T-Zelldifferenzierung bei Patienten mit variablem Immundefekt

T-Zelldifferenzierung bei Patienten mit
variablem Immundefekt
Diplomarbeit
angefertigt für die Fakultät für Biologie
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg
vorgelegt von
Anja Preuhsler
am
19. März 2010, Freiburg i. Breisgau
durchgeführt am
Zentrum für chronische Immundefizienz (CCI)
der Medizinischen Klinik
des Universitätsklinikums
der
Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
Leiter der Arbeit:
Prof. Dr. Hans-Hartmut Peter
Betreuer der Arbeit innerhalb der Fakultät:
PD. Dr. Hermann Eibel
Betreuer der Arbeit:
PD Dr. Klaus Warnatz
Inhaltsverzeichnis
ii
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung ................................................................................... 1
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
2
Das Immunsystem .......................................................................................... 1
T-Zellentwicklung ............................................................................................ 3
Follikuläre T-Helferzellen (Tfh- Zellen) ............................................................ 5
Zytokine ........................................................................................................ 10
Variable Immundefizienz (CVID) ................................................................... 14
Thema der Arbeit .......................................................................................... 17
Material und Methoden ............................................................ 20
2.1
Material ......................................................................................................... 20
2.1.1
Probenmaterial ....................................................................................... 20
2.1.2
Zellkultur ................................................................................................ 20
2.1.3
Stimulationen ......................................................................................... 20
2.1.4
Durchflusszytometrie.............................................................................. 21
2.1.5
Immunglobulin- ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) ............. 22
2.1.6
Puffer ..................................................................................................... 22
2.1.7
Verbrauchsmaterial ................................................................................ 23
2.1.8
Geräte .................................................................................................... 24
2.1.9
Verwendete Programme ........................................................................ 24
2.2
Methoden ...................................................................................................... 25
2.2.1
Isolierung der Zellen............................................................................... 25
2.2.2
Stimulationen ......................................................................................... 27
2.2.3
Durchflusszytometrische Färbung .......................................................... 28
2.2.4
Immunglobulin- ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) ............. 29
2.2.5
Statistische Auswertung ......................................................................... 32
3
Ergebnisse ............................................................................... 33
3.1
Phänotypisierung peripherer CXCR5+ T-Zellen ............................................. 33
3.1.1
Phänotypisierung der CXCR5+ T-Zellen aus Blut und Tonsille von
immunologisch gesunden Kontrollpersonen ........................................................ 33
3.1.2
Phänotypisierung der CXCR5+ T-Zellen in Patienten mit CVID ............... 34
3.2
Generierung Tfh-ähnlicher Zellen .................................................................. 36
3.2.1
Durch Stimulation peripherer Blutlymphozyten mit anti-ICOS und IL-21 . 36
3.2.2
Durch Stimulation isolierter Milzzellen mit anti-ICOS und IL-21 .............. 38
3.2.3
Durch Stimulation peripherer Blutlymphozyten mit IL-6 .......................... 39
3.2.4
Durch Stimulation peripherer Blutlymphozyten mit IL-12 ........................ 40
3.3
Analyse der Zytokinproduktion durch Th2-Zellen in Patienten mit CVID ........ 44
3.4
Die Population der Th1- und Th17-Zellen in Patienten mit CVID ................... 50
3.5
Funktion der B-Zellhilfe in CVID .................................................................... 55
3.6
Zytokinfunktion in Patienten mit CVID ........................................................... 60
4
Diskussion ............................................................................... 66
4.1
4.2
4.3
4.4
Phänotypisierung unstimulierter CXCR5+ T-Zellen ........................................ 66
Phänotypisierung unstimulierter CXCR5+ T-Zellen in Patienten mit CVID ...... 67
Generierung Tfh-ähnlicher Zellen aus dem peripheren Blut .......................... 67
Analyse der Zytokinproduktion durch Th2-Zellen in Patienten mit CVID ........ 69
Inhaltsverzeichnis
4.5
4.6
4.7
4.8
5
iii
Die Population der Th1- und Th17-Zellen in Patienten mit CVID ................... 71
Funktion der B-Zellhilfe in CVID .................................................................... 73
Zytokinfunktion in Patienten mit CVID ........................................................... 74
Ausblick ........................................................................................................ 76
Zusammenfassung/ Summary ................................................. 77
Literaturverzeichnis ......................................................................... iv
Abbildungsverzeichnis ................................................................... xv
Tabellenverzeichnis ..................................................................... xviii
Abkürzungsverzeichnis .................................................................. xix
Eidesstattliche Erklärung................................................................ xxi
Einleitung
1
1
Einleitung
1.1
Das Immunsystem
Eine der zentralen Aufgaben des Immunsystems ist es den Körper gegen
Krankheitserreger, die Barrieren wie Haut und Schleimhäute überwinden und in den
Körper eindringen, zu schützen.
Das Immunsystem erkennt Eindringlinge wie Viren, Bakterien oder Pilze als fremd und
löst Abwehrmechanismen durch die Aktivierung verschiedener Effektorzellen oder
Effektormoleküle, einschließlich antimikrobieller Stoffe aus.
Die Zellen des Immunsystems entstehen in den primären lymphatischen Organen, im
Knochenmark und im Thymus. Danach patrouillieren sie über das Lymphsystem und
die sekundären lymphatischen Organe wie Milz und Lymphknoten durch den Körper.
Es werden zwei miteinander eng verknüpfte Teile des Immunsystems unterschieden:
das angeborene und das adaptive Immunsystem.
Die Zellen des angeboren Immunsystems, das sich evolutionär früher entwickelte,
erkennen regelmäßige extrazelluläre oder intrazelluläre Strukturen der Pathogene
(pathogene associated molecular pattern, PAMPs) über keimbahnkodierte Rezeptoren
(Pattern recognition receptors, PRRs). Hierzu gehören Toll like Rezeptoren (TLRs), die
verschiedene von Pathogenen exprimierte Moleküle erkennen. Dadurch können die
TLR exprimierenden Zellen die Anwesenheit von Pathogenen erkennen und werden
über sogenannte „Danger-Signals― entsprechend aktiviert. Diese Aktivierung führt u.a.
zu Proliferation und Differenzierung der Zellen sowie zur Freisetzung von
Effektormolekülen.
Andere
lösliche
Komponenten
des
angeborenen
Immunsystems
wie
das
Komplementsystem werden direkt über Bindung an Oberflächenmoleküle der
Pathogene oder über Bindung an Immunkomplexe (Antigen:Antikörper) aktiviert. Dies
führt wiederum zur Markierung des Pathogens für phagozygotische Zellen oder zur
Lyse des Pathogens und zur Initiierung einer lokalen inflammatorischen Antwort.
Die Zellen des adaptiven Immunsystems werden erst etwa zwei Tage nach Erkennung
des Pathogens durch das angeborene Immunsystem aktiviert und sind in der Lage ein
immunologisches Gedächtnis zu entwickeln.
Zu diesen Zellen gehören T- und B-Zellen.
T-Zellen entwickeln sich im Thymus und tragen neben dem für ein Antigen
spezifischen T-Zell-Rezeptor (TCR) das Korezeptormolekül CD4 oder CD8.
Einleitung
2
Die Aktivierung der T-Zellen erfolgt über Antigenerkennung und gleichzeitiges
kostimulatorisches Signal durch Zytokine oder Ligand:Rezeptor Interaktionen mit
dendritischen
Zellen.
Antigene
sind
Substanzen,
die
nach
Erkennung
und
Internalisierung durch verschiedene Rezeptoren im Endoplasmatischen Retikulum
prozessiert und zusammen mit dem Haupt-Histokompatibilitäts-Komplex (major
histocompatibility complex, MHC) als Antigen:MHC-Komplexe auf der Oberfläche
präsentiert werden.
Nach
Erkennung
ihres
spezifischen
Antigen:MHC-Komplexes
auf
einer
antigenpräsentierenden Zelle über ihren T-Zell-Rezeptor kommt es zur Proliferation
und Reifung der Zellen zu verschiedenen Effektorzelltypen. Ein Teil der Zellen
differenziert zu langlebigen Gedächtniszellen, die bei einer wiederkehrenden Infektion
durch dasselbe Pathogen schneller als naive Zellen eine Effektorfunktion erreichen.
CD8 exprimierende T-Zellen reifen in der Regel zu zytotoxischen T-Zellen heran, die
aufgrund von mit Perforin und Granzymen gefüllten Granula und der Sekretion von
IFNγ in der Lage sind Virusinfektionen zu bekämpfen. Sie erkennen ihre Antigene
direkt auf der infizierten Zelle.
Die
Differenzierung
von
CD4+
T-Zellen
ist
abhängig
von
den
durch
die
antigenpräsentierende Zelle sekretierten Zytokinen. Diese werden antigenspezifisch
ausgeschüttet und lenken so die Entwicklung der CD4 Subpopulationen, welche in 1.2
näher erläutert wird.
Zu den Subpopulationen zählen vor allem T-Helfer-Zellen (Th1-, Th2-, Th17-, Tfh-) und
regulatorische T-Zellen.
Die B-Zellhilfe durch Th2- oder follikuläre T-Helferzellen findet nur statt, wenn die BZelle dasselbe Antigen erkennt, welches die T-Zelle aktiviert hat. Die Erkennung erfolgt
meist durch direkte Erkennung des Antigens durch den B-Zellrezeptor (BCR). Das
Antigen wird von der B-Zelle gleich jeder anderen antigenpräsentierenden Zelle
prozessiert und der T-Zelle auf MHC-Molekülen präsentiert. Kostimulatorische
Moleküle
und
Zytokine
der
T-Zelle
veranlassen
die
B-Zelle
zur
Plasmazelldifferenzierung oder zur Bildung eines Keimzentrums.
Plasmazellen produzieren im Knochenmark große Mengen Antikörper, die das
Komplementsystem aktivieren und Pathogene neutralisieren oder zur Phagozytose
durch Opsonierung markieren.
Im Keimzentrum kommt es durch somatische Hypermutation und Rekombination des
BCR zur Affinitätsreifung und zum Klassenwechsel der sekretierten Antikörper.
Hierdurch verbessern sich die Effektorfunktion und die Bindeeigenschaften der
Antikörper. Dieser Isotypwechsel wird durch von den T-Helferzellen sekretierte
Zytokine gesteuert. Während durch Th1-Zellen produziertes IFNγ die Entstehung von
Einleitung
3
IgG2a und IgG3 fördert, lenken die von Th2-Zellen produzierten Zytokine IL-4 oder
TGFβ die Entstehung von IgG1 und IgE bzw. IgA und IgG2b Antikörpern, die jeweils
unterschiedliche Effektorfunktionen ausführen (Janeway’s Immunology, 7th Revised
edition).
Die am Beginn der Immunantwort sekretierten Zytokine spielen im weiteren Verlauf
eine wichtige Rolle. Durch sie wird die Verteilung der T-Zellsubpopulationen reguliert
und
somit
ebenfalls die
Entstehung
spezifischer
Antikörper
mit
bestimmter
Effektorfunktion festgelegt.
Auf die Differenzierung der T-Zellsubpopulationen und ihre sekretierten Zytokine wird
daher in den folgenden Abschnitten näher eingegangen.
1.2
T-Zellentwicklung
Die Entwicklung der T-Zellen findet im Thymus statt (thymusabhängige Lymphozyten =
T-Zellen).
Dort
passieren
sie
verschiedene
Entwicklungsphasen,
die
durch
Veränderungen im Status der T-Zell-Rezeptor-Gene und Expression des TCR sowie
auch durch Veränderungen in der Expression von Oberflächenmolekülen wie CD3
geprägt sind.
In der frühen T-Zellentwicklung entstehen zwei verschiedene Linien von T-Zellen – α:β
und γ:δ T-Zellen, welche unterschiedliche TCRs exprimieren, mit α- und β-Kette bzw.
γ- und δ-Kette. α:β –T-Zellen differenzieren sich in einer späteren Phase der
Entwicklung in CD4 oder CD8 exprimierende Zellen, die unterschiedliche Funktionen
aufweisen und weitere Differenzierungsschritte durchlaufen (Janeway’s Immunology,
7th Revised edition).
periphere T-Zellentwicklung
CD4+ T-Zellen können nach Aktivierung in der Peripherie in verschiedene TZellsubpopulationen differenzieren. Es handelt sich dabei i.d.R. um T-Helferzellen
(Th1, Th2, Th17 und Tfh) und um regulatorische T-Zellen (Treg).
Th1-Zellen aktivieren v.a. durch Sekretion von IFNγ und IL-2 die Zerstörung von
intraendosomalen Pathogenen in Makrophagen.
Th2-Zellen aktivieren vorwiegend mit Hilfe von Zytokinen und kostimulatorischen
Molekülen die Antikörpersekretion durch B-Zellen.
Th17-Zellen zeichnen sich durch die Sekretion des Zytokins IL-17 aus, welches
phagozytierende Zellen des angeborenen Immunsystems aktiviert.
Regulatorische T-Zellen (Tregs) können Effektorfunktionen anderer Immunzellen
inhibieren und spielen so eine wichtige Rolle in der Erhaltung der körpereigenen
Selbsttoleranz.
Einleitung
4
Follikuläre T-Helferzellen (Tfh-Zellen) sind wichtig für die B-Zellhilfe im Keimzentrum.
Hier finden Affinitätsreifung und Klassenwechsel der Antikörper sowie die Entstehung
der B-Gedächtniszellen statt.
Die
Regulation
dieser
Differenzierung
geschieht
vorwiegend
durch
von
antigenpräsentierenden Zellen gebildete Zytokine, die bei der Interaktion mit einer
naiven T-Zelle antigenspezifisch sekretiert werden.
Die Linie der Th1-Zellen wird durch die Zytokine IL-12 und IFNγ gefördert. Die
Transkriptionsfaktoren Tbet, STAT1 und STAT4 werden dieser T-Zellsubpopulation
zugeschrieben (Szabo et al., 2003), während GATA3, STAT5 und STAT6a in der Linie
der Th2-Zellen exprimiert werden (Kaplan et al., 1996; Zheng und Flavell 1997). Die
Differenzierung in Th2-Zellen wird durch Sekretion von IL-2 und IL-4 geleitet.
Schütten APCs IL-6 und TGFβ aus, wird die Differenzierung in Th17-Zellen eingeleitet
(Betteli et al, 2006; Veldhoen et al., 2006), welche die Transkriptionsfaktoren RORγt
und STAT3 exprimieren (Ivanov et al, 2006). IL-23 unterstützt das Überleben dieser
Zelllinie (Zhou et al., 2008).
Abbildung 1 Periphere Differenzierung der T-Zellsubpopulationen.
Die T-Zellsubpopulationen Th1, Th2, Th17, Tfh und Treg unterscheiden sich durch die Expression von
Transkriptionsfaktoren und die Sekretion von Zytokinen. Ihre Differenzierung wird durch von APCs
ausgeschüttete Zytokine reguliert. (Fazilleau et al., 2009)
In letzter Zeit wurde eine Flexibilität zwischen den Zelllinien Th1 und Th17 immer
wahrscheinlicher. Es ergab sich u.a. eine gemeinsame Vorläuferzelllinie, welche IL-12
und IL-23 koexprimierte (Betteli et al., 2006). Auch wurden IFNγ und IL-17 positive
Zellen gefunden, die als Th17/Th1 Zellen bezeichnet wurden. Diese wiesen sich durch
die gleichzeitige Expression der Transkriptionsfaktoren RORγt und Tbet aus
Einleitung
5
(Annunziato et al., 2007). Th17/Th1 Zellen entwickelten sich aus Th17 Zellen, welche
mit IL-12 behandelt wurden, sowie aus CD4+ Nabelschnurblutzellen, welche mit IL-1β
und IL-23 behandelt wurden (Reinhardt et al., 2008). Diese Zellen wurden interessant
mit Blick auf viele Erkrankungen des Immunsystems, dessen Pathologie auf Th1-, bzw.
Th17-Zellen beruhten.
Regulatorische T-Zellen entwickeln sich nach Stimulation mit TGFβ und IL-2. Die
Transkriptionsfaktoren Foxp3 und STAT5 werden in dieser T-Zellpopulation exprimiert
(Fontenot et al, 2003).
Die
explizite
Expression
bestimmter
Transkriptionsfaktoren
lässt
somit
eine
Unterscheidung der verschiedenen T-Zellsubpopulationen zu. Seit kurzem wird die
Population der Tfh-Zellen ebenfalls als eigenständige T-Zelllinie betrachtet (Chtanova
et al., 2004). Als Transkriptionsfaktor wurde Bcl-6 identifiziert (Johnston et al., 2009; Yu
et al., 2009; Nurieva et al., 2009). In welchem Stadium der T-Zelldifferenzierung sich
die Linie der follikulären T-Helferzellen abspaltet, ist jedoch noch nicht vollständig
aufgeklärt. Unklar bleibt, ob sie sich gleichzeitig mit Th1 und Th2 Zellen aus dem Pool
der naiven T-Zellen löst oder ob sie sich erst später aus einer der anderen beiden
Subpopulationen entwickelt. Im Kontext der vor kurzem postulierten T-Helferzell
Plastizität (Bluestone et al., 2009) können sich beide Modelle überschneiden und
müssen nicht exklusiv zutreffen.
1.3
Follikuläre T-Helferzellen (Tfh- Zellen)
Follikuläre T-Helferzellen (Tfh-Zellen) sind charakterisiert als CXCR5 exprimierende TZellen, die in sekundär lymphatischen Geweben in B-Zell Follikeln lokalisiert sind und
die Immunglobulinproduktion unterstützen (Schaerli et al., 2000; Breitfeld et al., 2000;
Kim et al., 2001).
Besonders zahlreich kommen sie in der Tonsille, in follikulären Regionen und
Keimzentren entzündeter Gewebe vor (Förster et al., 1994). Die Expression des
Chemokinrezeptors CXCR5, der das vorwiegend in den Follikeln der Keimzentren
produzierte Chemokin CXCL13 bindet, oder der feste, langanhaltende Kontakt mit
einer ebenfalls CXCR5 exprimierenden B-Zelle über Oberflächenmoleküle der SLAM
(signalling lymphocytic activation molecule) – Familie machen diese Lokalisation
möglich (Qi et al., 2008).
Tfh-Zellen leisten B-Zellhilfe im Keimzentrum
Die
Aufgabe
der
Tfh-
Zellen,
B-Zellhilfe
und
somit
Induktion
der
Immunglobulinproduktion zu leisten, ist durch Expression von Kostimulationsmolekülen
und Produktion von Zytokinen möglich. Die Interaktion von Tfh- und B-Zelle findet unter
Einleitung
6
anderem über den T-Zell-Rezeptor, CD28, CD40L, OX40 und inducible costimulator
(ICOS) statt. CD40-CD40L Interaktionen sind essenziell für das Überleben und die
Differenzierung von B-Zellen im Keimzentrum (Liu et al., 1989), während die OX40
Ligation für Gedächtnis-B-Zell-Antworten benötigt wird (Gaspal et al., 2005). ICOS, auf
Tfh Zellen besonders hoch exprimiert, ist wichtig in der Induktion der T-Zellaktivierung,
der –differenzierung und der Zytokinproduktion, insbesondere von IL-10, IL-17 und IL21 (Takahashi et al., 2009; Bauquet et al., 2009). Ebenfalls kontrolliert ICOS die TZellabhängige Antikörperproduktion durch Plasmazellen (Mak et al., 2003).
Abbildung 2: Grundlegende molekulare Mechanismen der Tfh-Zell Funktion.
Über die Aktion zwischen CXCL13 und CXCR5 an der Oberfläche von T- und B-Zellen sind diese in den
Follikeln lokalisiert. Aktionen zwischen T- und B-Zellen beinhalten molekulare Interaktionen über
Oberflächenmoleküle oder Zytokine und ihre Rezeptoren. (CD40L: CD40 Ligand; ICOSL: ICOS Ligand; IL21R: IL-21 Rezeptor; SAP: signalling lymphocytic activation molecule (SLAM)-associated protein).(Vinuesa
et al., 2005, 2)
Bei den von Tfh-Zellen sekretierten Zytokinen handelt es sich vorwiegend um BZelldifferenzierung und Antikörperproduktion induzierende Zytokine wie IL-21 und IL-4,
aber auch die Produktion von IL-2, IL-5, IL-13 oder IFNγ in vitro durch CXCR5+ TZellen wurde gezeigt (Schaerli et al., 2000)). Im humanen System ist zusätzlich die
Produktion von IL-10 nachgewiesen (Kim et al., 2001; Ebert et al. 2004). IL-10 dient als
Wachstums- und Differenzierungsfaktor für B-Zellen (Rousset et al., 1992). Neueste
Erkenntnisse zeigen, dass die von Tfh-Zellen produzierten Zytokine nicht indirekt über
Bystanderzellen, sondern direkt auf die Antikörperproduktion von B-Zellen wirken.
Produziertes IL-4 und IFNγ leiteten den Klassenwechsel sowie somatische
Hypermutation bei mit Tfh-Zellen Konjugat bildenden B-Zellen ein. Dies schien
ebenfalls Auswirkungen auf die Selektion von B-Zellen zur optimalen Affinitätsreifung
zu haben (Reinhardt et al., 2009).
Einleitung
7
Entwicklung von Tfh-Zellen
T-Zellen, die nach dem ersten APC-Kontakt die Expression von CXCR5 beibehalten,
haben das Potenzial sich zu einer Tfh-Zelle zu entwickeln (Ansel et al., 1999).
Studien mit Transfer von CD4+ T Zellen in immunisierte Mäuse zeigten, dass
diejenigen T-Zellen mit der höchsten Affinität zu Peptid-MHC Klasse II Komplexen in
den Tfh-Zellpool selektiert wurden (Fazilleau et al., 2009)).
Experimente an IL-4 sekretierenden T-Zellen in Keimzentren lassen vermuten, dass
sich in den Lymphknoten befindliche T-Zellen, die IL-4 sekretieren können, in TfhZellen differenzieren, sobald sie an der Grenze der follikulären B-Zellzone
Antigenkontakt und über ICOS: ICOSL Interaktion stabilen Kontakt mit einer B-Zelle
aufnehmen. Bei Fehlen des Kontaktes verlassen diese IL-4+ T-Zellen den
Lymphknoten und entwickeln sich in Th2-Zellen der Peripherie (Reinhardt et al., 2009).
Aber auch additive Signale der Umgebung durch Zytokine leiten die Entwicklung in TfhZellen ein. Nurieva et al. zeigten, dass die Generierung von T-Zellen mit
Helferphänotyp im murinen System abhängig ist von IL-6, IL-21 und der Aktivierung
des Transkriptionsfaktors STAT-3 (Nurieva et al., 2008). Interleukin-21 wurde ebenfalls
von Vogelzang et al. als Tfh-Differenzierungsfaktor beschrieben. Sie konnten an IL-21
defizienten Mäusen die Notwendigkeit von IL-21 für die Entstehung von Keimzentren
beweisen. Sie zeigten ebenfalls, dass in Mäusen mit gestörter IL-21: IL-21R Interaktion
der Defekt in Keimzentrumsentwicklung und IgG1 Produktion auf das Unvermögen der
CD4+ T-Zellen auf IL-21 zu reagieren zurück zu führen war. Die Expression des
Kostimulators ICOS schien notwendig für eine optimale Produktion von IL-21
(Vogelzang et al., 2008).
Dienz et al. beschrieben IL-6 als Förderer der IL-21 Produktion durch CD4+ T-Zellen
bei Mäusen, wobei es sich um Tfh-Zellen handeln könnte, da diese sich u.a. durch die
Sekretion von IL-21 auszeichneten. Der Zusatz von IL-6 übte auch einen positiven
Einfluss auf die Antikörperproduktion durch B-Zellen aus (Dienz et al., 2009).
Im humanen System wurde in vitro IL-12 als induzierender Faktor eines follikulären THelferzell-ähnlichen Phänotyps, charakterisiert durch die Produktion von IL-21,
identifiziert (Schmitt et al., 2009; Ma et al., 2009). Diese Zellen wurden als Tfh-ähnliche
Zellen beschrieben, in denen die Produktion von IL-21 mit der Hochregulation von Bcl6, einem Tfh-spezifischen Transkriptionsfaktor, verknüpft war.
Die Entwicklung von Tfh-ähnlichen CXCR5+ ICOShigh T-Zellen wird durch die
Interaktion mit ICOS-Ligand auf B-Zellen in vitro (Vinuesa et al., 2005) sowie in vivo
(Nurieva et al., 2008) verstärkt. In ICOS defizienten Personen wurden reduzierte Level
an CXCR5+ T-Zellen detektiert, welches ICOS eine zentrale Rolle in der Regulation
von CXCR5+CD4+ T-Zellen zu spricht. Dies wurde auch an ICOS defizienten Mäusen
Einleitung
8
nachgewiesen. Bei diesen Zellen handelt es sich um zirkulierende CD57+CXCR5+ TZellen, die vermutlich aus den Keimzentren stammen, da die Reduktion der Zellen mit
einer Reduktion der Keimzentren einhergeht (Bossaler et al., 2006). Dies wurde
unterstützt durch die Tatsache, dass in drei CD40L defizienten Patienten, die keine
Keimzentren aufwiesen, die CXCR5+ T-Zellen fast vollständig fehlten.
In Sanroque Mäusen resultiert die Expansion von Tfh-Zellpopulationen in exzessiver
Signalgebung durch ICOS und darausfolgend in erhöhter Autoantikörper Produktion
und renaler Pathologie (Vinuesa et al., 2005, 1). Eine zentrale Rolle von ICOS in der
Differenzierung von Tfh-Zellen scheint somit gesichert.
Bcl-6 wurde erst vor kurzem als Tfh-spezifischer Transkriptionsfaktor durch
verschiedene Gruppen postuliert (Johnston et al., 2009; Yu et al., 2009; Nurieva et al.,
2009).
Vermutlich wirken viele Faktoren gemeinsam um die Differenzierung in Richtung TfhZelle zu leiten, der genaue Zeitpunkt und Ablauf ist bis jetzt jedoch noch unklar.
Phänotypisierung von Tfh-Zellen
Tfh-Zellen kommen nicht nur im Keimzentrum vor, sondern können auch im Blut als
zirkulierende CXCR5+ T-Zellen gefunden werden. Diese zeichnen sich durch hohe
Expression Tfh-spezifischer Oberflächenmoleküle wie PD-1 oder CD57 aus.
Rasheed et
al. führten im
Zusammenhang
ihrer
Forschung
an Tfh-Zellen
Genexpressionsanalysen verschiedener T-Zellpopulationen durch (Rasheed et al.,
2006). Aufbauend darauf wurde die Expression von OX40, ICOS, CD200, PD-1 und IL21R als Phänotyp für periphere CXCR5+ T-Zellen des Blutes, die in direkter
Verbindung mit Tfh-Zellen stehen, festgelegt.
OX40 und sein Ligand (OX40L) spielen eine große Rolle in der T-B-Zell-Kostimulation.
Die Ligation von OX40 erhöht die IL-4 Produktion durch naive T-Zellen und steuert ihre
Differenzierung in Richtung Th2-Zytokinproduzierende Effektorzellen (Lombardi et al.,
2009). Auch für die Entstehung einer Immunantwort durch B-Gedächtniszellen ist
OX40 essenziell (Gaspal et al., 2005).
ICOS ist wichtig für die primäre T-Zellhilfe und kontrolliert T- und B-Zellaktivitäten
sowie die T-Zellabhängige IgG1 Produktion (Mak et al., 2003). Zusätzlich kontrolliert es
die Produktion des B-Zellaktivierenden Zytokins IL-10 (Hutloff et al., 1999).
