GB VIRUS-C

Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie-1 und Hygiene
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Abteilung Virologie
EINFLUSS DER KOINFEKTION MIT DEM
GB-VIRUS-C
AUF DEN KRANKHEITSVERLAUF BEI
HIV-INFIZIERTEN PATIENTEN
Dissertation
zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der
Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
Juli 2006
von
Kati Franziska Spindler
Dekan:
Prof. Dr. Christoph Peters
Erstgutachter:
PD Dr. Josef Schneider
Zweitgutachter:
PD Dr. Ulrich Walker
Jahr der Promotion:
2006
Inhaltsverzeichnis
1. Inhaltsverzeichnis
1. Inhaltsverzeichnis...............................................................................1
2. Einleitung............................................................................................4
2.1. Das GB-Virus-C......................................................................................5
2.1.1.
2.1.2.
2.1.3.
2.1.4.
2.1.5.
Entdeckung................................................................................................5
Taxonomie..................................................................................................5
Epidemiologie und Infektionswege............................................................7
Aufbau des GBV-C.....................................................................................8
Genom.......................................................................................................8
2.2. Die HIV-Infektion ..................................................................................10
2.2.1. Entdeckung .............................................................................................10
2.2.2. Epidemiologie und Übertragungswege....................................................10
2.2.3. Aufbau des HIV-Partikels ........................................................................13
2.2.4. Replikationszyklus des HIV......................................................................14
2.2.5. Genetische Struktur des HIV...................................................................15
2.2.6. Pathogenese............................................................................................17
2.2.6.1. Natürlicher Verlauf der Infektion........................................................17
2.2.7. Die Immunantwort gegen das HIV...........................................................20
2.2.7.1. Zelluläre Abwehrmechanismen.........................................................20
2.2.7.2. Humorale Abwehrmechanismen.......................................................21
2.2.8. Klinik der HIV-Infektion ............................................................................22
2.2.9. Klassifikation der HIV-Erkrankung...........................................................23
2.2.10. Nachweis der HIV-Infektion....................................................................23
2.2.11. Quantifizierung der HIV-Virämie.............................................................24
2.2.12. Antiretrovirale Therapie .........................................................................24
2.2.12.1. Inhibitoren viraler Enzyme...............................................................24
2.2.12.2. Entry-Inhibitoren..............................................................................27
2.2.13. Alternative Therapieansätze..................................................................28
2.2.13.1. Immuntherapien..............................................................................28
2.2.13.2. Prophylaktische Vakzinierung..........................................................28
2.2.13.3. Therapeutische Vakzinierung..........................................................28
2.3. Wechselwirkungen zwischen GBV-C und HIV......................................29
2.3.1. Positiver Einfluss der Koinfektion.............................................................30
2.3.2. Negativer oder neutraler Effekt der Koinfektion.......................................31
2.3.3. Einfluss auf den Therapieerfolg...............................................................32
1
Inhaltsverzeichnis
3. Fragestellung....................................................................................34
4. Material und Methoden.....................................................................38
4.1. Patientendaten......................................................................................38
4.2. Laboranalysen......................................................................................39
4.2.1. RNA-Extraktion........................................................................................39
4.2.2. Prinzip der LightCycler-PCR....................................................................40
4.2.3. Quantifizierung der GBV-C-RNA..............................................................43
4.2.4. Durchführung der LightCycler-PCR.........................................................44
4.2.4.1. Beschreibung des Hannoveraner Tests.............................................44
4.2.4.2. Beschreibung des Freiburger Tests...................................................45
4.2.5. Nested-RT-PCR.......................................................................................46
4.2.5.1. Durchführung der Nested-RT-PCR....................................................47
4.2.5.1. Agarose-Gelelektrophorese zum Nachweis des Amplimers..............49
4.3. Statistische Analysen............................................................................50
5. ERGEBNISSE....................................................................................52
5.1. Ergebnisse der Laboranalysen ............................................................52
5.1.1. Hannoveraner Assay ...............................................................................52
5.1.2. Freiburger Assay .....................................................................................52
5.1.3. Nested-PCR.............................................................................................53
5.1.4. Sensitivität und Spezifität der LightCycler-Assays ..................................54
5.1.4.1. Sensitivität und Spezifität des Hannoveraner Assays.......................54
5.1.4.2. Sensitivität und Spezifität des Freiburger Assays..............................55
5.1.5. Quantifizierung der GBV-C-RNA..............................................................55
5.1.5.1. Hannoveraner Assay.........................................................................55
5.1.5.2. Freiburger Assay...............................................................................55
5.1.5.3. Vergleich der Anzahl der RNA-Kopien..............................................55
5.2. Charakterisierung der Gesamt-Kohorte................................................56
5.2.1. Grundcharakteristika ...............................................................................56
5.2.2. WHO-Stadien...........................................................................................56
5.2.3. Hochaktive antiretrovirale Therapie.........................................................57
5.3. Vergleich GBV-C-positiver und GBV-C-negativer Patienten.................58
5.3.1. Grundcharakteristika................................................................................58
5.3.2. Klinischer Verlauf der HIV-Infektion.........................................................61
5.3.2.1. WHO-Stadium...................................................................................61
5.3.2.2. Langzeitüberleben.............................................................................61
5.3.2.3. Progression zu symptomatischen Krankheitsstadien........................62
5.3.3. Vergleich der HIV-spezifischen Laborwerte.............................................65
5.3.3.1. CD4-Stadien nach WHO ..................................................................65
5.3.3.2. Progression zu CD4-Stadium 2 und 3...............................................65
5.3.3.3. Mittlere CD4-Zellzahl.........................................................................67
5.3.3.4. CD4-Zellzahl bei therapienaiven Patienten.......................................67
5.3.3.5. Mittlere HIV-Last................................................................................67
5.3.3.6. HIV-Last vor HAART.........................................................................67
2
Inhaltsverzeichnis
5.3.4. Einfluss der GBV-C-Infektion auf die Therapie........................................68
5.3.4.1. Therapieregime ................................................................................68
5.3.4.2. Therapieerfolg ..................................................................................70
6. Diskussion.........................................................................................72
6.1. Ergebnisse der GBV-C-Tests................................................................72
6.2. Einfluss des GBV-C auf den Krankheitsverlauf HIV-Infizierter .............73
6.2.1. Grundcharakteristika der Freiburger Kohorte ..........................................73
6.2.1.1. Häufigkeit der persistierenden GBV-C-Virämie.................................74
6.2.1.2. Dauer der HIV-Infektion.....................................................................74
6.2.1.3. Beobachtungszeit der Kohorte..........................................................75
6.2.1.4. Einfluss von Alter und Geschlecht auf das Ergebnis.........................75
6.2.1.5. Infektionsmodi...................................................................................76
6.2.1.6. Therapieerfahrung der Kohorte.........................................................77
6.2.2. Vergleich GBV-C-positiver und GBV-C-negativer Patienten....................78
6.2.2.1. Klinischer Verlauf ..............................................................................78
6.2.2.2. HIV-spezifische Laborwerte...............................................................82
6.2.2.3. Einfluss der Ko-Infektion auf die Therapie.........................................84
6.2.3. Mögliche Mechanismen der Interaktion von HIV und GBV-C..................85
7. Zusammenfassung...........................................................................90
8. Anhang...............................................................................................91
8.1. Literaturverzeichnis...............................................................................91
8.2. Abbildungsverzeichnis........................................................................101
8.3. Tabellenverzeichnis.............................................................................103
8.4. Abkürzungsverzeichnis.......................................................................104
Lebenslauf
Danksagung
3
Einleitung
2. Einleitung
Seit der Entdeckung des Immunschwächevirus HIV zu Beginn der achtziger Jahre,
wurden die Mechanismen erforscht, welche nach jahrelanger Latenz des Virus im
menschlichen Organismus zu dem tödlich verlaufenden Immunschwächesyndrom
AIDS führen. Dennoch ist es bis zum heutigen Zeitpunkt, trotz bedeutender
therapeutischer Fortschritte und einer deutlichen Prognoseverbesserung für HIVInfizierte, nicht gelungen, das Virus dauerhaft zu kontrollieren und seine Verbreitung
einzudämmen.
Die Tatsache, dass die HIV-Infektion individuell sehr unterschiedlich verläuft, stellt
einen wichtigen Ausgangspunkt für die Erforschung der komplexen Interaktionen des
Virus mit dem menschlichen Immunsystem dar. Die durchschnittliche Latenzzeit, also
die Zeit von der Infektion bis zur Ausbildung eines manifesten Immundefekts, beträgt
bei HIV-Infizierten ca. 8-10 Jahre. Viele Patienten entwickeln jedoch schon nach
einer deutlich geringeren Zeitspanne das Vollbild der Erkrankung, während andere
noch
10-20
Jahre
nach
Infektion
keine
Symptome
einer
geschwächten
Immunabwehr zeigen. Es besteht berechtigte Hoffnung, dass das Verständnis der
Ursachen dieser Unterschiede für die Therapie und Prophylaxe der HIV-Infektion
nutzbar gemacht werden kann. In den vergangenen zwei Jahrzehnten wurden
bereits eine Reihe von Faktoren identifiziert, welche die Krankheitsprogression
beeinflussen. Dazu gehören, neben genetischen Eigenschaften der Infizierten, auch
Koinfektionen mit anderen Erregern, insbesondere mit Viren.
So konnte in verschiedenen Untersuchungen gezeigt werden, dass HIV-Patienten,
welche zusätzlich HBV- bzw. HCV-Antigen-positiv waren, eine schlechtere Prognose
haben als HIV-Patienten ohne den Nachweis einer Virushepatitis [Ockenga et al.,
1997] [Piroth et al.]. Die Vermutung, dass die negativen Effekte zweier pathogener
Viren sich gegenseitig verstärken, war nicht überraschend. Interessanterweise fand
sich jedoch in verschiedenen klinischen Studien bei HIV-Infizierten ein günstigerer
Krankheitsverlauf, wenn diese Patienten gleichzeitig mit dem GB-Virus-C, einem erst
Mitte der neunziger Jahre entdeckten, nicht pathogenen Flavivirus, infiziert waren.
4
Einleitung
Die Frage nach den Mechanismen, die zu einem verlängerten Überleben von
HIV/GBV-C-Koinfizierten
führen,
wurden
mit
diesen
Untersuchungen
nicht
beantwortet. Auch kamen nicht alle, nachfolgend zu diesem Thema publizierten,
Studien zu dem Ergebnis, dass sich die Infektion mit dem GBV-C positiv für HIVInfizierte auswirkt. Der fragliche Vorteil einer GBV-C-Koinfektion muss also weiter
evaluiert werden. Zu diesem Zweck untersuchten wir den GBV-C-Status in einer
Kohorte Freiburger HIV-Patienten, und verglichen GBV-C-positive mit GBV-Cnegativen Patienten bezüglich ihres Krankheitsverlaufes. Der Präsentation dieser
Studie und ihrer Ergebnisse sei zunächst eine Einführung zu den beiden Viren GBVC und HIV vorangestellt.
2.1. Das GB-Virus-C
2.1.1. Entdeckung
Auf der Suche nach Erregern von kryptogenen Hepatitiden wurden 1995 und 1996
zwei Varianten eines Virus entdeckt, welche als HGV bzw. GBV-C bezeichnet
wurden. HGV steht für Hepatitis-G-Virus; GBV-C wurde nach den Initialen eines
Patienten mit Non-A-Non-B-Hepatitis benannt [Simons, 1995] [Linnen, 1996].
Spätere Studien zeigten, dass es sich dabei um zwei Isolate des gleichen Virus
handelt [Alter, 1996]. Die anfängliche Vermutung, das neuentdeckte Virus würde eine
Hepatitis auslösen, konnte durch klinische Studien allerdings nicht bestätigt werden
[Stark, 1999] [Rambusch, 1998]. Da das Virus nach heutigem Kenntnisstand als nicht
pathogen angesehen wird, die Bezeichnung Hepatitis-G-Virus also unzutreffend ist,
wird es im Folgenden als GB-Virus-C (GBV-C) bezeichnet. Simmonds et al. gelang
1998 die Isolierung zweier eng mit dem GBV-C verwandter Viren aus den Seren von
Affen. Diese Viren wurden als GBV-A und GBV-B (auch GBV-C-CPZ) bezeichnet
[Simmonds, 2001].
2.1.2. Taxonomie
Aufgrund ihres Genomaufbaus gehören die GB-Viren der Familie der Flaviviridae an,
welche auf der Ebene des Genus neben Vertretern der Flaviviren auch Hepaciviren
und Pestiviren umfasst. Eine offizielle Zuordnung von GBV-C in ein Genus existiert
noch nicht. Wahrscheinlich bilden die GB-Viren ein eigenes Genus.
5
Einleitung
Genus
Flavivirus
Pestivirus
Hepacivirus
Noch nicht
zugeordnet
Virusspezies (infizierter Organismus)
Louping III Virus (Schaf)
Wesselsbron (Schaf )
Japanische Enzephalitis (Schw ein)
Frühsommer Meníngoenzephalitis Virus (Mensch)
Gelbf ieber Virus (Mensch)
Dengue Virus Typ 1-4 (Mensch)
Virus der bovinen Diarrhöe 1
Virus der bovinen Diarrhöe 2
V irus der klassischen Schw einepest
Border Disease Virus der Schaf e
Hepatitis C Virus, Genotypen 1-6 (Mensch)
GB Virus Typ A (Af fen)
GB V irus Typ B (Af f en)
GB Virus Typ C (Mensch)
Abbildung 1: Vertreter der Flaviviridae
Von den drei Vertretern der GB-Viren konnte lediglich für das GBV-C eine Infektion
des Menschen nachgewiesen werden. GBV-A und GBV-B unterscheiden sich
phylogenetisch zu weit vom GBV-C, um auch im Menschen infektiös zu sein
[Simmonds, 2001], und wurden bisher nur bei nicht menschlichen Primaten
nachgewiesen.
Die phylogenetische Analyse zeigt, dass das GBV-C eng mit dem GBV-A und
weniger eng mit den anderen Vertretern der Flaviviridae verwandt ist. Das GBV-B,
welches enger mit dem HCV als mit GBV-A und GBV-C verwandt ist, verursacht bei
Neuweltaffen eine Hepatitis.
Abbildung 2: Stammbaum der Flaviviridae (BVDV: bovine
Virusdiarrhoe; YFV: Gelbfiebervirus)
6
Einleitung
2.1.3. Epidemiologie und Infektionswege
Das GB-Virus-C ist weltweit verbreitet. Es werden fünf Genotypen unterschieden,
deren Nukleotidsequenzen sich um maximal 13 % voneinander unterscheiden. Man
nimmt an, dass das Virus schon in menschlichen Populationen vorhanden war, als
diese vor 100000-150000 Jahren aus Afrika auswanderten, und die verschiedenen
Genotypen sich später entwickelten. So findet man z. B. in Ostasien und bei
amerikanischen Ureinwohnern ausschließlich Genotyp 3, in der nordafrikanischen
und westwärts von Indien lebenden Bevölkerung Genotyp 2 sowie südlich der
Sahara den Genotyp 1.
Die Prävalenz der aktiven GBV-C-Infektion in der Durchschnittsbevölkerung Europas
und den USA ist mit ca. 1-4 % relativ hoch, in Entwicklungsländern liegt sie sogar bei
10-12 % [Dawsen, 1996]. Die Expositionsrate der Bevölkerung ist jedoch wesentlich
höher als die Rate persistierender Infektionen, und wird auf 60-80 % geschätzt
[Williams, 2004]. Die Infektion mit dem GBV-C verläuft subklinisch oder mit milden
Symptomen. Bei ca. 70 % aller Infizierten werden Antikörper gegen Bestandteile der
Virushülle (Anti-E2) gebildet, wodurch das Virus eliminiert wird. In einem geringen
Prozentsatz der Fälle, geht die Eliminierung des Flavivirus aus bisher unbekanntem
Grund nicht mit der Bildung von Anti-E2 einher [Van der Bji, 2005]. Man weiß jedoch
inzwischen, dass der neben der humoralen Immunantwort auch spezifische zelluläre
Abwehrmechanismen gegen das Flavivirus existieren [Addo, 2004]. Bei bis zu 30 %
der primär Infizierten persistiert die Infektion im Organismus, und es kann über Jahre
hinweg
virale
RNA im
Serum
nachgewiesen
werden
[Xiang,
2001].
Die
Mechanismen, mit denen das GBV-C in diesen Fällen der Immunabwehr entgeht,
sind bisher nicht bekannt.
Die Infektion mit dem GBV-C erfolgt vor allem durch Blut- und Sexualkontakte, aber
auch eine vertikale, perinatale Übertragung ist möglich. [Alter, 1997] [Bjorkman,
2001]. Diese Vermutung wird gestützt durch den Nachweis viraler RNA in Speichelund Sperma-Proben sowie in Muttermilch [Schröter, 2000] [Quiros-Roldan, 2001].
Die Risikofaktoren entsprechen denen für HCV, HBV und HIV, weshalb bei Patienten
mit diesen Erkrankungen eine wesentlich höhere Prävalenz des GBV-C festzustellen
ist (von 15 % bei HCV positiven bis zu 35 % bei HIV-positiven Personen [Xiang,
2001]).
7
Einleitung
Trotz zahlreicher Untersuchungen konnte der Zell- und Gewebetropismus der GBV-C
bisher nicht restlos aufgeklärt werden. Entgegen der ursprünglichen Vermutung, das
GBV-C würde sich in Leberzellen vermehren, gilt jedoch mittlerweile als gesichert,
dass das Virus in erster Linie in Zellen des hämatopoetischen Systems (wie z.B. in
Plasmazellen, T-und B-Lymphozyten, mononuklearen Makrophagen) vor allem in der
Milz und im Knochenmark, repliziert [Fogeda, 1999] [Laskus, 1998] [Tucker, 2000]
[Handa, 2001].
2.1.4. Aufbau des GBV-C
Über den Aufbau des GBV-C-Virions ist bisher wenig bekannt. Seine Größe beträgt
ca. 40-50 nm im Durchmesser. Es besitzt eine Lipidhülle, in welche die
viralen
Oberflächenproteine E1 und E2 eingelagert sind. Die Existenz eines Nukleokapsids,
analog dem des HCV und anderer Flaviviren ist umstritten.
Abbildung 3: Schematische Darstellung des GBV-C
2.1.5. Genom
Das GBV-C besitzt ein einzelsträngiges positiv-Strang-RNA-Genom mit ca. 9400
Nukleotiden. Es ähnelt dem Hepatitis-C-Virus mit ca. 25 % Homologie auf der Ebene
der Aminosäuren, ist jedoch phylogenetisch zu weit vom HCV entfernt, um als
Hepacivirus zu gelten. Ähnlich dem Genom des HCV enthält das GBV-C-Genom
einen großen offenen Leserahmen, welcher für ein Polyprotein mit Sequenzen
sowohl für die Strukturproteine (E1, E2) als auch für die Nicht-Strukturproteine (NS2,
NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS45B) kodiert. Die Prozessierung des Polyproteins
8
Einleitung
erfolgt sowohl durch viruseigene als auch durch zelluläre Proteasen. Die folgende
Abbildung stellt das Genom des GBV-C dem des HCV gegenüber.
Abbildung 4: Vergleich des Genoms von GBV-C und HCV (NCR = non coding region)
Die Funktionen der Genprodukte des HCV sind fast alle bekannt. Aufgrund von
Strukturähnlichkeiten beider Virusgenome, kann man daher auf Funktionen der
Produkte homologer Gene des GBV-C schließen. So kodieren die Gene E1 und E2
beim HCV für Glykoproteine der Virushülle. Ähnliches darf für die Funktion dieser
Gene bei GBV-C angenommen werden. Das Core-Gen, welches bei HCV für das
Nucleokapsid kodiert, fehlt bei GBV-C an entsprechender Stelle. Messungen der
Schwebedichte im Sucrose-Gradienten und Elektronenmikroskopie weisen allerdings
die Existenz eines Nukleokapsids nach. Seine Herkunft ist jedoch bislang unklar. Die
Gene NS2 und NS3 kodieren für zwei Proteasen und eine Helikase, NS4B für einen
Co-Faktor des Genprodukts von NS3 und NS5B für eine RNA-Polymerase. Die
Funktion des Gen-Produktes der NS5A-Region ist bisher nicht bekannt. Die 5’NTRRegion
(nontranslated
region)
des
Genoms
von
GBV-C
stellt
einen
hochkonservierten Bereich dar, und eignet sich deshalb als Primer-Bindungsstelle für
die Detektion von GBVC-RNA mittels RT-PCR [Andonow, 1998].
9
Einleitung
2.2. Die HIV-Infektion
2.2.1. Entdeckung
Anfang der achtziger Jahre wurden in den USA gehäuft Fälle von schwerer
Immunschwäche
unter
jungen
homosexuellen
Männern
beobachtet.
Die
Immundefizienz war von einem Abfall der CD4-positiven T-Helfer-Zellen im Blut
begleitet. Die betroffenen Patienten verstarben an schweren opportunistischen
Infektionen,
die
der
gesunde
Körper
normalerweise
mittels
zellulärer
Abwehrmechanismen kontrolliert. 1983 wurde aus Blutseren dieser Patienten ein
Virus isoliert, das man heute als HIV (human immunnodeficiency virus) bezeichnet.
Kurz darauf wurde die kausale Beziehung zwischen dem neuen Virus und dem
Immunschwäche-Syndrom aufgedeckt [Barré-Sinoussi, 1983], [Broder, 1984], [Gallo,
1984]. Die Infektion mit dem HIV führt unbehandelt nach ca. 5-15 Jahren bei fast
allen Infizierten zum letal verlaufenden Endstadium AIDS, welches durch den
vollständigen Verlust von CD4-positiven Lymphozyten und die unkontrollierte
Vermehrung opportunistischer Erreger gekennzeichnet ist.
2.2.2. Epidemiologie und Übertragungswege
Das HIV und das bei Affen vorkommende Immunschwächevirus SIV haben ihren
gemeinsamen
Ursprung
in
Zentral-Afrika.
Wahrscheinlich
wurde
das
Immunschwächevirus SIV durch Biss- oder Schnittverletzungen bei der Jagd und der
Zubereitung von infiziertem Fleisch von Affen auf den Menschen übertragen.
Durch die geringe Mobilität der Bevölkerung war die Verbreitung der HIV-Infektion
vorerst
lokal
begrenzt.
Kriege,
Wirtschaftsemigration
und
intensivierte
Handelsbeziehungen ermöglichten es dem Virus in der zweiten Hälfte des vorigen
Jahrhunderts, sich auch auf andere Teile Afrikas und schließlich über die ganze Welt
auszubreiten. Von HIV existieren zwei verschiedene Virustypen, die als HIV-1 und
HIV-2 bezeichnet werden, wobei sich HIV-1 noch in verschiedene Subtypen (die
Gruppen M, N und O) unterteilen lässt. HIV 1 und das bei Schimpansen
vorkommende SIVcpz (Simian Immunodeficiency Virus) sind relativ eng verwandt.
10
Einleitung
Die anderen bei Primaten vorkommenden SIVs sind jeweils mit bestimmten
Primatenspezies assoziiert und enger mit dem HIV-2 als mit HIV-1 verwandt.
Während HIV-1 weltweit die verbreitetere Variante ist, kommt die Infektion mit HIV-2
vor allem in Westafrika vor.
In alten Krankheitsberichten aus Afrika ist AIDS mit seiner typischen Symptomatik (z.
B. im Gegensatz zu Malaria oder Gelbfieber) nicht beschrieben worden. Deshalb
nimmt man an, dass es sich um eine in der menschlichen Population relativ junge
Krankheit
handelt.
Gestützt
wird
diese
Annahme
durch
phylogenetische
Untersuchungen, welche die Übertragung des SIV auf den Menschen auf das Jahr
1930 datieren. Erste serologische Hinweise auf eine Infektion mit dem HIV fanden
sich in Seren aus Zentralafrika von 1959. Da die ersten AIDS-Fälle in den USA 1981
beschrieben wurden, geht man davon aus, dass das Virus dort schon Anfang der
siebziger Jahre verbreitet gewesen ist. Seit dieser Zeit hat sich das HIV rasant
ausgebreitet. Weltweit sind derzeit ca. 40 Millionen Menschen infiziert. Am stärksten
sind mit bis zu 30 % ihrer Gesamtbevölkerung zentral- und südafrikanische Länder
betroffen (siehe Abbildung 5). Ihre schnellste Ausbreitung erfährt die Krankheit zur
Zeit in Asien und Osteuropa.
Abbildung 5: Verbreitung und Prävalenz des HIV Ende 2005
11
Einleitung
In Deutschland liegt die Prävalenz der HIV-Infektion derzeit bei ca. 0.06 %. Damit
lebten nach Schätzung des Robert-Koch-Institutes zum Ende des Jahres 2005 in
Deutschland etwa 49000 HIV-infizierte Menschen. Nachdem die Zahl der
Neuinfektionen während der neunziger Jahre in Deutschland auf relativ niedrigem
Niveau stabil war, hat sie neuerdings von ca. 1000 im Jahr 1999 auf ca. 1800 im
Jahr 2005 zugenommen [RKI, 2005]. Jährlich sterben immer noch ca. 750 Personen
an AIDS. In den folgenden Abbildungen sind Prävalenz und Inzidenz der HIVInfektion und AIDS in Deutschland während der vergangenen 25 Jahre dargestellt.
Abbildung 7: Prävalenz von HIV, AIDS
und HAART in Deutschland
Abbildung 6: Inzidenz von HIV, AIDS und AIDSassoziierten Todesfällen in Deutschland
Das Virus findet sich in Körperflüssigkeiten, in hohen Konzentrationen vor allem in
Blut,
Sperma
Sexualverkehr,
und
Vaginalsekret.
Blutkontakte
und
Die
Hauptübertragungswege
perinatale
Übertragung.
sind
daher
Risikogruppen
in
Nordamerika und Europa sind in erster Linie homosexuelle Männer, i.v.
Drogenabhängige,
Transfusionspatienten,
Kinder
HIV-infizierter
Mütter
sowie
Patienten aus Ländern mit hoher HIV-Prävalenz. Von den ca. 1800 jährlichen
Neuinfektionen in Deutschland sind 20% heterosexuell, 70% homosexuell und 9%
durch i.v. Drogengebrauch erworben [RKI, 2005]. Allerdings nimmt der Anteil der auf
heterosexuellem Weg Infizierten in den westlichen Ländern zu. Dabei ist das Risiko
einer Übertragung der Infektion vom Mann auf die Frau zwei- bis achtmal größer als
das der Ansteckung eines Mannes durch eine Frau. Gleichzeitig bestehende
Geschlechtskrankheiten, Schleimhautirritationen und eine hohe Viruskonzentration in
den Körperflüssigkeiten des Infizierten erhöhen jedoch das Risiko einer Infektion. Bei
12
Einleitung
intravenösen Injektionen genügen schon geringe Mengen Blut (<1µl) um das Virus zu
übertragen. Die vertikale Übertragung von der Mutter auf das Kind kann sowohl in
utero und perinatal als auch mit der Muttermilch erfolgen, und spielt vor allem in
Ländern ohne ausreichende medizinische Versorgung eine Rolle.
