Maßgeschneiderte Enzyme durch Mutationen im Computer Tailoring

Jahrbuch 2014/2015 | Sanchez-Garcia, Elsa | Maßgeschneiderte Enzyme durch Mutationen im Computer
Maßgeschneiderte Enzyme durch Mutationen im Computer
Tailoring enzyme specificity by computational mutagenesis
Sanchez-Garcia, Elsa
Max-Planck-Institut für Kohlenforschung, Mülheim an der Ruhr
Korrespondierender Autor
E-Mail: [email protected]
Zusammenfassung
Enzyme sind hochaktive Biokatalysatoren, die untrennbar mit der Entw icklung des Lebens verbunden sind. Ein
w ichtiges Ziel der Forschung ist es, Enzymaktivitäten gezielt zu verändern, um neue therapeutisch w ertvolle
Stoffe zu synthetisieren. Voraussetzung für erfolgreiche enzymologische Experimente ist ein molekulares
Verständnis des W irkmechanismus von Enzymen. Dieser Beitrag zeigt, w ie Computersimulationen bei der
Voraussage von Mutationen helfen, die in einem großen Multienzym-Komplex zu einer gezielten Änderung der
Selektivität führen.
Summary
Enzymes are pow erful and specific biocatalysts that are inseparably linked to life. Ways to manipulate
enzymatic activity and specificity as a tool to produce new therapeutic agents are much sought after in
biomedical and industrial research. The molecular understanding of the events involved in enzymatic activity is
often of key importance for successful enzymology experiments. The article show s how computational
simulations allow ed to successfully predict, w hich single mutation can be applied to modify the specificity of a
highly selective multi-enzyme complex.
Einleitung
Enzyme sind Katalysatoren in biologischen Systemen. Obw ohl es auch RNA mit katalytischer Aktivität gibt, sind
doch die meisten bekannten Enzyme Proteine. Die eigentliche Enzymkatalyse findet in dem aktiven Zentrum
statt, w o Substrate spezifisch und mit genau definierter Orientierung so gebunden w erden, dass die
Bedingungen für eine
chemische
Reaktion optimal sind. W ichtigste
Eigenschaften von Enzymen als
Biokatalysatoren sind Effizienz und Selektivität.
Eine besondere Rolle in der Biokatalyse spielen intermolekulare Wechselw irkungen, deren molekulares
Verständnis
der
Schlüssel
zur
Planung
erfolgreicher
biomedizinischen Forschung findet man viele
Beispiele
Experimente
in
dafür, w ie
das
der
Enzymologie
Verständnis
ist.
In
der
der molekularen
W echselw irkungen zur Entw icklung neuer W irkstoffe führt. Eines der w ichtigsten Ziele der Pharmaforschung ist
die Entw icklung schneller und effizienter Verfahren für die Synthese neuer Antibiotika.
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Eine w ichtige Strategie ist hierbei die Computersimulation von Enzymeigenschaften. Dazu w erden verlässliche
Computermodelle benötigt, mit deren Hilfe Enzyme mit maßgeschneiderten Eigenschaften konstruiert w erden
können. Diese Computermodelle sind die Voraussetzung für das rationale Design von Biokatalysatoren, die
gezielt neue W irkstoffe liefern. Für die experimentellen Arbeitsgruppen ist die Computersimulation eine
Alternative zu zeitraubenden, teuren und häufig w enig erfolgreichen „trial and error“ Experimenten. Umgekehrt
ist der Input von experimentellen Ergebnissen notw endig, um die in silico Computermodelle zu validieren.
Molekulardynamik-Simulationen (MD) bilden zusammen mit multi-scale Quantenmechanik/MolekularmechanikMethoden (QM/MM) w ichtige Werkzeuge für theoretische Studien an Enzymen. W ie aus dem Namen ersichtlich
ist, beschreiben Molekulardynamik-Simulationen das zeitabhängige Verhalten molekularer Systeme. Um die
Energie der Systeme zu berechnen, w erden häufig klassische Molekülmechanik-Rechnungen eingesetzt, die
das Mittel der W ahl für große biologische Systeme sind.