Das Mitglied der SLAM (signalling lymphocyte activation molecule) - Familie CD200,
auch bekannt als OX2, wurde als immunsuppressiv beschrieben. Die Bindung an
seinen Rezeptor CD200R erhöht die Sekretion Th2-ähnlicher Zytokinen wie IL-4 und
IL-10 und mindert die Produktion von Zytokinen durch Th1-Zellen (Gorczynski, 2001).
Zusätzlich fördert es die Differenzierung von CD4+CD25+Foxp3+ Treg Lymphozyten
(Groczynski et al., 2008).
Einleitung
9
PD-1 (programmed death-1) gehört zur Familie der kostimulatorischen B7 Proteine, die
in der adaptiven Immunität fungieren. Die Ligation von PD-1 mit seinem Liganden (PDL1) inhibiert Proliferation, Zytokinproduktion und zytolytische Funktion von T-Zellen
durch Blockade des T-Zell Rezeptorsignals. Die PD-1 und PD-L1 Interaktionen sichern
so die periphere Immuntoleranz und modulieren die Aktivierung von naiven T-Zellen
(Folkl et al., 2009).
Der Interleukin-21 Rezeptor (IL-21R) bindet das Zytokin Interleukin-21, welches
immunregulativ auf B- und T-Zellen wirkt. Bei Tfh-Zellen scheint IL-21 die Proliferation
und das Überleben positiv zu beeinflussen (Vogelzang et al., 2008, 2). Daher liegt es
nahe, dass IL-21R auf diesen Zellen höher exprimiert vorliegt als auf anderen TEffektorzellen.
Rolle der Tfh-Zellen in Autoimmunität und Immundefizienz
T-Zellen
vermitteln
immunologische
Toleranz,
was
im
Zusammenhang
mit
Autoimmunität eine wichtige Rolle spielt. Da sie in der Lage sind Spezifitäten von
Autoimmunantikörpern zu kontrollieren, könnten im Falle von Antikörperinduzierten
Autoimmunerkrankungen Tfh-Zellen unpassende Hilfssignale an selbstreaktive BZellen vermitteln. CXCR5+ T-Zellen mit erhöhtem Level an PD-1 und ICOS wurden im
Blut von Patienten mit Systemischem Lupus erythematodes (SLE) oder Sjogren’s
Syndrom gefunden (Hutloff et al., 2004; Watanabe et al., 2008). Dies ging einher mit
erhöhter Autoantikörperbildung und Organversagen in Patienten mit SLE (Simpson et
al., 2009). Aufgrund ihres Phänotyps handelt es sich vermutlich um aus extralymphoiden Geweben stammende CXCR5+ T-Zellen und nicht um zirkulierende TfhZellen.
Durch Studien verschiedener Autoimmunkrankheiten an Mausmodellen, die zeigen
konnten, dass die funktionelle Inhibition Tfh- Zellassoziierter Oberflächenmoleküle wie
CD40L, ICOS, SAP (SLAM-associated protein) und IL-21 die Produktion von
Autoantikörpern reduzierte, wird ebenfalls die Rolle der Tfh-Zellen im Gebiet der
Autoimmunität dargelegt (Herber et al., 2007; Hu et al., 2009).
Tfh-Zellen werden auch auf dem Gebiet der Immundefizienz als Defekt diskutiert. In
Patienten mit XLP (X-linked lymphoproliferative syndrome) kommt es zu reduzierter
Lymphozyten Aktivierung. Dies vermutlich aufgrund gestörter Signalgebung durch
Interaktion des Oberflächenmoleküls CD84 der Tfh-Zellen mit dem aufgrund einer
Genmutation inaktiven SAP. In Konsequenz daraus kommt es zu geminderter TfhZellhilfe für die humorale Immunantwort und resultierender Hypogammaglobulinämie.
In einigen CVID Patienten wurde eine Mutation im Gen für ICOS nachgewiesen.
Bossaler et al. konnten zeigen, dass in ICOS defizienten Patienten eine Reduktion der
Einleitung
10
CD57+ CXCR5+ T-Zellen, die vermutlich aus dem Keimzentrum stammten, auftrat
(Bossaler et al., 2006).
Auch wurden in den letzten Jahren Tfh-Zellen als Ursprung von Lymphomen immer
aktueller. Das Transkriptom des Angioimmunoblastischen T-Zelllymphoms zeigt einige
Gemeinsamkeiten mit dem der Tfh-Zellen (Expression von Bcl-6, CXCR5, ICOS,
CD40L, OX40 und PD-1, Produktion von CXCL13) (Rodrigues-Justo et al., 2009).
1.4
Zytokine
Zytokine sind kleine Proteine, die nach aktivierendem Stimulus von verschiedenen
Zellen freigesetzt werden und durch Bindung an ihre spezifischen Rezeptoren
Zelldifferenzierung, Zellproliferation und andere zellspezifische Reaktionen auslösen.
Sie können autokrin auf die produzierende Zelle selber als auch parakrin auf Zellen in
der näheren Umgebung wirken. Sie werden von Zellen des angeborenen sowie des
adaptiven Immunsystems sekretiert und spielen eine wichtige Rolle in der Verbindung
dieser beiden Bereiche des Immunsystems.
Es
gibt
drei
Familien
von
Zytokinen.
Zur
Hämatopoietin
Familie
gehören
Wachstumsfaktoren und Interleukine des adaptiven und angeborenen Immunsystems.
Die
Tumor-Nekrose-Faktor-
(TNF-)Famile
schließt
TNF
selber
sowie
viele
membrangebundene Faktoren ein. Die dritte Klasse von Zytokinen wird als Chemokine
bezeichnet. Dies sind Proteine mit der Eigenschaft von Chemoattraktoren, die
vorwiegend die Migration von Zellen beeinflussen.
Die Variabilität der produzierten Zytokine hängt von den induzierenden Stimulatoren,
z.B.
Krankheitserregern, ab, die eine Signalübertragung über unterschiedliche
Rezeptoren auslösen. Immunantworten werden so in ihrer Ausprägung geformt, da die
freigesetzten Zytokine die jeweils nächste Phase der Immunabwehr wesentlich
mitbestimmen. Daher haben auftretende Störungen der Zytokinproduktion oder –
rezeption, z.B. i.d.R.
bei Immundefekten oder Autoimmunerkrankungen, starke
Auswirkungen auf den Verlauf von Immunantworten (Janeway’s Immunology).
Zum Beispiel sind einige inflammatorische Zytokine zentral an der Pathogenese von
Autoimmunkrankheiten
wie
Rheumatoide
Arthritis
und
Systemischem
Lupus
Erythematodes (SLE) beteiligt (Feldmann et al., 2008). So wird die Differenzierung von
CD4+
T-Zellen
während
einer
Immunantwort
wesentlich
durch
die
von
Antigenpräsentierenden Zellen produzierten Zytokine reguliert. Eine Dysregulation in
der Zytokinproduktion und somit veränderte T-Zellpopulationsverteilung während der
Immunantwort führt in einigen Fällen zu Autoimmunität.
Auch Immundefekte sind zytokinvermittelt. Der Defekt der allgemeinen γ-Kette
verschiedenster
Zytokinrezeptoren
führt
durch
gestörte
Signaltransduktion
zu
Einleitung
11
gestörtem Wachstum von Lymphozyten und somit zu einem X-chromosomalen
schweren kombinierten Immundefekt (XSCID) (Leonard et al., 1996; Noguchi et al.,
2008).
Mutationen im Gen für INFγ oder IL-12 und IL-12R wurden im Zusammenhang mit
Tuberkuloseerkrankungen diskutiert (Rossouw et al., 2003; Sahiratmadja et al., 2007).
Auch im Fall von CVID wurden Einzelnukleotidpolymorphismen proinflammatorischer
Zytokine untersucht und der TNFα-AG Genotyp gehäuft aufgefunden (Rezaei et al.,
2009).
TNFα und IL-6 Polymorphismen traten auch in IgA defekten Patienten auf (De la
Concha et al., 2000; López-Mejías et al. 2008).
Interferon γ
Das Typ II Interferon IFNγ wird hauptsächlich durch NK-Zellen und T-Zellen produziert
und spielt eine Schlüsselrolle in der adaptiven Immunantwort gegen virale und
bakterielle Infektionen. IFNγ erhöht die Expression von MHC Klasse II Molekülen sowie
von MHC Klasse I Molekülen auf der Oberfläche von Zellen und fördert somit die
Immunantwort der CD4+ und CD8+ T-Zellen. Ein weiterer Effekt des Typ II Interferons
beinhaltet die Rekrutierung von Effektorzellen an Entzündungsherde durch Aktivierung
von chemokinproduzierenden Makrophagen. Zusätzlich induziert es die Expression
von T-bet, ein Transkriptionsfaktor, der den Klassenwechsel von Immunglobulinen in
IgG2a fördert (Meyer, 2009).
Neuere Studien zeigen jedoch, dass IFNγ nicht nur proinflammatorische Eigenschaften
aufweist, sondern auch gegenteilige Wirkung erzielt. Dazu gehört seine Involvierung in
die Aktivität der Treg (Wang et al., 2006; Sawitzki et al., 2005) und die suppressive
Wirkung auf die Differenzierung proinflammatorischer Th17 Zellen (Cruz et al., 2006;
Chu et al., 2007). IFNγ kann daher als bidirektional immunregulatorisches Zytokin
betrachtet werden.
Aufgrund dessen hat eine Dysregulation der IFNγ Produktion starke Auswirkungen auf
den Verlauf der Immunantwort. Eine Übersekretion von IFNγ kann die zelluläre
Immunantwort stärken und somit eine Verschiebung weg von der humoralen
Immunantwort bewirken.
Menschen mit Mutationen im Gen für INFγ scheinen für das Erkranken an Tuberkulose
prädisponiert zu sein (Rossouw et al., 2003). Auch Mutationen im Gen für IL-12 und IL12R wurden mit der Anfälligkeit für Tuberkulose in Verbindung gebracht (Sahiratmadja
et al., 2007). Die IL-12/IFNγ Signalgebung spielt eine wichtige Rolle in der
Immunabwehr gegen Mycobakterien durch Aktivierung der zellvermittelten Immunität.
Dies zeigt, dass Defekte in diesem Zytokin zu einer erhöhten Infektanfälligkeit aufgrund
unzureichender Aktivierung der zellvermittelten Immunantwort führen kann.
Einleitung
12
Interleukin - 21
Interleukin-21 (IL-21) wird hauptsächlich von aktivierten CD4+ T-Zellen (Th2, Th17, Tfh)
produziert und gehört zur Interleukin-2 Familie.
Es wurde zunächst als T-Zell kostimulatorisches Zytokin beschrieben, das die anti-CD3
induzierte Proliferation verschiedener T-Zellpopulationen verstärkt (Kasaian et al.,
2002). Das Zytokin scheint jedoch in bestimmten Fällen immunmodulatorisch die
Entwicklung von Th1 Antworten, charakterisiert durch hohe IFNγ Produktion, zu
limitieren und somit Th2 Immunantworten zu fördern (Wurster et al., 2002).
IL-21 stimuliert ebenfalls in Anwesenheit von koaktivierenden Stimuli primäre B-Zellen
und erhöht die anti-CD40-vermittelte Proliferation (Parrish-Novak et al., 2000). Ohne
vorhergehende Stimulation durch CD40 vermittelt IL-21 jedoch proapoptotische
Signale durch Herabregulation der anti-apoptotischen Faktoren Bcl-xL und Bcl-2
(Mehta et al., 2003). IL-21 übernimmt ebenfalls eine wesentliche Funktion in der
Plasmazelldifferenzierung und vermittelt die Effektorfunktion der antigenspezifischen
Antikörper Produktion. Während die Produktion von IgG1 gefördert wird, scheint IL-21
die IgE Synthese zu inhibieren (Ozaki et al., 2002; Suto et al., 2002).
Der Zusammenhang von IL-21 und Autoimmunerkrankungen wurde aufgrund seiner
Effekte auf die Produktion von IFNγ, einem wichtigen Mediator von Autoimmunität, in
den letzten Jahren näher erforscht. An einigen Tiermodellen wurde kürzlich bestätigt,
dass IL-21 unter anderem ein allgemeiner Modulator der adaptiven Immunantwort
gegen Eigen-Gewebe in Krankheiten wie Rheumatoide Arthritis, SLE, Multiple Sklerose
oder Typ 1 Diabetes zu sein scheint (Vogelzang et al., 2008, 1).
IL-21R defiziente Mäuse wiesen normale Lymphozytenzahlen auf, zeigten jedoch nach
Immunisierung reduzierte Level an IgG1. Waren diese Mäuse zusätzlich defizient für
IL-4, so bildete sich eine Dysagammaglobulinämie mit fast vollständig fehlender IgG
Produktion aus. Diese Zytokine scheinen daher mitverantwortlich für die Pathologie in
Patienten mit X-vermittelter schwerer kombinierter Immundefizienz (XSCID) zu sein,
die eine Mutation im Gen der allgemeinen γ-Kette von vielen Zytokinrezeptoren, wie IL21R, IL-2R und IL-4R, aufweisen (Ozaki et al., 2002).
Interleukin-10
Hauptproduzenten von Interleukin-10 (IL-10) sind Th2-Zellen, regulatorische T-Zellen
und Th17-Zellen (O’arra et al., 2007). Doch auch CD8+ T-Zellen, Monozyten,
Makrophagen sowie Dendritische Zellen und B-Zellen sind in der Lage IL-10 zu
produzieren (Fillatreau et al., 2008).
IL-10 ist ein potenter Inhibitor der Antigenpräsentation durch Hemmung der MHC
Klasse II Expression und Hochregulation der kostimulatorischen Moleküle CD80 und
Einleitung
13
CD86. Ebenfalls hemmt es die Differenzierung von dendritischen Zellen aus
Monozytenvorläuferzellen und deren Reifung.
Ein weiterer tiefgreifender Effekt von IL-10 betrifft seine negative Wirkung auf die
Produktion von proinflammatorischen Zytokinen und Mediatoren von Makrophagen und
dendritischen Zellen. Die Level an IL-1, IL-6, IL-12 und Tumor Nekrose Faktor (TNF)
sind dramatisch reduziert nach Zugabe von IL-10 (Akdis et al., 2001).
Neben seiner immunsuppressiven Wirkung kostimuliert Interleukin-10 die BZellaktivierung, das B-Zellüberleben und wirkt positiv auf den Vorgang des
Klassenwechsels der B-Zellen.
Einige Studien mit IL-10 defizienten Mäusen zeigen die einschränkende Wirkung
dieses Zytokins auf Autoimmunpathologien (Berg et al., 1995; Gazzinelli et al., 1996).
In nahezu jedem Maus-Modell einer Autoimmunkrankheit, wie Rheumatoide Arthritis
oder
Autoimmun
Encephalitis,
führte
IL-10
Defizienz
zu
einer
deutlichen
Verschlechterung der Krankheit. Diese Studien und Studien mit Überexpression an IL10 zeigen, dass Interleukin-10 eine überschießende Immunantwort einschränken und
Autoimmunität verhindern kann.
In Versuchen an Mäusen mit autoimmuner Encephalitis waren autoantigen reaktive BZellen, die IL-10 produzierten, in der Lage die Pathogenese zu bessern (Fillatreau et
al., 2002). In Menschen, die eine reduzierte Antikörperproduktion aufgrund einer
Immundefizienz, z.B. CVID, aufweisen, könnte IL-10 zu einer Besserung solcher
proinflammatorischen Situationen führen, da auch Autoantikörper nur vermindert
gebildet werden.
IL-10 knock-out oder defiziente Mäuse entwickeln eine chronische Enterokolitis
aufgrund fehlender Immunregulation gegen innere Antigene (Kuhn et al., 1993).
Inflammation des Gastrointestinaltraktes treten auch in Patienten mit CVID auf und
könnten auf eine IL-10 Defizienz hinweisen. In CVID Patienten mit nachgewiesener
Mutation im Gen für ICOS wurde eine verringerte IL-10 Sekretion nachgewiesen
(Warnatz et al., 2006), welche auch in weiteren CVID Patienten vorkommen könnte.
Interleukin-17
Interleukin-17 (IL-17), heute gleichzusetzen mit IL-17A, gilt als Modelmolekül für eine
ganze Familie von IL-17 Zytokinen (IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17F). Hauptsächlich von
Th17-Zellen, aber auch von CD8+ T-Zellen und γδ T-Zellen erzeugt(Ivanov et al., 2007;
Peng et al., 2008), scheint IL-17 eine wichtige Rolle als proinflammatorisches Zytokin
in angeborener und adaptiver Immunantwort zu übernehmen (Ouyang et al., 2008).
Unter anderem induziert es die Freigabe von sekundären, proinflammatorischen
Chemokinen und Wachstumsfaktoren von mesenchymalen Zellen und führt so zur
Einleitung
14
Rekrutierung und Akkumulierung von Neutrophilen an den Entzündungsherd im Organ
(Laan et al., 1999).
Studien in Mäusen belegen, dass IL-17 einen wichtigen Beitrag zur Bekämpfung
verschiedener Pathogene in Säugetieren leistet (Kolls et al., 2004; Lindén et al., 2005).
Zum Beispiel wird die Expression von antimikrobiellen Molekülen wie β-Defensine in
Lunge, Haut und Darm durch IL-17 hochreguliert (Gaffen et al., 2008).
In Verbindung mit Autoimmunkrankheiten und chronischen Entzündungen können
erhöhte Level an IL-17 in Blut, brochoalveolarer Lavage (BAL) Flüssigkeit und Sputum
von Patienten mit Asthma (Ivanov et al., 2007) sowie in BAL Flüssigkeit von Patienten
mit zystischer Fibrose (Aujla et al., 2008) nachgewiesen werden.
Auch an Rheumatoider Arthritis leidende Patienten weisen auffällig viel IL-17 in Serum
und Gewebebiopsien auf (Kotake et al., 1999). Die Involvierung des Zytokins in
Transplantationsimmunität aufgrund nachgewiesener Erhöhung an lokalem IL-17 bei
Lungen - und Nieren - Allotransplantatabstoßungen in Patienten und Tiermodellen
steht fest (van Audenaerde et al., 2006, van Kooten et al., 1998).
Chronische Cutane Candidiasis ist ein Immundefekt, der seit kurzem mit IL-17 in
Verbindung gebracht werden kann. Eine Punktmutation im Gen für CARD9 in einigen
dieser Patienten ging einher mit geringer Zahl an Th-17-Zellen (Glocker et al., 2009).
Des Weiteren zeigten Patienten mit klinischer multipler Sklerose, die in CD4+ T-Zellen
eine erhöhte STAT3 Expression aufwiesen, eine erhöhte IL-17 Produktion im Vergleich
zu Patienten, die nur am klinisch isolierten Syndrom litten, welches suggestiv zu
Multipler Sklerose steht (Frisullo et al., 2008).
ICOS defiziente Mäuse konnten kein IL-17 produzieren (Bauquet et al., 2009). In CVID
Patienten mit nachgewiesener Mutation im Gen für ICOS wurde bei anti-ICOS
Stimulation eine verringerte IL-17 Sekretion detektiert (Warnatz et al., 2006), welche
auch in anderen CVID Patienten vorliegen könnte. Die reduzierte Rekrutierung von
Zellen durch IL-17 in pulmonale Gewebe kann zur Häufigkeit respiratorischer
Infektionen bei manchen Patienten mit CVID beitragen.
1.5
Variable Immundefizienz (CVID)
Primäre Immundefizienzen gründen auf genetischen Defekten, die das Immunsystem
betreffen. Der häufigste symptomatische primäre Immundefekt im Erwachsenenalter ist
die variable Immundefizienz (CVID) (Spickett et al., 2001) mit einer Häufigkeit von 1:25
000 bis 1:66 000.
CVID wird definiert durch Hypogammaglobulinämie von mindestens zwei der drei
Immunoglobulinisotypen IgG, IgA oder IgM, durch rezidivierende bakterielle Infektionen
vor allem des Respirations- und Gastrointestinaltraktes und durch eine gestörte
Einleitung
15
Antikörperantwort auf Protein oder Polysaccharid Vakzine (IUIS Scientific Committeee.
International Union of Immunological Societies, 1999).
Andere
Ursachen
der
Infektionskrankheiten,
Defekte müssen
Hypogammaglobulinämie
wie
Tumore,
Eiweißverlust,
Medikamente oder andere immunologische oder genetische
zur Diagnose zunächst ausgeschlossen werden (Warnatz et al.,
2004).
Die Therapie erfolgt durch regelmäßige intravenöse Immunglobulinsubstitution mit IgG
und durch eine resistenzgerechte Antibiotikatherapie gegen bakterielle Infekte (Gaspar
et al., 1998).
Klinische Präsentation
Die Heterogenität der klinischen Präsentation von CVID erschwert eine Diagnose der
Krankheit, die sich oft erst in der zweiten oder dritten Lebensdekade manifestiert.
Die Patienten leiden unter wiederkehrenden Infektionen des Respirationstraktes wie
Bronchitis oder Pneumonie (Ogershok et al., 2006). 10% der Patienten entwickeln eine
granulomatöse lymphozytische interstitiale Lungenkrankheit (GLILD) (Park et al.,
2005), die für eine inflammatorische Dysregulation aufgrund einer zusätzlichen TZellstörung spricht.
Gastrointestinale Komplikationen sind bei den Betroffenen relativ häufig, darunter
chronische Diarrhö (50% der Patienten) aufgrund von intestinalen, parasitären,
bakteriellen oder viralen Infektionen (Cunningham-Rundles et al., 1999) oder Sprueoder Crohn-ähnlicher Enteritis, welche ebenfalls Zeichen einer T-Zellstörung sind.
Weitere auffällige klinische Manifestationen sind lymphoproliferative Krankheiten wie
Splenomegalie (1/3 aller CVID Patienten) und Granulome in weiteren Organen wie
Leber, Haut oder Milz (Cunningham-Rundles et al., 1999).
Das Risiko einer Lymphomentstehung ist in Patienten mit einer CVID Diagnose erhöht.
Es handelt sich dabei meist um B-Zell non-Hodgkin Lymphome (Kinlen et al., 1985).
25% der CVID Betroffenen leiden zusätzlich unter Autoimmunkrankheiten, vor allem
unter idiopathischer Thrombopenie oder hämolytischer Anämie (Cunningham-Rundles
et al., 1999).
Dem
gemeinsamen
immunologischen
Phänotyp
liegt
eine
Störung
der
Immunglobulinproduktion zugrunde.
CVID Patienten zeigen eine gestörte B-Zell-Homöostase, besonders bei der
Entwicklung von Gedächtnis B-Zellen. Diese tragen den Phänotyp naiver BLymphozyten: keine somatische Hypermutation der variablen schweren Ketten-Gene
und restringierte Vh Genfamilien (Bonhomme et al., 2000; Levy et al., 1998). Eine
veränderte Zahl und Aktivierung der Gedächtniszellen (Brouet et al., 2000) sowie
Einleitung
16
schwere Defekte der klassengewechselten Gedächtniszellen treten auf (Agematsu et
al., 2002; Warnatz et al., 2002).
20% der CVID Patienten haben eine gestörte T-Zellproliferation, wobei meist die
Anzahl der CD4+ T-Zellen verringert ist (Baumert et al., 1992; Jaffe et al., 1993).
Auch verminderte T-Helferfunktion (Reinherz et al., 1981), abnormale T-Zell
Signalgebung (Majolini et al., 1991) sowie erhöhte T-Zell-Suppressorfunktionen (North
et al., 1998) wurden in der Literatur beschrieben. Giovannetti et al. zeigten, dass
Patienten mit CVID, die an einer Hepatitis C Infektionen leiden, mit größerer
Wahrscheinlichkeit ein Leberversagen entwickeln als Patienten mit XLA (Giovannetti et
al., 2002). Dies gründet vermutlich auf einer T-Zelldefizienz, die Patienten mit CVID
von Patienten mit XLA unterscheidet.
Neben Zellen der humoralen und zellulären adaptiven Immunantwort zeigen auch
Zellen des angeborenen Immunsystems Defekte in CVID. Dies betrifft in den meisten
Fällen die dendritischen Zellen. Diese können eine gestörte Reifung aufweisen und in
Phänotyp und Funktion Monozyten ähneln, so dass die Antigenpräsentation suboptimal
verläuft (Scott-Taylor et al., 2006). Eine fehlende Auslösung der adaptiven
Immunantwort aufgrund von Defekten in der Aktivierung dendritischer Zellen über ihre
PRRs kommt ebenfalls vor (Cunningham-Rundles et al., 2006).
Genetische Defekte
Bei ca. 15% der CVID Patienten wird aufgrund der familiären Anamnese eine
wesentliche genetische Komponente vermutet. Allerdings ist nur für ca. 8% aller CVID
Patienten der zugrundeliegende genetische Defekt bekannt.
Betroffen sind die Mitglieder der TNF (Tumor Nekrose Faktor)-Familie TACI
(Transmembrane Activator and Calcium-modulating Cyclophilin Ligand interactor)
(Salzer et al., 2005) und BAFF-R (B Cell Activating Factor Receptor) (Warnatz et al.,
2005). Auch der homozygote Verlust der Oberflächenmoleküle ICOS (inducible
CoStimulator) auf T-Zellen (Grimbacher et al., 2003) und CD19 auf B-Zellen (van Zelm
et al., 2006) sind bisher als Defekte in CVID identifiziert.
Klassifizierung
Die Heterogenität von CVID machte eine Klassifizierung der Patienten innerhalb der
Krankheit sinnvoll.
Die Klassifizierung nach Bryant beruht auf der Fähigkeit der IgG und IgM Sekretion
nach
anti-IgM
oder
Interleukin-2
Stimulation
(Bryant
et
al.,
1990)
Neuere
Klassifizierungen (Freiburg- und Paris- Klassifizierung) ziehen die Prozentzahl an
klassengewechselten B-Gedächtniszellen als Marker heran und können leicht per
Einleitung
17
Durchflusszytometrie durchgeführt werden (Warnatz et al., 2002 ; Piqueras et al.,
2003).
Für diese Arbeit wurde die so genannte „Freiburg―- Klassifizierung herangezogen.
Patienten, die weniger als 0,4% an CD27+IgD- B-Zellen aufweisen, werden der Gruppe
I
zugeordnet.
Patienten
mit
einem
höheren
Prozentsatz
(>
0,4
%)
an
klassengewechselten B-Gedächtniszellen gehören der Gruppe II an. Die Anzahl an
CD21low B-Zellen, die in den meisten gesunden Personen bei deutlich unter 5% der
CD19+ B-Zellen liegt, wird zu einer weiteren Unterteilung der Patienten der Gruppe I
herangezogen. Bei einem Prozentsatz von über 20% CD21low B-Zellen werden die
Patienten der Gruppe Ia zugeordnet, bei einem Prozentsatz darunter gehören sie der
Gruppe Ib an (Warnatz et al., 2002).
1.6
Thema der Arbeit
In 75 % der Fälle von CVID bleibt die Ursache der Krankheit bis heute ungeklärt.
Auch die Heterogenität der Krankheit macht eine Identifizierung der gestörten Zelltypen
und Mechanismen schwierig. Die variable Ausprägung von gestörter B-Zellproliferation
und dem Schweregrad an dysregulierter Immunglobulin-Produktion lassen in einigen
eher einen Defekt in der B-Zellregulation als eine intrinsische B-Zellspezifische
Mutation als Ursache von CVID vermuten. Die Tatsache, dass B-Zellen von CVID
Patienten, die in vitro unter Zusatz von anti-CD40 und IL-4 kultiviert wurden, normal
proliferierten und eine normale Menge an IgE synthetisierten, unterstützte die
Hypothese, dass die meisten Patienten B-Zellen mit normaler Funktion besitzen
(Nonoyama et al., 1993). Auch die Tatsache, dass die Proliferation aller peripherer
Blutlymphozyten (PBL) nach in vitro Stimulation mit Mitogenen und Antigenen in
einigen CVID-Patienten gestört war (Cunningham-Rundles et al., 1999), wies auf mehr
als nur einen B-Zelldefekt hin.