2.2.3. Aufbau des HIV-Partikels
Das HIV gehört zur Gruppe der Lentiviren aus der Familie der Retroviren. Das
Viruspartikel wird nach außen von einer Lipidhülle begrenzt, in welche die viralen
Glykoproteine gp120 und gp41 eingebaut sind. Nach innen bildet das Matrixprotein
p17 eine kugelförmige Schale. Hierin ist das kegelförmige innere Kapsid, bestehend
aus dem Kapsidprotein p24, eingeschlossen. Innerhalb des Kapsids befinden sich
zwei Moleküle ssRNA sowie die Enzyme Reverse Transkriptase (RT), RNAse H,
(p66) Protease (p9) und Integrase (p32).
Abbildung 8: Aufbau des HIV-Partikels
13
Einleitung
2.2.4. Replikationszyklus des HIV
Der Eintritt des HIV in seine Zielzellen erfolgt über den CD4-Rezeptor, ein ca. 58 kDa
schweres monomeres Glykoprotein, welches sich auf der Oberfläche von TLymphozyten, T-Vorläuferzellen in Knochenmark und Thymus, auf Monozyten und
Makrophagen, dendritischen Zellen und Mikrogliazellen des ZNS befindet. Auf CD4positiven T-Zellen gehört der CD4-Rezeptor zum T-Zellrezeptor-Komplex und bindet
physiologischerweise
an
MHC-II-Moleküle
auf
der
Oberfläche
von
antigenpräsentierenden Zellen.
Die Bindung des HIV an den CD4-Rezeptor erfolgt mit Hilfe des viralen gp120.
Allerdings benötigt das Virus für den Eintritt in die Zelle weitere Ko-Rezeptoren: die
Chemokinrezeptoren CCR5 (auf der Zelloberfläche von Makrophagen) bzw. CXCR4
(auf T-Helferzellen). Ob der CCR5- oder der CXCR4-Rezeptor als Ko-Rezeptor
benutzt wird, ist abhängig vom Virustyp. HI-Viren, welche CXCR4 benutzen, werden
als t-trop, jene, die CCR5 benutzen als m-trop bezeichnet.
Die Bindung des gp120 an den CD4-Rezeptor induziert eine Konformationsänderung
des gp120 Moleküls, welche es dem gp41 erlaubt, sein hydrophobes N-terminales
Ende in die Plasmamembran zu inserieren. Virus- und Zellmembran verschmelzen
und der Viruskern wird in das Zytoplasma aufgenommen. In einem bisher nicht bis
ins Detail verstandenen Prozess kommt es zur Auflösung der Viruskapsid-Strukturen
(uncoating). Im Zytoplasma wird die virale RNA durch die Reverse Transkriptase des
HIV in doppelsträngige DNA umgewandelt. Der RNA-Strang wird dabei sofort von der
RNAse H abgebaut.
Das viruseigene Enzym
Integrase
ermöglicht,
nach dem Transport der
proviralen DNA in den
Zellkern, schließlich die
Integration derselben an
beliebiger Stelle in das
Wirtsgenom.
Abbildung 9: Eintritt des HIV in die CD4-Positive Zelle
14
Einleitung
Wird nun die infizierte Zelle durch ein Antigen stimuliert, kommt es zur Transkription
des viralen Genoms. Die transkribierte Virion-RNA und die virale mRNA verlassen
den Zellkern. Im Zytoplasma werden zunächst die Regulatorproteine des Virus (Nef,
Ref, Tat, Vpr und Vpu) synthetisiert, über welche die Expression der viralen RNA, der
Zusammenbau der Virusproteine und das Ausknospen der Partikel gesteuert und
beschleunigt werden. In einer zweiten Phase werden Strukturproteine synthetisiert,
und zwar vorerst als die Vorläuferproteine Gag (group specific antigen), Pol
(Polymerase) und gp160. Die Spaltung des Vorläuferproteins Gag-Pol erfolgt durch
die
virale
Protease,
welche
eine
geringe
Substrat-Spezifität
besitzt,
und
verschiedene Peptidbindungen spalten kann. Das gp160 wird im endoplasmatischen
Retikulum zunächst glykosyliert und später in die Oberflächenproteine gp120 und
gp41 gespalten. Der Zusammenbau des HIV-Partikels und seine Ausknospung
erfolgen
schließlich
an
der
Zellmembran.
Hierbei
wird
ein
Teil
der
Zytoplasmamembran zur Lipidhülle des Virions (siehe Abbildung 10).
Abbildung 10: Replikationszyklus des HIV
2.2.5. Genetische Struktur des HIV
Das HIV-Genom ist ca. 9600-9700 Basenpaare lang und wird an beiden Enden von
LTR-Sequenzen (LTR - long terminal repeat) flankiert. Die LTR enthalten eine
modulatorische Region (mit Bindungsstellen für zelluläre Faktoren, die den
Nukleinsäurestoffwechsel im Kern aktivieren), eine Enhancer-Region (sie bindet z. B.
15
Einleitung
NFκB und beeinflusst damit die Geschwindigkeit der Virusvermehrung) und die CoreRegion mit dem Promoter. Das Genom selbst enthält Gene für Strukturproteine (gag
und env), Enzyme (pol) und Regulatorproteine (tat, nef, rev, vif, vpr und vpu; siehe
Abbildung 11).
Abbildung 11: Das Genom des HIV-1
Env (envelope) kodiert das Glykoprotein gp160, welches später durch eine zelluläre
Protease in die Glykoproteine gp120 und gp41 gespalten wird. Gag (group specific
antigen) und pol (polymerase) kodieren ein Vorläuferprotein, welches durch die
virale Protease in die Kernproteine p24, p17, und p7, sowie in die vom Virus
benötigten Enzyme (Protease, Reverse Transkriptase, RNAse H und Integrase)
gespalten wird.
Abbildung 12: Vorläuferproteine und daraus hervorgehende funktionelle Proteine des HIV-1
16
Einleitung
Das von tat kodierte Protein (transactivator of transcription) aktiviert die Transkription
viraler DNA. Rev (regulator of expression of virion proteins), der nukleäre
Exportfaktor, ist wichtig für die Umstellung der Expression früher regulatorischer
Proteine zu den später synthetisierten Strukturproteinen. Tat und rev stimulieren die
Transkription von HIV-DNA in RNA und deren Elongation, fördern den Transport von
HIV-RNA vom Zellkern ins Zytoplasma und sind wesentlich für die Translation.
Nef (negative factor) wird ebenso wie Tat und Rev als regulatorisches Protein früh
während des Replikationszyklus produziert. Nef steuert die Virusreplikation und
induziert eine Herunterregulation von HLA-Klasse-I-Antigenen an der Oberfläche
infizierter Zellen. Es beeinflusst außerdem die Aktivierung von T-Zellen, indem es mit
verschiedenen intrazellulär in Signaltransduktionsketten involvierten Proteinen
interagiert.
Vpr ist für den Transport des viralen Präintegrationskomplexes zum Kern von
Bedeutung und kann sowohl die HIV-LTR als auch eine Reihe von zellulären und
viralen Promotern stimulieren. Vpu spielt eine wichtige Rolle beim Ausknospen des
Virus von der Zellmembran. Außerdem ist es an der Degradation von CD4-gp160Komplexen im endoplasmatischen Retikulum beteiligt.
Vif inhibiert den zellulären Faktor APOBEC3G (apolipoprotein B mRNA editing
enzyme catalytic polypeptide-like 3G), eine Cytosin-Deaminase, welche zu einer
Mutation
viraler
DNA
führt
und
somit
einen
allgemeinen
antiviralen
Schutzmechanismus der Zelle darstellt.
2.2.6. Pathogenese
2.2.6.1. Natürlicher Verlauf der Infektion
Die HIV-Infektion wird in Abhängigkeit von der Virusmenge im Blut, der CD4-Zellzahl
und den klinischen Symptomen in drei Phasen eingeteilt, welche als Primärinfektion,
klinische Latenzphase und AIDS-Stadium bezeichnet werden.
Die erste Phase der Erkrankung dauert nur wenige Wochen und ist von einer hohen
Virämie gekennzeichnet. Die Virusmengen im Blut können dabei auf über 5.000.000
RNA-Kopien/ml ansteigen. Die Zahl der CD4-positiven T-Zellen fällt häufig auf die
Hälfte des Ausgangswertes ab. Das zunächst noch intakte Immunsystem kann die
Viruslast jedoch mittels HIV-spezifischer T-Helferzellen und zytotoxischer T-Zellen
deutlich senken, oft unter die Nachweisgrenze von 50 RNA-Kopien/ml im peripheren
17
Einleitung
Blut. Der Wert, auf den die Virämie nach der Primärinfektion sinkt (der sog. Setpoint),
hat entscheidende Bedeutung für den Krankheitsverlauf. Je höher die Virusaktivität
und je niedriger die individuelle antivirale Immunität zu diesem Zeitpunkt sind, um so
schneller ist die Progression zu AIDS. Nach der primären Erkrankungsphase
normalisiert sich die anfangs erniedrigte Zahl der CD4-positiven Zellen wieder,
erreicht aber selten den Wert vor der Infektion.
Abbildung 13: Natürlicher Verlauf der HIV-Infektion (Acute infection entspricht der Akutphase, chronic
lymphadenopathy und subclinical immundysfunktion der Latenzphase. Systemic immune deficiency
entspricht dem AIDS-Stadium
In der darauf folgenden klinischen Latenzphase sind nur wenige der zirkulierenden
CD4-Zellen infiziert, und infektiöse Viren sind nur in geringer Menge im Blut
vorhanden. Die Virusreplikation findet jetzt vor allem in den Keimzellen der
Lymphfollikel statt. Die dort befindlichen infizierten dendritischen Zellen stehen in
engem Kontakt mit aktivierten CD4-Lymphozyten, welche auf diesem Wege ständig
infiziert werden und zugrunde gehen. Es pendelt sich ein oft über Jahre stabiles
Gleichgewicht zwischen Virusreplikation und Zerstörung der T-Helferzellen einerseits
und Virussupprimierung bzw. Regenerierung neuer T-Zellen andererseits ein.
Trotz
einer
zunächst
starken
Aktivierung
zellulärer
und
humoraler
Immunmechanismen, nimmt die Zahl der CD4-positiven Zellen im Verlauf der
Erkrankung kontinuierlich ab. Die in den Keimzentren befindlichen dendritischen
18
Einleitung
Zellen wirken zunächst als Filter und begrenzen während der Latenzphase die
Infektion. Schließlich werden aber auch sie irreversibel geschädigt. Die innere
Architektur des Lymphfollikel wird vernichtet, und die HIV-infizierten Lymphozyten
werden massenweise freigesetzt. Dadurch steigt die Viruslast im peripheren Blut
sprunghaft an. Ähnlich den Lymphfollikeln fungieren auch die Milz, die Tonsillen und
die Peyerschen Plaques als Erregerreservoire und chronische Infektionsherde.
Noch vor dem Erreichen der klinisch manifesten Immunsuppression (AIDS)
beobachtet man häufig einen Wechsel der Zellspezifität des Virus: Die primäre
Infektion erfolgt zunächst durch Viren, welche den auf Makrophagen und
dendritischen Zellen exprimierten CCR5 als Ko-Rezeptor nutzen (m-trope Viren).
Diese Zellen transportieren das Virus vom Ort der Infektion zu den lokalen
Lymphknoten. Mutationen des für den CCR5-Rezeptor kodierenden Gens, wie sie
innerhalb der kaukasischen Population mit einer Häufigkeit von 1 % (homozygot) zu
finden sind, können daher vor einer Infektion mit m-tropen Stämmen schützen. In
späteren Stadien werden dagegen zunehmend t-trope, sogenannte SI-Stämme
(syncytium-inducing virus) gebildet, welche T-Helferzellen über ihren CXCR4 KoRezeptor infizieren. Bei ca. 80% der HIV-Positiven finden sich vorwiegend m-trope
Virusstämme. Lediglich ca. 20% der Patienten weisen in erster Linie t-trope Isolate
auf, und befinden sich meist in einem weit fortgeschrittenen Krankeitsstadium.
Durch welche Mechanismen die Wirtszellen letztendlich zerstört werden, ist noch
nicht
bis
ins
Detail
geklärt.
Infizierte
Zellen
werden
sowohl
durch
die
Virusvermehrung selbst, als auch durch zytotoxische CD8-Zellen abgetötet, welche
sie als Träger von Fremdantigen erkennen. Nicht infizierte CD4-Zellen werden
funktionsunfähig, indem sie mit infizierten Zellen zu Syncytien verschmelzen. Ein
weiterer Grund für den Verlust nicht infizierter Zellen ist von der Virusoberfläche
freigesetztes lösliches gp120, welches über den CD4-Rezeptor aufgenommen, und
an der Zelloberfläche in MHC-II-Molekülen präsentiert wird. Zytotoxische Zellen töten
auch diese nicht infizierten, antigenpräsentierenden Zellen ab. Durch eine
zunehmende Schädigung des Thymusgewebes gelingt es dem Organismus nicht
mehr, den Mangel an T-Helferzellen auszugleichen.
Auch die Funktion der CD4-positiven Gedächtniszellen ist schon im Frühstadium der
Krankheit gestört. Das zeigt sich vor allem in der Verschiebung ihrer InterleukinProduktion von einer TH-1-Anrwort (d.h. der Sekretion von IL-2 und IFN-γ) hin zu
einer TH-2-Antwort (IL-4 und IL-10). IL-2 und IFN-γ wirken stimulierend auf CD8-
19
Einleitung
positive, zytotoxische Lymphozyten, welche durch das Fehlen dieser Zytokine ihre
entscheidende Bedeutung bei der Immunkontrolle der Infektion nicht mehr
wahrnehmen können.
2.2.7. Die Immunantwort gegen das HIV
2.2.7.1. Zelluläre Abwehrmechanismen
Die Unterdrückung der HIV-Replikation und die Abtötung infizierter Zellen erfolgt in
erster Linie durch HIV-spezifische, zytotoxische T-Lymphozyten (CTL). Diese können
virusinfizierte Zellen mit Hilfe des CD8-Rezeptors und ihres individuellen TZellrezeptors erkennen und eliminieren. Vergleicht man HIV-Langzeitüberlebende
(engl.:
long
term
non
progressors,
LTNP)
mit
Patienten
mit
raschem
Krankheitsverlauf, so finden sich bei den LTNP eine hohe Zahl von HIV-spezifischen
Vorläufer-CTL mit breiter Spezifität gegen verschiedenste Proteine des HIV.
Die zu Beginn der HIV-Infektion zunächst sehr effektive CTL-Antwort lässt im Verlauf
der Erkrankung nach. Dafür sind mehrere Gründe denkbar. So führt eine permanente
Aktivierung von CD8-positiven Lymphozyten zu einer erhöhten Apoptoserate dieser
Zellpopulation [Carbonari, 1995]. Durch Selektion des HIV und die Bildung von
Escape-Mutanten wird darüber hinaus die Erkennung infizierter Zellen durch CTL
erschwert.
Das
Nef-Protein
des
HIV
kann
seinerseits
MHC-I-Antigene
herunterregulieren und somit ebenfalls ein Erkennen durch CD8-positive Zellen
verhindern. CTL sind außerdem bei ihrer Proliferation und Aktivierung auf die
Unterstützung von T-Helferzellen angewiesen. Da HIV-spezifische T-Helferzellen zu
den ersten Zellen gehören, die nach dem Eindringen des Virus in den Organismus
aktiviert werden, werden sie andererseits auch bevorzugt infiziert. Ob der häufig zu
beobachtende Verlust von HIV-spezifischer CTL-Aktivität einen intrinsischen Defekt
der CTL widerspiegelt, oder aber sekundär einen Verlust von HIV-spezifischen THelferzellen reflektiert, ist noch nicht geklärt.
Zusätzlich
zu
der
Langzeitüberlebenden
zytotoxischen
eine
Aktivität
lösliche
HIV-spezifischer
CD8-Zell-abhängige
CTL
wurde
in
Suppressoraktivität
identifiziert, welche nicht mit einer Zerstörung der infizierten Zelle einhergeht, und als
CAF (CD8-T-Cell antiviral factor) bezeichnet wurde [Walker, 1986]. Dieser Faktor
scheint für die Kontrolle der HIV-Infektion von zumindest gleichwertiger Bedeutung
zu sein, wie die MHC-I vermittelte, zytotoxische Aktivität der CD8-Lymphozyten. Die
Identität des CAF ist allerdings bis heute nicht restlos geklärt. Wahrscheinlich tragen
20
Einleitung
mehrere von CD8-Lymphozyten sezernierte Substanzen zu einer verlangsamten
Krankheitsprogression bei. Ein Teil dieser Aktivität ist durch die Chemokine MIP-1α
MIP-1ß und RANTES erklärbar. Diese stellen die natürlichen Liganden des CCR5Rezeptors dar und hemmen den Eintritt m-troper HI-Viren in ihre Zielzellen [Cocchi,
1995]. Es gibt jedoch Hinweise darauf, dass sich die eigentliche CAF-vermittelte
Suppression des HIV sich auf der Ebene der Transkription abspielt [Mackewitz,
1995].
Auch das von CTL sezernierte Inteterleukin 16 war als Kandidat für den CAF
diskutiert worden, nachdem sich bei LTNP erhöhte IL16-Spiegel fanden. Dieses
Zytokin kann an den CD4-Rezeptor binden, die Transkription von HIV-1 verhindern
und T-Helferzellen im Beisein von IL2 zur Proliferation anregen [Center, 2000].
Allerdings wurde nicht in allen experimentellen Ansätzen, bei denen eine CAFAktivität nachgewiesen wurde, IL16 detektiert [Levy, 1996]. Neuere Hinweise auf die
Identität des CAF lieferten Untersuchungen der Arbeitsgruppe von Zhang et al.
[Zhang, 2002]. Aus Seren von LTNP wurden von CD8-Zellen sezernierte Proteine
isoliert (sogenannte α-Defensine 1, 2 und 3), welche die HIV-Replikation hemmten.
Der inhibitorische Effekt konnte durch den Zusatz von gegen diese Proteine
gerichteten Antikörpern aufgehoben werden. Dies deutet darauf hin, dass Defensine,
welche unter anderem auch in der Lage sind, HSV und CMV zu hemmen, eine
wichtige Rolle bei der Kontrolle des HIV durch das Immunsystem spielen .
2.2.7.2. Humorale Abwehrmechanismen
Die humorale Immunantwort spielt bei der Bekämpfung der Infektion nur eine
untergeordnete Rolle. Sie wird durch HI-Viren zwar stark stimuliert und es kommt zur
Bildung von Antigen-Antikörperkomplexen. Da jedoch die Reverse-Transkriptase des
HIV außerordentlich fehlerhaft arbeitet, mutiert das Virus-Genom sehr schnell. Dem
Organismus gelingt es daher nicht, das Virus durch neutralisierende oder
Zytotoxizität induzierende Antikörper zu kontrollieren. Die Glykosylierung der gp120Moleküle erschwert darüber hinaus die Bindung von Antikörpern an die Virushülle.
Zudem werden reaktive Antikörper von löslichem gp120, welches ständig produziert
wird und selbst keine infektiösen Eigenschaften hat, abgefangen.
Neben der zellulären und der humoralen Immunabwehr existieren weitere, sowohl
wirts- als auch virusspezifische, Faktoren, welche die Geschwindigkeit des
natürlichen Krankheitsverlaufes beeinflussen. Dazu zählt unter anderem die HLA21
Einleitung
Klasse des Infizierten. Sie determiniert die Beschaffenheit der MHC-Moleküle und
damit
die
Fähigkeit
von
Makrophagen
und
dendritischen
Zellen
zur
Antigenpräsentation in MHC-II Molekülen. Aber auch die Präsentation von in
infizierten Zellen gebildeten Virusproteinen auf der Zelloberfläche hängt von der HLAKlasse des Individuums ab. So sind die HLA-Klassen HLA-B27 und HLA-B57 mit
einer deutlich verlangsamten, die Klasse HLA B35 dagegen mit einer raschen
Krankheitsprogression assoziiert [Kaslow 1996].
Darüber hinaus gibt es sicherlich eine Vielzahl weiterer, noch zu identifizierender
immunologischer Faktoren, welche den Verlauf der HIV-Infektion beeinflussen.
2.2.8. Klinik der HIV-Infektion
Die primäre HIV-Infektion verläuft in den meisten Fällen asymptomatisch. Bei ca. 20
% der Patienten kommt es allerdings einige Wochen nach der Infektion zu einem,
meist transienten, grippe-ähnlichen Krankheitsbild mit Lymphknotenschwellung,
Fieber, Pharyngitis und Hautausschlag. Bis zur Entwicklung eines klinisch manifesten
Immundefekts können bis zu 15 Jahre vergehen. Oft findet sich in dieser
Latenzphase eine generalisierte Lymphadenopathie. Im späteren Verlauf treten bei
vielen Patienten Allgemeinsymptome wie Abgeschlagenheit und Gewichtsabnahme
auf. Bei Abfall der CD4-Lymphozyten unter 500/µl (der Normalwert liegt bei 6001200/µl) zeigen sich erste klinische Hinweise auf eine eingeschränkte zelluläre
Abwehr, häufig in Form von Herpes Zoster- und Pilzinfektionen. Durch die gestörte
Immunregulation können auch Autoimmunphänomene auftreten, die mit Blut- und
Knochenmarksveränderungen und der Bildung von Autoantikörpern einhergehen.
Das AIDS-Stadium ist durch einen Abfall der CD4-Lymphozyten unter den kritischen
Wert von 200/µl gekennzeichnet und verläuft unbehandelt immer letal. Durch die
stark eingeschränkten zellulären Abwehrmechanismen des Organismus kommt es zu
schweren opportunistischen Infektionen, insbesondere durch intrazelluläre Erreger.
Die am häufigsten zum Tode führende Infektion ist eine Pneumonie mit dem
Protozoon Pneumozystis carinii (PCP). Infektionen mit Herpes- oder ZytomegalieViren, Pilz-Pneumonien (vor allem Candida und Aspergillus), Toxoplasmose und
Tuberkulose stellen weitere ernste Gefahren für AIDS-Patienten dar. Auch
Malignome, in erster Linie Non-Hogkin-Lymphome (ausgelöst durch eine nicht
supprimierte
EBV-Infektion),
das
bei
AIDS-Patienten
besonders
aggressiv
verlaufende Kaposi-Sarkom (verursacht durch HHV-8) und das Zervix-Karzinom,
22
Einleitung
werden in diesem Stadium der Krankheit gehäuft beobachtet. Bei einigen HIVPatienten kommt es zu neurologischen Symptomen im Sinne einer HIVEnzephalopathie mit fortschreitender Demenz.
2.2.9. Klassifikation der HIV-Erkrankung
Zur Klassifikation der HIV-Erkrankung wird das seit 1993 geltende CDC-Schema
verwendet, welches von der WHO übernommen wurde. Nach klinischen Kriterien
erfolgt die Einteilung in die Krankheitsstadien in A, B und C. Stadium A gilt für
asymptomatische, Stadium B für symptomatische Patienten mit bestimmten
Infektionen wie Herpes Zoster, oraler Candidiasis oder oraler Haarleukoplakie.
Patienten mit AIDS-definierenden Erkrankungen, wie z. B. PCP-Pneumonie, KaposiSarkom, TBC oder Malignomen, befinden sich im klinischen Stadium C. Anhand der
Zahl der CD4-positiven Zellen werden die CD4-Stadien 1, 2 und 3 unterschieden. Die
T-Helferzellzahl ist im CD4-Stadium 1 noch normal, im Stadium 2 kleiner als 500/µl,
und im Stadium 3 schließlich auf unter 200/µl abgefallen.
2.2.10. Nachweis der HIV-Infektion
Eine Infektion mit dem HIV wird primär durch den Nachweis spezifischer Antikörper
mittels ELISA-Suchtest festgestellt. Diese sind frühestens 3 Wochen, spätestens 12
Wochen nach Infektion nachweisbar. Beim ELISA binden die im Blut-Plasma des
infizierten Patienten vorhandenen Antikörper mit einem ihrer Fab-Arme an ein
Festphasen-gekoppeltes HIV-Antigen (z. B. env-Proteine). Der zweite, noch freie
Fab-Arm des Antikörpers bindet an lösliches Antigen, welches nach einigen
Waschschritten hinzugefügt wird, und identische Epitope wie das fest gebundene
besitzt. Das lösliche Antigen wiederum ist an ein Enzym gekoppelt. Anschließend
wird eine Substratlösung hinzugegeben, welche durch das Enzym umgewandelt
wird. Dadurch kommt es zu einem Farbumschlag der Substratlösung. Die Spezifität
des Verfahrens liegt bei ca. 95 %, die Sensitivität bei über 99 %.
Jedes positive HIV-ELISA-Ergebnis muss durch einen weiteren Test bestätigt
werden.
Für
diesen
Bestätigungstest
kommen
Immunoblot-Verfahren
zur
Anwendung. Dabei werden rekombinant hergestellte Proteine des HIV chemisch
denaturiert und ihrem Molekulargewicht entsprechend mittels Gelelektrophorese
aufgetrennt. Die entstandenen Proteinbanden werden anschließend auf eine
Nitrozellulose-Membran übertragen, welche mit dem zu testenden Serum inkubiert
23
Einleitung
wird. Sind HIV-Antikörper vorhanden, so binden diese an die Proteine und werden
dann - ähnlich wie beim ELISA - mit einem enzymmarkierten zweiten Antikörper
nachgewiesen. Der Nachweis des gp120 hat dabei die größte Sensitivität. Da aber
auch unspezifische Bindungen an das Glykoprotein vorkommen, müssen für einen
positiven Befund noch weitere Virusproteine nachgewiesen werden.
Neben dem indirekten Nachweis der Infektion über Antikörper ist auch der direkte
Nachweis des Virus durch Detektion von HIV-RNA oder viralen Antigenen (z. B. p24)
möglich.
