Vom Gen zum Verhalten: Fehlt das Entwicklungsgen Ear2, zeigt das

Jahrbuch 2004/2005 | Eichele, Gregor; Neubert, Karola | Vom Gen zum Verhalten: Fehlt das Entw icklungsgen
Ear2, zeigt das Gehirn später Funktionsstörungen in der zirkadianen Rhythmik
Vom Gen zum Verhalten: Fehlt das Entwicklungsgen Ear2, zeigt das
Gehirn später Funktionsstörungen in der zirkadianen Rhythmik
From Gene to Behaviour: Deficiency of the developmental gene Ear2
results in an abnormal circadian rhythm
Eichele, Gregor; Neubert, Karola
Max-Planck-Institut für experimentelle Endokrinologie, Hannover
Korrespondierender Autor
E-Mail: [email protected]
Zusammenfassung
Ein
Netzw erk
von
Genen
steuert
die
Gehirnentw icklung.
Viele
Entw icklungsgene
w urden
bereits
charakterisiert, doch eine Herausforderung liegt darin, diese Gene mit einer definierten Funktion im
Erw achsenen-Gehirn zu verknüpfen. Mutationen in den betreffenden Genloci sind häufig letal. W issenschaftler
des Max-Planck-Instituts in Hannover konnten aber jetzt für den Transkriptionsfaktor Ear2 sow ohl dessen
embryonale Funktion als auch die sich daraus ableitende Rolle von Ear2 im erw achsenen Maushirn
herausfinden.
Summary
A complex netw ork of genes coordinates the development of the mammalian brain. Many developmentally
important genes have been characterized of w hich only few could be functionally linked to physiological
processes in the adult brain because of the frequent lethality of mutations in these essential loci. Scientists at
the Max Planck Institute in Hannover have now succeeded in linking the embryonic function of the transcription
factor Ear2 to specific neuronal functions in and outside of the adult rodent brain.
Das An- und Abschalten von Genen w ird durch Transkriptionsfaktoren reguliert, das heißt durch Proteine, die
an die Kontrollregionen von Genen binden. Die Rezeptoren von Sexualhormonen sind beispielsw eise solche
Transkriptionsfaktoren, die in Hormon-abhängiger Weise zahlreiche Gene regulieren und so embryonale
Entw icklungsvorgänge und physiologische Prozesse steuern. Diese Rezeptoren befinden sich im Zellkern und
w erden daher auch als nukleäre Rezeptoren bezeichnet. Neben nukleären Rezeptoren, die Hormone binden,
gibt es die so genannten Orphan-Rezeptoren: „Waisen“, für die ein Hormon entw eder nicht bekannt oder
möglicherw eise auch nicht vorhanden ist. Trotzdem regulieren diese Orphan-Rezeptoren eine Reihe von
Entw icklungsprozessen z. B. im zentralen Nervensystem. Ear2 (auch bekannt als Nr2f6) ist einer von ihnen und
bildet zusammen mit den Transkriptionsfaktoren COUP-TFI und COUP-TFII eine Unterfamilie. Für Ear2 ist es
nun gelungen, eine lebensfähige Mausmutante zu generieren und so seine Funktion im Entw icklungsprozess
des
Maushirns
aufzuzeigen:
Das Ear2-Gen w urde
mittels
molekulargenetischer Methoden (homologe
Rekombination) abgeschaltet. An dieser Mausmutante – bezeichnet als Ear2 -/- – konnten Forscher in der
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Ear2, zeigt das Gehirn später Funktionsstörungen in der zirkadianen Rhythmik
Abteilung Eichele zeigen, dass das Fehlen von Ear2 w ährend der Embryogenese in der erw achsenen Maus zu
