Tierärztliche Hochschule Hannover

Tierärztliche Hochschule Hannover
Charakterisierung der entzündungsbedingten
Surfactant- und Lungenparenchymalterationen beim Schwein
nach Infektion mit
Actinobacillus pleuropneumoniae
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)
vorgelegt
von
Diana Johanna Linda Busley
Hamm
Hannover 2014
Wissenschaftliche Betreuung:
Prof. Dr. Isabel Hennig-Pauka
Klinik für kleine Klauentiere und Forensische
Medizin und Ambulatorische Klinik,
Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof. Dr. Dr. Andreas Schmiedl
Institut für Funktionelle und Angewandte Anatomie
Medizinische Hochschule Hannover
1. GutachterIn:
Prof. Dr. Isabel Hennig-Pauka
Prof. Dr. Dr. Andreas Schmiedl
2. Gutachter:
PD Dr. Christoph Baums
Institut für Mikrobiologie, Zentrum für
Infektionsmedizin,
Tierärztliche Hochschule Hannover
Tag der mündlichen Prüfung:
22.10.2013
In Zusammenarbeit mit dem Institut für Funktionelle und Angewandte Anatomie der
Medizinischen Hochschule Hannover.
Diese Forschungsarbeit wurde dankenswerterweise von der Friedrich-Ebert-Stiftung
unterstützt.
Für Jens
Für Unsere Stärke
Für Johanna F. Funke
Für Deinen Glauben an Bildung
Inhaltsverzeichnis:
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
TABELLENVERZEICHNIS
Seite
15
1.
Übergeordnete Einleitung
2.
Literaturübersicht
2.1
Anatomischer und histologischer Aufbau der Lunge beim Schwein
bzw. bei Haussäugetieren
2.2
Surfactant
2.2.1 Aufbau, Funktion und Synthese
2.2.2 Die Rolle des Surfactants im angeborenen Immunsystem
2.2.3 Surfactantdysfunktion
2.2.4 Die Rolle des Surfactants bei spezifischen Erkrankungen
des Menschen bzw. in der tierexperimentellen
Grundlagenforschung
2.3
Surfactant bei Tieren
2.4
Surfactant beim Schwein
2.5
Erkrankungen des Respirationstrakts beim Schwein
2.5.1 Porcine Respiratory Disease Complex (PRDC)
2.5.2 Porzine Pleuropneumonie
17
Material und Methoden
3.1
Surfactantcharakterisierung beim Schwein
3.1.1 Infektionsversuche mit Scoring im Rahmen des
FUGATO-RePoRI- Projektes
3.1.1.1
Versuchstiere
3.1.1.2
Aerosolinfektion
3.1.1.3
Klinische und pathomophologische
Erhebungen
3.1.2 Bronchoalveoläre Lavage
3.1.2.1
Spülmethode
3.1.2.2
Zytologische Untersuchung
3.1.2.3
Surfactantgewinnung- und aufbereitung
3.1.2.4
Aufbereitung der Lavageflüssigkeit für die
Elektronenmikroskopie
3.1.3 Elektronenmikroskopie
3.1.3.1
Fragestellung
3.1.3.2
Elektronenmikroskopische Auswertung
3.1.3.3
Stereologische Parameter wie
Volumendichte, Oberflächendichte und des
Volumen-/Oberflächenverhältnis‘
41
41
3.
17
21
21
23
25
27
31
33
35
35
36
41
41
42
42
45
45
46
47
48
50
50
51
54
3.2
3.3
3.4
3.1.4 Biophysikalische Untersuchung des Surfactants:
Pulsating Bubble Surfactometrie
Charakterisierung von immersionsfixiertem Lungenparenchym
beim Schwein (Lungengesunde- und A.pp.- infizierte Schweine)
3.2.1 Versuchstiere
3.2.2 Aerosolinfektion
3.2.3 Klinische, computertomographische, hämatologische und
pathomorphologische Erhebungen im Rahmen der
Infektionsstudien von BRAUER (2012) und
HENNIG-PAUKA et al. (2012)
3.2.4 Präparationstechnik
3.2.5 Fixierung, Einbettung und Anfertigung von
Gewebedünnschnitten
3.2.6 Protokoll der lichtmikroskopischen Auswertung und
Berechnung stereologischer Parameter
3.2.7 Auswertung der computertomographischen
Transversalschnitte von Schweinelungen
3.2.7.1
Punktzählverfahren im STEPanizer
3.2.7.2
Berechnung des funktionellen
Lungenparenchymvolumens der
Schweinelungen nach dem Cavalieri Prinzip
3.2.7.3
Funktionelles Volumen der Alveolarsepten
3.2.7.4
Funktionelle Oberfläche der Alveolarsepten
3.2.7.5
Funktionelles Parenchymvolumen von
pathologisch veränderter Strukturen
Charakterisierung von perfusionsfixiertem Lungenparenchym
beim Schwein
3.3.1 Versuchstiere
3.3.2 Versuchsablauf
3.3.3 Samplingverfahren der perfusionsfixierten Lungen
3.3.4 Aufbereitung der Proben für die lichtmikroskopische
Untersuchung
3.3.5 Protokoll der lichtmikroskopischen Auswertung
3.3.6 Berechnung der stereologischen Parameter
Statistik
3.4.1 Statistische Auswertung von vor und nach der Infektion
erhobenen Daten
3.4.2 Statistische Auswertung der Daten, die nach Immersionsoder Perfusionsfixierung lichtmikroskopisch
erhoben wurden
56
61
61
61
61
63
63
64
66
66
67
67
68
68
69
69
69
74
76
76
76
76
76
77
4.
Manuskript
Characterisation of the inflammation-caused alterations of
Surfactant in pigs infected by Actinobacillus pleuropneumoniae
Abstract
Background
Porcine respiratory disease
Pulmonary surfactant
Methods
Housing, infection and examination of pigs
Bronchoalveolar lavage
Fixation and tissue processing
Stereology
Pulsating bubble surfactometry
Statistical analysis
Results
Clinical and laboratory diagnostic findings
Morphology of surfactant subtypes
Average minimal surface tension
Discussion
Conclusions
Abbreviations
Competing interests
Author’s contribution
Acknowledgements
References
Figure legends
Tables and figures
5.