2.2.11. Quantifizierung der HIV-Virämie
Eine Quantifizierung der HIV-RNA wird seit 1996 durchgeführt und ist für die
Beurteilung des Therapieerfolges essentiell. Dafür kommen meist der bDNA-Assay
(branched DNA signal amplifikation von Bayer) oder die quantifizierende TaqMan
Real-Time-PCR (Roche) zum Einsatz. Beim bDNA-Assey wird die HIV-RNA von
Sonden aus dem Pol-Bereich des HIV-Genoms gebunden, die sich auf einer
Mikrotiterplatte befinden. An den RNA-Strang binden in einem weiteren Schritt
spezifische Oligonukleotide, welche mit alkalischer Phosphatase besetzt sind. Ein
danach zugegebenes Substrat wird von dem Enzym umgesetzt, und es kommt zu
einem Chemilumineszens-Signal, welches der Menge der an die Mikrotiterplatte
gebundenen HIV-RNA proportional ist.
2.2.12. Antiretrovirale Therapie
2.2.12.1. Inhibitoren viraler Enzyme
Seit Anfang der neunziger Jahre stehen antiretroviral wirksame Medikamente zu
Verfügung. Es handelt sich dabei um Nukleosidanaloga (z.B. Zidovudin, Didanosin
und Zalcitabin), die spezifisch die Reverse Transkriptase (RT) des HIV hemmen
(nukleosidische Reverse-Transkiptase-Inhibitoren, NRTI). Leider bildeten sich unter
Monotherapie oder Kombinationstherapie mit zwei dieser Stoffe schnell resistente
HIV-Stämme. Seit 1996 werden zusätzlich nicht-nukleosidische Inhibitoren der RT
(NNRTI) eingesetzt und mit den NRTI kombiniert. Einen weiteren Ansatzpunkt für die
medikamentöse Therapie stellt die Inhibition der viralen Protease dar, welche das
gag/pol-Vorläuferprotein des HIV in seine Einzelkomponenten spaltet. Seit 1998
stehen Hemmstoffe für dieses Enzyms (Proteinaseinhibitoren, PI) zur Verfügung.
24
Einleitung
NRTI und NNRTI sind durch ihre gute Liquorgängigkeit auch im ZNS wirksam. In
lymphatischen Geweben wird ihre Wirksamkeit dagegen von den PI übertroffen.
Eine
seit
ca.
1996
mögliche
Kombinationstherapie
aus
mindestens
drei
verschiedenen antiretroviralen Medikamenten wird als hochaktive antiretrovirale
Therapie (HAART) bezeichnet und verlängert das symptomfreie Überleben sowie
das Überleben im AIDS-Stadium erheblich. Bei fast allen Patienten steigt die CD4Zellzahl nach Therapiebeginn an. Bei 80% der primär Behandelten gelingt es, die
Virusreplikation so stark zu unterdrücken, dass keine virale RNA im Blut nachweisbar
ist. Probleme, die sich aus der HAART ergeben, sind die zum Teil erheblichen
Nebenwirkungen, komplizierte und genau einzuhaltende Einnahme-Schemata, sowie
die Entwicklung von Resistenzen, die oft einen Therapiewechsel notwendig machen.
Die Therapie stößt deshalb bei Patienten mit ungenügender Compliance oder mit
multiresistenten Virusstämmen häufig an ihre Grenzen. Wenn die Medikamente
regelmäßig eingenommen werden und es gelingt, die Virusreplikation unter die
Nachweisgrenze zu senken, kann die Ausbildung von Resistenzen allerdings sehr
lange aufgehalten werden.
Bei der Auswahl der Medikamente müssen mehrere Faktoren berücksichtigt werden,
wie z. B. Nebenwirkungen, das Krankheitsstadium, vorhandene Resistenzen,
Begleiterkrankungen, Compliance und Lebensumstände des Patienten. Ziel der
Therapie ist es, eine möglichst vollständige Suppression der Virusvermehrung zu
erreichen und somit die Resistenzentwicklung zu verlangsamen. Dafür stehen derzeit
verschiedene Drei- und Vierfachkombinationen zur Verfügung. Üblich ist z. B. die
Einnahme von zwei NRTI in Kombination mit entweder einem NNRTI oder einem PI.
Alternativ wird häufig eine Kombinationstherapie mit drei Substanzklassen
durchgeführt (NRTI, NNRTI und PI). Um einem Wiederanstieg der Viruslast bzw.
einem Abfall der CD4-Zellzahl unter Therapie sofort durch Wechsel der Medikamente
zu begegnen, wird empfohlen, Viruslast und CD4-Werte vierteljährlich zu bestimmen.
Der Erfolg des initialen Therapieregimes sollte durch Messung dieser Parameter
bereits vier Wochen nach Therapiebeginn überprüft werden. Wenn das verordnete
Therapieschema
trotz
regelmäßiger
Medikamenteneinnahme
versagt,
sollten
möglichst alle bisher eingesetzten Medikamente ausgetauscht werden. Bei der
Auswahl der neuen Therapeutika sind, insbesondere bei mehrfach vorbehandelten
Patienten, Resistenzbestimmungen hilfreich. Ein ungenügendes Ansprechen auf die
Therapie kann auch Folge von zu niedrigen Medikamentenspiegeln sein, die
wiederum ihre Ursache in der ungenügenden gastroenteralen Resorption oder im
25
Einleitung
beschleunigten
Abbau
Empfindlichkeit
des
der
Virus
Medikamente
auf
die
haben.
Therapie
Wenn
und
trotz
erwiesener
ausreichend
hoher
Medikamentenspiegel die Viruslast nicht abfällt, sind primäre Resistenzen in Betracht
zu
ziehen.
So
verfügen
die
Wirtszellen
in
seltenen
Fällen
über
Transportmechanismen, welche die antiretroviralen Substanzen aus dem Zytoplasma
entfernen, so dass die intrazellulär wirksamen Konzentrationen nicht erreicht werden.
Während noch vor einigen Jahren die kontinuierliche Medikamenteneinnahme als
Voraussetzung für den dauerhaften Erfolg der HAART galt, wirkten sich kontrollierte
Therapieunterbrechungen in einigen Fällen, insbesondere bei Patienten, welche sich
noch im Anfangsstadium der Infektion befinden, positiv aus [Lisziewicz, 1999] [Ruiz,
2003] [Haslett, 2000]. Es wurde beobachtet, dass die Viruslast nach Unterbrechung
der HAART auf niedrigem Niveau stabil blieb und es zu einer Verbesserung der HIVspezifischen CD4- oder CD8-Immunantwort kam. Die Fallzahlen dieser Studien
waren allerdings gering. Spätere Studien mit größeren Patientenkohorten und mit
Patienten im chronischen Stadium der Infektion zeigten jedoch, dass der Setpoint der
Viruslast nur bei sehr wenigen Patienten (mit meist vorher schon niedriger Viruslast)
gesenkt wurde [Oxenius, 2002] [Fagard, 2003]. Anders als bei akut Infizierten scheint
eine Verbesserung der HIV-spezifischen Immunantwort in der Phase der chronischen
Infektion durch Therapiepausen unwahrscheinlich.
Bei langjährig therapierten Patienten mit multiresistenten Virusstämmen kann eine
Therapieunterbrechung jedoch die Vermehrung eines HAART-sensiblen WildtypVirusstammes fördern, welcher sich häufig schneller vermehrt als die mutierte
Variante und diese teilweise verdrängt. Diese Strategie wird allerdings noch
kontrovers diskutiert, da es während der Therapiepause oft zu einem ausgeprägten
CD4-Zellverlust und zu opportunistischen Infektionen kommt. Zudem können
resistente Viren in ruhenden CD4-Zellen überdauern [Izopet 2000].
In den vergangenen Jahren wurden verschiedene Studien durchgeführt, welche die
Effekte
einer
intermittierenden
Therapie
untersuchten.
Prinzip
dieser
Therapieschemata ist es, die Therapie erst beim Absinken der CD4-Werte unter 350
Zellen/μl zu beginnen und nach dem Wiederanstieg der CD4-Werte abzusetzen.
Dadurch sollten die Therapiekosten und der kumulative toxische Effekt der Therapie
verringert werden. Obwohl diese Therapiestrategie in Studien mit kleinen Fallzahlen
Erfolge zeigte, deutet die Meta-Analyse einer sehr umfangreichen Studie (SMART,
strategies of management of antiretroviral therapy) darauf hin, dass Therapiepausen
26
Einleitung
zu einem erhöhten AIDS-Risiko führen. Die Studie wurde daraufhin im Januar 2006
abgebrochen [El-Sadr, 2006].
Es wird auch in absehbarer Zeit nicht möglich sein, das Virus vollständig aus dem
Organismus zu eliminieren, da das virale Genom kovalent in die menschliche DNA
integriert ist und ruhende CD4-positive HIV-infizierte Zellen ein permanentes
Erregerreservoir
darstellen.
Einen
interessanten
Ansatz
liefert
in
diesem
Zusammenhang eine Pilotstudie mit vier HIV-infizierten Patienten [Lehrman, 2005].
Die Patienten erhielten zusätzlich zur antiretroviralen Therapie Valproat, ein
Antiepileptikum und Inhibitor der Histon-Deacetylase 1 (HDAC1). Die Blockade von
HDAC1 führte zu einer Ausschwemmung von HIV aus ruhenden T-Zellen und damit
zur Reduktion des Erregerreservoirs, ein Anspruch der von herkömmlichen HIVMedikamenten bisher nicht erfüllt werden konnte.
2.2.12.2. Entry-Inhibitoren
Einen relativ neuen Ansatz der antiretroviralen Therapie stellt die Blockierung des
Eintritts von HIV in die Zelle dar. Zum einen ist es die Bindung an den CD4-Rezeptor
bzw. an die Ko-Rezeptoren, zum anderen die Verschmelzung von Zelle und Virus,
deren Inhibierung therapeutisch genutzt werden können. Im Mai 2003 wurde in
Europa mit T-20 (Fuzeon®) die erste Substanz dieser Klasse zugelassen. Zahlreiche
weitere Substanzen befinden sich in der Entwicklung, werden jedoch nicht innerhalb
der nächsten zwei Jahre verfügbar sein. T-20 ist ein Fusionsinhibitor, ein relativ
großes Peptid, welches subkutan gespritzt werden muss. Es bindet an das HIVProtein gp41, welches für die Fusion von HIV mit der Zielzelle unerlässlich ist.
Probleme der Therapie mit T-20 sind, neben der parenteralen Applikationsform, die
enormen Therapiekosten. Auch Resistenzentwicklungen sind bereits beobachtet
worden. Daher wird die Verabreichung des Medikaments lediglich bei intensiv
vorbehandelten Patienten mit multiresistenten Virusstämmen empfohlen.
In
Phase-II-Studien
werden
derzeit
Ko-Rezeptor-Antagonisten
getestet,
insbesondere solche, die gegen den CCR5-Rezeptor gerichtet sind. Auch
monoklonale Antikörper gegen das gp120 oder den CD4-Rezeptor befinden sich
bereits in klinischen Testphasen. Obwohl die Ergebnisse der bisher durchgeführten
Studien keine dramatischen Verbesserungen der HIV-spezifischen Laborwerte
ergaben, könnten sich mit den Entry-Inhibitoren in den nächsten Jahren ganz neue,
derzeit noch gar nicht absehbare Möglichkeiten in der HIV-Therapie eröffnen.
27
Einleitung
2.2.13. Alternative Therapieansätze
2.2.13.1. Immuntherapien
In den letzten Jahren wurden zunehmend immunomodulatorische Therapiestrategien
erprobt. Ein klinischer Benefit konnte bislang allerdings noch für keine der Therapien
festgestellt werden.
Für Interleukin 2 (Proleukin®), ein von aktivierten T-Zellen produziertes Zytokin, das
die Proliferation und Zytokinproduktion von T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen anregt,
konnte zwar in mehreren Studien ein deutlicher Anstieg der CD4-positiven Zellen
gezeigt werden, der allerdings nicht mit einem Abfall der HI-Viruslast einherging
(Chun 1999, Carcelain 2003). Unklar ist nach der Studienlage außerdem, ob die
Patienten tatsächlich einen klinischen Benefit von den sehr nebenwirkungsreichen
IL-2-Kuren haben. Für einen Therapieversuch mit IL-2 kommen vor allem Patienten
mit fehlendem immunologischen Ansprechen trotz guter Virussuppression unter
HAART in Betracht.
Der schon seit vielen Jahren bekannte antivirale Effekt von Interferon wurde in
Studien getestet. Es gibt Hinweise darauf, dass die Substanz im Salvagebereich
einen Sinn haben könnte (Mildvan 1996).
2.2.13.2. Prophylaktische Vakzinierung
Das Spektrum der Vakzinestrategien gegen HIV reicht von der Verwendung von HIVPeptiden, nackter DNA, Lebendvektoren, Proteinen, Pseudovirionen, bakteriellen
oder viralen Vektoren hin bis zum möglichen Einsatz von modifizierten HIV-Isolaten.
Man geht davon aus, dass durch die Vakzinierung sowohl eine humorale als auch
eine zelluläre Immunantwort induziert werden kann. Ein Problem bei der Entwicklung
einer protektiven humoralen Immunantwort liegt jedoch einerseits in der hohen
Mutationsrate des Virus, mit z. B. einer hohen Variabilität des Hüllproteins gp120,
andererseits in der ausgeprägten Glykosylierung der Virusoberfläche, welche die
Erkennung
immunodominanter
Peptidstrukturen
erschwert.
Trotz
weltweiter
Bemühungen steht daher auch in absehbarer Zeit keine prophylaktische Impfung
gegen das HIV zur Verfügung.
2.2.13.3. Therapeutische Vakzinierung
Verschiedene therapeutische Vakzinestrategien wurden bislang mit dem Ziel
entwickelt, eine spezifische CTL-Antwort zu induzieren. Lu et al. berichteten über
28
Einleitung
eine Pilotstudie an 18 therapienaiven HIV-infizierten Patienten mit stabiler Viruslast.
Die Probanden wurden mit autologen, in vitro aus Monozyten hergestellten
dendritischen Zellen geimpft, die mit inaktiviertem autologen HIV beladen worden
waren. Es wurde ein dramatischer Abfall der Viruslast beobachtet, der bei 8
Patienten über mehr als ein Jahr anhielt. Parallel dazu konnten HIV-spezifische THelferzellen, welche Interferon und Interleukin-2 produzieren, sowie gag-spezifische
CTL nachgewiesen werden [Lu, 2004]. Diese vielversprechenden Ergebnisse lassen
weitere Studien mit "virus-gepulsten", dendritischen Zellen als therapeutische
Vakzine erwarten.
2.3. Wechselwirkungen zwischen GBV-C und HIV
Da das GB-Virus-C auf demselben Wege wie die HIV übertragen wird und sich in
HIV positiven Patientenkollektiven ein im Vergleich zur Allgemeinbevölkerung,
wesentlich höherer Prozentsatz GBV-C-Positiver befindet, stellt sich die Frage, ob
sich die beiden Viren in vivo gegenseitig beeinflussen. Die Beobachtung, dass
gleichzeitige
Infektionen
mit
anderen
Erregern
einen
Einfluss
auf
den
Krankheitsverlauf HIV-Infizierter haben können, wurde bereits in verschiedenen
Studien bestätigt. Für einige Infektionen wie z. B. den durch die Rickettsie Orienta
tstusugamishi verursachten scrub-typhus wurde eine vorübergehende Absenkung
der HIV-Last beobachtet [Watt, 2000]. Die Mehrzahl anderer Koinfektionen, wie z. B.
mit
Mycobacterium
tuberculosis,
oder
HSV-1,
scheint
jedoch
die
Krankheitsprogression zu beschleunigen [Pantaleo, 1996].
Bei parenteral HIV-Infizierten besteht häufig eine Koinfektion mit dem Hepatitis-CVirus. In Studien zum Krankheitsverlauf bei gleichzeitiger Infektion mit beiden Viren
konnte eine eindeutige Prognoseverschlechterung für die HIV/HCV-koinfizierten
Patienten gezeigt werden [Lesens, 1999] [Greub, 2000]. Nach der Entdeckung des
mit dem HCV verwandten GBV-C ergaben sich überraschenderweise bei einigen
Untersuchungen deutliche Hinweise auf einen günstigeren Krankheitsverlauf bei
gleichzeitiger Infektion durch HIV und GBV-C. Diesen Arbeiten stehen jedoch einige
klinische Studien gegenüber, in denen der positive Effekt der Koinfektion nicht
nachgewiesen wurde. Die bisher zu diesem Thema durchgeführten Untersuchungen
sind im Folgenden zusammengefasst.
29
Einleitung
2.3.1. Positiver Einfluss der Koinfektion
Eine der ersten Untersuchungen, die auf einen protektiven Effekt der GBV-CInfektion bei HIV-Infizierten hindeuteten, wurde von Heringlake et al. an 197 HIVpositiven Patienten durchgeführt. GBV-C-virämische Patienten hatten in dieser
Studie
überraschenderweise
signifikant
höhere
CD4-Werte
und
bessere
Überlebensraten als Patienten ohne den Nachweis von GBV-C-RNA [Heringlake,
1998]. In den folgenden Jahren wurden daraufhin weitere Studien durchgeführt, in
denen sich diese Beobachtungen bestätigten.
Lefrere et al. untersuchten eine Kohorte von 95 HIV-Infizierten mit bekanntem HIVSerokonversionszeitpunkt hinsichtlich ihres Krankheitsverlaufs. Drei und fünf Jahre
nach Serokonversion wurden die mittleren Werte für HIV-Last und Anzahl der CD4positiven Zellen der beiden Gruppen miteinander verglichen. Es stellte sich heraus,
dass die GBV-C-positiven Patienten zu beiden Zeitpunkten eine signifikant niedrigere
Viruslast und nach fünf Jahren auch eine signifikant höhere CD4-Zellzahl hatten als
die GBV-C negativen. Beide Gruppen unterschieden sich jedoch nicht nur bezüglich
der HIV-spezifischen Laborwerte, sondern auch hinsichtlich des klinischen Outcome.
So war der Anteil jener Patienten, die bei Studienende keine klinischen Symptome
der HIV-Infektion aufwiesen, mit 62 % bei den GBV-C-Positiven deutlich höher als in
der GBV-C-negativen Gruppe (20 %). Die Überlebensrate lag bei 100 % in der GBVC-positiven gegenüber lediglich 47 % in der negativen Gruppe [Lefrere, 1999].
Ein geringeres Risiko an AIDS zu erkranken hatten GBV-C/HIV-Koinfizierte in einer
Studie mit 131 hämophilen HIV-Patienten [Yeo, 2000]. Auch in dieser Untersuchung
waren die CD4-Werte der GBV-C-Infizierten höher als in der nicht GBV-C
exponierten Subgruppe.
Die Ergebnisse einer von Tillmann et al. veröffentlichten Studie weisen ebenfalls
darauf hin, dass eine persistierende Infektion mit dem GB-Virus-C den Verlauf der
HIV-Erkrankung positiv beeinflusst [Tillmann, 2001]. In dieser prospektiven Studie
wurden 197 HIV-infizierte Patienten untersucht. Die GBV-C virämische Kohorte wies
eine höhere Überlebensrate und ein langsameres Fortschreiten der Krankheit zum
AIDS-Stadium auf. Selbst nach der Entwicklung von AIDS war die Überlebensrate in
dieser Gruppe signifikant höher als bei den GBV-C negativen Patienten. Diese
Effekte blieben auch sichtbar, wenn die Analysen auf die Jahre nach 1996, als
HAART verfügbar war, beschränkt wurden. Darüber hinaus war die HIV-Last in der
GBV-C koinfizierten Gruppe signifikant niedriger als in der GBV-C negativen und
30
Einleitung
korrelierte invers mit der GBV-C-Last. All diese Effekte wurden lediglich bei GBV-Cvirämischen HIV-Infizierten beobachtet, nicht jedoch bei den Patienten, die
Antikörper gegen das E2-Glykoprotein des GBV-C und damit Hinweise auf eine
abgelaufene Infektion aufwiesen. Die Persistenz des Virus im Organismus schien
also die Voraussetzung für den protektiven Effekt der Ko-Infektion zu sein. Xiang et
al. kamen in einer ähnlichen, 362 Patienten umfassenden Studie vom September
2001 ebenfalls zu dem Ergebnis, dass die GBV-C-Koinfektion das Überleben HIVinfizierter Personen verlängert. Die GBV-C positive Gruppe hatte darüber hinaus
tendenziell höhere CD4-Werte [Xiang, 2001].
Eine neuere Studie bestätigt die bessere Überlebensrate dauerhaft mit dem GBV-C
Koinfizierter [Williams, 2004]. Zudem wurde auch hier 5 Jahre nach HIVSerokonversion in der GBV-C positiven Gruppe eine signifikant höhere CD4-Zellzahl
festgestellt als in der Gruppe ohne Nachweis von GBV-C-RNA. Interessanterweise
hatten in der GBV-C-negativen Gruppe diejenigen Patienten die schlechteste
Prognose, welche nach erfolgter GBV-C-Infektion das Virus eliminiert hatten.
Den Untersuchungen von Heringlake, Lefrere, Yeo, Tillmann, Xiang und Williams et
al. stehen allerdings mehrere Studien gegenüber, welche den positiven Einfluss der
GBV-C-Infektion nicht bestätigen bzw. in denen sogar negative Effekte der
Koinfektion festgestellt wurden.
2.3.2. Negativer oder neutraler Effekt der Koinfektion
In einer neueren dieser Studien [Van der Bji, 2005] zeigten sich in der GBV-Cvirämischen Gruppe zwei Jahre nach HIV-Serokonversion niedrigere CD4-Werte und
eine beschleunigte Krankheitsprogression im Vergleich zu den GBV-C-RNAnegativen Patienten. Dieser Effekt kehrte sich allerdings im Verlauf der Studie um,
und ca. 8 Jahre nach Beobachtungsbeginn zeigten die Patienten mit persistierender
GBV-C-Virämie ein geringeres Risiko, an AIDS zu erkranken bzw. zu sterben. Auch
hier wurde, wie bei Williams et al., die Beobachtung gemacht, dass diejenigen
Patienten, die zunächst GBV-C positiv waren, im weiteren Verlauf aber das Virus
eliminierten, eine schlechtere Prognose hatten, als diejenigen, welche nie GBV-Cpositiv getestet worden waren. Es bestand keine Assoziation von GBV-C-Status und
CD4-Werten bzw. HIV-Last. Ausgehend von der Annahme, dass das Flavivirus in TLymphozyten repliziert, kamen die Autoren dieser Studie zu der Schlussfolgerung,
dass die Persistenz bzw. der Verlust des GBV-C eher ein Sekundäreffekt der
zunehmenden Vernichtung dieser Zellen ist als dessen Ursache.
31
Einleitung
Eine weitere Arbeitsgruppe [Brust, 2002] fand in einer Studie mit 180 HIV-Patienten
keinen positiven Effekt des GB-Virus-C auf den Verlauf der HIV-Infektion. Die HIVLast der GBV-C-positiven unterschied sich nicht von der HIV-Last der GBV-Cnegativen Gruppe. Am Ende der Beobachtungszeit zeigte sich bei den GBV-Cpositiven Studienteilnehmern sogar ein erhöhtes Mortalitätsrisiko gegenüber den
GBV-C-Negativen.
In einer Studie von Quiros et al. zeigten sich hinsichtlich der Anzahl von Todesfällen
bzw. dem Auftreten von AIDS-definierenden Erkrankungen keine Unterschiede
zwischen der GBV-C-positiven und der GBV-C-negativen Gruppe, wobei hier die
Fallzahlen der Ereignisse in beiden Gruppen sehr klein waren (1 % bzw. ca. 4 %).
Die CD4-Werte beider Gruppen waren sowohl zu Beginn der Studie als auch 5 Jahre
später nicht signifikant verschieden [Quiros-Roldan, 2002]. In drei weiteren Studien
fand sich ebenfalls kein Effekt der GBV-C-Koinfektion auf den Verlauf der HIVInfektion bzw. auf HIV-spezifische Laborwerte [Birk, 2002] [Björkman, 2002] [Kaye,
2005].
2.3.3. Einfluss auf den Therapieerfolg
Vom Jahr 2002 an wurden mehrere Studien zu dem Einfluss der GBV-C/HIVKoinfektion auf die antiretrovirale Therapie publiziert. Auch hier waren die Ergebnisse
teilweise widersprüchlich.
Die Arbeitsgruppe von Brumme et al. erhob Daten von 461 HIV-infizierten Patienten
die zwischen Juni 1996 und August 1998 eine HAART begonnen hatten [Brumme,
2002]. Bei 90 Patienten (20,4 %) wurde GBV-C-RNA im Plasma detektiert. Die HIVViruslast in dieser Gruppe war vor Studienbeginn signifikant niedriger als in der GBVC-negativen Vergleichsgruppe und die CD4-Zellzahl etwas höher (jedoch nicht
signifikant). Beide Gruppen unterschieden sich jedoch nicht in der Zeitdauer bis zum
Erreichen
des
virologischen
Erfolges
nach Therapiebeginn
bzw.
bis
zum
virologischen Versagen der initialen Therapie. Auch die Zeitdauer bis zum
immunologischen Versagen der Therapie war in beiden Gruppen nicht signifikant
verschieden. Zu ähnlichen Ergebnissen gelangten Tillmann et al. in einer Studie mit
258 Patienten, welche keine Unterschiede zwischen GBV-C-negativen und GBV-Cpositiven Patienten hinsichtlich des immunologischen und virologischen Ansprechens
auf HAART ergab [Tillmann, 2003].
Demgegenüber stehen 5 Studien, in denen ein positiver Effekt der Koinfektion auf
den Erfolg der Therapie nachgewiesen wurde [Voirin, 2002] [Rodriguez, 2003]
32
Einleitung
[Nunnari, 2003] [Souza, 2004] [Antonucci, 2005]. Die umfangreichste dieser
Untersuchungen wurde von Antonucci et al. mit 400 Patienten durchgeführt, wobei
sich
die
GBV-C-Infektion
während
der
ersten
drei
Jahre
nicht
auf
den
therapeutischen Erfolg auswirkte. Nach Ablauf dieser Zeitspanne aber war in der
Gruppe der Koinfizierten ein signifikant geringeres Risiko des Wiederanstiegs der
HIV-Last zu verzeichnen.
Zusammengefasst kommt die Mehrzahl der zu den Wechselwirkungen von HIV- und
GBV-C-Infektion publizierten klinischen Studien zu dem Ergebnis, das die GBV-CKoinfektion das Überleben von HIV-Infizierten verlängert und die Entwicklung HIVassoziierter Erkrankungen verzögert oder zumindest den klinischen Verlauf der
Infektion nicht negativ beeinflusst. Lediglich eine Arbeitsgruppe [Brust, 2002]
beobachtete bei GBV-C-positiven HIV-Patienten eine erhöhte Mortalitätsrate.