erhöhtem Schmerzempfinden führt und das zirkadiane System des Vorderhirns beeinträchtigt. Diese Defizienz
in der erw achsenen Maus konnten die Forscher auf einen ganz spezifischen Defekt in einer kleinen, aber
w ichtigen Gehirnregion zurückführen. [1]
Ear2 und der Locus coeruleus
Der nukleäre Orphan-Rezeptor Ear2 w ird w ährend der frühen Embryonalentw icklung kurzzeitig in einem Teil
des Gehirns exprimiert, aus dem unter anderem der Locus coeruleus (LC) entsteht. Der LC ist ein Kern im
Säugerhirn, der die Hauptquelle des Neurotransmitters Noradrenalin darstellt. Das w egen seiner tiefblauen
Färbung im Menschen als Locus coeruleus bezeichnete Gehirnareal besteht bei der Maus aus etw a 1300
Neuronen, beim Menschen umfasst es rund 3000 Neuronen. Der LC sendet ein Netzw erk von Nervenfasern in
praktisch alle Hirnregionen aus und reguliert über Noradrenalin und möglicherw eise auch über w eitere
Neurotransmitter
ein
breites
Spektrum
von
Verhaltens-
und
physiologischen
Funktionen,
w ie
das
Erregungssystem, das Lernverhalten oder das Schmerzempfinden. Die Entw icklung und Funktion des LC zu
verstehen ist daher von großem Interesse. Mit der Ear2-Mausmutante hatten die W issenschaftler die
Möglichkeit, hierüber Näheres zu erfahren. Denn ohne das Ear2-Gen, so zeigten die Schnitte durch das Gehirn
erw achsener Mäuse, fehlten etw a 70 % der Zellen des Locus coeruleus, w obei vor allem Neuronen im
dorsalen Teil betroffen w aren (Abb. 1). Normalerw eise w erden von dort vor allem noradrenerge Fasern (d. h.
Fasern, w elche den Neurotransmitter Noradrenalin ausschütten) in die Großhirnrinde (Kortex) geschickt; in der
Ear2-Mutante ist die Anzahl der dorsalen Neuronen aber so reduziert, dass die kortikale Konzentration an
Noradrenalin viermal geringer als bei der normalen Maus ist. Die W issenschaftler ziehen daraus den Schluss,
dass die verminderte Konzentration an Noradrenalin eine Beeinträchtigung der Funktionen der Großhirnrinde
erw arten lässt, und dies w urde dann auch gefunden.
Schnitt durch de n Locus coe rule us (LC ) in e ine m e m bryona le n
Ma ushirn (link s W ildtyp, re chts Ear2-Muta nte ). Die LC Ne urone n sind für da s Enzym Dopa m in-ß-Hydrox yla se
a nge fä rbt. Ma n be a chte die m a ssive R e duk tion de r
Ausde hnung de s LC in de r Muta nte (IV; 4. Ve ntrik e l).
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Endok rinologie /W a rne ck e
Die Signalkaskade in der Entwicklung des Locus coeruleus
W ie kommt es nun, dass der LC in der Ear2-Mutante derart unterentw ickelt ist? Die Entw icklung des LC und
die Wanderung seiner Vorläuferzellen w ird über eine Signalkaskade von Genen reguliert, die in Embryonen
o h n e Ear2, so zeigten die Versuche, partiell unterbrochen ist. In der Ursprungsregion des LC, der so
genannten rhombischen Lippe, ist der Transkriptionsfaktor Mash1 exprimiert (d.h. angeschaltet). Dieser Faktor
w iederum schaltet die Homeobox-Gene Phox2a und Phox2b an. [2] Im Ear2 -/- -Embryo w ird diese Signalkette
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Ear2, zeigt das Gehirn später Funktionsstörungen in der zirkadianen Rhythmik
unterbrochen: Es gibt nur ganz w enige Zellen, in denen die Phox2a- und Phox2b-Gene angeschaltet sind.