78
78
79
80
84
91
93
97
97
97
98
98
98
107
109
Übergreifende Diskussion
5.1
Alterationen im Surfactantsystem (vgl. Manuskript)
5.1.1 Reflexion der Ergebnisse
5.1.2 Reflexion der angewandten Methoden und Ausblick
5.2
Charakterisierung der infektionsbedingten Parenchymalterationen
5.2.1 Reflexion der Ergebnisse
5.2.2 Methodenkritik und Ausblick
5.3
Strukturelle Charakterisierung von porzinem, perfusionsfixiertem
Lungenparenchym
5.3.1 Reflexion der Ergebnisse
5.3.2 Methodenkritik und Ausblick
115
115
115
122
124
124
127
6.
Literaturverzeichnis
133
7.
Anhang
163
Anhang 1. mit Tabelle 7.1.1: „Alterationen im Surfactantsystem:
Klinik, Pathomorphologie und kulturelle Untersuchung“
163
Anhang 2. „Stereologische Charakterisierung von immersionsfixiertem
129
129
132
Anhang 3.
Anhang 4.
Lungenparenchym beim Schwein
(Lungengesunde und A.pp.- infizierte Schweine)“
Vergleich zwischen Immersions- und Perfusionsfixierung
von Lungenparenchym beim Schwein
Protokoll über die Surfactant-Auswertung
164
177
180
8./9. Zusammenfassung in deutscher und englischer Sprache
181
10.
186
Danksagung
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
AE II
alveolar epithelial cells type II
A.pp.
Actinobacillus pleuropneumoniae
ARDS
Acute Respiratory Distress Syndrome
BAL
Bronchoalveoläre Lavage
BALF
Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit
BMBF
Bundesministerium für Bildung und Forschung
bspw.
beispielsweise
CT
Computertomographie
DPPC
Dipalmitoylphosphatidylcholin
Σ
Summe
ECP
eosinophilic cationic protein
Fa.
Firma
hPa
Hektopascal
KGW
Körpergewicht
kV
Kilovolt
kPa
Kilopascal
LA
large aggregates
lb
lamellar body
lbl
lamellar body-like forms
LLS
Lung Lesion Score
LSP
Linienschnittpunkt
mAs
Milliampèresekundenprodukt
MHz
Megaherz
mlv
multilamellar vesicle
ms
Millisekunde
p
p-Wert
P
Punkt(e)
PBS
Pulsating Bubble Surfactometer
PEEP
positive end-exspiratory pressure
PINSP
pressure inspiratoric
PRDC
Porcine Respiratory Disease Complex
p. inf.
post infectionem
RHS
Respiratory Health Score
SA
small aggregates
SD
standard deviation
s.o.
siehe oben
SP bzw. SP-
Surfactantprotein
SV
Oberflächendichte
TEM
Transmissionselektronenmikroskop
tm
tubular myelin
u.a.
unter anderem
ulv
unilamellar vesicle
V/S-Ratio
Volumen-/Oberflächenverhältnis
VV
Volumendichte
z.B.
zum Beispiel
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Seite
Literaturverzeichnis
Abb. 2.1. a: Aufbau der Schweinelunge (aus WAIBL 1999, S. 268)
18
Abb. 2.1. b: Legende zur Abb. 2. 1. a (aus WAIBL 1999, S. 268)
18
Abb. 2.2:
Surfactant bei belastungsinduzierten Asthma (modifiziert nach
ENHORNING et al. 2000)
28
Material und Methodik
Abb. 3.1.1:
Versuchsdesign im Rahmen des FUGATO-RePoRI-Projektes,
teilweise publiziert in REINER et al. (2014)
Abb. 3.1.2:
a.)
44
Beispielhaft Ferkel in Neuroleptanalgesie mit
ausgebundenem Kiefer während Laryngoskopie,
wie beschrieben in KIPPER (1990)
b.)
46
Beispielhaft Bronchoskopie, wie beschrieben in KIPPER
(1990)
46
Abb. 3.1.3.: Punktzählverfahren im STEPanizer© stereology tool
53
Abb. 3.1.4:
PBS
58
Abb. 3.1.5:
PBS schematisch (ENHORNING 1977)
58
Abb. 3.1.6:
Blick durch das Okular des Pulsating Bubble SurfactometersTM
59
Abb. 3.1.7:
PBS Output eines Kontrollschweines:
60
Abb. 3.3.1:
Nahezu vollständig kollabierte Lunge ohne definierte Blähung
72
Abb. 3.3.2:
Überblähtes Lungenparenchym durch falsche Einstellung des
Beatmungsdruckes (>40 mbar), beim späteren Sampling floss viel
Flüssigkeit von der Schnittfläche ab
Abb. 3.3.3:
Entnommene Lungen mit definierter Blähung durch
Abklemmung der Trachea am Ende der Inspiration
Abb. 3.3.4:
72
73
Schneidapperatur zum exakten Schneiden der Lungen (von der
Forschungswerkstatt der Medizinischen Hochschule Hannover
konstruiert)
75
Diskussion
Abb. 5.1.1:
Schematische Darstellung des Surfactantmetabolismus (aus
MÜHLFELD u. OCHS 2010, S. 4)
119
Anhang
Abb. 7.2.1:
Verteilung der stereologisch erarbeiteten Volumendichten bei
Kontrolltieren und infizierten Tieren am Tag der Sektion
Abb. 7.2.2:
168
Oberflächendichten [1/µm] der Alveolarsepten bei Kontrolltieren
und infizierten Tieren
169
Abb.7.2.3:
V/S-Ratio [µm] bei Kontrolltieren und infizierten Tieren
169
Abb.7.2.4:
Vergleichende Darstellung der zytologischen Untersuchung der
BALF der Kontrolltiere und der infizierten Schweine am Tag
der Sektion
Abb.7.2.5:
Vergleichende Darstellung der Blutwerte der Kontrolltiere und
infizierten Schweine am Tag 21. p. inf.
Abb. 7.2.6:
171
Vergleichende Darstellung der stereologisch ermittelten Daten der
Kontrolltiere und infizierten Schweine am Tag 21. p. inf.
Abb.7.2.7:
170
172
Via Stereologie ermittelte funktionelle Oberfläche der
Alveolarsepten vergleichend für Kontrolltiere und der
infizierten Schweine am Tag 21. p. inf.