33
Fragestellung
3. Fragestellung
Mit dieser Studie sollte der von Lefrere, Xiang, und Tillmann et al. aufgestellten
Hypothese eines positiven Einflusses der GBV-C-Infektion auf den klinischen Verlauf
der HIV-Infektion nachgegangen werden. Da die Frage des Effekts der GBV-CInfektion auf HIV-Infizierte durch die bisher zu diesem Thema durchgeführten
Untersuchungen nicht eindeutig beantwortet werden konnte, erschien es sinnvoll,
weitere Untersuchungen durchzuführen und die zentrale Fragestellung nach dem
Krankheitsverlauf um einige wesentliche Aspekte, wie den Einfluss der GBV-C/HIVKoinfektion auf den Erfolg der antiretroviralen Therapie, zu ergänzen.
Zu diesem Zweck sollten Daten einer größeren Kohorte HIV-Infizierter aus dem
Raum Freiburg erhoben werden. Aus diesen Parametern sollte eine Datenbank
erstellt und zunächst das gesamte Patientenkollektiv charakterisiert werden. Dabei
stellte sich die grundsätzliche Frage, ob die Freiburger HIV-Patienten hinsichtlich
ihres Alters, der Verteilung der Geschlechter und Risikogruppen sowie eventuell
vorhandener Ko-Infektionen mit den in anderen Studien untersuchten Patienten
vergleichbar sind.
Anschließend sollten die Blutseren der HIV-Infizierten auf das Vorhandensein von
GBV-C-RNA untersucht werden. Die Infektion mit diesem Virus war in allen bisher zu
diesem Thema durchgeführten Untersuchungen mittels konventioneller PCRVerfahren nachgewiesen worden. Diese Methoden zeichnen sich durch eine hohe
Sensitivität und Spezifität aus. Sie sind allerdings sehr zeit- und arbeitsaufwendig
und eignen sich somit schlecht als Screening-Verfahren. Zudem ist eine
Quantifizierung der GBV-C-Virämie mit der konventionellen PCR allein nicht möglich.
Die Freiburger Arbeitsgruppe Schneider et al. entwickelte 2001 einen LightCyclerAssay welcher es ermöglicht, die GBV-C-RNA in einer Real-time-PCR mit wenigen
Arbeitsschritten nachzuweisen und zu quantifizieren. Ein zweiter LightCycler-Assay,
welcher sich in den verwendeten Primern und den Reaktionsbedingungen von dem
Freiburger Assay unterscheidet, war von Tillmann et al. in Hannover entwickelt
worden. Vortests ergaben Hinweise darauf, das sich die beiden Tests hinsichtlich
34
Fragestellung
ihrer Sensitivität und Spezifität unterscheiden. In der hier vorliegenden Arbeit sollten
die beiden Assays miteinander verglichen, ferner ihre Validität und somit ihre
Verwendbarkeit als Screeningtests geprüft werden.
Nach Feststellung des GBV-C-Status der Patienten sollte die Kohorte in zwei
Untergruppen eingeteilt und die GBV-C-negativen mit den GBV-C-positiven HIVPatienten hinsichtlich des klinischen Verlaufs ihrer Erkrankung und der HIVspezifischen Laborwerte CD4-Zellzahl und HIV-Viruslast verglichen werden.
Falls das GB-Virus-C sich, wie von Tillmann et al. behauptet, günstig auf
Lebenserwartung und Laborwerte der Patienten auswirken sollte, wäre bei GBV-Cvirämischen Patienten eine langsamere Progression zu den symtomatischen
Krankheitsstadien B und C bzw. ein langsamerer Abfall der CD4-positiven Zellen zu
erwarten. Möglicherweise wäre auch bei der Betrachtung aktueller Krankheitsstadien
festzustellen, dass sich ein im Vergleich zur GBV-C-negativen Gruppe größerer
prozentualer Anteil der GBV-C positiven Patienten in den prognostisch günstigeren
klinischen Stadien A und B bzw. in den CD4-Stadien 1 und 2 befindet. Der Anteil
Langzeitüberlebender, also der Patienten, deren HIV- Erstdiagnose vor 1988 gestellt
wurde, wäre in der GBV-C-positiven Gruppe im Falle eines protektiven Effekts
möglicherweise ebenfalls höher als bei HIV-Patienten, welche nicht mit dem
Flavivirus infiziert sind.
In mehreren Studien war eine Assoziation des GBV-C-Status mit der Anzahl der
CD4-positiven Zellen bzw. der HIV-Last beschrieben worden. Um zu überprüfen, ob
dieser Zusammenhang auch für die Freiburger Kohorte zutrifft, verglichen wir die
durchschnittlichen
Werte
dieser
Parameter
in
beiden
Gruppen.
Allerdings
ermöglichen die Bestimmung und der Vergleich der mittleren Werte für HIV-Last und
CD4-Zellzahl nur generelle Aussagen über allgemeine immunologische und
virologische Situation der Patienten. Der Abfall von T-Helferzellen und die damit
verbundene Wahrscheinlichkeit an opportunistischen Infektionen zu erkranken ist
jedoch von verschiedensten Faktoren, insbesondere individuellen immunologischen
Faktoren, aber auch vor allem von der medizinischen Betreuung und der Compliance
des Patienten abhängig.
Den größten Stellenwert hat in diesem Zusammenhang zweifellos die antiretrovirale
Therapie, welche nicht nur zu einer Unterdrückung der Virusreplikation, sondern in
den meisten Fällen auch zu einer Zunahme der CD4-Zellen und zur Stabilisierung
anderer immunologischer Parameter führt. Bei der Auswertung der Daten war daher
zu beachten, dass der postulierte positive Effekt der GBV-C-Virämie durch die
35
Fragestellung
verabreichten Medikamente möglicherweise überlagert sein würde. Um den Einfluss
der antiretroviralen Therapie auf den Krankheitsverlauf auszuschließen, betrachteten
wir daher isoliert Daten (HIV-Viruslast und CD4-Werte), die vor Therapiebeginn
erhoben wurden. Sollte die GBV-C-Virämie den Verlauf der
HIV-Infektion
beeinflussen, dann müsste dieser Effekt in der therapienaiven Subgruppe besonders
deutlich werden.
Ein Aspekt, der in vor 2001 durchgeführten Studien nicht näher untersucht worden
war, war die Frage nach den Auswirkungen der GBV-C-Infektion auf den Verlauf der
HIV-spezifische Therapie. Um diesen Sachverhalt näher zu beleuchten, sollte
überprüft werden, ob sich die durchschnittliche Anzahl der verordneten Medikamente
und Substanzklassen in der GBV-C-positiven und GBV-C-negativen Gruppe
unterscheidet. Für den Fall eines protektiven Einflusses der Koinfektion wäre zu
erwarten, dass bei den GBV-C positiven Patienten eine weniger aggressive Therapie
nötig wäre, um die Replikation des HIV zu unterdrücken. Ähnliches gilt für den
prozentualen Anteil der Patienten, die keine medikamentöse Therapie benötigen.
Dieser sollte, falls die Infektion mit dem Flavivirus dazu beiträgt, Klinik und
Laborparameter zu verbessern, in der GBV-C positiven Gruppe größer sein als in der
GBV-C-negativen.
Als ein weiterer Gesichtspunkt interessierte uns die Frage, ob die GBV-C-Koinfektion mit dem virologischen und immunologischen Erfolg der Therapie assoziiert
ist. Dazu bestimmten wir in beiden Subgruppen den Anteil der Patienten, bei denen
die HIV-Replikation durch die Therapie dauerhaft unter 50 Kopien/ml gesenkt wurde,
sowie den Anteil der Patienten, deren HIV-Last niemals unter die Nachweisgrenze
abfiel. Das immunologische Ansprechen auf die Therapie sollte anhand des Anstiegs
der CD4-Zellen nach Therapiebeginn bestimmt, und in beiden Subgruppen
miteinander verglichen werden.
Mittels quantitativer Bestimmung der GBV-C-Virämie sollte außerdem untersucht
werden, ob die von Tillmann et al. beobachtete inverse Korrelation von GBV-C-Last
und HIV-Viruslast auch für unser Patientenkollektiv zutrifft. Diese Annahme ist nicht
unwahrscheinlich, da beide Viren in den gleichen Wirtszellen replizieren können und
somit die Vermehrung des GBV-C mit einer Replikationshemmung des HIV
einhergehen könnte.
Die praktische Bedeutung der Frage, ob die GBV-C-Virämie das Langzeitüberleben
HIV-positiver Personen beeinflusst, besteht darin, dass im Falle eines positiven oder
negativen Effektes die Prognose von HIV-Patienten genauer einzuschätzen und
36
Fragestellung
somit die antiretrovirale Therapie besser an das Individuum anzupassen wäre. Sollte
der protektive Effekt des GBV-C tatsächlich so stark ausgeprägt sein, wie von
Tillmann et al. vermutet, käme das Virus evtl. auch für therapeutische Zwecke bei
bisher nicht GBV-C-exponierten HIV-Patienten in Betracht. Nicht zuletzt gäbe der
Nachweis
eines
Zusammenhangs
von
GBV-C-Virämie
und
verlangsamter
Krankheitsprogression bzw. niedrigerer HIV-Last Anlass zu weiteren biologischen
Studien, durch welche neue Erkenntnisse über die Interaktionsmechanismen
zwischen beiden Viren und die Funktionsweise unseres Immunsystems gewonnen
werden könnten.
37
Material und Methoden
4. Material und Methoden
4.1. Patientendaten
Im Zeitraum von Juni 2001 bis Dezember 2001 wurden von 366 HIV-positiven
Patienten, welche an der Universitätsklinik Freiburg und in der internistischen Praxis
von PD Dr. J.-A. Rump in Freiburg betreut wurden, Proben von EDTA-Blut
entnommen. Das Blut-Plasma dieser Patienten wurde eingefroren und, nachdem die
Patienten schriftlich ihr Einverständnis erteilt hatten, auf das Vorhandensein von RNA
des GB-Virus-C untersucht.
Von Juli bis Oktober 2002 wurden retrospektiv die unten aufgeführten Parameter
erhoben. Stichtag der evaluierten Daten war der 01. Oktober 2001. Bei 20 der 366
Patienten war kein kompletter Datensatz vorhanden, weshalb diese von der Studie
ausgeschlossen wurden. Insgesamt wurden also die Daten von 346 HIV-Patienten
ausgewertet. Die Patienten waren im Verlauf ihrer Erkrankung in drei- bis
sechsmonatigen Abständen ärztlich untersucht und die klinischen Befunde,
aufgetretene Erkrankungen sowie die HIV-spezifischen Laborwerte (HI-Viruslasten
und CD4-Werte) in den Patientenakten dokumentiert worden.
Folgende
Parameter
zusammengefasst: Alter,
wurden
in
der
Geschlecht,
Basis-Datenbank
Infektionsmodus,
das
dieser
Jahr
der
Arbeit
HIV-
Erstdiagnose, das Jahr der HIV-Infektion (soweit bekannt), Ko-Infektionen mit HBV
und HCV und das Jahr des Beginns der hochaktiven antiretroviralen Therapie.
Darüber hinaus wurden folgende Parameter erfasst, um den Einfluss der GBV-CVirämie auf den Verlauf der HIV-Infektion genauer zu untersuchen: das aktuelle
klinische Krankheits- und CD4-Stadium,
sämtliche im Verlauf der Erkrankung
gemessenen CD4-Werte und HIV-Viruslasten, die Zeitpunkte des erstmaligen
Auftretens HIV- bzw. AIDS-assoziierter Erkrankungen und schließlich Medikamente
und Substanzklassen der aktuell verschriebenen antiretroviralen Therapie.
Infektionsmodi und Risikofaktoren waren homo- oder heterosexuelle Kontakte,
intravenöser Drogenmissbrauch, stattgefundene Bluttransfusionen oder Herkunft aus
38
Material und Methoden
einem Land mit hoher HIV-Prävalenz. Klinische und CD4-Stadien der HIV-Infektion
wurden nach den seit 1993 geltenden WHO-Regeln definiert. Patienten, deren HIVErstdiagnose
mindestens
14
Jahre
zurücklag
(ausgehend
vom
Jahr
der
Datenerfassung 2001), wurden als Langzeitüberlebende definiert.
Bei Patienten, in deren Krankenakten eine Angabe über das Jahr der HIV-Infektion
angegeben war (entweder als zeitlicher Mittelpunkt zwischen einem vormaligen
negativen und dem ersten positiven HIV-Test oder als der vom Patienten vermutete
Zeitpunkt der HIV-Infektion), wurde dieser Zeitpunkt als bekannter Infektionszeitpunkt
in die Datenbank eingetragen. Dies traf für 174 Patienten zu (50,2 %).
Allgemeines Therapieprinzip war die Verordnung antiretroviraler Medikamente wenn
der Patient HIV-assoziierte Erkrankungen aufwies bzw. wenn die CD4-Zellen den
Wert von 350/mm3 unterschritten. Asymptomatische Patienten mit CD4-Werten 350500/mm3 wurden therapiert, wenn sie eine hohe Viruslast (über 10000 Kopien pro
ml) hatten. Lagen die CD4-Werte über 500/mm3 und waren keine HIV-assoziierten
Erkrankungen aufgetreten, wurde in aller Regel keine antiretrovirale Therapie
verabreicht. Als frühestmöglicher Zeitpunkt des Beginns hochaktiver antiretroviraler
Therapie wurde der 1. Januar 1996 definiert, da ab diesem Zeitpunkt eine
Kombinationstherapie mit drei verschiedenen antiviralen Medikamentenklassen
möglich war. In der Zeit vor HAART stand für die HIV-spezifische Therapie lediglich
Zidovudin zur Verfügung (ab 1989), welches ab 1993 mit Didanosin oder Zalcitabin
kombiniert werden konnte. Da die Mono- bzw. die duale Therapie nur kurzzeitige
Erfolge zeigte und ihr Einfluss auf das Fortschreiten der Erkrankung somit gering
war, wurde sie bei der Auswertung der Therapiedauer nicht berücksichtigt.
4.2. Laboranalysen
4.2.1. RNA-Extraktion
Das Blutplasma der Patienten wurde bei –80°C eingefroren. Mit Hilfe des Viral RNA
Mini Spin Kits (QIAGEN) wurde anschließend die Gesamt-RNA aus den
Plasmaproben isoliert. Hierbei wurde das Virus zunächst zur Lyse in RNAseDenaturierungspuffer eingesetzt, anschließend die RNA an einen festen Träger
gebunden, mit verschiedenen Puffern gewaschen und schließlich mit sterilem,
hochgereinigtem Wasser eluiert .
39
Material und Methoden
4.2.2. Prinzip der LightCycler-PCR
Der Nachweis der GBV-C-RNA als Ausdruck einer aktiven Infektion mit dem Virus
erfolgte mittels Real-Time-PCR im LightCycler. Diese Methode ermöglicht auf
schnelle und einfache Weise nicht nur die Detektion der Virus-RNA, sondern im
gleichen Arbeitsschritt auch die Quantifizierung der Viruslast. Prinzip der LightCyclerPCR ist die Detektion von Licht einer bestimmten Wellenlänge, welches während der
Amplifikation als Folge der Spaltung von im Bereich des gesuchten Amplimers
gebundenen Proben emittiert wird.
Hierzu wird zusammen mit den PCR-Primern in der Mitte des Amplikons eine
Oligonukleotid-Probe gebunden, bei welcher die Fluoreszenz des endständigen
Fluorophors zunächst durch ein Quencher-Molekül am anderen Ende des
Oligonukleotids unterdrückt wird. Die 5´Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase
spaltet das Oligonukleotid während der Polymerisation. Dadurch werden Fluorophor
und Quencher räumlich voneinander getrennt. Bei Einstrahlung von UV-Licht entsteht
dann ein Fluoreszenzsignal, dessen Intensität der Menge an synthetisierter DNA
proportional ist.
Abbildung 14: Prinzip der LightCycler-PCR mittels Taqman-Probes.
Während der Polymerisation und nach Abspaltung des Quenchers (rot)
sendet das Fluorophor (grün) ein Fluoreszenzsignal aus.
Das Signal wird bei jedem PCR-Zyklus am Ende des Syntheseschrittes gemessen.
Wird nun die Anzahl der PCR-Zyklen gegen das Fluoreszenzsignal aufgetragen,
entsteht eine sogenannte Amplifikations-Kurve. Die folgende Abbildung zeigt die
Amplifikationskurven von vier RNA-Standards mit je 103, 104, 105 oder 106 RNAKopien/μl und einer negativen Kontrollprobe mit Wasser anstelle von Template.
40
Material und Methoden
Abbildung 15: Amplifikationskurve der RNA-Standards mit 10E6 (pink), 10E5 (grau), 10E4 (rot), 10E3
(grün) und Wasser-Kontrolle (blau)
Der Verlauf der Amplifikation wird durch die Formel:
K n=K 0×E
n
beschrieben.
Kn ist die Anzahl der RNA-Kopien der während des Zyklus n, K0 die initial eingesetzte
RNA-Menge. E entspricht der Effizienz der Amplifikation. Im Fall des Vorhandenseins
von GBV-C-RNA ist E idealerweise gleich zwei, da sich die RNA-Menge in jedem
PCR-Zyklus verdoppelt.
Das Reaktionsprofil im LightCycler hat drei Phasen: eine frühe Phase mit einer
unspezifischen Hintergrundfluoreszenz, eine exponentielle Wachstumsphase und
eine Plateauphase. Die exponentielle Wachstumsphase beginnt, wenn genügend
PCR-Produkt vorhanden ist, um einen Anstieg der Fluoreszenz über das
Hintergrundsignal zu erreichen. Der PCR-Zyklus mit diesem ersten signifikanten
Anstieg der Kurve ist der Ct-Wert (cycle threshold). Dabei sind die Ct-Werte
proportional zur ursprünglich in die Reaktion eingesetzten GBV-C-RNA-Menge.
41
Material und Methoden
Die Abbildung 16 zeigt exemplarisch eine Amplifikationskurve, bei der die Schwelle
auf den Fluoreszenzwert F1 = 0,04 festgelegt wurde. Aus dem Erscheinungsbild und
dem Anstieg der Kurven im Diagramm lässt sich auf den GBV-C-Status des
Patienten schließen, wobei kein bzw. ein stetiger, flacher Anstieg der Kurve gegen,
und ein im Idealfall logarithmischer Anstieg für das Vorhandensein von GBV-C-RNA
spricht.
Abbildung 16: Amplifikationskurven von drei stark positiven (rot, hellblau, mittelblau), einer schwach
positiven (gelb) und fünf negativen (grau, grün, dunkelblau) Serumproben. Der Schwellenwert zur
Berechnung der RNA-Konzentration liegt bei F1 = 0,04.
Neben eindeutig positiven und eindeutig negativen Amplifikationskurven, zeigten
einige Serumproben intermediäre Ergebnisse. Als stark positiv gewertet wurden
diejenigen Proben, die einen Fluoreszenzwert F1 von mindestens 0,04 erreichten
und bei denen die grafische Darstellung einen mehr als linearen Anstieg zeigte.
Proben, deren Kurve zwar parabelförmig verlief, jedoch nicht den Wert F1 = 0,04
erreichte wurden als schwach positiv gewertet, Proben mit einem stetigen Anstieg
der Kurve mit Erreichen des Fluoreszenzwertes von F1 = 0,04 als nicht eindeutig
negativ. Als eindeutig GBV-C negativ definiert wurden schließlich alle Proben, deren
grafische Darstellung nicht überlinear waren, und die nie einen Fluoreszenzwert von
0,04 erreichten.
42
Material und Methoden
4.2.3. Quantifizierung der GBV-C-RNA
Anhand der bei jedem LightCycler-Lauf mitgeführten RNA-Standards von 103 bis 106
Kopien/μl wurde eine Eichkurve erstellt, anhand derer die ursprüngliche RNAKonzentration der zu testenden Proben ermittelt werden konnte. Die Konzentration
der ursprünglich eingesetzten Menge der Standard-RNA wurde in logarithmischer
Skalierung als Wert auf die x-Achse aufgetragen, die der PCR-Zyklus bei Erreichen
des Fluoreszenzwertes F1 auf die y-Achse.
Die folgende Eichkurve ergibt sich aus den Daten der in Abbildung 15 dargestellten
Amplifikationskurven der RNA-Standards.
Abbildung 17: Standard-Eichkurve der RNA-Proben aus Abbildung 15
Wie bereits erwähnt, kann die Amplifikation der GBV-C-RNA mittels der Gleichung
K =K 0×E
F1
beschrieben werden. Zur Bestimmung der Effizienz des jeweiligen LightCyclerLaufes wird die Formel nach E umgestellt:
log E =
log K −log K 0 
F1
Ist die Effizienz der Amplifikation bekannt, lässt sich nun die gesuchte RNAKonzentration der Serumproben ermitteln. Da E zwischen den einzelnen LightCyclerLäufen gering variiert, wurden in jedem Lauf RNA-Standards mitgeführt und die
jeweilige Eichkurve für jeden Lauf neu erstellt.
43
Material und Methoden
4.2.4. Durchführung der LightCycler-PCR
Für die LightCycler-Reaktion kamen zwei Assays mit jeweils unterschiedlicher
Sensitivität und Spezifität zum Einsatz: ein von der Arbeitsgruppe Dr. Schneider/ Dr.
Weidmann/ C. Feil in Freiburg etablierter Assay und ein von der Arbeitsgruppe
Tillmann et al. in Hannover entwickelter LightCycler-Assay (im folgenden als
Freiburger
bzw.
als
Hannoveraner
Test
bezeichnet).
Alle
in
der
Studie
aufgenommenen Patienten wurden mit beiden Assays auf GBV-C-RNA untersucht.
In beiden Tests wird ein Fragment aus der 5’UTR-Region der Virus-RNA amplifiziert.
Sie unterscheiden sich jedoch in der Art der verwendeten Primer und Probes sowie
in der Länge des amplifizierten Fragments, wobei das im Freiburger Test
synthetisierte Amplicon kürzer ist (ca. 80 NT) und komplett innerhalb des
Hannoveraner Amplicons (256 NT) liegt. Außerdem werden beide Tests mit jeweils
unterschiedlichen Reaktions-Kits durchgeführt.
4.2.4.1. Beschreibung des Hannoveraner Tests
Verwendeter Reaktions-Kit: LightCycler RNA Amplification Kit Hybridisation Probes
(Roche) Cat.No. 2015145
Primer:
C3: 5`-CCCACTGGTCYTTGYCAACTC
C4: 5`-AATCCCGGTCAYCYTGGTAGCCACT
Probe:
5`-FAM-AATAAGGGCCCGACGTCAGGCTC-TAMRA-3
(Abkürzungen für degenerierte Basen: Y = T und C zu je 50%)
Zusammensetzung des Mastermix:
Stammlösung
H2O
MgCl2 25 mM
Reaktion Mix
Primer C3
Primer C4
Probe
Enzym Mix
Summe
Einfachansatz (µl)
5,6
2
4
1
1
1
0,4
15
44
Endkonzentration
2,5 mM
1x
300 nM
300 nM
40 nM
1x
Material und Methoden
Die Reagenzien wurden auf Eis gekühlt und gemischt. In jede LightCycler-Kapillare
wurden 15 µl des Mastermix pipettiert und anschließend je 5 µl der extrahierten
Virus-RNA hinzugefügt, so dass sich insgesamt 20 µl in jedem Reaktionsansatz
befanden. Nach Zentrifugation der Ansätze wurde die Real-time PCR mit folgendem
Temperaturprofil im LightCycler-1 (Roche) durchgeführt:
Vorgang
Temperatur
Zeit
Reverse Transkription
55°C
30 min
Denaturierung/Aktivierung
95°C
30 sec
Amplifikation (50 Zyklen)
95°C
56°C
72°C
5 sek
15 sek
13 sek
Abkühlen
40°C
30 sek
Parallel zu den zu untersuchenden Proben wurden bei jedem LightCycler-Lauf RNAStandards (103, 104, 105, 106) zur Kalibrierung sowie eine Null-Probe (H2O)
mituntersucht.
4.2.4.2. Beschreibung des Freiburger Tests
Verwendeter Reaktions-Kit: LightCycler-RNA Master Hybridisation Probes (Roche)
Cat. No. 3018954
Primer:
LC1: 5`-CAGGTGTTGGCCCTACCG
LC2: 5`-CGTACGTGGGCGTCGTT
Probe:
TIB-1: 5`-6FAM-AATAAGGGCCCGACGTCAGGCTCTAMRA
Im Unterschied zu dem im Hannoveraner-Test verwendeten enthält dieser Kit nur ein
Enzym: eine Tth-Polymerase aus Thermus thermophilus, welche drei Aktivitäten
besitzt: Reverse-Transkriptase-, DNA-Polymerase-und 5´Exonuklease-Aktivität .
45
Material und Methoden
Mastermix:
Stammlösung
2,7 x Puffer und Enzym
Mn(OAc)2 50mM
H2O
Primer GBV-LC1
Primer GBV-LC2
Probe
Summe
Einfachansatz (µl)
7,4
1,3
3,9
1
1
0,4
15
Endkonzentration
1x
3,25 mM
500 nM
500 nM
200 nM
Wie im zuvor beschriebenen Hannoveraner Test erfolgte auch hier zunächst die
Pipettierung des Mastermix (je Kapillare 15 µl), anschließend das Hinzufügen von je
5 µl RNA. RNA-Standards und Nullprobe wurden in jedem LightCycler-Lauf als
Kontrollen mitgeführt.
Temperaturprofil für die RT-PCR:
Vorgang
Temperatur
Zeit
Reverse Transkription
61°C
20 min
Denaturierung/Aktivierung
95°C
5 min
Amplifikation (45 Zyklen)
92°C
60°C
60°C
15 sek
15 sek
15 sek
Abkühlen
40°C
30 sek
4.2.5. Nested-RT-PCR
In den Fällen, bei denen die Ergebnisse beider LightCycler-Assays diskordant, nur
schwach positiv, bzw. nicht eindeutig waren, wurden die Proben nochmals mittels
konventioneller PCR in Form einer Nested-RT-PCR untersucht. Wir verwendeten
dazu die gleichen Reagentien und Reaktionsbedingungen wie bereits von Tillmann et
al. beschrieben [Tillmann, 2001].
46
Material und Methoden
4.2.5.1. Durchführung der Nested-RT-PCR
Verwendeter Kit: Titan One Tube RT-PCR System (ROCHE DIAGNOSTICS GmbH)
Primer:
C1: 5`-ATGCCACCCGCCCTCACCCGAA (2pmol/µl)
C2: 5`-AAAGGTGGTGGATGGGTGATG (2pmol/µl)
C3: 5`-CCCCACTGGTCYTTGYAACTC (2pmol/µl)
C4: 5`-AATCCCGGTCAYAYTGGTAGCCACT (2pmol/µl)
(Abkürzung für degenerierte Basen: Y = C/T zu je 50%)
Der Kit enthält AMV-RT (Reverse Transkriptase aus Avian Myeloblastosis Virus) für
die Erststrang-Synthese. Für die DNA-Amplifikation wird ein Gemisch aus TaqPolymerase und einer korrekturlesefähigen Polymerase eingesetzt.