Es wurden daher vermehrt Phänotyp und Funktion von T-Zellen und Zellen des
angeborenen Immunsystems in CVID Patienten erforscht.
Kostimulation durch T-Zellen spielt in der B-Zell-Differenzierung eine wichtige Rolle.
Farrington et al. zeigten, dass bei Patienten mit CVID eine reduzierte Expression des
Kostimulationsmoleküls CD40L vorliegt (Farrington et al., 1994). In einigen Patienten
wurde auch eine Mutation im Gen für das Oberflächenmolekül ICOS, als bisher
einziger T-Zelldefekt identifiziert (Grimbacher et al., 2003).
Untersuchungen an ICOS defizienten Patienten zeigten einen Rückgang der
Keimzentren und zirkulierender CXCR5+ T-Zellen (Bossaller et al., 2006). Defiziente
Tfh-Zellfunktion und somit eine gestörte B-Zellhilfe im Keimzentrum könnten daher ein
Grund der anormalen B-Zelldifferenzierung in CVID darstellen.
Einleitung
18
Wie oben bereits ausgeführt, beeinflussen mehrere durch T-Zellen und durch andere
Zellen des Immunsystems produzierte Zytokine die Differenzierung und Reifung von BZellen und weisen eine potenzielle pathologische Bedeutung für CVID auf.
Untersuchungen an Patienten mit CVID zeigten, dass nach in vitro Stimulation weniger
IL-4 und IL-2 durch PBL produziert wurde (Pastorelli et al., 1989). Die Produktion von
IFNγ durch CD4+ und CD8+ T-Zellen hingegen war in Patienten mit CVID im Vergleich
mit gesunden Spendern erhöht (North et al., 1996), welches auf eine exzessive Th1Zellvermittelte Immunantwort hinweist.
Rezaei et al. fanden in Patienten mit CVID auffällige Nukleotidpolymorphismen im Gen
für transforming growth factor (TGF)-beta und erwarteten daher eine niedrigere
Produktion dieses Zytokins in diesen Patienten (Rezaei et al., 2009).
Informationen über die Th17 Population in Patienten mit CVID, wie Funktion und
Differenzierung, sind zurzeit nicht publiziert und sollten in dieser Studie erhalten
werden.
Cunningham-Rundles et al. sowie Bayry et al. wiesen in Patienten mit CVID eine
reduzierte IL-12 Sekretion durch dendritische Zellen nach (Cunningham-Rundles et al.,
2005; Bayry et al., 2004). Da die IL-21 Produktion von CD4+ T-Zellen durch IL-12
gefördert wird, liegt die Überlegung nahe, dass CVID Patienten weniger IL-21
produzieren und daher die Funktion der B-Zellhilfe gestört ist.
Diese Hypothese wird unterstützt durch Experimente, die von Borte et al. durchgeführt
wurden. Diese zeigten, dass eine anti-CD40 mit zusätzlicher IL-21 Stimulation ex vivo
noch effektiver die Immunglobulinproduktion in CVID Patienten anregt (Borte et al.,
2009). Die Differenzierung in Plasmazellen aus naiven B-Zellen konnte so in den
meisten untersuchten Patienten induziert werden.
Erniedrigte IL-10 Sekretion durch T-Zellen nach anti-CD3/CD28 Stimulation wurde in
Patienten mit CVID bereits detektiert (Holm et al., 2003), jedoch nicht auf die neue
Klassifizierung ausgeweitet. In diesem Zusammenhang ist bekannt, dass die
Immunglobulinproduktion in Patienten mit CVID durch anti-CD40 und zusätzlicher IL-10
Stimulation normalisiert werden kann (Zielen et al., 1993), welches für eine vorhandene
Dysregulation der IL-10 Sekretion in Patienten mit CVID spricht.
Zytokine können die Immunantwort in vieler Hinsicht beeinflussen, indem sie die
Differenzierung und Aktivierung bestimmter Zelltypen fördern oder hemmen.
Dysregulierte Produktion verschiedener Zytokine in Patienten mit CVID könnte daher
zur Pathologie beitragen.
Einleitung
19
Das Thema meiner Diplomarbeit beschäftigte sich aufgrund des Gesagten mit der
Bedeutung möglicher Störungen der T-Zelle in der Pathogenese des variablen
Immundefektes. Aufbauend auf dem geschilderten Wissensstand hatte meine
Diplomarbeit folgende drei zentrale Ziele:
a) Induktion von Tfh-Zellen aus zirkulierenden CXCR5+ T-Zellen
b) Untersuchung der Differenzierung und Funktion zirkulierender CXCR5+ T-Zellen
bei Patienten mit CVID
c) Untersuchung der Assoziation einer zytokindefinierten T-Zelldysbalance mit
bestehender Klassifikation
Hierzu wurden im Einzelnen folgende Teilaspekte untersucht:
1.)
Etablierung einer auf Durchflusszytometrie basierten Messung von
Zytokinen in T-Zellen von gesunden Kontrollpersonen
2.)
Erweiterte Phänotypisierung zirkulierender und Generierung follikulärer
T-Helferzellen in Patienten mit CVID
3.)
Vergleichende Untersuchung der Zahl IL-21 produzierender T-Zellen in
Patienten mit unterschiedlichen Subklassen von CVID
4.)
Vergleichende Untersuchung der Zahl IL-10 produzierender T-Zellen in
Patienten mit unterschiedlichen Subklassen von CVID
5.)
Vergleichende Untersuchung der Zahl IL-17 produzierender T-Zellen in
Patienten mit unterschiedlichen Subklassen von CVID
6.)
Vergleichende Untersuchung der Zahl IFNγ produzierender T-Zellen in
Patienten mit unterschiedlichen Subklassen von CVID
7.)
Immunglobulinproduktion in Patienten mit CVID nach Kostimulation mit
voraktivierten T-Zellen
8.)
Immunglobulinproduktion in Patienten mit CVID nach Kostimulation mit
von voraktivierten Zellen gewonnenem Überstand
Material und Methoden
20
2
Material und Methoden
2.1
Material
2.1.1
Probenmaterial
Das untersuchte Blut von CVID Patienten stammte aus dem Kollektiv des
Universitätsklinikums Freiburg, die regelmäßig in der Immundefekt Ambulanz vorstellig
werden. Freiwillige Spender ermöglichten den Vergleich mit gesundem Kontrollblut.
Alle Spender wurden zuvor aufgeklärt und eine Einverständniserklärung wurde
unterschrieben.
Isolierte Tonsillenzellen wurden aus bereits vorhandenen, eingefrorenen Zelllproben
erhalten, während Zellen der Milz von einer befreundeten Arbeitsgruppe aus
Gewebematerial, das von der AG um PD Dr. Ulrich Baumann aus Hannover zur
Verfügung gestellt wurde, isoliert wurden.
2.1.2
Zellkultur
Bicoll Separating Solution
Biochrom AG, Berlin
RPMI 1640 Medium (1x)
Biochrom AG, Berlin
Penicillin/Streptomycin
Invitrogen/Gibco, Carlsbad CA/USA
PBS Dulbecco (1x)
Biochrom AG, Berlin
FCS (Fetales Kälber Serum)
Biochrom AG, Berlin
Essigsäure
Sigma-Aldrich, Steinheim
2.1.3
Stimulationen
Antikörper /
Interleukine
Spezies
Klon
Hersteller
CD3
Maus
Beckton Dickinson GmbH, Heidelberg
CD28
Maus
IL-21
IL-6
rekombinant
rekombinant
IL-12
rekombinant
HIT3a
CLB-CD28/1,
15E8
E. Coli
E. Coli
Spodoptera
frugiperda 21
ICOS
IgG (Fab2Fragment)
F44
Maus
Sanquin, Amsterdam (Niederlande)
ImmunoTools, Friesoythe
ImmunoTools, Friesoythe
R&D Systems, Wiesbaden
erhalten von Richard Kroczek, RobertKoch-Institut Berlin
Jackson Immuno Research, West
Grove, (PA/ USA)
Material und Methoden
Antikörper /
Interleukine
Spezies
spez. κ-Kette
Ziege
21
Klon
Hersteller
Southern Biotech, Birmingham (AL/
USA)
Tabelle 1: Übersicht der verwendeten Stimulanzien
2.1.4
Durchflusszytometrie
Antikörper
Markier
ung
Spezies
Klon
Verdünnung Hersteller
CD3
PE-Cy7
Maus
UCHT1
1:4
CD4
PerCP
Maus
SK3
konzentriert
CD8
PerCP
Maus
SK1
konzentriert
CD8
APC
Maus
SK1
1:2
CD19
PE-Cy7
Maus
J4.119
1:8
CD21
FITC
Maus
BL13
konzentriert
CD27
PerCPCy5.5
Maus
O323
1:3
CD38
APC
Maus
HIT2
konzentriert
CD38
Pacific
Blue
Maus
HIT2
konzentriert
FITC
Maus
UCHL1
konzentriert
PE
Maus
ACT35
konzentriert
CD200
PE
Maus
MRC OX104
konzentriert
CD279
(PD-1)
PE
Maus
MIH4
konzentriert
CXCR5
PE
Maus
51505.111
konzentriert
CXCR5
APC
Maus
51505
1:2
ICOS
PE
Maus
ISA-3
konzentriert
IL-21R
PE
Maus
17A12
konzentriert
IL-21
PE
Maus
3A3-N2.1
konzentriert
IL-10
PE
Ratte
JES3-9D7
konzentriert
IL-17A
PE
Maus
eBio64DE
C17
1:10
IFNg
APC
Maus
B27
1:100
IgM
Cy 5
Kaninchen
CD45
RO
CD134
(OX40)
1:40
Beckman Coulter,
Krefeld
Beckton Dickinson
GmbH, Heidelberg
Beckton Dickinson
GmbH, Heidelberg
Beckton Dickinson
GmbH, Heidelberg
Beckman Coulter,
Krefeld
Beckman Coulter,
Krefeld
BioLegend, San Diego
(CA/ USA)
Beckton Dickinson
GmbH, Heidelberg
Exbio, Prag
(Tschechien)
Beckman Coulter,
Krefeld
Beckton Dickinson
GmbH, Heidelberg
Beckton Dickinson
GmbH, Heidelberg
Beckton Dickinson
GmbH, Heidelberg
R&D Systems,
Wiesbaden
R&D Systems,
Wiesbaden
eBioscience, San Diego
(CA/ USA)
Beckton Dickinson
GmbH, Heidelberg
Beckton Dickinson
GmbH, Heidelberg
Beckton Dickinson
GmbH, Heidelberg
eBioscience, San Diego
(CA/ USA)
R&D Systems,
Wiesbaden
Jackson Immuno
Research, West Grove,
(PA/ USA)
Material und Methoden
22
Antikörper
Markier
ung
Spezies
Klon
Verdünnung Hersteller
IgG
FITC
Kaninchen
F0056
1:20
IgA
PE
Ziege
Dako, Glostrup
(Dänemark)
Southern Biotech,
Birmingham (AL/ USA)
1:40
DAPI
Sigma-Aldrich,
Steinheim
1:100
dihydrochloride
Tabelle 2: Übersicht der für die durchflusszytometrische Färbung verwendeten Antikörper
FACSFlowTM
Beckton Dickinson GmbH, Heidelberg
Optilyse: OptiLyse B Lysing solution
Immunotech, Marseille/Frankreich
Cytofix/Cytoperm
Beckton Dickinson GmbH, Heidelberg
Perm/ Wash Puffer
Beckton Dickinson GmbH, Heidelberg
Cytofix
Beckton Dickinson GmbH, Heidelberg
Phosflow Perm Puffer III
Beckton Dickinson GmbH, Heidelberg
®
Dynal CD4 Positive Isolation Kit
2.1.5
Invitrogen/ Dynal AS, Oslo (Norwegen)
Immunglobulin- ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
N Protein Standard SL
Siemens, München
Phosphatase Substrat
Sigma-Aldrich, Steinheim
Antikörper
Spezies
Spezifität
IgA, IgG, IgM
Ziege
IgM
Ziege
Fc5µ Fragment
IgA
Ziege
α Kette
IgG
Ziege
Fcγ Fragment
Hersteller
Jackson Immuno
Research, West Grove,
(PA/ USA)
Jackson Immuno
Research, West Grove,
(PA/ USA)
Jackson Immuno
Research, West Grove,
(PA/ USA)
Jackson Immuno
Research, West Grove,
(PA/ USA)
Tabelle 3: Übersicht der für den ELISA verwendeten Antikörper
2.1.6

Puffer
R0 Medium
RPMI 1640 Medium
100 U/ ml Penicillin (1%)
100 µg/ ml Streptomycin (1%)
Material und Methoden

R10 Medium
23
RPMI 1640 Medium
100 U/ ml Penicillin (1 %)
100 µg/ ml Streptomycin (1 %)
10 % fetales Kälberserum (FCS)


Permeablisierungs-
Aqua dest.
und Waschpuffer
Perm/ Wash Puffer (10 %)
ELISA Waschpuffer
40 g NaCl
7,0 g Na2HPO4.(H2O)
1,0 g KCl
1,0 g KH2PO4
1,0 g Natrium-Azid
2,5 ml Tween 20
mit Wasser auf 5 l auffüllen
pH 7,4

ELISA Coating Puffer
1,59 g Na2CO3
2,93 g NaHCO3
0,20 g Natrium-Azid
mit Wasser auf 1 l auffüllen
pH 9,6

ELISA Enzym Puffer
97 ml Diethanolamin
0,1 g MgCl2.6H2O
0,2 g Natrium-Azid
2.1.7
Verbrauchsmaterial
0,5 ml Reaktionsgefäße Safe Seal
Eppendorf, Hamburg
1,5 ml Reaktionsgefäße
Biozym, Oldendorf
15ml, 50 ml Reaktionsgefäße
Greiner Bio-one, Frickenhausen
FACS-Röhrchen
Beckton Dickinson, Heidelberg
Material und Methoden
24
Spitzen
Starlab, Ahrensburg
Spitzen Finntip Band 4
Thermo Scientific, Düsseldorf
Stripetten
Costar, Corning (NY/USA)
75 ml Reagent Reservoir
Thermo Scientific, Düsseldorf
96 Loch Platten, Rundboden, steril
NuncTM, Roskilde (Dänemark)
96 Loch Platten, Flachboden, unsteril
Greiner Bio-one, Frickenhausen
24 Loch Platten, Flachboden, steril
Greiner Bio-one, Frickenhausen
2.1.8
Geräte
Heraeus Multifuge 1 S-R
Thermo Scientific, Düsseldorf
Heraeus Multifuge 1 S
Thermo Scientific, Düsseldorf
Zentrifuge Heraeus Fresco 21
Thermo Scientific, Düsseldorf
Heraeus Brutschrank Hera Cell 240i
Thermo Scientific, Düsseldorf
Sterile Werkbank Safe 2020
Thermo Scientific, Düsseldorf
Durchflusszytometer FacsCanto II
Beckton Dickinson, Heidelberg
Mikroskope Axiovert 40C und PrimoStar
Zeiss, Jena
Pipetierhilfe Akkujet Pro
Brand, Wertheim
Pipetten
Gilson, Den Haag (Niederlande) und
Peqlab, Erlangen
Multikanalpipette Transferpette
®
Brand, Wertheim
Thermomixer Comfort
Eppendorf, Hamburg
Heizplatte/ Rührgerät IKAMAG® RCT
IKA Labortechnik, Staufen
pH-Meter
WTW
(Wissenschaftliche
Technische
Werkstätten), Weilheim
Wipptisch Minirocker
Peqlab, Erlangen
Vortexer Reax Top
Heidolph, Schwabach
Dynal® MPCTM- L Magnet
Invitrogen/Gibco, Carlsbad (CA/USA)
Zählkammer Neubauer
Brand, Wertheim
Multiscan EX Elisa Reader
Thermo Scientific, Düsseldorf
2.1.9
Verwendete Programme
Microsoft® Excel 2002
Microsoft Corporation
Microsoft® Power Point
Microsoft Corporation
Graph Pad Prism 5
GraphPad Software, Inc.
Flow Jo 7.2.2
Tree Star, Inc.
Material und Methoden
25
2.2
Methoden
2.2.1
Isolierung der Zellen
2.2.1.1 Isolierung peripherer Blut-Lymphozyten (PBL) per FicollDichtegradientenzentrifugation
EDTA-Blut von Spendern wurde 1:2 mit RPMI-Medium verdünnt und resuspendiert.
Das verdünnte Blut wurde vorsichtig auf die in einem 50 ml Reaktionsgefäß
vorgelegten 15 ml der Ficoll Lösung geschichtet und bei 1400 rpm bei Raumtemperatur
(RT) für 17 Minuten ohne Bremse zentrifugiert. Dabei trennten sich die Blutbestandteile
aufgrund ihrer Dichte in verschiedene Schichten auf. Erythrozyten und Thrombozyten
bildeten
das
Pellet.
Zwischen
der
folgenden
Ficoll-Zuckerlösung
und
der
Mediumsschicht bildete sich eine intermediäre Schicht, die vorwiegend aus peripheren
Blut- Lymphozyten (PBL) und Monozyten bestand (Abb.3).
Diese Schicht wurde vorsichtig abgenommen und in ein neues Reaktionsgefäß
überführt, das daraufhin mit RPMI-Medium auf 50 ml aufgefüllt wurde. Nach
Zentrifugation bei 1000 rpm für 10 Minuten bei RT folgte ein weiterer Waschschritt in
10 ml R10 bei gleicher Zentrifugationseinstellung. Das Zellpellet wurde zuletzt in 1 ml
R10 aufgenommen und die Zellzahl ermittelt.
Ficoll
Ficoll
Abbildung 3: Darstellung der Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation zur Isolierung von mononukleären
Zellen.
Nach Zentrifugation bilden sich verschiedene Phasen aufgrund ihrer Dichteverteilung aus. Die Interphase
bilden mononukleäre Zellen, die dann so von Erythrozyten und Granulozyten, die sich im Pellet befinden,
abgetrennt werden können. (Quelle: Dissertation Robert Tripmacher; 2005)
Material und Methoden
26
2.2.1.2 Isolation von CD4+ T-Zellen mit Dynal® CD4 Positive Isolation Kit
Die Isolation von CD4+ T-Zellen erfolgte mit Hilfe des Dynal® CD4 Positive Isolation Kit.
Es handelt sich hierbei um eine Positivisolation, d.h. die CD4 positiven Zellen werden
von Beads gebunden und somit von den restlichen Lymphozyten abgetrennt. Da die
Beads magnetisch beladen sind, kann man sie und nach deren Bindung auch die CD4+
T-Zellen mit Hilfe eines Magneten von der restlichen Lösung separieren.
Um etwa 4 x 106 CD4+ T-Zellen zu erhalten wurden 20 x 106 PBL-Zellen der Probe auf
5 x 106 Z/ml eingestellt. Pro ml Probe wurden 72 µl Dynabeads benötigt und hierzu in 1
ml PBS/ 2% FCS resuspendiert. Nach etwa 30 s waren die Beads an den Magneten
gebunden und der Überstand wurde abgenommen. Die so gewaschenen Beads
wurden in 72 µl PBS/ 2% FCS pro ml Probe aufgenommen.
Nun wurde die Zellprobe zu den Beads gegeben und für 20 min bei 2-8 °C unter
leichtem Schütteln und Rühren inkubiert. Nach 2-3 min waren die Beads, die an die
Zellen gebunden hatten, am Magneten zentriert. Der Überstand wurde verworfen und
die Beads mit den gebunden CD4+ T-Zellen 4-5 mal nach dem gleichen Prozedere in 1
ml PBS/ 2% FCS gewaschen. Die gewaschenen und isolierten CD4+ T-Zellen wurden
in 100 µl R10 aufgenommen.
Um die Beads von den Zellen freizusetzen wurde 10 µl DetachaBead® pro 100 µl
Zellsuspension zugegeben und für 45-60 min bei RT auf dem Schüttler inkubiert. Das
Gefäß wurde danach für 2 min in den Magneten gestellt. Die nun freigesetzten Zellen
befanden sich im Überstand und wurden in einem neuen Gefäß separiert. Die Beads
wurden 2-3 mal in 500 µl R10 gewaschen und der Überstand jeweils abgenommen.
Die freigesetzten Zellen wurden in insgesamt 10 ml R10 resuspendiert und 6-8 min bei
400 g zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 1 ml R10 aufgenommen und die Zellen
gezählt.
2.2.1.3 Bestimmung der Zellzahl
Um die Lymphozytenzahl in 1 ml Medium zu bestimmen, wurden zunächst 50 µl der
Zellsuspension 1:20 in 3 %iger Essigsäure verdünnt. Mit der verdünnten Lösung wurde
eine Neubauer-Zählkammer befüllt und zwei Großquadrate der Kammer wurden unter
dem Mikroskop bei einer 40-fachen Vergrößerung gezählt.
Die Zellzahl ermittelte sich aus folgender Formel:
Volumen
der
Zellsuspension
Verdünnungsfaktor = Zellzahl/ml
x
Mittelwert
der
gezählten
Zellen
x
104
x
Material und Methoden
2.2.2
27
Stimulationen
2.2.2.1 Coaten von 96-well Platten mit CD3 und CD28
Das „Coaten― von Zellkulturplatten verbessert die Stimulation der Zellen in Kultur durch
stärkere Kreuzvernetzung der Oberflächenrezeptoren. Besonders für isolierte CD4+ TZellen reichte es nicht aus lösliches CD3 oder CD28 zum Stimulationsmedium
zuzugeben und ein Coaten der Platte mit CD3 und CD28 Antikörper war nötig.
Die Platten wurden einen Tag vor Kulturansatz mit anti-Maus IgG (Fab2-Fragment)
Antikörper gecoatet. Hierzu wurden die Vertiefungen der Platte mit 100 µl PBS mit 2,5
µg /ml anti-Maus IgG aufgefüllt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Am darauf folgenden
Tag fand nach einmaligem Waschen mit je 200 µl PBS pro Vertiefung die Inkubation
mit den sekundären Antikörpern CD3 und CD28 statt, die sich an das an der Platte
festsitzende IgG hefteten. Die Vertiefungen der Platte wurden hierzu mit 100 µl PBS
versetzt mit 200 ng/ml CD3 und 200 ng/ml CD28 befüllt und für 2 h bei 37°C inkubiert.
Bevor die Zellen und das Medium für eine Stimulation zugegeben wurden, wurden die
Vertiefungen der Platte zweimal mit je 200 µl R10 gewaschen.
2.2.2.2 T-Zell-Stimulation
Zur erfolgreichen Stimulation von T-Zellen wurde eine Konzentration von 1 x 106 Z / ml
gewählt.
Zur Stimulation frischer PBL war kein Coaten der Platten mit anti-CD3/CD28 nötig.
Daher wurden jeweils 200 ng/ml des gelösten monoklonalen Antikörpers CD3 und 200
ng/ml des monoklonalen Antikörpers CD28 dem Medium R10 zugegeben. Soweit
vermerkt wurden zusätzlich 100 ng/ml IL-6, 10 ng/ml IL-12, 100 ng/ml IL-21 oder 4
µg/ml monoklonalen Antikörpers ICOS zugegeben. Als Negativkontrolle diente jeweils
R10. Die Stimulation fand in 1 ml Volumen in 24-well Platten statt.
Die Stimulation isolierter CD4+ T-Zellen fand in 200 µl Volumen in vorher mit anti-CD3/
CD28 gecoateten 96-well Platten statt. Als Medium wurden R10 oder R10 mit 10 ng/ml
IL-12 verwendet.
Die Stimulationen erfolgten für 48 h bei 37 °C und 5 % CO2 im Brutschrank.
2.2.2.3 T-und B-Zell Kostimulation
Die T- und B-Zell Kostimulation wurde mit frisch isolierten PBL in einer Konzentration
von 1 x 106 Z/ml durchgeführt. Zur Stimulation der T-Zellen wurden 200 ng/ml CD3
sowie 200 ng/ml CD28 Antikörper dem Medium R10 zugegeben. Als Negativkontrolle
Material und Methoden
28
diente eine Kultur mit R10. Die Stimulation fand in 1 ml Volumen in 24-well Platten für 6
Tage bei 37°C und 5 % CO2 im Brutschrank statt.
Um das Überleben der Zellen über 6 Tage hinweg zu sichern wurden nach 3 Tagen
500 µl Medium vorsichtig abgenommen und verworfen. Daraufhin wurden 500 µl
frisches R10 vorsichtig am Rand der Vertiefung hinzu gegeben. Vor Ernte der Zellen
nach 6 Tagen wurden 500 µl Überstand abgenommen und bei -20 °C eingefroren.
2.2.2.4 Stimulation mit aus T-Zellstimulation gewonnenem Überstand
Die Stimulation mit Überstand wurde mit frisch isolierten PBL in einer Konzentration
von 1 x 106 Z/ml durchgeführt. Zur Stimulation der Zellen wurden 200 ml eines aus
einer 48 h anti-CD3/CD28 Lymphozytenstimulation stammenden Überstands (s.
2.2.2.2) mit 300 ml Medium R10 vermischt und zu den Zellen gegeben. Als
Negativkontrolle diente eine Kultur mit nach 48 h Lymphozyten Kontrollstimulation
(R10) gewonnenem Überstand. Die Stimulation fand in 1 ml Volumen in 24-well Platten
für 6 Tage bei 37°C und 5 % CO2 im Brutschrank statt.
Um das Überleben der Zellen über 6 Tage hinweg zu sichern wurden nach 3 Tagen
500 µl Medium vorsichtig abgenommen und verworfen. Daraufhin wurden 500 µl
frisches R10 vorsichtig am Rand der Vertiefung hinzu gegeben. Vor Ernte der Zellen
nach 6 Tagen wurden 500 µl Überstand entnommen und bei -20 °C eingefroren.
2.2.3
Durchflusszytometrische Färbung
2.2.3.1 Extrazelluläre Antikörperfärbung unstimulierter Zellen
Zur Antikörperfärbung extrazellulärer Moleküle wurden 500 000 ficollisierter PBL Zellen
in einem Volumen von 50 µl mit je 5 µl der entsprechenden Antikörper versetzt und für
20 min bei 4 °C inkubiert. Die Inkubationsschritte erfolgten jeweils im Dunkeln um ein
Ausbleichen der Fluoreszenzfarbstoffe zu verhindern.
Danach wurden 30 µl OptiLyse B zur Fixierung der Zellen zugegeben und für 15 min
bei RT inkubiert. Vor und nach Zugabe wurde die Zellsuspension jeweils mittels
Vortexen gemischt. Einer weiteren Inkubation in 500 µl Aqua dest. für 3-5 min zur Lyse
von Erythrozyten folgte ein Waschvorgang in 500 µl FACS-Puffer bei 1200 rpm für 5
min.
Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde in 100 µl FACS-Puffer
aufgenommen. Bis zur Messung der Zellsuspension im Durchflusszytometer wurden
die Zellen bei 4 °C dunkel gelagert.