Abb. 7.2.8:
173
Funktionelle Parenchymvolumina pathologisch
veränderter vergleichend für die Kontrolltiere und die
infizierten Schweine am Tag 21. p. inf.
Abb. 7.2.9:
174
Immersionsfixiertes Lungenparenchym eines
Kontrolltieres, HE-Färbung
175
Abb. 7.2.10: Immersionsfixiertes Lungenparenchym eines mit A.pp.infizierten Tieres (21 Tag p.inf.), HE-Färbung
Abb. 7.3.1:
176
Verteilung der stereologisch berechneten Volumendichten von
immersionsfixiertem Lungenparenchym und
perfusionsfixiertem Lungenparenchym (schraffiert).
Abb. 7.3.2:
Vergleich der Oberflächendichte [1/µm] zwischen
177
Immersions- und Perfusionsfixierung (schraffiert)
Abb. 7.3.3:
Perfusionsfixiertes Lungenparenchym eines
Kontrolltieres, HE-Färbung
Abb. 7.3.4:
178
179
Nahezu vollständig kollabierte Lunge ohne definierte
Blähung am Ende der Inspiration, Lungenparenchym eines
Kontrolltieres, HE-Färbung
179
TABELLENVERZEICHNIS
Seite
Anhang
Tabelle 7.1.1:
Alterationen im Surfactantsystem: Klinik, Pathomorphologie und kulturelle Untersuchung
Tabelle 7.2.1:
Stereologische und klinische Charakterisierung der
Lungenparenchymalterationen nach Infektion mit A.pp.
Tabelle 7.2.2
163
164
Pathomorphologische und histopathologische
Charakterisierung der Lungenparenchymalterationen
nach Infektion mit A.pp.
Tabelle 7.2.3:
Ausgewählte Korrelationen (Lichtmikroskopie) in der
Kontrollgruppe (n=5)
Tabelle 7.2.4:
165
166
Ausgewählte Korrelationen (Lichtmikroskopie) bei den
A.pp.- infizierten Schweinen (n=4)
167
Übergeordnete Einleitung
1. Übergeordnete Einleitung
Erkrankungen des Respirationstraktes führen in der Schweineproduktion zu großen
wirtschaftlichen Verlusten (JACKSON u. COCKCROFT 2007) und sind neben den
Durchfallerkrankungen einer spanischen Studie zufolge die bedeutendste Indikation
für den Einsatz von Antibiotika beim Schwein (CASAL et al. 2007).
Die
Weiterentwicklung
der
Diagnostik
und
Therapie
von
porzinen
Atemwegserkrankungen ist deshalb nicht nur aus ökonomischen Gesichtspunkten
nötig, sondern auch im Sinne des Verbraucherschutzes, des Tierschutzes und der
Landwirtschaft entscheidend (modifiziert nach HENNIG-PAUKA 2007).
Die Dissertation basiert auf vorausgegangenen Arbeiten, in denen a) die genetische
Krankheitsresistenz verschiedener Rassen und die Bedeutung angeborener
Immunitätsmechanismen
bezüglich
der Anfälligkeit
gegenüber
Actinobacillus
pleuropneumoniae untersucht wurde (HÖLTIG 2009), b) bildgebende Verfahren bei
dieser Erkrankung evaluiert wurden (BRAUER et al. 2012) und c) zum angeborenen
Immunsystem
gehörende
antibakterielle
Peptide
im
die
Lungenoberfläche
auskleidenden Flüssigkeitsfilm entdeckt und als Krankheitsmarker genutzt wurden
(HENNIG-PAUKA et al. 2006).
Studien
haben
Immunsystems,
gezeigt,
dass
funktionelle
als Komponenten
Bestandteile
des Surfactantsystems,
des
angeborenen
bei
der Abwehr
bakterieller Erreger eine wichtige Rolle spielen (LEVINE et al. 1998; GIANNONI et al.
2006; WU et al. 2003).
Somit
lag
es
nahe,
die
bronchoalveoläre
Lavageflüssigkeit
(BALF)
grundlagenorientiert zu untersuchen. Hierbei wurde die BALF sowohl auf ihre
biophysikalischen Eigenschaften (Oberflächenspannung) als auch ultrastrukturell
(Surfactantsubtypen) anhand bestimmter morphometrischer Parameter untersucht (in
Anlehnung an SCHMIEDL et al. 2003). Diese Untersuchungen fanden in
Zusammenarbeit
mit
der
Medizinischen
Hochschule
Hannover,
Institut
für
Funktionelle und Angewandte Anatomie und der Klinik für Pädiatrische Pneumologie,
Allergologie und Neonatologie statt.
Anhand der Infektion mit Actinobacillus pleuropneumoniae (A.pp) sollen mit dieser
15
Übergeordnete Einleitung
Studie
nun
zwei
daran
anknüpfende
grundlagenforschungsorientierte
Fragestellungen bearbeitet werden (in Anlehnung an SCHMIEDL et al. 2003; VAN
SCHAIK et al. 1997):
1.
Wie
stellt
sich
die
Morphologie
der
Surfactantsubtypen
und
die
biophysikalische Funktion vor und nach der Infektion dar?
2.
Lassen sich entzündungsbedingte Veränderungen des Surfactants hinsichtlich
seiner Morphologie und
Gesundheitszustand
Funktion
(Klinik
darstellen,
und
so
dass
Pathomorphologie)
auf
des
den
Tieres
rückgeschlossen werden kann?
Die BALF könnte dann einerseits auf Erreger (vgl. GROSSE-BEILAGE et al. 2013, S.
204-206), andererseits auch auf die Qualität des oberflächenaktiven Surfactants
(s.o.) untersucht werden. Langfristig wäre dies ein wichtiger Ansatz, um neue
Therapieansätze und auch Vakzinierungsstrategien bezüglich ihrer Wirkung auch auf
Komponenten des angeborenen Immunsystems evaluieren zu können (modifiziert
nach HENNIG-PAUKA et al. 2012).
Dabei sollen die durchgeführten Untersuchungen Orientierungswerte für die
Surfactantcharakterisierung beim Schwein bieten, und zwar sowohl für gesunde
Tiere, als auch für Tiere mit Pneumonie.