Mastermix 1, Runde 1:
Stammlösung
dNTP (10 mM)
Primer C1 (2 µM)
Primer C2 (2 µM)
DTT (100 mM)
RNAse-Inhibitor (40 U/µl)
Summe
Einfachansatz (µl)
1
5
5
2,5
1,5
15
Endkonzentration
200 µM
200 nM
200 nM
50 mM
Die Reagenzien wurden gemischt und anschließend je 15 µl des Mastermix mit 10 µl
RNA in ein Tube pipettiert.
Mastermix 2, Runde 1:
Stammlösung
H2O
5x RT-PCR-Puffer mit
MgCl2
Enzym-Mix
Summe
Einfachansatz (µl)
14
10
1
25
47
Endkonzentration
1,5 mM
Material und Methoden
Zunächst wurden die Reagenzien von Mastermix 1 und 2 jeweils getrennt gemischt
und gekühlt. Anschließend wurden Mastermix 1 und 2 in einem PCR-Tube zu
insgesamt 50 µl vermischt und mit 30 µl Mineralöl bedeckt.
Die 1. Runde der PCR wurde mit folgendem Temperatur-Profil in einem
Thermocycler von Perkin-Elmer durchgeführt:
Vorgang
Temperatur
Zeit
Reverse Transkription, 1x
50°C
30 min
Denaturierung/Aktivierung, 1x
94°C
3 min
Amplifikation (35 Zyklen)
94°C
55°C
68°C
30 sek
30 sek
1 min
Prolongierte Elongation, 1x
68°C
5 min
Das in der ersten Runde amplifizierte Produkt wurde nun mit anderen Primern in
einer zweiten PCR-Runde eingesetzt.
Mastermix Runde 2:
Stammlösung
dNTP (10mM)
Primer C3 (2 pmol/µl)
Primer C4 (2 pmol/µl)
MgCl2
Puffer
H2O
Taq-Polymerase
Summe
Einfachansatz (µl)
5
5
Endkonzentration
1 mM
200 µM
5
5
5
19,8
0,3
200 µM
45,1
Im PCR-Tube wurden je 5 µl der in Runde 1 amplifizierten DNA mit je 45 µl des
Mastermix gemischt und mit 30 µl Öl bedeckt.
48
Material und Methoden
Die 2. Runde der PCR wurde mit folgendem Temperatur-Profil durchgeführt:
Vorgang
Temperatur
Zeit
Denaturierung/Aktivierung, 1x
94°C
3 min
Amplifikation (35 Zyklen)
94°C
55°C
72°C
45 sek
30 sek
1 min
Prolongierte Elongation, 1x
72°C
5 min
4.2.5.1. Agarose-Gelelektrophorese zum Nachweis des Amplimers
Verwendete Chemikalien/Lösungen:
Agarose (GIBCO BRL)
Ethidiumbromid (Boehringer)
1x TAE-Puffer: 4,84 g/l Tris-Base
1,142 ml/l Eisessig
0,744 g/l Na2EDTA 2H2O
Ladepuffer:
50,0% (v/v) Glycerin
10,0 mM Tris/HCl, pH8,0
0,05 mM EDTA, pH8,0
0,05 % (w/v) Bromphenolblau
Zur Herstellung des einprozentigen Gels wurden 0,7 g Agarose in einen
Erlenmeyerkolben eingewogen und in 70 ml 1-fach TAE suspendiert. Die Agarose
wurde in einem Mikrowellengerät aufgekocht, bis sie vollständig aufgelöst war. Nach
Abkühlung auf ca. 70°C wurden 2 µl Ethidiumbromid (1 %) dazugegeben.
Anschließend wurde die noch flüssige Agarose in einen Trog gegossen, der an den
beiden offenen Seiten mit Klebeband abgedichtet war. Ein Probenkamm wurde
eingesteckt, um die Geltaschen auszusparen. Nach Erstarren des Gels wurden das
Klebeband
und
der
Probenkamm
entfernt.
Das
Gel
kam
Elektrophoresekammer, die mit 1-fach TAE bis über das Gel aufgefüllt wurde.
49
in
die
Material und Methoden
Je 1 µl des DNA-Produktes der RT-PCR wurden mit je 5 µl Ladepuffer gemischt und
in die zuvor mit TAE-Puffer gespülten Probentaschen pipettiert. Die Trennung erfolgte
in der Horizontalelektrophoresekammer (Biorad) bei 100 Volt für ca. eine Stunde.
Das Bandenmuster wurde unter UV-Licht (254 nm) sichtbar, und mittels eines
Videokamerasystems (Panasonic) als Ausdruck dokumentiert.
Um die Länge des amplifizierten Fragments abschätzen zu können, wurden neben
den DNA-Proben und der Nullprobe (H2O) 1-kb-Referenzunukleotide (GIBCO BRL)
als Marker in der Elektrophorese mitaufgetrennt. Die folgende Abbildung zeigt
exemplarisch die mittels Gel-Elektrophorese bei 7 von 16 getesteten Serumproben
nachgewiesene GBV-C-RNA.
Abbildung 18: Nachweis des PCR-Produktes mittels
Gelelektrophorese; 1-3:Nullprobe und Referenz-Nukleotide; die
Proben 6,8,10,11,12,13 und 18 sind GBV-C-positiv
4.3. Statistische Analysen
Patienten bei denen in beiden LightCycler-Tests GBV-C-RNA nachgewiesen wurde,
gelten als GBV-C-positiv, Patienten deren beide Tests negativ waren, als GBV-Cnegativ. Waren die Ergebnisse der LightCycler-Tests nicht übereinstimmend, wurde
zum Nachweis bzw. Ausschluss der GBV-C-Infektion eine Nested-PCR durchgeführt,
ebenso, wenn die Ergebnisse eines der Tests nur schwach positiv oder nicht
eindeutig negativ waren. Auf diese Weise wurden eine GBV-C-virämische und eine
GBV-C-negative Subkohorte gebildet, deren Daten wir separat auswerteten.
50
Material und Methoden
HIV-Last und CD4-Zellzahl der Patienten waren in drei- bis sechsmonatigen
Abständen bestimmt worden. Die mittlere CD4-Zellzahl wurde aus allen über den
gesamten Beobachtungszeitraum gemessenen Werten ermittelt. Die Bestimmung
der HIV-Last war ab 1996 erfolgt. Auch hier ergab sich die mittlere HIV-Last aus allen
im Beobachtungszeitraum dokumentierten Werten.
Der zeitliche Verlauf von CD4-Zellabfall und klinischer Krankheitsprogression wurde
mit Hilfe von Kaplan-Meier-Überlebenskurven dargestellt. Dabei wurde das
Fortschreiten der Infektion zunächst für sämtliche GBV-C-positiven bzw. -negativen
Patienten dargestellt. Die gleiche Analyse wurde anschließend für eine Subgruppe
von Patienten mit bekanntem HIV-Infektionszeitpunkt durchgeführt.
Durch die Bildung zweier Untergruppen sollte der Einfluss der antiretroviralen
Therapie auf das Ergebnis minimiert werden. Bei einer Untergruppe von Patienten,
welche keine HAART erhalten hatten, deren HIV-Infektionszeitpunkt bekannt war und
bei denen zumindest drei Messungen der CD4-Zellen erfolgt waren, bestimmten wir
die Steilheit des Abfalls der CD4-positiven Zellen über die Zeit. In einer weiteren
Untergruppe therapienaiver Patineten wurden die 5 Jahre nach bekanntem HIVInfektionszeitpunkt gemessenen CD4-Werte GBV-C-Positiver und GBV-C-Negativer
miteinander verglichen.
Die statistische Auswertung der Daten wurde von Prof. Dr. Schulte-Mönting an der
Abteilung für medizinische Informatik der Universität Freiburg im Breisgau unter
Verwendung von SAS-Software durchgeführt. Für Vergleiche der kategorischen
Daten kamen Fishers`s-exact-test und Chi-square-test zur Anwendung, für
Vergleiche kontinuierlicher Daten der Wilcoxon-Rangsummen-Test. Bei p-Werten
kleiner als 0,05 wurden die beobachteten Unterschiede als statistisch signifikant
gewertet.
51
ERGEBNISSE
5. ERGEBNISSE
5.1. Ergebnisse der Laboranalysen
Insgesamt wurde von 366 Patienten je eine Blut-Plasmaprobe mit den beiden oben
beschriebenen Assays auf das Vorhandensein von GBV-C-RNA getestet. In
Zusammenschau der Ergebnisse von Real-Time-PCR und konventioneller PCR
ergab sich für die Kohorte von 366 HIV-infizierten Patienten ein Endergebnis von 87
GBV-C-positiven (entsprechend 23,8 %) und 279 GBV-C-negativen (entsprechend
76,2 %) HIV-Infizierten.
5.1.1. Hannoveraner Assay
Der Hannoveraner LightCycler-Assay (HA) detektierte in 95 der 366 Proben GBV-CRNA, was einem Anteil GBV-C Koinfizierter an der Gesamtkohorte von 25,9 %
entspricht. Davon waren 58 Proben stark und 37 Proben schwach positiv.
In 271 der 366 Plasmaproben fand sich im HA keine GBV-C-RNA (74 % GBV-CNegative). Davon waren 225 Proben eindeutig, 46 nicht eindeutig negativ.
5.1.2. Freiburger Assay
Im Freiburger LightCycler-Assay (FA) waren 58 der 366 Proben GBV-C-RNA positiv,
308 -negativ. Das entspricht einem Anteil von 15,9 % GBV-C-Positiven und 84,1 %
GBV-C-Negativen in der untersuchten Kohorte. Die Ergebnisse dieses Tests waren
jeweils entweder eindeutig positiv bzw. eindeutig negativ.
Die
Ergebnisse
beider
LightCycler-Assays
zusammengefasst:
52
sind
in
der
folgenden
Tabelle
ERGEBNISSE
HA stark
positiv
HA
schwach
positiv
HA nicht
eindeutig
negativ
HA
eindeutig
negativ
Gesamt
FA positiv
47
10
0
1
58
FA negativ
11
27
46
224
308
Gesamt
58
37
46
225
366
Tabelle 1: Ergebnisse der LightCycler-Assays
5.1.3. Nested-PCR
In 85 Fällen wurde der endgültige Nachweis bzw. Ausschluss der GBV-C-Virämie
mittels Nested-PCR durchgeführt. Insgesamt waren 30 dieser Proben positiv und 55
negativ für GBV-C-RNA.
Bei allen Plasmaproben, welche im HA stark positiv und im FA negativ waren (11 von
366 Seren), konnte in der konventionellen PCR GBVC-RNA nachgewiesen werden.
Von den 27 Proben, welche im HA schwach positiv und im FA negativ waren, waren
in der Nested-PCR 13 GBV-C positiv.
Bei 46 der Proben ergab sich in den LightCycler-Tests folgende Konstellation: nicht
eindeutig negativ im HA und negativ im FA. In dieser Gruppe identifizierte die
Nested-PCR 4 GBV-C positive Seren.
In dem einzigen Fall, bei dem der HA eindeutig negativ, der FA jedoch positiv war,
ergab die Nested-PCR ein positives Ergebnis. Bei der sonst höheren Sensitivität des
HA sticht diese reproduzierbare Beobachtung heraus. Darüber hinaus gab es keinen
Fall, in dem der HA negativ, bzw. nicht eindeutig negativ war und der FA ein positives
Ergebnis gezeigt hätte.
53
ERGEBNISSE
Ha.-Test positiv
Ha.-Test negativ
Fr.-Test Fr.-Test Gesamt
Nicht
positiv negativ
Stark Schwach eindeutig Eindeutig
positiv positiv negativ negativ
82
5
Endergebnis
58
29
87
Positiv
58
24
4
1
13
Endergebnis
Negativ
Gesamt
Sensitivität
des Tests
Spezifität
des Tests
0
266
13
42
0
279
279
58
308
366
224
95
271
94,3 %
66,7 %
95 %
100 %
Tabelle 2: Zusammenfassung der Testergebnisse aus FA, HA und Nested-PCR
5.1.4. Sensitivität und Spezifität der LightCycler-Assays
5.1.4.1. Sensitivität und Spezifität des Hannoveraner Assays
Von den 87 im Endergebnis positiven Proben wurden im HA 82 richtig als positiv
erkannt. Somit beträgt die Sensitivität dieses Tests ca. 94,3 %. Bei fünf der in diesem
Test negativen Proben konnte mittels Nested-PCR GBV-C-RNA nachgewiesen
werden. Zu beachten ist, dass der überwiegende Teil dieser falsch negativen
Plasmaproben nicht eindeutig negativ war (vier von fünf Proben, welche in der
graphischen Darstellung zwar den Grenzwert F1 überschritten, jedoch keine
Parabelform aufwiesen). Lediglich eine der fünf falsch negativen Proben ergab im HA
ein eindeutig negatives Ergebnis.
Von den 279 im Endergebnis negativen Samples wurden 266 im HA richtig als
negativ erkannt. Die Spezifität des Assays beträgt somit ca. 95 %. Von 95 im HA
positiven Plasmaproben waren 13 falsch positiv. Sämtliche falsch positiven
Ergebnisse stellten sich in den Real-Time-PCR-Kurven als schwach positiv dar (mit
einer
parabelförmigen
Kurve,
jedoch
ohne
den
Fluoreszenzwert
F1
zu
überschreiten). Alle stark positiven Patientenseren waren auch im Endergebnis
54
ERGEBNISSE
positiv. Von insgesamt 37 schwach positiven Proben waren 24 (entsprechend 65 %)
richtig positiv.
5.1.4.2. Sensitivität und Spezifität des Freiburger Assays
Der FA identifizierte von 87 im Endergebnis positiven Proben lediglich 58 als richtig
positiv, entsprechend einer Sensitivität von 66,7 %. Es wurden 29 GBV-C positive
Serumproben im FA nicht erkannt. Allerdings waren alle mit diesem Verfahren positiv
getesteten Seren auch im Endergebnis positiv, der Freiburger Assay lieferte also im
Gegensatz zum Hannoveraner Assay keine falsch positiven Ergebnisse. Seine
Spezifität beträgt 100 %.
5.1.5. Quantifizierung der GBV-C-RNA
5.1.5.1. Hannoveraner Assay
Die mittlere Anzahl der RNA-Kopien aller GBV-C-positiver Proben betrug im HA
20935,06 Kopien pro μl mit einem Maximum von 697437,22/μl und einem Minimum
von 0,62 Kopien/μl (Median 4728/μl; SD=73872,12).
In der separaten Analyse der schwach positiven Proben ergab sich eine mittlere
RNA-Kopienzahl von 4131/μl mit maximal 76929,15/μl und minimal 0,62/μl (Median
544,93/μl; SD 12809,62). Der Mittelwert aller stark positiven Seren lag bei 31842,58
Kopien/μl mit einem Maximum von 697437,22/μl und einem Minimum von 189,35/μl
(Median 13185,69/μl; SD 92685,71).
Die Anzahl der RNA-Kopien der schwach positiven Proben war signifikant niedriger
als die mittlere Kopienzahl aller HA-positiven Proben (Wilcoxon-Rangsummentest,
p = 0,0001).
5.1.5.2. Freiburger Assay
Die mittlere Anzahl an RNA-Kopien betrug im FA 1743757,22 pro μl mit einem
Maximum von 64000000/μl und einem Minimum von 14 Kopien/μl (Median=11800/μl,
SD=10376050,01).
5.1.5.3. Vergleich der Anzahl der RNA-Kopien
Der Vergleich der RNA-Quantifizierung beider Assays ergab keine signifikanten
Unterschiede zwischen den RNA-Kopienzahlen von HA und FA (WilcoxonRangsummentest, p = 0,18).
55
ERGEBNISSE
Die mittlere RNA-Kopienzahl jener Proben, welche im HA positiv und im FA negativ
waren, betrug 9957,85 pro μl (Median=788,98/μl; SD=29184,51; maximal 163819,82,
minimal 77,98). Die GBV-C-Last der vom HA zusätzlich erkannten Proben war
signifikant niedriger als die GBV-C-Last sämtlicher im HA positiv getesteten Proben
(Wilcoxon-Rangsummentest, p = 0,0041).
5.2. Charakterisierung der Gesamt-Kohorte
Von den in die Auswertung der Daten einbezogenen 346 Patienten wurden 82 positiv
auf GBV-C-RNA getestet, 264 waren GBV-C-negativ. Dies entsprach einem Anteil
von 23,7 Prozent GBV-C-virämischen Individuen an der Gesamtkohorte. Die
Beobachtungszeit in der Kohorte reichte von 3 Monaten (HIV-Diagnose im Juni 2001)
bis zu 20 Jahren (bei der am weitesten zurückliegenden HIV-Diagnose 1983). Die
mittlere Beobachtungszeit der Kohorte betrug 8,8 Jahre.
5.2.1. Grundcharakteristika
Das mittlere Alter der Patienten betrug 41,3 Jahre (SD = 10,2). Ungefähr ein Drittel
der HIV-Infizierten waren weiblich (32,1 %). Bei den Infektionsmodi war die sexuelle
Übertragung von HIV wesentlich häufiger als die parenterale (79,2 % vs. 20,8 %),
wobei der Anteil heterosexuell infizierter Personen den der homosexuell Infizierten
um 2,6 % übertraf (34,1 % versus 31,5 %).
5.2.2. WHO-Stadien
Ungefähr ein Drittel der Patienten (32,4 %) wies keine klinischen Symptome einer
eingeschränkten Immunität auf (WHO-Stadium A). Der Großteil (44,5 %) befand sich
zum Zeitpunkt der Datenerhebung bereits in einem symptomatischen Stadium der
HIV-Infektion, in dem allerdings noch keine schweren opportunistischen Infektionen
aufgetreten waren (WHO-Stadium B). Bei 23,1 % der Untersuchten war es bereits zu
AIDS-definierenden Erkrankungen gekommen (WHO-Stadium C). Insgesamt waren
also ca. drei Viertel der HIV-Infizierten nicht oder nur leicht symptomatisch, während
sich ein Viertel der Patienten in einem weit fortgeschrittenen klinischen Stadium der
HIV-Infektion befand.
Bei der Betrachtung der CD4-Zellstadien zeigt sich innerhalb der Gesamtkohorte
eine andere Verteilung. Hier befand sich fast die Hälfte der Patienten (47,4 %) im
56
ERGEBNISSE
prognostisch ungünstigsten CD4-Stadium 3 (CD4-Zellen < 200/µl). Der Anteil von
Patienten im Stadium 2 mit CD4-positiven Zellen von 200-500/µl war mit 41,6 % fast
eben so hoch. Lediglich bei 11 % des Gesamtkollektivs lag die T-Helfer-Zellzahl noch
im Normbereich.
5.2.3. Hochaktive antiretrovirale Therapie
Der überwiegende Teil der Patienten (91,9 %) war antiretroviral behandelt worden.
Die mittlere Therapiedauer betrug 47 Monate (SD = 35,1). Lediglich 8,1 % der
Patienten wurden nie spezifisch therapiert, entweder weil die Indikation zu
antiretroviralen Medikamenten nicht gegeben war, oder die Patienten sich einer
Therapie verweigerten. Der Anteil Untherapierter war dabei eng mit dem Anteil der
Patienten, welche sich im CD4-Stadium 1 befanden und bei denen somit keine
Therapieindikation bestand, assoziiert.
Die Mehrzahl der Patienten (55,9 %) erhielt eine Kombinationstherapie mit drei
verschiedenen Wirkstoffen. Bei ca. 26 % der Therapierten wurde eine HAART mit 4
Wirkstoffen durchgeführt und 6 % der Patienten erhielten 5 verschiedene
Medikamente. Ein geringer Anteil von 0,6 % wurde mit 6 verschiedenen Substanzen
therapiert.
Bezüglich der verschriebenen Substanzklassen ergab die Auswertung der Daten
folgendes Bild: Bei 76,6 % der Gesamtkohorte kamen Medikamente aus zwei
verschiedenen Substanzklassen zum Einsatz (NRTI+NNRTI oder NRTI+PI), 9,5 %
der Patienten wurden mit Medikamenten aus einer Substanzenklasse therapiert
(NRTI) und 4,1 % erhielten Medikamente aus drei verschiedenen Substanzklassen
(NRTI/NNRTI/PI).
Die folgende Tabelle fasst die Charakteristika der Gesamtkohorte noch einmal
zusammen.
57
ERGEBNISSE
Anzahl der Patienten
Prozent
GBV-C-Status:
positiv
negativ
82
264
23,7 %
76,3 %
235
111
67,9 %
32,1 %
118
109
65
47
7
34,1 %
31,5 %
18,8 %
13,6 %
2,0 %
112
154
80
32,4 %
44,5 %
47,4 %
38
144
164
11,0 %
41,6 %
47,4 %
28
318
8,1 %
91,9 %
Geschlecht:
männlich
weiblich
Infektionsmodus:
heterosexuell
homosexuell
i.v. Drogenmissbrauch
Hochrisiko-Gebiet
Transfusion
Klinisches Stadium:
A
B
C
CD4-Stadium:
1
2
3
Antiretrovirale Therapie:
Keine HAART
HAART
Tabelle 3: Charakteristika der Gesamtkohorte
5.3. Vergleich GBV-C-positiver und GBV-C-negativer Patienten
5.3.1. Grundcharakteristika
Bei der für beide Gruppen separaten Auswertung nach Alter, Geschlecht, Infektionsund Therapiedauer und Hepatitis-Koinfektionen fielen leichte Unterschiede zwischen
der GBV-C-positiven und -negativen Gruppe auf, die jedoch bei keinem der
Parameter statistische Signifikanz erreichten.
58
ERGEBNISSE
Geringe, nicht signifikante Unterschiede zwischen den beiden Subkohorten fanden
sich hinsichtlich des Alters, der Geschlechterverteilung und der Ko-Infektion mit HCV.
Tendenziell war die GBV-C-positive Gruppe etwas jünger als die GBV-C-negative (39
Jahre vs. 41 Jahre). Der Frauenanteil war bei den GBV-C-positiven Patienten
geringer (25 % vs. 34 %) und der Anteil mit Hepatitis C Infizierter höher als bei den
GBV-C-negativen (23,2 % vs. 15,2 %). In den für die aktuelle klinische Situation der
HIV-Infizierten wesentlichen Parametern Infektions- und Therapiedauer ließen sich
praktisch keine Unterschiede feststellen. Auch die prozentualen Anteile chronisch
HBV-Infizierter in beiden Gruppen unterschieden sich nicht signifikant.
Bei der Verteilung der Infektionsrisiken ergaben sich für beide Gruppen allerdings
signifikante Unterschiede (p=0,04). So waren 20,3 % der heterosexuell infizierten
Patienten GBV-C-positiv. Innerhalb der Gruppe homosexuell Infizierter lag dieser
Anteil etwas höher bei 23,8 %. Besonders deutlich werden die Unterschiede, bei der
Betrachtung der durch intravenösen Drogenabusus infizierten Patienten, von denen
36,9 % GBV-C-positiv waren. HIV-Infizierte aus Endemiegebieten waren dagegen mit
einem Anteil GBV-C-Positiver von 12,8 % deutlich weniger oft koinfiziert als jene, die
aus Europa stammten.
Die unterschiedlichen Anteile GBV-C-Positiver und GBV-C-Negativer innerhalb der
einzelnen Risikogruppen sind Abbildung 19 grafisch dargestellt.
Anteil GBV-C-Positiver und GBVC-Negativer innerhalb der Risikogruppen
100,00%
90,00%
80,00%
70,00%
60,00%
GBV-C-negativ
GBV-C-positiv
50,00%
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
Heterosexuell
Homosexuell
IVDU
Endemiege-
Hämophilie
Abbildung 19: Anteil GBV-C-Positiver und GBV-C-Negativer an den einzelnen Risikogruppen
59
ERGEBNISSE
Die folgende Tabelle fasst die Grundcharakteristika der GBV-C-positiven und der
GBV-C-negativen Gruppe noch einmal zusammen.
GBV-C-positiv
n=82
GBV-C-negativ
n=264
p
(Chi-Square-Test)
39,60 ± 9,23
41,89 ± 10,39
0,07
61 (74,4 %)
21 (25,6 %)
174 (65,9 %)
90 (34,1 %)
0,10
Infektionsdauer
ab
HIV-ED (Jahre)
8,65 ± 5,52
8,87 ± 5,26
0,80
Therapiedauer
(Jahre)
3,65 ± 2,87
3,78 ± 2,93
0,56
HBV positiv
7 (8,5 %)
15 (5,7 %)
0,36
HCV positiv
19 (23,2 %)
40 (15,2 %)
0,09
Mittl. Alter (Jahre)
Geschlecht:
männlich
weiblich
Infektionsmodus:
heterosexuell
homosexuell
i.v. Drogenabusus
Endemiegebiet
Hämophilie
0,04
24 (20,3 %)
25 (23,8 %)
24 (36,9 %)
6 (12,8 %)
2 (28,6%)
94 (79,7 %)
83 (76,2 %)
41 (63,1 %)
41 (87,2 %)
5 (71,4 %)
Tabelle 4: Vergleich der Grundcharakteristika GBV-C-Positiver und GBV-C-Negativer
60
ERGEBNISSE
5.3.2. Klinischer Verlauf der HIV-Infektion
5.3.2.1. WHO-Stadium
Bei der Betrachtung des klinischen Stadiums der Patienten in der GBV-C-positiven
bzw. in der GBV-C-negativen Subgruppe fielen tendenzielle Unterschiede bezüglich
der prozentualen Verteilung der WHO-Stadien auf. So waren etwa 38 % der
koinfizierten Patienten bisher symptomfrei (Stadium A), während dies nur für ca. 31
%
der
GBV-C-negativen
Patienten zutraf. Der Anteil
von
im
WHO-Stadium
B
befindlichen Patienten war in
der koinfizierten Gruppe mit
36,5 % geringer als in der
GBV-C-negativen (46,9 %).
Allerdings befanden sich in
der GBV-C-positiven Gruppe
etwas mehr Patienten im Abbildung 20: Prozentualer Anteil der klinischen WHO-Stadien in
prognostisch
ungünstigen
der GBV-C-negativen und der GBV-C-positiven Subkohorte
WHO-Stadium C als in der GBV-C-negativen (25,6 % versus 22,5 %). Zu beachten
ist, dass die beobachteten Unterschiede statistisch nicht signifikant sind (p = 0,25).