Material und Methoden
29
2.2.3.2 Extrazelluläre Antikörperfärbung stimulierter Zellen
Bei stimulierten Zellen erfolgte kurz vor der Messung im Durchflusszytometer eine
Färbung mit je 5 µl des Farbstoffes Dapi. Durch diesen mit der DNA interkalierenden
Farbstoff ist eine Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen möglich, da er
nur tote Zellen ohne intakte Zellmembran anfärbt. Da eine Fixierung der Zellen durch
OptiLyse B jedoch auch die Zellmembran vitaler Zellen angreift, werden diese ebenfalls
für Dapi positiv gefärbt. Eine Fixierung der Zellen mit war somit nicht möglich.
Nach Inkubation der Oberflächen-Antikörper für 20 min fand daher nur ein
Waschvorgang in 1 ml FACS-Puffer bei 1200 rpm für 5 min statt. Der Überstand wurde
verworfen und das Zellpellet in 100 µl FACS-Puffer aufgenommen. Bis zur Messung
der Zellsuspension im Durchflusszytometer wurden die Zellen bei 4 °C dunkel gelagert.
2.2.3.3 Intrazelluläre Antikörperfärbung stimulierter Zellen
Um intrazelluläre Moleküle wie Interleukine mit Antikörpern zu markieren, muss die
Zelle
mithilfe
eines
Paraformaldehyd
und
Saponin
enthaltenen
Reagenzes
permeabilisiert und fixiert werden.
Nach Inkubation der Oberflächenantikörper für 20 min bei 4 °C wurden die Zellen in 1
ml FACS-Puffer bei 1200 rpm für 5 min gewaschen. Dem Zellpellet wurden unter
Vortexen 250 µl der Paraformaldehyd haltigen Lösung Cytofix/Cytoperm zugegeben
und für 20 min bei 4 °C inkubiert. Hierbei fand eine Fixierung und gleichzeitige
Permeabilisierung der Zellen statt.
Es folgten zwei Waschschritte mit je 1 ml Saponin haltigem 1x Perm Wash Puffer bei
1200 rpm für 5 min. Der Überstand wurde jeweils verworfen.
Für die intrazelluläre Antikörperfärbung wurde das Zellpellet nach dem zweiten
Waschschritt in 50 µl 1x Perm Wash Puffer resuspendiert und 10 µl Antikörper
zugegeben. Nach einer Inkubation für 30 min bei 4 °C, wurden die Zellen einmal in 1
ml 1x Perm Wash Puffer bei 1200 rpm für 5 min gewaschen. Der Überstand wurde
verworfen. Das Zellpellet wurde in 100 µl FACS-Puffer aufgenommen und bis zur
Messung der Zellsuspension im Durchflusszytometer bei 4 °C dunkel gelagert. Eine
Auftrennung von lebenden und toten Zellen mit DAPI ist aus oben genannten Gründen
bei dieser Färbung nicht möglich.
2.2.4
Immunglobulin- ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
Mit dem Immunglobulin ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) können
sekretierte Immunglobuline in Kulturüberständen quantitativ gemessen werden. In
diesem Fall handelte es sich um einen sogenannten Sandwich-ELISA bei dem
Material und Methoden
30
zunächst Immunglobulin-spezifische Antikörper an eine Platte gekoppelt werden (Abb.
4, Schritt 1) um dann die im Überstand vorhandenen Immunglobuline zu binden (Abb.
4, Schritt 2). Enzymgekoppelte Antikörper (Enzymkonjugate) binden dann an anderer
Stelle an diese Immunglobuline (Abb. 4, Schritt 3), welche durch ein durch das Enzym
katalysierte Reaktion nachgewiesen werden (Abb. 4, Schritt 4 und 5). In der Reaktion
wird üblicherweise ein Substrat in ein farbiges Reaktionsprodukt umgewandelt. Die
Stärke dieses Signals im Vergleich mit einem ebenfalls gemessenen Standard dient
zur Quantifizierung.
Abbildung 4: Darstellung des Sandwich ELISA.
(1) Mit coating-Antikörper beschichtete Mikrotiterplatte; (2) Zugabe der Probe und Inkubation; (3) Zugabe
des Detektions-Antikörpers; (4) Zugabe und Komplexbildung des enzymgekoppelten Antikörpers, des
Antigens, des zweiten Antikörpers; (5) Zugabe eines zum Enzym passenden Substrats, das zu einem
nachweisbaren Reaktionsprodukt umgesetzt wird (Quelle: Jeffrey M. Vinocur)
Die
Immunglobulin-Bestimmung
der
Kulturüberstände
wurde
in
ELISA-
Flachbodenplatten durchgeführt. Für die Messung der Immunglobuline IgG, IgA und
IgM, wurde jeweils eine eigene Platte genommen. Die äußeren Vertiefungen wurden
nicht verwendet, da hier aufgrund von Verdunstung die größten Abweichungen in der
Konzentration zu erwarten waren. Sie wurden bei jedem Inkubationsschritt jedoch mit
PBS-Tween befüllt.
Plattenbeschichtung (Coating):
Zunächst wurde eine 2 µg/ml Gebrauchsverdünnung des Anti-IgGAM Antiserums in
Coating-Puffer hergestellt. Die Platten wurden mit je 50 µl der Gebrauchsverdünnung
pro Vertiefung beschickt, abgedeckt und über Nacht bei 4 °C, bzw. 2 h bei 37 °C
inkubiert. Die Platten wurden nach Inkubation ausgeschlagen und dreimal mit 200 µl
PBS-Tween gewaschen.
Standard-Verdünnungen:
Alle Verdünnungen wurden jedes Mal frisch in PBS-Tween angesetzt.
Nachdem der N-Protein-Standard 1:1000 vorverdünnt wurde, wurde eine erste
Weiterverdünnung (G0 = 60 ng/ml, A0 = 60 ng/ml, M0 = 300 ng/ml) angesetzt.
Material und Methoden
31
Aus G0, A0, bzw. M0 wurden dann die eigentlichen Standards durch serielle
Verdünnung hergestellt:
G1 = 15 ng/ml, A1 = 15 ng/ml, M1 = 75 ng/ml
G2 = 7.5 ng/ml, A2 = 7.5 ng/ml, M1 = 37.5 ng/ml
G3 = 3.8 ng/ml, A3 = 3.8 ng/ml, M1 = 18.8 ng/ml
G4 = 1.9 ng/ml, A4 = 1.9 ng/ml, M4 = 9.4 ng/ml
G5 = 0.9 ng/ml, A5 = 0.9 ng/ml, M5 = 4.7 ng/ml
weitere Verdünnungen:
Die Kulturüberstände und R10 als Kontrolle wurden 1:100 in PBS-Tween verdünnt.
Die Verdünnung des Enzymkonjugats erfolgte 1:300 in PBS-Tween.
Inkubation mit dem Enzym-Konjugat:
Je 50 µl der Gebrauchsverdünnungen der konjugierten Antiseren gegen IgG, IgA und
IgM wurden in die entsprechenden Platten pipettiert. Dazu wurden gemäß
Pipettierschema (Abb.5) je 100 µl der Standardverdünnungen IgG/ IgA/ IgM 1 bis 5,
100 µl der PBS-Tween Kontrolle, 100 µl der Mediumkontrolle (R10) und 100 µl der
Probenverdünnungen zugegeben. Die Inkubation erfolgte für 2 h bei Raumtemperatur.
Anschließend wurden die Platten ausgeschlagen und dreimal mit je 200 µl PBS-Tween
gewaschen.
Pipettierschema:
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
B
S1
S1
P1
P1
P7
P7
P13
P13
P19
P19
C
S2
S2
P2
P2
P8
P8
P14
P14
P20
P20
D
S3
S3
P3
P3
P9
P9
P15
P15
P21
P21
E
S4
S4
P4
P4
P10
P10
P16
P16
P22
P22
F
S5
S5
P5
P5
P11
P11
P17
P17
P23
P23
G
PBS
PBS
P6
P6
P12
P12
P18
P18
R10
R10
A
H
Abbildung 5: Pipettierschema des Sandwich-ELISA.
Jede Messung wird als Doppelmessung durchgeführt. S = Standard, P = Probe.
12
Material und Methoden
32
Entwicklung der Platten:
Je 100 µl der frisch hergestellten Substratlösung (1 Tablette/ 5 ml Enzympuffer) wurde
pro Vertiefung in die gewaschenen Platten gegeben. Die Inkubation erfolgte dunkel bei
Raumtemperatur bis die Extinktion des Standard 1 (S1) einen Wert von 1,5 erreicht
hatte. Nun wurde die Extinktion der gesamten Proben in den Platten mit Hilfe des
ELISA-Readers gemessen und ausgewertet.
2.2.5
Statistische Auswertung
Nach der Messung im Durchflusszytometer wurden die Ergebnisse mit FlowJo 7.2.2
ausgewertet.
Die Auswertung der ELISA-Messung fand mit der ELISA Ascent Software Version 2.6
statt.
Die statistische Auswertung der in den Versuchen gewonnenen Ergebnisse wurde mit
Graph Pad Prism 5 und Excel durchgeführt.
Ergebnisse
33
3
Ergebnisse
3.1
Phänotypisierung peripherer CXCR5+ T-Zellen
3.1.1
Phänotypisierung der CXCR5+ T-Zellen aus Blut und Tonsille von
immunologisch gesunden Kontrollpersonen
Follikuläre T-Helferzellen sind CXCR5+ Zellen, die im Keimzentrum B-Zellen bei
Klassenwechsel und der Differenzierung der B-Zelle zu Gedächtnis- und effektiven,
Antikörper produzierenden Plasmazellen Hilfe leisten.
Zunächst wurden phänotypische Untersuchungen an aus Tonsille isolierten T-Zellen
durchgeführt, die Tfh-Zellen aus sekundären Keimzentren enthalten. Hierdurch sollten
mit Hilfe von bereits publizierten Daten Marker identifiziert werden, um anschließend im
peripheren Blut zirkulierende CXCR5+ T-Zellen mit dem Phänotyp der eigentlichen TfhZellen vergleichen zu können.
Die Phänotypisierung wurde parallel an gesunden Kontrollen (HD, healthy donor) für
PBL (HD 1) und tonsilläre Zellen (HD 3) durchgeführt. Die Ermittlung der
Expressionshöhe von OX40, ICOS, CD200, PD-1 und IL-21R auf CXCR5+ T-Zellen
fand mittels Durchflusszytometrie statt.
CD4+ T-Zellen
OX40
ICOS
CD200
PD-1
IL-21R
13,10%
3,16%
9,92%
0,94%
0,09%
0,12%
1,32%
0,89%
0,76%
3,56%
2,7%
5,72%
8,93%
3,57%
7,06%
14,22%
15,05%
2,66%
0,48%
HD1
0,94%
Tonsille
CXCR5
Abbildung 6: Phänotypische Analyse unstimulierter CXCR5+ T-Zellen aus PBL und Tonsille.
+
Prozentuale Expression von OX40, ICOS, CD200, PD-1 und IL-21R von CXCR5 T-Zellen in der Tonsille
einer gesunden Kontrolle (HD3) im Vergleich zu PBL einer weiteren gesunden Kontrolle (HD1).
Ergebnisse
34
Die Zellen wurden zunächst aufgrund ihrer Größe und Granularität auf Lymphozyten
eingegrenzt um dann von diesen Zellen die CD3+ CD4+ Zellen für die Analyse zu
verwenden (CD4+ T-Zellen).
Betrachtet man die tonsillären Zellen, so weisen diese rund 15% CXCR5+ Zellen auf,
während die PBL durchschnittlich mit rund 7 % CXCR5 positiv sind. Von diesen
CXCR5 positiven Zellen exprimieren in PBL nur wenige die hier betrachteten Marker.
14,1 % der CXCR5- Zellen und 43,1 % der CXCR5+ Zellen exprimieren OX40, 10,5 %
und 16,2 % ICOS. Die Marker CD200, PD-1 und IL-21R sind auf den Blutlymphozyten
insgesamt kaum detektierbar.
Dies steht im Kontrast zu den tonsillären Zellen, die fast alle Marker zu einem
gewissen Teil exprimieren. Diese Expression findet vorwiegend auf CXCR5+ Zellen
statt. 14,6 % der CXCR5+ Zellen sind OX40+, mehr als 50 % ICOS+, 92 % PD-1+, 40,9
% CD200+ und 7,2 % IL-21R+. Die Expression dieser Marker fällt auf CXCR5- Zellen
eher schwach aus.
Aufgrund unserer Untersuchungen schienen OX40, ICOS und CD200 als die besten
geeigneten Oberflächenmarker zur Phänotypisierung zirkulierender CXCR5+ T-Zellen
zu sein.
Zur Untersuchung der in vitro Differenzierung von Tfh-Zellen wurden alle hier
untersuchten Marker, OX40, ICOS, CD200, PD-1 und IL-21R, ausgewählt.
3.1.2
Phänotypisierung der CXCR5+ T-Zellen in Patienten mit CVID
Aufgrund publizierter Daten über verringerte CXCR5+ T-Zellen in ICOS-defizienten
CVID Patienten, sollte untersucht werden, ob allgemein in allen CVID Patienten die
Zahl an CXCR5+ T-Zellen im Vergleich mit gesunden Kontrollen erniedrigt vorliegt und
ob sie sich von diesen phänotypisch unterscheiden. Eine erhöhte Reaktivität der
Patientenzellen und daher auch erhöhte Level an spezifischen Molekülen im
unstimulierten Zustand zum Ausgleich einer möglichen gestörten Funktion wäre
vorstellbar.
Die Phänotypisierung peripherer Blutlymphozyten (PBL) wurde an jeweils fünf CVID
Patienten
und
drei
gesunden
Kontrollen
durchgeführt.
Hierzu
Expressionslevel an OX40, ICOS und CD200 auf CXCR5
Durchflusszytometrie ermittelt.
+
wurden
die
T-Zellen mittels
Ergebnisse
35
CD4+ T-Zellen
CD45RO
OX40
29,96
ICOS
CD200
9,07
0,25%
0,04%
0,17%
0,23%
0,14%
0,29%
0,02%
0,11%
0,02%
HD 2
64,52
19,17
0,16%
0,18%
0,08%
Patient 1
CXCR5
+
Abbildung 7: Phänotypische Analyse unstimulierter CXCR5 T-Zellen aus PBL.
Prozentuale Häufigkeit der Expression von CD45RO, OX40, ICOS und CD200 eines CVID Patienten
(Patient 1) im Vergleich zur gesunden Kontrolle (HD1). Diese Ergebnisse sind repräsentativ für alle
untersuchten Patienten und gesunde Kontrollen.
100
HD
CVID
T-Zellen [%]
80
60
40
20
+
+
R
XC
C
4+
C
D
C
D
4+
C
D
45
C
R
D
O
4+
+
5+
0
+
+
+
Abbildung 8: Prozentualer Anteil der CD4 , CD4 CD45RO und CD4 CXCR5 T-Zellen der gesunden
Kontrollen im Vergleich mit dem der CVID Patienten.
In Abbildung 7 ist die Expression an CD45RO, OX40, ICOS und CD200 zwischen
einem Patient mit CVID im Vergleich mit einer gesunden Kontrolle gezeigt.
Die Abgrenzung der Populationen fand wie in 3.1.1 beschrieben statt.
Der Anteil CD45RO positiver CD4 T-Zellen fällt in Patienten mit CVID um einiges höher
aus als in den gesunden Kontrollen (Abb. 7A und 8). Die Expression von OX40, ICOS
und CD200 dagegen unterscheidet sich kaum zwischen Patient 1 und gesunder
Kontrolle. Die Werte liegen bei den CXCR5- sowie bei den CXCR5+ T-Zellen jeweils
unter 0,3 % und sind somit kaum detektierbar (Abb. 7B).
Ergebnisse
36
Abbildung 8 zeigt zusammengefasst die prozentuale Anzahl der CD4+ T-Zellen, sowie
davon die CXCR5+ und CD45RO+ Zellen in den analysierten CVID Patienten und den
gesunden Kontrollen. Es konnte bei den untersuchten CVID Patienten keine Expansion
der CXCR5+ T Zellen im peripheren Blut festgestellt werden, auch die Anzahl der CD4 +
T-Zellen liegt im Normalbereich (Abb. 8).
Der Phänotyp der untersuchten CXCR5 positiven T Zellen unterscheidet sich in den
untersuchten Markern nicht von gesunden Kontrollpersonen.
3.2
Generierung Tfh-ähnlicher Zellen
3.2.1
Durch Stimulation peripherer Blutlymphozyten mit anti-ICOS und
IL-21
In diesem Versuch sollte die Generierung follikulärer T-Helferzellen aus peripheren
Blutlymphozyten von CVID Patienten und gesunden Kontrollen untersucht werden.
Als
Differenzierungsmarker
diente
die
Expression
der
vorher
identifizierten
Oberflächenmoleküle OX40, ICOS, CD200, PD-1 und IL-21R auf CXCR5+ T-Zellen.
Um verschiedene Stimulationen der CXCR5+ T-Zellen und so eine Differenzierung in
Tfh-Zellen zu erreichen, wurden zu einem allgemein wirksamen T-Zellstimulus durch
Antikörper gegen die Korezeptormoleküle CD3 und CD28 des T-Zellrezeptors
zusätzlich mit oder ohne anti-ICOS Antikörper und IL-21 stimuliert.
Die Versuche wurden zunächst mit Zellen einer gesunden Kontrolle durchgeführt.
Nach 48 h Stimulation wurden die Zellen geerntet und die Expressionlevel an OX40,
ICOS,
CD200,
PD-1
und
IL-21R
auf
CXCR5+
CD4+
T-Zellen
wurden
durchflusszytometrisch ermittelt.
Abbildung 9 zeigt die Expressionslevel an OX40, ICOS, CD200, PD-1 und IL-21R auf
stimulierten, aus PBL gewonnenen CXCR5+ T-Zellen.
Die Zellen wurden aufgrund ihrer Größe und Granularität auf Lymphozyten
eingegrenzt. Von diesen wurden die vitalen Zellen (Dapi-) mit CD3+ CD4+ Expression
zur phänotypischen Analyse verwendet (vitale CD4+ T-Zellen).
Bei der Betrachtung fällt zunächst eine Expansion der CXCR5+ T-Zellen auf, die nach
allen Stimulationen ähnlich hoch ausfällt: von 3,5 % bei unstimulierten Zellen auf 14 16 % nach Stimulation.
Die Expression von OX40 erreicht in allen Stimulationen mit Zusatz von antiCD3/CD28 eine ähnliche Höhe und liegt um einiges höher vor als in der nicht
stimulierten Kontrolle (R10). 48 – 54 % der CXCR5- Zellen und 60 – 65 % der CXCR5+
Ergebnisse
37
Zellen exprimieren OX40, während im unstimulierten Zustand OX40 auf 2 % der
CXCR5- Zellen und 15 % der CXCR5+ Zellen exprimiert wird.
lebende CD4+
T-Zellen
OX40
ICOS
1,94%
0,05%
CD200
0,06%
PD-1
0%
0,1%
8,12%
0,96%
0,01%
IL-21R
0,08%
0,02%
0,29%
0,03%
R10
45,99%
9,75%
36,67%
40,49%
10,15%
0,53%
41,26%
8,47%
0,14%
0,48%
0,11%
0,01%
0,15%
0,05%
0,01%
0,38%
1,24%
4,76%
0,81%
CD3/CD28
0,14%
0,35%
0,97%
0,62%
CD3/CD28
+ICOS
0,09%
0,45%
0,07%
0,47%
0,1%
CD3/CD28
+ICOS
+IL-21
CXCR5
+
Abbildung 9: Phänotypische Analyse der CXCR5 T-Zellen aus PBL nach 48 h Stimulation mit R10,
CD3/CD28, CD3/CD28 + anti-ICOS und CD3/CD28 + anti-ICOS + IL-21.
+
Prozentuale Expression von OX40, ICOS, CD200, PD-1 und IL-21R von unstimulierten CXCR5 T-Zellen
+
einer gesunden Kontrolle (HD 5) im Vergleich mit CXCR5 T-Zellen nach unterschiedlicher Stimulation.
Nur bei anti-CD3/CD28 stimulierten Zellen tritt eine Expression von ICOS auf (14,39 %
der CXCR5- Zellen und 48,83 % der CXCR5+ Zellen).
Die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von OX40 und ICOS fällt auf CXCR5- T-Zellen
in allen Stimulationsansätzen ähnlich hoch aus wie auf CXCR5+ T-Zellen.
Aufgrund der nur sehr geringen Erhöhung der CD200 Expression, kann es sich sehr
gut auch nur um eine unspezifische Färbung handeln.
Das gleiche gilt für die Expression von PD-1, außer nach Stimulation mit
CD3/CD28/ICOS/IL-21. Hier kommt es zu einer geringen Expansion der PD-1+ CXCR5T-Zellen.
Ergebnisse
38
Auch bei der Färbung des IL-21R lässt sich keine eindeutige Änderung der Expression
nach den verschiedenen Stimulationen erkennen.
3.2.2
Durch Stimulation isolierter Milzzellen mit anti-ICOS und IL-21
Parallel zur Generierung von Tfh-Zellen aus PBL wurde der Versuch auch mit isolierten
Milzzellen durchgeführt. Diese sollten ebenfalls in der Lage sein follikuläre THelferzellen hervorzubringen. Aufgrund der ursprünglichen Mikroumgebung des
Keimzentrumshaltigen Gewebes sollte sich bei diesen gewebestämmigen Zellen die
Stimulation sogar effektiver auf die Differenzierung in Tfh-Zellen auswirken.
Die Milzzellen einer Person wurden unter Zusatz von anti-CD3/28, sowie zusätzlich mit
anti-ICOS und anti-ICOS mit IL-21 stimuliert. Nach 48 h fand eine Ernte der Zellen statt
und
die
Expression
von
OX40,
ICOS,
CD200,
PD-1
und
IL-21R
wurde
durchflusszytometrisch ermittelt.
Abbildung 10 zeigt die Expression an OX40, ICOS, CD200, PD-1 und IL-21R auf
stimulierten, aus der Milz gewonnenen CXCR5+ T-Zellen.
Die Eingrenzung der Zellen fand wie in 3.3.1.1 beschrieben statt.
Die Population der CXCR5+ T-Zellen steigt in allen drei Stimulationen an.
Durch die Stimulation mit anti-CD3/CD28 fand ebenfalls eine starke Erhöhung der
OX40 Expression auf CXCR5- Zellen im Vergleich zur Kontrollstimulation statt. Dabei
war es nicht ausschlaggebend ob zuzüglich zu anti-CD3/CD28 noch anti-ICOS oder IL21 dazu gegeben wurden. Mit durchschnittlich 83 % der CXCR5- Zellen und 94 % der
CXCR5+ Zellen war die Population der OX40 exprimierenden Zellen sehr viel größer
als nach Stimulation mit R10.
Nach anti-CD3/CD28 Stimulation ergeben sich mit 33,5 % der CXCR5- Zellen und 66,8
% der CXCR5+ Zellen die meisten ICOS exprimierenden Zellen. Der Zusatz von antiICOS zur Stimulation erlaubte keine Messung der ICOS Expression.
CD200 wird in allen Stimulationen ähnlich stark auf rund 90 % der CXCR5- Zellen
exprimiert. In der Population der CXCR5+ Zellen kommt es jedoch nach Stimulation mit
anti-CD3/CD28 zu einer Expansion der CD200 exprimierenden Zellen von 72,7 % auf
96,4 %, welches jedoch auf die Expansion aller CXCR5+ Zellen zurück zu führen sein
könnte.
Die PD-1 und IL-21R Expression ändert sich nach Stimulation nur geringfügig und
muss aufgrund der Größenzunahme der Zellen nicht sicher ein Ausdruck von
Expressionsteigerung sein. Möglicherweise handelt es sich um Detektionsproblem.
Ergebnisse
39
lebende CD4+
T-Zellen
OX40
ICOS
CD200
PD-1
20,45%
1,73%
4,39%
1,18%
69,57%
6,17%
66,93%
18,7%
26,94%
13,09%
69,84%
20,87%
68,78%
17,39%
7,59%
2,94%
69,95%
23,4%
67,53%
16,49%
13,37%
6,37%
71,16%
21,64%
IL-21R
49,69%
5,95%
25,07%
1,61%
R10
66,50%
16,71%
46,46%
10,29%
66,22%
19,29%
38,64%
9,54%
65,64%
15,77%
48,36%
11,01%
CD3/CD28
CD3/CD28
+ ICOS
CD3/CD28 +
ICOS + IL-21
CXCR5
+
Abbildung 10: Phänotypische Analyse von CXCR5 T-Zellen der Milz nach 48 h Stimulation mit R10,
CD3/CD28, CD3/CD28 + anti-ICOS und CD3/CD28 + anti-ICOS + IL-21.
Vergleich der prozentualen Expression an OX40, ICOS, CD200, PD-1 und IL-21R von unstimulierten mit
+
unterschiedlich stimulierten, aus der Milz isolierten CXCR5 T-Zellen einer gesunden Kontrolle (HD 3).
3.2.3
Durch Stimulation peripherer Blutlymphozyten mit IL-6
Der Zusatz von anti-ICOS und IL-21 führte nicht zur Hochregulierung der Expression
aller untersuchter Tfh-Marker. Nach zusätzlicher Recherche wurde IL-6 als weiterer
potenzieller Tfh-Zelldifferenzierungsfaktor identifiziert.
Frisch isolierte PBL einer gesunden Kontrolle wurden mit anti-CD3/CD28 mit Zusatz
von IL-6 stimuliert und nach 48h geerntet. Die Expression von OX40, CD200, PD-1 und
IL-21R wurde mittels Durchflusszytometrie ermittelt.
Ergebnisse
40
OX40
CD200
3,55%
0,28%
42,35%
16,31%
PD-1
0,11%
0,01%
IL-21R
0,04%
0,01%
0,71%
0,03%
R10
9,57%
4,18%
0,74%
0,71%
1,82%
1,00%
CD3/CD28
+ IL-6
CXCR5
+
Abbildung 11: Phänotypische Analyse von CXCR5 T-Zellen aus PBL nach 48 h Stimulation mit R10 und
CD3/CD28 + IL-6.
Vergleich der prozentualen Expression von OX40, CD200, PD-1 und IL-21R von unstimulierten mit
+
unterschiedlich stimulierten CXCR5 T-Zellen einer gesunden Kontrolle (HD 6).
Abbildung 11 zeigt die Expression von OX40, CD200, PD-1 und IL-21R auf aus PBL
gewonnenen CXCR5+ und CXCR5- Zellen. Die Zellen wurden 48 h mit anti-CD3/CD28
stimuliert und mit einer Kontrollstimulation (R10) verglichen.
Die Eingrenzung der Zellen fand wie in 3.3.1.1 beschrieben statt.
CXCR5 wird nach Stimulation vermehrt exprimiert (von 0,95 % auf 24,36 % der CD4+
T-Zellen).
Die Expressionssteigerung von OX40, die bereits in Abbildung 9 nach anti-CD3/CD28
auftritt, ist auch hier nach anti-CD3/CD28 zuzüglich IL-6 Stimulation zu erkennen.
OX40 wird von 56 % der CXCR5- Zellen und von 67 % der CXCR5+ Zellen exprimiert.
Die Anzahl der CD200 exprimierenden Zellen steigt nach anti-CD3/CD28 zuzüglich IL6 Stimulation in der CXCR5- Zellpopulation (1 % auf 12,3 %), sowie auch in der
CXCR5+ Zellpopulation (0,94 % auf 18,8 %) an, während die Expression von PD-1 und
IL-21R nach anti-CD3/CD28 zuzüglich IL-6 Stimulation nicht messbar ansteigt. Dies
spiegelt sich auch in der Betrachtung der MFI von PD-1 und IL-21R wieder, welche
nach Stimulation kaum verändert vorliegt (Daten nicht gezeigt).