Diese
Beobachtung
ist
von
Bedeutung,
w eil
zuvor
gezeigt
w erden
konnte,
dass Phox
2a/b
Determinierungsgene für den LC sind: Fehlen diese Gene, bildet sich kein LC aus. Phox2a und b regulieren
außerdem die Expression der Schlüsselenzyme der Noradrenalin-Synthese. Da die Expression von Phox2a und
b vermindert, die von Mash1 in Ear2 -/- -Embryonen aber unbeeinflusst ist, postulierten Eichele und seine
Mitarbeiter, dass sich Ear2 in der Signalkaskade zw ischen Mash1 und Phox2a/b befindet. Diese Ergebnisse
zeigten, dass Ear2 offensichtlich in der frühen Entw icklung des Locus coeruleus benötigt w ird, allerdings nicht
für den gesamten LC, denn erw achsene Ear2 -/- -Mäuse hatten ja noch Restmengen an LC-Neuronen. Eichele
und sein Team postulierten daher w eitergehend, dass Ear2 als regionale Determinante w irkt und damit die
topographische Organisation des LC und die Entw icklung von LC-Fasern mitbestimmt.
Funktionale Defekte im zirkadianen Verhalten
Abgesehen von den bereits oben angemerkten Funktionen des LC gibt es Hinw eise, dass dieser Kern an der
Regulation des Erregungssystems und des Schlaf-Wach-Verhaltens beteiligt ist, und es ist außerdem bekannt,
dass Neuronen dieses Kerns im zirkadianen Rhythmus „feuern“. Für die Forscher in Hannover Grund genug,
die Ear2 -/- - Mutanten auf Defekte im zirkadianen System zu untersuchen, zumal dieses Gebiet seit Jahren zu
den Schw erpunkten des Instituts zählt. [3] Die W issenschaftler konzentrierten sich dabei auf das Vorderhirn,
denn dieses w ird von zahlreichen noradrenergen Nervenfasern erreicht, die vom dorsalen Teil des LC
stammen. Außerdem konnte für das Vorderhirn bereits ein eigener zirkadianer Schrittmacher charakterisiert
w erden. Dieser reguliert unter anderem die Anpassung der Aktivitätsphasen an veränderte Lichtzyklen und
zeitliche Verschiebungen im Nahrungsangebot.
Mithilfe der In-situ-Hybridisierung (ISH) konnte zunächst gezeigt w erden, dass das Uhrengen Period1 (Per1) im
Vorderhirn der Ear2 -/- - Mutante nicht mehr in einem zirkadianen Rhythmus exprimiert w ird. Bei der ISH w ird in
einem hauchdünnen Gehirnschnitt die Boten-RNA eines Gens mit einer entsprechenden Sonde angefärbt. Das
MPI für experimentelle Endokrinologie verfügt in dieser Technologie über ein ausgereiftes Know -how und hat
in den vergangenen Jahren mit "GenePaint" eine Automatisierung der In-situ-Hybridisierung entw ickelt. Neben
der Bestimmung der Genexpressionsmuster führten Henrik Oster und sein Zirkadian-Team Verhaltensversuche
durch, um die phänotypischen Ausw irkungen der Ear2 Defizienz im zirkadianen System des Kortex zu
bestimmen. Es w urde deutlich, dass die morphologische Veränderung des LC, bedingt durch das Fehlen von
Ear2 in der Embryonalentw icklung, eine Verzögerung in der Anpassung an einen verschobenen Licht-DunkelZyklus nach sich zog und die Mutanten sich außerdem w eniger effizient auf eingeschränkte Fütterungszeiten
w ährend ihrer eigentlichen Ruhephase einstellen konnten (Abb. 2). Zudem konnte gezeigt w erden, dass die
Präzision der Aktivitätsrhythmik in Ear2-defizienten Tieren herabgesetzt w ar und diese unter Dauerlicht dazu
neigten, ihre Rhythmik ganz zu verlieren. Untersuchungen zur Uhren-Genexpression im suprachiasmatischen
Nukleus (SCN) zeigten, dass diese Effekte keinesw egs mit der Zentraluhr des Tieres zusammenhängen,
sondern unabhängig davon in Bereichen des Vorderhirns reguliert w erden.
