. Mit einer Größe von ca. 30000 Nukleotiden besitzen Coronaviren das größte Genom der RNA-Viren. Die genomische RNA trägt am 5`-Ende eine Cap-Struktur und ist am 3`-Ende polyadenyliert (Lai und Cavanagh, 1997). Am 5’-Ende des Genoms befinden sich die offenen Leserahmen (ORF) 1a und 1b, die für die RNA-Polymerase (pol) kodieren. In 5’ 3’ Richtung folgt die codierende Gensequenz von Coronaviren für die Strukturproteine in folgender Reihenfolge: (HE)-S-E-M-N. Zwischen den Leserahmen der Strukturproteine können zusätzlich noch verschiedenene, virus-spezifische Gene für Nicht-Strukturproteine vorhanden sein. 5 2. Literaturübersicht RNA S Membran M E N 3` HE Abbildung 2 Schematische Darstellung eines Coronaviruspartikels. S= SpikeProtein, M= Membran-Protein, E= Envelope-Protein, N= Nukleokapsid-Protein, HE= Hämagglutinin-Esterase-Protein (nur bei einigen Vertretern der Betacoronaviren vorhanden). Das virale Genom trägt am 5´Ende eine Cap-Struktur und ist am 3´Ende polyadenyliert. 2.1.3. Strukturproteine der Coronaviren 2.1.3.1. Das Spike-Protein (S) Als Strukturprotein Coronaviruspartikeln ist das eingebaut. Spike-Protein Das (S-Protein) S-Protein ist in die Hülle verantwortlich für von die Namensgebung der Coronaviren, da es das Viruspartikel durch seine ca. 20 nm großen, keulenförmigen Projektionen auf der Virusoberfläche, wie einen Kranz (lat. Corona) zu umgeben scheint. Es vermittelt die Bindung an den zellulären Rezeptor und ist verantwortlich für die Fusion von Virus- und Zellmembran. Dadurch vermittelt das S-Protein den Zelltropismus (Casais et al., 2003). Für das aviäre Coronavirus ist noch kein Rezeptorprotein bekannt, das eine Infektion vermitteln kann. Das S-Protein ist ein Typ 1 Membranprotein. Es besitzt eine relativ große N-terminale Ektodomäne, eine Transmembrandomäne und eine kurze zytoplasmatische Endodomäne am C- 6 2. Literaturübersicht Terminus. Die Ektodomäne des S-Proteins besitzt zahlreiche N- Glykosylierungsstellen. Mit 1160 Aminosäuren (AS) hat das aviäre Coronavirus das kürzeste S-Protein der Coronaviren. Das FIPV S-Protein hingegen hat ein Größe von 1452 AS (Cavanagh, 1995). Das Molekulargewicht des S-Proteins in ungespaltener Form beträgt 170-220 kDa. Abhängig von der Coronavirusspeizies kann das S-Protein in zwei nicht-kovalent verbundene Untereinheiten, die S1- und S2-Untereinheit, proteolytisch gespalten werden. Bei dem aviären Coronavirus, bei BCoV und MHV liegt das S-Protein in gespaltener Form im Viruspartikel vor, das S-Protein von TGEV und einigen anderen Coronaviren wird ungespalten in Virionen eingebaut (Cavanagh, 1995). Die Aminosäuresequenz der S-Proteine verschiedener Coronaviren variiert deutlich. Hierbei weist die S1-Untereinheit größere Varianz auf als die S2-Untereinheit. Aber selbst innerhalb der Spezies AvCoV gibt es große Unterschiede in der Spike-ProteinSequenz zwischen verschiedenen Stämmen. Die große Variabilität der S1Untereinheit ist der wesentliche Grund für das Auftreten vieler verschiedener Serotypen der aviären Coronaviren. Als Hauptantigen ist das S-Protein für die Bildung neutralisierender Antikörper verantwortlich. Die meisten antigenen Epitope befinden sich auf der S1-Untereinheit (Delmas und Laude, 1990). Auf der S2-Untereinheit befinden sich zwei Regionen mit einer 4,3-hydrophoben Wiederholung (heptad repeats), die auf eine coiled-coilStruktur hindeuten (de Groot et al., 1987; Rasschaert und Laude, 1987). Es wird angenommen, dass das S-Protein als Homotrimer vorliegt (Cavanagh, 1995). Für die beiden Coronaviren AvCoV und TGEV wurde gezeigt, dass ein Tyrosin-basiertes Retentionssignal in der zytoplasmatischen Domäne dazu führt, dass die S-Proteine beider Viren intrazellulär am ERGIC (endoplasmic reticulumgolgi intermediate compartment) zurückgehalten werden (Schwegmann-Wessels et al., 2004; Winter et al., 2008a). 7 2. Literaturübersicht 2.1.3.2. Rolle des Spike-Proteins für den Speziestropismus von Coronaviren Coronaviren infizieren eine große Anzahl verschiedener Säugetiere und Vögel und weisen dabei in der Regel eine große Wirtsspezifität auf. Im letzten Jahrzehnt wurden jedoch bedeutende Speziesübertritte von Tieren auf den Menschen durch Coronaviren beobachtet (Alekseev et al., 2008; Chu et al., 2011; Jin et al., 2007; Vijgen et al., 2005). In der Humanmedizin waren bis zum Jahr 2003 zwei Coronaviren, die Erkältungserreger HCoV-OC43 und HCoV-229E bekannt (Almeida and Tyrrell, 1967; Tyrrell and Bynoe, 1965). Humane Coronaviren galten bis dahin als eher harmlose Erkrankungen des Respirationstrakts (Heikkinen and Järvinen, 2003). Mit dem Auftreten eines bis dahin unbekannten Coronaviruses im Jahre 2003, das zur SARS-Epidemie 2002/2003 geführt hat, bei der ca. 8000 Menschen mit dem SARS-Coronavirus (SARS-CoV) infiziert wurden und etwa 1000 an den Folgen verstarben, gewannen Coronaviren auch im Bereich der Humanmedizin größeres weltweites Interesse (Cavanagh, 2007a; WHO, 2003). Es konnte gezeigt werden, dass das zum Genus Betacoronavirus gehörende SARS-CoV die Speziesbarriere überwinden konnte. Als natürliches Reservoir des SARS-CoV wurde die chinesische Hufeisennasen-Fledermaus (Rhinolophus spp.) identifiziert (Lau et al., 2005). Ziebetkatzen (Paguma larvata) wurden als Zwischenwirt identifiziert und die Adaption an den humanen Wirt konnte durch eine genetische Untersuchung von Virusisolaten aus infizierten Zibetkatzen und infizierten Menschen nachgewiesen werden (Song et al., 2005). Es wurde gezeigt, dass Mutationen in der Rezeptorbindungsdomäne des viralen S-Proteins dazu geführt haben, dass das Virus an einen humanen Rezeptor binden kann und so eine Infektion des Menschen mit anschließender Mensch-zuMensch Übertragung möglich war (Li et al., 2005). Als weiteres neuartiges, humanpathogenes Coronavirus, das einen Speziesübertritt von Tier zu Mensch ausführen konnte, wurde im Jahre 2012 das Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) identifiziert. Wie auch das SARS-CoV hat das MERS-CoV zu vielen Todesfällen und schweren Krankheitsverläufen geführt (WHO, 2013; Zaki et al., 2012). Auch das MERS-CoV wird dem Genus Betacoronavirus zugeordnet. Ähnlich dem SARS-CoV dienen wahrscheinlich Fledermäuse als Reservoir für das MERS-CoV-, denn in Fledermäusen, sowie in Igeln, wurden dem MERS-CoV nah 8 2. Literaturübersicht verwandte Viren isoliert (van Boheemen et al., 2012; Corman et al., 2014; Ithete et al., 2013; Lau et al., 2013; Perlman, 2013). Als Zwischenwirt für das MERS-CoV wird über das Dromedar diskutiert (Haagmans et al., 2014; Perera et al., 2013; Reusken et al., 2013). Die Bindung an die Wirtszelle ist der erste wichtige Schritt einer Virusinfektion. Für Coronaviren wird die Bindung durch die S1-Untereinheit des viralen S-Proteins vermittelt (Laude et al., 1995; Taguchi, 1995; Taguchi et al., 1995). Durch verschiedene Arbeitsgruppen wurde konstatiert, dass das S-Protein hauptverantwortlich für das Wirtsspektrum von Coronaviren ist, da das Einbringen der Ektodomäne eines heterologen S-Proteins dazu geführt hat, dass das so generierte, chimäre Virus den Tropismus des eingebrachten, heterologen S-Proteins aufweist (Casais et al., 2003; Haijema et al., 2003; Kuo et al., 2000; Schickli et al., 2004; Thackray and Holmes, 2004; Wickramasinghe et al., 2011). Auch eine Mitbeteiligung der S2-Untereinheit im erweiterten Wirtsspektrum von Coronaviren wurde diskutiert (McRoy und Baric, 2008; Promkuntod et al., 2013; Yamada et al., 2009). Die Arbeitsgruppe von H. Verheije hat die Bindungseigenschaften von löslichen AvCoV S1-Strep-tag-Protein-Konstrukten auf unterschiedlichen Geweben untersucht und festgestellt, dass das Bindungsverhalten der löslichen S1-Konstrukte der getesteten Stämme, die Situation im Feld wiederspiegelt. 2.1.3.3. Das Membran-Protein (M) Als Strukturprotein befindet sich das Membran-Protein (M-Protein) in der Virushülle. Das M-Protein ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 20 bis 38 kDa. Es trägt entweder N- oder O-glykosidisch gebundene Oligosaccharide (Rottier, 1995). Die intrazelluläre Lokalisation des M-Proteins am Golgi-Apparat wird durch ein Signalpeptid, welches am N-Terminus lokalisiert ist, vorgegeben (Klumperman et al., 1994; Locker et al., 1995). Dort akkumuliert das M-Protein während der Replikation und wird nicht zur Plasmamembran transportiert (Locker et al., 1992). Das M-Protein übernimmt eine wichtige Aufgabe beim Zusammenbau des Coronaviruspartikels. In Coexpressionsstudien konnte gezeigt werden, dass das M- und das E-Protein „virus- 9 2. Literaturübersicht like particles“ bilden und freisetzen können (Bos et al., 1996; Kim et al., 1997; Vennema et al., 1996). 2.1.3.4. Das Nukleokapsid-Protein (N) Das Nukleokapsid-Protein (N-Protein) der Coronaviren hat ein Molekulargewicht von 45 bis 63 kDa. Das N-Protein umschließt die gesamte RNA und macht den Hauptteil des Nukleokapsids aus. Während der viralen Replikation hat das N-Protein unterschiedliche Aufgaben (Laude and Masters, 1995). Zusammen mit dem viralen RNA-Genom bildet das N-Protein den Ribonukleoproteinkomplex (Davies et al., 1981; Lai und Cavanagh, 1997). Außerdem wird das innere Core durch die Interaktion des N-Proteins mit der carboxyterminalen Domäne des M-Proteins geformt (Escors et al., 2001; Risco et al., 1996). Zúñiga et al., (2007), führten zudem an, dass das N-Protien als RNAChaperon fungiert und in dieser Funktion die RNA durch eine korrekte Faltung in ihre aktive Form bringt. 2.1.3.5. Das Envelope-Protein (E) Das Envelope-Protein (E-Protein) ist in die Hüllmembran des Coronaviruspartikels eingebaut. Als kleines, integrales Membranprotein (Liu und Inglis, 1991) hat es ein Molekulargewicht von etwa 9,1 bis 12, 4 kDa (Siddell, 1995). Das E-Protein wird in einem Prä-Golgi-Kompartiment vorübergehend zurückgehalten (Lim und Liu, 2001). Es kann in diesem Prä-Golgi-Kompartiment mit dem M-Protein interagieren und dieses, im Falle einer Coexpression, ebenfalls dort zurückhalten. 2.1.3.6. Das Hämagglutinin-Esterase-Protein (HE) Bei einigen Vertretern der Betacoronaviren kommt zusätzlich zu den anderen Strukturproteinen das Hämagglutinin-Esterase-Protein (HE-Protein) vor. Das HE-Protein ist ein Typ-1 Membranprotein und hat ein Molekulargewicht von ca. 65 kDa. Es hat eine rezeptorzerstörende Funktion. Das HE-Protein besitzt, wie das 10 2. Literaturübersicht HEF-Protein des Influenza-C-Virus, eine 9-O-Acetylesterase Aktivität (Vlasak et al., 1988a, 1988b). Da die Bindungsaffinität des S-Proteins zu Neu5,9Ac2 größer ist, als die des HE-Proteins (Schultze und Herrler, 1992; Schultze et al., 1991a, 1991b), wird vermutet, dass die Funktion des HE-Proteins wahrscheinlich nicht der Bindung des Virus an die Zielzelle dient, sondern der Inaktivierung der Rezeptordeterminante NAcetyl-9-OAcetylneuraminsäure. Durch die Möglichkeit des Loslösens von Nachkommenviren von der infizierten Zelle und durch das Verhindern der Bildung von Virusaggregaten wird eine erleichterte Ausbreitung des Virus ermöglicht. 2.1.4. Replikation Der Replikationszyklus der Coronaviren beginnt mit der Bindung an ein geeignetes Rezeptormolekül auf der Wirtszelle. Coronaviren haben eine ausgeprägte Rezeptorspezifität. Abhängig von der Coronavirusspezies können sowohl zelluläre Proteine als auch Zuckerstrukturen als Rezeptormolekül fungieren (Hofmann et al., 2005; Raj et al., 2013; Schultze et al., 1992; Vlasak et al., 1988b; Williams et al., 1991; Winter et al., 2006). Nach der Bindung an das zelluläre Rezeptormolekül kommt es zu einer Konformationsänderung des S-Proteins (Bosch et al., 2003) und der Fusion zwischen viraler und zellulärer Membran. Anschließend wird das virale Nukleokapsid in das Zytoplasma der Zelle entlassen. Im Zytoplasma findet nun die für Coronaviren charakteristische Replikationsstrategie statt. Da das virale Genom von positiver Polarität ist, kann es direkt für die Translation verwendet werden (Lai und Cavanagh, 1997; Siddell et al., 1983). Zunächst wird die virale RNA am 5´-Endes translatiert. Die beiden überlappenden Leserahmen (ORF1a und ORF 1b) kodieren für die beiden Polyproteine pp1a und pp1ab. Das Polyprotein pp1ab wird durch einen Leserastersprung, der durch einen von der viralen RNA gebildeten Pseudoknoten verursacht wird, gebildet (Namy et al., 2006; Weiss et al., 1994). Beide Polyproteine werden durch proteolytischen Abbau in Nicht-Strukturproteine (nsp) gespalten (Baker et al., 1989; Denison et al., 1992; Dong et al., 1995). Zu diesen nsp gehört auch die RNA-abhängige RNA-Polymerase, durch dessen Aktivität das Genom in einen Minusstrang umgeschrieben wird. Hierbei dient das ursprüngliche virale Genom mit 11 positiver Polarität als Matrize. Die 2. Literaturübersicht diskontinuierliche Transkription der subgenomischen RNA wird durch die am 3’-Ende des viralen Genoms und vor den Leserahmen befindlichen transkriptions regulierende Sequenzen (TRS) gesteuert. Da die subgenomischen mRNAs alle das gleiche 3’-Ende aufweisen, spricht man von einem sogenannten „nested set“. Von diesen subgenomischen mRNAs wird jedoch nur der am 5’-Ende befindliche Leserahmen in ein Protein translatiert (Lai et al., 1984, 1994; Masters, 2006; Sawicki and Sawicki, 2005; Sawicki et al., 2007; Spaan et al., 1984). Anschließend müssen die so hergestellten Strukturproteine zu einem neuen Viruspartikel zusammengebaut werden. Dazu formt das N-Protein mit der neu gebildeten genomischen RNA Nukleokapside. Durch die Interaktion des M-Proteins und des E-Proteins werden beide Proteine im Prä-Golgi-Kompartiment zurückgehalten (Lim und Liu, 2001). Am intermediären Kompartiment zwischen ER und Golgi-Apparat (endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment, ERGIC) findet sowohl die Virusknospung als auch die Virusfreisetzung statt (Risco et al., 1998). Durch Transportvesikel werden die Viruspartikel über den Golgi-Apparat an die Zelloberfläche transportiert und anschließend in die Umgebung entlassen (Rossen et al., 1996; Salanueva et al., 1999; Tooze et al., 1984). 2.2. Das aviäre Coronavirus 2.2.1. Ätiologie Das aviäre Coronavirus gehört zur Gattung Gammacoronavirus innerhalb der Familie Coronaviridae. Das Genom dieses einzelsträngigen RNA-Virus ist nicht segmentiert und ist von positiver Polarität. Der Erreger ist von kugelförmiger bis pleomorpher Gestalt und hat einen Durchmesser von 60 - 120 nm. Auf der Virushülle befinden sich die für Coronaviren typischen keulenförmigen Glykoproteine, die Spike-Proteine (Berry et al., 1964). Die Spike-Proteine sind aus den zwei Untereinheiten S1 und S2 aufgebaut und sind wesentlich für die Infektiösität des Virus verantwortlich. Das aviäre Coronavirus infiziert vor allem die Epithelzellen des Respirationstrakts, des Gastrointestinaltrakts, des Ovidukts und der Nieren. 12 2. Literaturübersicht 2.2.2. Epidemiologie und Pathogenese Als Erkrankung der Atemwege bei wenige Tage alten Küken wurde das aviäre Coronavirus 1931 in North Dakota, USA, erstmalig beschrieben (Schalk und Hawn, 1931). 