Da das Schwein häufig als Modelltier genutzt wird (TRACHSEL et al. 2011,
HOHLFELD et al. 1999 b, ROGERS et al. 2008), stellen diese Daten auch für die
humanmedizinische
Forschung
eine
Grundlage
dar,
um
Tiermodelle
für
Erkrankungen des Menschen besser charakterisieren zu können. Dieselben Tiere,
die zuvor zur Beantwortung anderer Fragestellungen mit A.pp. infiziert worden waren
(s.o.), wurden nun auch genutzt, um in dieser Arbeit die pathogenspezifischen
Alterationen im porzinen Surfactant und im Lungenparenchym zu charakterisieren.
16
Literaturübersicht
2. Literaturübersicht
2.1
Anatomischer und histologischer Aufbau der Lunge beim Schwein
bzw. bei Haussäugetieren
Anatomie
Grundsätzlich hat die Lunge der Haussäugetiere die Struktur eines tubuloalveolär
zusammengesetzten Gangsystems, die Aufzweigung des Bronchialbaumes ist als
Grundlage für die Lappengliederung tierartspezifisch gegeben (KÖNIG u. LIEBICH
2012, S. 383).
KÖNIG u. LIEBICH (2012, S. 382) beschreiben, dass beim Schwein die Anatomie
der rechten Lunge (Pulmo dextra) und der linke Lunge (Pulmo sinistra) in Bezug auf
die Lappengliederung verschieden ist. Die Pulmo sinistra gliedert sich in einen Lobus
cranialis sinister mit je einer Pars cranialis und Pars caudalis und einen Lobus
caudalis sinister. Die rechte Lunge besitzt vier Lappen: Lobus cranialis, Lobus
accessorius, Lobus medius und Lobus caudalis (KÖNIG u. LIEBICH 2012, S. 382).
Des Weiteren erörtern KÖNIG u. LIEBICH (2012, S. 386) beim Schwein und beim
Wiederkäuer
das
gesonderte
Vorhandensein
eines
rechtsseitigen
Bronchus
trachealis. Dieser entspringt als selbstständiger Lappenbronchus vor der Bifurcatio
tracheae aus der Trachea. Das luftleitende Bronchialsystem lässt sich bei den
Haussäugetieren in Hauptbronchien (Bronchi principales) nach Aufzweigung der
Trachea, Lappenbronchien (Bronchi lobares) jeweils der linken und rechten Lunge,
Segmentbronchien (Bronchi segmentales) für ein umschriebenes kegelförmiges
Lungensegment,
Subsegmentbronchien
(Bronchi
subsegmentales),
kleinere
Bronchien (Bronchioli veri) und Endbronchiolen (Bronchioli terminales) untergliedern.
Daran anschließend besteht das respiratorische System aus Bronchioli respiratorii,
Alveolargängen (Ductus alveolares), Alveolarsäckchen (Sacculi alveolares) und
Lungenbläschen (Alveoli pulmonis) (KÖNIG u. LIEBICH 2012, S. 386).
Funktionell ist die Lunge bei den Haussäugetieren über den Truncus pulmonalis an
das Gefäßsystem des kleinen Lungenkreislaufs angeschlossen, die nutritive
Versorgung übernehmen die Arteria und Vena bronchooesophagea (KÖNIG u.
LIEBICH 2012, S. 388).
17
Literaturübersicht
Arterielles, sauerstoffangereichertes Blut wird über die Venae pulmonales in die linke
Vorkammer des Herzens gebracht (KÖNIG u. LIEBICH 2012, S. 388).
a:
b:
c:
d:
1:
Lobus cranialis
Lobus medius
Lobus caudalis
Lobus accessorius
Incisura cardiaca pulmonis dextri bzw.
sinistri
2:
Trachea
3:
Bronchus principalis
4:
Bronchus trachealis
5:
Bronchus lobaris cranialis
6:
Bronchus lobaris medius
7:
Bronchus accessorius
8:
Bronchus lobaris caudalis
9:
1. bzw. 3. ventraler
Segmentbronchus des Lobus‘
caudalis
10:
2. dorsaler Segmentbronchus des
Lobus’ caudalis
11:
weitere Segmentbronchen
12:
Lymphonodi tracheobrochales
craniales
13:
Lymphonodi tracheobrochales
sinistri
14:
Lymphonodi tracheobrochales
dextri
15:
Lymphonodi tracheobrochales
medii
(aus WAIBL 1999, S. 268)
Abb. 2.1.a (nach WAIBL 1999, S. 268)
Abb. 2.1.b (nach WAIBL 1999, S. 268)
Abb. 2.1.a:
Aufbau der Schweinelunge (nach WAIBL 1999, S. 268)
Abb. 2.1.b:
Legende zu Abb. 2. 1.a (nach WAIBL 1999, S. 268)
Histologie
LIEBICH u. ZENGERLING (2010, S. 265-267) berichten, dass die Lunge bei den
Haussäugetieren außen von einer Kapsel (Pleura visceralis) umschlossen wird, die
ein einschichtiges, flaches bis isoprismatisches Epithel und eine unregelmäßig dicke
Lage kollagener und elastischer Fasen enthält. Davon ausgehend laufen
Bindegewebssepten zusammen mit Blutgefäßen und Nerven ins Organinnere und
gliedern als beim Schwein deutlich ausgebildetes, interstitielles Bindegewebe die
Lunge in Lappen und Läppchen (LIEBICH u. ZENGERLING 2010, S. 265-267).
18
Literaturübersicht
Den innerhalb der Lunge liegenden, luftleitenden Abschnitten fallen ca. 6 % des
Lungenvolumens zu, den respiratorischen Abschnitten hingegen rund 85 % (LIEBICH
u. ZENGERLING 2010, S. 265).
Luftleitendes System
LIEBICH u. ZENGERLING (2010, S. 267) beschreiben, dass die innere Oberfläche
der Bronchien bei den Haussäugetieren von einem respiratorischen Flimmerepithel
mit Becherzellen ausgekleidet wird, die Epithelhöhe wird dabei nach distal laufend
kontinuierlich geringer. Die Lamina propriae mucosae ist mit gemischten Drüsen,
Blut- und Lymphgefäßen, Nerven, Solitärlymphknötchen und lockerem Bindewebe
(kollagene, aber vor allem elastische Fasern) ausgestattet. Sich daran anlegend folgt
eine Schicht glatter Muskulatur und hyalinem Knorpelparenchym (je nach
Aufzweigungsgrad
Knorpelspangen
bis
Knorpelfragmente)
(LIEBICH
u.