Die MFI von OX40 und CD200 steigt nach Stimulation stark an und liegt vor sowie
nach Stimulation bei CXCR5- T-Zellen etwas niedriger als bei CXCR5+ T-Zellen.
3.2.4
Durch Stimulation peripherer Blutlymphozyten mit IL-12
Auch der Zusatz von IL-6 führte nicht wesentlich zu einer Expressionssteigerung der
Tfh-spezifischen Moleküle PD-1 und IL-21R auf CXCR5+ T-Zellen. Zwei gleichzeitig
relativ neu erschienenen Publikationen zeigten, dass humane CD4+ T-Zellen durch
Zusatz von IL-12 zur Produktion von IL-21 angeregt werden konnten, während IL-6
Ergebnisse
41
keinen Einfluss auf die IL-21 Produktion im humanen System ausübte (Schmitt et al.
2009 und Ma et al. 2009). Somit wurde nun IL-12 als Stimulationszusatz in einem
weiteren Versuch verwendet um die Differenzierung der T-Zellen in Richtung Tfh-Zelle
zu leiten.
Frisch isolierte PBL einer gesunden Kontrolle wurden mit anti-CD3/CD28 und IL-12
stimuliert und nach 48 h geerntet. Die Expression von OX40, ICOS, CD200, PD-1 und
IL-21R wurde mittels Durchflusszytometrie ermittelt.
Zusätzlich fand eine Messung der IL-21 Produktion statt. Dies wurde an PBL sowie an
isolierten CD4+ T-Zellen einer gesunden Kontrolle gemäß des in der Publikation von
Schmitt et al. beschriebenen Versuchsaufbaus durchgeführt. Die Zellen wurden 48 h
mit anti-CD3/CD28 unter Zusatz von IL-12 stimuliert. Zusätzlich fand eine
Restimulation mit PMA (Phorbol Myristat Acetat) und Ionomycin für 6 h statt. Die
letzten 4 h unter Zusatz von BFA (Brefeldin A) zur Hemmung der Zytokinsekretion.
Die
Menge
an
produziertem
IL-21
wurde
mittels
intrazellulärer
durchflusszytometrischer Färbung ermittelt.
OX40
ICOS
CD200
0,67%
0,06%
0,21%
0,01%
55,89%
8,3%
25,13%
4,89%
58,99%
7,36%
29,17%
4,12%
PD-1
1,11%
0,06%
IL-21R
0,21%
0,02%
1,4%
0,04%
R10
17,11%
2,17%
3,51%
1,22%
6,28%
1,77%
0,65%
20,19%
1,23%
CD3/
CD28
18,94%
2,82%
3,51%
CD3/CD28
+ IL-12
CXCR5
+
Abbildung 12: Phänotypische Analyse der CXCR5 T-Zellen nach 48 h Stimulation von PBL mit R10,
CD3/CD28 und CD3/CD28 + IL-12.
Vergleich der prozentualen Expression von OX40, ICOS, CD200, PD-1 und IL-21R von unstimulierten mit
+
unterschiedlich stimulierten CXCR5 T-Zellen einer gesunden Kontrolle (HD 7).
In Abbildung 12 wird die Expression der Oberflächenmoleküle OX40, ICOS, CD200,
PD-1 und IL-21R auf CXCR5- und CXCR5+ T-Zellen einer gesunden Kontrolle nach
unterschiedlicher Stimulation verglichen.
Das Gating der Zellen fand wie in 3.3.1.1 beschrieben statt.
Ergebnisse
42
Die Expression von CXCR5 liegt wie bereits in Abbildung 9 und 10 zu sehen auch nach
dieser Stimulation erhöht vor.
Die OX40 sowie die ICOS Expression unterscheiden sich zwischen anti-CD3/CD28
und anti-CD3/CD28 zuzüglich IL-12 kaum. Die erwartete Expressionserhöhung im
Vergleich zur Kontrollstimulation, die bereits in Abbildung 9 und teilweise in Abbildung
11 erkennbar war, ist auch hier eingetroffen.
Ein wesentlicher Unterschied der PD-1 Expression nach anti-CD3/CD28 zuzüglich IL12 Stimulation im Vergleich zu den beiden anderen Stimulationen ist nicht erkennbar.
Nach anti-CD3/CD28 Stimulation mit oder ohne IL-12 steigt die Expression von CD200
deutlich auf CXCR5+ sowie auch auf CXCR5- T-Zellen an, wobei die Expression auf
CXCR5- Zellen stärker ausfällt.
Die IL-21R exprimierende Population steigt nach anti-CD3/CD28 Stimulation auf 6,28
% auf CXCR5- und 1,23 % auf CXCR5+ Zellen an. Eine zusätzliche Steigerung wird
nach zusätzlicher Stimulation mit IL-12 erreicht, auf 20,19 % auf CXCR5- und 3,51 %
auf CXCR5+ Zellen.
Allerdings findet hier, wie auch in der Expression von CD200 zu sehen, eine
Verschiebung der gesamten Zellwolke statt, welches möglicherweise Ausdruck einer
unspezifischen Erhöhung der Markerexpression sein könnte und nicht als positiver
Effekt des IL-12 gewertet werden kann.
IL-21
R10
CD3/CD28
19,12%
0,7%
CD3/CD28 +
IL-12
16,91%
CXCR5
+
Abbildung 13: Phänotypische Analyse der CXCR5 T-Zellen nach 48 h Stimulation von PBL mit R10,
CD3/CD28 und CD3/CD28 + IL-12.
Vergleich der prozentualen, intrazellulären IL-21 Expression von unstimulierten mit unterschiedlich
+
stimulierten CXCR5 T-Zellen einer gesunden Kontrolle (HD 7).
Abbildung 13 zeigt ebenfalls aus PBL gewonnene CXCR5- und CXCR5+ T-Zellen, die
48 h mit anti-CD3/CD28, bzw. anti-CD3/CD28 zuzüglich IL-12 stimuliert wurden. Die
Zellen wurden auf ihre intrazelluläre Expression des Zytokins IL-21 getestet.
Die Eingrenzung der Zellen fand wie in 3.1 beschrieben statt.
Man kann eine deutliche Expressionssteigerung des Zytokins nach anti-CD3/CD28
Stimulation (19,12 %) im Vergleich zur Kontrollstimulation (1,7 %) erkennen. Durch den
Ergebnisse
43
Zusatz von IL-12 zuzüglich zu anti-CD3/CD28 konnte keine weitere Steigerung der IL21 produzierenden Zellen erreicht werden. Bei den IL-21+ Zellen handelt es sich fast
ausschließlich nur um CXCR5- Zellen.
CD4+ TZellen
IL-21
R10
CD3/CD28
0,9%
CD3/CD28
+IL-21
1,58%
2,99%
CXCR5
+
+
Abbildung 14: Phänotypische Analyse der CXCR5 T-Zellen von isolierten CD4 T-Zellen nach 48 h
Stimulation mit R10, CD3/CD28 und CD3/CD28 + IL-12.
Vergleich der prozentualen, intrazellulären IL-21 Expression von unstimulierten mit unterschiedlich
+
stimulierten CXCR5 T-Zellen einer gesunden Kontrolle (HD 8).
Da im Ansatz mit PBL aufgrund der anwesenden Monozyten eine endogene IL-12
Produktion vorhanden ist, wurde der Versuch noch einmal mit isolierten CD4+ T-Zellen
wiederholt. Auf Abbildung 14 ist die IL-21 Expression auf CXCR5- und CXCR5+ TZellen, die aus isolierten CD4+ T-Zellen stammen, dargestellt.
Nach entsprechender Kontrolle der Reinheit der CD4 T-Zellpopulation, fällt auf, dass
bereits unstimulierte Zellen IL-21 produzieren.
Auch kann man hier eine Expressionssteigerung des Interleukin 21 nach antiCD3/CD28 Stimulation im Vergleich zur Kontrollstimulation erkennen (0,9 % zu 1, 58
%). Der Zusatz von IL-12 zusätzlich zum anti-CD3/CD28 führt zu einer weiteren
Steigerung der IL-21 Expression auf 2,99 %. Die Expression des Zytokins findet
wiederum hauptsächlich auf CXCR5- Zellen statt. Allerdings sind CXCR5+ Zellen in
diesem Ansatz nur schwer abzugrenzen.
Ergebnisse
3.3
44
Analyse der Zytokinproduktion durch Th2-Zellen in Patienten
mit CVID
In den bisherigen Versuchen fiel die starke IL-21 Produktion durch CD45RO positive TZellen nach anti-CD3/CD28 Stimulation auf.
Deshalb wurde die Analyse der IL-21 und IL-10 Produktion an einer größeren Zahl von
CVID Patienten (n = 26) und gesunden Kontrollen (n = 24) durchgeführt. Die Patienten
wurden der Freiburg-Klassifizierung gemäß eingeteilt, wobei sich 9 CVID Ia Patienten,
10 CVID Ib Patienten und 7 CVID 2 Patienten ergaben.
Frisch isolierte PBL wurden 48 h mit R10 und anti-CD3/CD28 stimuliert. Anschließend
fand eine Restimulation mit PMA (Phorbol Myristat Acetat) und Ionomycin für 6 h statt.
Die letzten 4 h unter Zusatz von BFA (Brefeldin A) zur Hemmung der
Interleukinsekretion. Die Sekretion an IL-21 und IL-10 durch CD4+ T-Zellen wurde
mittels intrazellulärer durchflusszytometrischer Färbung ermittelt. Die Restimulation mit
PMA hat eine verringerte Expression des CD4 Moleküls zur Folge, woraufhin die
Trennung der CD4+ T-Zellen nur sehr ungenau möglich war. Daher wurden die Zellen
auf CD8 gefärbt und die CD8- T-Zellen zur Analyse verwendet.
A
B
C
D
Abbildung 15: Mikroskopische Ansicht der Lymphozyten- Zellkultur nach 48 h Stimulation.
Zellen einer gesunden Kontrolle (HD9) nach 48 h Stimulation A: mit R10, B: mit CD3/CD28; Zellen eines
Patienten (Patient 2) nach 48 h Stimulation C: mit R10, D: mit anti-CD3/CD28.
In diesem Versuch war der Vergleich von stimulierten mit unstimulierten Zellen von
Interesse. Abbildung 15 zeigt eine mikroskopische Aufnahme von Zellen, die 48 h mit
anti-CD3/CD28 (Abb. 15 B/D), bzw. kontrollstimuliert wurden (Abb. 15 A/C). Man kann
erkennen, dass anti-CD3/CD28 stimulierte Zellen deutlich größere Kolonien bilden und
somit eine starke Proliferation zeigen.
Beim Vergleich von Zellen von CVID Patienten (Abb. 15 C und D) mit Zellen einer
gesunden Kontrolle (Abb. 15 A und B) fallen keine großen Unterschiede auf. Auch die
aus Patientenblut gewonnenen Zellen zeigen eine starke Koloniebildung nach antiCD3/CD28 Stimulation als Zeichen der Proliferation.
Ergebnisse
45
A
CD8- T-Zellen
B
CD8- T-Zellen
Abbildung 16: Eingrenzung der zu analysierenden Zellen nach durchflusszytometrischer Messung.
+
Die Zellen wurden nach Auswahl der Lymphozyten auf CD3 eingegrenzt und von diesen Zellen die CD8
-
zur Analyse weiter betrachtet; A: nach 48 h R10 Stimulation, B: nach 48 h CD3/CD28 Stimulation.
Auf Abbildung 16 ist die Eingrenzung der Zellen zur Analyse nach Aufnahme im
Durchflusszytometer dargestellt. Abb. 16 A zeigt kontrollstimulierte Zellen, Abb. 16 B
zeigt Zellen, die mit anti-CD3/CD28 stimuliert wurden. Die Eingrenzung fand in beiden
Fällen nach dem gleichen Muster statt. Zunächst wurden aufgrund der Größe und
Granularität die Lymphozyten zur Analyse ausgewählt. Von diesen wurden dann die
CD3+ CD8- Zellen näher betrachtet.
Die anti-CD3/CD28 stimulierten Zellen zeigen eine starke Proliferation, die sich durch
Größenzunahme der Zellen äußert (Abb. 16 B).
In Abbildung 17 ist der Vergleich der IL-21 Produktion durch Zellen einer gesunden
Kontrolle (HD 9) mit Zellen eines CVID Patienten (Patient 2), die in gleicher Art
stimuliert wurden, von Interesse.
In beiden Fällen tritt eine Steigerung der IL-21 Sekretion nach anti-CD3/CD28
Stimulation ein. Im Fall dieser gesunden Kontrolle von 0,28 % auf 26,97 %, im Falle
dieses Patienten von 2,6 % auf 35,64 %.
Ergebnisse
46
IL-21
HD 9
Patient 2
0,28%
2,6%
R10
HD 9
Patient 2
26,97%
35,64%
CD3/CD28
CD45RO
Abbildung 17: Analyse der IL-21 Sekretion in PBL nach R10 und CD3/CD28 Stimulation.
-
Prozentuale intrazelluläre Expression von IL-21 in unstimulierten und mit CD3/CD28 stimulierten CD8 TZellen eines Patienten mit CVID (Patient 2) im Vergleich mit einer gesunden Kontrolle (HD 9).
A
B
CD3/CD28
R10
n. s.
p = 0,015
80
IL-21 + CD8- T-Zellen [%]
10
5
0
60
40
20
+
VI
D
C
D
C
H
D
VI
D
0
H
IL-21 + CD8 - T-Zellen [%]
15
-
Abbildung 18: Prozentsatz der IL-21 CD8 T-Zellen in der Gruppe der CVID Patienten im Vergleich zur
Kontrollgruppe (HD).
A: nach Kontrollstimulation, B: nach 48 h anti-CD3/CD28 Stimulation. (n.s.: nicht signifikant; p: engl. value,
Signifikanz).
Abbildung 18 vergleicht die Werte der IL-21 Sekretion der Gesamtkohorte der CVID
Patienten und der gesunden Kontrollen.
Abbildung 18 A zeigt den prozentualen Anteil an IL-21+ CD8- T-Zellen nach
Kontrollstimulation. Patienten mit CVID zeigen einen Mittelwert von 2,5 %. Drei
Personen fallen mit Werten von 10 – 15 % stark heraus. Die gesunden Kontrollen
weisen durchschnittlich 1,5 % IL-21+ CD8- T-Zellen auf. Auch hier fallen zwei Personen
mit 6 % und 12 % IL-21 sekretierenden Zellen aus der Verteilung heraus. Obwohl die
durchschnittliche IL-21 Sekretion von Patienten mit CVID höher ausfällt als die der
gesunden Kontrollen, ist diese Erhöhung nicht signifikant.
Ergebnisse
47
Im Gegensatz dazu ist die Menge an IL-21 produzierenden Zellen nach anti-CD3/CD28
Stimulation in Patienten mit CVID signifikant erhöht (p = 0,015) (Abb. 18 B). Sie liegt
mit einem Mittelwert von 35 % um 7 % höher als die der gesunden Kontrollen.
A
B
CD3/CD28
R10
p = 0,003
80
IL-21 + CD8 - T-Zellen [%]
10
5
p = 0,003
60
40
20
2
VI
D
C
C
VI
D
Ib
Ia
VI
D
C
2
VI
D
C
VI
D
C
VI
D
C
Ib
Ia
D
H
+
D
0
0
H
IL-21 + CD8- T-Zellen [%]
15
-
Abbildung 19: Prozentsatz der IL-21 CD8 T-Zellen in den verschiedenen CVID Klassen Ia, Ib und 2 im
Vergleich zur Kontrollgruppe (HD)
A: nach Kontrollstimulation, B: nach 48 h anti-CD3/CD28 Stimulation. (p: engl. value, Signifikanz).
Abbildung 19 zeigt die IL-21 Sekretion der CVID Patienten in die einzelnen Klassen
CVID Ia, Ib und 2 unterteilt. Nach Kontrollstimulation mit R10 fällt auf, dass die CVID Ia
Patienten einen signifikant höheren Mitttelwert von 5,7 % IL-21 produzierender Zellen
im Vergleich zu den anderen Gruppen aufweisen (p = 0,003). Jedoch fällt die
Standardabweichung in diesem Fall mit 4,8 % relativ hoch aus, welches auf starke
Schwankungen innerhalb der Gruppe hinweist.
Die Klassen CVID Ib und 2 liegen mit Mittelwerten von 1,09 % und 1,6 % im Bereich
der gesunden Kontrollen (1,35 %).
Nach anti-CD3/CD28 Stimulation zeigt die Klasse der CVID Ib Patienten mit
durchschnittlich rund 30 % eine ähnliche IL-21 Sekretion wie die gesunden Kontrollen
(Mittelwert 27 %). Die Sekretion der CVID 2 Patientengruppe ist mit 35 % leicht, jedoch
nicht signifikant erhöht, während die der CVID Ia Patienten mit einem Mittelwert von
fast 40 % eine signifikante Erhöhung (p = 0,003) zur Gruppe der gesunden Kontrollen
aufweist.
Abbildung 20 zeigt die Interleukin-10 Sekretion durch CD45RO+ CD8- T- Zellen nach
anti-CD3/CD28, bzw. nach Kontrollstimulation eines CVID Patienten (Patient 2) im
Vergleich mit einer gesunden Kontrolle (HD 9).
Man kann deutlich die Steigerung der IL-10 Produktion nach anti-CD3/CD28
Stimulation erkennen.
Ergebnisse
48
IL-10
HD 9
Patient 2
0,34%
0,43%
R10
HD 9
Patient 2
2,85%
5,33%
CD3/CD28
CD45RO
Abbildung 20: Analyse der IL-10 Sekretion in PBL nach R10 und CD3/CD28 Stimulation.
-
Prozentuale intrazelluläre Expression von IL-10 in unstimulierten und mit CD3/CD28 stimulierten CD8 TZellen eines Patienten mit CVID (Patient 2) im Vergleich mit einer gesunden Kontrolle (HD 9).
A
B
R10
n. s.
8
IL-10+ CD8- T-Zellen [%]
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
6
4
2
C
+
C
VI
D
VI
D
D
H
D
0
0.0
H
IL-10+ CD8- T-Zellen [%]
CD3/CD28
p = 0,013
-
Abbildung 21: Prozentsatz der IL-10 CD8 T-Zellen in der Gruppe der CVID Patienten im Vergleich zur
Kontrollgruppe (HD).
A: nach Kontrollstimulation, B: nach 48 h anti-CD3/CD28 Stimulation.(n.s.: nicht signifikant; p: engl. value,
Signifikanz).
Abbildung 21 zeigt den Prozentsatz der IL-10+ CD8- T-Zellen in der Gesamtkohorte der
CVID Patienten im Vergleich mit allen gesunden Kontrollen.
In Abbildung 21 A werden die Werte nach R10 Kontrollstimulation verglichen, wobei
eine signifikant höhere IL-10 Sekretion (p = 0,013) in der Gruppe der CVID Patienten
auffällt. Diese liegt aufgrund großer Streuung durchschnittlich bei 0,7 %, obwohl Werte
bis zu 1,7 % auftreten. Die Werte der gesunden Kontrollen liegen durchschnittlich bei
0,4 %, nur eine Person fällt mit fast 2,5 % IL-10+ T-Zellen aus der Verteilung heraus.
Nach anti-CD3/CD28 Stimulation liegt der Prozentsatz an IL-10+ CD8- T-Zellen in
beiden Gruppen gleich hoch (Mittelwert HD: 4,2 %, CVID: 3,86 %). In beiden Kohorten
kommt es zu einer starken Streuung der Werte von rund 1 % bis etwa 7 %.
Ergebnisse
49
A
B
CD3/CD28
R10
p = 0,015
8
IL-10+ CD8- T-Zellen [%]
2.0
1.5
1.0
0.5
6
4
2
2
C
VI
D
Ib
VI
D
C
C
VI
D
D
2
C
C
VI
D
VI
D
Ib
Ia
C
VI
D
D
H
+
Ia
0
0.0
H
IL-10+ CD8- T-Zellen [%]
2.5
-
Abbildung 22: Prozentsatz der IL-10 CD8 T-Zellen in den verschiedenen CVID Klassen Ia, Ib und 2 im
Vergleich zur Kontrollgruppe (HD).
A: nach Kontrollstimulation, B: nach 48 h anti-CD3/CD28 Stimulation.(p: engl. value, Signifikanz).
Ein Vergleich der Prozentzahl an IL-10+ CD8- T-Zellen der einzelnen CVID Klassen Ia,
Ib und 2 mit der Kohorte der gesunden Kontrollen ist in Abbildung 22 dargestellt.
Nach R10 Kontrollstimulation fallen die Durchschnittswerte der CVID Klassen alle
etwas höher aus als der Wert der gesunden Kontrollgruppe, wobei die Gruppe der
CVID Ia Patienten mit einem Mittelwert von 0,9 % die höchste IL-10 Sekretion aufweist
(Abb. 22 A). Diese zeigt im Vergleich mit der Kontrollgruppe einen Signifikanzwert von
p = 0,015, während die Gruppen CVID Ib und 2 keine signifikante Erhöhung zur
Kontrollgruppe aufzeigen. Insgesamt fallen in den Klassen der CVID Patienten starke
Streuungen der Werte von 0,2 % bis 1,7 % auf. Die gesunde Kontrollgruppe weist bis
auf einen Wert nur geringe Abweichungen auf. Dies spricht für eine große
Heterogenität der IL-10 Sekretion in der Gruppe der CVID Patienten.
Nach anti-CD3/CD28 Stimulation unterscheidet sich die IL-10 Sekretion der
verschiedenen Gruppen nicht signifikant von einander (4,2 %, 4,5 % und 4,1 %) (Abb.
22 B).
Abbildung 23 zeigt eine Korrelationsanalyse zwischen dem Anteil der CD45RO
positiven T-Zellen im Blut der CVID Patienten mit dem der IL-21+ bzw. IL-10+ T-Zellen
nach anti-CD3/CD28 Stimulation. Betrachtet man die Ausgleichsgerade zeigen sich
teilweise Tendenzen zur Korrelation, allerdings lag diese in keiner der drei Gruppen
vor.
Ergebnisse
50
B
20
10
CD45RO + T-Ze lle n [%]
10
0
0
0
10
0
80
60
40
20
0
30
80
20
IL-21
IL-10
40
60
40
50
20
IL-21
IL-10
CVID Ib
IL-21 + /IL-10 + CD8 - T-Zellen [%]
60
0
IL-21 + /IL-10 + CD8 - T-Zellen [%]
CVID Ia
40
A
CD45RO + T-Ze lle n [%]
C
IL-21
IL-10
60
40
20
10
0
80
60
40
20
0
0
IL-21 + / IL-10 + CD8 - T-Zellen [%]
CVID 2
80
CD45RO + T-Ze lle n [%]
-
Abbildung 23: Analyse der Korrelation zwischen IL-21 bzw. IL-10 Expression auf CD8 T-Zellen und der
CD45RO Expression.
A: in der Gruppe der CVID Ia Patienten, B: in der Gruppe der CVID Ib Patienten, C: in der Gruppe der
CVID 2 Patienten.
3.4
Die Population der Th1- und Th17-Zellen in Patienten mit
CVID
Nachdem die Population der T-Helferzellen der humoralen Immunantwort in Patienten
mit CVID auf ihre Zytokinproduktion hin analysiert wurden, sollten nun auch die
Populationen der Th1 und Th17 Zellen auf ihrer Zytokinsekretion hin untersucht
werden.
Th1-Zellen produzieren hauptsächlich Interferon (IFN) γ, welches Einfluss auf die
zelluläre Immunantwort ausübt. In CVID Patienten wurde bereits eine erhöhte IFNγ
Produktion durch CD4+ und CD8+ T-Zellen beschrieben (North et al., 1996) und spricht
für eine übermäßige Th1-Immunantwort in diesen Patienten. Allerdings gab es hierzu
noch keine Untersuchungen zur Korrelation mit der neuen Klassifizierung, welches in
dieser Studie überprüft werden sollte.
Hierfür wurde die Interleukin-17 und IFN γ Produktion durch periphere Blutlymphozyten
von 26 CVID Patienten mit der von 24 gesunden Kontrollen verglichen. Die Patienten
wurden der Freiburg-Klassifizierung gemäß eingeteilt, wobei sich 9 CVID Ia Patienten,
10 CVID Ib Patienten und 7 CVID 2 Patienten ergaben.
Ergebnisse
51
Der Versuch wurde wie in 3.4 beschrieben durchgeführt und die Eingrenzung der zur
Analyse verwendeten Zellen fand gemäß Abbildung 16 statt.
IL-17
HD 10
0,41%
Patient 3
0,12%
1,22%
0,53%
R10
8,94%
HD 10
0,89%
15,98%
Patient 3
0,85%
1,58%
0,74%
CD3/CD28
31,97%
20,82%
IFNγ
Abbildung 24: Analyse der IL-17 und IFNγ Sekretion in PBL nach R10 und CD3/CD28 Stimulation.
Prozentuale intrazelluläre Expression von IL-17 und IFNγ in unstimulierten und mit CD3/CD28 stimulierten
-
CD8 T-Zellen eines Patienten mit CVID (Patient 3) im Vergleich mit einer gesunden Kontrolle (HD 10).
Die Produktion von IL-17 und IFNγ durch CD8- T-Zellen nach anti-CD3/CD28 bzw.
Kontrollstimulation ist in Abbildung 24 dargestellt. Zusätzlich wird zwischen der
Zytokinsekretion eines CVID Patienten (Patient 3) und einer gesunden Kontrolle
(HD10) verglichen. In der Darstellung werden drei verschiedene T-Zellpopulationen
voneinander unterschieden: Zellen, die IL-17 oder IFNγ oder IL-17 und IFNγ
sekretieren.
Die Population der IL-17 und IL-17 und IFNγ doppelt sekretierenden Zellen steigt nach
Aktivierung der Zellen mit anti-CD3/CD28 leicht an. Die Steigerung im Fall der IFNγ
sekretierenen Zellen fällt um einiges höher aus.
Abbildung 25 zeigt den Prozentsatz der IL-17+ CD8- T-Zellen der Gesamtkohorte der
CVID Patienten im Vergleich mit der Kontrollgruppe (HD). Es wird zusätzlich zwischen
den ermittelten IL-17+ CD8- T-Zellen nach Kontrollstimulation (Abb. 25A) und den IL17+ CD8- T-Zellen nach anti-CD3/CD28 Stimulation (Abb. 25B) verglichen.
Nach Kontrollstimulation liegen die Werte der gesunden Kontrollen durchschnittlich bei
0,75 %, die der CVID Patienten mit 0,86 % nur leicht und somit nicht signifikant höher.
Nach anti-CD3/CD28 Stimulation weisen CVID Patienten einen Mittelwert von 1,22 %,
die Kontrollgruppe einen Mittelwert von 1,33 % IL-17 sekretierender T-Zellen auf. Auch
hier ergibt sich kein signifikanter Unterschied.
Ergebnisse
52
A
B
R10
n. s.
n. s.
6
IL-17+ CD8- T-Zellen [%]
4
3
2
1
4
2
0
D
C
H
C
H
VI
D
D
0
VI
D
IL-17 + CD8 - T-Zellen [%]
CD3/CD28
+
-
Abbildung 25: Prozentsatz der IL-17 CD8 T-Zellen in der Gruppe der CVID Patienten im Vergleich zur
Kontrollgruppe (HD).
A: nach Kontrollstimulation, B: nach 48 h anti-CD3/CD28 Stimulation.(n.s.: nicht signifikant).