1937 wurde das AvCoV erstmals in embryonierten Hühnereiern angezüchtet (Beaudette und Hudson, 1937). Van Roeckel et al. gelang es 1942, den wichtigen aviären Coronavirusstamm Massachusetts 41 (M41) zu isolieren (Fabricant, 1998). Über immunologische Unterschiede zwischen den aviären Coronavirusstämmen, die eine Kreuzprotektivität zwischen den verschiedenen Stämmen verhindern, wurden von (Jungherr et al., 1956) berichtet. Als neuartige Erkrankung der Atemwege von Hühnern wurde das aviäre Coronavirus 1950 wahrscheinlich in Deutschland entdeckt (Sassenhoff, 1950). Mittlerweile ist das AvCoV eine weltweit verbreitete Erkrankung, die vor allem in der Geflügelindustrie verbreitet ist. Die Virusübertragung des AvCoV kann über viele Wege erfolgen. Vor allem die aerogene Virusausbreitung ist von großer Bedeutung bei der Übertragung zwischen unterschiedlichen Beständen (Cavanagh, 2007b; Gough und Alexander, 2000). Auch der direkte Kontakt von Tier zu Tier als Tröpfcheninfektion, sowie die Übertragung über kontaminierte Gegenstände, über das Trinkwasser oder über den Menschen (Cavanagh, 2007a; Cavanagh und Naqi, 2003; Hofstad, 1967; Hofstad und Yoder, 1966) sind mögliche Getreideschimmelkäfers Übertragungswege. (Alphitobius diaperinus) Auch kann das eine Auftreten des Virusübertragung fördern, da dieser das AvCoV sowohl auf seiner Körperoberfläche tragen kann- als auch durch orale Aufnahme in sich tragen kann (Stuke und Kaleta, 1970). Als weitere Infektionsquelle wird das Persistieren des Erregers in verschiedenen Organen und die damit verbundene intermittierende oder durchgehende Virusausscheidung genannt (Alexander und Gough, 1977; Cook, 1968; Hofstad, 1967; Jones und Ambali, 1987; Woernle, 1968). Nach der Infektion mit dem AvCoV beträgt die Inkubationszeit zwischen 18 und 36 Stunden. Nach kurzer Zeit ist ein gesamter Bestand infiziert. Die Aufnahme des Virus erfolgt über Schleimhäute der Atemwege. Durch die dortige Virusvermehrung (Raj und Jones, 1997) wird das Nasen- und Trachealepithel geschädigt. Das AvCoV breitet sich nachfolgend in Luftsäcken und der Lunge (Janse 13 2. Literaturübersicht et al., 1994; Otsuki et al., 1990) und in den Gonaden aus (Boltz et al., 2004, 2006; Villarreal et al., 2007). Die Infektion mit einem nephropathogenen AvCoV-Stamm führt zu Schädigungen der Nierenepithelien (Cumming, 1969a, 1969b, 1969c). Im Gastrointestinaltrakt konnte ebenfalls eine Virusvermehrung nachgewiesen werden (Ambali und Jones, 1990; Lucio und Fabricant, 1990). Weitere Organe, in denen das Virus nachgewiesen wurde, sind die Bursa Fabricii, Blut, Hardersche Drüse, Leber, Milz und Thymus (Ambali und Jones, 1990; van Ginkel et al., 2008; Hofstad und Yoder, 1966; Toro et al., 1996). 2.2.3. Klinisches Erscheinungsbild Das klinische Erscheinungsbild nach einer Infektion mit dem AvCoV ist von mehreren Faktoren abhängig. Der Organ-Tropismus des AvCoV-Stamms und auch das Alter der Tiere ist von Bedeutung. Bei einer Morbidität von nahezu 100%, kann die Mortalitätsrate 25-% bis zu 80-% erreichen, abhängig vom Alter der Tiere, dem Impfstatus, dem AvCoV-Stamm und dem Auftreten von bakteriellen Sekundärinfektionen (Avellaneda et al., 1994; Cook and Huggins, 1986; Cook et al., 1991; Tottori et al., 1997; Woernle und Hafez, 1992). Die Dauer der Erkrankung beträgt in der Regel ein bis zwei Wochen. Bei einer Erkrankung von Küken, die jünger als zwei Wochen alt sind, kann es zu einer dauerhaften Schädigung des Eileiters kommen. Im adulten Alter ist die Legefähigkeit dieser Tiere entweder nicht vorhanden oder es werden Eier mit minderer Qualität gelegt (Crinion et al., 1971a, 1971b). Die äußerlich gesund erscheinenden Tiere, die aber keine Eier legen, werden als sogenannte „falsche Leger“ bezeichnet (Broadfoot et al., 1954; Jones und Jordan, 1970). Bei Jungtieren, treten vor allem respiratorische Symptome in den Vordergrund, was auch die ursprüngliche Bezeichnung des AvCoV als „Infektiöses Bronchitis Virus“ (IBV) erklärt. Einhergehend mit einer hohen Mortalität (Cavanagh und Naqi, 2003; Woernle und Hafez, 1992) zeigen infizierte Jungtiere ein beeinträchtigtes Allgemeinbefinden mit gesträubtem Gefieder. Zudem haben betroffene Tiere Nasenausfluss, sie zeigen Schnabelatmung, niesen und husten (Ambali und Jones, 1990; Cavanagh und Naqi, 14 2. Literaturübersicht 2003; Cumming, 1969a; Raj und Jones, 1997; Terregino et al., 2008). Terregino et al., (2008) berichten über das Autreten einer Konjunktivitis bei infizierten Tieren. Bei Legehennen hingegen überwiegen Schädigungen am Legeapparat, einhergehend mit einem starken Leistungsabfall von bis zu 92 % (Bisgaard, 1976; Broadfoot et al., 1954). Gelegte Eier sind von minderer Qualität, einhergehend mit dünnen, häufig missgebildeten Eischalen, entfärbten Eiern und wässrigem Eiklar. Zudem ist die Brut- und Schlupfrate reduziert (Cavanagh und Naqi, 2003; Cook und Huggins, 1986; Crinion, 1972). Respiratorische Symptome stehen bei Legehennen eher im Hintergrund und sind wenn überhaupt nur schwach ausgeprägt (Cavanagh und Naqi, 2003; Raj und Jones, 1997; Woernle und Hafez, 1992). Bei einer Infektion durch einen nephropathogenen AvCoV-Stamm kommt es vor allem bei Jungtieren und zu einer sogenannten Nephritis-Nephrose Form. Ein akutes Nierenversagen, ausgelöst durch das Zurückhalten von Harnsäure bei gleichzeitig erhöhter Elektrolytausscheidung, führt zu hohen Mortalitätsraten von bis zu 60 % (Condron und Marshall, 1986; Cumming, 1969a, 1969b; Meulemans et al., 1987). 2.2.4. Bekämpfung Nach dem Ausbruch des aviären Coronavirus in einem Bestand kann durch eine antibiotische Behandlung alleinig versucht werden, mögliche Komplikationen durch Sekundärinfektionen mit z. B. E. coli und Mycoplasmen zu verhindern (Cavanagh und Naqi, 2003; Woernle und Hafez, 1992). Eine spezifische Behandlung erkrankter Bestände ist nicht möglich. Vielmehr gilt es neben der Immunprophylaxe durch Impfungen gegen das AvCoV, grundlegende Hygienevorschriften und -maßmahmen einzuhalten. Dazu gehört neben der Überwachung des Personen- und Fahrzeugverkehrs, vor allem eine gründliche und regelmäßige Reinigung und Desinfektion vor Neueinstallungen und die Einhaltung von Leerzeiten der Stallungen (Cavanagh, 2007b; Cavanagh und Naqi, 2003). Für die Impfung gegen das AvCoV werden sowohl attenuierte Lebendvakzinen als auch Inaktivatvakzinen eingesetzt. Durch Viruspassagierung im embryonierten Hühnerei kommt es zu einem Verlust der Virulenz für Küken und Hühner, so dass die attenuierten Virusstämme als Vakzinen eingesetzt werden können (Bijlenga et al., 15 2. Literaturübersicht 2004). Jackwood et al., (2010) berichtet über eine Kombination aus Viruspassagierung und einer Hitzebehandlung zur Attenuierung des AvCoV. In Elterntierherden und Legehennenbeständen werden vorwiegend Lebendvakzinen zur Grundimmunisierung und Inaktivatvakzinen als Boosterung eingesetzt. In Broilerbeständen werden vorwiegend Lebendvakzinen eingesetzt (Jackwood und de Wit, 2013; Woernle und Hafez, 1992). Im Gegensatz zu Inaktivatvakzinen, die parenteral zu verabreichen sind, können Lebendvakzinen durch verschiedene Methoden verabreicht werden, durch Augentropfen, Spray oder über das Trinkwasser. Durch das Auftreten vieler verschiedener Serotypen ist ein vollständiger Schutz trotz der vorhandenen Lebend- und Inaktivatvakzinen bis heute nicht zu realisieren. Das Auftreten neuer Serotypen des AvCoV wird durch Punktmutation (Wang und Khan, 2000) oder durch Rekombination (Jia et al., 1995; Wang et al., 1993) ausgelöst. Die Entwicklung weiterer Impfstoffe und Impfstrategien zum Schutz vor dem AvCov ist nach wie vor von großer Bedeutung. Versuche mit unterschiedlichen DNAVakzinen und mit rekombinanten Vakzinen wurden in jüngerer Vergangenheit durchgeführt. Über Vakzinen mit rekombinantem AvCoV, die ein heterologes SpikeProtein eines pathogenen Stamms exprimieren (Hodgson et al., 2004), wurde berichtet. Auch wurden AvCoV-Gene mit dem Baculovirus exprimiert (Breslin et al., 2001; Song et al., 1998). Mit rekombinanten Fowlpox- und Adenoviren, die das Spike eines AvCoV-Stammes exprimieren, wurden Vakzinations-Versuche durchgeführt (Johnson et al., 2003; Wang et al., 2002, 2009; Zeshan et al., 2011). Zudem wurden Versuche zur DNA-Vakzinierung durchgeführt (Kapczynski et al., 2003). Zhou et al., (2003) berichten, dass transgene Kartoffeln das S1-Protein des AvCoV exprimieren können. Zudem wurde über eine in ovo Applikation von Lebendvakzinen diskutiert. Über diese Impfmethode wurden bereits vielversprechende Ergebnisse geliefert (Kapczynski et al., 2003; Tarpey et al., 2006; Zeshan et al., 2011). 16 2. Literaturübersicht 2.3. Sialinsäuren als Rezeptordeterminanten Als Sialinsäure werden die verschiedenen Derivate der Neuraminsäure bezeichnet. Es handelt sich um negativ geladene Zuckermoleküle, die als terminale Komponente auf den Zuckerketten von Glykoproteinen und Glykolipiden vorkommen. Es gibt über 50 verschiedene natürlich vorkommende Sialinsäuren, die sich durch verschiedene Acetylierungen, vor allem N- und O-Acetylierungen, oder durch andere Modifikationen, wie z.B Methylierungen, Phosphorylierungen oder Sulfatierungen (Schwörer, 2004) unterscheiden. Am häufigsten kommt die N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac) vor. Die Verknüpfung von Sialinsäuren mit Zuckerketten wird durch das Enzym Sialyltransferase katalysiert. Sialinsäuren werden durch Sialyltransferasen in einer bestimmten Orientierung an Zuckerketten gebunden, die häufigsten Bindungsarten sind alpha 2,3- und alpha 2,6-gebundene Sialinsäuren, die an Galactose gebunden sind. Auch eine alpha-2,8-Bindung ist möglich (Kleineidam et al., 1997; Nicholls et al., 2008). Sialinsäuren sind im Organismus sowohl an der Zellalterung, als auch an der Zellreifung beteiligt und sie werden teilweise auch von Pathogenen als Rezeptoren erkannt (Schauer, 2000). Sialinsäuren dienen vielen Viren als Rezeptordeterminante. Die N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac) wird von Influenza-A und –B-Viren erkannt und wurde als erste Virus-Rezeptor-Determinante beschrieben (Gottschalk, 1958). Dem entgegen erkennen Influenza-C-Viren und einige Vertreter der Betacoronaviren, wie z. B. das BCoV die 9-O-Acetylneuraminsäure (Neu5,9Ac2) als Rezeptor-Determinante (Rogers et al., 1986; Schultze and Herrler, 1992; Schultze et al., 1990; Vlasak et al., 1988b). Als Vertreter der Alphacoronaviren ist für TGEV neben der Bindung an das Rezeptorprotein Porzine Aminopeptidase N eine zusätzliche Sialinsäurebindungseigenschaft beschrieben, die eine Rolle für die Enteropathogenität von TGEV zu spielen scheint (Krempl et al., 1997; SchwegmannWessels et al., 2003). Auch die Bedeutung von Sialinsäuren als Rezeptordeterminante für eine Infektion mit dem AvCoV wurde beschrieben (Winter et al., 2006, 2008b). 17 2. Literaturübersicht 2.4. Aufbau und Funktion des galliformen Ovidukts Das Ovidukt des Huhnes lässt sich morphologisch und funktionell in fünf Segmente differenzieren, Infundibulum, Magnum, Isthmus, Uterus und Vagina (König et al., 2009; Salomon und Krautwald-Junghanns, 2008; Schwarz, 1969a). In dieser Arbeit wurden ausschließlich die Segmente Infundibulum, Magnum, Isthmus, und Uterus untersucht (Abbildung 3). Beim Huhn, sowie bei der Mehrheit der Vögel entwickelt sich, trotz beidseitiger embryonaler Anlage, meist nur das linke Ovidukt, samt Ovar vollständig aus (König et al., 2009). Das Ovidukt befindet sich in der Bauchhöhle und kann während der Legeperiode eine Länge von ca. 65 cm erreichen. Als maßgebliches Organ der Eibildung, besteht die Aufgabe des Ovidukts darin, die dotterreiche Eizelle nach der Ovulation aufzunehmen und weiterzuleiten. Während der Passage durch die verschiedenen Segmente des Ovidukts, wird die Eizelle mit den Schalenhäuten, Eiweiß und der Kalkschale ausgestattet (Gerstberger und Barth, 2004; Schwarz, 1969a). 18 2. Literaturübersicht Abbildung 3 Ovidukt eines juvenilen (18 Wochen) alten Huhnes direkt nach der Präparation. Das entnommene Ovidukt wird in die vier Abschnitte Infundibulum, Magnum, Isthmus und Uterus unterteilt. 2.4.1. Infundibulum Das Infundibulum lässt sich in zwei Abschnitte gliedern, den proximalen trichterförmigen und den distal befindlichen röhrenförmigen Abschnitt (König et al., 2009; Schwarz, 1969b). Der trichterförmige Abschnitt ist anfangs drüsenlos, erst caudal dieses proximalen Abschnittes sind Drüsen nachweisbar (König et al., 2009). Die dünne Wand dieses Abschnittes des Infundibulums weist primäre und sekundäre Schleimhautfalten auf (König et al., 2009). Der distal gelegene, röhrenförmige Abschnitt des Infundibulums weist als Ort der Befruchtung, eine dickere Wandstärke, sowie höhere primäre und sekundäre Schleimhautfalten als im proximalen trichterförmigen Abschnitt auf (König et al., 2009). Die ovulierte Eizelle, samt Dotterkugel wird vom Infundibulum aufgenommen. Während der Passagezeit von ca 20-30 Minuten wird die Dotterkugel von phospholipid- und glykoproteinhaltigen 19 2. Literaturübersicht Sekreten umschichtet, aus denen sich die chalazifere Eiklarschicht und teilweise die Hagelschnüre formen (König et al., 2009). 2.4.2. Magnum Nach der Passage durch das Infundibulum wird die ovulierte Eizelle mit Dotterkugel weiter in den röhrenförmigen und mit ca. 34 cm längsten Abschnitt des Ovidukts geleitet (König et al., 2009; Schwarz, 1969b). Die großen Schleimhautfalten des Magnums füllen das Lumen fast vollständig aus und weisen keine sekundäre Fältelung auf (Aitken, 1971; König et al., 2009; Schwarz, 1969b). Während der Passagezeit von ca. 3 Stunden werden Ovalbumine, Ovotransferrin und Ovomucid sezerniert, die der Bildung des Eiklares dienen (König et al., 2009). 2.4.3. Isthmus Die Passage des Eis durch den ca. 10 cm langen Isthmus dauert ca. 1,5 bis 2 Stunden. In diesem Abschnitt findet die Bildung der so genannten inneren Schalenhaut statt. Dazu wird das Eiklar von Sekreten, die schwefelhaltige Proteine enthalten, in Form einer doppelschichtigen Schalenhaut umschlossen (Gerstberger und Barth, 2004; König et al., 2009). Der Isthmus unterscheidet sich von den anderen Abschnitten des Ovidukts durch eine deutliche Verengung des Lumens. Der proximale Abschnitt des Isthmus weist eine drüsen- und faltenfreie Zone auf. Der nachfolgende distale Abschnitt ist durchsetzt mit Drüsen und Schleimhautfalten. 2.4.4. Uterus Der Funktion nach gibt es für den sich dem Isthmus anschließenden Uterus mehrere Bezeichnungen. Der als „Eihalter“, „Kalkkammer“ oder „Schalendrüse“ bezeichnete Uterus dient der Ausbildung der Kalkschale (König et al., 2009; Schwarz, 1969b). Während einer Verweildauer von ca. 24. Stunden werden Kalziumkarbonat und weitere Kalziumsalze synthetisiert, die für die Ausbildung der Kalkschale benötigt werden (König et al., 2009). Des Weiteren werden Pigmente in die Schale 20 2. Literaturübersicht eingelagert. Die muskulöse Wand des ca. 8 cm langen, sackartig erweiterten Uterus weist Längsfalten mit querverlaufenden Furchen auf, wodurch blattartige Lamellen entstehen (König et al., 2009; Schwarz, 1969b) Die Drüsen des Uterus gleichen denen des Isthmus, sie sind allerdings in größerer Anzahl als im Isthmus vorhanden (König et al., 2009). 