ZENGERLING 2010, S. 267).
Im Weiteren wird von LIEBICH u. ZENGERLING (2010, S. 269) genannt, dass
abschließend bei den Haussäugetieren eine bindegewebige Tunica adventitia mit
Gefäßen und Nerven folgt. Das Lumen der Bronchioli wird von einem mehrreihigen,
hochprismatischen Flimmerepithel ausgekleidet. Dieses wird morphologisch mit
zunehmender
Aufzweigung
mehrreihig,
isoprismatisch
bis
einschichtig,
isoprismatisch in den Bronchioli terminales. In bevorzugt kleineren Bronchioli finden
sich auch hochprismatische Zellen ohne Zilien (Clara-Zellen). Im Grundaufbau der
Bronchioli sind Drüsen und knorpelige Strukturen gänzlich nicht vorhanden, eine
kräftige Tunica muscularis aus mehreren Lagen vorrangig zirkulär angeordneter
glatter Muskelzellen ist deutlich ausgeprägt (LIEBICH u. ZENGERLING 2010, S.
269).
Respiratorisches System
LIEBICH u. ZENGERLING (2010, S. 270) stellen dar, dass histologisch die beim
Schwein selten vorkommenden Bronchioli respiratorii überwiegend den Bronchioli
terminales gleichen. Die Bronchioli respiratorii sind bei den Haussäugetieren mit
19
Literaturübersicht
tiefen Ausbuchtungen, ausgekleidet mit einem flachen Alveolarepithel, ausgestattet.
Aus den terminalen Bronchioli respiratorii zweigen sich bis zu zehn Alveolargänge ab
(LIEBICH u. ZENGERLING 2010, S. 270).
LIEBICH u. ZENGERLING (2010, S. 270) weisen darauf hin, dass die Alveolargänge
mit ihren Nischen aus einschichtigem Plattenepithel (Alveolarepithel) von außen von
einem Netz aus kollagenen und vor allem elastischen Fasern umfasst werden,
zusätzlich findet man glatte Muskelzellen. Durch drei- bis fünffache Aufzweigung der
Alveolargänge entwickeln sich die Endabschnitte des respiratorischen Systems: die
Alveolarsäckchen (Sacculi alveolares). Die Lungenbläschen (Alveoli pulmonis)
kleiden die Bronchioli respiratorii, die Ductus und Sacculi alveolares als
säckchenförmige Ausstülpungen aus (LIEBICH u. ZENGERLING 2010, S. 270).
Die mittels stereologischer Methoden ermittelte Anzahl der Alveolen beträgt beim
Menschen ca. 480 Millionen, ein mm³ Lungenparenchym beeinhaltet folglich ca. 170
Alveolen (OCHS et al. 2004).
LIEBICH u. ZENGERLING (2010, S. 270) erörtern, dass das die Alveolen
auskleidende Alveolarepithel bei den Haussäugetieren
aus zwei Zelltypen:
Alveolarepithelzellen Typ I (AE I) und AE II besteht. Die AE I sind als dünne,
abgeplattete Deckzellen für ca. 95 % der Innenauskleidung der Alveolaroberfläche
verantwortlich. Als Bestandteil der Blut-Luftschranke liegen sie der Basalmembran
an. AE II sind wesentlich größere Zellen (etwa 10-12 µm) und befinden sich als kleine
Gruppen in den Alveolarnischen (LIEBICH u. ZENGERLING 2010, S. 270).
Als Charakteristikum der AE II sind die Lamellenkörper zu sehen, die dicht gepacktes
phospholipidreiches Material (intrazellulärer Surfactant) enthalten (LIEBICH u.
ZENGERLING 2010, S. 271). AE II sind für die Produktion, Sekretion,
Wiederaufnahme und Recycling des Surfactants verantwortlich (JOBE u. RIDER
1992).
Eine vergleichende Studie von WIRKES et al. (2010) zum intrazellulären
Surfactantsystem
bei
verschiedenen
Säugetieren
(Etruskische
Spitzmaus,
Meerschweinchen, Mensch, Rind, Pferd, Kamel, Giraffe, Kaninchen, Hund, Ziege,
Ratte und Maus) zeigt, dass das mittlere Volumen der AE II 500-600 µm3 und das
20
Literaturübersicht
mittlere Volumen der Lamellenkörper je AE II 80-100 µm3 bei den meisten Spezies
beträgt und nur bei der Etruskischen Spitzmaus, Meerschweinchen und beim
Menschen etwas höher liegt. Das mittlere Volumen der AE II stellte sich folglich
unabhängig vom Körpergewicht dar. Das Gesamtvolumen der Lamellenkörper und
die Anzahl der AE II waren mit dem Körpergewicht korreliert, was eine allometrische
Relation bedeutet (WIRKES et al. 2010).
Eine Zellteilung und Transformation von AE II zu AE I bei Verletzungen des
Alveolarepithels ist beim Menschen möglich (WELSCH u. DELLER 2010, S. 281).
LIEBICH u. ZENGERLING (2010, S. 271) erklären, dass die benachbarte
gemeinsame Wand zweier Alveolen (Septum interalveolare) beidseitig von AE I und II
bedeckt wird, die Alveolarepithelzellen liegen ihrerseits einer dünnen Basalmembran
auf.
Zusätzlich
ist
subepithelial
eine
bindegewebige
Grundlage,
das
Lungeninterstitium, mit dichtem Kapillarnetz vorhanden (LIEBICH u. ZENGERLING
2010, S. 271).
Zusammenfassend dient folglich als Blutluftschranke: Surfactant auf der Oberfläche
der
Alveolarepithelzellen,
Alveolarepithels,
die
das
Zytoplasma
Basalmembran
und
und
die
Zytoplasma
Basalmembran
des
des
der
Endothels
Kapillarwand, das Blutplasma und die Plasmalemm der Erythrozyten (LIEBICH u.