5.3.2.2. Langzeitüberleben
Der Anteil Langzeitüberlebender (HIV-Erstdiagnose vor 1988) war in der GBV-Cpositiven Gruppe mit 12,2 % etwas geringer als in der GBV-C-negativen (14,4 %).
Allerdings erreichten auch hier die Unterschiede keine statistische Signifikanz (p =
0,62).
Tabelle 5 fasst die das klinische Stadium und das Langzeitüberleben betreffenden
Unterschiede
zwischen
GBV-C-positiven
zusammen.
61
und
GBV-C-negativen
Patienten
ERGEBNISSE
GBV-C-positiv
n=82
GBV-C-negativ
n=264
Klinisches Stadium
A
B
C
Langzeitüberleben
p
(Chi-Square-Test)
0,25
31 (37,8 %)
30 (36,6 %)
21 (25,6 %)
81 (30,7 %)
124 (47,0 %)
59 (22,5 %)
10 (12,2 %)
38 (14,4 %)
0,62
Tabelle 5: Vergleich der klinischen Stadien und des Langzeitüberlebens GBV-C-Positiver und GBV-CNegativer
5.3.2.3. Progression zu symptomatischen Krankheitsstadien
Die Geschwindigkeit des Fortschreitens der Erkrankung zu den klinischen WHOStadien B und C wird in den gezeigten Kaplan-Meier-Kurven für beide Gruppen
getrennt dargestellt. Dabei zeigte sich vor allem beim Übergang vom Stadium A zu
Stadium B ein geringer Vorteil für die GBV-C-positive Gruppe, welcher sowohl in der
Gesamtkohorte, als auch in der Subgruppe von Patienten mit bekanntem
Infektionszeitpunkt deutlich wird. So wiesen 6 Jahre nach HIV-Erstdiagnose bereits
ca. 69 % der GBV-C-Negativen, aber nur ca. 55 % der GBV-C-Positiven erste HIVassoziierte Symptome auf (Stadium B). Allerdings war der positive Effekt der KoInfektion ca. 7 Jahre nach der HIV-Erstdiagnose (bzw. 10 Jahre nach Infektion) nicht
mehr nachzuweisen.
Für den Übergang zum klinischen Stadium C (AIDS) ergab die Analyse der Daten
ähnliche Unterschiede zwischen den beiden Gruppen. Auch hier erwies sich die
GBV-C-Virämie innerhalb der ersten 6 bis 7 Jahre nach HIV-Erstdiagnose als
vorteilhaft. So hatten 6 Jahre nach Diagnosestellung bereits ca. 22 % der GBV-Cnegativen Patienten AIDS definierende Erkrankungen erlitten, während dies nur für
ca. 12 % der GBV-C-Positiven zutraf. Wurden die Progressionsraten auf den
Infektionszeitpunkt bezogen, ergab sich hier allerdings für keine der beiden Gruppen
ein Vorteil bezüglich der Entwicklung von AIDS.
62
ERGEBNISSE
Bei der Auswertung der Daten ist zu beachten, dass trotz des in den ersten Jahren
beobachteten Effekts der GBV-C-Virämie die Unterschiede zwischen den beiden
Gruppen, über den gesamten Beobachtungszeitraum betrachtet, statistisch nicht
signifikant sind.
Die folgenden Diagramme zeigen die kumulativen Progressionsraten zu den
klinischen WHO-Stadien B (Erkrankungen bei mäßiger Störung der zellulären
Abwehr) und C (AIDS) in der GBV-C-positiven und der GBV-C-negativen Gruppe.
63
ERGEBNISSE
Abbildung 21: Progressionsraten zu WHOStadium B ab HIV-Erstdiagnose (p = 0,08)
A: GBV-C negativ (n=124)
B: GBV-C positiv (n=30)
Abbildung 22: Progressionsraten zu WHOStadium B ab HIV-Infektionszeitpunkt (p = 0,11)
A: GBV-C negativ (n=68)
B: GBV-C positiv (n=14)
Abbildung 23: Progressionsraten zu WHOStadium C ab HIV-Erstdiagnose (p = 0,51)
A: GBV-C negativ (n=59)
B: GBV-C positiv (n=21)
Abbildung 24: Progressionsraten zu WHOStadium C ab HIV-Infektionszeitpunkt (p = 0,83)
A: GBV-C negativ (n=14)
B: GBV-C positiv (n=4)
64
ERGEBNISSE
5.3.3. Vergleich der HIV-spezifischen Laborwerte
5.3.3.1. CD4-Stadien nach WHO
Die Auswertung der aktuellen CD4-Stadien ergab einen geringen, jedoch auch hier
statistisch nicht signifikanten Vorteil für die GBV-C virämischen Patienten (p=0,29).
So zeigte sich in der GBV-C-positiven Gruppe ein tendenziell höherer Anteil von
Patienten mit normaler CD4Zellzahl als in der GBV-Cnegativen (15,9 % vs. 9,5 %).
Dementsprechend befanden
sich überproportional mehr
GBV-C negative Patienten im
CD4-Stadium 2 (42 % vs.
40,2 % ) und im prognostisch
ungünstigen CD4-Stadium 3 Abbildung 25: Prozentualer Anteil der Patienten in den CD4(48,5 % vs. 43,9 %).
Stadien 1-3 in der GBV-C-positiven und der GBV-C-negativen
Subkohorte
5.3.3.2. Progression zu CD4-Stadium 2 und 3
Die Darstellung des zeitlichen Verlaufs des CD4-Zellverlustes als Kaplan-MeierKurven zeigt minimale, wiederum nicht signifikante Vorteile für die GBV-C-positiven
Patienten. Dieser Effekt ist insbesondere bei der Analyse der Daten bis zum Eintritt in
das CD4-Stadium 2 sichtbar. Für den Übergang in das CD4-Stadium 3 besteht der
Vorteil der GBV-C positiven Gruppe nur innerhalb der ersten 8 Jahre nach
Erstdiagnose. Nach dieser Zeitspanne verläuft der CD4-Zellverlust sogar schneller
als bei den GBV-C negativen Patienten.
Wurde der CD4-Zellverlust in der Subgruppe mit bekanntem Infektionszeitpunkt
ausgewertet, zeigte sich auch hier ein tendenziell positiver Einfluss der Ko-Infektion,
welcher ca. 8 Jahre nach der HIV-Infektion nicht mehr nachweisbar war.
65
ERGEBNISSE
Abbildung 27: Progressionsraten zu WHOStadium 2 ab HIV-Erstdiagnose (p = 0,37)
A: GBV-C negativ (n=111)
B: GBV-C positiv (n=33)
Abbildung 28: Progressionsraten zu WHOStadiium 3 ab HIV-Erstdiagnose (p = 0,50)
A: GBV-C negativ (n=128)
B: GBV-C-positiv (n=36)
Abbildung 26: Progressionsraten zu WHOStadium 2 ab HIV-Infektionszeitpunkt (p = 0,61)
A: GBV-C negativ (n=62)
B: GBV-C positiv (n=21)
Abbildung 29: Progressionsraten zu WHOStadium 3 ab HIV-Infektionszeitpunkt (p = 0,50)
A: GBV-C negativ (n=53)
B: GBV-C-positiv (n=9)
66
ERGEBNISSE
5.3.3.3. Mittlere CD4-Zellzahl
Die
mittlere
CD4-Zellzahl,
welche
aus
den
über
den
gesamten
Beobachtungszeitraum gemessenen CD4-Werten bestimmt wurde, war in beiden
Gruppen annähernd gleich (GBV-C-Negative: 469,7 CD4-Zellen/μl, GBV-C-Positive:
468,3 CD4-Zellen/μl; p = 0,99).
5.3.3.4. CD4-Zellzahl bei therapienaiven Patienten
Die Auswertung der Steilheit des CD4-Zellabfalls in einer Untergruppe 128
untherapierter Patienten mit bekanntem HIV-Infektionszeitpunkt ergab in der GBV-Cpositiven
Gruppe
einen
mittleren
monatlichen
Verlust
von
4,4
Zellen/μl.
Demgegenüber verlief der CD4-Abfall in der GBV-C negativen Gruppe mit 5,9
Zellen/μl pro Monat etwas, wenn auch nicht signifikant rascher (p = 0,59).
In der Subgruppe von 61 Patienten, bei denen CD4-Werte 5 Jahre nach bekanntem
HIV-Infektionszeitpunkt und vor Beginn von HAART vorlagen, zeigten sich ebenfalls
leichte, nicht signifikante Unterschiede zwischen GBV-C-positiven und -negativen
Patienten. Der mittlere CD4-Wert betrug für die GBV-C-positive Gruppe 408,9 Zellen
pro μl und war damit etwas höher als in der GBV-C-negativen Gruppe, in der der
mittlere CD4-Wert 5 Jahre nach Infektion bei 386,9 Zellen pro μl lag (p = 0,58).
5.3.3.5. Mittlere HIV-Last
Die mittlere HIV-Last der GBV-C-positiven Gruppe war mit 22561,2 RNA-Kopien/ml
tendenziell etwas niedriger als in der GBV-C-negativen Gruppe (24754,9 Kopien/ml).
5.3.3.6. HIV-Last vor HAART
Die isolierte Betrachtung der vor dem Beginn von HAART gemessenen HIV-Last
zeigte ebenfalls einen geringen Vorteil für die Patienten in der GBV-C positiven
Gruppe (104047,8 vs. 124871,35 Kopien/ml). Jedoch waren die Unterschiede auch
hier statistisch nicht signifikant (p = 0,95 bzw. p = 0,48).
Die Unterschiede in den HIV-spezifischen Laborparametern HIV-Last und CD4Zellzahl sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.
67
ERGEBNISSE
GBV-C-positiv
n=82
GBV-C-negativ
n=264
CD4-Stadium:
0,27
(Chi-Square-Test)
1
2
3
13 (15,9 %)
33 (40,2 %)
36 (43,9 %)
25 (9,5 %)
111 (42,0 %)
128 (48,5 %)
468,3 ± 252,9
469,7 ± 239,1
0,99
(WilcoxonRangsummentest)
22561,2 ± 38240,3
24954,9 ± 49267,8
0,95
(WilcoxonRangsummentest)
Mittlerer CD4-Wert
(Zellen pro μl)
Mittlere HIV-Last
(Kopien/ml)
P
HIV-Last vor
104047,8 ± 166962,7 124871,35±192407,3
HAART (Kopien/ml)
0,49
(WilcoxonRangsummentest)
Tabelle 6: Vergleich von CD4-Zellstadien, mittlerer CD4-Zellzahl und Viruslast GBV-C-Positiver und
GBV-C-Negativer
5.3.4. Einfluss der GBV-C-Infektion auf die Therapie
5.3.4.1. Therapieregime
28 der HIV-Patienten hatten niemals eine hochaktive antiretrovirale Therapie
bekommen. Davon waren 7 GBV-C positiv und 21 negativ, entsprechend 8,5 % der
GBV-C virämischen bzw. 7,5 % der GBV-C negativen Subkohorte. Der Anteil der zum
Zeitpunkt der Datenerhebung nicht therapierten Patienten (34 Individuen, davon 28
Therapienaive und 6 Patienten in Therapiepause) war in der GBV-C-positiven
Gruppe etwas größer als in der GBV-C-negativen (11,0 % vs. 9,5 %). Diese
Unterschiede waren statistisch nicht signifikant.
Auch bei der Anzahl der verordneten antiretroviralen Medikamente ließen sich nur
geringe, nicht signifikante Unterschiede zwischen den beiden Gruppen feststellen.
Der prozentuale Anteil der mit drei verschiedenen Medikamenten therapierten
Patienten betrug in der GBV-C-positiven Gruppe 54,9 % vs. 56,1 % in der GBV-C68
ERGEBNISSE
negativen. Die prozentualen Anteile der Patienten, welche mehr als drei
verschiedene Medikamente bekamen, waren ebenfalls in beiden Gruppen annähernd
gleich (s. Tabelle 7).
Auch bei der Anzahl der Substanzklassen zeigten sich keine signifikanten
Unterschiede zwischen beiden Subgruppen. Tendenziell kamen bei den GBV-C
positiven Patienten häufiger Medikamente aus drei verschiedenen Substanzklassen
(NRTI, NNRTI, PI) zum Einsatz als bei den GBV-C-negativen (7,3 % vs. 3,0 %). Die
Anteil der Patienten, welche mit einem oder mit zwei Proteaseinhibitoren behandelt
wurden war dagegen in der GBV-C-positiven Gruppe etwas geringer (28,1 % vs. 34,1
% in der GBV-C-negativen Gruppe).
GBV-C-positiv
n=82
GBV-C-negativ
n=264
Anzahl der
Medikamente:
0
2
3
4
5
6
0,98
9 (11,0 %)
1 (1,2 %)
45 (54,9 %)
22 (26,8 %)
5 (6,1 %)
0 (0 %)
25 (9,5 %)
4 (1,6 %)
148 (56,1 %)
69 (26,1 %)
16 (6,1 %)
2 (0,7 %)
Anzahl der
Substanzklassen:
0
1
2
3
0,35
9 (11,0 %)
7 (8,5 %)
60 (73,2 %)
6 (7,3 %)
25 (9,5 %)
26 (9,9 %)
205 (77,7 %)
8 (3,0 %)
Proteinaseinhibitor
0
1
2
p
(Chi-Square-Test)
0,59
59 (72,0 %)
7 (8,5 %)
16 (19,5 %)
174 (65,9 %)
26 (9,9 %)
64 (24,2 %)
Tabelle 7: Anzahl der verordneten Medikamente und Substanzklassen
69
ERGEBNISSE
5.3.4.2. Therapieerfolg
Die Auswertung des virologischen Erfolgs der Therapie, also einer Unterdrückung der
HIV-Replikation unter die Nachweisgrenze, erbrachte keinen Vorteil für die GBV-Cvirämischen HIV-Infizierten. So war der Prozentsatz von Patienten, deren HI-Viruslast
nie unter die Nachweisgrenze gesenkt werden konnte, in der GBV-C- positiven
Gruppe zwar tendenziell höher als in der GBV-C-negativen (18,7 % vs. 16,5 %). Der
Anteil jener Patienten, deren Viruslast nach initial erfolgreicher Supprimierung unter
50 Kopien/ml wieder anstieg, war in der GBV-C positiven Subgruppe etwas höher als
in der GBV-C negativen ( 32,0 % vs. 31,6 %) Dementsprechend hatten Patienten
ohne den Nachweis von GBV-C eher eine dauerhaft unterdrückte HIV-Replikation
ohne Rebound (51,9 % vs. 49,3 %). Sämtliche den Erfolg der Therapie betreffenden
Unterschiede waren statistisch nicht signifikant (p = 0,88)
HIV-Last
GBV-C positiv
n=75
GBV-C negativ
n=243
p
(Chi-Square-Test)
Niemals <50 K/ml
14 (18,7 %)
40 (16,5 %)
0,88
Rebound
24 (32,0 %)
77 (31,6 %)
0,88
Dauerhaft <50
K/ml
37 (49,3 %)
126 (51,9 %)
0,88
Tabelle 8: Virologischer Erfolg der HAART
Bei der Betrachtung des immunologischen Erfolges, also des CD4-Zellanstiegs nach
Therapiebeginn, zeigte sich dagegen ein Vorteil für die GBV-C-koinfizierten
Patienten. So stieg in der GBV-C-positiven Subkohorte die Zahl der CD4-Zellen im
Monat durchschnittlich um 23,3 Zellen/μl an,
in der GBV-C negativen dagegen
monatlich nur um 18,1 Zellen/μl. Die den immunologischen Erfolg betreffenden
Unterschiede waren, wie auch die Unterschiede bezüglich des virologischen Erfolgs,
statistisch nicht signifikant (p = 0,17).
Wurde der Erfolg der Therapie in Bezug zur Höhe der GBV-C-Last gesetzt, bestand
ein geringer, wiederum nicht signifikanter Vorteil für Patienten mit hoher GBV-C-Last
70
ERGEBNISSE
(>10000 Kopien/μl). So war bei lediglich 5 % dieser Patienten die HIV-Last nie unter
50 Kopien/μl gefallen. Bei den Patienten mit niedriger GBV-C-Last (<10000
Kopien/μl) wurde dagegen in 26 % kein durchschlagender virologischer Erfolg
erreicht. Dementsprechend war bei 50 % der stark GBV-C-virämischen Patienten die
HIV-Replikation dauerhaft unterdrückt, was nur für 36,8 % der Patienten mit geringer
GBV-C-Last zutraf (p = 0,18). Es zeigte sich allerdings keine Korrelation zwischen
der Höhe der GBV-C-Last und der durchschnittlichen Höhe der HIV-Last bzw. der
CD4-Zahl.
71
Diskussion
6. Diskussion
6.1. Ergebnisse der GBV-C-Tests
Die konventionelle Nested-RT-PCR mit dem Nachweis der viralen Nukleinsäure
mittels Gel-Elektrophorese stellt aufgrund ihrer fast 100-prozentigen Spezifität und
Sensitivität den Goldstandard zur Detektion einer aktiven Infektion mit dem GB-VirusC dar. Als Screening-Untersuchung größerer Patientenkohorten ist sie jedoch wegen
ihres hohen Zeit- und Arbeitsaufwandes wenig geeignet. Als Alternative bietet sich
die Real-Time-RT-PCR im LightCycler-Verfahren an. Dieses Verfahren findet bereits
in der Erfassung und Quantifizierung verschiedener viraler Infektionen, wie z. B. der
Infektion mit HBV, CMV oder EBV, eine breite Anwendung. Für den Nachweis der
aktiven GBV-C-Infektion standen zu Beginn dieser Arbeit zwei verschiedene
LightCycler-Assays
zur
Verfügung,
deren
Verwendbarkeit
als
Screening-
Untersuchung überprüft wurde. Dabei traten deutliche Unterschiede zwischen den
beiden Tests bezüglich ihrer Sensitivität und Spezifität zu Tage.
Während die Spezifität des Freiburger Assays 100 % beträgt, ist seine Sensitivität
von ca. 67 % nicht ausreichend für eine Verwendung zur Identifizierung GBV-CPositiver in größeren Kohorten. Bei Fragestellungen, in denen es darum geht, mit
größtmöglicher Verlässlichkeit ausschließlich GBV-C-positive Individuen aus einer
Grundgesamtheit zu selektieren, hat die Anwendung dieses Verfahrens jedoch
durchaus ihre Berechtigung.
Der von Tillmann et al. in Hannover entwickelte Assay hat dagegen, neben einer
ausreichend hohen Sensitivität von 94,3 % auch eine Spezifität, welche mit ca. 95 %
der konventionellen PCR annähernd ebenbürtig ist. Somit ist die Hannoveraner LCPCR grundsätzlich für den Nachweis einer aktiven GBV-C-Infektion geeignet. Bei
Fragestellungen,
die
eine
annähernd
100-prozentige
Gewissheit
über
den
Infektionsstatus des Patienten erfordern, ist allerdings die Durchführung einer
Nested-RT-PCR bei allen schwach positiven Testergebnissen notwendig. Auf eine
72
Diskussion
Nachtestung der nicht eindeutig negativen Proben kann ggf. verzichtet werden, da
hier der Anteil richtig Negativer bei ca. 91 % liegt.
6.2. Einfluss des GBV-C auf den Krankheitsverlauf HIV-Infizierter
Nach der Entdeckung des GBV-C stellte sich die Frage, ob das Flavivirus den Verlauf
der HIV-Infektion beeinflusst. Obwohl in der Mehrzahl der zu diesem Thema
durchgeführten klinischen Studien ein protektiver Einfluss der GBV-C-Koinfektion
nachgewiesen wurde [Heringlake, 1998] [Lefrere, 1999] [Tillmann, 2001] [Xiang,
2001] [Williams, 2004] [Yeo, 2000], stellten einige Autoren keinen [Birk, 2002]
[Björkman, 2002] [Van der Bij, 2005], bzw. einen negativen Effekt der GBV-CInfektion auf die Krankheitsprogression bei HIV-Infizierten fest [Brust, 2002].
Ziel der hier vorliegenden Untersuchung war es, die widersprüchlich diskutierte Rolle
des GBV-C für den Verlauf der HIV-Infektion zu überprüfen. In Zusammenschau
unserer Ergebnisse, konnte der von den genannten Autoren beobachtete, signifikant
günstigere
Krankheitsverlauf
bei
HIV/GBV-C-Koinfektion
nicht
nachgewiesen
werden. Allerdings hatte die GBV-C-positive Subgruppe sowohl bezüglich der
klinischen Parameter, als auch hinsichlich HIV-spezifischer Laborwerte tendenziell
einen geringen Vorteil gegenüber der GBV-C-negativen Gruppe. Da die Unterschiede
zwischen den beiden Subkohorten jedoch statistisch nicht signifikant waren,
sprechen unsere Ergebnisse für einen neutralen oder allenfalls geringen protektiven
Effekt der GBV-C-Koinfektion bei HIV-Patienten. Ein negativer Einfluss des
Flavivirus, wie von Brust et al. beobachtet, wurde mit dieser Untersuchung nicht
festgestellt.
6.2.1. Grundcharakteristika der Freiburger Kohorte
Es stellt sich nun die Frage, ob die vorliegende Studie ausreicht, um den von den
genannten Autoren beobachteten, positiven Einfluss des GB-Virus-C auf den Verlauf
der HIV-Infektion auszuschließen. Für eine korrekte Beurteilung unserer Ergebnisse
gilt es zunächst zu überprüfen, inwieweit sich unser Studiendesign von dem Aufbau
anderer Studien unterscheidet
und ob die Grundcharakteristika der Freiburger
Kohorte mit denen anderer Patientenkollektive vergleichbar sind. Weiterhin wäre zu
diskutieren, ob es bei der Zusammensetzung der beiden Subgruppen oder bei der
statistischen Auswertung Faktoren gibt, die einen möglicherweise signifikanten Effekt
der GBV-C-Infektion überlagern.
73
Diskussion
6.2.1.1. Häufigkeit der persistierenden GBV-C-Virämie
Der Anteil GBV-C-virämischer Patienten an der Gesamtkohorte lag bei 23,7 % und
somit im mittleren Bereich der in anderen Studien beobachteten Werte (von 17 % bei
Tillmann et al. bis 42 % bei Van der Bji et al.). Die Unterschiede zu den Ergebnissen
von Tillmann et al. sind somit nicht durch einen geringeren Anteil GBV-C-Infizierter zu
erklären. Unsere Studie bestätigt allerdings die Beobachtung, dass die Persistenz
der Infektion mit dem GB-Virus-C bei HIV-Infizierten wesentlich häufiger auftritt als in
der Durchschnittsbevölkerung, wo sie mit einer Häufigkeit von 1-4 % angegeben wird
[Simons, 1995] [Linnen 1996] [Nordbo, 2000]. Für die höhere Prävalenz des GBV-C
bei HIV-Infizierten sind prinzipiell mehrere Gründe denkbar. So sind HIV-Infizierte (je
nach Zugehörigkeit zu einer bestimmten Risikogruppe) häufig auch anderen, sexuell
und parenteral übertragbaren, Erregern ausgesetzt. Die Infektion mit HBV und HCV
z. B. ist unter HIV-Patienten häufiger als in der Durchschnittsbevölkerung. Selbiges
gilt analog auch für das auf gleichem Weg übertragene GBV-C [Rey, 1999].
Andererseits ist die höhere Rate der persistierenden GBV-C-Infektion auch dadurch
erklärbar, dass das eingeschränkte Immunsystem HIV-Infizierter, im Vergleich zu
dem Gesunder, weniger gut in der Lage ist, das Flavivirus zu eliminieren.
6.2.1.2. Dauer der HIV-Infektion
Einer der Gründe, warum die zu diesem Thema durchgeführten Studien zu
widersprüchlichen
Aussagen
kommen,
könnte
darin
liegen,
dass
die
Studienpopulationen zu unterschiedlichen Zeitpunkten im Verlauf der HIV-Infektion
untersucht wurden. Wenn sich die GBV-C-Infektion tatsächlich protektiv auswirken
sollte, dann ist es denkbar, dass dieser Effekt erst einige Jahre nach erfolgter HIVInfektion deutlich sichtbar wird. In den Untersuchungen von Lefrere et al. und
Williams et al. wurde der Einfluss des GBV-C auf die CD4-Zellzahl erst ca. fünf Jahre
nach HIV-Serokonversion deutlich, und sowohl Tillmann et al. als auch Xiang et al.
beobachteten den günstigeren Krankheitsverlauf bei GBV-C-Positiven in einer
Kohorte in einem eher fortgeschrittenen Stadium der HIV-Infektion. Bei Studien, in
denen kein Einfluss der Koinfektion gefunden wurde, wurden Patienten dagegen in
einem relativ frühen Stadium der HIV-Infektion evaluiertet [Brust, 2002] [Birk, 2002].
Die in der Freiburger Studie eingeschlossenen Patienten waren zum Zeitpunkt der
Datenauswertung im Mittel ca. 8 Jahre HIV-infiziert, wobei die Dauer der Infektion für
beide Subgruppen praktisch gleich war. Die relativ lange Infektionsdauer der
Freiburger
Kohorte
sollte
also
keinen
74
Grund
dafür
darstellen,
dass
ein
Diskussion
möglicherweise bestehender protektiver Effekt des GBV-C nicht nachgewiesen
wurde.
6.2.1.3. Beobachtungszeit der Kohorte
Die Dauer der Beobachtungszeit, welche eine wesentliche Rolle für das Ergebnis
spielt, war in der Freiburger Studienpopulation länger als in der Mehrzahl der zum
Verlauf der HIV/GBV-C-Koinfektion durchgeführten Studien. Allerdings waren auch
die Patientendaten von Lefrere et al. und Williams et al. über ähnlich lange Zeiträume
dokumentiert worden, wobei sich ein deutlicher Unterschied zwischen der HIVKrankheitsprogression GBV-C-Positiver und -Negativer fand. Somit ist der von uns,
im Unterschied zu den genannten Autoren, beobachtete geringere Einfluss der GBVC-Infektion nicht mit einer unterschiedlich langen Beobachtungszeit erklärbar.