2.4.5. Vagina Als letzter Abschnitt des Ovidukts, mündet die Vagina als sigmoide Schleife ins Urodeum der Kloake (König et al., 2009; Schwarz, 1969b). Während einer Passagezeit von ca. 5-10 Minuten wird die äußere Schalenhaut (Cuticula) gebildet (König et al., 2009). Die Schleimhaut der Vagina ist mit dünnen Falten, die eine sekundäre Fältelung aufweisen, durchsetzt (König et al., 2009; Liebich and Kölle, 2010; Schwarz, 1969b). Neben der Bildung der äußeren Schalenhaut, dient die Vagina mit ihren Uterovaginaldrüsen als Spermienreservoir (König et al., 2009) 21 3. Material 3. Material 3.1. Zelllinien Vero-Zellen Vero-Zellen stammen aus dem Nierengewebe der grünen Meerkatze (african green monkey). Die Zellinie wurde vom Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt (ATCC Nr. CCL-81). BHK-21-Zellen BHK-21-Zellen (baby hamster kidney) stammen aus dem Nierengewebe von syrischen Goldhamstern, Mesocricetus auratus. Die Zelllinie stammt aus der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig (Katalognummer DSM ACC 61) und wurde vom Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt. CLEC-213-Zellen Clec-213-Zellen stammen aus dem Lungengewebe des weißen Leghorn Huhnes. Die Zelllinie wurde von Evelyne Esnault, INRA (Infectiologie Animale et Santé Publique, Pathologie et Immunologie Aviaires, Nouzilly, Frankreich) zur Verfügung gestellt. Primäre Zellen Die in dieser Arbeit verwendeten primären Zellkulturen wurden selbst hergestellt. Zum einen wurden primäre embryonale Hühner-Nierenzellen (eCKC), zum anderen isolierte Epithelzellen aus dem Hühneroviduct (COEC) hergestellt. 23 3. Material 3.2. Viren Das aviäre Coronavirus (AvCoV) Der pathogene AvCoV-Stämm B1648, sowie der apathogene Beaudette-Stamm wurden von Dr. Dave Cavanagh (Institute for Animal Health, Compton, UK) zur Verfügung gestellt. Der pathogene QX-Stamm wurde von Dr. Hans-Christian Philipp (Lohmann Tierzucht, Cuxhaven) zur Verfügung gestellt. 3.3. Bakterien Escherichia coli XL1-Blue (E. coli) Der E. coli-XL1-Blue-MRF`-Stamm wurde vermehrt, durch verschiedene Waschschritte chemisch kompetent gemacht und bei der Hitzeschocktransformation eingesetzt. Die Bakterien wurden von der Firma Stratagene erworben und vom Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule zur Verfügung gestellt. 3.4. Plasmide pCG1-Fc Dieses Plasmid ist ein Derivat des pCG1-Plasmids. Es beinhaltet das Gen für das Fc-Fragment (Fc-Markerpeptid) des humanen Immunoglobulin G. Das Plasmid enhält zwischen der Multiple Cloning Site (MCS) und dem Promotor des Zytomegalievirus (CMV) ein Intron des β-Globin-Gens aus dem Kaninchen, welches die Expression des eingebrachten Konstrukts über den Zellkern eukaryotischer Zellen ermöglicht. Außerdem hat das Plasmid ein Ampicillin-Resistenz-Gen für die Selektion von plasmidtragenden Bakterien. Das pCG1-Fc Plasmid wurde zur Herstellung von löslichen Spike-Proteinen, die an einen Fc-Abschnitt gekoppelt sind, benutzt. Dies diente der einfacheren Detektion und Aufreinigung des löslichen SpikeProteins. Das Plasmid wurde vom Institut für Virologie, Stiftung Tierärtzliche Hochschule Hannover, zur Verfügung gestellt. 24 3. Material pCG1-FcATG Bei diesem Plasmid wird das Fc-Fragment alleine exprimiert, da dem Gen für das FcFragment ein ATG-Codon vorgeschaltet ist. Das Plasmid wurde vom Institut für Virologie, Stiftung Tierärtzliche Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt. 3.5. cDNA solQXS1_Fc Dieses Konstrukt wurde während der Dissertation angefertigt und zur Expression des S1-Abschnittes (AA 1–524) vom AvCoV-Stamm QX verwendet. solB1648S1_Fc Es handelt sich um ein Konstrukt, das zur Expression des S1-Abschnittes (AA 1-536) vom AvCoV-Stamm B1648 verwendet wurde. Die cDNA wurde von Dr. Christine Winter, Institut für Virologie, Stiftung Tierärtzliche Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt. 3.6. Embryonierte Hühnereier SPF Hühnereier VALO Bio Media, Osterholz-Scharmbeck 3.7. Hühner Alle Hühner wurden in den Stallungen der Klinik für Geflügel gehalten. Die Hühner wurden mit einem Alleinfuttermittel für Legehennen „all-mash L“ (Firma Deuka) gefüttert. Futter und Wasser wurden ad libitum bereitgestellt. Hühner für Vorversuche 16 Wochen alte Hühner der Rasse Lohmann Brown, Geglügelzucht Zahrte, Soltau 25 3. Material Hühner für Hauptversuche SPF Hühnereier, VALO Bio Media, Osterholz-Scharmbeck. Eingelegt und ausgebrütet in der Klinik für Geflügel, Stiftung Tierärtzliche Hochschule Hannover 3.8. Zellkulturmedien Alle Medien, Puffer, Lösungen und Reagenzien wurden bei 4 °C gelagert, wenn nicht anders angegeben. Tabelle 1 EMEM (Eagle’s Minimum Essential Medium), pH 7,0 EMEM-Fertigpulver 9,6 g Gibco /Invitrogen NaHCO3 2,2 g Merck Penicillin 0,06 g Streptomycin 0,05 g Aqua bidest steril Ad 1 l Tabelle 2 Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich DMEM (Dulbecco`s modified Eagel Medium), pH 6,9 Edulb-Fertigpulver 13,53 g Gibco /Invitrogen NaHCO3 2,2 g Merck Penicillin 0,06 g Streptomycin 0,05 g Aqua bidest steril Ad 1 l Tabelle 3 Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Ham’s F12, pH 7,0-7,5 Ham´s F12 mit L-Glutamine PAA 26 3. Material fertig für den Gebrauch Tabelle 4 Versen-Trypsin 0,125 %, pH 7,0 NaCl 8,0 g Merck KCl 0,20 g AppliChem Na2HPO4 x 2 H2O 2,31 g Merck KH2PO4 x 2 H2O 0,20 g Merck CaCl2 x 2H2O 0,13 g Merck MgSO4 x 7 H2O 0,10 g Merck Trypsin 1,25 g Merck Versen (EDTA) 1,25 g Merck Streptomycin 0,05 g Gibco/Invitrogen Penicillin 0,06 g Gibco/Invitrogen Aqua bidest. steril ad 1 l Tabelle 5 Zellkulturzusätze Fetales Kälberserum (FKS) Biochrom Insulin Roche L-Glutamin PAA Natriumpyruvat Gibco/Invitrogen Tabelle 6 Einfriermedium EMEM oder DMEM 10 ml FKS 10 % Glycerin 10 % 27 3. Material Tabelle 7 CLEC213 Medium, pH 6,9 DMEM + HAM’s F12 1:2 FKS 10 % Biochrom BSA 3% AppliChem Insulin-TransferrinSelenium-X (100X) / ITS Pen/Strep 1% Life Technologies 1% PAA EGF 0,25 % Biochrom Tabelle 8 COEC Medium (Chicken oviduct epithelial cell medium), modifiziert nach Jung et al., (2011a) DMEM + HAM’s F12 1:1 Nicht-essentielle Aminosäuren 0,01 % PAA Pen/Strep 1% PAA FKS 5% Biochrom Chicken Serum 1% Sigma-Aldrich Amphothericine B 0,01 % Sigma-Aldrich Gentamycin 0,01 % PAA 3.9. Bakterienkulturmedien Tabelle 9 Luria-Bertani (LB-Medium), pH 7,0 Trypton 10 g AppliChem Natriumchlorid (NaCl) 10 g AppliChem Hefe-Extrakt 5g AppliChem 28 3. Material Aqua bidest. Tabelle 10 ad 1 l LB-Agar, pH 7,0 Trypton 10 g AppliChem Natriumchlorid (NaCl) 10 g AppliChem Hefe-Extrakt 5g AppliChem Agar 20 g autoklaviert, Lagerung bei Aqua bidest. ad 1 l 4 °C 3.10. Puffer und Lösungen Agarosegelelektrophorese Tabelle 11 10 x TBE-Puffer Tris 108 g AppliChem Borsäure 53,4 g AppliChem EDTA 7,4 g AppliChem H2O ad 1 l Tabelle 12 10 x TAE-Puffer, pH 8 Tris/HCl, pH 8 40 mM AppliChem (NaCH3COO x 3 H2O) 20 mM Merck EDTA (für 1x) 2 mM AppliChem H2O ad 1 l Natriumacetat 29 3. Material Tabelle 13 Ethidiumbromid-Färbebad Ethidiumbromid 1g 1 x TAE-Puffer Ad 100 ml Sigma-Aldrich Die Stammlösung wurde zum Färben von Agarosegelen 1:20000 mit 1 x TAE-Puffer verdünnt (0,5 µg/ml). Sea Plaque Agarose Biozym GenerulerTM 100 bp DNA ladder plus MBI Fermentas GenerulerTM 1kb Plus DNA ladder MBI Fermentas 6x Loading Dye Solution MBI Fermentas Polyacrylamidgel-Elektrophorese Tabelle 14 10 x SDS-Laufpuffer SDS 10 g AppliChem Tris 30 g AppliChem Glycin 144 g AppliChem H2O ad 1 l Tabelle 15 Sammelgellösung (5 ml) H2O 3,4 ml Acrylamidlösung 30 % 0,83 ml Roth 1 M Tris/HCl, pH 6,8 0,63 ml Roth 10 % SDS 50 µl Roth 10 % APS 50 µl BIO-RAD TEMED 10 µl Sigma-Aldrich 30 3. Material Tabelle 16 Trenngellösung (12 %) (5 ml) H2O 3,3 ml Acrylamidlösung 30 % 4 ml Roth 1 M Tris/HCl, pH 6,8 2,5 ml Roth 10 % SDS 100 µl Roth 10 % APS 100 µl BIO-RAD TEMED 16 µl Sigma-Aldrich Tabelle 17 20 x MOPS Laufpuffer, pH 7,0 MOPS 0,4 M Sigma-Aldrich Natriumacetat 160 mM Sigma-Aldrich EDTA 20 mM AppliChem H2O ad 1 l PageRuler™ Plus Prestained Proteinin Ladder Fermentas Spectra™Multicolor High Range Protein Ladder Fermentas Gel Code Blue Stain Reagent Pierce NuPAGE LDS sample buffer 4x Invitrogen Western Blot Tabelle 18 Anodenpuffer I, pH 9 1 M Tris/HCl, pH 9 300 ml AppliChem Ethanol 200 ml AppliChem H2O 500 ml Tabelle 19 Anodenpuffer II, pH 7,4 1 M Tris/HCl, pH 7,4 25 ml AppliChem 31 3. Material Ethanol 200 ml H2O 775 ml Tabelle 20 AppliChem Kathodenpuffer, pH 9 Aminocapronsäure 5,25 mg Sigma-Aldrich 1 M Tris/HCl, pH 9 25 ml AppliChem Ethanol 200 ml AppliChem H2O 775 ml Tabelle 21 PBS, pH 7,5 NaCl 8,0 g AppliChem KCl 0,2 g AppliChem Na2HPO4 x 2 H2O 1,15 g Roth KH2PO 0,12 g Roth MgCl2 x 6 H2O 0,1 g Roth CaCl2 x 2 H2O 0,132 g Roth Aqua bidest. ad 1 l Tabelle 22 PBSM, pH 7,5 NaCl 8g AppliChem KCl 0,2 g AppliChem Na2HPO4 x 2 H2O 1,15 g Roth KH2PO4 0,2 g Roth Aqua bidest. ad 1 l Tabelle 23 PBSM PBSM 0,1 % Tween 2l Roth, Karsruhe 32 3. Material Tween 20 2 ml AppliChem, Darmstadt Immunfluoreszenz Tabelle 24 3 % Paraformaldehyd Paraformaldehyd 3g PBSM ad 100 ml Tabelle 25 0,1 M Glycin in PBSM Glycin 0,7 g PBSM ad 100 ml Tabelle 26 0,2 g PBSM ad 100 ml Roth 1 % BSA in PBS BSA 1g PBS ad 100 ml Tabelle 28 AppliChem 0,2 % TRITON-X-100 in PBSM TRITON X 100 Tabelle 27 AppliChem Roth Mowiol Mowiol 2,5 g Calbiochem Glycerol 6,0 g AppliChem Aqua bidest. 6,0 ml 33 3. Material Der Ansatz wurde mehrere Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und gerührt, 12 ml 0,2 M TRIS HCl, pH 8,5 dazu pipettiert und bei ca. 50 °C eine Stunde gerührt. Anschließend wurde das Gemisch bei 5000 U/min für 15 Minuten zentrifugiert. Zu dem Überstand wurde 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)-octan (DABCO) gegeben, so dass die Endkonzentration 2,5 % betrug. Von dieser Lösung wurden 1 ml Aliquots bei -20 °C eingefroren. Tabelle 29 Mykoplasmen-Detektionstest DAPI (4-6-Diamidino-2phenylindol-di-hydrochlorid) 10 g Sigma-Aldrich Ethanol ad 10 ml AppliChem 3.11. Transfektionsreagenzien Polyethylenimine (PEI) Polysciences 3.12. Synthetische Oligonukleotide Die eingesetzten Oligonukleotide wurden von MWG Biotech AG, Ebersberg synthetisiert und mit einer Konzentration von 10pmol/µl in der PCR verwendet. Tabelle 30 Nr. 1. 2. 51. 70. 87. Synthetische Oligonukleotide Name Sequenz des Primers 5‘> 3‘ IBVBd.S_S(EcoRI) TTT GAA TTC ATG TTG GTA ACA CCT CTT TTA CTA CTG ACT C IBVBd.S_AS(BamHI) TTT GGA TCC TCA AAC AGA CTT TTT AGG TCT GTA TTG TTC IBVSsense(BamH1) CGC CGC GGA TCC ATG TTG GTA ACA CCT CTT TTA CTA GTG ACT IBVSsense(BamH1) CGC GCT CGA GTC AAA CAG ACT TTT TAG GTC TGT ATT G IBVQXS1_AS(Hind3) TTT AAG CTT ATG TGA GCT ATT GGT TAA CTT AAC ATA AAA 34 3. Material 88. IBVQXS_S(BamHI) 90 IBV QXS 400-424 TTT GGA TCC ATG TTG GTG AAG TCA CTG TTT TTA GTG ACC ATT CGT ATT TCT GCA ATG AAA AAT G 3.13. Restriktionsendonukleasen BamH1 (#ER0051) Fermentas HindIII (10U/µl) Fermentas 3.14. Enzyme T4 DNA Ligase (5U/µl) Fermentas Pfu DNA Polymerase Fermentas Taq Polymerase (5U/µl) Fermentas Neuraminidase (Clostridium perfringens) Sigma-Aldrich Protease (Streptomyces griseus), Type XIV Sigma-Aldrich 3.15. Substrate Super Signal West Dura Thermo Scientific Super Signal West FEMTO Thermo Scientific 3.16. DNA- und Proteinmarker GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder Fermentas Spectra™ Multicolor High Range Protein Fermentas PageRuler Plus™ Prestained Protein Fermentas 35 3. Material 3.17. Antikörper Alle Antikörper wurden für die IF und FACS in 1 % BSA (in PBS) verdünnt (FITC = Fluorescin isothiocyanate, HRP = horse reddish peroxidase, Cy3 = Cyanine 3) Tabelle 31 Antikörper Bezeichnung Verdünnung Anwendung Bezugsquelle 1:200 IF Prionics anti-Keratin14, mAB 1:100 IF anti-Keratin1-19,mAB 1:100 IF anti-Vimentin 1:40 IF Sigma-Aldrich anti-Muc5Ac 1:400 IF Acris GmbH 1:200 IF Sigma-Aldrich 1:200 IF Sigma-Aldrich anti-ßTubulin 1:400 IF Sigma-Aldrich anti-hFc-FITC 1:300 IF Sigma-Aldrich 1:300 IF Sigma-Aldrich 1:20000 WB Sigma-Aldrich 1:200 FACS anti-Chicken-IBV, mAB, Ch/IBV 48.4 Antibodiesonline GmbH Antibodiesonline GmbH anti-MausFITC anti-MausCy3 anti-hFcCy3 anti-hFcHRP F(ab’)2 anti-human IgG PE 36 BeckmannCoulter 3. Material 3.18. Lektine Alle Lektine wurden in 1 % BSA verdünnt Tabelle 32 Lektine Spezifität Verdünnung/ Bezeichnung Bezugsquelle Anwendung Sambucus nigra agglutinin (SNA) FITC gekoppelt α2,6gebundene α2,6- (SNA) Digoxigenin gekoppelt, gebundene DIG Glycan differentiation kit Sialinsäuren (MAAII) Biotin gekoppelt Maackia amurensis agglutinin (MAAI) FITC gekoppelt Maackia amurensis agglutinin 1:200 IF Roche 1:200 IF Vector Labs 1:200 IF Vector Labs 1:200 IF Roche α2,3gebundene Sialinsäuren α2,3gebundene Sialinsäuren α2,3- (MAAI) Digoxigenin gekoppelt, gebundene DIG Glycan differentiation kit Vector Labs Sialinsäuren Sambucus nigra agglutinin Maackia amurensis agglutinin 1:200 IF Sialinsäuren 3.19. Kits QIAquick PCR Purification Kit Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 37 3. Material QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen QiaexII Gel Extraction Kit Qiagen QIAamp viral RNA Mini Kit Qiagen SuperScript III Kit Invitrogen LIVE/ DEAD Viability/ Cytotoxicity Kit Invitrogen DIG Glycan Differentiation Kit Roche 3.20. Weitere Chemikalien Accutase PAA Agarose Biozym DEPC behandeltes Wasser Roth 1,4-Dithiothreitol (DTT) Roth 2-Mercaptoethanol Fluka Blocking-Reagenz Roche Bovines Serumalbumin (BSA) Roth Human Epidermal Growth Factor (hEGF) Biochrom Isopropanol Roth Insulin-Transferrin-Selenium-X (100X) / ITS Life Technologies Opti-MEM® Gibco Ethanol AppliChem Isopropanol Roth BD Matrigel Basement Membrane Matrix BD Biosciences Tissue freezing medium Jung Poly-L-Lysin Sigma-Aldrich 3.21. Geräte und sonstige Materialien Mikroskope Fluoreszenzmikroskop Axiophot 2 Zeiss Fluoreszenzmikroskop Nikon eclipse Ti Nikon Konfokales Mikroskop Leica TCS SP5 Leica 38 3. Material Lichtmikroskop Axiovert 25 Leitz Zentrifugation Eppendorf Tischzentrifuge 5417 C Eppendorf Eppendorf Zentrifuge 5417 R Eppendorf Sicherheitswerkbänke NuAire Class II Nuaire Hera Safe Heraeus NuAire Class II Type A/B3 Nuaire KOJAIR KR-130 BW MSC CL II En12469 KOJAIR Sonstige Materialien und Geräte Autoklav Webeco Jürgens Brutschrank Typ B16 Heraeus Coulter Epics XL Durchflusszytometer Beckman Coulter CO2-Brutschrank Heraeus ChemiDoc System BIO-RAD Elektrophoresekammer Keutz Fastblot Semi-Dry Blotter Biometra Elektroporationsküvette, 2 mm BIO-RAD Gene Pulser Xcell BIO-RAD Gene Quant RNA/DNA Calculator Pharmacia Biotech Kryostat Reichert-Jung Kühl- und Gefriergeräte Liebherr LKB-Pumpe Pharmacia Microtomklingen Type A35 Feather MF-Membrane Filters Millipore Primus 25/96 Thermocycler MWG Biotech Photometer Ultraspec 2000 Amersham pH-Meter Jürgens RCT basic Magnetrührer IKA Labortechnik 39 3. Material Amicon Ultra-15 Centrifuge Filter Millipore Schüttelinkubator Typ 3033 GFL Thermoblock Liebisch Thermomixer Kompakt Eppendorf Uhu Klebstoff Alleskleber Uhu Zellfilter (100 µm) Greiner Bio one 3.22. Verbrauchsmaterialien Deckgläschen Roth Kryoröhrchen Greiner Bio-one Kulturplatten (6-well, 24-well) Greiner Bio-one Kulturplatten mit Filtereisätzen Corning Objektträger Roth Parafilm Roth Pipettenspitzen (10 µl, 200 µl, 1000 µl) Ratiolab Reaktionsgefäße (1,5 ml, 2 ml) Eppendorf AG Reaktionsgefäße (15 ml, 50 ml) Greiner Bio-one Zellkulturflaschen (75 cm²) Greiner Bio-one Corning® Transwell® polyester Costar membrane cell culture inserts (6.5mm Transwell with 0.4m pore size; CLS3470) 3.23. Software Axiophot 2 Fluoreszenzmikroskop Zeiss Coulter Epics XL (Durchflusszytometer) Beckman Coulter Gel Capture Entry (DNA-Gel) INTAS NIS Viewer Nikon Quantity One V4.4.0 (ChemiDoc) BIO-RAD Adobe Photoshop CS2 Adobe 40 Corning 4. Methoden 4. Methoden 4.1. Zellkulturtechnik 4.1.1. Zellkultur Alle Zellen wurden bei 37 °C und 5 % CO2-Atmosphäre in 75 cm2-Zellkulturflaschen in 20 ml Medium kultiviert und zweimal pro Woche passagiert. Dazu wurde zunächst das Medium abgenommen und die Zellen einmal mit 10 ml PBS gewaschen. Zum Ablösen wurden die Zellen mit 1 ml Trypsin/EDTA inkubiert, bis sie sich von dem Flaschenboden ablösten. Anschließend wurden die Zellen in 10 ml serumhaltigem Medium resuspendiert und für die weitere Kultivierung im Verhältnis von 1:5 bis 1:20 in einem Volumen von 10 ml Zellkulturmedium passagiert. Die restliche Zellsuspension wurde je nach Bedarf ausgesät oder verworfen. 