Auf der anderen Seite stehen Quantenmechanik/Molekularmechanik-Methoden (QM/MM), bei denen eine
Zentralregion (z. B. die Bindungstasche eines Enzyms) mit akkuraten QM-Methoden beschrieben w ird, und der
größere, vom Reaktionsgeschehen aber w eiter entfernte Rest des Moleküls und das Lösungsmittel, in dem die
Reaktion stattfindet, mit MM-Methoden. Daher ist die QM/MM-Kombination auf ideale Weise dazu geeignet,
komplexe chemische Systeme und Biomoleküle mit hoher Genauigkeit zu beschreiben [1]. ChemShell ist das
modulare Programmpaket, das w ir für unsere Studien nutzen, w eil es erlaubt, sehr flexibel eine große Zahl an
QM- und MM-Methoden miteinander zu verbinden [2].
Polyketidsynthasen
Polyketidsynthasen (PKS) sind Multienzym-Komplexe, die in Bakterien, Pilzen und Pflanzen gefunden w erden
und für die Synthese einer Vielzahl an biologisch w irksamen Polyketiden verantw ortlich sind. Die Aktivitäten
dieser Metabolite reichen von extrem toxisch (w ie beim Maitotoxin) bis zu pharmazeutisch nützlich als
Antibiotikum, Immunsuppressivum, cholesterin-senkendes Arzneimittel oder Krebstherapeutikum, um nur
einige zu nennen (Abb. 1).
A bb. 1: Struk turvie lfa lt von Me ta bolite n m it P olyk e tid-Struk tur.
Die P KS, die für die Biosynthe se de r Antibiotik a Erythrom ycin
und Mone sin ve ra ntwortlich sind, wurde n von uns unte rsucht
[3, 4].
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In cis-Acyltransferase Typ 1 Polyketidsynthasen finden Claisen-Kondensationen zw ischen Enzym-gebundenen
Acylthioestern
und
Malonsäurebausteinen
statt.
An
diesen
Reaktionen
sind
Ketosynthasen
(KS),
Acyltransferasen (AT) und Acyl Carrier Protein (ACP) Domänen beteiligt. Optionale reduktive Folgeschritte
w erden über Ketoreductase (KR), Dehydratase (DH) und Enolreduktase (ER) Domänen katalysiert. Trotz ihrer
enormen strukturellen Vielfalt liegt allen Polyketiden diese gemeinsame biochemische Syntheselogik zugrunde.
Um neue Polyketide biosynthetisch herstellen zu können, müssen generelle Strategien zur Diversifizierung der
Bausteine in PKS entw ickelt w erden. Die Ausw ahl von Malonsäure-Bausteinen durch die PKS ist ein komplexer
Prozess, der hauptsächlich durch AT-Domänen kontrolliert w ird. Die Spezifität für bestimmte Bausteine kann
durch Verpflanzung von AT-Domänen zw ischen verschiedenen PKS geändert w erden. Allerdings hat eine
Verpflanzung
häufig
die
Bildung
nicht
funktionsfähiger
Hybrid-Enzyme
zur
Folge.
Eine
potentiell
erfolgversprechendere Vorgehensw eise ist die direkte Änderung von AT-Domänen durch gezielten Ersatz
einzelner Aminosäuren an Stelle der ganzen Domänen. Allerdings w ird diese Aufgabe durch die enorme
Komplexität der PKS und mangelndes W issen über die Bindungsstellen der Malonylthioester-Bausteine
erschw ert. Die gezielte Mutagenese von AT-Domänen ist eine große Herausforderung, und die Suche nach der
besten Strategie für das Design der Verlängerungseinheiten noch lange nicht abgeschlossen.
Ein w ichtiger Enzymkomplex für die Biosynthese des Antibiotikums Erythromycin ist die 6-Deoxyerythronolide B
Synthase (DEBS). In dieser PKS akzeptieren alle AT-Domänen ausschließlich Methylmalonyl-CoA (MMCoA) als
Substrat und zeigen eine hohe Sequenzhomologie. Die Herausforderung liegt nun darin, DEBS so zu variieren,
dass Derivate der natürlichen Produkte mit verbesserten pharmakologischen Eigenschaften gebildet w erden.