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Ea r2-de fizie nte Mä use pa sse n sich schle chte r a n
e inge schrä nk te Fütte rungsze ite n a n. Die zirk a dia ne Uhr wird
m it La ufra dve rsuche n studie rt. Mä use be nutze n da s La ufra d in
de r Dunk e lhe it und sind ta gsübe r we itge he nd ina k tiv. Link s:
La ufra da k tivitä t e ine r W ildtyp-Ma us (grüne Ba lk e n;
fortla ufe nde Ta ge sind unte re ina nde r a ufge ze ichne t) unte r ad
libitum-Fütte rung (AL) und be i Be schrä nk ung de s
Futte ra nge bots a uf dre i Stunde n wä hre nd de s Morge ns (R F;
Fütte rze ite n rosa unte rle gt). Mitte : Typische Ak tivitä tsprofile
im Ta ge sve rla uf unte r ad libitum (obe n) und 3h-Futte rzuga ng
(unte n). De utlich zu e rk e nne n ist die a ntizipa torische
La ufra da k tivitä t (AA) in Erwa rtung de r Fütte rung. R e chts: Die
vorge zoge ne Ak tivitä t in Erwa rtung de r Fütte rung im Ve rhä ltnis
zur ge sa m te n Ta ge sa k tivitä t (TA) ist in Ear2-Muta nte n (-/-) im
Ve rgle ich zum W ildtyp (+/+) um ca . 50% re duzie rt.
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Endok rinologie /O ste r
Diese vielfältigen zirkadianen Defekte konnten mithilfe der Ear2-Mutante erstmals funktionell mit dem
noradrenergen System des LC in Verbindung gebracht w erden. Die komplexen Verbindungen des LC zu
anderen Zentren des zentralen Nervensystems machen diese Mutante zu einem interessanten Modellsystem
für die Untersuchung der zirkadianen Regulation zahlreicher anderer ZNS-Funktionen.
Erhöhtes Schmerzempfinden ohne das Ear2-Gen
Der Locus coeruleus spielt eine besondere Rolle im Prozess der Schmerzempfindlichkeit. Denn Noradrenalin,
das im LC produziert w ird, unterdrückt die Aktivität von schmerzvermittelnden (nozizeptiven) Neuronen und
hat so einen schmerzdämpfenden Effekt. Wenn nun ein Teil des LC fehlt, w ie in der Ear2-Mutante, sollte sich
das
auf das
Schmerzverhalten
der Mäuse
ausw irken. Die
Versuche
ergaben
tatsächlich, dass
die
Schmerzempfindlichkeit der Mutanten höher w ar, w as auf den eingeschränkten LC und die dadurch
verursachte Verringerung des Noradrenalin-Gehalts im Rückenmark zurückgeführt w erden konnte.
Ausblick
Der Locus coeruleus ist für viele physiologische Prozesse und Verhaltensw eisen bedeutsam. Die Ear2-Mutante,
der ein großer Teil des LC fehlt, eröffnet daher die Möglichkeit, die Funktionen dieses bedeutsamen Kerns im
natürlichen Umfeld zu testen. Für die innere Uhr und das Schmerzempfinden konnte die Arbeitsgruppe um
Gregor Eichele bereits entscheidende Zusammenhänge herausfinden. Es w äre nun interessant zu erforschen,
ob die Mutante Auffälligkeiten in anderen Verhaltensfunktionen zeigt, die mit dem LC in Zusammenhang
gebracht w erden. Hierzu zählen auch das Angstverhalten, das Lernverhalten oder Gedächtnisleistungen. Dazu
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Ear2, zeigt das Gehirn später Funktionsstörungen in der zirkadianen Rhythmik
w ird es zunächst w ichtig sein herauszufinden, w ie das komplexe Netz neuronaler Fasern, das vom LC
ausgesandt w ird, in der Ear2-Mausmutante verändert ist.
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[1] Warnecke, M., Oster, H., Revelli, J.-P., Alvarez-Bolado, G. and G. Eichele
Abnormal development of the locus coeruleus in Ear2(Nr2f6)-deficient mice impairs the functionality of
the forebrain clock and affects nociception.
Genes and Development 19, 614-625 (2005).
[2] Brunet, J. F. and A. Pattyn
Phox2 genes–From patterning to connectivity.
Current Opinion of Genetic Development 12, 435-440 (2002).
[3] Albrecht, U. and G. Eichele
The mammalian circadian clock.
Current Opinion of Genetic Development 13, 271-277. Review (2003).
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