4.1.2. Kryokonservierung und Auftauen von Zellen Um die Zellen zu konservieren, wurden diese eingefroren und bei -80 °C gelagert. Dazu wurden Zellen, die in 75 cm2-Zellkulturflaschen konfluent gewachsen waren, trypsiniert, anschließend in 9 ml Medium aufgenommen und für 5 Minuten bei 400 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde in EMEM oder DMEM, 10 % Glycerin und 10 % FKS, resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in Kryoröhrchen, in 1ml Aliquots bei -80 °C eingefroren. Zum Auftauen wurden die Zellen im Wasserbad bei 37 °C erwärmt und mit 10 ml entsprechendem Medium versetzt. Nach 24 Stunden erfolgte ein Mediumwechsel. 4.1.3. DAPI-Test Um eine Kontamination der Zellen mit Mykoplasmen auszuschließen, wurden die Zellen alle vier Wochen mit dem DAPI-Test getestet. Dazu wurden die Zellen am Vortag dünn auf ein Deckgläschen ausgesäht. Am nächsten Tag wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und anschließend mit 200 µl DAPI-Lösung pro Deckgläschen für 10 Minuten bei 37 °C inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt 41 4. Methoden wurden die Deckgläschen mit Mowiol auf einem Objektträger fixiert und unter dem Fluoreszenzmikroskop beurteilt. Zusätzlich zum DAPI-Test wurden die Zellen alle zwei Monate durch technisches Laborpersonal des Instituts für Virologie in einem ELISA (Mycoplasma Detection Kit, Roche) auf Mykoplasmen getestet. 4.1.4. Bestimmung der Zellzahl Die Zellzahl wurde mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Die Kammer wurde dazu mit einem Deckgläschen bedeckt und ein Tropfen der Zellsuspension auf die Kammer pipettiert. Unter dem Lichtmikroskop wurden vier Großquadrate ausgezählt. Die Zellzahl wurde nach folgender Formel berechnet: Zellzahl/ml = Mittelwert von 4 Großquadraten x 10^4 4.1.5. Herstellung primärer Hühnernierenzellkulturen Für die Herstellung von embryonalen Hühnernierenzellkulturen (eCKC) wurden 19 Tage alte SPF-Hühnerembryonen verwendet. Diesen wurde nach der Dekapitation unter sterilen Bedingungen das retroperitoneal gelegene Nierengewebe entnommen und dreimal mit sterilem, kaltem PBS gewaschen. Anschließend wurde das Nierengewebe in einen Erlenmeyerkolben überführt und mit Versen-Trypsin ca. 10 Minuten auf dem Magnetrührer bei 37 °C verdaut. Die trübe Zellsuspension wurde in 50 ml-Zentrifugenröhrchen überführt, die bereits zu einem Drittel mit serumhaltigem EDULB-Medium gefüllt waren. Nach dem Abzentrifugieren der Zellen bei ca. 250 x g für 10 Minuten wurden die Zellpellets in EDULB-Medium resuspendiert und durch sterile Zellfilter (Falcon) filtriert. Die Zellen wurden dann in einer Konzentration von ca. 2 x 105 Zellen pro ml ausgesät. Hühnernierenzellen wurden in EDULB-Medium mit 5-10 % FKS inkubiert. 42 4. Methoden 4.1.6. Isolierung des Oviduktes für Organschnitte Bei 16-18 Wochen alten Hühnern wurde nach vorheriger Tötung durch einen Schlag mit dem Gummihammer auf den Kopf und anschließender Entblutung durch die Öffnung der Halsschlagader, das Ovidukt entnommen. Die Legereife hatte zu diesem Zeitpunkt noch nicht eingesetzt. Die einzelnen Organabschnitte des Ovidukts, Infundibulum, Magnum, Isthmus und Uterus wurden identifiziert und vorsichtig in PBS gewaschen. Mit einer Mikrotomklinge wurden von jedem Abschnitt möglichst feine, ca. 5mm dünne Ringe präpariert und in Kulturgefäße mit entsprechendem COEC-Medium (siehe Material) überführt und am nächsten Tag für Infektionsversuche oder Lektinfärbungen verwendet. 4.1.7. Lebend-/Totfärbung Um die Vitalität der Oviduktexplantate zu bestimmen, wurde eine Lebend-/Totfärbung zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Präparation mit einem entsprechenden Kit (LIVE/ DEAD Viability/ Cytotoxicity Kit, Invitrogen) getestet. Dazu wurde 3h, 12h, 24h, 36h, 48h, 72h jeweils ein Oviduktring pro Abschnitt nach Angaben des Herstellers mit den Fluoreszenfarbstoffen Calcein AM und Ethidium homodimer -1 (EthD-1) gefärbt und für 30 Minuten inkubiert, um eine Unterscheidung von toten und lebendigen Zellern zu ermöglichen. Lebende Zellen stellten sich grün, tote Zellen stellten sich rot unter dem Mikroskop dar. Die Auswertung erfolgte direkt im Anschluss an die Inkubationszeit unter dem Floureszenzmikroskop. 4.1.8. Isolierung von Epithelzellen des Ovidukts Zur Isolierung der Epithelzellen wurde das Ovidukt im Bereich des Magnums isoliert und durch einen Längsschnitt eröffnet und in ca. 1cm lange Stücke geschnitten. Diese Stücke wurden durch vorsichtiges Schwenken in einem Becherglas mit kaltem PBS gewaschen. Die Vereinzelung der Zellen erfolgt mit Hilfe eines Proteaseverdaus (Streptomyces griseus, Type XIV) für 3 Stunden bei 37 ˚C auf einem Schwenker. Die Protease wurde in einer Konzentration von 0,4 mg/ ml EDULB-Medium (steril filtriert) 43 4. Methoden eingesetzt. Im Anschluss wurden die nun aus dem Zellverband gelösten Epithelzellen bei 400 x g für 10 Minuten bei 4 ˚C pelletiert. Der Überstand wurde nach dem Pelletieren verworfen und das Zellpellet mit 20-30 ml COEC-Medium resuspendiert und durch einen 100 µm Filter pipettiert. Die gefilterte Zellsuspension wurde nun auf Zellklulturflaschen aufgeteilt und für weitere 2 Stunden bei 37 ˚C inkubiert, um vorhandenen Fibroblasten die Möglichkeit zu geben, sich abzusetzen. Im Anschluss wurden die sich im Überstand befindlichen Epithelzellen abgenommen und in Kulturgefäße ausgesät. 4.1.9. Aussäen der Oviduktzellen auf Deckgläschen Die isolierten Oviduktzellen (COEC) wurden zum einen in 75 cm² Zellkulturflaschen gesät und nach 2-3 Tagen mit Trypsin abgelöst, um die Zellen auf am Vortag mit Poly-L-Lysin oder mit BD Matrigel Basement Membrane Matrix beschichtete oder unbeschichtete Deckgläschen zu säen. Zum anderen wurden die isolierten Zellen direkt auf die entsprechend vorbehandelten oder unbehandelten Deckgläschen gegeben. Die Zellen wurden in einer Konzentration von 2,5 x 10 5 Zellen in einem Volumen von jeweils 250 μl auf die Deckgläschen ausgesät. Da die isolierten Epithelzellen aber keine Reinkultur darstellen, sondern auch mit z. B. Erythrozyten durchmischt waren, ist die angegebene Zellzahl nur eine ungefähre Angabe. Die Zellen wurden anschließend bei 37 °C und 5 % CO2 im Brutschrank kultiviert. Das Medium wurde alle zwei Tage gewechselt und die Zellen auf ihre Vitalität unter dem Lichtmikroskop beurteilt. 4.1.10. Infektionsversuche mit Oviduktringen Die Ovidukt-Explantate der unterschiedlichen Ovidukt-Abschnitte wurden 24 Stunden nach der Explantation mit den AvCoV-Stämmen Beaudette, Qx und B1648 mit einem Titer von je 1x104 Foci-forming units (FFU/Ring), jeweils im Doppelansatz in 24-WellPlatten infiziert. Die infizierten Oviduktringe wurden anschließend für 1 Stunde bei 37 °C auf dem Schwenker inkubiert. Nach 1 Stunde wurde das virushaltige Medium abgenommen und jede Vertiefung mit 1 ml serumfreien Edulb-Medium aufgefüllt. 44 4. Methoden Nach 12 Stunden, 24 Stunden, und 48 Stunden wurden die infizierten Ringe mit Tissue freezing-Medium auf kleinen Filterpapieren eingebettet und direkt in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert. Ein Teil der Oviduktringe wurde ohne vorherige Infektion, 24 Stunden nach der Explantation, direkt in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert. Diese Explantate standen dann u.a. für Lektinfärbungen oder als Kontrollschnitte zur Verfügung. Alle Versuche wurden mindestens fünfmal wiederholt. 4.1.11. Herstellung von Kryoschnitten Von den infizierten und nicht infizierten Oviduktringen wurden Kryoschnitte mit einer Dicke von 10 μm angefertigt. Dazu wurde ein Kryostat von Reichert-Jung verwendet. Die auf Objektträgern befindlichen Kryoschnitte wurden 24 Stunden an der Luft getrocknet, um anschließend mit spezifischen Antikörpern oder Lektinen inkubiert zu werden oder bei -20 °C gelagert zu werden. 4.1.12. Infektionsversuche mit isolierten COEC Die auf Deckgläschen ausgesäten, isolierten Oviduktzellen wurden am Tag nach der Präparation unter dem Lichtmikroskop auf ihre Vitalität untersucht, wobei die Deckgläschen, auf denen eine deutliche Zilienaktivität der Zellen zu erkennen war, für erste Infektionsversuche verwendet wurden. Die COEC wurden mit den AvCoVStämmen Beaudette, Qx und B1648 mit einem Titer von je 1x104 Foci-forming units (FFU/Ring), jeweils im Doppelansatz in 24-Well-Platten infiziert. Oder für die Charakterisierung der Zellen mit Lektinen inkubiert. Die infizierten COEC wurden anschließend für 1 Stunde bei 37 °C auf dem Schwenker inkubiert. Nach 1 Stunde wurde das virushaltige Medium abgenommen und jede Vertiefung mit 1 ml serumfreien Edulb-Medium aufgefüllt. Nach 12 Stunden, bzw. 24 Stunden wurden die COEC mit 3 % Paraformaldehyd fixiert und bis zur weiteren Analyse bei 4 °C im Kühlschrank gelagert. Alle Versuche wurden mindestens dreimal wiederholt. 45 4. Methoden 4.1.13. Lektinfärbungen Um alpha 2,3-gebundene Sialinsäuren zu detektieren, wurde das Lektin Maackia amurensis agglutinin (MAA) in seinen zwei Isoformen MAA I und MAA II verwendet. Um alpha 2,6-gebundene Sialinsäuren zu detektieren, wurde das Lektin Sambucus nigra agglutinin verwendet. Kryoschnitte der entsprechenden Abschnitte des Oviduktes oder am Vortag isolierte Ovidukepitheltzellen, die auf Deckgläschen ausgesät waren, wurden zuvor mit 3 % Paraformaldehyd für 20 Minuten fixiert. Nach dem Quenchen mit 0,1M Glycin-PBS für 5 Minuten folgten drei Waschschritte mit PBS. Anschließend wurde das gewünschte Lektin auf dem Kryoschnitt, jeweils 1:200 in 1 % BSA verdünnt, in einer feuchten Kammer für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Das Lektin MAAII wurde nach vorheriger Inkubation der Zellen mit einem Avidin/Biotin Blocking Kit, das nach Angaben des Herstellers eingesetzt wurde, verwendet. Die Detektion der gebundenen MAAII-Lektine erfolgte nach weiterer Inkubation für eine Stunde in der feuchten Kammer mit einem StreptavidinAntikörper, der an das Fluorochrom Cy3 gekoppelt ist. Nach der Inkubationszeit erfolgten erneut zwei Waschschritte mit PBS und einer mit destilliertem H2O. Die Kryoschnitte oder Deckgläschen wurden anschließend mit einem Tropfen DAPIMowiol eingedeckelt und bis zur Auswertung bei 4˚C gelagert. 4.1.14. Virusanzucht Zur Anzucht aller Stämme wurden embryonierte Hühnereier verwendet. SPFHühnereier (VALO SPF) wurden zehn Tage bei 37 °C vorbebrütet und geschiert und abgestorbene oder unbefruchtete Eier aussortiert. Zur Desinfektion wurden die Eier oberflächlich mit Ethanol besprüht. Mit einer weitlumigen Kanüle wurde ein Loch in den stumpfen Pol des Eis gestanzt. Je 0,1 ml der in PBS 1:10 verdünnten Virussuspension wurde mittels einer Spritze in die Allantoishöhle injiziert. Die Einstichstelle wurde anschließend mit Alleskleber verschlossen. Die infizierten Eier wurden bei 37 °C im Eiinkubator weiter bebrütet. Dreimal täglich erfolgte ein Schieren der Eier und bereits abgestorbene Eier wurden bei 4 °C gelagert, um ein Absinken des Titers zu vermeiden. Spätestens nach 72 Stunden wurden die 46 4. Methoden restlichen Eier kalt gestellt. Nach fünf Stunden bei 4 °C waren die Embryonen abgestorben, so dass mit der Ernte des Virus begonnen werden konnte. Dazu wurden die Eier oberflächlich desinfiziert und mit einer Pinzette eröffnet. Die Ernte erfolgte unter einer sterilen Werkbank. Die klare Allantoisflüssigkeit wurde mit einer Pipette abgesaugt und anschließend auf Eis gelagert. Um grobe Bestandteile zu entfernen, wurde bei 3000 x g und 4 °C zentrifugiert. Die Allantoisflüssigkeit wurde danach aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80 °C gelagert. 4.2. Bindungstests mit löslichen AvCoV-S-Proteinen 4.2.1. Neuraminidase-Behandlung Um Sialinsäuren auf der Zelloberfläche zu entfernen, wurden die Zellen mit Neuraminidase Typ V aus Clostridium perfringens vorbehandelt. Die Desialylierung erfolgte am Tag nach dem Aussäen der isolierten eCKC- oder COEC-Zellen. Die Neuraminidasebahandlung der Zellen erfolgte vor der Inkubation mit löslichen SProteinen. Bis zu 300 mU Neuraminidase, verdünnt mit PBS in einem Volumen von 200 µl/Eppendorfgefäß wurden zu den Zellen gegeben und diese dann bei 37 °C für eine Stunde geschwenkt. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit PBS gewaschen und standen für weitere Versuche zur Verfügung. 4.2.2. Durchflusszytometrie Durchflusszytometrie wurde für die quantitative Untersuchung der Bindung von löslichen AvCoV-S-Proteinen an eCKC- oder COEC-Zellen angewendet. Für diesen Zweck wurden die entsprechenden Zellen am Vortag in 6-Well-Platten ausgesät. Am folgenden Tag wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit 400 µl Trypsin inkubiert, um die Zellen zu vereinzeln. Nach dem Ablösen der Zellen wurden diese mit 0,1 % BSA in PBS versetzt. Nach dem Pelletieren der Zellen durch Zentrifugation bei 400 x g für 5 Minuten folgte die Inkubation der Zellen für 1 Stunde mit löslichem IBV-S-Protein in einem Überkopfschüttler bei 4 °C. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit 0,1 % BSA in PBS gewaschen und bei 400 x g für 5 Minuten pelletiert. 47 4. Methoden Nach der Inkubation mit einem anti-human-PE- Antikörper in einer Verdünnung von 1:400 für 1 Stunde bei 4 °C erfolgte ein erneutes Waschen der Zellen mit 0,1 % BSA in PBS. Nach dem Resuspendieren der Zellen wurden diese direkt in einem Beckmann Coulter Epics Durchflusszytometer analysiert und die Bindung des löslichen AvCoV-S-Proteins an eCKC- oder COEC-Zellen mit der EXPO32 Analysesoftware quantifiziert. 4.2.3. Bindungstest löslicher Proteine mit Kryoschnitten des Ovidukts Um die Bindung der löslichen Spike Proteine auf Kryoschnitten zu analysieren, wurden die löslichen Spike-Proteine der AvCoV-Stämme QX, Bd und B1648 auf Kryoschnitten der verschiedenen Abschnitte des Oviduktes für 1 Stunde bei 4 °C inkubiert. Um zu testen, ob die Bindung sialinsäure-abhängig ist, wurde ein Teil der Kryoschnitte mit 300 mU Neuraminidase Typ V aus Clostridium perfringens für 1 Stunde bei 37 °C vor der Inkubation mit dem löslichen Protein inkubiert. Um Bindung zu detektieren, wurde ein Cy-3-gekoppelter Zweitantikörper in einer Verdünnung von 1:750 in 1 % BSA eingesetzt. Die Kryoschnitte wurden anschließend mit einem Deckgläschen und DAPI-Mowiol bedeckt und nach dem Trocknen unter dem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. Alle Versuche wurden mindestens fünfmal wiederholt. 