Dieser Aufgabe steht insbesondere der Mangel an verlässlicher Strukturinformation der PKS entgegen. Das
ambitionierte Ziel der Computersimulation besteht also darin, verlässliche molekulare Modelle der PKS
aufzubauen. Diese Modelle sollen Voraussagen über die gezielte Mutation der AT-Domänen in PKS erlauben,
damit
diese
künstlichen
Bausteine
akzeptieren, w as
zur
Biosynthese
nicht-natürlicher
Derivate
mit
verbesserten Eigenschaften führen sollte.
Computersimulationen an DEBS
Wegen ihrer hohen Komplexität ist die chemische Modifizierung von Naturstoffen häufig eine große
Herausforderung. W ie oben beschrieben, sind die AT-Domänen maßgebend für die Spezifität von DEBS
verantw ortlich,
und
daher
sind
die
AT-Domänen
das
primäre
Ziel
für
Mutagenese-Studien
zur
Enzymselektivität. Für die Untersuchung von DEBS w urde die letzte Acyltransferase-Domäne AT6 (AT6 DEBS)
ausgew ählt.
Um den Einfluss von Mutationen auf die Enzymaktivität zu studieren, w urde daher AT6 DEBS und seine
Wechselw irkungen mit (2S)-Methylmalonyl-CoA (MMCoA) modelliert. Ein Homologie-Modell von AT6 DEBS w urde
auf der Basis der großen Sequenzhomologie mit den AT3- und AT5-Domänen in DEBS, für die Kristallstrukturen
vorlagen, aufgebaut. Dieses AT6 DEBS-Modell w urde als Ausgangspunkt für Dockingstudien mit dem Substrat
MMCoA eingesetzt. Im nächsten Schritt w urden Modelle des W ildtyp-Proteins mit und ohne Substrat in einer
Box mit explizitem Wasser solvatisiert und mit MD-Simulationen optimiert (Abb. 2). Mehrere MD-Simulationen
w urden
durchgeführt
(jew eils
mit
Simulationszeiten
zw ischen
30
und
60
ns), um unterschiedliche
Orientierungen des Liganden und Konformationen der Bindungstasche zu berücksichtigen. Schließlich w urden
zufällig ausgew ählte MD-Snapshots mit QM/MM optimiert, w obei das Substrat auf DFT-Niveau berechnet w urde
[3].
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A bb. 2: Mode llie rte Struk tur von AT6 DEBS m it e ine r Solva thülle
von W a sse rm ole k üle n.
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Nachdem auf diesem Weg ein brauchbares Modell für die Insertion von MMCoA in die aktive Tasche des
W ildtyp AT6 DEBS erhalten w urde, konnten die Wechselw irkung von MMCoA mit ausgew ählten Mutanten
untersucht w erden. Als Mutanten w urden Q198R, Q198K, Y297H, S299Y, S299F und S299V ausgew ählt, da für
diese experimentelle Daten über deren Enzymaktivität vorhanden w aren. Die Wechselw irkungen zw ischen
AT6 DEBS und synthetischen, nicht-natürlichen Substraten w urden ebenfalls untersucht [5].
Die Qualität der Computersimulationen konnte durch Vergleich der W ildtyp-Modelle mit experimentellen Daten
von DEBS überprüft w erden. Ein w ichtiges Teilergebnis dieser Studien w ar, dass die Rolle von His300 zur
Aktivierung von Ser197 für die nukleophile Addition, die zur Bindung des Malonylthioesters an das Enzym führt,
korrekt beschrieben w urde. Die Modelle von AT6 DEBS und seinen Mutanten zeigen auch im Detail, w ie die
YASH-Sequenz der AT-Domäne die Selektivität kontrolliert. Für die Positionierung des Substrats sind
insbesondere
Gln128, Arg222, Tyr297
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und
Ser299
verantw ortlich. Dies
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ist
in
Übereinstimmung
mit
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experimentellen Ergebnissen, die zeigen, dass Mutationen des Arg222 für die Enzymfunktion schädlich sind.