ZENGERLING 2010, S. 271).
2.2
Surfactant
2.2.1
Aufbau, Funktion und Synthese
Das pulmonale Surfactant setzt sich aus ca. 90 % Lipiden, vor allem dem
Dipalmitoyl-Phosphatidylcholin
(DPPC),
und
ca.
10%
Proteinen
zusammen
(COCKSHUTT u. POSSMAYER 1992, S. 340).
Zu den Proteinen zählen die Surfactantproteine (SP) A, B, C und D (COCKSHUTT u.
POSSMAYER 1992, S. 342). Die hydrophoben SP B und C haben biophysikalische
Eigenschaften (COCKSHUTT u. POSSMAYER 1992, S. 343-344). Eigenschaften der
Erregerabwehr sind vor allem SP A (VAN IWAARDEN et al. 1990; VAN IWAARDEN
et al. 1991; VAN IWAARDEN 1992; VAN IWAARDEN et al. 1992 a) und D (VAN
21
Literaturübersicht
IWAARDEN et al. 1992 b; HERBEIN u. WRIGHT 2001) zuzusprechen (ausführlich
dargestellt in CROUCH und WRIGHT 2001; WRIGHT 2005).
Das sezernierte Surfactant kleidet die intraalveoläre Oberfläche komplett aus, setzt
als
oberflächenaktive
Substanz
die
Oberflächenspannung
an
der
Luft-
Flüssigkeitsgrenze im Inneren der Alveolen um das fünf bis zehn-fache herab
(LIEBICH u. ZENGERLING 2010, S. 271), verhindert ein Kollabieren der Alveolen
(CLEMENTS 1997; ENHORNING u. HOLM 1993) und trägt somit zur alveolären
Stabilität bei (CLEMENTS et al. 1961).
Dieses hochgradig oberflächenaktive Material ermöglicht zudem eine leichte
Erweiterung der Alveolen während der Einatmung (GRIESE 1999).
Die
Surfactanproteine
werden
via
Transskription,
Translation
am
rauhen
endoplasmatischen Retikulum (rER) und posttranslationaler Modifikation vorwiegend
am Golgi-Apparat und teilweise auch in den multivesikulären Körperchen in den AE II
produziert und modifiziert (MÜHLFELD u. OCHS 2010, S. 4).
Vor der Exozytose wird der Großteil aller intrazellulärer Surfactantkomponenten in
den Lamellenkörpern der AE II (OCHS 2010), die nahezu zu den Lysosomen
identische, hydrolytische Eigenschaften aufweisen (HOOK u. GILMORE 1982),
zusammengesetzt und gelagert (OCHS 2010). Als Unterschied zu „echten“
Lysosomen
besitzen
die
Lamellenkörper
eher
eine
Speicherungs-
und
Sekretionsfunktion als dass sie am Abbau von Strukturen beteiligt sind (WEAVER et
al. 2002).
WEAVER et al. (2002) erörtern, dass die Lamellenkörper (Größe: 1-2 µm)
endozytotisch bei saurem pH-Wert (5,5) aktiv sind. Die Phospholipide in den
Lamellenkörpern sind dicht gepackt und in konzentrischen membranartigen Blättern
angeordnet. DPPC stellt die Hauptkomponente der zweischichtigen Blätter dar
(WEAVER et al. 2002), welches unter allen bekannten Phospholipiden am stärksten
oberflächenaktiv ist (VELDHUIZEN et al. 1998).
OCHS (2010) beschreibt, dass ausgehend von den AE II die Exkretion mittels
Exozytose in die wässrige Hypophase des Alveolarraumes erfolgt. Ein bestimmter
Surfactantsubtyp, der als Lamellenkörper-ähnliche Struktur angesprochen werden
kann, verbindet sich mit dem Surfactantprotein A unter Bildung eines gitterförmigen
22
Literaturübersicht
Komplexes, der als Tubuläres Myelin bezeichnet wird (OCHS 2010).
Man nimmt dabei an, dass sich SP-A in die äußeren Ecken des Gitters setzt
(VOORHOUT et al. 1991). Dieser Komplex ist vermutlich als Vorläufer des
Surfactantfilms zu sehen, von dem ausgehend nun der eigentliche Surfactantfilm
aufgebaut werden kann (HAWGOOD u. POULAIN 2001; OCHS 2010).
Sezerniertes Surfactant liegt in der Hypophase in Form von oberflächenaktiven
Vorstufen und oberflächeninaktiven Abbauprodukten vor (UEDA et al. 1994; GROSS
u. NARINE 1989 a). Unilamelläre Vesikel (ulv) sind als als „verbrauchte“ (GROSS u.
NARINE 1989 a) bzw. inaktive Surfactantsubtypkomponenten zu sehen, die in AE II
recycelt oder abgebaut werden oder von Alveolarmakrophagen aufgenommen und
abgebaut werden können (MÜHLFELD u. OCHS 2010, S. 4).
Die Surfactantsubtypen tubuläres Myelin (tb) und lamellenkörperartige Vesikel (lbl)
stellen sich hingegen als aktive Surfactantkomponenten dar (OCHS 2010). Durch
Dichtegradientenzentrifugation von intraalveolärem Surfactant, gewonnen aus BALF,
lassen sich small aggregates (SA) und large aggregates (LA) unterscheiden
(GROSS et al. 2000). SA enthalten die inaktiven Surfactantsubtypen, wie ulv
(GROSS u. NARINE 1989 a; OCHS et al. 2006), und LA die aktiven
Surfactantsubtypen wie lbl und tm (SCHMIEDL et al. 2003). Das Verhältnis von SA
zu LA (SA/LA ratio) spiegelt die biophysikalische Aktivität des intraalveolären
Surfactants wieder (OCHS 2010). So findet sich beim Ischämie/Reperfusioninduzierten Lungenschaden (OCHS 2010), Lungentransplantation (HOHLFELD et al.
1998) bzw. beim Akuten Atemnotsyndrom (VELDHUIZEN et al. 1995) eine
verschlechterte biophysikalische Funktion des Surfactants im Sinne einer erhöhten
SA/LA ratio.
2.2.2
Die Rolle des Surfactants im angeborenen Immunsystem
Die SP A und D gehören zu der Proteinfamilie der Kollektine, die dem angeborenen
Immunsystem zugeordnet sind (MÜHLFELD u. OCHS 2010, S. 3).