4.3. Virustiterbestimmung 4.3.1. Foci forming units, Endpunktverdünnungsmethode Um die Anzahl infektiöser Viruspartikel in einer Suspension zu bestimmen, wurde die Endpunktverdünnungsmethode eingesetzt. Durch Verwendung von Methylcellulose wird die Ausbreitung der Viren durch Diffusion verhindert, so dass sich die Viren nur von Zelle zu Zelle ausbreiten können. Die Zellen, die mit dem Virus infiziert sind, bilden einen „Focus“, den man durch Färbung sichtbar machen kann. Der Virustiter wird in „foci forming units“ pro ml (ffu/ml) angegeben. 48 4. Methoden Für die Titration wurden am Vortag primäre Hühnernierenzellen hergestellt und in eine 24-Well-Platte, die mit Deckgläschen bestückt war, ausgesät (2,5 x 105 Zellen/ml, je 1 ml Zellsuspension pro Vertiefung). Am folgenden Tag wurden die Hühnernierenzellen vorsichtig dreimal mit PBS gewaschen, um anschließend die zu testende Virussuspension im Doppelansatz als ganzzahlig logarithmische Verdünnungsreihe zur Basis 10 anzulegen. Hierzu wurden 900 μl virusfreies Medium in einem Eppendorfgefäß vorgelegt und je 100 μl der jeweiligen Verdünnungsstufe hinzugegeben. Anschließend wurde jedes Eppendorfgefäß auf dem Vortexer gemischt und jeweils 250 μl von jeder Verdünnungsstufe in die Vertiefungen gegeben. Als Negativkontrolle wurde auf je eine Vertiefung pro Titrationsreihe ausschließlich virusfreies Medium gegeben. Nach einer Inkubationszeit von einer Stunde auf dem Schwenker bei 37 °C, wurde 1ml Methylcellulose in EDulb +5 % FKS als Überschichtungsmedium in jede Vertiefung gegeben. Nach weiteren 24 Stunden bei 37 °C wurde die Methylcellulose abgesaugt und die Platte vorsichtig dreimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit 0,2 ml Paraformaldehyd für 20 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Es folgte das Quenchen mit 0,1M PBS-Glycin für 10 min. Permeabilisiert wurden die Zellen mit 0,2 % PBS-Triton-X-100. Um die Foci zu quantifizieren, wurden die sich auf den Deckgläschen befindlichen Zellen mit einem AvCoV-Antikörper, der gegen das N-Protein gerichtet ist, für eine Stunde in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur inkubiert (1:100 in BSA verdünnt). Nach drei Waschschritten mit PBS wurde als Zweitantikörper ein FITCgekoppelter Antikörper aus der Ziege (1:200 verdünnt) auf die Zellen gegeben und ebenfalls für eine Stunde bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer im Dunkeln inkubiert. Nach drei weiteren Waschschritten konnten die Foci unter dem Lichtmikroskop ausgezählt werden. 49 4. Methoden 4.4. Transiente Transfektion eukaryotischer Zellen 4.4.1. Transiente Transfektion von BHK-21-Zellen Als Transfektion wird das Einbringen von fremder DNA in eukaryotische Zellen bezeichnet (Lottspeich und Engels, 2006). Bei der transienten Transfektion wird das zu exprimierende Gen nicht ins Genom der Zelle integriert, die Genexpression der eingebrachten Plasmide ist auf einen kurzen Zeitraum beschränkt. Für die Transfektion wurden die Zellen am Vortag mit einer Anzahl von 2 x 10 5 Zellen/ml in 6-Well-Schalen (je 2,5 ml Zellsuspension) oder auf 10 cm-Schalen (je 10 ml Zellsuspension) ausgesät. Die Durchführung der Transfektion erfolgte mittels Polyethylenimine (PEI), welches anfangs als PEI-Gebrauchslösung angesetzt wurde. Dazu wurde Polyethlen-Pulver in destilliertem H2O in einer Konzentration von 1 μg/μl eingewogen. Um das PEI zu lösen, wurde 37 %-iges HCl hinzugefügt und der pHWert auf 2,0 eingestellt. Dieser Ansatz wurde für 2-3 Stunden gerührt. Anschließend wurde die die PEI-Lösung mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt. Nach der sterilen Filtration, wurde die nun fertige PEI-Gebrauchslösung aliquotiert und bei -80 °C gelagert. Die Zellen waren am Tag der Transfektion 80-100 % konfluent. Das Zellulturmedium wurde abgenommen und durch EMEM mit 3 % FKS ersetzt. Opti-MEM wurde der Schalengröße entsprechend vorgelegt und die zu transfizierende Plasmid-DNA wurde hinzu pipettiert und bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert. Anschließend wurde die PEI-Gebrauchslösung nach und nach in das Reaktionsgefäß gegeben. Dieser Ansatz, bestehend aus der Plasmid-DNA, Opti-MEM und PEI- Gebrauchslösung, wurde für weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend tröpfchenweise auf die Zellen gegeben. Die Zellen wurden bei 37 °C und 5 % CO2 im Brutschrank inkubiert. Nach 24 Stunden fand der erste Mediumwechsel statt, wobei der Überstand bei 4 °C gelagert und mit dem nach 48 Stunden erneut abgenommenen Überstand gemischt wurde. Die im Überstand befindlichen Proteine wurden mit Amicon Ultra-15 Centrifuge (100 K) Filtern bei 300 x g ankonzentriert und anschließend bei -20 °C gelagert. 50 4. Methoden Tabelle 33 Bedingungen für eine Transfektion mit PEI 6-Well-Schalen 10 cm-Schalen Plasmid-DNA 4 µg 12 µg PEI 6 µl 20 µl Opti-MEM (Volumen) 1 ml 3 ml Vorgelegtes Medium 2 ml 7 ml (EMEM mit 3% FKS) 4.5. Biochemische und immunologische Methoden 4.5.1. Immunfluoreszenztest Um Virusantigen sichtbar zu machen, wurde der Immunfluoreszenztest durchgeführt. Sowohl die infizierten Epithelzellen auf Kryoschnitten, als auch die infizierten, isolierten COEC (auf Deckgläschen) wurden mit 3 % Paraformaldehyd für 20 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Um das überschüssige Paraformaldehyd zu entfernen, wurden die Zellen/Kryoschnitte mit 0,1 M Glycin in PBS für 5 Minuten inkubiert. Um intrazelluläre Proteine nachzuweisen, mussten die Zellen noch zusätzlich mit 0,2 % TRITON-X-100 in PBSM für 10 Minuten bei Raumtemperatur permeabilisiert werden. Anschließend folgten drei Waschschritte mit PBS. Der erste Antikörper wurde in 1 % BSA verdünnt und als 30 µl Tropfen auf Parafilm in einer feuchten Kammer vorgelegt. Die Deckgläschen wurden mit der Zellseite auf den Antikörper-Tropfen gelegt und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Für drei nachfolgende Waschschritte mit PBS wurden die Deckgläschen mit der Zellseite nach oben zeigend in eine 24-Well-Platte verbracht. Der Zweitantikörper, der mit einem Floureszenzfarbstoff gekoppelt war, wurde ebenfalls in 1 % BSA verdünnt und auch als Tropfen auf Parafilm in der feuchten Kammer vorgelegt. Die Deckgläschen wurden erneut mit der Zellseite auf den Antikörper-Tropfen gelegt und für 1 Stunde in der feuchten Kammer bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert, um ein Ausbleichen des Farbstoffes zu verhindern. Anschließend erfolgten drei weitere Waschschritte mit PBS und einmal mit destilliertem H20. Nach dem letzten Waschschritt wurden die 51 4. Methoden Deckgläschen auf einem Objektträger und die Kryoschnitte mit Deckgläschen mit DAPI-Mowiol eingedeckelt und bei 4 °C gelagert. Die Auswertung erfolgte unter dem Nikon Eclipse Ti Mikroskop. 4.5.2. SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) Proteine wurden mit Hilfe der diskontinuierlichen Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamidgel-Elektrophorese (Laemmli, 1970) ihrer Größe nach aufgetrennt. Die Trenngele hatten die Maße 50 x 80 x 0,75 mm3 und eine Acrylamidkonzentration von 8 %. Die Auftrennung der Proteine erfolgte bei 80 Volt im Sammelgel und 120 Volt im Trenngel bis der Bromphenolblau-Marker des Probenpuffers den unteren Rand des Gels erreicht hatte. Ein Größenstandard für Proteine wurde ebenfalls mit aufgetragen. 4.5.3. Western Blot Nach der elektrophoretischen Auftrennung wurden die Proteine mit Hilfe des Semidry-Blot-Verfahrens auf eine Nitrozellulosemembran übertragen (Kyhse- Anderson, 1984). Zwischen die Graphitelektroden der Blot-Apparatur wurden in Puffer getränkte Filterpapiere, Nitrozellulose und das Polyacrylamid-Gel in der folgenden Reihenfolge angeordnet: 2 Blatt Filterpapier getränkt in Anodenpuffer I, 1 Blatt Filterpapier getränkt in Anodenpuffer II, Nitrozellulose getränkt in Wasser, Gel und 3 Blatt Filterpapier getränkt in Kathodenpuffer. Der Transfer der Proteine auf die Nitrozellulosemembran erfolgte für 18 Minuten bei einer konstanten Stromstärke von 300 mA. Freie Proteinbindungsstellen auf der Membran wurden durch Inkubation mit Blocking-Reagenz (0,5 % in PBSM) über Nacht bei 4 °C blockiert. 4.5.4. Immunologische Detektion von Proteinen Die auf die Nitrocellulose-Membran übertragenen Proteine wurden im nächsten Schritt mit spezifischen Antikörpern detektiert. Vor der Inkubation wurde die Membran dreimal für jeweils 10 Minuten mit PBSM-0,1 % Tween gewaschen. 52 4. Methoden Anschließend folgte die Inkubation mit einem anti-hFc-HRP Antikörper für 1 Stunde bei 4 °C. Darauf folgten erneut drei Waschschritte mit PBSM-0,1 % Tween. Die Peroxidase der gebundenen Zweitantikörper konnte durch die Inkubation für 5 Minuten mit entsprechenden Substraten (Super Signal Dura, Super Signal Femto) mit Hilfe des Chemi Doc Systems sichtbar gemacht werden. 4.6. Molekularbiologische Methoden 4.6.1. Isolierung viraler RNA Zur Isolierung viraler RNA wurde der Überstand von am Vortag mit dem AvCoV-QXStamm infizierten eCKC-Zellen verwendet und mit dem QIAamp viral RNA Mini Kit nach Angaben des Herstellers durchgeführt. 4.6.2. RT-PCR Die Reverse Transkriptase-PCR wurde eingesetzt, um die isolierte RNA in cDNA umzuschreiben. Die RT-PCR basiert auf der Eigenschaft, dass diverse virale Polymerasen aus RNA als Ausgangsmaterial ein DNA Produkt synthetisieren können (Baltimore, 1970; Temin and Mizutani, 1970). Daher werden sie auch als RNAabhängige-DNA-Polymerasen oder reverse Transkriptasen bezeichnet. Hierzu wurde das Superscript III-Kit nach Angaben des Herstellers eingesetzt. 4.6.3. Herstellung löslicher Spike-Proteine Mit Hilfe der RT-PCR wurde cDNA der S1-Untereinheit des QX-Spikes hergestellt. Diese wurde anschließend in den pCG1-Fc-Vektor geklont, um Fusionsproteine, die aus dem S1-Gen des entsprechenden AvCoV-Stammes, gekoppelt an die humane IgG Fc Domäne bestanden, herzustellen. Für die Herstellung löslicher Spike-Proteine wurden BHK 21 Zellen mit dem entsprechenden Plasmid transfiziert. Als Transfektionsreagenz wurde PEI wie unter 4.4.1 beschrieben, eingesetzt. Die Überstände mit den darin befindlichen löslichen Proteinen wurden 24 Stunden und 53 4. Methoden 48 Stunden nach der Transfektion geerntet, in Amicon Ultra-15 Centrifuge (100 K) Filtern ankonzentriert und bei -20 C° gelagert. 4.6.4. Polymerasekettenreaktion (PCR) Die Polymerasekettenreaktion ist eine in vitro-Methode zur Vervielfältigung eines bekannten DNA-Abschnittes. Diese Technik wurde von Saiki et al. (1985 und 1988), beschrieben. Voraussetzung zur Anwendung dieser Methode ist die Kenntnis der DNA-Sequenz an den Enden des zu ampflizierenden Abschnittes, an die zwei synthetische Oligonukleotid-Primer in gegenläufiger Orientierung binden können. Durch die Wahl geeigneter Primer können Mutationen, Deletionen, Insertionen und Restriktionsschnittstellen in das Amplifikat eingeführt werden. Jeder Zyklus einer PCR besteht aus einem Denaturierungsschritt, bei dem die doppelsträngige DNA bei einer Temperatur von 95 °C in Einzelstränge denaturiert wird. Es folgt die Anlagerung (annealing) von synthetischen Oligonukleotiden (Primern) an die flankierenden Bereiche des DNA-Abschnittes, der amplifiziert werden soll. Anschließend folgt ein Elongationsschritt, bei dem mittels einer DNA-Polymerase ein neuer DNA-Doppelstrang synthetisiert wird. Zur Amplifikation der DNA wurde die Pfu-Polymerase aus Pyrococcus furiosus eingesetzt, die über eine 3'-5'- Exonukleaseaktivität verfügt. Hierdurch wird der Einbau von falschen Nukleotiden in den neusynthetisierten DNA-Strang verringert. Die PCR-Reaktionen wurden, soweit dies nicht anders beschrieben ist, in einem Thermocycler unter den in Tabelle 35 angegebenen Bedingungen durchgeführt. Tabelle 34 Ansatz der PfU-PCR DEPC- H2O ad 50 µl 10 x Pfu-Puffer + MgSO4 5 µl 10 mM dNTPs 1 µl 10 µM sense-Primer 2,5 µl 10 µM antisense-Primer 2,5 µl Template-DNA 1 µl Pfu-Polymerase 1 µl 54 4. Methoden Tabelle 35 Bedingungen der PfU-PCR Temperatur Dauer Zyklen 75 °C beliebig 95 °C 2 min 95 °C 30 sec 55 °C (-0,2 °C pro Zyklus) 30 sec 72 °C 2 min/kb 95 °C 30 sec 54 °C 30 sec 72 °C 2 min/kb 72 °C 7 min 4 °C bis zum Abbruch 10 18 4.6.5. Reinigung von DNA-Fragmenten Um Enzyme und Salze von der DNA zu entfernen, wurden nach der Amplifikation von DNA-Fragmenten die PCR-Produkte und Vektoren mit dem QIAquick PCR Purification Kit nach Angaben des Herstellers gereinigt. Im Anschluss an die Reinigung wurde die DNA in DEPC-Wasser eluiert. 4.6.6. Spaltung der DNA mittels Restriktionsendonukleasen Bakterielle Restriktionsendonukleasen Erkennungssequenzen schneiden. können Diese die DNA an spezifischen DNA-Fragmente mit spezifischen 3´/5´Enden wurden in einer anschließenden Ligation als Inserts in Plasmidvektoren verwendet. Der Restriktionsverdau erfolgte nach Angaben des Herstellers. 55 4. Methoden Tabelle 36 Restriktionsansatz DEPC- H2O ad 50 µl 10 x Puffer 5 µl BSA 0,5 µl DNA x µl Enzym 1-5 µl 4.6.7. Agarosegelelektrophorese Die Agarosegelelektrophorese ist ein Trennverfahren, um DNA-Fragmente ihrer Größe nach aufzutrennen und zu identifizieren. Das Prinzip beruht auf der Wanderung von geladenen Molekülen in einem elektrischen Feld. Die negativ geladene DNA wandert von der Kathode zur Anode mit einer Geschwindigkeit, die abhängig von der Molekülgröße ist. Für die Auftrennung der DNA zu analytischen Zwecken wurden die Agarosegele mit TBE-Puffer hergestellt und die Elektrophorese mit einer Spannung von 130 Volt durchgeführt. Für präparative Zwecke wurden die Agarosegele mit TAE-Puffer hergestellt und die Elektrophorese mit einer Spannung von 80 Volt durchgeführt. Abhängig von der Größe der zu analysierenden DNAFragmente lag die Agarosekonzentration zwischen 0,8 % und 1,5 %. Um die DNA sichtbar zu machen, wurden die Gele für ca. 5 Minuten im Ethidiumbromidbad gefärbt und danach ca. 10 Minuten gewässert und anschließend unter UV-Licht ausgewertet. Ethidiumbromid ist ein Molekül, das sich zwischen den Basen von Nukleinsäuren anlagert. Durch ultraviolettes Licht werden die mit Ethidiumbromid gefärbten DNA-Fragmente sichtbar. 4.6.8. Isolierung von DNA aus Agarosegelen Im Anschluss an die Spaltung der DNA mit Restriktionsendonukleasen wurde eine präparative Gelelektrophorese durchgeführt, um überschüssige Enzyme, Salze oder nicht geschnittene DNA-Fragmente zu entfernen. Der Verdau-Ansatz wurde mit 10 μl Probenpuffer versetzt. 10 μl dieses Ansatzes wurden direkt neben den in der ersten 56 4. Methoden Spur befindlichen Längenstandard auf ein Agarosegel aufgetragen. Die nächste Spur (die dritte) wurde freigelassen und der Rest der Probe wurde auf die restlichen Spuren verteilt. Nach der Auftrennung der DNA bei einer Spannung von 80 Volt, wurden nur die beiden ersten Spuren im Ethidiumbromidbad gefärbt. Beim Betrachten unter dem UV-Licht wurden die gewünschten DNA-Banden durch kleine Skalpellschnitte im Gel markiert. Die zu reinigende DNA wurde anschließend aus dem Gel, welches nicht mit Ethidiumbromid und UV-Licht in Berührung gekommen ist, ausgeschnitten und mit dem QIAquick Gel Extraction Kit nach Angaben des Herstellers isoliert. 