Ein w ichtiges Ergebnis dieser Computersimulationen w ar, dass Met235 und Val295 die Spezifität der
Bindungstasche stark beeinflussen, und daher bevorzugte Ziele der Mutationsstudien sein sollten. Eine
Methylgruppe von Val295 befindet sich in Nachbarschaft zu der Isopropylgruppe in MMCoA und schränkt damit
den freien Raum für größere Substituenten ein. Auf der anderen Seite kann der Einbau kleinerer Substituenten
zu einem Verlust der Wechselw irkungen führen, die
für die
Substratpositionierung und ‑selektivität
entscheidend sind.
Das w ichtigste Ziel der Studie w ar die Entw icklung einer AT6 DEBS-Variante, die ein propargyliertes Derivat von
MMCoA als Substrat toleriert. Daher w urden Simulationen von AT6 DEBS mit Propargylmalonyl-SNAC als Substrat
durchgeführt. Malonyl-SNAC (MSNAC) verhält sich ähnlich w ie Malonyl-CoA (MCoA) und w ird daher in PKSStudien eingesetzt. Diese Modelle bestätigten die Rolle von Met235 und Val295 und führten zum Design neuer
Mutanten. Die Simulationen zeigten, dass insbesondere für starre Substituenten w ie die Propargylgruppe die
Orientierung sehr w ichtig ist. Die Dreifachbindung in Propargylmalonyl-SNAC ist nicht flexibel genug, um in die
Bindungstasche von W ildtyp AT6 DEBS zu passen. Das führt zu einer Fehlpositionierung von Arg222, das aus
der Bindungstasche herausw andert, und von Met235 und Val295, die nicht mehr mit den Substituenten in der
Malonylregion des Substrats w echselw irken [3].
A bb. 3: W ie durch die C om pute rsim ula tion vora usge sa gt, ist
in de r V295A-Muta tion die Spe zifitä t für die Biosynthe se von
Erythrom ycin-De riva te n re duzie rt.
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Die Mutante V295A w urde dann modelliert, in der die Selektivität der AT-Domäne reduziert ist und Substrate
mit funktionellen Gruppen, die größer als eine Methylgruppe sind, eingebaut w erden können [5]. Dieses Modell
w urde durch mehrere MD-Simulationen mit nicht-natürlichen Substraten ansteigender Größe getestet. Die
Simulationen zeigten, dass die Bindungstasche des neuen Mutanten flexibel ist, und Substituenten mit einer
Länge von bis zu drei Kohlenstoffatomen akzeptiert w erden, w as sow ohl Allyl- als auch Propargylgruppen
einschließt (Abb. 3). Im Unterschied zu dem W ildtyp ist die Bindungstasche in der V295A-Mutation flexibler und
erlaubt
damit
die
korrekte
Positionierung
von Propargylmalonyl-SNAC.
Noch
längere
und
sperrigere
Seitengruppen w erden allerdings nicht mehr toleriert. Interessanterw eise w urde aber Phenylmalonyl-SNAC
eingebaut. Allerdings ist es unw ahrscheinlich, dass dieses die Bindungstasche auch erreichen könnte, da der
Eingangskanal sehr eng ist.
Diese theoretischen Ergebnisse sind in hervorragender Übereinstimmung mit experimentellen Studien der
Gruppe von Frank Schulz an der Ruhr-Universität Bochum (Abbildung 4). Tatsächlich akzeptiert die Mutante
(2S)-Ethylmalonyl-SNAC, (2S)-Allylmalonyl-SNAC und (2S)-Propargylmalonyl-SNAC als Substrate und produziert
damit 2-Ethyl-erythromycin, 2-Allyl-erythromycin bzw . 2-Propargyl-erythromycin. Das Phenylderivat erw ies sich
als zu toxisch für S. erythraea um damit Studien durchführen zu können. In schöner Übereinstimmung mit der
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theoretischen Vorhersage w erden die Isopropyl- und Hexylderivate nicht produziert. Sow ohl Theorie als auch
Experiment bestätigen, dass die Substratspezifität des V295A-AT6 DEBS-Mutanten reduziert ist und sich damit
neue Derivate des Erythromycins synthetisieren lassen.
