Etablierung eines durch Verletzung induzierbaren Promotors

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Zusammenfassung
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Zusammenfassung
Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Klonierung und Charakterisierung eines durch
Läsion induzierbaren p75NTR-Promotorsbereichs. Zu diesem Zweck wurde am RZPD
in Berlin eine genomische Maus-DNA-Bank mit spezifischen Sonden gegen den bis
dahin bekannten p75NTR-Promotorbereich gescreent. Aus den erhaltenen BACKlonen konnten neue Bereiche 5´-stromaufwärts von Exon I des p75NTR isoliert und
sequenziert werden. Insgesamt konnten durch dieses Vorgehen 5.1 kb stromaufwärts
von Exon I und 2 kb stromabwärts von Exon I sequenziert und im Hinblick auf
mögliche Transkriptionsfaktorbindungsstellen untersucht werden. Durch PCRReaktion wurden verschiedene p75NTR-Promotorkonstrukte generiert und mit dem
Reportergen EGFP fusioniert. Die p75NTR-Promotor-EGFP Konstrukte wurden mit
Hilfe des pAdEasy Systems adenoviral verpackt und für die in vivo Versuche an
adulten Ratten eingesetzt. Um die Hochregulation des p75NTR zu untersuchen, wurde
am Nervus ischiadicus eine Läsion gesetzt. Die Injektion der rekombinanten
Adenoviren erfolgte in den distalen und proximalen Teil des durchtrennten Nerven.
Eine Woche nach Läsion wurden die Ratten getötet und die Gesamt-RNA aus den
verschiedenen Regionen des lädierten Nerven isoliert. Durch Real-Time PCR konnte
gezeigt werden, das ein 5.1 kb langes p75NTR Promotorfragment 5´-stromaufwärts zu
Exon I nach Läsion induziert werden kann. Die Induktion erfolgt spezifisch im
distalen Bereich der Läsion und ist auf RNA-Ebene um Faktor 8 höher als die durch
den CMV-Promotor gesteuerte Expression des Reportergens. Damit bietet sich der
klonierte Promotorbereich für Untersuchungen an Modellen für neurodegenerative
Krankheiten an, bei denen eine Reexpression des p75NTR zu beobachten ist. Durch
die Kopplung des durch Läsion regulierbaren Promotors mit therapeutischen Genen,
besteht die Möglichkeit eines gentherapeutischen Einsatzes für Krankheiten wie der
amyotrophen Lateralsklerose oder Morbus Alzheimer.
Zusätzlich wurde die Signaltransduktion für das Überleben von sensorischen
Neuronen durch BDNF oderNT4/5 über den gemeinsamen Rezeptor TrkB untersucht.
Mit Hilfe des Baculovirussystems wurde eine mutierte TrkB-Variante exprimiert, bei
der das für die Signaltransduktion wichtige Tyrosin 515 (Y515) durch Phenylalanin
ersetzt worden war (Y515F). Durch Pull-Down Assays konnte gezeigt werden, das die
IRS1-PTB Domäne spezifisch an das Y515 des TrkB Rezeptors bindet. Zusammen mit
Daten von Volker Eulenburg (Diplomarbeit 1998) konnte damit gezeigt werden, dass
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das Y515 für das Überleben von NT4-abhängigen sensorischen Neuronen essentiell
ist. Das Überleben von BDNF-abhängigen Neuronen wird durch die Mutation kaum
beeinflusst. Redundante Signalwege, zum Beispiel über die Bindung von PLCγ an das
Tyrosin 817 und anschließende Aktivierung des PI3-Kinase Wegs, erhöhen die
Variabilität der Signaltransduktion durch BDNF.
Im letzten Teil der Arbeit wurde der Einfluß des Immunsuppressivums FK506 auf den
Verlauf der amytrophen Lateralsklerose untersucht. FK506 wurde in verschiedenen
Konzentrationen in SOD1 G93A-Mäuse injiziert, nachdem die ersten Symptome der
ALS aufgetreten waren. Die motorische Leistungsfähigkeit wurde mit Hilfe des
RotaRods
bestimmt.
Zusätzlich
wurde
die
Lebensdauer
der
Versuchstiere
protokolliert. Die Daten zeigen, dass durch die intraperitoneale Gabe von FK506 keine
Verbesserung der motorischen Leistung auftritt. Die Lebensdauer wird durch FK506
nicht verlängert. Obwohl FK506 bei anderen neurodegenerativen Erkrankungen
positive Wirkung zeigt, bietet sich das Immunsuppressivum aufgrund dieser
Ergebnissse nicht für einen Einsatz bei ALS an.
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