Zusammenfassung 6. 94 Zusammenfassung Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Klonierung und Charakterisierung eines durch Läsion induzierbaren p75NTR-Promotorsbereichs. Zu diesem Zweck wurde am RZPD in Berlin eine genomische Maus-DNA-Bank mit spezifischen Sonden gegen den bis dahin bekannten p75NTR-Promotorbereich gescreent. Aus den erhaltenen BACKlonen konnten neue Bereiche 5´-stromaufwärts von Exon I des p75NTR isoliert und sequenziert werden. Insgesamt konnten durch dieses Vorgehen 5.1 kb stromaufwärts von Exon I und 2 kb stromabwärts von Exon I sequenziert und im Hinblick auf mögliche Transkriptionsfaktorbindungsstellen untersucht werden. Durch PCRReaktion wurden verschiedene p75NTR-Promotorkonstrukte generiert und mit dem Reportergen EGFP fusioniert. Die p75NTR-Promotor-EGFP Konstrukte wurden mit Hilfe des pAdEasy Systems adenoviral verpackt und für die in vivo Versuche an adulten Ratten eingesetzt. Um die Hochregulation des p75NTR zu untersuchen, wurde am Nervus ischiadicus eine Läsion gesetzt. Die Injektion der rekombinanten Adenoviren erfolgte in den distalen und proximalen Teil des durchtrennten Nerven. Eine Woche nach Läsion wurden die Ratten getötet und die Gesamt-RNA aus den verschiedenen Regionen des lädierten Nerven isoliert. Durch Real-Time PCR konnte gezeigt werden, das ein 5.1 kb langes p75NTR Promotorfragment 5´-stromaufwärts zu Exon I nach Läsion induziert werden kann. Die Induktion erfolgt spezifisch im distalen Bereich der Läsion und ist auf RNA-Ebene um Faktor 8 höher als die durch den CMV-Promotor gesteuerte Expression des Reportergens. Damit bietet sich der klonierte Promotorbereich für Untersuchungen an Modellen für neurodegenerative Krankheiten an, bei denen eine Reexpression des p75NTR zu beobachten ist. Durch die Kopplung des durch Läsion regulierbaren Promotors mit therapeutischen Genen, besteht die Möglichkeit eines gentherapeutischen Einsatzes für Krankheiten wie der amyotrophen Lateralsklerose oder Morbus Alzheimer. Zusätzlich wurde die Signaltransduktion für das Überleben von sensorischen Neuronen durch BDNF oderNT4/5 über den gemeinsamen Rezeptor TrkB untersucht. Mit Hilfe des Baculovirussystems wurde eine mutierte TrkB-Variante exprimiert, bei der das für die Signaltransduktion wichtige Tyrosin 515 (Y515) durch Phenylalanin ersetzt worden war (Y515F). Durch Pull-Down Assays konnte gezeigt werden, das die IRS1-PTB Domäne spezifisch an das Y515 des TrkB Rezeptors bindet. Zusammen mit Daten von Volker Eulenburg (Diplomarbeit 1998) konnte damit gezeigt werden, dass Zusammenfassung 95 das Y515 für das Überleben von NT4-abhängigen sensorischen Neuronen essentiell ist. Das Überleben von BDNF-abhängigen Neuronen wird durch die Mutation kaum beeinflusst. Redundante Signalwege, zum Beispiel über die Bindung von PLCγ an das Tyrosin 817 und anschließende Aktivierung des PI3-Kinase Wegs, erhöhen die Variabilität der Signaltransduktion durch BDNF. Im letzten Teil der Arbeit wurde der Einfluß des Immunsuppressivums FK506 auf den Verlauf der amytrophen Lateralsklerose untersucht. FK506 wurde in verschiedenen Konzentrationen in SOD1 G93A-Mäuse injiziert, nachdem die ersten Symptome der ALS aufgetreten waren. Die motorische Leistungsfähigkeit wurde mit Hilfe des RotaRods bestimmt. Zusätzlich wurde die Lebensdauer der Versuchstiere protokolliert. Die Daten zeigen, dass durch die intraperitoneale Gabe von FK506 keine Verbesserung der motorischen Leistung auftritt. Die Lebensdauer wird durch FK506 nicht verlängert. Obwohl FK506 bei anderen neurodegenerativen Erkrankungen positive Wirkung zeigt, bietet sich das Immunsuppressivum aufgrund dieser Ergebnissse nicht für einen Einsatz bei ALS an.