A bb. 4: Die the ore tische n Erge bnisse sind in he rvorra ge nde r
Übe re instim m ung m it e x pe rim e nte lle n Studie n de r Gruppe
von Fra nk Schulz a n de r R uhr-Unive rsitä t Bochum .
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Zusammenfassung
Polyketidsynthasen sind Multienzym-Komplexe von hoher medizinischer Bedeutung, da sie die Biosynthese von
Antibiotika, Antikrebsmitteln und anderen biologisch aktiven Molekülen steuern. Durch „in silico“ MutageneseStudien an PKS ist es gelungen, Mutanten zu entw ickeln, die auch nicht-natürliche Bausteine für die
Biosynthese tolerieren.
Durch MD-Simulationen und QM/MM-Rechnungen w urde ein tiefer Einblick in die Wechselw irkungsmechanismen
erhalten, die für den Einbau von Substraten in PKS verantw ortlich sind. Dabei w urden zw ei funktionelle
Gruppen identifiziert, denen eine Schlüsselfunktion für die Substratspezifität der PKS zukommt. Die Met-Gruppe
spielt bei der Kontrolle der Stereochemie der eingehenden Malonylderivate eine Rolle. Die sperrigere ValGruppe ist dagegen für die Größenselektion des eingehenden Substrats verantw ortlich.
Die AT6 DEBS-Variante V295A w urde konstruiert, um synthetisches Propargyl-MSNAC in den Biosynthesepfad
einzuschleusen, w as sow ohl theoretisch als auch experimentell überprüft und bestätigt w urde. Allerdings
w urde das propargylierte Erythromycin nur als Nebenprodukt erhalten, in Übereinstimmung mit den
theoretischen Modellen, die für rigide Substrate w ie das Propargyl-MSNAC eine genaue Ausrichtung in der
Bindungstasche verlangen. Um dies zu erreichen und die Produktausbeute zu erhöhen, sind w eitere
Modifizierungen notw endig.
Die theoretischen Studien mit Propargyl-MSNAC zeigen auch, dass das Substrat optimiert w erden kann. Obw ohl
MSNAC
dem MCoA
sehr
ähnlich
ist, fehlen
dem kleineren
synthetischen
Substrat
einige
w ichtige
Bindungsmotive, insbesondere Wechselw irkungen über die Phosphatgruppen. Die Modelle zeigen, dass die
Phosphatgruppen am Eingang des aktiven Zentrums mit positiv geladenen Seitenketten w echselw irken. Diese
Wechselw irkungen tragen dazu bei, dass das Substrat in der Nähe zum nukleophilen Ser gehalten w ird. Daher
ist es sinnvoll, größere Substrate mit Phosphatgruppen zu synthetisieren und zu testen.
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ist es sinnvoll, größere Substrate mit Phosphatgruppen zu synthetisieren und zu testen.
Die theoretischen Studien belegen eindringlich, dass die in silico Mutagenese ein unverzichtbares Werkzeug
für die Entw icklung neuer Biokatalysatoren ist. Die hier vorgestellten Arbeiten erklären nicht nur den Einfluss
von Punktmutationen auf die Enzymaktivität, sondern erlauben auch vorherzusagen, w elche einzelne Mutation
zum Einbau nicht-nativer Bausteine führt. Die durch theoretische Voraussagen geleiteten Experimente führten
zum ersten Mal zur Biosynthese neuer Derivate des Erythromycins.
Literaturhinweise
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Sanchez-Garcia, E.
Substrate Flexibility of a Mutated Acyltransferase Domain: Implications for Polyketide Biosynthesis
Chemistry & Biology, accepted (2015)
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