6.2.1.4. Einfluss von Alter und Geschlecht auf das Ergebnis
Bezüglich
des
Alters
und
der
Geschlechterverteilung
entsprach
die
Zusammensetzung der Freiburger Kohorte den in Deutschland für die HIV-Infektion
geltenden epidemiologischen Beobachtungen [RKI, 2005]. Die Mehrzahl der HIVInfizierten unserer Kohorte war männlich und mittleren Alters, allerdings war der
Anteil von Frauen mit ca. 32 % höher als in den meisten vergleichbaren
Untersuchungen, wo die weiblichen Patienten einen Anteil von 12 % (Xiang et al.) bis
maximal 22 % (Lefrere et al.) an der Gesamtkohorte hatten. Der prozentuale Anteil
von Frauen war in der GBV-C-koinfizierten Subgruppe etwas geringer als in der
GBV-C-negativen. Das Geschlecht HIV-Infizierter korreliert allerdings nicht mit der
Prognose,
insofern
ist
dieser
Unterschied
bezüglich
der
Ergebnisse
zu
vernachlässigen. In einigen, der zu diesem Thema durchgeführten Untersuchungen
waren entweder nur Männer [Birk, 2002] [Williams, 2004] oder ausschließlich Frauen
[Kaye, 2005] eingeschlossen worden. Nach den Ergebnissen dieser Studien
bestehen keine Hinweise darauf, dass der Einfluss des GBV-C mit dem Geschlecht
der Patienten korreliert.
Bezüglich des Alters der Patienten zeigten sich in unserer Studie zwar geringe
Unterschiede zwischen GBV-C-Negativen und GBV-C-Positiven, jedoch waren diese
nicht signifikant. Da das Alter bei HIV-Serokonversion einer der Parameter ist, welche
die
Krankheitsprogression
beeinflussen
[Lefrere, 1998], wäre
prinzipiell
zu
diskutieren, ob das geringfügig jüngere Alter der GBV-C-Koinfizierten zu deren
tendenziell besserem Outcome beiträgt.
75
Diskussion
6.2.1.5. Infektionsmodi
Bezüglich der Infektionsmodi und Risikofaktoren zeigte sich in der Freiburger
Kohorte interessanterweise eine andere Verteilung als in der Literatur beschrieben
[Hoffmann,
Rockstroh,
Kamps:
HIV.Net
2005].
Während
in
Deutschland
homosexuelle Patienten die zahlenmäßig größte Gruppe HIV-Infizierter stellen, hatte
sich der Großteil der Freiburger Patienten auf heterosexuellem Weg infiziert. In
diesem Punkt unterscheidet sich unsere Kohorte auch von Patientenkollektiven
anderer Studien, in denen der Anteil homosexuell infizierter Personen den der
heterosexuell Infizierten überwiegt [Tillmann, 2001] [Lefrere, 1999] [Björkmann,
2004]. Dieser Unterschied ist zum Teil dadurch erklärbar, dass die Rekrutierung der
Patienten im Unterschied zu den erwähnten Studien nicht in einem großstädtischen
Ballungsraum erfolgte, wo der prozentuale Anteil homosexuell lebender Personen an
der Gesamtbevölkerung möglicherweise höher ist als in Freiburg und den
umliegenden Ortschaften. Auch Immigration und der zunehmende Tourismus in
Hochprävalenzgebiete könnten in diesem Zusammenhang eine Rolle spielen. Der
Anteil der durch i.v. Drogenabusus Infizierter in unserer Kohorte entsprach mit ca. 19
% den Beobachtungen vergleichbarer Publikationen, wo die parenteral infizierten
Patienten mit 8-30 % ebenfalls den drittgrößten Anteil stellten.
Die Verteilung der Risikofaktoren ist in unserer Studie der einzige Parameter, in dem
sich GBV-C-positive Patienten signifikant von GBV-C-negativen unterscheiden. Die
Tatsache, dass die GBV-C-Infektion unter den i.v. Drogenabhängigen unserer
Kohorte signifikant häufiger auftritt als bei den anderen Risikogruppen, entspricht
dabei den Beobachtungen in anderen epidemiologischen Studien über die
Verbreitung des GBV-C [Rey, 1999] [Christensen, 2003]. Es gibt dafür zwei
Erklärungsmöglichkeiten. Entweder erfolgt die Infektion mit dem Flavivirus, analog
der HIV-Infektion, durch eine höhere Konzentration des Virus im Blut auf
parenteralem Weg effektiver als bei Sexualkontakten. Möglicherweise bewirken aber
auch in der Schleimhaut lokalisierte Immunzellen eine stärkere Sensibilisierung
gegenüber Proteinen des GBV-C, und ermöglichen es damit dem Immunsystem, das
Virus effektiver als bei parenteraler Infektion zu eliminieren.
Der Anteil HCV-infizierter Patienten lag in der GBV-C-positiven Subgruppe in fast
signifikanter Weise höher als in der GBV-C negativen. Dieser Umstand könnte zu
einer Verschlechterung der Prognose GBV-C-Koinfizierter, und damit zu einer
Verringerung eines möglichen positiven Effekts des Flavivirus geführt haben.
Wahrscheinlich hängt der höhere Anteil HCV-Infizierter in dieser Subgruppe mit der
76
Diskussion
Verteilung der Infektionsrisiken in beiden Gruppen zusammen. Der in der GBV-Cvirämischen Gruppe deutlich höhere Prozentsatz von parenteral HIV-Infizierten
bedingt auch die höhere Rate an HCV-Infektionen, welche eine typische
Komplikation von Transfusionen und i.v. Drogenmissbrauch darstellen.
6.2.1.6. Therapieerfahrung der Kohorte
Das in dieser Studie untersuchte Patientenkollektiv war zum Zeitpunkt der
Datenerhebung
überwiegend
antiretroviral
behandelt
worden.
Mit
91,9
%
Therapierter lag dieser Anteil höher als in anderen zu diesem Thema durchgeführten
Untersuchungen. Der mögliche Effekt des GB-Virus-C auf die HIV-Infektion könnte in
dieser Studie durch die Therapie, welche zu einer deutlichen Verbesserung des
klinischen Zustandes und der Laborwerte des Patienten führt, überlagert worden
sein, wodurch sich die Unterschiede zwischen GBV-C-Negativen und GBV-CPositiven weniger deutlich darstellen. Insofern spiegeln Studien, in denen Daten aus
den Jahren vor Einführung der HAART ausgewertet wurden, wie die von Williams et
al. und Lefrere et al., den natürlichen Verlauf der HIV/GBV-C-Koinfektion deutlich
besser wider. Patienten in Studien, in denen kein positiver Einfluss des GBV-C
gefunden wurde, waren zum größten Teil antiretroviral therapiert worden. Die
Unterschiede
der
Therapieerfahrung
verschiedenen
stellen
Studienpopulationen
wahrscheinlich
einen
der
bezüglich
Hauptgründe
ihrer
für
die
widersprüchlichen Aussagen zum Effekt der HIV/GBV-C-Koinfektion dar. Der Einfluss
dieses Faktors wurde in unserer Studie durch die Bestimmung der CD4-Zellverlaufes
in einer Untergruppe therapienaiver Patienten sowie durch den Vergleich von vor
dem Therapiebeginn dokumentierten HI-Viruslasten minimiert. Da die Ergebnisse in
dieser Untergruppe jedoch ebenfalls nur einen tendenziellen Vorteil für die GBV-Cvirämischen Patienten ergaben, sind die deutlichen Unterschiede zu den Studien von
Lefrere et al. und Williams et al. nicht allein durch die Therapieerfahrung unserer
Kohorte zu erklären.
Da sowohl der Anteil Nichttherapierter als auch die Therapiedauer in der GBV-Cpositiven und der GBV-C-negativen Subgruppe annähernd gleich waren, sollte der
postulierte protektive Effekt der GBV-C-Koinfektion nicht durch einen therapiebedingt
günstigeren Krankheitsverlauf der GBV-C-negativen Patienten überlagert worden
sein.
77
Diskussion
Damit bleibt festzuhalten, dass in der Freiburger Kohorte keine signifikanten
Unterschiede
zwischen
GBV-C-negativen
und
GBV-C-virämischen
Patienten
bezüglich der Grundcharakteristika Alter, Infektions- und Therapiedauer sowie
Hepatitis-Koinfektionen, bestehen, und sich das Patientenkollektiv bezüglich seiner
Zusammensetzung und seiner Beobachtungszeit nicht wesentlich von den Kohorten
anderer Studien unterscheidet. Die Tatsache, dass die meisten Patienten antireroviral
therapiert worden waren, mag zu einer Verringerung des Vorteils für GBV-C-Infizierte
geführt haben. Der Vergleich von vor dem Beginn von HAART gewonnenen Daten
spricht jedoch gegen einen starken protektiven Effekt der Koinfektion bei
therapienaiven Patienten. Somit bleibt die Frage zunächst noch offen, warum der in
anderen Studien beobachte positive Einfluss des Flavivirus mit dieser Untersuchung
nicht nachgewiesen wurde.
6.2.2. Vergleich GBV-C-positiver und GBV-C-negativer Patienten
6.2.2.1. Klinischer Verlauf
Bei einer eingehenden Betrachtung der Krankheitsprogression wird deutlich, dass
unsere Beobachtungen sich diese nicht grundsätzlich von denen der oben
genannten Autoren unterscheiden. Nachdem der klinische Verlauf der HIV-Infektion
GBV-C-negativer mit dem GBV-C-positiver Patienten mittels Kaplan-Meier-Kurven
verglichen wurde, zeichnete sich für die GBV-C-virämische Gruppe in der Tat eine
tendenziell
langsamere
Krankheitsprogression
ab,
wobei
die
auftretenden
Unterschiede über den gesamten Beobachtungszeitraum betrachtet allerdings keine
statistische Signifikanz erreichten. Unsere Beobachtung widerspricht damit nicht dem
von Tillmann et al. gezeigten günstigeren Krankheitsverlauf, wenngleich der Vorteil
für die GBV-C-virämischen Patienten weniger deutlich zu Tage trat. Bei der
Betrachtung der Kaplan-Meier-Kurven fällt auf, dass die Krankheitsprogression in der
GBV-C-positiven Gruppe innerhalb der ersten 7 Jahre nach HIV-Diagnose, vor allem
zu leicht symptomatischen Stadien aber auch zum AIDS-Stadium, deutlich
langsamer verläuft als in der GBV-C-negativen Gruppe. Später gleichen sich die
Kurvenverläufe beider Subgruppen aneinander an, wodurch der Einfluss des GBV-C
über den gesamten Beobachtungszeitraum betrachtet schwächer wird. Die Tatsache,
dass dieser protektive Effekt sich ca. 7 Jahre nach HIV-Erstdiagnose verliert, könnte
daher rühren, dass mit zunehmender Krankheitsdauer auch der Anteil antiretroviral
78
Diskussion
therapierter Patienten steigt, und somit ein protektiver Einfluss der Ko-Infektion von
dem wesentlich stärkeren Effekt der Therapie überlagert wird.
Bei der Auswertung der WHO-Stadien bleibt, trotz der im Anfangsstadium
verlangsamten Progression der Erkrankung, die Tatsache bestehen, dass die GBVC-virämischen Patienten keine signifikanten Vorteile gegenüber den GBV-CNegativen haben. Der etwas höhere Anteil Symptomfreier innerhalb der koinfizierten
Gruppe wird durch den - wenn auch nur geringfügig - höheren Anteil an AIDSKranken in dieser Gruppe ausgeglichen. Bei gemeinsamer Bewertung der beiden
symptomatischen Stadien B und C könnte man anhand der Daten von einem
tendenziell besseren klinischen Status der GBV-C-Infizierten sprechen (62,2 % vs.
69,5 % der Patienten symptomatisch). Diese Unterschiede sind allerdings ebenfalls
zu gering, um statistische Signifikanz zu erreichen. Auch der in beiden Gruppen
annähernd gleich große Anteil Langzeitüberlebender spricht gegen einen starken
protektiven Einfluss der HIV/GBV-C-Koinfektion. Diese Betrachtung der klinischen
Krankheitsstadien ist in anderen Studien nicht durchgeführt worden. Sie kann nur
einen sehr generellen Eindruck vom klinischen Verlauf der HIV-Infektion vermitteln,
und insbesondere keine Auskunft über den Zeitverlauf der Krankheitsprogression
geben. Dennoch sollte aufgrund der Größe der Kohorte ein starker Einfluss des
Flavivirus auf den Krankheitsverlauf erkennbar werden. Dabei ist zu beachten, dass
das WHO-Stadium nicht die aktuelle Situation des Patienten widerspiegelt, sondern
den im Verlauf der Infektion jeweils schlechtesten immunologischen und klinischen
Status. Da sich sowohl Klinik als auch CD4-Werte nach Initiierung von HAART in den
meisten Fällen bessern, ändert sich nach Therapiebeginn das einmal erreichte WHOStadium nur selten. Patienten, die bereits HIV-infiziert waren, bevor eine HAART mit
drei verschiedenen Wirkstoffen zur Verfügung stand, hatten ein wesentlich größeres
Risiko der Entwicklung von AIDS, als jene, die sich erst nach 1996 infizierten.
Deshalb gehen langjährig Infizierte eher mit den WHO-Stadien B und C in die
Auswertung ein, als jene, die sich nach 1996 infizierten. Dies könnte zu einer
stärkeren Gewichtung Langzeitinfizierter in der Auswertung der WHO-Stadien, und
damit zu einer Verzerrung der Ergebnisse führen. Da jedoch die durchschnittliche
bekannte Infektionsdauer beider Subgruppen annähernd gleich ist, sollten die
fehlenden Therapiemöglichkeiten der Ära vor Einführung von HAART nicht zu
Unterschieden zwischen GBV-C-Positiven und –Negativen beitragen. Insofern ist der
79
Diskussion
Vergleich der CDC-Stadien in Bezug auf den natürlichen Verlauf der HIV/GBV-CKoinfektion durchaus aussagekräftig.
Im Gegensatz zu den Untersuchungen, in denen ein positiver Einfluss der
Koinfektion festgestellt wurde, konnten wir mit dieser retrospektiven Studie keine
Aussage über die Mortalität bzw. die Überlebensraten der Patienten treffen. Da die
Mortalität jedoch nicht ausschließlich mit dem HI-Virus assoziiert ist, sondern auch
von Koinfektionen (z. B. mit Hepatitiserregern), direkter Drogentoxizität, der sozialen
und psychischen Situation des Patienten und vielen anderen Faktoren abhängt,
erscheint dieser Parameter zur Beurteilung der Krankheitsprogression weniger
geeignet
als
der
Vergleich
der
Progressionsraten
zu
AIDS-definierenden
Erkrankungen.
Ein prinzipielles Problem bei der Beurteilung des Krankheitsverlaufes stellt die
Tatsache dar, dass bei der Freiburger Kohorte der genaue Zeitpunkt der HIVInfektion in der überwiegenden Anzahl der Fälle nicht bekannt war. Von allen bisher
zu diesem Thema durchgeführten Studien evaluierten lediglich Williams et al. und
Lefrere et al. Patienten mit bekanntem HIV-Serokonversionszeitpunkt, wodurch sie in
der Lage waren, ein möglichst genaues Bild des Krankheitsverlaufes zu
rekonstruieren. In der hier vorliegenden Untersuchung war bei ca. der Hälfte der
Patienten der ungefähre HIV-Infektionszeitpunkt bekannt, und zwar in der Form, dass
entweder ein negativer HIV-Test weniger als drei Jahre vor Erstdiagnose vorlag, oder
die Patienten den wahrscheinlichen Zeitpunkt ihrer Infektion angegeben hatten.
Diese Angaben sind nur bedingt verlässlich. Sie ermöglichen es aber, die Dauer der
HIV-Infektion einzugrenzen, und somit eine Untergruppe zu bilden, in welcher sich
der zeitliche Verlauf der HIV-Infektion genauer nachvollziehen lässt als in der
Gesamtkohorte. Wurden die Kaplan-Meier-Analysen zum klinischen Verlauf für diese
Untergruppe durchgeführt, zeigten sich ähnliche Ergebnisse, wie bei der Auswertung
des gesamten Patientenkollektivs. Aus diesem Grund, ist es unwahrscheinlich, dass
die Ergebnisse der Gesamtkohorte wesentlich anders ausgefallen wären, wenn der
genaue Zeitpunkt der HIV-Infektion bekannt gewesen wäre. Dennoch muss
anerkannt werden, dass die genannten Autoren durch die Auswahl von Patienten mit
definierter Infektionsdauer verlässlichere Aussagen über das Fortschreiten der
Immunschwäche erhalten konnten.
80
Diskussion
Eine nicht zu vernachlässigende Einschränkung bei der Beurteilung unserer
Ergebnisse stellt die Tatsache dar, dass der GBV-C-Status der Patienten erst am
Ende der Beobachtungszeit bestimmt wurde. Es ist daher nicht möglich festzustellen,
wann sich die Patienten mit dem Flavivirus infizierten. Die Dauer der Koinfektion
dürfte für den Krankheitsverlauf jedoch eine wesentliche Rolle spielen. Es ist nicht
auszuschließen, dass sich unter den GBV-C-Positiven auch Patienten befanden, die
erst kurze Zeit mit dem Flavivirus infiziert waren und bei denen deshalb der Effekt der
Koinfektion bis zum Zeitpunkt der Auswertung nicht wirksam werden konnte, so dass
ein möglicherweise protektiver Einfluss des GBV-C weniger deutlich zum Vorschein
kam.
Einen weiteren wichtigen Unterschied zwischen dieser und vorangegangenen
Studien stellt die Tatsache dar, dass mit der Detektion von RNA des GBV-C lediglich
der Anteil von Patienten mit persistierender GBV-C-Infektion ermittelt wurde. Die
Patientenseren wurden nicht auf das Vorhandensein von E2-Antikörpern untersucht.
Aussagen über den Krankheitsverlauf von HIV-Patienten mit abgelaufener GBV-C
Infektion können daher nicht getroffen werden. Es gibt jedoch Hinweise darauf, dass
sich die Prognose Anti-E2-positiver Patienten von der jener Patienten unterscheidet,
welche nie GBV-C-infiziert waren. So wiesen Anti-E2-Positive in der Studie von
Tillmann et al. zwar eine schnellere Krankheitsprogression als Patienten mit aktiver
GBV-C-Infektion auf, hatten allerdings immer noch einen günstigeren Verlauf als jene
Patienten, die nie GBV-C-infiziert waren. Diese Beobachtung könnte darauf
hinweisen, dass eine gegen das Flavivirus gerichtete Immunreaktion nach dessen
Eliminierung, z. B. in Form einer Kreuzreaktion, auch gegen HIV wirksam ist. Die
Tatsache, dass in unserer Studie die Daten von Patienten mit abgelaufener GBV-CInfektion mit denen von nie GBV-C-exponierten Patienten zusammengefasst wurden
könnte zu einer Verringerung der Unterschiede zwischen GBV-C-positiver und GBVC-negativer Subgruppe geführt haben.
In den Untersuchungen von Van der Bji et al. und Williams et al. war der GBV-CStatus zu mehreren Zeitpunkten im Verlauf der HIV-Infektion bestimmt worden.
Interessanterweise fand sich in der Subgruppe von Patienten, die das Flavivirus
während der Beobachtungszeit verloren, ein besonders rasches Fortschreiten zu
symptomatischen HIV-Stadien und eine noch schlechtere Prognose, als in der nie
GBV-C-infizierten Subgruppe. Der Verlust des GBV-C war bei den meisten dieser
Patienten nicht von der Entwicklung von E2-Antikörpern begleitet. In der
Immunkompetenten, HIV-negativen Bevölkerung dagegen, geht die Eliminierung des
81
Diskussion
Flavivirus in der Regel mit dem Auftreten von Anti-E2-Immunglobulinen einher. Van
der Bji et al. hatten beobachtet, dass der protektive Effekt des GBV-C von der CD4Zellzahl
im
Blut
abhängig
war,
und
zogen
aus
ihrer
Beobachtung
die
Schlussfolgerung, dass die Persistenz des in CD4-Zellen replizierenden GBV-C nicht
die Ursache, sondern vielmehr die Folge hoher CD4-Werte und damit eines
günstigeren Krankheitsverlaufes sei. Diese Annahme wird von der Tatsache gestützt,
dass Patienten mit besonders rascher Progression das Flavivirus ohne die
Entwicklung von Anti-E2 verloren. Jedoch widerspricht dieser Umstand nicht der
Beobachtung, dass die ständig aktive GBV-C-Infektion das Überleben HIV-Infizierter
verlängert. So könnte die Ko-infektion durchaus protektiv sein, solange dem GBV-C
genügend Wirtszellen zur Verfügung stehen. Der sekundäre Verlust des Virus
aufgrund des Abfalls der CD4-positiven Zellen, zu dem es ja auch bei einer
verlangsamten Krankheitsprogression kommt, würde schließlich zum Verschwinden
des protektiven Effekts führen. Insofern könnte die Schlussfolgerung von van der Bji
et al. zutreffen, dass die GBV-C-Virämie bei Patienten mit sehr niedrigen CD4Werten eher einen Marker als eine Ursache für die Intaktheit der zellulären Immunität
darstellt, während Patienten in weniger weit fortgeschrittenen CD4-Stadien von der
HIV/GBV-C-Koinfektion profitierten.
6.2.2.2. HIV-spezifische Laborwerte
Wurden die über CD4-Zellzahlen definierten Stadien beider Subkohorten, in denen
sich die Patienten zum Zeitpunkt der Datenerhebung befanden, miteinander
verglichen, so zeichnete sich ein ähnliches Bild ab, wie bei der Betrachtung der
klinischen Stadien. Obwohl die GBV-C-positiven Patienten sich häufiger als die
Vergleichsgruppe im WHO-Stadium 1 mit normaler CD4-Zellzahl befanden, waren
die beobachteten Unterschiede zu gering, um von einer wesentlich besseren
immunologischen Situation der Koinfizierten zu sprechen. Auch die Tatsache, dass
die über den gesamten Beobachtungszeitraum gemessenen CD4-Werte GBV-Cpositiver und GBV-C-negativer Patienten annähernd gleich waren, spricht gegen
einen starken protektiven Einfluss der Koinfektion.
Bei
dieser
allgemeinen
Betrachtungsweise
wird
jedoch
die
individuell
unterschiedliche Therapieerfahrung und HIV-Infektionsdauer der Patienten nicht
berücksichtigt. Dies könnte dazu geführt haben, dass eine geringfügige GBV-Cinduzierte Verlangsamung des CD4-Zellabfalls weniger deutlich zu Tage tritt. Um den
Einfluss der genannten Faktoren auszuschalten, bildeten wir eine Untergruppe
82
Diskussion
therapienaiver Patienten, deren HIV-Infektionszeitpunkt anamnestisch bekannt war.
Die in dieser Subkohorte fünf Jahre nach Infektion gemessenen CD4-Werte waren
jedoch, ähnlich den über den gesamten Beobachtungszeitraum gemessenen CD4Werten, für GBV-C-Koinfizierte nur tendenziell höher. In der Untersuchung von
Williams et al. waren dagegen in einer Kohorte untherapierter Patienten mit
bekanntem HIV-Serokonversionszeitpunkt fünf Jahre nach Infektion signifikant
höhere CD4-Werte und ein deutlich langsamerer Abfall der CD4-Zellen in der GBV-Cvirämischen Gruppe beobachtet worden. Der Grund für diesen Unterschied könnte in
der Größe der von uns gebildeten Untergruppe bestehen. Diese umfasste lediglich
61 Patienten, während in der Studie von Williams et al. 271 Patienten untersucht
worden waren. Mit einer Tendenz zu höheren CD4-Werten bei Therapienaiven
widersprechen unsere Ergebnisse also nicht grundsätzlich dem von Williams et al.
beobachteten Effekt.
Analog zum klinischen Verlauf der HIV-Infektion zeigten sich in den Kaplan-MeierAnalysen des CD4-Zellverlusts geringe, nicht signifikante Vorteile für die GBV-Cinfizierte Subgruppe. Am deutlichsten wurden diese wiederum innerhalb der ersten 7
Jahre nach Erstdiagnose, allerdings waren sie insgesamt weniger ausgeprägt, als
beim klinischen Verlauf. Auch hier könnte der zunehmende Anteil antretroviral
Therapierter zu einer Abnahme des initial deutlicher ausgeprägten Effekts der
Koinfektion geführt haben.
Die über den gesamten Beobachtungszeitraum gemessenen HI-Virus-Lasten waren
in beiden Gruppen praktisch gleich. Dieser Parameter ist jedoch nur bedingt
geeignet, einen möglichen Unterschied zwischen GBV-C-Positiven und -Negativen
erkennen zu lassen. Viele Faktoren, wie z. B. die jeweilige Beobachtungszeit des
Patienten, der Zeitpunkt der HIV-Diagnose und des Therapiebeginns bezogen auf die
Erkrankungsdauer, Compliance und die Wirksamkeit der Therapie werden bei dieser
Art der Auswertung nicht berücksichtigt, obwohl sie einen starken Einfluss auf das
Ergebnis
haben.
Liegt
die
Viruslast
vor
Therapiebeginn
oft
bei
einigen
hunderttausend Kopien pro ml, fällt sie unter HAART zumeist unter die
Nachweisgrenze. Patienten mit langem Krankheitsverlauf und vielen unter Therapie
gemessenen Werten wurden beim Vergleich der Durchschnittswerte stärker
berücksichtigt, als solche, bei denen nur wenige Messungen vorlagen. Zwar
unterscheiden sich die mittleren Beobachtungs- und Therapiezeiten beider Gruppen
nicht, jedoch lässt sich nicht ausschließen, dass ein möglicherweise geringer Einfluss
83
Diskussion
des GBV-C auf die Viruslast durch die Menge der das Ergebnis beeinflussenden
Faktoren überlagert wurde.
Wesentlich genauer lassen sich Unterschiede in der Viruslast durch den Vergleich
der vor dem Beginn der Therapie gemessenen Viruslast bestimmen. Dieser Wert gibt
zumeist den Setpoint der HIV-Virämie wieder, welcher nach der Initialphase der
Infektion jahrelang relativ stabil bleibt. Es wurde somit pro Patient jeweils nur ein
Wert in die Auswertung einbezogen, welcher zudem von der Dauer der HIV-Infektion
wenig, und von der antiretroviralen Therapie gar nicht beeinflusst war. Hierbei traten
deutlichere Unterschiede zwischen GBV-C-positiven und GBV-C-negativen Patienten
zu Tage, als beim Vergleich der Gesamt-Viruslasten, und es zeichnete sich ein
leichter Vorteil für die GBV-C-virämische Gruppe ab. Dieser Unterschied war zwar
wiederum statistisch nicht signifikant, jedoch konnten wir damit die von mehreren
Autoren beschriebene Hemmung der HIV-Replikation durch das GB-Virus-C
nachvollziehen [Lefrere, 1999] [Tillmann, 2001] [Brumme, 2002].
6.2.2.3. Einfluss der Ko-Infektion auf die Therapie
Wie der natürliche Verlauf der HIV/GBV-C-Koinfektion, so ist auch der Einfluss des
Flavivirus auf die antiretrovirale Therapie bisher widersprüchlich diskutiert worden.