Die erste Etappe der Wirtsabwehr wird durch das angeborene Immunsystem
bewerkstelligt, dieses wirkt als Brücke bis die adaptive Immunreaktion greifen kann
23
Literaturübersicht
(HAAGSMANN et al. 2008).
Es ist ein „phylogenetisch altes System“, das mit Keimbahn-kodierten Proteinen, wie
den Lysozymen, Kollektinen und dem Komplementsystem arbeitet (WRIGHT 2004).
Zusätzlich sind noch physikalische Komponenten der Wirtsabwehr, wie die
Epithelbarrieren im Respirationstrakt und die mukoziliäre Clearance, zu erwähnen
(ROHMANN et al. 2011).
Als Zellfraktionen des angeborenen Immunsystems gelten Dendritische Zellen,
Epithelzellen, Basophile und Eosinophile Granulozyten, Natürliche Killerzellen und
Mastzellen sowie die phagozytierenden Zellen wie Neutrophile Granulozyten,
Monozyten und Makrophagen (ROHMANN et al. 2011).
Da das adaptive Immunsystem bei Neugeborenen noch nicht ausgebildet ist, ist das
angeborene Immunsystem besonders wertvoll (HAAGSMANN et al. 2008).
WRIGHT (2004) erklärt, dass die Kollektine eine N-terminale, kollagenartige-Region
und eine C-terminale Lektin-Domäne besitzen. Die Lektin-Domäne ist für den
Bindungsvorgang mit wirtsfremden Oligosacchariden auf der Oberfläche von
Krankheitserregern (Bakterien und Viren) verantwortlich (WRIGHT 2004).
Dieser Vorgang ist auch als Opsonisierung bekannt, da die Aufnahme durch
Phagozyten erleichtert wird (VAN IWAARDEN et al. 1991; WRIGHT 2004).
Eine Studie mit SP-A defizienten Mäusen zeigte nach einstündiger, intratrachealer
Infektion mit Pseudomonas aeruginosa eine wesentlich geringere bakterielle
Elimination (Phagozytose durch Makrophagen) als der Wildtyp (LEVINE et al. 1998).
WRIGHT (2004) nennt, dass in in vitro Studien die Aktivität vieler Zellen des
Immunsystems
durch
Kollektine
vermittelt
wird,
obwohl
ein
genauer
Wirkmechanismus häufig nicht klar ist. Phagozytose, Chemotaxis, Zytokinregulation
und die Bildung freier Sauerstoffradikale durch verschiedenste Abwehrzellen werden
durch SP-A und SP-D beeinflusst (WRIGHT 2004).
Des Weiteren konnte bei SP-A und SP-D eine antimikrobielle Wirkung (Hemmung
des Wachstums von bestimmten gramnegativen Bakterien) belegt werden (WU et al.
2003).
HAAGSMANN et al. (2008) erklären, dass Kollektine grundsätzlich mit zahlreichen
Bakterien reagieren, wobei bei gram-negativen Bakterien die Lipopolysaccharide der
24
Literaturübersicht
Membranen einen Hauptangriffspunkt darstellen. Bei gram-positiven Bakterien sind
als Hauptangriffspunkte die Lipoteichonsäuren und Peptidoglykane zu nennen
(HAAGSMANN et al. 2008).
GIANNONI et al. (2006) wiesen in einer Studie bei Mäusen darauf hin, dass SP-A
und SP-D die Elimination von Pseudomonas aeruginosa aus dem Lungenparenchym
verstärken. Dies geschieht durch eine modulierte Entzündungsreaktion und einer
stimulierten Aufnahme durch Alveolarmakrophagen (GIANNONI et al. 2006).
Auch die adaptive Immunantwort (T-Lymphozyten und Dendritische Zellen) wird
durch Kollektine (SP A und D) beeinflusst (WRIGHT 2004).
Des
Weiteren
ist
auch
den
Surfactantlipiden
eine
immunologische
Rolle
zuzusprechen: sie verstärken Phagozytose und Erregerelimination, modifizieren die
Bildung freier Radikale und Lymphozytenproliferation (WRIGHT 1997).
2.2.3
Surfactantdysfunktion
Einer der Gründe für die Entstehung einer
Surfactantdysfunktion
ist die
Ausschwitzung von Plasmaproteinen in den Alveolarraum (SEEGER et al. 1993 a;
PARK et al. 1998; KEOUGH et al. 1988; CURRIE et al. 1998 a). Des Weiteren findet
man bei pathologischen Prozessen wie Asthma von eosinophilen Granulozyten
freigesetzte, zytotoxische Proteine wie das eosinophilic cationic protein (ECP)
(BOUSQUET et al. 1990; HOHLFELD et al. 2004), für das auch ein deutlicher
Zusammenhang zur Surfactantinaktivierung gezogen werden konnte (HOHLFELD et
al. 2004).
SCHMIEDL et al. (2004) zeigten in diesem Zusammenhang, dass eine Mischung von
Alveofact®, einem exogenen natürlichen bovinen Surfactant, mit ECP eine
signifikante Größenreduktion der aktiven Surfactantsubtypen und einen signifikanten
Anstieg der Volumenfraktion der inaktiven Surfactantsubtypen bewirkt (SCHMIEDL et
al. 2004).
Diese Verschiebung von aktiven zu inaktiven Surfactant-Subtypen konnten auch in
anderen Studien im Rahmen von akutem Lungenschaden und Lungentransplantation
(MAITRA et al. 2002) und Akutem Atemnotsyndrom (VELDHUIZEN et al. 1995)
25
Literaturübersicht
gezeigt werden.
ENHORNING (2008) erklärt, dass Plasmaproteine nur schwach hydrophob und
potenziell überall im Flüssigkeitsfilm der Atemwege vorhanden sind. Sie sind bei der
Exspiration nur geringgradig an den Surfactantfilm adhäriert und verhindern
dennoch, dass die amphiphilen Phospholipide näher zusammen rücken, wodurch die
Oberflächenspannung physiologischer Weise gesenkt werden würde (ENHORNING
2008).