B
A
R10
CD3/CD28
6
IL-17 + CD8 - T-Zellen [%]
3
2
1
0
4
2
+
2
VI
D
C
VI
D
C
C
C
Ib
Ia
D
VI
VI
D
D
2
Ib
D
VI
C
C
VI
D
H
D
Ia
0
H
IL-17+ CD8- T-Zellen [%]
4
-
Abbildung 26: Prozentsatz der IL-17 CD8 T-Zellen in den verschiedenen CVID Klassen Ia, Ib und 2 im
Vergleich zur Kontrollgruppe.
A: nach Kontrollstimulation, B: nach 48 h anti-CD3/CD28 Stimulation.
Bei Betrachtung der Prozentwerte der IL-17+ CD8- T-Zellen der CVID Patientengruppe
nach Unterteilung in die einzelnen Klassen in Abbildung 25 liegen die Mittelwerte der
IL-17+ CD8- T-Zellen nach Stimulation mit R10 in allen Gruppen in einem ähnlichen
Bereich, wobei die Gruppe der CVID 2 Patienten mit 1,02 % die höchste
durchschnittliche IL-17 Sekretion aufweist. Es ergeben sich keine signifikanten
Unterschiede zwischen den Gruppen der CVID Patienten und der Kontrollgruppe (Abb.
26A).
Auch nach anti-CD3/CD28 Stimulation fallen die Ergebnisse ähnlich aus. Die Gruppe
der CVID Ia Patienten weist mit einem Mittelwert von 0,85 % die niedrigste IL-17
Sekretion auf, die der anderen Gruppen liegt mit einem Mittelwert von 1,32 % in der
Kontrollgruppe, mit 1,4 % in der Gruppe der CVID Ib Patienten und mit 1,27 % in der
Gruppe der CVID 2 Patienten auf einem ähnlichen Level (Abb. 26B).
Es ergeben sich keine signifikanten Unterschiede.
Ergebnisse
53
A
B
CD3/CD28
R10
p = 0,004
p = 0,01
80
IFN + CD8 - T-Zellen [%]
30
20
10
0
60
40
20
D
H
+
C
C
H
D
VI
D
0
VI
D
IFN + CD8- T-Zellen [%]
40
-
Abbildung 27: Prozentsatz der IFNγ CD8 T-Zellen in der Gruppe der CVID Patienten im Vergleich zur
Kontrollgruppe.
A: nach Kontrollstimulation, B: nach 48 h anti-CD3/CD28 Stimulation.(p: engl. value, Signifikanz).
A
B
CD3/CD28
R10
p = 0,005
80
p = 0,005
IFN + CD8- T-Zellen [%]
30
20
10
60
40
20
2
VI
D
C
Ib
VI
D
C
C
VI
D
D
2
C
C
VI
D
VI
D
Ib
Ia
C
VI
D
D
H
+
Ia
0
0
H
IFN + CD8- T-Zellen [%]
40
-
Abbildung 28: Prozentsatz der IFNγ CD8 T-Zellen in den verschiedenen CVID Klassen Ia, Ib und 2 im
Vergleich zur Kontrollgruppe (HD).
A: nach Kontrollstimulation, B: nach 48 h anti-CD3/CD28 Stimulation.(p: engl. value, Signifikanz).
In Abbildung 27 sind die Prozentwerte der IFNγ+ CD8- T-Zellen der gesamten
Kontrollgruppe (HD) mit den Werten der Gesamtkohorte der CVID Patienten
zusammen dargestellt. Abbildung 27A und 27B lassen einen Vergleich der Werte
unstimuliert vor Aktivierung (R10) mit den Werten nach anti-CD3/CD28 Stimulation zu.
Bei Betrachtung der Werte nach Kontrollstimulation fällt eine starke Streuung der
Werte der CVID Gruppe von 2,23 % bis 32 % auf. Die Standardabweichung liegt mit
9,25 % bei einem Durchschnittswert von 16,06 % sehr hoch. Trotz dessen weist die
Gruppe der CVID Patienten einen signifikant höheren Mittelwert (16,06 %) auf als die
Kontrollgruppe (9,29 %), (p = 0,004).
Auch nach anti-CD3/CD28 Stimulation liegt der Mittelwert der CVID Patienten mit
39,09 % höher als der der Kontrollgruppe mit 30,38 %. Dieser Unterschied weist
ebenfalls noch eine Signifikanz auf (p =0,01).
Ergebnisse
Nach
54
Unterteilung
der
Prozentwerte
der
INFγ+
CD8-
T-Zellen
der
CVID
Patientengruppe in die einzelnen Klassen in Abbildung 28 bleibt die bereits in
Abbildung 27A erkannte Streuung der Werte der CVID Gruppe erhalten (Abb. 28A).
Besonders die Werte der CVID Ia und 2 Gruppe weisen große Streuungen und eine
Standardabweichung von jeweils rund 10 % auf. In diesen Gruppen scheint die INFγ
Sekretion sehr heterogen in den einzelnen Personen auszufallen.
Hier tritt auch die höchste IFNγ Sekretion mit einem Mittelwert von je rund 18 % auf,
die im Vergleich mit der Kontrollgruppe hoch signifikant ausfällt. Die Sekretion der
CVID Ib Patienten fällt mit einem Mittelwert von 12,57 % leicht höher aus als die der
Kontrollgruppe, die mit 9,29 % den niedrigsten Mittelwert zeigt.
Auch nach anti-CD3/CD28 Stimulation sieht die Verteilung ähnlich aus (Abb. 28B). Die
Kontrollgruppe weist mit 30,38 % durchschnittlich die niedrigste IFNγ Sekretion auf,
während die Gruppen der CVID Ia und 2 Patienten mit Mittelwerten von 39,47 % und
40,57 % die höchste IFNγ Sekretion zeigen. Auch hier fällt die starke Streuung der
Werte der beiden Gruppen um den Mittelwert auf. Vermutlich ergeben sich dadurch
keine signifikanten Unterschiede.
A
B
CD3/CD28
IL-17 + IFN + CD8 - T-Zellen [%]
1.0
0.5
3
2
1
0
C
H
VI
D
C
H
4
D
0.0
n. s.
5
+
+
VI
D
n. s.
1.5
D
IL-17+ IFN + CD8- T-Zellen [%]
R10
-
Abbildung 29: Prozentsatz der IL-17 IFNγ CD8 T-Zellen in der Gruppe der CVID Patienten im Vergleich
zur Kontrollgruppe(HD).
A: nach Kontrollstimulation, B: nach 48 h anti-CD3/CD28 Stimulation.(n.s.: nicht signifikant).
Abbildung 29 zeigt die Prozentsätze der IL-17+ IFNγ+ CD8- T-Zellen nach antiCD3/CD28 bzw. nach Kontrollstimulation. Verglichen werden die Werte der CVID
Patientengruppe mit den Werten der Kontrollgruppe (HD).
Nach Kontrollstimulation weist die Gruppe der gesunden Kontrollen mit einem
Mittelwert von 0,27 % eine ähnliche IL-17+ IFNγ+ Sekretion auf, wie die Gruppe der
CVID Patienten mit durchschnittlich 0,24 %.
Nach Aktivierung mit anti-CD3/CD28 fallen die Ergebnisse ähnlich aus (Abb. 29B). Es
ergeben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den Mittelwerten der beiden
Gruppe (HD: 1,2 %; CVID: 1,03 %).
Ergebnisse
55
B
A
CD3/CD28
1
+
VI
D
C
Ia
C
VI
D
H
2
VI
D
+
2
0
C
C
VI
D
Ib
Ia
VI
D
C
H
2
D
0.0
3
Ib
0.5
4
VI
D
1.0
5
C
IL-17 + IFN + CD8 - T-Zellen [%]
1.5
D
IL-17+ IFN + CD8- T-Zellen [%]
R10
-
Abbildung 30: Prozentsatz der IL-17 IFNγ CD8 T-Zellen in den verschiedenen CVID Klassen Ia, Ib und 2
im Vergleich zur Kontrollgruppe.
A: nach Kontrollstimulation, B: nach 48 h anti-CD3/CD28 Stimulation.
Ähnliche Ergebnisse ergeben sich nach Unterteilung der IL-17+ IFNγ+ Sekretionswerte
der CVID Patienten in die einzelnen Klassen Ia, Ib und 2 in Abbildung 30.
Die Mittelwerte der CVID Ia und 2 Gruppe sowie der Kontrollgruppe liegen nach
Kontrollstimulation mit 0,28 %, 0,25 % und 0,27 % auf einem ähnlichen Level, während
die Gruppe der CVID Ib Patienten ein niedrigeres Mittel von 0,17 % aufweist (Abb.
30A).
Nach Aktivierung der Zellen mit anti-CD3/C28 (Abb. 29B) liegt der Mittelwert der CVID
Ia Patienten mit 0,69 % am niedrigsten. Die Mittelwerte der anderen Gruppen
unterscheiden sich kaum voneinander (HD: 1,2 %; CVID Ib: 1,12 %; CVID 2: 1,11 %).
Es ergeben sich weder vor noch nach Stimulation signifikante Unterschiede.
3.5
Funktion der B-Zellhilfe in CVID
In den vorherigen Versuchen wurde deutlich gezeigt, dass in den untersuchten
Patienten mit CVID kein Mangel an Produktion der Zytokine IL-21 und IL-10 vorliegt.
Dies gab jedoch keinen Aufschluss darüber, ob durch die Sekretion eine intakte BZellaktivierung und -differenzierung in Plasmazellen induziert werden kann.
Daher wurden die Zellen von fünf CVID Patienten und sechs gesunden Kontrollen
sechs Tage mit anti-CD3/CD28, bzw. kontrollstimuliert. Eine zusätzliche BZellstimulation wurde nicht durchgeführt. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie wurde die
Expression der Plasmazelldifferenzierungsmarker CD86, CD27 und CD38, sowie die
intrazelluläre Expression der Immunglobulinsubtypen IgG, IgA und IgM ermittelt.
Die Sekretion von IgG, IgA und IgM in den Überstand wurde zusätzlich mit Hilfe des
ELISA quantifiziert.
Ergebnisse
56
A
vitale BZellen
B
B-Zellen
Abbildung 31: Eingrenzung der zu analysierenden Zellen nach durchflusszytometrischer Messung.
-
Die Zellen wurden nach Auswahl der Lymphozyten A: auf Dapi und CD19
+
+
B-Zellen; B: auf CD19 B-
Zellen eingegrenzt und zur Analyse weiter betrachtet.
Abbildung 31 zeigt die Eingrenzung der Zellen, die zur Analyse der B-Zellen in diesem
Versuch verwendet wurde. Nach Eingrenzung der Lymphozyten aufgrund von Größe
und Granularität wurden im Falle der Oberflächenfärbung die toten (Dapi+) Zellen
abgegrenzt und die vitalen CD19+ B-Zellen zur Analyse verwendet. Im Fall der
intrazellulären Färbung war aufgrund der Methode eine Abgrenzung der toten Zellen
nicht möglich. Daher wurden alle CD19+ Lymphozyten analysiert.
Nach der Eingrenzung auf B-Zellen wurden weitere Einteilungen der Zellen zur
Analyse der Plasmablastendifferenzierung vorgenommen. Diese sind in Abbildung 32
und 33 gezeigt. Zunächst wurde CD27 gegen CD38 dargestellt und folgende
Populationen aufgrund der Zellverteilung nach anti-CD3/CD28 Stimulation abgegrenzt:
die Population der CD27 negativen B-Zellen, die Population der CD27 positiven BZellen und die Population der CD38hi CD27hi B-Zellen, welche im Folgenden auch als
Plasmablasten bezeichnet werden.
Die Population der Plasmablasten wurde daraufhin auf ihre IgA und IgG Expression hin
analysiert (Abb. 32), sowie auf ihre Expression von CD86 und CD21 (Abb. 33). Die
Population der CD38hi CD27hi CD86hi und CD21low B-Zellen können als voll
ausdifferenzierte Plasmablasten betrachtet werden. Diese weitere Analyse wurde nur
bei anti-CD3/CD28 stimulierten Zellen durchgeführt.
Ergebnisse
57
CD27
IgA
R10
CD3/CD28
HD
Patient 1
Patient 2
CD38
IgG
Abbildung 32: Analyse der Immunglobulinexpression auf Plasmablasten in zwei Patienten und einer
gesunden Kontrolle.
Expression von CD38 und CD27 vor sowie nach Stimulation. Expression von IgA und IgG auf CD38
hi
hi
CD27 B-Zellen nach anti-CD3/CD28 Stimulation.
CD27
CD86
R10
CD3/CD28
HD
Patient 1
Patient 2
CD38
CD21
Abbildung 33: Analyse der Plasmablastendifferenzierung in zwei CVID Patienten und einer gesunden
Kontrolle.
hi
hi
Expression von CD86 und CD21 auf CD38 CD27 B-Zellen nach anti-CD3/CD28 Stimulation.
Ergebnisse
58
Abbildung 32 und 33 lassen eine Vergleichsanalyse der Plasmablastendifferenzierung
zweier Patienten mit einer gesunden Kontrolle zu. Nach anti-CD3/CD28 Stimulation
steigt die Expression von CD38 und CD27 auf den Zellen der gesunden Kontrolle (HD)
sowie
des
Patient
1
stark
an
und
es
findet
u.a
eine
Expansion
der
Plasmablastenpopulation statt. Diese Expressionssteigerung sowie die Expansion
fallen bei den Zellen von Patient 2 sehr viel schwächer aus. Dies verdeutlicht die
heterogen vorliegende Störung der B-Zellaktivierung in den verschiedenen Patienten,
die unterschiedlich stark ausfallen kann.
Ein deutlicher Unterschied zwischen Patient und gesunder Kontrolle zeigt sich in der
näheren Differenzierungsanalyse der Plasmablasten. Die IgA, IgG, sowie die CD86
Expression fällt in beiden Patienten niedriger aus als in der gesunden Kontrolle.
Besonders Patient 2 zeigt eine kaum messbare Expression der Marker.
A
B
IgA+ Plasmablasten
2.5
IgA Plasmablasten [%]
30
20
hi
+
hi
10
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
C
IgG + Plasmablasten
C
D
IgM+ Plasmablasten
15
4
3
2
10
5
+
1
C
C
VI
D
H
D
D
0
0
H
+
IgM Plasmablasten [%]
5
IgG Plasmablasten [%]
VI
D
D
H
C
H
VI
D
D
0
VI
D
CD38 CD27 B-Zellen [%]
Plasmablasten
Abbildung 34: Analyse der Immunglobulinexpression auf Plasmazellen in der Kohorte der CVID Patienten
im Vergleich zur Kohorte der gesunden Kontrollen nach anti-CD3/CD28 Stimulation.
hi
hi
+
A: Population der CD27 CD38 Plasmablasten; B: Population der IgA Plasmablasten; C: Population der
+
+
IgG Plasmablasten; D: Population der IgM Plasmablasten.
Ergebnisse
59
A
low
Plasmablasten
15
10
5
hi
hi
hi
CD38 CD27 CD86 CD21
B-Zellen [%]
20
C
H
VI
D
D
0
B
C
MFI CD86
Mittlere Fluoreszenz CD86
40000
30000
20000
10000
30000
20000
10000
0
VI
D
C
H
C
H
VI
D
D
0
D
Mittlere Fluoreszenz CD86
MFI CD86
Abbildung 35: Analyse der Plasmablastendifferenzierung in der Kohorte der CVID Patienten im Vergleich
zur Kohorte der gesunden Kontrollen nach anti-CD3/CD28 Stimulation.
A: Population der CD38
hi
CD27
hi
CD86
hi
low
CD21
Plasmablasten; B:Mittlere Fluoreszenzintensität von
+
-
CD86 auf CD27 B-Zellen; C: Mittlere Fluoreszenzintensität von CD86 auf CD27 B-Zellen.
In Abbildung 34 und 35 sind die Ergebnisse aller gemessener CVID Patienten mit
denen der gesunden Kontrollen verglichen. Die Patienten zeigen nach anti-CD3/CD28
Stimulation eine niedrigere Population an Plasmablasten als die gesunden Kontrollen
(Mittelwert: CVID: 5,4 %, HD: 11,3 %) (Abb. 34 A). Dies fällt besonders bei Betrachtung
von Abbildung 35 A auf, welche die Population der genauer analysierten
Plasmablasten zeigt. Diese liegt in CVID Patienten stark erniedrigt vor (1,44 % zu 6,63
% Mittel). Auch die Expression an Immunglobulinen auf Plasmablasten ist in CVID
Patienten schwächer, wobei es unerheblich ist ob es sich um IgG, IgA oder IgM
handelt (Abb. 34 B, C und D).
Die mittlere Fluoreszenzintensität von CD86 fällt jedoch bei CVID Patienten verglichen
mit gesunden Kontrollen auf CD27 positiven B-Zellen leicht erhöht, auf CD27 negativen
Zellen normal aus.
Die vorhandenen Unterschiede zwischen Patienten und gesunden Kontrollen zeigen
alle keine Signifikanz.
Die Quantifizierung der Immunglobulinsekretion im ELISA, welche in Abbildung 36
dargestellt
ist,
zeigt
ähnliche
Ergebnisse
Immunglobulinexpression auf Plasmablasten.
wie
bereits
die
Analyse
der
Ergebnisse
60
A
IgM Steigerung
B
IgM
400
R10
3/28
300
200
200
0
0
C
C
H
VI
H
D
D
100
D
100
VI
D
IgM [ng/ml]
300
C
D
IgG
800
600
600
400
200
400
200
D
C
C
-200
H
VI
D
H
D
E
VI
D
0
0
F
IgA
IgA Steigerung
200
R10
3/28
150
n.s.
60
40
100
IgA [ng/ml]
50
20
D
D
H
D
C
VI
-20
VI
D
0
0
H
IgA [ng/ml]
n.s.
800
IgG [ng/ml]
IgG [ng/ml]
IgG Steigerung
R10
3/28
C
IgM [ng/ml]
n.s.
400
Abbildung 36: Sekretion von IgM, IgG und IgA durch Zellen von CVID Patienten im Vergleich mit
gesunden Kontrollen nach R10 bzw. CD3/CD28 Stimulation (A, C und E) und Steigerungsanalyse der IgSekretion (B, D und F).
Die Menge an sekretiertem IgM liegt in der gesunden Kontrollgruppe relativ höher vor
als in der Gruppe der CVID Patienten und zeigt nach T-Zellstimulation einen relativ
stärkeren Anstieg (Abb. 36 A). Die Steigerungen erreichen dementsprechend ebenfalls
höhere, jedoch nicht signifikant höhere Werte (Abb.36 B). Ähnlich verhält es sich mit
der Sekretion von IgG, welche in der Gruppe der CVID Patienten im Vergleich zu den
gesunden Kontrollen nur sehr geringe Werte und kaum Anstieg erreicht (Abb.36 C und
D). Die Sekretion von IgA fällt bis auf eine Ausnahme in der Kontrollgruppe in beiden
Gruppen ähnlich aus (Abb.36 E). Auch bei Betrachtung der nach anti-CD3/CD28
erreichten Steigerungen unterscheiden sich beide Gruppen kaum voneinander (Abb.36
F).
3.6
Zytokinfunktion in Patienten mit CVID
Zusätzlich zum Versuch der B-Zellaktivierung durch T-Zellstimulus wurde das gleiche
Experiment mit Überständen als Stimulanz durchgeführt. Diese aus vorherigen
Versuchen gewonnenen Überstände stammten von Zellen, die 48 h mit antiCD3/CD28, bzw. kontrollstimuliert wurden. Dank der vorherigen Versuche ist gewiss,
dass diese Überstände neben anderen Faktoren gewisse Mengen an IL-21 und IL-10
Ergebnisse
61
enthielten. Es sollte überprüft werden, ob die löslichen, im Überstand vorhandenen
Faktoren ausreichend sind, um ebenfalls eine B-Zellaktivierung und -differenzierung in
Plasmablasten mit anschließender Immunglobulinsekretion zu erreichen und ob sich
Überstände von CVID Patienten in ihrer Wirkung von der der gesunden Kontrollen
unterscheiden. Eine zusätzliche Stimulation der T- und B-Zellen wurde nicht
durchgeführt.
Die Zellen von CVID Patienten und gesunden Kontrollen wurden sechs Tage mit den
Überständen, die entweder von Zellen gesunder Kontrollen oder CVID Patienten
stammten, stimuliert. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie wurde die Expression der
Plasmazelldifferenzierungsmarker CD86, CD27 und CD38 sowie die intrazelluläre
Expression der Immunglobulinsubtypen IgG, IgA und IgM ermittelt.
Die Sekretion von IgG, IgA und IgM in den Überstand wurde zusätzlich mit Hilfe des
ELISA quantifiziert.
Das Experiment wurde zunächst an Zellen einer gesunden Kontrolle (HD 11) mit dem
Überstand einer anderen gesunden Kontrolle und eines CVID Patienten durchgeführt.
Es wurde dann an Zellen zweier gesunder Kontrollen (HD 12 und 13) und zweier CVID
Patienten (CVID 1 und 2) mit dem Überstand anderer gesunder Kontrollen und anderer
CVID Patienten wiederholt. Bei der Auswahl der Überstände wurde darauf geachtet HD
und CVID Überstände miteinander zu vergleichen, die im Zytokinanalyseexperiment
(3.4) ähnlich hohe IL-21 und IL-10 Expressionswerte gezeigt hatten. So können
mögliche auftretende Unterschiede in der B-Zellaktivierung weniger auf unterschiedlich
hohe Konzentrationen von IL-21 und IL-10 zurückzuführen sein, sondern auf andere
Faktoren im Überstand gründen.
Die Abbildungen 37 und 38 im direkten Vergleich mit den Abbildungen 32 und 33
zeigen, dass die Stimulation mit von T-Zellstimulierten Zellen gewonnenem Überstand
durchaus eine ähnliche Wirkung auf die B-Zellaktivierung haben kann, wie eine direkte
T-Zellstimulation mit anti-CD3/CD28. Nach Stimulation mit Überstand einer gesunden
Kontrolle findet die gleiche Hochregulation der Marker CD27 und CD38 statt, wie sie
auch nach direkter T-Zellstimulation erreicht wird. Die Population der Plasmablasten
zeigt eine ähnlich starke Expansion, auch die Expression der Immunglobuline IgA und
IgG fällt nach Stimulation mit Überstand ähnlich hoch aus wie nach direkter TZellstimulation. Auch B-Zellen eines CVID Patienten konnten mit Hilfe von Überstand
stimuliert und aktiviert werden (Daten nicht gezeigt).
Ergebnisse
62
CD27
IgA
R10
CD3/CD28
HD
Überstand
CVID
Überstand
CD38
IgG
Abbildung 37: Analyse der Aktvierungsmarker CD27 und CD38 auf gesunden Kontrollzellen nach
Stimulation mit Überstand einer gesunden Kontrolle im Vergleich mit Überstand von CVID Patienten nach
anti-CD3/CD28, bzw. Kontrollstimulation.
Weitere Differenzierungsanalyse der Plasmablasten auf IgA und IgG Expression nach anti-CD3/CD28
Stimulation.
CD27
CD86
R10
CD3/CD28
HD
Überstand
CVID
Überstand
CD38
CD21
Abbildung 38: Analyse der Plasmablastendifferenzierung einer gesunden Kontrolle nach Stimulation mit
Überstand einer gesunden Kontrolle im Vergleich mit Überstand eines CVID Patienten nach antiCD3/CD28, bzw. Kontrollstimulation.
hi
hi
Expression von CD86 und CD21 auf CD38 CD27 B-Zellen nach anti-CD3/CD28 Stimulation.
Vergleicht man die Aktivierung nach Stimulation mit dem Überstand eines CVID
Patienten und einer gesunden Kontrolle, so kann man feststellen, dass diese
unvollständig verläuft. Die Population der Plasmablasten fällt deutlich geringer aus als
nach Stimulation mit HD Überstand. Es liegen kaum IgG und IgA exprimierende Zellen
vor, auch die CD86 Expression ist stark verringert.
Ergebnisse
63
Es scheint, als könne der Überstand dieses CVID Patienten die B-Zellen nicht in
gleichem Maße zur Differenzierung in Plasmablasten aktivieren, wie es nach
Stimulation mit dem Überstand der gesunden Kontrolle möglich ist.
Der Versuch wurde zur Überprüfung der Ergebnisse zweimal an jeweils einer
gesunden Kontrolle (HD 12 und 13) und einem CVID Patient (CVID 1 und 2), die
jeweils mit Überstand einer gesunden Kontrolle, bzw. eines CVID Patienten behandelt
wurden, wiederholt.
Diese Ergebnisse und die Ergebnisse aus dem ersten Ansatz sind in Abbildung 39
und 40 mit den Absolutwerten der einzelnen Populationen zusammengefasst.
Man kann deutlich erkennen, dass die Werte von HD 11 nach Stimulation mit
Überstand
eines
CVID
Patienten
weniger
gesamte
Plasmablasten
und
dementsprechend auch weniger IgA, IgG und IgM exprimierende Plasmablasten als
nach Stimulation mit Überstand einer gesunden Kontrolle aufweisen (Abb. 39 A, B,C
und D). Auch die Zahl der durch Hochregulierung von CD86 und Herabregulierung von
CD21 charakterisierten Plasmablastenpopulation fällt geringer aus.Die Populationen
der CD27 negativen und positiven B-Zellen zeigen ebenfalls eine geringere Aktivierung
durch erniedrigte mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von CD86.
Diese Ergebnisse werden durch die zwei anderen Ansätze nicht wiederholt bestätigt.
Zwar zeigt auch HD 12 nach Stimulation mit CVID Überstand eine verringerte
Population der gesamten Plasmablasten und der der IgA, IgG und IgM exprimierenden
Plasmablasten als nach Stimulation mit HD Überstand, im Fall von HD 13 steigen
diese Populationen jedoch eher noch an (Abb. 39).
Die Population der CD38hi CD27hi CD86hi CD21low B-Zellen fällt in allen getesteten
Personen nach Stimulation mit CVID Überstand geringer aus verglichen mit nach
Stimulation mit HD Überstand (Abb. 40 A). Bei Betrachtung des Aktivierungsgrades der
CD27 negativen und positiven B-Zellen, ausgedrückt durch den MFI von CD86, stellt
sich jedoch kein Unterschied zwischen den beiden Stimulationsansätzen (mit HD oder
CVID Überstand) heraus.
Ergebnisse
64
A
B
IgA+ Plasmablasten
2.0
15
10
IgA Plasmablasten [%]
HD 11
HD 12
HD 13
CVID 1
CVID 2
+
5
0
HD 11
HD 12
HD 13
CVID 1
CVID 2
1.5
1.0
0.5
D
C
VI
H
D
VI
D
C
D
IgM+ Plasmablasten
IgG+ Plasmablasten
5
2.5
HD 11
HD 12
HD 13
CVID 1
CVID 2
2.0
1.5
+
1.0
IgM Plasmablasten [%]
0.5
HD 11
HD 12
HD 13
CVID 1
CVID 2
4
3
2
1
0
S
Ü
D
H
C
H
C
VI
D
D
Ü
Ü
S
S
Ü
S
0.0
VI
D
+
Ü
Ü
S
S
Ü
Ü
D
H
C
IgG Plasmablasten [%]
S
0.0
S
CD38hi CD27hi B-Zellen [%]
Plasmablasten
Abbildung 39: Analyse der Immunglobulinexpression auf Plasmazellen von CVID Patienten und gesunder
Kontrollen nach Stimulation mit Überstand gesunder Kontrollen im Vergleich mit Überstand von CVID
Patienten nach anti-CD3/CD28 Stimulation.
hi
hi
+
A: Population der CD27 CD38 Plasmablasten; B: Population der IgA Plasmablasten; C: Population der
+
+
IgG Plasmablasten; D: Population der IgM Plasmablasten
A
low
Plasmablasten
HD 11
HD 12
HD 13
CVID 1
CVID 2
2
hi
hi
CD38 CD27 CD86 CD21
B-Zellen [%]
3
hi
1
C
H
D
VI
D
Ü
Ü
S
S
0
B
C
MFI CD86
MFI CD86
15000
10000
5000
HD 11
HD 12
HD 13
CVID 1
CVID 2
15000
10000
5000
0
Ü
S
S
D
Ü
D
H
C
C
VI
H
D
D
Ü
Ü
S
S
0
VI
Mittlere Fluoreszenz CD86
HD 11
HD 12
HD 13
CVID 1
CVID 2
Mittlere Fluoreszenz CD86
20000
20000
Abbildung 40: Analyse der Plasmablastendifferenzierung von CVID Patienten und gesunder Kontrollen
nach Stimulation mit Überstand gesunder Kontrollen im Vergleich mit Überstand von CVID Patienten nach
anti-CD3/CD28 Stimulation.