4.6.9. Bestimmung der DNA-Konzentration Zur Quantifizierung der DNA wurde der Gene Quant II RNA/DNA Calculator (Pharmacia) eingesetzt. Durch die Messung der Absorption bei 260 nm lässt sich die DNA-Konzentration bestimmen. Die Berechnung der Konzentration erfolgte nach folgender Formel: Adsorption260nm x (Verdünnung x Faktor/1000) = DNA-Konzentration in µg /µl Der spezifische Extinktionskoeffizient für doppelsträngige DNA ist 50, d.h. eine OD von 1 entspricht einer Konzentration von ca. 50 µg / ml DNA. 4.6.10. Ligation Eine Ligation ist die enzymatische Verknüpfung zweier Nukleinsäuremoleküle an deren Enden. Dabei katalysiert die eingesetzte DNA-Ligase des T4-Bakteriophagen die Bindung der Phosphodiester-Gruppen zwischen den 5'-Phosphat- und 3'Hydroxylgruppen doppelsträngiger DNA. Insert und Vektor wurden in einem molaren Verhältnis von 5:1 angesetzt. Die Ligation wurde bei 14 °C über Nacht angesetzt. Als Negativkontrolle diente ein Ligationsansatz ohne Insert-DNA. 57 4. Methoden Tabelle 37 Ligationsansatz DEPC- H2O ad 20 µl 10 x Ligase-Puffer 2 µl T4 DNA-Ligase (4 U/L) 2 µl Vektor-DNA x µl (50-100ng) Insert-DNA x µl 4.6.11. Hitzeschock-Transformation chemisch kompetenter E. coli XL1-Blue Um die zuvor ligierte DNA in chemisch kompetente E. coli XL1-Blue Bakterien (wurden vom Institut für Virologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt) einzubringen, wurde eine Hitzeschock-Transformation durchgeführt. Dazu wurden 2 µl des Ligationsansatzes in das Reaktionsgefäß zu den chemisch kompetenten Bakterien pipettiert und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz für 30 Sekunden auf 42 °C erhitzt. Nach weiteren 2 Minuten auf Eis wurden 200 µl LB-Medium dazugegeben und der Ansatz für 1 Stunde bei 37 °C auf einem Schüttler inkubiert. Die Bakterien wurden auf einer LBAmpicillin-Platte ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. 4.6.12. Kolonie-PCR Um zu überprüfen, ob die gewachsenen Kolonien das gewünschte Insert aufgenommen haben, wurde die Kolonie-PCR eingesetzt. Als Polymerase wurde die Taq-Polymerase aus Thermus aquaticus eingesetzt, die im Gegensatz zu der PfuPolymerase nicht über eine 3'-5'-Exonukleaseaktivität verfügt, aber deutlich schneller arbeitet als die Pfu-Polymerase. Mit Hilfe einer Pipettenspitze wurden die Kolonien von der Platte gepickt und in je ein PCR-Gefäß, das mit je 15 µl des in Tabelle 38 angegebenen Reaktionsansatzes befüllt war, durch mehrmaliges Resuspendieren überführt. Die gleiche Pipettenspitze wurde ebenfalls in einem mit 250 μl LB-Medium gefüllten 1,5 ml Reaktionsgefäß mehrmalig resuspendiert. Dieser Ansatz wurde, 58 4. Methoden während die PCR-Reaktion unter den in Tabelle 39 aufgeführten Bedingungen in einem Thermocycler ablief, bei 37 °C schüttelnd vorinkubiert. Tabelle 38 Ansatz für eine Kolonie-PCR DEPC- H2O ad 15 µl 10 x Taq-Puffer 1,5 µl MgCl2 1,2 µl dNTP (10mM) 0,3 µl Primer Sense (10µM) 0,45 µl Primer Antisense (10µM) 0,45 µl Taq-Polymerase Tabelle 39 Temperatur 95 °C 95 °C 54 °C 72 °C 72 °C 4 °C 4.6.13. 0,1 µl Bedingungen der Kolonie-PCR Dauer 2 min 15 sec 30 sec x min 5 min ∞ Zyklen 20 Präparation von Plasmid-DNA Bei einem positiven PCR-Ergebnis wurde der LB-Ansatz der entsprechenden Klone vermehrt. Anschließend folgte eine Midi-DNA-Präparation. Die Plasmid-tragenden Bakterien wurden zunächst in einer Übernachtkultur vermehrt. Hierzu wurden 100 ml LB-Medium mit Ampicillin mit 100 μl Bakteriensuspension beeimpft und über Nacht bei 37 °C auf dem Schüttler inkubiert. Die Präparation der Plasmid-DNA erfolgte am nächsten Tag mit dem NucleoBond Xtra Midi Kit nach Angaben des Herstellers. Die DNA wurde in 400 μl DEPC-H2O über Nacht bei 4 °C resuspendiert. Die DNA- 59 4. Methoden Konzentration wurde bestimmt und anschließend wurde die DNA bei -20 °C eingefroren. 4.6.14. Sequenzierung Die Plasmide wurden von der Firma MWG Biotech AG in Martinsried sequenziert. Alignements zum Kontrollieren der Sequenzen wurden mit dem Computerprogramm ClustalW2 durchgeführt (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/). 60 5. Publikation 5. Publikation 5.1. Manuskript I Differences in the tissue tropism to chicken oviduct epithelial cells between avian coronavirus IBV strains QX and B1648 are not related to the sialic acid binding properties of their spike proteins Ann-Kathrin Mork1, Martina Hesse1, Sahar Abd El Rahman2, Silke Rautenschlein3, Georg Herrler1 and Christine Winter1* *Corresponding author: Christine Winter [email protected] 1 Institute of Virology, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg 17, 30559 Hannover, Germany 2 Department of Virology, Faculty of Veterinary Medicine Mansoura University, Mansoura, Egypt 3 Clinic for Poultry, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg 17, 30559 Hannover, Germany Veterinary Research 2014, 45:67 Published online Jun 14, 2014. doi:10.1186/1297-9716-45-67 http://www.veterinaryresearch.org/content/45/1/67 Authors’ contributions AKM carried out the experiments and wrote the manuscript. MH participated in the FACS analysis and molecular cloning. SAE participated in the explant and cryosection preparation. SR and GH participated in the design of the study. CW designed the study and wrote the manuscript. All authors read and approved the final manuscript. 61 5. Publikation Abstract The avian coronavirus (AvCoV) infectious bronchitis virus (IBV) is a major poultry pathogen. A characteristic feature of IBV is the occurrence of many different strains belonging to different serotypes, which makes a complete control of the disease by vaccinations a challenging task. Reasons for differences in the tissue tropism and pathogenicity between IBV strains, e.g. a predilection for the kidneys or the oviduct are still an open question. Strains of the QX genotype have been major pathogens in poultry flocks in Asia, Europe and other parts of the world. They are the cause of severe problems with kidney disease and reproductive tract disorders. We analysed infectivity and binding properties of the QX strain and compared them with those of the nephropathogenic strain B1648. As most IBV strains do not infect permanent cell lines and show infection only in primary chicken cells of the target organs, we developed a culture system for chicken oviduct explants. The epithelial cells of the oviduct showed a high susceptibility to infection by the QX strain and were almost resistant to infection by the nephropathogenic B1648 strain. Binding tests with isolated primary oviduct epithelial cells and soluble S1 proteins revealed that S1 proteins of two IBV strains bound with the same efficiency to oviduct epithelial cells. This attachment was sialic acid dependent, indicating that the sugar binding property of IBV spike proteins is not the limiting factor for differences in infection efficiency for the oviduct of the corresponding viruses. Keywords avian coronavirus, spike protein, IBV, tissue tropism 62 5. Publikation 5.2. Manuskript II Charakterisierung von isolierten Oviduktepithelzellen aus Hühnern Ann-Kathrin Mork1, Silke Rautenschlein2, Georg Herrler1 und Christine Winter1 1 Institut für Virologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Bünteweg 17, 30559 Hannover, Germany 2 Klinik für Geflügel, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Bünteweg 17, 30559 Hannover, Germany (In Vorbereitung) 63 5. Publikation Zusammenfassung Das aviäre Coronavirus (AvCoV) ist einer der bedeutendsten Krankheitserreger in der Geflügelindustrie. Eine besondere wirtschaftliche Bedeutung kommt der Erkrankung in Legehennenbeständen zu, da das Virus nicht nur den Respirationstrakt oder die Nieren befällt, sondern einige Stämme auch im Ovidukt pathologische Veränderungen hervorrufen. Um eine Infektion mit dem AvCoV am Ovidukt zu untersuchen, wurden Epithelzellen des Ovidukts (COEC) von Hühnern isoliert und kultiviert. Durch die Färbung mit Fluoreszenzfarbstoffen konnte gezeigt werden, dass die isolierten Zellen Muzin-produzierende Zellen und zilientragenden Zellen enthalten. Weiterhin konnte durch die Färbung mit den Lektinen Maackia amurensis agglutinin und Sambucus nigra agglutinin gezeigt werden, dass die isolierten Epithelzellen in ausdifferenziertem Zustand sowohl alpha 2,3-gebundene Sialinsäuren, die als Rezeptordeterminante für das aviäre Coronavirus fungieren, als auch alpha 2,6-gebundene Sialinsäuren exprimieren. Erste Infektionsversuche zeigen die Empfänglichkeit der isolierten Zellen für verschiedene AvCoV-Stämme. Die hier gezeigte Methode zur Isolierung von Ovidukt Epithelzellen ermöglicht nun Infektionsstudien unter in vitro-Bedingungen. Stichwörter Aviäres Coronavirus, Hühner Ovidukt, Epithelzellen 64 5. Publikation Das AvCoV ist als Krankheitserreger von enormer Bedeutung für die Geflügelindustrie, da eine Infektion bei jungen Küken zu bleibenden Schäden am Ovidukt führen kann und es bei adulten Tieren zu einem drastischen Abfall der Legeleistung mit Eiern, die aufgrund ihrer Qualitätsmängel nicht für den Verkehr geeignet sind (Crinion et al., 1971a, 1971b; Jones and Jordan, 1970; Sevoian and Levine, 1957), kommen kann. Da es trotz vorhandener Impfprogramme immer wieder zu Krankheitsausbrüchen und den damit verbundenen wirtschaftlichen Verlusten kommt, besteht ein großer Bedarf, die Virusinfektion im Ovidukt näher zu untersuchen. Die Untersuchung von AvCoV-Infektionen unter in vitro Bedingungen gestaltet sich schwierig. Die meisten AvCoV-Stämme replizieren nicht in permanenten Zellkuturen. In vorherigen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass sich primäre Zellkultursysteme mit Zellen des Respirationstrakts und des Ovidukts eignen, um Infektionen mit verschiedenen AvCoV-Stämmen auf diesen Zellen zu untersuchen und zu vergleichen (Abd El Rahman et al., 2010; Mork et al., 2014; Winter et al., 2008b). Diese Explantat-Kulturen haben den Vorteil, dass sie die identische Zellzusammensetzung aufweisen, wie im lebenden Organismus. Die Herstellung dieser Kulturen ist jedoch aufwendig und die genaue Zellzahl pro Explantat lässt sich nicht ermitteln. Daher sollte eine Methode zur Zellisolierung etabliert werden, die es erlaubt eine große Anzahl empfänglicher Oviduktzellen zu isolieren, um sie in in vitro Infektionsversuchen einzusetzen. Dieser Ansatz zollt auch dem Tierschutzgedanken in der Grundlagenforschung besonders Rechnung, da bereits aus einem Spendertier eine große Anzahl an Zellen gewonnen werden kann. Die mit dieser Methode gewonnenen Zellen erlauben nun die Untersuchung von Virusinfektionen in Epithelzellen des Ovidukts unter in vitro Bedingungen. Zur Isolierung der Epithelzellen wurde das Ovidukt von adulten Legehennen (28 Wochen alt) im Bereich des Magnums frei präpariert und durch einen Längsschnitt eröffnet und in ca. 1 cm lange Stücke geschnitten. Diese Stücke wurden durch vorsichtiges Schwenken in einem Becherglas mit kaltem PBS gewaschen. Die Vereinzelung der Zellen erfolgte mit Hilfe eines Proteaseverdaus (Protease aus Streptomyces griseus, Type XIV) für 3 Stunden bei 37 ˚C auf einem Schwenker. Die Protease wurde in einer Konzentration von 0,4 mg/ ml EDULB-Medium (steril-filtriert) 65 5. Publikation eingesetzt. Im Anschluss wurden die nun aus dem Zellverband gelösten Epithelzellen bei 400 x g für 10 Minuten bei 4 ˚C pelletiert. Der Überstand wurde nach dem Pelletieren verworfen und das Zellpellet mit 20-30 ml COEC-Medium resuspendiert und durch einen Filter mit 100 µm Porengröße pipettiert. Die gefilterte Zellsuspension wurde nun auf Zellklulturflaschen aufgeteilt und für weitere 2 Stunden bei 37 ˚C inkubiert, um den in der Zellsuspension vorhandenen Fibroblasten die Möglichkeit zu geben, sich abzusetzen. Im Anschluss wurden die sich im Überstand befindlichen Epithelzellen abgenommen und auf Deckgläschen ausgesät. Ca. 48 Stunden nach der Isolierung haben sich “Zellinseln” aus Epithelzellen des Ovidukts auf den Deckgläschen ausgebildet (Abbildung 4). Unter dem Lichtmikroskop wurden die isolierten Oviduktepithelzellen aus Hühnern (COEC) auf ihre Vitalität untersucht, wobei die Deckgläschen, auf denen ein deutlicher Zilienschlag der Zellen zu erkennen war, für eine genauere Charakterisierung der Zellen verwendet wurden. Eine Färbung mit einem anti-ß-Tubulin Antikörper und einem anti-Muc5ac Antikörper wurde zur Detektion von Zilien und Muzinen durchgeführt. Es konnte so gezeigt werden, dass die isolierten COEC aus Muzin-produzierenden Zellen und zilientragenden Zellen bestehen (Abbildung 5) und von Zellen, die ihre Differenzierung verloren hatten und keinen Zilienschlag und keine Muzin Produktion mehr zeigten, umrandet werden (Abbildung 4). Bei diesen Zellen handelt es sich wahrscheinlich um Basalzellen, also Epithelzellen, die sich in einem nicht ausdifferenzierten Zustand befinden. Um auszuschließen, dass es sich bei diesen Zellen um Fibroblasten handelt, wurde eine Färbung mit einem Antikörper gerichtet gegen Vimentin durchgeführt (Daten nicht gezeigt), einem Protein, welches als Markerprotein zur Identifizierung von Fibroblasten dient. Zur weiteren Charakterisierung der Zellen wurden Lektinfärbungen der COEC durchgeführt. Lektine sind in der Lage, Zuckerstrukturen auf Zelloberflächen zu erkennen. Die COEC wurden mit folgenden Lektinen behandelt: Maackia amurensis agglutinin (MAA I und II), um alpha 2,3 gebundene Sialinsäuren, die Rezeptordeterminante des AvCoV nachzuweisen und mit Sambucus nigra agglutinin (SNA), um alpha 2,6 gebundene Sialinsären zu detektieren. Die Färbung mit den genannten Lektinen hat ergeben, dass die COEC Sialinsäuren in beiden genannten Verküpfungsarten 66 5. Publikation exprimieren (Abbildung 6). Die Zellen, die die Epithelzellinseln umgaben und vermutlich ihre Differenzierung verloren hatten, ließen sich nicht mit den genannten Lektinen anfärben. Um die Sensitivität der isolierten Zellen für eine Infektion mit dem AvCoV zu untersuchen, wurden die Zellen wie oben beschrieben isoliert und auf Deckgläschen ausgesät und mit den AvCoV-Stämmen Beaudette, QX und B1648 mit einem Titer von je 1x104 Foci-forming Units (FFU/Ring), jeweils im Doppelansatz in 24-WellPlatten infiziert. Die infizierten COEC wurden anschließend für 1 Stunde bei 37 °C auf dem Schwenker inkubiert. Nach 1 Stunde wurde das virushaltige Medium abgenommen und jede Vertiefung mit 1 ml serumfreien Edulb-Medium aufgefüllt. Nach 12 Stunden, bzw. 24 Stunden wurden die COEC mit 3 % Paraformaldehyd fixiert und bis zur weiteren Analyse bei 4 °C im Kühlschrank gelagert. Die Infektionsversuche mit den AvCoV-Stämmen QX, B1648 und Beaudette haben ergeben, dass die isolierten COEC für alle Stämme empfänglich waren (Abbildung 7). Unterschiede in der Sensitivität der Zellen für die verschiedenen Stämme konnten nicht beobachtet werden. Interessanterweise ließen sich nur die ausdifferenzierten Zellen von den genannten AvCoV-Stämmen infizieren. Die Zellen, die ihre Differenzierung verloren hatten und die Epithelzellinseln umgaben, waren nicht empfänglich für eine Infektion. Abbildung 4 Lichtmikroskopaufnahme isolierter COEC, die sich zu einer „Epithelzellinsel“ formiert haben und von Zellen, die ihre Differenzierung verloren haben, umrandet werden. 