Empfehlungen der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie

Empfehlungen der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie
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Z. klin. Chem. u. klin, Biochem.
8. Jg. S. 658—660, November 1970
Empfehlungen der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie
Standardisierung von Methoden zur Bestimmung von Enzymaktivitäten in biologischen Flüssigkeiten
Eine direkte Bestimmung der En^ymmenge in biologischen
Flüssigkeiten ist ohne Stofftrennung nicht möglich.
Enzyme werden daher aufgrund ihrer kataljtischen Aktivität durch Messung von Stoffumsatzraten bestimmt.
Ihr Maß ist die Enzymaktivität, deren Werte in Einheiten pro Volumen angegeben werden1). Als Standardeinheit (Unit) wird entsprechend den Empfehlungen der
Enzymkommission der IUB diejenige Enzymaktivität
bezeichnet, welche die Umwandlung von l //Mol Substrat oder die Bildung von l
! Reaktionsprodukt pro
Minute unter definierten Bedingungen katalysiert. Als
definierte Bedingungen wurden verstanden: Optimale Substrat- und Wasserstoffionen-Konzentrationen sowie eine
festgelegte Meßtemperatur. Von der Enzymkommission
der IUB wurde 1961 als Meßtemperatur 25° C, 1964 aus
meßtechnischen Gründen 30° C vorgeschlagen.
Diese Definitionen sind jedoch nicht ausreichend. Es ist
daher notwendig, Standardmethoden festzulegen. Nur bei
Verwendung von standardisierten Methoden werden
reproduzierbare und vergleichbare Ergebnisse erzielt.
Zur Standardisierung empfehlen wir folgende Parameter
festzulegen:
1. Fortlaufende Messung der Enzymkinetik2).
2. Die Reaktion soll während der gesamten Messung
linear proportional der Zeit verlaufen.
3. Substrate, Cofaktoren, Aktivatoren und Puffer sollen
optimale Reaktionsbedingungen ergeben. Dies gilt
sowohl für die Substanzen als auch für die Konzentrationen.
4. Es sollen inhibitorfreie Reagenzien verwendet werden.
5. Meßtemperatur 25° C. — Messungen bei 25° C sind
leichter standardisierbar als bei 30° C. Diese Temperatur
von 25° C kann heute zuverlässig konstant gehalten
werden; sie entspricht im übrigen der internationalen
physikochemischen Standardtemperatur.
Bei der Bestimmung verschiedener Enzymaktivitäten
können aus technischen Gründen optimale Bedingungen
nicht erreicht werden. Die praktikable Annäherung an
das Optimum wird als „optimierte Methode" bezeichnet.
Folgende optimierte Methoden wenden vorgeschlagen:
Die angegebenen Konzentrationen bezeichnen die Endkonzentrationen im Test.
x
) Hierfür wurde der Begriff „Volumenaktivität" vorgeschlagen.
) Diese Meßtechnik wird auch als „kinetischer Test" bezeichnet.
2
Lactat-Dehydrogenase, LDH
L-Lactat: NAD-Oxydoreduktase
EC 1.1.1.27
Phosphatpuffer
Pyruvat
NADH
50
0,6
0,18
pH = 7,5
LDH-1-Isoenzym, „*-HBDH"3)
2-Hydroxybutyrat: NAD-Oxydoreduktase
Phosphatpuffer
2-Oxobutyrat
NADH
50
3,0
0,18 IHM
pH = 7,5
Glutamat-Dehydrogenase, G1DH
L-Glutamat: NAD-Oxydoreduktase (desaminierend)
EC 1.4.1.2
Triäthanolamin-Puffer
2-Oxoglutarat
pH = 8,0
EDTA
ADP4)
NADH
50
7
100
2,5
1
0,2
mM
mM
mM
mM
mM
Glutamat-Oxalacetat-Transaminase, GOT
L-Aspartat: 2-Oxoglutarat-Aminotransferase
EC 2.6.1.1
Phosphatpuffer
pH = 7,4 80
L-Aspartat
200 mM
2-Oxoglutarat
12
NADH
0,18
Malat-Dehydrogenase (MDH) ,
^ 0,6 U/m/
Lactat-Dehydrogenase (LDH)5)
^1,2 U/m/
Glutamat-Pyruvat-Transaminase, GPT
L-Alanin: 2-Oxoglutarat-Aminotränsf erase
EC 2.6.1.2
Phosphatpuffer
pH = 7,4 . 80
niM
L-Alanin
800 mM
2-Oxoglutarat
18 mM
NADH
0,18 niM
Lactat-Dehydrogenase (LDH)
^ 1,2 U/m/
3
) Die hier angegebenen Bedingungen sind methodisch nicht opttmiert. Sie führen aber zu einer optimalen Diskriminierung zwischen
den beiden Isoenzymen LDH-1 und LDH-5.