A: Population der CD38
+
hi
CD27
hi
CD86
hi
low
CD21
Plasmablasten; B:Mittlere Fluoreszenzintensität von
-
CD86 auf CD27 B-Zellen; C: Mittlere Fluoreszenzintensität von CD86 auf CD27 B-Zellen.
Ergebnisse
65
Ähnliches zeigt sich in der im ELISA ermittelten IgA, IgG und IgM Sekretion (Abb. 41).
Diese fällt bei HD 11 nach Stimulation mit CVID Überstand nur schwach aus und zeigt
kaum Steigerung zwischen Stimulation mit Überstand nach anti-CD3/CD28 Stimulation
und nach Kontrollstimulation (Abb. 41 A, C und E).
Dieser Unterschied der Immunglobulinsekretion zwischen HD und CVID Überstand tritt
jedoch bei Betrachtung von HD 13 und CVID 2 nicht auf. Hier liegt die Sekretion bei
beiden Überstandsstimulationen ähnlich hoch vor und zeigt ebenfalls eine ähnliche
Steigerung der Sekretion nach Stimulation mit nach anti-CD3/CD28 Stimulation
gewonnenem Überstand.
Die
Werte
des
CVID
Patienten
sind
allerdings
aufgrund
geringer
Immunglobulinsekretion schwierig zu interpretieren.
A
C
IgM
10
100
IgA [ng/ml]
IgG [ng/ml]
15
IgA
60
R10
3/28
R10
3/28
20
IgM [ng/ml]
E
IgG
150
25
50
R10
3/28
40
20
5
0
VI
D
C
Ü
S
VI
D
H
D
Ü
S
Ü
S
VI
D
Ü
S
C
Ü
S
VI
D
H
D
Ü
S
C
C
VI
D
Ü
S
Ü
S
0
D
Ü
S
VI
D
100
C
H
D
Ü
S
C
VI
D
D
150
50
H
0
Ü
S
0
Ü
S
10
R10
3/28
200
IgA [ng/ml]
200
100
H
R10
3/28
300
IgG [ng/ml]
20
IgA
250
D
R10
3/28
30
HD 13
Ü
S
Ü
S
D
H
F
IgG
400
40
IgM [ng/ml]
VI
D
C
D
IgM
H
B
Ü
S
Ü
S
D
H
C
H
VI
D
D
Ü
S
Ü
S
0
C
0
CVID 2
HD 13
CVID 2
HD 13
CVID 2
Abbildung 41: Sekretion von IgM, IgG und IgA nach Stimulation mit Überstand gesunder Kontrollen im
Vergleich mit Überstand von CVID Patienten nach anti-CD3/CD28, bzw. Kontrollstimulation.
A: IgM Sekretion einer mit den verschiedenen Überständen behandelten gesunden Kontrolle (HD 11); B:
IgM Sekretion einer mit den verschiedenen Überständen behandelten gesunden Kontrolle (HD 13) im
Vergleich mit einem gleich behandelten CVID Patienten (CVID 2); C: IgG Sekretion einer mit den
verschiedenen Überständen behandelten gesunden Kontrolle (HD 11); D: IgG Sekretion einer mit den
verschiedenen Überständen behandelte Kontrolle (HD 13) im Vergleich mit einem gleich behandelten
CVID Patienten (CVID 2); E: IgA Sekretion einer mit den verschiedenen Überständen behandelten
gesunden Kontrolle (HD 11); F: IgA Sekretion einer mit den verschiedenen Überständen behandelte
Kontrolle (HD 13) im Vergleich mit einem gleich behandelten CVID Patienten (CVID 2).
Diskussion
4
66
Diskussion
Die adäquate Produktion von spezifischen Antikörpern nach Infektion oder Impfung
hängt von zahlreichen komplexen Schritten ab, die letztendlich in der Interaktion
antigenspezifischer T- und B- Zellen im Keimzentrum sekundär lymphatischer Organe
kumuliert. Dort entstehen nicht nur langlebige Plasmazellen, sondern auch
zirkulierende
Antigen-spezifische
Gedächtnis
B-
und
T-
Zellen,
die
den
entscheidenden Fortschritt in der Evolution des spezifischen Immunsystems darstellen.
Patienten mit CVID leiden an einer schweren Störung der Ausbildung eines humoralen
Gedächtnisses. Eine zentrale Rolle bei diesem Prozess spielen die CXCR5+
follikulären Helfer T- Zellen, die möglicherweise eng mit den zirkulierenden CXCR5+ TZellen im peripheren Blut assoziiert sind.
Aus diesem Grund sollte die Differenzierung CXCR5 positiver T-Zellen bei Patienten
mit CVID im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen untersucht werden.
4.1
Phänotypisierung unstimulierter CXCR5+ T-Zellen
Bei Betrachtung der Ergebnisse der PBL sowie der Tonsillenzellen fällt auf, dass der
Prozentsatz Markerexprimierender Zellen in der Population der CXCR5+ Zellen in allen
Fällen höher ausfiel als in der Population der CXCR5- Zellen.
Zellen aus der Tonsille wiesen eine größere Population an CXCR5+ T-Zellen auf als
Zellen aus dem peripheren Blut.
Die
Phänotypisierung
der
gewebestämmigen
CXCR5+
T-Zellen
zeigte,
dass
entsprechend der Literatur in der Tonsille die Populationen der CD200 und PD-1
exprimierenden T-Zellen am höchsten ausfällt. Diese Zellen waren ebenfalls meist
CXCR5 positiv. Nur wenige PBL exprimierten die hier betrachteten Marker (Abb. 7).
In der Population der CXCR5- T-Zellen war die OX40 und ICOS Expression auf Zellen
des peripheren Blutes höher ausgeprägt als auf tonsillären Zellen. Dies konnte jedoch
in den nachfolgenden Versuchen (Abb. 8, Abb. 9) nicht wiederholt gezeigt werden, so
dass es sich in diesem Fall (Abb. 7) vermutlich um aktivierte, zirkulierende T-Zellen
handelt, die von Person zu Person unterschiedlich hoch ausfallen können.
Bei der Messung der Expression des Moleküls IL-21R scheint es sich um eine
unspezifische Bindung des Antikörpers zu handeln, so dass diese nicht auszuwerten
war. Ebenfalls macht es die niedrige Expressionshöhe einiger Marker schwierig die
Daten mit Sicherheit richtig auszuwerten.
Diskussion
67
Eine Bestimmung messbarer Marker zur Differenzierung von zirkulierenden Tfh-Zellen
war jedoch möglich. Fast alle der hier untersuchten Marker (OX40, ICOS, CD200 und
PD-1) haben sich zur Differenzierungsbestimmung sinnvoll erwiesen.
Diese wurde an Patienten mit CVID im Vergleich mit immunologisch gesunden
Kontrollen durchgeführt.
4.2
Phänotypisierung unstimulierter CXCR5+ T-Zellen in Patienten
mit CVID
Die Phänotypisierung der CXCR5+ T-Zellen in Patienten mit CVID ergab zunächst eine
erhöhte Zahl an CD45RO+ T-Zellen im Vergleich zu den gesunden Kontrollen (Abb.
9A). Dies wurde bereits durch Vlková et al. beschrieben (Vlková et al., 2006) und
indiziert einen Shift in Richtung aktivierte T-Zellen und T-Gedächtniszellen. Dies könnte
durch eine gestörte Differenzierung der CD4+ T-Zellen oder durch eine vermehrte
Stimulation des Immunsystems ausgelöst werden.
Eine absolute Expansion der CXCR5 positiven Zellen lag in Patienten mit CVID nicht
vor. Auch die Zahl der CD4+ T-Zellen lag im Normalbereich.
Des Weiteren zeigen CVID Patienten keine erhöhte Aktivität der CXCR5+ T-Zellen des
peripheren Blutes. Sie exprimieren die Tfh-spezifischen Oberflächenmoleküle OX40,
ICOS und CD200 in gleichem Maße wie die getesteten gesunden Kontrollen (Abb. 8).
Ein Vergleich zwischen tonsillären Zellen einer gesunden Kontrolle mit denen eines
CVID Patienten konnte aufgrund der erschwerten Beschaffung von Material leider nicht
durchgeführt werden. Die tonsillären Zellen wiesen bereits in der gesunden Kontrolle
mehr aktivierte CXCR5+ T-Zellen und somit mehr Tfh-Zellen auf als Zellen des
peripheren Blutes. Somit könnten hoch aktivierte CXCR5+ T-Zellen in CVID Patienten,
sollten sie vorhanden sein, auch nur in den Tonsillen vorkommen und daher im Blut
nicht detektierbar sein.
4.3
Generierung Tfh-ähnlicher Zellen aus dem peripheren Blut
Die Möglichkeit zur Generierung Tfh-ähnlicher Zellen wurde unter Verwendung
verschiedener aus der Literatur ermittelter Tfh-spezifischer Differenzierungsfaktoren
untersucht. Während heute allgemein anerkannt ist, dass IL-4 die Entwicklung von
Th2-Zellen fördert und IL-12 die Entwicklung in Richtung Th1-Zellen lenkt, ist der
Signalweg der Tfh-Differenzierung noch nicht eindeutig geklärt. In Mäusen wurde IL-6
als Differenzierungsfaktor ermittelt, wurde jedoch im humanen System eher als TfhZelldifferenzierungshemmend beschrieben. IL-12 scheint bei humanen Zellen die
Differenzierung in follikuläre T-Helferzellen zu lenken.
Diskussion
68
Die Ergebnisse konnten dies ebenfalls nicht klären. Die Zugabe von anti-ICOS, IL-21,
IL-6 oder IL-12 zusätzlich zum T-Zellstimulus anti-CD3/CD28 auf eine in vitro Kultur
peripherer Blutlymphozyten hatte keine Induktion der Aktivierungsmarker von TfhZellen auf zirkulierenden CXCR5 positiven T-Zellen zur Folge. Vermutlich sind
zusätzliche lokale Faktoren, die zum bisherigen Zeitpunkt noch nicht identifiziert
wurden, notwendig um eine Differenzierung einzuleiten.
Interessanterweise hat die Induktion aller Aktivierungsmarker nach Stimulation
hauptsächlich auf CXCR5- T-Zellen und nicht wie erwartet auf CXCR5+ T-Zellen
stattgefunden. Allerdings fällt der Prozentsatz an Markerexprimierenden Zellen in der
Population der CXCR5+ T-Zellen meist höher aus als in der Population der CXCR5- TZellen.
In peripheren Blutlymphozyten war es möglich die Oberflächenmoleküle OX40 und
ICOS durch Zusatz von anti-CD3/CD28 hoch zu regulieren (Abb. 9).
Durch Zusatz von IL-6 konnte in peripheren Blutlymphozyten, besonders auf CXCR5+
T-Zellen, ein leichter Anstieg der CD200+ T-Zellen erreicht werden (Abb. 11). Jedoch
wurde keine Veränderung der PD-1, sowie der IL-21R Expression erreicht, sodass hier
nicht von einer vollständigen Differenzierung in follikuläre T-Helferzellen gesprochen
werden kann.
Auch die erhöhte IL-21R Expression auf peripheren Blutlymphozyten nach IL-12
Stimulation (Abb. 13) scheint nicht von einer Entwicklung in Tfh-Zellen her zu rühren,
sondern eher von einer unspezifischen Markererhöhung, da eine Verschiebung der
kompletten Zellwolke nach Oben zu erkennen ist.
Der Zusatz von IL-12 führte jedoch auf isolierten CD4+ T-Zellen zur Sekretion von IL21, eines durch Tfh-Zellen produzierten Zytokins (Abb. 14). Dies wurde jedoch
hauptsächlich durch CXCR5- T-Zellen gebildet, sodass es sich auch hierbei kaum um
ausdifferenzierte Tfh-Zellen handeln kann. Es scheint, als ob verschiedene TZellpopulationen in der Lage sind IL-21 zu sekretieren, welche in diesem Ansatz jedoch
nicht näher identifiziert werden konnten.
Die Oberflächenmoleküle OX40 und ICOS wurden auf Milzzellen ebenfalls durch
Zusatz von anti-CD3/CD28 hoch reguliert (Abb. 10), wobei die Expression von OX40
auf Milzzellen um einiges höher ausfiel, als auf Zellen des peripheren Blutes (Abb. 9,
Abb. 10).
Auf Milzzellen war es sogar möglich durch diesen Stimulus die CD200, PD-1 und IL21R
Expression
stark
zu
erhöhen
(Abb.
10).
Jedoch
liegt
diese
in
der
Kontrollstimulation schon höher, als in der Phänotypisierung der Milzzellen ermittelt
Diskussion
69
(Daten nicht gezeigt). Daher könnte diese Expressionsteigerung durch eine
unspezifische Bindung des verwendeten Antikörpers erreicht worden sein.
Diese Expressionsteigerung unterstützt jedoch die Überlegung, dass gewebestämmige
Zellen mit einer Tfh-fördernden Mikroumgebung leichter in der Lage sind in Tfh-Zellen
zu differenzieren. Dies wurde bereits im murinen System an in die Milz transferierten
FOXP3- T-Zellen gezeigt, die nach Immunisisierung mit Schaf Erythrozyten (SRBC) in
Tfh-Zellen differenzierten (Tsuji et al., 2009). Tfh fördernde Zytokine scheinen in dieser
Umgebung in großer Menge vorhanden zu sein.
Um die Wirkung lokaler Gewebefaktoren auf die Tfh-Differenzierung weiter zu
konkretisieren sollten weitere Experimente durchgeführt werden. Die Kultur peripherer
Blutlymphozyten mit Überständen stimulierter Milz- oder Tonsillenzellen wäre hierbei
von Interesse. Auch eine Kokultur von PBL mit Milz-, bzw. Tonsillenzellen könnte neue
Ergebnisse bringen. Allerdings war die Durchführung dieser Experimente aufgrund der
fehlenden Gewebe im Laufe meiner Arbeit nicht möglich.
Da die Generierung der Tfh-Zellen durch geeignete Stimulanzien bereits in gesunden
Kontrollen nicht möglich war, wurde der Versuch einer Tfh-Differenzierung in CVIDPatienten nicht durchgeführt. Ob diese Differenzierung in Patienten mit CVID einer
gestörten Regulation unterliegt, kann daher nicht beantwortet werden und bleibt
weiterhin offen.
4.4
Analyse der Zytokinproduktion durch Th2-Zellen in Patienten
mit CVID
Viele Erkrankungen des Immunsystems werden durch Zytokine beeinflusst. Oft handelt
es sich hierbei um Autoimmunkrankheiten wie Rheumatoide Arthritis, doch auch
Immundefekte gründen auf fehlerhafter Sekretion von Zytokinen.
Patienten mit CVID leiden u.a. an einer Störung der B-Zelldifferenzierung in Richtung
Plasmazelle. Zytokine, die diese Differenzierung einleiten oder unterstützen, sind
Interleukin-21 und Interleukin-10. Die Annahme, in CVID Patienten die Funktion oder
Sekretion dieser Zytokine gestört vorzufinden, liegt daher nahe.
Die Versuche mit anti-CD3/CD28 und IL-12 stimulierten CD4+ T-Zellen zeigten eine
gesteigerte IL-21 Produktion verglichen mit der Sekretion nach anti-CD3/CD28
Stimulation (Abb.14). Da in Patienten mit CVID eine erniedrigte Sekretion von IL-12
durch dendritische Zellen publiziert wurde (Cunningham-Rundles et al., 2004, Bayry et
al., 2004), kam die Hypothese einer verminderten IL-21 Produktion durch T-Zellen von
Patienten mit CVID auf. Die Analyse wurde auf IL-10 ausgeweitet, da dieses Zytokin
sehr wichtig für die weitere Differenzierung der B-Zellen ist.
Diskussion
70
Die Ergebnisse aus Versuch 3.5 zeigen eine erhöhte Sekretion von IL-21 in Patienten
mit CVID (Abb.18), welches der erwähnten Theorie, in CVID Patienten erniedrigte
Level an IL-21 vorzufinden, widerspricht.
Die Expression von IL-21 und IL-21R wurden in CVID Patienten bisher als normal
beschrieben (Borte et al., 2009), auch konnte keine genetische Mutation im Gen für IL21 detektiert werden (Salzer et al. 2008; Borte et al., 2009).
Nach Aufschlüsslung der Ergebniswerte in die einzelnen CVID Klassen sticht die
Klasse der CVID Ia deutlich mit der höchsten IL-21 Sekretion heraus (Abb. 19).
Interessanterweise liegt das IL-21 Sekretionslevel bereits vor Aktivierung der Zellen mit
anti-CD3/CD28 erhöht vor (Abb. 19A).
Auch die IL-10 Sekretion ist teilweise erhöht (Abb. 21), wobei die Gruppe der CVID Ia
Patienten die höchste IL-10 Expression aufweist (Abb. 22). Nach Aktivierung mit antiCD3/CD28 liegt jedoch keine erhöhte IL-10 Sekretion im Vergleich zu den gesunden
Kontrollen mehr vor.
Die Sekretion von IL-10 in CVID Patienten wurde bisher einerseits als normal (Pons et
al., 2006), andererseits als vermindert beschrieben (Holm et al. 2003). Diese
Unterschiede
lassen
sich
vermutlich
durch
die
verschieden
verwendeten
Messmethoden erklären. Pons et al. führten Untersuchungen auf genetischer Ebene,
Holm
et
al.
führten
durchflusszytometrische
Messungen
Färbungen
im
Überstand
angefertigt
wurden.
durch,
Auch
während
wurde
hier
in
den
Publikationen keine Zuordnung zu bestehenden oder eine weitere Klassifzierung der
CVID Patienten vorgenommen.
Die hohe Sekretion von IL-21 und IL-10 vor Aktivierung könnten auf das Level an TGedächtniszellen zurück zu führen sein, das in Patienten mit CVID erhöht vorliegt
(Abb. 8A). Da IL-21 und IL-10 vorwiegend durch CD45RO+ CD8- T-Zellen produziert
werden (Abb. 17), werden, je mehr T-Gedächtniszellen vorliegen, desto mehr Zytokine
produziert. Um dies ausschließen zu können wurde eine Korrelation der Zahl an
Gedächtnis-T-Zellen mit der IL-21 und IL-10 Expression durchgeführt (Abb. 23). Es
zeigten sich jedoch keine Korrelationen in keiner der drei CVID Klassen. Auch fiel auf,
dass eine hohe Zahl an CD45RO positiven Zellen eher mit einer niedrigen Zahl an IL21
exprimierenden
Zellen
einherging,
welches
der
Hypothese
der
hohen
Zytokinsekretion aufgrund hohem Anteil an T-Gedächtniszellen widerspricht.
CVID Ia Patienten unterscheiden sich von den anderen beiden CVID Gruppen durch
das vermehrte Vorkommen einer bestimmten B-Zellpopulation, die den Phänotyp
CD38-
CD21low aufweist.
Diese
Zellen
sind
naiven
B-Zellen
aufgrund
von
Genexpression und Expression von IgM und IgD auf der Oberfläche, sowie dem
Fehlen von klassengewechselten Isotypen und somatischer Hypermutation sehr
Diskussion
71
ähnlich (Rakhmanov et al., 2009). Über die Funktion und Rolle dieser sogenannten
CD21low B-Zellen ist noch nicht sehr viel bekannt.
Möglicherweise korreliert das Auftreten dieser Population mit der gesteigerten IL-21
oder IL-10 Produktion durch T-Zellen. Durch CD21low B-Zellen sekretierte Zytokine
könnten ihrerseits die IL-21 und IL-10 Produktion fördern oder in anderer Weise auf die
T-Zellen Einfluss nehmen.
Da IL-21 und IL-10 auf B-Zellen wirken, wäre auch das Auftreten der CD21low B-Zellen
aufgrund der erhöhten Zytokinproduktion möglich.
Hierbei handelt es sich jedoch nur um Hypothesen, welche weiterer Versuche
bedürfen. In diesen Experimenten müssten IL-21 und IL-10 in Verbindung mit den
CD21low B-Zellen untersucht werden. Vorstellbar wäre hierzu eine Analyse der TZellzytokine nach Stimulation naiver B-Zellen in Anwesenheit von CD21low B-Zellen im
Vergleich mit der Abwesenheit dieser B-Zellsubpopulation.
Zusammenfassend wurde in diesem Versuch kein Patient identifiziert, der nicht in der
Lage war IL-21 oder IL-10 zu produzieren. Es ergaben sich vor Stimulation signifikante
Unterschiede in der IL-21 und IL-10 Expression, die in CVID Ia Patienten höher ausfiel
als in der gesunden Kontrollgruppe. Nach Stimulation lag in der Gruppe der CVID Ia
Patienten die IL-21 Expression höher vor.
4.5
Die Population der Th1- und Th17-Zellen in Patienten mit
CVID
Th17-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei verschiedenen inflammatorischen
Erkrankungen, insbesondere des Atemtraktes. In Untergruppen der CVID Patienten
treten vermehrt inflammatorische Veränderungen im Bereich des Atemtraktes auf, so
dass Th17 Zellen bei CVID Patienten in Abhängigkeit von inflammatorischen
Veränderungen untersucht werden sollten.
In dieser Studie wurde die IL-17 Sekretion der CVID Patienten im Vergleich zu
gesunden
Kontrollen
analysiert.
Zusätzlich
dazu
wurde
die
Sekretion
des
proinflammatorischen Zytokins IFNγ als typisches Th1-Zytokin, welches die zelluläre
Immunantwort unterstützt und die humorale Immunantwort hemmt, betrachtet.
Im Zusammenhang damit wurde auch die Population der Th17/Th1 Zellen, doppelt
positiv für IFNγ und IL-17, analysiert um eine Expansion dieser Population in Patienten
mit CVID auszuschließen. Diese Zellpopulation wird in Autoimmunerkrankungen wie
Rheumatoide Arthritis, welche eine Involvierung von Th1, sowie von Th17 Zellen an
der Ausprägung der Pathologie vermuten lässt, als interessantes Forschungsziel
angesehen (Annunziato et al., 2009).
Diskussion
72
Die Ergebnisse dieser Studie sind aufgrund der niedrigen Fallzahl nicht repräsentativ,
zeigen jedoch, dass die hier untersuchten CVID Patienten gegenüber den gesunden
Kontrollen eine normale IL-17 Sekretion aufweisen (Abb. 25A und B). Es ist hierbei
unerheblich, ob es sich um unstimulierte oder aktivierte T-Zellen handelt.
Th17-Zellen produzieren jedoch nicht nur IL-17, sondern ebenfalls IL-22. IL-22+ CD4+
T-Zellen wurden im Blut von Patienten mit Spondylitis Ankylosis und Rheumatoider
Arthritis in erhöhtem Maße gefunden (Shen et al., 2009). Auch in Patienten mit
autoimmuner Schilddrüsenerkrankung, wie Hashimotos Thyroiditis, wurden erhöhte
Level an IL-22 sekretierenden T-Zellen detektiert (Figueroa-Vega et al., 2009). Somit
sollten auch andere durch Th17-Zellen sekretierte Zytokine in Bezug zur Pathologie in
Patienten mit CVID in Betracht gezogen werden.
Im Gegensatz zu IL-17 ist die Sekretion von IFNγ in Patienten mit CVID vor sowie nach
T-Zellstimulation signifikant erhöht (Abb. 27).
Eine erhöhte IFNγ Produktion durch CD4+ und CD8+ T-Zellen in Patienten mit CVID
wurde bereits beschrieben (North et al., 1996) und spricht für eine übermäßige Th1Immunantwort in diesen Patienten.
Erhöhte IFNγ Level in unstimuliertem Zustand weisen auf eine Voraktivierung der TZellen hin, welches vermutlich auf die Häufigkeit an Infektionen in Patienten mit CVID
zurück zu führen ist.
Die erhöhte IFNγ Sekretion nach T-Zellaktivierung lässt ebenfalls auf eine
Verschiebung der Immunantwort in Richtung zellulärer Immunabwehr schließen. Dies
steht in Verbindung mit der in CVID Patienten vorhandenen Störung der BZelldifferenzierung
Differenzierung
in
von
antikörpersezernierende
Th1-Zellen,
Plasmazellen.
so dass die
B-Zellhilfe
IFNγ
fördert
und die
die
humorale
Immunantwort unzureichend unterstützt werden.
Diese Erhöhung der IFNγ Sekretion ist besonders in CVID Ia und CVID 2 Patienten zu
vermerken. Jedoch findet gleichzeitig in diesen beiden Gruppen die größte Streuung
der IFNγ Sekretionswerte statt (Abb. 28A und B). Vermutlich hängen die Werte vom
jeweiligen Tages- und Gesundheitszustand des untersuchten Patienten ab und
müssen daher nicht CVID-Klassenspezifisch zugeordnet sein.
Die Population der IL-17+ IFNγ+ CD8- T-Zellen liegt in Patienten mit CVID in gleichem
Maße vor wie in der gesunden Kontrollgruppe (Abb. 29). Es ergibt sich somit eine
Normalverteilung der untersuchten T-Zell-Populationen in der Patientengruppe. Es ist
hierbei unerheblich, ob es sich um unstimulierte oder aktivierte T-Zellen handelt. Somit
kann eine Expansion der Th17/Th1 Zellen als Auslöser der Pathologie in Patienten mit
CVID ausgeschlossen werden.
Diskussion
4.6
73
Funktion der B-Zellhilfe in CVID
Patienten mit CVID zeigen eine gestörte Differenzierung in Plasmazellen, welche einer
Kostimulation mit T-Helferzellen bedarf. Die Funktion der B-Zellhilfe sollte daher in
diesem Teil der Arbeit untersucht werden. Aus diesem Grund wurden in vitro lediglich
T-Zellen mit anti-CD3/CD28 stimuliert und anschließend die Auswirkungen auf die BZellaktivierung und –differenzierung in Plasmablasten gemessen.
Die Ergebnisse zeigen nach T-Zellstimulation eine starke Aktivierung der B-Zellen. Die
Expression von CD27 und CD38 steigt stark an, ebenfalls die Population der
Plasmablasten (Abb. 32). Dieses weist auf eine Proliferation dieser Zellpopulation hin.
Vermutlich findet ebenfalls eine Förderung der Differenzierung in Plasmablasten durch
die stattfindende T-Zellstimulation statt.