67 5. Publikation Abbildung 5 Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme einer Epithelzellinsel. Zilientragende Zellen wurden mit einem anti-ß-Tubulin Antikörper (rot) gefärbt, Muzin produzierende Zellen wurden mit einem anti-Muc5Ac Antikörper gefärbt (grün). Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt 68 5. Publikation Abbildung 6 Charakterisierung isolierter COEC mittels Lektinfärbung (Konfokalmikroskopie). Die isolierten COEC wurden mit Lektinen (A) SNA (Roche), (B) MAA I (Vector Labs), (C) MAA (Roche), (D) MAAII (Vektor Labs), (E) SNA (Vector Labs) inkubiert. Die Zellkerne wurden mit DAPI gefärbt (blau). 69 5. Publikation Abbildung 7 Immunfluoreszenzanalyse infizierter COEC mittels Konfokalmikroskopie. Die isolierten COEC wurden mit den AvCoV-Stämmen (A) QX, (B) B1648, (C) Bd, infiziert. Zur Detektion des Virusantigens wurde ein monoklonaler IBV Antikörper, gerichtet gegen das N-Protein verwendet und mit einem FITCgekoppelten anti-mouse-Fitc Antikörper sichtbar gemacht (grün). Die Zellkerne wurden mit DAPI gefärbt (blau). (D) diente als Negativkontrolle und wurde nur mit dem sekundären anti-mouse-Fitc Antikörper inkubiert. Die Isolierung und Kultivierung von Legedarmepithelzellen unter in vitro- Bedingungen wurde bereits beschrieben (Jung et al., 2011a; Kasperczyk et al., 2012; Muramatsu et al., 1995; Oishi et al., 2011; Sanders and McKnight, 1985). Kasperczyk et al., (2012) haben weitere Versuche zur Optimierung einer OviduktEpithelzellkultur unternommen und festgestellt, dass sich zur Gewinnung der Epithelzellen das Infundibulum am besten eignet. Dies konnte in dieser Arbeit nicht bestätigt werden. Bei den hier isolierten Epithelzellen handelt es sich um Epithelzellen aus dem Magnum des adulten Ovidukts, da sich diese am besten und in ausreichender Menge isolieren ließen und für die hier vorgestellten Zwecke besser 70 5. Publikation geeignet waren als Epithelzellen aus den anderen Segmenten des Ovidukts. Oviduktepithelzellkulturen von anderen Arbeitsgruppen sind bisher noch nicht für Infektionsversuche genutzt worden. Der Vorteil von den hier vorgestellten in vitro Ovidukt-Zellkultursystemen ist, dass die Zellen zumindest teilweise in einem ausdifferenzierten Zustand vorliegen und die Situation in vivo besser wiederspiegeln. Die isolierten COEC weisen die Eigenschaften eines Epithels, bestehend aus zilientragenden Zellen, Muzin-produzierenden Zellen und vermutlich Basalzellen auf. Eine Färbung mit einem Antikörper gegen Vimentin konnte ausschließen, dass es sich bei den undifferenzierten Zellen um Fibroblasten handelt. Eine Bestätigung, dass es sich um Zellen epithelialen Ursprungs handelt, konnte jedoch bis zum Ende der Arbeit nicht erbracht werden. Eine Erklärung dafür, dass sich die Zellen, die sich in einem ausdifferenzierten Zustand befanden mit allen getesteten AvCoV-Stämmen infizieren ließen, die entdifferenzierten Zellen hingegen nicht infizierbar waren, ist, dass die entdifferenzierten Zellen ein verändertes Sialinsäure-Expressionsmuster aufweisen. Die Rezeptordeterminante (alpha-2,3 gebundene Sialinsäuren) kann nicht mehr auf der Oberfläche nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse unterscheiden sich von Infektionsversuchen und Lektinfärbungen mit Orgenexplantaten juveniler Tiere. Infektionsversuche mit den Stämmen QX und B1648 in den Explantaten haben ergeben, dass die Epithelzellen im juvenilen Ovidukt eine unterschiedliche Empfänglichkeit für eine Infektion mit den beiden genannten AvCoV-Stämmen aufweisen (Mork et al., 2014). Während alle Segmente des Ovidukts hochempfänglich für den QX-Stamm waren, konnte nur vereinzelt Infektion im Infundibulum mit dem B1648-Stamm nachgewiesen werden. Es konnte gezeigt werden, dass der unterschiedliche Gewebetropismus von juvenilen COEC für die Stämme QX und B1648 nicht mit den Sialinsäure-Bindungseigenschaften ihrer Spike-Proteine zusammenhängt. Eine genaue Erklärung, warum der B1648-Stamm die isolierten Zellen adulten Ursprungs infizieren kann, nicht aber die Epithelzellen der juvenilen Explantate, kann hier nicht gegeben werden. Es ist denkbar, dass Rezeptoren auf den isolierten Zellen besser zugänglich sind, bzw., dass das Vorhandensein von Muzinen auf dem Epithel der Explantate eine Infektion erschwert. 71 5. Publikation Es ist auch denkbar, dass ein oder mehrere Co-Rezeptoren auf den adulten Zellen exprimiert werden, während sie auf den juvenilen fehlen könnten. Eine genauere Untersuchung steht noch aus. Jung et al., (2011b) haben Zellen des Magnums von juvenilen und adulten Hühnern des Ovidukts hinsichtlich der Bindung von verschiedenen Lektinen untersucht. Bindung des an D-Galaktose bindendenen Peanut Agglutinin (PNA) konnte nur bei den adulten Tieren, nicht aber bei den juvenilen Tieren detektiert werden. Die Unterschiede der Sialinsäure- Expressionsmuster im juvenilen und im adulten Ovidukt könnten durch ein unterschiedliches Glycosilierungsmuster in den verschiedenen Segmenten des juvenilen Ovidukts erklärt werden. In dieser Arbeit befanden sich die isolierten COEC für einen Zeitraum von 96 Stunden in ausdifferenziertem, für AvCoV-Infektionen empfänglichen Zustand. Da für Infektionsversuche eine minimale Lebensdauer der Zellen von 24 Stunden notwendig ist, eignen sich die hier vorgestellten Zellen, um Infektionsversuche mit dem AvCoV durchzuführen. In dieser Studie konnten die isolierten COEC bis zu 15 mal passagiert werden, jedoch hatte dies den Verlust der Differenzierung, dies war schon nach der ersten Passage der Fall, zur Folge. Jung et al. 2011 konnten bei den Epithelzellen adulter Tieren nur sechs Passagen, bei juvenilen Tieren hingegen sogar 25 Passagen durchführen. Diese Zellen wurden aber nicht für Infektionsstudien genutzt. Die Autoren danken Sonja Bernhard und Martina Kaps für die technische Unterstützung. 72 5. Publikation Literatur Manuskript II Aitken, R. N. C. (1971). The oviduct. In: Physiology and biochemistry of the domestic fowl. Bell, D.J., Freeman, B.M. (Eds.) Academic Press, London, pp.1237-1289. Crinion, R.A., Ball, R.A., and Hofstad, M.S. (1971a). Abnormalities in laying chickens following exposure to infectious bronchitis virus at one day old. Avian Dis. 15, 42–48. Crinion, R.A., Ball, R.A., and Hofstad, M.S. (1971b). Pathogenesis of oviduct lesions in immature chickens following exposure to infectious bronchitis virus at one day old. Avian Dis. 15, 32–41. Gerstberger R. und Barth SW. (2004). Reproduktion beim Vogel. In: Physiologie der Haustiere. 2. ed. (von Engelhardt W, Breves G, eds.) Stuttgart: 536-550. (Enke Verlag). Jones, R.C., and Jordan, F.T. (1970). The exposure of day-old chicks to infectious bronchitis and the subsequent development of the oviduct. Vet. Rec. 87, 504–505. Jung, J. G., T. S. Park, J. N. Kim, B. K. Han, S. D. Lee, G. Song, and J. Y. Han. 2011. Characterization and Application of Oviductal Epithelial Cells In Vitro in Gallus domesticus. Biol Reprod. Jung, J. G., W. Lim, T. S. Park, J. N. Kim, B. K. Han, G. Song, and J. Y. Han. 2011. Structural and histological characterization of oviductal magnum and lectin-binding patterns in Gallus domesticus. Reprod Biol Endocrinol 9:62 Kasperczyk, K., Bajek, A., Joachimiak, R., Walasik, K., Marszalek, A., Drewa, T., and Bednarczyk, M. (2012). In vitro optimization of the Gallus domesticus oviduct epithelial cells culture. Theriogenology 77, 1834–1845. 73 5. Publikation Miessen, K., Sharbati, S., Einspanier, R., and Schoen, J. (2011). Modelling the porcine oviduct epithelium: A polarized in vitro system suitable for long-term cultivation. Theriogenology 76, 900–910. Mork, A.-K., Hesse, M., Abd El Rahman, S., Rautenschlein, S., Herrler, G., and Winter, C. (2014). Differences in the tissue tropism to chicken oviduct epithelial cells between avian coronavirus IBV strains QX and B1648 are not related to the sialic acid binding properties of their spike proteins. Vet. Res. 45, 67. Muramatsu, T., Hiramatsu, H., and Okumura, J. (1995). Induction of ovalbumin mRNA by ascorbic acid in primary cultures of tubular gland cells of the chicken oviduct. Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 112, 209–216. Oishi, I., Kim, S., Yoshii, K., Esteban, C.R., and Izpisua Belmonte, J.C. (2011). CreLoxP-regulated expression of monoclonal antibodies driven by an ovalbumin promoter in primary oviduct cells. BMC Biotechnol. 11, 5. Sanders, M.M., and McKnight, G.S. (1985). Chicken egg white genes: multihormonal regulation in a primary cell culture system. Endocrinology 116, 398–405. Sevoian, M. and Levine, P.P. (1957). Effects of infectious bronchitis virus on the repro ductive tracts, egg production and egg quality of laying chickens. Avian Dis. 1: 136-164. 74 6. Diskussion 6. Diskussion 6.1. Bewertung der Etablierung von primären HühneroviduktZellkultursystemen Die Untersuchung von AvCoV-Infektionen unter in vitro Bedingungen gestaltet sich schwierig. Die meisten AvCoV-Stämme können nur primäre Zellkulturen aviären Ursprungs infizieren. Für das Ovidukt gibt es keine kommerziell erhältlichen Zellkulturen, daher wurden in dieser Arbeit zwei primäre Organ-, bzw. Zellkultursysteme mit Epithelzellen des Ovidukts etabliert und mit ihrer Hilfe die Epithelzellen des Ovidukts von Hühnern charakterisiert und hinsichtlich ihrer Empfänglichkeit für eine Infektion durch die aviären Coronavirusstämme QX, B1648 und Beaudette untersucht. In vorherigen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass sich primäre Zellkultursysteme mit Zellen des Respirationstrakts eignen, um Infektionen mit verschiedenen AvCoVStämmen auf diesen Zellen zu untersuchen und zu vergleichen (Abd El Rahman et al., 2010; Winter et al., 2008b). Zwar wurden bereits von anderen Arbeitsgruppen Organkulturen vom HühnerOvidukt hergestellt und diese Kulturen wurden auch bereits für Infektionsversuche mit AvCoV-Stämmen genutzt (Benyeda et al., 2009; Chousalkar und Roberts, 2007; Chousalkar et al., 2009; Darbyshire et al., 1978; Pradhan et al., 1983; Raj und Jones, 1997). Es kamen hier aber immer Zellen adulter Tiere, oder künstlich durch Hormonbehandlungen gereifte Zellen zum Einsatz. Juvenile Zellen, wie sie in den hier vorgstellten Explantaten enthalten waren, wurden bisher noch nicht für Infektionsversuche verwendet. Da ein wichtiges Problem bei der Infektion mit dem AvCoV die Entstehung von sogenannten falschen Legern bei der Infektion juveniler Tiere darstellt, stellt der hier vorgestellte Ansatz ein deutlich geeigneteres System dar. Die Isolierung und Aussaat von vereinzelten Epithelzellen aus dem Ovidukt stellte sich hingegen als zu ineffizient bei juvenilen Tieren dar. In diesem Fall wurde zur Isolierung der Epithelzellen, das Ovidukt adulter Tiere verwendet, da sich die Zellen ausschließlich im adulten Ovidukt in ausreichender Menge isolieren ließen. Die Isolierung der COEC aus juvenilen Tieren hätte einen nicht zu rechtfertigen enorm hohen Tierverbrauch bedeutet. Die so isolierten Zellen 75 6. Diskussion waren in vitro kultivierbar und ließen sich über 15 Passagen in Kultur halten bevor sie seneszent wurden. Doch ging mit der Passage auch ein Verlust der Differenzierung, also der Verlust wichtiger Eigenschaften, wie z.B. Zilienschlag und Muzin-Produktion einher. Auch der Verlust der Sensitivität für eine AvCoV-Infektion war damit verbunden. Dennoch konnten die Zellen für erste Infektionsversuche genutzt werden, da die Zellen für mindenstens 96 Stunden im ausdifferenzierten Zustand verblieben. Das ist genug Zeit für eine AvCoV-Infektion. Da die gewonnenen Zellpopulationen auch Zellen ohne jede Differenzierung enthielten, war eine Aussaat als Filterkulturen mit geschlossenem Epithel, welches durch sogennante Tight Junctions zwischen den Zellen gekennzeichnet ist, nicht möglich. Die undifferenzierten Zellen verhinderten die Bildung eines polaren Epithels. Auch auf Deckgläschen konnten immer nur Teilbereiche mit ausdifferenziertem Epithel erreicht werden. Dadurch konnten wichtige geplante Infektionsversuche, z.B. zum Viruseintritt in polare Epithelzellen nicht durchgeführt werden. Dennoch stellen die hier in dieser Arbeit etablierten Zellkulturen, die Explantate und die isolierten Zellen, hilfreiche Zellsysteme dar, um das AvCoV in vitro zu untersuchen. Einen vollständigen Ersatz zu Infektionsstudien in vivo stellen sie aber nicht dar. Dafür ist das Infektionsgeschehen im Huhn zu komplex, um es in diesen in vitroZellkutursystemen umfänglich widerspiegeln zu können. So kann z. B. der Einfluss der Immunantwort des infizierten Tieres nicht in Betracht gezogen werden. 6.2. Bedeutung der Sialinsäureexpression im Ovidukt für eine AvCoVInfektion Die Bedeutung von Sialinsäuren als Rezeptordeterminante für eine Infektion mit den Stämmen Beaudette, M41 und B1648 wurde für Zellen des Trachealepithels beschrieben (Winter et al., 2008b). Um die Bedeutung der Sialinsäureexpression im Ovidukt für eine AvCoV-Infektion zu untersuchen, wurden Oviduktepithelzellen mittels Lektinfärbung auf die Expression von alpha 2,3-gebundene Sialinsäuren, der Rezeptordeterminante des AvCoV (Abd El Rahman et al., 2009; Winter et al., 2006), und die Expression von alpha 2,6- 76 6. Diskussion gebundene Sialinsäuren, untersucht. Im juvenilen Ovidukt konnten Unterschiede im Glycosilierungsmuster der Epithelzellen in den verschiedenen Segmenten des Ovidukts gezeigt werden. Eine unterschiedliche Bindung der hier eingesetzten Lektine in den einzelnen Ovidukt-Bereichen macht dies deutlich. Es zeigte sich jedoch, dass die unterschiedliche Expression von Sialinsäuren entlang des Ovidukts nicht zu einer variablen Sensitivität für AvCoV-Infektionen führt. Verheije und Kollegen beschreiben ein ähnliches Bindungsverhalten mit dem Lektin MAAI und löslichem AvCoV S-Protein. Dies könnte darauf hindeuten, das MAAI und das AvCoV an ähnliche Glykane binden. Ein übereinstimmendes Bindungsverhalten von AvCoV Spike-Proteinen und MAAI konnte in dieser Arbeit jedoch nicht bestätigt werden. So war eine Bindung des Lektins MAAI auf die Segmente Magnum und Uterus beschränkt. Infektionen mit den Stämmen QX und Beaudette waren aber in allen Segmenten zu finden. Auch Bindungstests mit löslichen Spike-Proteinen der Stämme QX, Beaudette und B1648 zeigten in allen Segmenten eine Bindung. Das Lektin MAAII hingegen, zeigte in dieser Arbeit ein vergleichbares Bindungsverhalten wie die löslichen Spike-Proteine. Bei der Deutung dieser Ergebnisse muss jedoch bedacht werden, dass Glycan-Array-Analysen ergeben haben, dass die hier verwendeten Lektine ein sehr viel breiteres Bindungsspektrum aufweisen als z.B. das Spike Protein vom M41 Stamm (Wickramasinghe et al., 2011). Glycan-Array-Analysen von den hier verwendeten löslichen Spike-Proteinen haben keine Ergebnisse gebracht. Es scheint, dass die AvCoV Spike-Proteine eine Affinität für sehr spezifische Glykane auf Hühnerzellen besitzen. Dass die Bindung der Spike-Proteine und damit auch die Infektion der Viren im Ovidukt sialinsäureabhängig ist, konnte in dieser Arbeit aber klar gezeigt werden. Eine Abspaltung der Rezeptordeterminante führt zu einer deutlichen Reduktion einer Infektion in den Epithelzellen des Ovidukts. Die Bindung der löslichen S1-Proteine ist zwar deutlich reduziert, aber nicht vollständig blockiert. Dies kann mehrere Gründe haben. Da die Kryoschnitte der verschiedenen Oviduktsegmente eine Dicke von 10 µm haben und das Lumen des Ovidukts Schleimhautfalten aufweist (König et al., 2009), ist es sehr wahrscheinlich, dass die Neuraminidase nicht in alle Bereiche des Oberflächenepithels vorgedrungen ist und somit nicht alle Sialinsäuren abgespalten 77 6. Diskussion hat. Des Weiteren könnte ein noch nicht identifizierter Co-Rezeptor, den das AvCoV zusätzlich nutzen könnte, vorhanden sein. Abschließend lässt sich mit den Ergebnissen feststellen, dass alpha 2,3-gebundene Sialinsäuren auf den Zellen des Ovidukts als Rezeptordeterminante für die untersuchten AvCoV Stämme fungieren. 