Der von der Mehrzahl der Autoren festgestellte positive Einfluss der GBV-C-Infektion
auf den Erfolg der HAART konnte mit der hier vorliegenden Studie nicht bestätigt
werden. Im Gegensatz zu Antonucci et al. stellten wir in der GBV-C-positiven
Subgruppe ein tendenziell höheres Risiko des Wiederanstiegs der HIV-Last nach
Therapiebeginn fest. Darüber hinaus erreichten GBV-C-koinfizierte Patienten
seltener als GBV-C-negative eine komplette Unterdrückung der HIV-Replikation. Ein
geringer Vorteil fand sich in der GBV-C-positiven Gruppe bezüglich des
immunologischen Erfolges der Therapie, womit die von Voirin et al. und Rodriguez et
al. gemachten Beobachtungen bestätigt werden. Allerdings erreichten sämtliche den
Therapieerfolg betreffenden Unterschiede zwischen der GBV-C-positiven und der
GBV-C-negativen Subgruppe in unserer Studie keine statistische Signifikanz.
Insofern tendieren die Ergebnisse dieser Untersuchung, wie von Brumme et al. und
Tillmann et al. beschrieben, eher in Richtung eines neutralen Effekts der GBV-CInfektion auf den virologischen und immunologischen Erfolg der antretroviralen
Therapie [Brumme, 2002] [Tillmann, 2003].
84
Diskussion
6.2.3. Mögliche Mechanismen der Interaktion von HIV und GBV-C
Zusammengefasst sprechen die Ergebnisse dieser Studie also eher gegen einen
starken protektiven Effekt der GBV-C-Infektion für HIV-Infizierte. Da HIV/GBV-CKoinfizierte jedoch sowohl klinisch, als auch bezüglich der HIV-relevanten
Laborparameter tendenziell bessere Werte aufwiesen, ist ein geringer Vorteil,
insbesondere für therapienaive Patienten nicht auszuschließen. Zudem sind die
Studien von Williams et al. und Lefrere et al. nicht zu ignorieren, welche bei
unbehandelten Patienten mit definierter HIV-Infektionsdauer einen protektiven Effekt
der Ko-infektion nachwiesen. Die Beobachtungen dieser Autoren werden durch Invitro-Experimente gestützt, in denen eine deutliche Hemmung der HIV-Replikation
durch das Flavivirus gezeigt wurde [Xiang, 2001] [Nattermann, 2003] [Schneider,
2001] [Jung, 2005]. Die Frage nach den Mechanismen dieser Interaktion konnte mit
diesen Untersuchungen zumindest teilweise beantwortet werden.
Prinzipiell ist für eine Inhibition des HIV durch das GBV-C sowohl eine direkte
Interaktion zwischen beiden Viren (z. B. in Form einer Konkurrenz um Rezeptoren
oder zelleigene Replikationsmechanismen), als auch ein, über verschiedene
Faktoren des Immunsystems vermittelter, indirekter Einfluss denkbar.
Voraussetzung für eine direkte Interaktion wäre unter anderem, dass beide Viren in
den gleichen Zellen replizieren. Dies ist prinzipiell möglich. Xiang et al. infizierten ein
Zellgemisch von PBMC mit HIV und GBV-C. Dabei stellte sich heraus, dass Zellen,
welche gleichzeitig mit GBV-C und HIV infiziert wurden, nach sechs Tagen eine
Inhibition der HIV-Vermehrung um ca. 50 % gegenüber HIV-monoinfizierten Zellen
zeigten. In Zellen, die zuerst mit GBV-C und 24 Stunden später mit HIV infiziert
wurden, replizierte das HIV fast gar nicht mehr. Mit diesem Experiment konnte keine
Aussage darüber getroffen werden, ob es sich bei den mit dem Flavivirus infizierten
Zellen um genau die gleichen Zellen handelte, welche auch das HIV als Wirtszellen
benutzte, und ob die Repression des HIV durch eine intrazelluläre Konkurrenz der
beiden Viren bedingt war [Xiang, 2001]. In einem weiteren Experiment wurde jedoch
nachgewiesen, das bestimmte GBV-C-Klone in der Lage sind, in CD4-positiven
Zellen zu replizieren [Xiang, 2000]. Diese Beobachtung lässt eine direkte Interaktion
beider Viren zumindest als möglich erscheinen. Es kann jedoch nicht als gesichert
gelten, dass sie auch in vivo zutrifft.
Die von Xiang et al. nachgewiesene Fähigkeit des GBV-C, in CD4-positiven Zellen zu
replizieren, wurde zudem nicht für alle Isolate des Flavivirus bestätigt [Fogeda, 1999]
85
Diskussion
[Jung, 2005]. Der unterschiedliche Zelltropismus verschiedener GBV-C-Isolate
könnte somit eine mögliche Erklärung für die widersprüchlichen Beobachtungen der
zum Verlauf der HIV/GBV-C-Koinfektion durchgeführten Studien darstellen. So ist in
den bisher durchgeführten Untersuchungen nicht evaluiert worden, ob die fünf
Subtypen des GBV-C, welche eine unterschiedliche Verteilung innerhalb der
Weltbevölkerung haben, sich in ihrer Affinität zu Lymphozyten unterscheiden. Um
den Einfluss des Flavivirus auf die HIV-Replikation zu beurteilen, sind daher weitere
Untersuchungen notwendig, die die Zellspezifität des GBV-C in vivo aufklären. Auch
sollte
in
zukünftigen
klinischen
Studien
der
GBV-C-Subtyp
der
Patienten
berücksichtigt werden.
Untersuchungen zum Gewebetropismus liefern Argumente gegen eine direkte
zelluläre Konkurrenz, da beide Viren unterschiedliche Organe der Replikation
bevorzugen. So repliziert HIV vorwiegend in den Lymphknoten, im Gegensatz zu
GBV-C, dessen replikative Formen von RNA zwar in Milz und Knochenmark, nicht
jedoch in Lymphknoten gefunden wurden [Tucker, 2000].
Fasst man die Erkenntnisse bezüglich des Zell- und Gewebetropismus des GBV-C
zusammengenommen, so ist eine direkte Interaktion zwischen beiden Viren zwar
denkbar, trifft jedoch nur für wenige GBV-C-Isolate zu. Die hierbei wirkenden
Mechanismen sind im einzelnen bisher nicht bekannt.
Demgegenüber sprechen die Ergebnisse mehrerer In-vitro-Untersuchungen dafür,
dass die GBV-C-vermittelte Hemmung des HIV durch komplexere Mechanismen des
Immunsystems bedingt ist. Eine besondere Rolle scheinen hierbei die natürlichen
Liganden jener Rezeptoren zu spielen, welche für den Eintritt des HIV in seine
Zielzelle benötigt werden. Es wurde gezeigt, das zytotoxische T-Lymphozyten in der
Lage sind, die β-Chemokine RANTES, MIP-1α und MIP-1β zu sezernieren, welche
die Infektion von Zellen mit dem HI-Virus blockieren [Cocci, 1995]. RANTES wurde
als natürlicher Ligand des CCR5-Rezeptors identifiziert [Deng, 1996].
Nattermann et al. konnten nachweisen, dass das E2-Protein des GBV-C spezifisch
an den CD81-Rezeptor von CD8-Lymphozyten bindet, was eine dosisabhängige
Freisetzung von RANTES zur Folge hat [Nattermann, 2003]. Dies führt zu einer
Herunterregulation des CCR5- Rezeptors auf der Oberfläche von Makrophagen,
wodurch der Eintritt des HIV in diese Zellen erschwert wird. Der Mechanismus wird
allerdings nur bei HIV-Isolaten wirksam, die den CCR5-Rezeptor als Korezeptor
benutzen. Da das HIV mit zunehmender Infektionsdauer vermehrt den CXCR4-
86
Diskussion
Korezeptor nutzt, könnte sich, wie von uns beobachtet, der protektive Effekt des
GBV-C in späteren Krankheitsstadien verlieren.
Die Beobachtung, dass die persistierende GBV-C-Infektion zu einer vermehrten
Freisetzung natürlicher Liganden der von HIV benötigten Ko-Rezeptoren führt, wird
auch in einer neueren Untersuchung bestätigt [Xiang, 2004]. Wurden PBMC mit
GBV-C und HIV infiziert, zeigte sich eine dosisabhängige Hemmung der HIVReplikation. Dies galt interessanterweise sowohl für HIV-Stämme, die den CCR5Rezeptor, als auch für solche, die den CXCR4-Rezeptor benutzen. In GBV-Cinfizierten Zellen war die Expression und Sekretion von RANTES, MIP-1α, MIP-1β
höher als in Zellen, welche nur mit HIV infiziert worden waren. Doch auch für SDF-1,
einen Liganden des CXCR4-Rezeptors, fanden sich in GBV-C-infizierten PBMC
höhere Expressions- und Sekretionsratenraten. Als Resultat der vermehrten
Ausschüttung natürlicher Liganden, wurde eine verminderte Dichte von CCR5- und
CXCR4-Rezeptoren auf der Oberfläche der PBMC im Sinne einer Herunterregulation
beobachtet. Der inhibitorische Effekt des GBV-C auf die Vermehrung des HIV in vivo
könnte also durchaus auf einer durch Chemokine vermittelten Downregulation der für
die
HIV-Infektion
notwendigen
Immunschwächevirus
mit
den
Rezeptoren
natürlichen
beruhen.
Liganden
Eine
des
Konkurrenz
CCR5
um
des
diese
Bindungsstelle wäre als Ursache der Replikationshemmung ebenfalls denkbar. Eine
sinnvolle Ergänzung für folgende klinische Studien könnte die Bestimmung der
Chemokine
RANTES,
MIP-1α,
MIP-1β
und
SDF-1
in
GBV-C-positiven
Patientenseren sowie eine Messung der CCR5- bzw. der CXCR4-Rezeptorendichte
sein.
Doch nicht allein die Sekretion von β-Chemokinen durch zytotoxische T-Zellen
scheint für die GBV-C-induzierte Hemmung der HIV-Replikation verantwortlich zu
sein. Einer Arbeitsgruppe der Universität Erlangen gelang es kürzlich nachzuweisen,
dass weitere, sowohl von CD4-, als auch von CD8-Zellen produzierte, lösliche
Faktoren zu einer Verminderung der HIV-Replikationsrate führen [Jung, 2005]. Es
fanden sich in mit Zellüberständen GBV-C-positiver Seren inkubierte und
anschließend mit HIV infizierten PBMC erhöhte Sekretionsraten von RANTES, MIP
1α und MIP 1β. Im Gegensatz zu den Beobachtungen von Xiang et al. zeigte sich
jedoch keine Induktion des CXCR4-Liganden SDF-1. Die beobachtete Inhibition traf
dennoch sowohl auf M-trope als auch auf T-trope HIV-Isolate zu, war also
unabhängig vom jeweils benutzten Korezeptor.
87
Diskussion
Die Vermutung, dass die GBV-C-Infektion die Bildung eines löslichen Faktors
induziert, welcher die Replikation des HIV hemmt, wird auch durch Experimente der
Freiburger Arbeitsgruppe von J. Schneider et al. gestützt. PBMC wurden zunächst
mit HIV und anschließend mit GBV-C-positivem sowie mit GBV-C-negativem
Patientenserum inkubiert. Nach vier Tagen wurde die Menge der neu produzierten
HIV-Partikel gemessen. Es zeigte sich in den mit GBV-C-positivem Serum
inkubierten Ansätzen eine 78-prozentige Inhibition der HIV-Vermehrung. Bei
Wiederholung des Experiments mit Seren, aus denen sämtliche GBV-C-Partikel
abzentrifugiert
worden
waren,
blieb
die
Replikationshemmung
in
gleicher
Größenordnung erhalten. Der inhibitorische Effekt schien also auch hier nicht direkt
vom Virus auszugehen. Insgesamt weisen die Experimente von Schneider et al. auf
die Existenz eines, speziell in GBV-C-positiven Patienten gebildeten, Faktors hin, der
mindestens 12 kDa groß, hitze- und kältestabil ist, kurzfristig wirksam die Replikation
des HIV vermindert und seine Infektiosität herabsetzt [Schneider et al., nicht
veröffentlicht].
In Zusammenschau der Ergebnisse von Nattermann, Xiang, Jung und Schneider ist
es sehr wahrscheinlich, dass der günstigere Krankheitsverlauf HIV/GBV-CKoinfizierter einerseits durch von CD8-Lymphozyten sezernierte β-Chemokine
vermittelt ist, und andererseits noch weitere, auch von CD4-Zellen sezernierte,
Faktoren die Replikation von sowohl M-, als auch T-tropen HI-Virusstämmen
inhibieren.
Die erhöhte Sekretion von Korezeptor-Liganden scheint allerdings nicht der einzige
protektive Mechanismus der GBV-C-Koinfektion zu sein. Xiang et al. identifizierten
kürzlich ein zweites Protein des GBV-C, das NS5A, welches in der Lage ist, durch
einen bisher unbekannten Mechanismus die HIV-Replikation zu unterdrücken [Xiang,
2005].
Als eine weitere Möglichkeit der Beeinflussung der HIV-Replikation wurden GBV-C
induzierte Effekte auf das Immunsystem beschrieben, die mit einem veränderten
Zytokinprofil in der GBV-C positiven Gruppe einhergingen. GBV-C-virämische
Patienten wiesen in dieser Untersuchung, verglichen mit GBV-C-Negativen, höhere
Werte für IL-2 und niedrigere Werte für IL-4 und IL-10 auf [Nunnari, 2003]. Dies
deutet darauf hin, dass durch die HIV/GBV-C-Koinfektion ein Zytokinprofil
aufrechterhalten wird, welches die zelluläre Immunabwehr stimuliert und dazu
beiträgt, die HIV-Infektion möglichst lange Zeit mit Hilfe von T-Lymphozyten zu
kontrollieren.
88
Diskussion
Nicht zuletzt kommen für eine inhibitorische Wirkung des GBV-C-Infektion auf die
HIV-Vermehrung auch unspezifische virusinhibierende Faktoren, wie z. B. eine GBVC–induzierte Sekretion von IFN α, in Frage. Dieses Zytokin wird von virusinfizierten
Zellen sezerniert und bindet an die Oberfläche gesunder Zellen, was diese weniger
empfänglich für eine Infektion macht. Für einen nahen Verwandten des GBV-C, das
tierpathogene BVDV, wurde die Induktion von IFN α und die darauf folgende
Hemmung der Infektion mit einem weiteren Virus nachgewiesen [Elvander, 1998].
Denkbar wäre ein ähnlicher Effekt durch das GBV-C. Es wäre daher für folgende
Studien bzw. In-vitro-Experimente interessant, zu prüfen, ob sich in Seren GBV-CInfizierter höhere Interferon-α-Spiegel finden, als bei GBV-C-Negativen.
Trotz
bedeutender
therapeutischer
Fortschritte
und
einer
deutlichen
Prognoseverbesserung für die Infizierten ist es bis zum heutigen Zeitpunkt nicht
gelungen,
das
HI-Virus
dauerhaft
zu
kontrollieren
und
seine
Verbreitung
einzudämmen. Da sich die HIV-Epidemie weltweit in bedrohlichem Maße ausbreitet
und die medikamentöse Therapie an ihre ökonomischen und medizinischen Grenzen
stößt, werden HIV und AIDS auch in Zukunft eine große Herausforderung für
Forschung
und
Gesundheitspolitik
sein.
In-Vitro-Experimente,
welche
die
Mechanismen der GBV-C-induzierten Hemmung der HIV-Replikation untersuchen,
leisten einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der immunologischen Vorgänge bei
der Abwehr viraler Infektionen, und ermöglichen es eventuell eines Tages, eine
antiretrovirale Strategie jenseits der pharmakologischen Therapie zu finden.
89
Zusammenfassung
7. Zusammenfassung
Zur Klärung der Frage nach dem Einfluss der persistierenden GBV-C-Infektion auf
die Krankheitsprogression HIV-Infizierter führten wir eine Studie mit 346 HIVpositiven Patienten aus dem Raum Freiburg durch. In zusammenfassender
Auswertung der Ergebnisse dieser Studie, konnte der von einigen Autoren postulierte
stark protektive Effekt der GBV-C-Infektion für HIV-Infizierte nicht mit statistischer
Sicherheit nachgewiesen werden. Tendenziell zeigte sich jedoch für die GBV-C/HIVkoinfizierte Subgruppe eine langsamere Progression zu symptomatischen Stadien.
Wir ziehen aus unseren Beobachtungen den Schluss, dass die persistierende GBVC-Infektion in der Frühphase der HIV-Infektion keinen oder allenfalls einen geringen
protektiven Effekt für Patienten darstellt.
Neben dem Krankheitsverlauf bei HIV/GBV-C-Koinfektion untersuchten wir den
Einfluss der GBV-C-Infektion auf den Erfolg der antiretroviralen Therapie bei HIVInfizierten. Es fanden sich keine Hinweise für einen signifikanten Einfluss der GBV-CInfektion auf die Wirksamkeit von HAART. Um eine möglichst exakte Aussage über
den Einfluss des Flavivirus auf die HIV-Infektion zu machen, sind jedoch weitere
Studien notwendig, in denen der Krankheitsverlauf bei untherapierten Patienten mit
bekanntem HIV-Infektionszeitpunkt untersucht wird. Auch der jeweilige GBV-CSubtyp sowie die Dauer der GBV-C-Infektion sollten bei der Auswertung
nachfolgender Studien Berücksichtigung finden.
Zur Detektion der GBV-C-Infektion, insbesondere in größeren Patientenkollektiven,
ist die Real-Time-RT-PCR mittels LightCycler grundsätzlich geeignet. Insbesondere
der von Tillmann et al. entwickelte Assay ist der konventionellen PCR bezüglich
Sensitivität und Spezifität annähernd ebenbürtig. Er bietet zudem die Möglichkeit der
Quantifizierung der GBV-C-Virämie. Für folgende Studien stellt die LightCycler-PCR
daher
eine attraktive Möglichkeit zur
Studienteilnehmer dar.
90
Bestimmung
des
GBV-C-Status
der
Anhang
8. Anhang
8.1. Literaturverzeichnis
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Abbildung 2: Stammbaum der Flaviviridae ................................................................6
Quelle: bibd.uni-giessen.de/doc/2001/uni/d010057/do10057d.pdf
Abbildung 3: Schematische Darstellung des GBV-C..................................................8
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Abbildung 4: Vergleich des Genoms von GBV-C und HCV .......................................9
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Abbildung 5: Verbreitung und Prävalenz des HIV 2005 ...........................................11
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Abbildung 6: Inzidenz von HIV, AIDS und AIDS-assoziierten Todesfällen in
Deutschland...............................................................................................................12
Quelle: RKI, Epidemiologisches Bulletin, 2005
Abbildung 7: Prävalenz von HIV, AIDS und HAART in Deutschland.......................12
Quelle: RKI, Epidemiologisches Bulletin, 2005
Abbildung 8: Aufbau des HIV-Partikels.....................................................................13
Quelle: www.wellesley.edu/Chem101/hiv/maturhiv.gif
Abbildung 9: Eintritt des HIV in die CD4-Positive Zelle............................................14
Quelle: Klinischer Leitfaden HIV, Gürtler/ Rockstroh, Abbott GMBH
Abbildung 10: Replikationszyklus des HIV...............................................................15
Quelle: Klinischer Leitfaden HIV, Gürtler/ Rockstroh, Abbott GMBH
Abbildung 11: Das Genom des HIV-1.......................................................................16
Quelle: Klinischer Leitfaden HIV, Gürtler/ Rockstroh, Abbott GMBH
Abbildung 12: Vorläuferproteine und daraus hervorgehende funktionelle Proteine
des HIV-1...................................................................................................................16
Quelle: Klinischer Leitfaden HIV, Gürtler/ Rockstroh, Abbott GMBH
Abbildung 13: Natürlicher Verlauf der HIV-Infektion ................................................18
Quelle: Micrbiology and Immunology online, University of South Carolina
Abbildung 14: Prinzip der Lightcycler-PCR mittels Taqman-Probes.........................40
Quelle:Randy Rasmussen, PhD, Idaho Technologie; Idahotch.com
Abbildung 15: Amplifikationskurve der RNA-Standards ..........................................41
101
Anhang
Abbildung 16: Amplifikationskurven von drei stark positiven, einer schwach positiven
und fünf negativen Serumproben...............................................................................42
Abbildung 17: Standard-Eichkurve der RNA-Proben aus Abbildung15....................43
Abbildung 18: Nachweis des PCR-Produktes mittels Gelelektrophorese................50
Abbildung 19: Anteil GBV-C-Positiver und GBV-C-Negativer an den einzelnen
Risikogruppen............................................................................................................59
Abbildung 20: Prozentualer Anteil der klinischen WHO-Stadien in der GBV-Cnegativen und der GBV-C-positiven Subkohorte.......................................................61
Abbildung 21: Progressionsraten zu WHO-Stadium B ab HIV-Erstdiagnose
(p = 0,08) A:GBV-C negativ, B: GBV-C positiv ..........................................................64
Abbildung 22: Progressionsraten zu WHO-Stadium B ab HIV-Infektionszeitpunkt
(p = 0,11) A: GBV-C negativ, B: GBV-C positiv..........................................................64
Abbildung 23: Progressionsraten zu WHO-Stadium C ab HIV-Erstdiagnose
(p = 0,51) A: GBV-C negativ, B: GBV-C positiv..........................................................64
Abbildung 24: Progressionsraten zu WHO-Stadium C ab HIV-Infektionszeitpunkt
(p = 0,83) A: GBV-C negativ; B: GBV-C positiv..........................................................64
Abbildung 25: Prozentualer Anteil der Patienten in den CD4-Stadien 1-3 in der GBVC-positiven und der GBV-C-negativen Subkohorte ...................................................65
Abbildung 26: Progressionsraten zu WHO-Stadium 2 ab HIV-Infektionszeitpunkt
(p = 0,61) A: GBV-C negativ, B: GBV-C positiv..........................................................66
Abbildung 27: Progressionsraten zu WHO-Stadium 2 ab HIV-Erstdiagnose
(p = 0,37) A: GBV-C negativ, B: GBV-C positiv..........................................................66
Abbildung 28: Progressionsraten zu WHO-Stadiium 3 ab HIV-Erstdiagnose
(p = 0,50) A: GBV-C negativ, B: GBV-C-positiv..........................................................66
Abbildung 29: Progressionsraten zu WHO-Stadium 3 ab HIV-Infektionszeitpunkt
(p = 0,50) A: GBV-C negativ, B: GBV-C-positiv..........................................................66
102
Anhang
8.3. Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Ergebnisse der LightCycler-Assays..........................................................53
Tabelle 2: Zusammenfassung der Testergebnisse aus FA, HA und Nested-PCR.....54
Tabelle 3: Charakteristika der Gesamtkohorte..........................................................58
Tabelle 4: Vergleich der Grundcharakteristika GBV-C-Positiver und GBV-C-Negativer
...................................................................................................................................60
Tabelle 5: Vergleich der klinischen Stadien und des Langzeitüberlebens GBV-CPositiver und GBV-C-Negativer..................................................................................62
Tabelle 6: Vergleich von CD4-Zellstadien, mittlerer CD4-Zellzahl und Viruslast GBVC-Positiver und GBV-C-Negativer..............................................................................68
Tabelle 7: Anzahl der verordneten Medikamente und Substanzklassen...................69
Tabelle 8: Virologischer Erfolg der HAART...............................................................70
103
Anhang
8.4. Abkürzungsverzeichnis
AIDS
Aquired Immunodeficiency Syndrom
BVDV
Bovine Viral Diarrhoe Virus (Virus der bovinen Virusdiarroe)
CD4/8
Cluster of Differenciation 4/8
CDC
Centers for Disease Control
CMV
Cytomegalievirus
CTL
Zytotoxische T-Lymphozyten
DNA
Desoxyribonukleinsäure
EBV
Epstein-Barr-Virus
ELISA
Enzyme linked immunosorbent assay
HAART
Hochaktive antiretrovirale Therapie
HHV8
Humanes-Herpes-Virus Typ 8
HIV
Human Immunodeficiency Virus
HSV1
Herpes Simplex Virus Typ 1
IFN
Interferon
IL
Interleukin
LTNP
Long Term Non Progressors
MIP1 α/β
Macrophage inflammatory Protein α/β
NFκB
Nuclear Factor kappa B
PCR
Polymerase Chain Reaction
PBMC
Periperal Blood Mononuklear Cells
RANTES
Regulated upon Activation T-cell expressed and secreted
RNA
Ribonukleinsäure
SD
Standardabweichung
SDF 1
Stroma Cell derived Factor 1
WHO
World Health Organisation
104
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name
Kati Franziska Spindler
Geburtsdatum
25. März 1977
Geburtsort
Chemnitz
Schulbildung
1983-1991
Grund- und Oberschule Frankenberg
1991-1995
Gymnasium Frankenberg
Studium
1995-1997
Studium der Anglistik, Universität Leipzig
1997-2005
Studium der Humanmedizin, Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
Dissertation
2001-2006
Dissertation am Institut für medizinische Mikrobiologie und
Hygiene der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau,
Abteilung Virologie bei PD Dr. rer.nat. J.Schneider
Berufliche Tätigkeit
seit Oktober 2005 Tätigkeit als Assistenzärztin in der Abteilung für Innere Medizin,
Kreiskrankenhaus Rheinfelden
Danksagung
In erster Linie bedanke ich mich bei PD Dr. rer. nat. Josef Schneider für die Betreuung der
Dissertation. Ohne seine kompetente Beratung, seine Freundlichkeit und Geduld wäre die
Fertigstellung dieser Arbeit nicht möglich gewesen. Bei Fragen und Problemen war er
jederzeit erreichbar und hat mich insbesondere in der etwas zähen Schlussphase der
Doktorarbeit immer wieder motiviert. Vielen Dank.
Die Zweitkorrektur der Dissertation wurde von PD Dr. med. Ullrich Walker übernommen,
dem ich dafür an dieser Stelle ebenfalls meinen herzlichsten Dank ausspreche.
Ein besonderer Dank gilt Professor Dr. Schulte-Mönting für die statistische Beratung und
Auswertung der Daten.
Bei PD Dr. med. Jörg-Andres Rump möchte ich mich für die Zurverfügungstellung der
Patientendaten und das mir entgegengebrachte Vertrauen herzlichst bedanken.
Meinen Eltern danke ich von ganzem Herzen für die selbstlose finanzielle und moralische
Unterstützung während meiner gesamten Ausbildung.
Und schließlich -last but not least- gilt mein Dank Pascal, Sonja, Janina, Silvie und allen
anderen Freunden, die mir mit ihrer konstruktiven Kritik und vielen Mut-mach-Gesprächen
geholfen haben, diese Arbeit zu beenden.