Diese B-Zellaktivierung kann in gesunden Kontrollen, sowie auch in Patienten
beobachtet werden. Allerdings treten bei den Patienten Unterschiede in der
Differenzierung der Plasmablasten auf. Zellen einiger Patienten sind eher in der Lage
nach Stimulation in Plasmablasten zu differenzieren, während bei anderen nur wenige
B-Zellen CD38, CD27 und CD86 hoch- und CD21 herabregulieren (Abb. 33). Dies
spricht für die vorhandene heterogene Ausprägung der Pathologie von CVID, welche
sich unter anderem in der unterschiedlichen Immunglobulinsekretionsfähigkeit der
Patienten äußert.
Die Analyse der Immunglobulinsekretion im ELISA nach in vitro Stimulation zeigt, dass
CVID Patienten im Vergleich mit gesunden Kontrollen weniger IgA, IgG und IgM
sekretieren (Abb. 36). Diese Sekretion kann jedoch durch die T-Zellstimulation im Fall
von IgA und IgM leicht gesteigert werden. Dies spricht für eine Proliferation
klassengewechselter Plasmablasten oder einer durch die T-Zellstimulation ausgelöste
Differenzierung. Allein die Differenzierung und Proliferation IgG+ Plasmablasten nach
Stimulation scheint in Patienten mit CVID schlechter zu funktionieren als in den
gesunden Kontrollen, da keine erhöhte IgG Sekretion stattfindet.
Insgesamt weisen die untersuchten CVID Patienten jedoch durchschnittlich weniger
Plasmablasten nach anti-CD3/CD28 Stimulation auf als gesunde Kontrollen, welches
den Daten der Immunglobulinanalyse entspricht (Abb. 34 und 35). Es scheint als läge
die T-Zellinduzierte Differenzierung in Plasmablasten bei Patienten gestört vor, so dass
nur wenige Zellen in der Lage sind Immunglobuline zu produzieren. Die allgemeine
Aktivierung der B-Zellen scheint in Patienten mit CVID jedoch normal zu verlaufen,
welches sich durch die normale Expression von CD86 auf CD27 negativen und
positiven B-Zellen äußert (Abb. 35).
Ob diese Aktivierung direkt über Kontakt mit aktivierten T-Zellen oder indirekt über
sekretierte Zytokine, wie z. B. IL-21 und IL-10, von statten geht, kann durch dieses
Diskussion
74
Experiment jedoch nicht geklärt werden. Da hier die gesamten Lymphozyten für den
Stimulationsversuch genommen wurden, ist auch eine Mitbeteiligung dendritischer
Zellen
oder
anderer
Zelltypen
nicht
auszuschließen.
Hierzu
müssten
Stimulationsversuche mit isolierten B- und T-Zellen durchgeführt werden. Um eine
direkte von einer indirekten Aktivierung unterscheiden zu können, müssten in weiteren
Versuchen die bei der Stimulation entstehenden Stoffe bestimmt werden und könnten
dann den B-Zellen in unterschiedlicher Kombination zugesetzt werden. Eine geförderte
Kostimulation durch Aktivierung der T-Zellen bleibt jedoch wahrscheinlich, so dass eine
Stimulation isolierter B-Zellen mit isolierten, aktivierten T-Zellen schon Aufschluss über
den Aktivierungsprozess der B-Zellen bringen würde.
Zusammenfassend kann man sagen, dass die T-Zellstimulation auch in Patienten mit
CVID die Aktivierung und Differenzierung von B-Zellen in Richtung Ig-sekretierender
Plasmablasten zu beeinflussen scheint, jedoch schwächer ausfällt als in den gesunden
Kontrollen. Borte et al. zeigten, dass der Zusatz von IL-21 mit zusätzlicher
Kostimulation durch anti-CD40 einen Klassenwechsel in Patienten mit CVID induzierte
(Borte et al., 2009). Ob in dem hier durchgeführten Versuch die erhöhte Expression
von IL-21 nach T-Zellstimulation hauptsächlich für die B-Zellaktivierung verantwortlich
ist, lässt sich nach diesem Experiment nicht sagen. Hierzu müsste zunächst die Frage
geklärt werden, ob stimulierte T-Zellen allein ausreichen um B-Zellen zu aktivieren oder
ob die anderen in diesem Ansatz vorhandenen Zellen einen Beitrag leisten. Auch
könnten neben IL-21 weitere lösliche Faktoren eine Rolle spielen, welches durch
Depletion einzelner Zytokine geklärt werden könnte.
Im Gesamten muss ebenfalls berücksichtigt werden, dass in diesem Experiment nur
eine kleine Anzahl von CVID Patienten untersucht wurde. Eine Ausweitung der Gruppe
und eventuelle Berücksichtigung der Freiburg Klassifzierung ist notwendig um eine
signifikante Aussage über die B-Zellaktivierung nach T-Zellstimulation in Patienten mit
CVID zu treffen.
4.7
Zytokinfunktion in Patienten mit CVID
Der vorherige Versuch zeigt, dass die in vitro Aktivierung von T-Zellen eine BZellaktivierung in Richtung klassengewechselter Plasmablasten zur Folge hat. In
welcher Art diese Aktivierung verläuft bleibt jedoch ungeklärt. Das Experiment 3.6
zeigt, dass die von mit anti-CD3/CD28 stimulierten Lymphozyten produzierten
Substanzen ebenfalls in der Lage sind B-Zellen in gleicher Art zu aktivieren. Es ergibt
sich kein Unterschied zur direkten Stimulation mit anti-CD3/CD28 (Abb.37 und 38).
Diese Beobachtung konnte auch bei durch Überstand einer gesunden Kontrolle
Diskussion
75
stimulierten Zellen von CVID Patienten gemacht werden. Auch diese konnten allein
durch die im Überstand vorhandenen Faktoren zur Plasmazelldifferenzierung und proliferation gebracht werden.
Ob die B-Zellaktivierung durch Überstand direkt oder indirekt verläuft, konnte durch
diesen Versuchsansatz jedoch nicht beantwortet werden. Es wäre möglich, dass Stoffe
im Überstand direkt auf B-Zellen wirken und eine Aktivierung und Differenzierung in
Plasmazellen induzieren. Die Stoffe im Überstand könnten jedoch auch T-Zellen oder
andere Zellen aktivieren um somit eine B-Zellaktivierung durch Kostimulation
einzuleiten. Auch muss man davon ausgehen, dass im nach zwei Tagen antiCD3/CD28 Stimulation gewonnenen Überstand noch Restkonzentrationen von antiCD3/CD28 vorhanden sind, welche T-Zellen wieder direkt stimulieren können.
Allerdings dürfte diese Restmenge deutlich unter der normal bei Direktstimulation
eingesetzten Konzentration liegen. Die Verwendung mit anti-CD3/CD28 gecoateter
Platten oder eine Stimulation über CD3/CD28 gekoppelte Beads anstatt löslicher
Stimulanzien würde dieses Problem beheben. Zusätzlich könnte eine Analyse der TZellaktivierungsmarker über die T-Zelldifferenzierung nach Stimulation mit dem
Überstand Aufschluss geben.
Um Gewissheit über den Vorgang der B-Zellaktivierung zu bekommen, sollten isolierte
B-Zellen mit Überstand stimuliert werden um eine direkte von einer indirekten
Stimulation unterscheiden zu können. Je nach Ausgang dieses Ansatzes könnten
unterschiedliche Lymphozytenpopulationen zum Stimulationsansatz hinzugefügt oder
weggelassen
werden.
Des
Weiteren
wären
Experimente,
die
die
Stoffzusammensetzung des Überstandes bestimmen, denkbar.
Im durchgeführten Versuchsansatz sollte zusätzlich die Qualität des durch Zellen von
CVID
Patienten
produzierten
Überstandes
näher
betrachtet
werden.
Da
Zytokinproduktion und T-Zellaktivierung in Patienten mit CVID normal verlief (3.4),
wurde die Störung der Differenzierung in Plasmazellen mit der Funktionalität der nach
T-Zellstimulation sekretierten Stoffe in Verbindung gebracht.
Es zeigte sich, dass der Überstand von T-Zellstimulierten Zellen eines CVID Patienten
im Einzelfall nicht in der Lage war B-Zellen in gleicher Art zu aktivieren, wie es nach
Stimulation mit dem Überstand einer gesunden Kontrolle der Fall war. Diese
Beobachtung konnte jedoch in der Wiederholung und Ausarbeitung des Ansatzes nur
bedingt wiederholt bestätigt werden. Es ergaben sich zwar teilweise Unterschiede in
der B-Zellaktivierung und Plasmablastendifferenzierung zwischen der Stimulation mit
Überstand eines CVID Patienten und dem Überstand einer gesunden Kontrolle, jedoch
fanden diese Personenbezogen statt und konnten nicht für alle untersuchten Proben
Diskussion
76
gezeigt werden. Besonders zwei gesunde Kontrollen zeigten nach Stimulation mit
CVID Überstand eine geringere Aktivierung der B-Zellen.
Man kann jedoch zu diesem Zeitpunkt keine Aussage über die Funktionalität des
Überstandes eines CVID Patienten treffen, da zu wenige Ansätze des Versuches
durchgeführt wurden. Die Beobachtungen könnten für Einzelfälle sprechen und nicht
für eine allgemeine Dysfunktion der nach T-Zellstimulation durch Zellen eines CVID
Patienten sekretierten Stoffe. Daher sollten die Versuche in großem Ansatz mit einer
Vielzahl von Probanden aus beiden Gruppen durchgeführt werden um eine genaue
Aussage und signifikante Ergebnisse über die Qualität des von Zellen eines CVID
Patienten produzierten Überstandes geben zu können. Auch sollte der Versuch mit den
weniger aktivierenden Überstanden in gleicher Weise wiederholt werden um
Doppelmessungen vorweisen zu können.
4.8
Ausblick
B-Zellhilfe durch T-Zellen ist wichtig um die Differenzierung von Plasmazellen und die
Sekretion von klassengewechselten Immunglobulinen zu gewährleisten. Diese in CVID
Patienten als gestört vorzufinden ist nach wie vor eine sehr aktuelle Hypothese und soll
in den nächsten Jahren weiterhin erkundet werden. Aufbauend auf diesen Versuchen
sollen weitere durch aktivierte T-Helferzellen sekretierte Zytokine identifiziert und in
Patienten mit CVID auf eine Störung hin untersucht werden. Ebenfalls soll die bereits
begonnene Studie der IL-21, IL-10, IL-17 und IFNγ Produktion um weitere Patienten
erweitert werden.
Ebenfalls soll vor dem Hintergrund der hier durchgeführten in vitro B-Zellaktivierung
durch Analyse des Überstandes mit Hilfe von modernen Methoden, z.B. des „BeadArray‘s― zur Zytokinbestimmung, geklärt werden, welche Faktoren für diese Aktivierung
verantwortlich sein könnten. Durch unterschiedliche Kombination der analysierten
Faktoren sollen die zur B-Zellaktivierung notwendigen identifiziert werden. Ansätze mit
isolierten Zellpopulationen sollen über die direkte oder indirekte Art der Stimulation
Aufschluss geben. Nach Aufklärung des B-Zellaktivierungsvorgangs sollen mögliche
Störungen dessen an einer Kohorte von CVID Patienten untersucht werden.
Die Generation der für die B-Zellhilfe im Keimzentrum wichtigen follikulären THelferzellen soll mit Hilfe von Tonsillengewebe und -zellen durch Schaffung der
richtigen Mikroumgebung induziert und an Zellen von Patienten mit CVID
nachempfunden werden. Eine mögliche Störung der Tfh-Generierung in CVID
Patienten soll somit aufgeklärt werden.
Zusammenfassung/ Summary
5
77
Zusammenfassung/ Summary
Zusammenfassung
Obwohl die variable Immundefizienz (CVID) Patienten mit einer B-Zelldysfunktion
einschließt, so werden immer öfter auch T-Zellstörungen im Zusammenhang mit CVID
beschrieben. Die Funktion der T-Helferzellen, welche auf die B-Zelldifferenzierung
einwirken, wurde in dieser Arbeit näher untersucht.
Mit dem Fokus auf follikuläre T-Helferzellen wurden phänotypische Untersuchungen
der peripheren CXCR5+ T-Zellen in Patienten mit CVID durchgeführt, welche keine
Unterschiede betreffend der Tfh-spezifischen Marker OX40, ICOS und CD200 in
Patienten mit CVID im Vergleich zu gesunden Kontrollen ergab. Zusätzlich wurde die
Möglichkeit einer Generierung Tfh-ähnlicher Zellen aus peripheren Blutlymphozyten
(PBL) mit Hilfe der Stimulanzien anti-ICOS, IL-21, IL-6 oder IL-12 getestet. Die
Versuchsbedingungen führten jedoch nicht zur Generierung Tfh-ähnlicher Zellen.
Des Weiteren wurden Analysestudien des Th1-Zytokins IFNγ, der Th2-Zytokine IL-21
und IL-10, sowie des Th17-Zytokins IL-17 mittels intrazellulärer Durchflusszytometrie
im Kontext der Freiburg Klassifizierung an Patienten mit CVID vorgenommen. Die IFNγ
Produktion lag in CVID Patienten erhöht vor, welches auf eine Verschiebung zur Th1Immunantwort hindeutet. Besonders Patienten der Gruppe CVID Ia und CVID 2 sind
davon betroffen. Auch die Th2-Zytokine IL-21 und IL-10 lagen in CVID Ia Patienten
erhöht vor, während das Level an IL-17 in CVID Patienten unverändert vorlag.
Zur näheren Untersuchung der B-Zellhilfe in Patienten mit CVID wurden in vitro
Kokulturexperimente mit Analyse der B-Zellaktivierung und -differenzierung nach TZellstimulation, sowie mit nach T-Zellstimulation erhaltenem Überstand durchgeführt.
Die Stimulation von T-Zellen in vitro hatte eine Aktivierung der B-Zellen hin zu
Immunglobulin-sekretierenden Plasmablasten zur Folge. Es ergab sich in den
getesteten Personen kein Unterschied zwischen der Aktivierung in Patienten mit CVID
und den gesunden Kontrollen. Die nach T-Zellstimulation gewonnenen Überstände
waren ebenfalls in der Lage B-Zellen von CVID Patienten im gleichen Maße wie Zellen
gesunder Kontrollen zu aktivieren. Hierbei traten in Einzelfällen Unterschiede zwischen
der Stimulation mit Überstand einer Kultur gesunder Spenderzellen und der Stimulation
mit Überstand einer Kultur von CVID Patientenzellen auf, welches in weiteren
Versuchen näher untersucht und wiederholt werden sollte.
Zusammenfassung/ Summary
78
Summary
Common variable immunodeficiency (CVID) encloses patients with a B cell function but
there is also disturbed T cell function described. This work analyses the function of T
helper cells with the impact on B cell differentiation in patients with CVID.
Focusing follicular T helper (Tfh) cells I phenotyped peripheral CXCR5+ T cells in
patients with CVID which showed no differences comparing the markers OX40, ICOS
and CD200. In addition I tried to generate Tfh-like cells from peripheral blood
lymphocytes (PBL) by stimulation with anti-ICOS, IL-21, IL-6 or IL-12 but without
success.
The analysis of IFNγ production by Th1 cells, of IL-21 and IL-10 production by Th2
cells as well as of IL-17 production by Th17 cells in correlation with the Freiburg
classification in patients with CVID per intracellular flowcytometry yield interesting
results. IFNγ production in patients with CVID, especially of group CVID Ia and CVID 2,
was increased and points out to a shift to the Th1 immune response. CVID Ia patients
showed also an increase in the Th2 cytokines IL-21 and IL-10 expression. The level of
Th17 was normal in patients with CVID.
To further analyse B cell function in patients with CVID I conducted in vitro coculture
experiments with analyses of B cell activation and differentiation after T cell stimulation
as well as after stimulation with supernatant of T cell stimulated cells.
Stimulation of T cells in vitro led to B cell activation in immunoglobuline secreting
plasmablasts with no difference of patients with CVID compared to healthy donors. B
cell activation also took place after stimulation with supernatant of T cell stimulated
cells. In individual cases the stimulation with supernatant of CVID cells showed
differences in B cell activation compared to stimulation with supernatant of healthy
donor cells which should be more researched into and should be repeated.
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Abbildungsverzeichnis
xv
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1 Periphere Differenzierung der T-Zellsubpopulationen. .............................. 4
Abbildung 2: Grundlegende molekulare Mechanismen der Tfh-Zell Funktion. .............. 6
Abbildung 3: Darstellung der Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation zur Isolierung von
mononukleären Zellen. ................................................................................................25
Abbildung 4: Darstellung des Sandwich ELISA. ..........................................................30
Abbildung 5: Pipettierschema des Sandwich-ELISA. ...................................................31
Abbildung 6: Phänotypische Analyse unstimulierter CXCR5+ T-Zellen aus PBL und
Tonsille........................................................................................................................33
Abbildung 7: Phänotypische Analyse unstimulierter CXCR5+ T-Zellen aus PBL. .........35
Abbildung 8: Prozentualer Anteil der CD4+, CD4+ CD45RO+ und CD4+ CXCR5+ TZellen der gesunden Kontrollen im Vergleich mit dem der CVID Patienten. ................35
Abbildung 9: Phänotypische Analyse der CXCR5+ T-Zellen aus PBL nach 48 h
Stimulation mit R10, CD3/CD28, CD3/CD28 + anti-ICOS und CD3/CD28 + anti-ICOS +
IL-21. ...........................................................................................................................37
Abbildung 10: Phänotypische Analyse von CXCR5+ T-Zellen der Milz nach 48 h
Stimulation mit R10, CD3/CD28, CD3/CD28 + anti-ICOS und CD3/CD28 + anti-ICOS +
IL-21. ...........................................................................................................................39
Abbildung 11: Phänotypische Analyse von CXCR5+ T-Zellen aus PBL nach 48 h
Stimulation mit R10 und CD3/CD28 + IL-6. .................................................................40
Abbildung 12: Phänotypische Analyse der CXCR5+ T-Zellen nach 48 h Stimulation von
PBL mit R10, CD3/CD28 und CD3/CD28 + IL-12. .......................................................41
Abbildung 13: Phänotypische Analyse der CXCR5+ T-Zellen nach 48 h Stimulation von
PBL mit R10, CD3/CD28 und CD3/CD28 + IL-12. .......................................................42
Abbildung 14: Phänotypische Analyse der CXCR5+ T-Zellen von isolierten CD4+ TZellen nach 48 h Stimulation mit R10, CD3/CD28 und CD3/CD28 + IL-12. .................43
Abbildung 15: Mikroskopische Ansicht der Lymphozyten- Zellkultur nach 48 h
Stimulation. .................................................................................................................44
Abbildung 16: Eingrenzung der zu analysierenden Zellen nach
durchflusszytometrischer Messung. ............................................................................45
Abbildung 17: Analyse der IL-21 Sekretion in PBL nach R10 und CD3/CD28
Stimulation. .................................................................................................................46
Abbildung 18: Prozentsatz der IL-21+ CD8- T-Zellen in der Gruppe der CVID Patienten
im Vergleich zur Kontrollgruppe (HD). .........................................................................46
Abbildung 19: Prozentsatz der IL-21+ CD8- T-Zellen in den verschiedenen CVID
Klassen Ia, Ib und 2 im Vergleich zur Kontrollgruppe (HD) ..........................................47
Abbildungsverzeichnis
xvi
Abbildung 20: Analyse der IL-10 Sekretion in PBL nach R10 und CD3/CD28
Stimulation. .................................................................................................................48
Abbildung 21: Prozentsatz der IL-10+ CD8- T-Zellen in der Gruppe der CVID Patienten
im Vergleich zur Kontrollgruppe (HD). .........................................................................48
Abbildung 22: Prozentsatz der IL-10+ CD8- T-Zellen in den verschiedenen CVID
Klassen Ia, Ib und 2 im Vergleich zur Kontrollgruppe (HD). .........................................49
Abbildung 23: Analyse der Korrelation zwischen IL-21 bzw. IL-10 Expression auf CD8T-Zellen und der CD45RO Expression. .......................................................................50
Abbildung 24: Analyse der IL-17 und IFNγ Sekretion in PBL nach R10 und CD3/CD28
Stimulation. Prozentuale intrazelluläre Expression von IL-17 und IFNγ in unstimulierten
und mit CD3/CD28 stimulierten CD8- T-Zellen eines Patienten mit CVID (Patient 3) im
Vergleich mit einer gesunden Kontrolle (HD 10). .........................................................51
Abbildung 25: Prozentsatz der IL-17+ CD8- T-Zellen in der Gruppe der CVID Patienten
im Vergleich zur Kontrollgruppe (HD). .........................................................................52
Abbildung 26: Prozentsatz der IL-17+ CD8- T-Zellen in den verschiedenen CVID
Klassen Ia, Ib und 2 im Vergleich zur Kontrollgruppe. .................................................52
Abbildung 27: Prozentsatz der IFNγ+ CD8- T-Zellen in der Gruppe der CVID Patienten
im Vergleich zur Kontrollgruppe...................................................................................53
Abbildung 28: Prozentsatz der IFNγ+ CD8- T-Zellen in den verschiedenen CVID
Klassen Ia, Ib und 2 im Vergleich zur Kontrollgruppe (HD). .........................................53
Abbildung 29: Prozentsatz der IL-17+ IFNγ+ CD8- T-Zellen in der Gruppe der CVID
Patienten im Vergleich zur Kontrollgruppe(HD). ..........................................................54
Abbildung 30: Prozentsatz der IL-17+ IFNγ+ CD8- T-Zellen in den verschiedenen CVID
Klassen Ia, Ib und 2 im Vergleich zur Kontrollgruppe. .................................................55
Abbildung 31: Eingrenzung der zu analysierenden Zellen nach
durchflusszytometrischer Messung. ............................................................................56
Abbildung 32: Analyse der Immunglobulinexpression auf Plasmablasten in zwei
Patienten und einer gesunden Kontrolle. .....................................................................57
Abbildung 33: Analyse der Plasmablastendifferenzierung in zwei CVID Patienten und
einer gesunden Kontrolle.............................................................................................57
Abbildung 34: Analyse der Immunglobulinexpression auf Plasmazellen in der Kohorte
der CVID Patienten im Vergleich zur Kohorte der gesunden Kontrollen nach antiCD3/CD28 Stimulation. ...............................................................................................58
Abbildung 35: Analyse der Plasmablastendifferenzierung in der Kohorte der CVID
Patienten im Vergleich zur Kohorte der gesunden Kontrollen nach anti-CD3/CD28
Stimulation. .................................................................................................................59
Abbildungsverzeichnis
xvii
Abbildung 36: Sekretion von IgM, IgG und IgA durch Zellen von CVID Patienten im
Vergleich mit gesunden Kontrollen nach R10 bzw. CD3/CD28 Stimulation (A, C und E)
und Steigerungsanalyse der Ig-Sekretion (B, D und F). ...............................................60
Abbildung 37: Analyse der Aktvierungsmarker CD27 und CD38 auf gesunden
Kontrollzellen nach Stimulation mit Überstand einer gesunden Kontrolle im Vergleich
mit Überstand von CVID Patienten nach anti-CD3/CD28, bzw. Kontrollstimulation. ....62
Abbildung 38: Analyse der Plasmablastendifferenzierung einer gesunden Kontrolle
nach Stimulation mit Überstand einer gesunden Kontrolle im Vergleich mit Überstand
eines CVID Patienten nach anti-CD3/CD28, bzw. Kontrollstimulation..........................62
Abbildung 39: Analyse der Immunglobulinexpression auf Plasmazellen von CVID
Patienten und gesunder Kontrollen nach Stimulation mit Überstand gesunder
Kontrollen im Vergleich mit Überstand von CVID Patienten nach anti-CD3/CD28
Stimulation. .................................................................................................................64
Abbildung 40: Analyse der Plasmablastendifferenzierung von CVID Patienten und
gesunder Kontrollen nach Stimulation mit Überstand gesunder Kontrollen im Vergleich
mit Überstand von CVID Patienten nach anti-CD3/CD28 Stimulation. .........................64
Abbildung 41: Sekretion von IgM, IgG und IgA nach Stimulation mit Überstand
gesunder Kontrollen im Vergleich mit Überstand von CVID Patienten nach antiCD3/CD28, bzw. Kontrollstimulation. ...........................................................................65
Tabellenverzeichnis
xviii
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Übersicht der verwendeten Stimulanzien ....................................................21
Tabelle 2: Übersicht der für die durchflusszytometrische Färbung verwendeten
Antikörper....................................................................................................................22
Tabelle 3: Übersicht der für den ELISA verwendeten Antikörper .................................22
Abkürzungsverzeichnis
xix
Abkürzungsverzeichnis
°C
Grad Celsius
Abb.
Abbildung
AITL
Angioimmunoblastisches T-Zelllymphom
APC
Antigen präsentierende Zelle
APC
Allophycocyanin
Aqua dest.
destilliertes Wasser
BAL
brochoalveolare Lavage
BCR
B-Zellrezeptor
bzw.
beziehungsweise
CD
cluster of differentiation (Differenzierungsmuster)
CVID
allgemeine variable Immundefizienz
CXCL
CXC Chemokinligand
CXCR
CXC Chemokinrezeptor
Cy
d.h.
das heißt
Dapi
4'-6-Diamidino-2-phenylindol
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
et al.
et alia (lat.) (und andere)
FACS
fluorescence activated cell
sorting
(Fluoreszenz aktivierte
Zellsortierung)
FCS
fetal calf serume (Fetales Kälberserum)
FITC
Fluoresceinisothiocyanat
g
mittlere Erdschwerebeschleunigung
g
Gramm
GLILD
granulomatöse lymphozytische interstitiale Lungenkrankheit
h
Stunde
HD
healthy donor (gesunder Spender)
i.d.R.
in der Regel
ICOS
inducible costimulator (Induzierbarer Kostimulator)
IFN
Interferon
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
l
Liter
m
milli
MFI
mittlere Fluoreszenzintensität
Abkürzungsverzeichnis
MHC
Major-Histocompatibility
xx
Komplex
(Haupt-Histokompatibilitäts
Komplex)
min
Minuten
n
nano
n. s.
nicht signifikant
NK-Zellen
Natürliche Killerzellen
p
Signifikanz
PAMPs
pathogene associated molecular pattern (Pathogen assoziierte
molekulare Strukturen)
PBL
periphere Blutlymphozyten
PBS
phosphate buffered saline (Phosphatgepufferte Salzlösung)
PE
Phycoerythrin
PerCP
Peridinin Chlorophyll Protein
PRRs
pattern recognition receptors (Mustererkennungsrezeptoren)
PTCL-F
periphere T-Zell Lymphome mit follikulärem Wachstumsraster
rpm
rotations per minute (Umdrehungen pro Minute)
RT
Raumtemperatur
s
Sekunden
SAP
signalling lymphocytic activation molecule (SLAM)-associated
protein
SLE
Systemischer Lupus erythematodes
spez.
speziell
TACI
Transmembrane Activator and Calcium-modulating Cyclophilin
Ligand interactor
TCR
T-Zell-Rezeptor
Tfh
follikuläre T-Helferzelle
Th-Zelle
T-Helferzelle
TLR
Toll-like receptor (Toll-ähnlicher Rezeptor)
TNF
Tumor Nekrose Faktor
Treg
regulatorische T-Zelle
U
unit (Einheiten)
v.a.
vor allem
Vh
schwere Kette des variablen Bereichs von T- oder B-Zellrezeptor
XLP
X-linked lymphoproliferative syndrome
Z /ml
Zellen pro mili-Liter
µ
mikro
Eidesstattliche Erklärung
xxi
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbst durchgeführt habe und
keine anderen als die angeführten Hilfsmittel und Quellen benutzt habe.
19. März 2010, Freiburg i.Br.
Anja Preuhsler