6.3. Bedeutung der S-Protein-Bindung für den Gewebetropismus des AvCoV Die Bindung an die Wirtszelle ist der erste wichtige Schritt einer Virusinfektion. Für Coronaviren wird die Bindung durch das S-Protein vermittelt. Es ist allgemein anerkannt, dass die Bindung eines Virus an die Wirtszellen ein sehr wichtiger Faktor für den Spezies- und auch den Gewebstropismus darstellt. Nur wenn ein Rezeptormolekül exprimiert wird, kann ein Virus binden und nachfolgend eine Infektion einleiten. Dennoch ist eine Bindung nicht in allen Fällen ausreichend, um den Tropismus von Viren zu erklären. Ein wichtiges Merkmal beim AvCov ist das Auftreten von vielen unterschiedlichen Virusstämmen. Diese unterscheiden sich zum Teil sehr stark in der Aminosäuresequenz ihrer Spike-Proteine. Auch zeigen die Stämme Unterschiede in ihrer Eigenschaft, sich auf verschiedene Organsysteme im Huhn auszubreiten. Um herauszufinden, ob die große Variabilität in der S1-Sequenz der verschiedenen AvCoV-Stämme mit den verschiedenen Bindungseigenschaften der S-Proteine zusammenhängt und dadurch der unterschiedliche Gewebetropismus der AvCoVStämme erklärt werden kann, wurde die Bindung der S1-Proteine der AvCoVStämme QX und B1648 auf COEC verglichen. Zu diesem Zweck wurden Bindungstests mit löslichen S1-Proteinen der beiden Stämme durchgeführt (siehe Manuskript I). Viruspartikel beider Stämme konnten ebenfalls an die Epithelzellen des Ovidukts binden, somit spiegeln die getesteten löslichen S1-Proteine die Bindung der Viruspartikel wider. Die löslichen S1-Proteine sowohl des pathogenen QX-Stammes, als auch des nephropathogenen B1648-Stammes konnten in allen Segmenten des Ovidukts binden. Da nach einer Infektion des Ovidukts im Falle von B1648 nur wenig Virusantigen im Infundibulum, nicht aber in den anderen Segmenten des Ovidukts detektiert werden konnte, kann die Bindung nicht der 78 6. Diskussion limitierende Faktor sein, der eine Infektion des Ovidukts mit dem Stamm B1648 verhindert. Der unterschiedliche Gewebetropismus der AvCoV-Stämme QX und B1648 im Ovidukt des Huhnes scheint nicht mit der Bindungseigenschaft des S-Proteins an Sialinsäuren, der Rezeptordeterminante des AvCoV auf der Zelloberfläche zusammen-zu-hängen und muss daher einen anderen Grund haben. Es könnte sein, dass die Bindung an ein bisher unbekanntes Rezeptormolekül oder an einen CoRezeptor durch den QX-Stamm vermittelt wird und ein Eintritt in die Zelle mit der Bindung an diesen ermöglicht wird, nicht aber für den B1648-Stamm. Die Bindung an Sialinsäuren wäre demnach nur die erste Interaktion des Viruspartikels mit der Zelle. Als möglicher Co-Rezeptor für das AvCoV kommen z. B. Glycolipide in Frage. Für das Sendai Virus wurden Glycolipide, speziell Ganglioside als Rezeptordeterminanten beschrieben (Hansson et al., 1984; Markwell et al., 1981). Auch für andere Viren wurde beschrieben, dass sie über verschiedenartige Rezeptormoleküle oder Rezeptordeterminanten an ihre Wirtszellen binden können. Für das Herpes-Simplex Virus wurde z. B. beschrieben, dass dieses, bevor es an die spezifischen Oberflächenproteine bindet, erst an Heparansulfat-Ketten auf Proteoglykanen bindet (Spear, 2004). Die Bindung der löslichen S1-Konstrukte könnte auch abhängig von der Konformation des jeweiligen Konstruktes sein und damit abhängig von einer korrekten Faltung des S-Proteins oder dem Vorhandensein der S2-Untereinheit. Es wurde gezeigt, dass die Anwesenheit der S2-Untereinheit in löslichen Spike-Konstrukten die Bindung an Zellen noch verbessern kann (Promkuntod et al., 2013). Bindungstests mit intakten Viruspartikeln konnten jedoch ausschließen, dass die in dieser Arbeit gezeigte Bindung der löslichen SpikeProteine nicht die Bindung der Spike-Proteine im Virus wiedergibt. Die Viruspartikel beider Stämme konnten ebenfalls an die Epithelzellen des Ovidukts binden. Auch ein der Bindung nachgeschalteter Schritt der viralen Replikation, z. B. die Fusion zwischen viraler und zellulärer Membran und der damit verbundene Viruseintritt in die Zelle könnte von den S-Proteinen der verschiedenen Stämme mit einer unterschiedlichen Effizienz vermittelt werden. Auch wirtseigene Proteasen, die zu einer Spaltung und Aktivierung des S-Proteins führen, könnten für den Organ- 79 6. Diskussion Tropismus verschiedener AvCoV-Stämme von Bedeutung sein, da die verschiedenen Stämme sehr stark in ihrer Aminosäuresequenz variieren und somit unterschiedlich sensibel für wirtseigene Proteasen sein könnten. Für Influenzaviren ist bekannt, dass H5 und H7 Subtypen einen deutlich erweiterten Gewebstropismus zeigen, wenn sie eine multibasische Spaltstelle zur proteolytischen Aktivierung ihres Hämagglutinins enthalten. Diese Viren können durch Furin aktiviert werden und sind damit in allen Organen infektiös, während Subtypen mit einer monobasischen Spaltstelle in ihrer Repliaktion auf den Respirationstrakt und den Verdauungstrakt beschränkt sind (Belser and Tumpey, 2013; Böttcher-Friebertshäuser et al., 2014; Suguitan et al., 2012; Zhang et al., 2012). Die in dieser Arbeit etablierten primären Organ- und Zellkultursysteme des Ovidukts haben sich als nützliche Werkzeuge zur Untersuchung von Infektionen mit dem AvCoV dargestellt. In weiteren Versuchen müssen die Mechanismen, die eine erfolgreiche Infektion der Epithelzellen des Ovidukts erlauben, weiter charakterisiert werden. 80 7. Literaturverzeichnis 7. Literaturverzeichnis Adams, M.J., and Carstens, E.B. (2012). 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Eine Infektion mit dem AvCoV äußert sich vor allem durch Schädigungen im Respirationstrakt, in den Nieren und im Legeapparat. Obwohl es wirksame Impfstrategien gibt, spielen Infektionen mit dem Aviären Coronavirus in den Geflügelbeständen nach wie vor eine große Rolle, da das Vorkommen von neuen Virusvarianten und die nicht vorhandene Kreuzprotektivität der vorhandenen Impfstoffe, einen vollständigen Schutz gegen das Virus schwierig macht. Der Grund für den unterschiedlichen Organ-Tropismus verschiedener AvCoVStämme ist noch nicht genau bekannt. In dieser Arbeit wurde die Expression von Sialinsäuren in den verschiedenen Segmenten des Ovidukts mit der Empfänglichkeit der Epithelzellen des Ovidukts für eine Infektion mit den AvCoV-Stämmen QX, B1648 und Beaudette verglichen. Dazu wurden ein Ovidukt-Organkultursystem mit dem Ovidukt juveniler Tiere und ein primäres Zellkultursystem mit isolierten chicken oviduct epithelial cells (COEC) adulter Tiere, etabliert. Eine Färbung der Epithelzellen des Ovidukts mit dem Lektin von Maackia amurensis agglutinin II (MAAII) zum Nachweis alpha 2,3-gebundener Sialinsäuren und mit dem Lektin von Sambucus nigra agglutinin (SNA), zum Nachweis alpha 2,6-gebundener Sialinsäuren ergab, dass beide Verknüpfungsarten entlang des Ovidukts exprimiert werden, alpha 2,3gebundene Sialinsäuren aber auf den Zielzellen vorherrschen. Die Infektion der unterschiedlichen Segmente des Ovidukts hat ergeben, dass der AvCoV-Stamm QX alle Segmente des Ovidukts effizient infizieren kann. Dementgegen konnte nur vereinzelt Virusantigen im Infundibulum mit dem nephropathogenen Stamm B1648 nachgewiesen werden. Durch die Bindung des viralen Spike-Proteins an einen Rezeptor auf der Zelloberfläche wird der Viruseintritt in Wirtszellen vermittelt. Für das AvCoV sind alpha 2,3-gebundene Sialinsäuren 96 als Rezeptordeterminante 8. Zusammenfassung beschrieben worden. Um zu untersuchen, ob der unterschiedliche Gewebetropismus der AvCoV-Stämme mit unterschiedlichen Bindungseigenschaften der S-Proteine erklärt werden kann, wurden Bindungsversuche mit löslichen S1-Proteinen der AvCoV-Stämme QX und B1648 auf COEC durchgeführt. Die löslichen S1-Proteine sowohl des pathogenen QX-Stammes, als auch des nephropathogenen B1648Stammes konnten in allen Segmenten des Ovidukts binden. Das Entfernen der Sialinsäuren von der Zelloberfläche durch die Behandlung der Zielzellen mit dem Enzym Neuraminidase führte dazu, dass sowohl der QX-Stamm, als auch der B1648-Stamm in ihrer Infektion und auch in der Bindung ihrer löslichen S1-Protein deutlich beeinträchtigt waren. Diese Ergebnisse zeigen, dass Sialinsäuren eine wichtige Rolle für die Infektion und die Bindung der löslichen Spike-Proteine der untersuchten AvCoV-Stämme spielen. Dennoch kann der unterschiedliche GewebeTropismus der beiden Stämme nicht mit den Sialinsäurebindungseigenschaften ihrer Spike-Proteine erklärt werden. In dieser Arbeit wurden zwei Kultursysteme mit enddifferenzierten Epithelzellen, ein Ovidukt-Organkulturen-System und ein Zellkultursystem mit primären, isolierten COEC, etabliert, die sich bei künftigen Arbeiten als interessante Hilfsmittel erweisen können, um die Infektion des Ovidukts durch das AvCoV genauer zu untersuchen. 97 9. Summary 9. Summary Ann-Kathrin Mork (2015) Comparative Analysis of differtent avian coronavirus strains in primary chicken oviduct cell culture systems The avian coronavirus (AvCoV) is a major poultry pathogen. The economic importance of the disease for layer flocks is tremendous, because the virus does not only replicate in the epithelium of the respiratory tract or the kidneys, some strains can also lead to pathological alterations in the oviduct. Reasons for differences in the tissue tropism and pathogenicity between different AvCoV strains, are still an open question. A characteristic feature of AvCoV is the occurrence of many different strains belonging to different serotypes, which makes a complete control of the disease by vaccinations a challenging task. In this study, the expression of sialic acids in the different segments of the oviduct was investigated. It was analyzed, if there are differences in the susceptibility of the epithelial cells of the Infundibulum, Isthmus, Magnum, and Uterus parts of the oviduct to an infection with the AvCoV strains QX, B1648 and Beaudette. For this purpose, two primary chicken culture systems, an oviduct-organ culture system of the juvenile oviduct and a primary cell culture system of isolated chicken oviduct epithelial cells (COEC) of adult animals were established. Lectin staining of the sensitive cells in the different segments of the oviduct with the lectin maackia amurensis agglutinin II (MAAII), to detect alpha 2,3-linked sialic acids and with the lectin sambucus nigra agglutinin SNA to detect alpha 2,6-linked sialic acids showed that both linkage types of sialic acids are expressed on the target cells, but alpha 2,3-linked sialic acids were abundantly expressed. Infection of the epithelial cells of the oviduct showed a high susceptibility to infection by the QX strain and were almost resistant to infection by the nephropathogenic B1648 strain. As the viral entry into host cells is mediated by binding of the viral S protein to a receptor on the cell surface, and alpha 2,3-linked sialic acids have been shown to serve as a receptor determinant for AvCoV, it was 99 9. Summary investigated, if the different tissue tropism of the analyzed strains can be explained with the different binding properties of their spike proteins. Binding tests with isolated primary oviduct epithelial cells and soluble S1 proteins revealed that S1 proteins of two IBV strains bound with the same efficiency to oviduct epithelial cells. A treatment of the cells with the enzyme neuraminidase to remove sialic acids from the surface of the target cells, affected the infection and the binding of the analyzed AvCoV strains. This attachment was sialic acid dependent, indicating that the sugar binding property of AvCoV spike proteins is not the limiting factor for differences in infection efficiency for the oviduct of the corresponding viruses. In this study, two culture systems for well-differentiated epithelial cells were established, an oviduct organ culture system and a primary cell culture system of isolated COEC. Both systems can be valuable tools in the future to analyse the AvCoV infection of the chicken oviduct in more detail. 100 10.Anhang 10. Anhang Tabelle 40 Zusammenfassung der Lektinbindung auf Organexplantaten des adulten Ovidukts SNA MAA I MAA II Infundibulum ++ + +++ Magnum ++ ++ ++ Istmus ++ + ++ Uterus +++ +++ +++ Bindungsintensität: - keine Bindung, + schwache Bindung, ++ mittelstarke Bindung, +++ starke Bindung Magnum Isthmus Uterus IBV Bd Infundibulum Abbildung 8 Immunfluoreszenzanalyse infizierter Kryoschnitte. Die verschiedenen Segmente des Ovidukts Infundibulum, Magnum, Isthmus und Uterus wurden mit den AvCoV-Stamm Beaudette infiziert. Zur Detektion des Virusantigens wurde ein monoklonaler IBV Antikörper, gerichtet gegen das N-Protein verwendet und mit einem FITC-gekoppelten anti-mouse-FITC Antikörper sichtbar gemacht (grün). Die Zellkerne wurden mit DAPI gefärbt (blau). 101 11. Danksagung 11. Danksagung Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Georg Herrler und Frau Christine Winter, Ph.D. für die Überlassung dieses interessanten Themas meiner Arbeit, für die hervorragende Betreuung und die vielen Anregungen und fachlichen Diskussionen während der Durchführung dieser Arbeit. Frau Prof. Dr. Silke Rautenschlein, Ph.D. aus der Geflügelklinik danke ich herzlich für die Bereitstellung ihrer Labore für die Inkubation von Bruteiern. Sandra Hartmann danke ich ganz besonders für die tolle Zusammenarbeit in der Geflügelklinik bei der Organentnahme und anschließend ersten Zellisolierungsversuchen. Frau Sonja Bernard danke ich für ihre freundliche Unterstützung in der Sektionshalle der Klinik für Geflügel. Ich danke allen Mitgliedern und ehemaligen Mitgliedern des Instituts für Virologie für die schöne Arbeitsatmosphäre und die Hilfsbereitschaft, insbesondere Anne, Anna T., Anna R., Fandan, Holger, Günter, Jana, Katarina, Mareike, Markus, Martina H., Martina K., Moni, Nadine, Nai-Hui, Sabine, Sandra B., Sandra G., Tim, Trust, Wei. Ganz besonders bedanke ich mich bei meinen Eltern, die mich immer voll unterstützen und mir diese Ausbildung ermöglicht haben. Zu guter Letzt möchte ich meinem Fels in der Brandung, Aiko für seine unermüdliche Geduld, Unterstützung und Liebe danken! 102