4
) ADP aktiviert das Enzym.
) LDH dient zur schnelleren Entfernung von endogenem Pyruvat.
Z. Idin. Chem. u. klin. BiocKem. / 8. Jahrg. 1970 / Heft 6
Recommendations of the German Society for Clinical Chemistry
Creatin-Kinase, CK (aktiviert)
ATP: Creatin-Phosphotransferase
EC 2.7.3.2
Leutin-Arylamidase, „LAP"
Tris-Puffer
L-Leucin-4-nitranilid
Nad«)
Triäthanolamin-Püffer
p H = 7,0 100 mM
35 mM
Creatinphosphat
20 mM
Glucose
0
..
Glutathion
10 mM
Magnesium-Acetat
1,0 IHM
ADP
0,6 mM
NADP
Glucose-6-phosphat-DehydroS 1,2 U/m/
genase (G6P-DH)
Hexokinase (HK)
^ 1,2 U/m/
p H= 9 , 8
pH = 7,5
50
4
250
Der experimentelle Beleg für die Empfehlung dieser optimierten Bedingungen und die hierfür geltenden Normbereiche werden in weiteren Mitteilungen der Deutschen
Gesellschaft für Klinische Chemie veröffentlicht.
Die Kommissionen für Enzymdiagnostik und Standardisierung,
gezeichnet
H. U. Bergmeyer
H. Büttner
G. Hillmann
F. H. Kreutz
H. Lang
D. Laue
Alkalische Phosphatase, AP
Orthophosphorsäuremonoester-Phosphohydrolase
EC 3.1.3.1
Diathanolamin-Puffer
4-Nitrophenylphosphat
Mg2+
659
I M
10 mM
0,5 mM
W. Rick
E. Schmidt
F. W. Schmidt
D. Stamm
G. Szasz
6
) NaCl verhindert Trübungen des Testansatzes.
Recommendations of the German Society for Clinical Chemistry
Standardisation of methods for the estimation of enzyme activity in biological fluids
The amount of an enzyme in a biological fluid cannot be
estimated directly by analytical methods. Therefore,
enzymes are estimated by their catalytic activity, i. e.
by measuring the rate of substrate conversion. The
measure is the enzyme activity, which is expressed as
units per volume1).
According to the recommendations of the Enzyme
Commission of the IUB the standard unit is defined as
that enzyme activity, which catalyzes the conversion of
1
substrate, resp. the formation of 1
reaction
product per minute under specified conditions. The
specified conditions are: optimal pH and substrate
concentration as well as defined temperature. In 1961
the Enzyme Commission of the IUB, proposed 25° C
as the standard temperature, and then in 1964, for
technical reasons, 30° C.
However, these definitions are not sufficient. It is
essential to establish standard methods, because only
by using standardized methods reproducible and comparable results will be obtained.
For standardisation we recommend the following conditions :
The term "volume activity" has been proposed for this value.
Z. klin. Chem. u. klin. Biochem. / 8. Jahrg. 1970 / Heft 6
1. Continuous monitoring of enzyme kinetics2).
2. The reaction rate should be constant during the
whole period of observation.
3. The kinds and concentrations of substrates, cofactors,
activators and buffers should result in optimal reaction
conditions. This relates to substances as well as to the
concentrations.
4. Reagents should be free of inhibitors.
5. Measurement temperature is 25° C. Measurements at
25° C are easier to be standardized than at 30° C. A temperature of 25° C can be kept constant and it conforms
with the international temperature for physico-chemical
data.
The optimal conditions for the determination of activities
of some enzymes are not technically attainable. The
practicable approximation to the optimum is called
"optimized method".
The following optimized methods are proposed:
The given concentrations are the final concentrations in
the test.
2
) This technique is also called "Kinetic Test".
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