In der Studie von CURRIE et al. (1998 b) mit Ozon ausgesetzten Mäusen zeigte sich
eine signifikante Verschlechterung der Surfactantfunktion. Nach Entfernung der
wasserlöslichen Proteine und anderer Substanzen stellte sich die Funktionalität
wieder ein (CURRIE et al. 1998 b).
Eine verschlechterte Surfactantfunktion zeigte sich auch in den Versuchen von VAN
SCHAIK et al. (1997) mit Mäusen, die mit dem Respiratorischen Synzytial Virus
infiziert worden waren, wobei hier die eingedrungenen Proteine nicht als einzige
Ursache für eine reduzierte Funktion diskutiert wurden. Es wurde auch die Hydrolyse
von Surfactantbestandteilen durch Mediatoren von Entzündungszellen diskutiert
(VAN SCHAIK et al. 1997).
Bei menschlichen Asthmapatienten zeigte sich ein ähnliches Bild: die BALF wies eine
deutlich bessere Funktion nach Entfernung der wasserlöslichen Inhibitoren (Proteine
und andere Substanzen) auf (JARJOUR u. ENHORNING 1999).
Eine Studie von WRIGHT et al. (2001) ergab nach Infektion von Mäusen mit
Pneumocystis
carinii
erhöhte
Oberflächenspannungen
und
erhöhte
Protein-
Phospholipid-Verhältnisse in der BALF (WRIGHT et al. 2001).
Bei asthmatischen Brown Norway Ratten konnte in der Studie von SCHMIEDL et al.
(2003) gezeigt werden, dass sowohl die minimale Oberflächenspannung als auch die
Lungenresistance signifikant erhöht war. Des Weiteren waren die inaktiven
Surfactantsubtypen stärker vertreten, was eine gesteigerte Konversion von aktiven
zu inaktiven Surfactantsubtypen nahelegte. Eine Interaktion zwischen Proteinen und
Konvertase oder eine Inaktivierung von SP-A wurden diskutiert. Ursächlich können
dafür entzündungsbedingte proteinreiche Exsudate sein (SCHMIEDL et al. 2003).
26
Literaturübersicht
2.2.4
Die Rolle des Surfactants bei spezifischen Erkrankungen des
Menschen bzw. in der tierexperimentellen Grundlagenforschung
Asthma (vgl. Abb. 2.2)
JARJOUR u. ENHORNING (1999) beschreiben, dass bei Patienten mit Asthma die
Surfactantdysfunktion
wahrscheinlich
primär
durch
die
Entzündungsreaktion,
verknüpft mit dem Einströmen von Plasmaproteinen in den Alveolarraum, ausgelöst
wird.
Diese Proteine schädigen massiv die oberflächenaktiven Eigenschaften des
Surfactants (JARJOUR u. ENHORNING 1999). Als zukünftiger, therapeutischer
Ansatz wäre die Hydrolyse dieser Proteine ohne eine Schädigung der Epithelien der
Lunge anzustreben (ENHORNING 2008).
In einer Studie von HOHLFELD et al. (1999 a) kam es 24 Stunden nach der
Allergenexposition von Asthmapatienten zu einem signifikanten Anstieg der
eosinophilen Granulozyten, der Proteine, der SA/LA ratio und der minimalen
Oberflächenspannung in der BALF. Hier wird eine stärkere Konversion der LA zu SA
vermutet. Bei Asthmapatienten sind die SP-A Level reduziert, so dass eine
abgeschwächte
Wirkung
des
SP-A
auf
die
Konversion
der
aktiven
Surfactantsubtypen zu erwarten ist. Auch an dieser Stelle wurden ursächlich
Entzündungsproteine
und
andere
inflammatorische
Produkte
angenommen
(HOHLFELD et al.1999 a).
Untersuchungen von ENHORNING et al. (2000) erörtern die Effekte einer
verringerten Temperatur auf die Surfactantfunktion, die zusätzlich durch entzündliche
Prozesse beeinflusst wird. Daraus ließe sich eine mögliche Ursachenerklärung für
den
erhöhten
Widerstand
in
den
Atemwegen
bei
Hyperventilation
Asthmapatienten bei kaltem Wetter ableiten (ENHORNING et al. 2000).
27
von
Literaturübersicht
Abb. 2.2: Surfactant bei belastungsinduziertem Asthma (Abbildung modifiziert nach
ENHORNING et al. 2000), Schwarze Linien: Mechanismen, die die Atemwegsobstruktion
verursachen, gestrichelte Linien: Mechanismen, die die Atemwegsobstruktion mildern (ENHORNING
et al. 2000)
Atemnotsyndrom des Erwachsenen (Adult Respiratory Distress Syndrome, ARDS)
bzw. tierexperimentelle Studien in diesem Rahmen
HAMM et al. (1996) subsummieren, dass beim Atemnotsyndrom des Erwachsenen
verschiedenste Ätiologien beschrieben worden sind: Traumata, Verbrennungen,
akute Pankreatitis; Sepsis, Pneumonie, etc. Der Gasaustausch in den Alveolen ist
akut, diffus und hochgradig gestört, was sich in einem respiratorischen Versagen
manifestiert. Auch bei der Pathogenese dieser Erkrankung spielen Veränderungen im
Surfactantsystem eine bedeutende Rolle (HAMM et al. 1996).
28
Literaturübersicht
Eine
Störung
der
Surfactantfunktion
(Erhöhung
der
minimalen
Oberflächenspannung) und eine veränderte Zusammensetzung der Phospholipide
sind in verschiedenen Tiermodellen bspw. beim Hund (LIAU et al. 1987) oder bei
Meerschweinchen (TAHVANAINEN und HALLMANN 1987) diskutiert worden
(ausführlich dargestellt in HAMM et al. 1996).
LEWIS et al. (1994) lösten beim Schaf einen Septikämie-bedingten akuten
Lungenschaden aus, der zu einer Erhöhung der SA/LA-Ratio und zu einer Reduktion
der SP A, B und C führte (LEWIS et al. 1994).
Lungentransplantation/ Ischämie/Reperfusion-induzierter Lungenschaden
Der Ischämie/Reperfusion-induzierte Lungenschaden kann in schweren Fällen nach
Lungentransplantation zu einem Transplantatversagen führen (DE PERROT et al.
2003), was entsprechende Mortalitäten (CHRISTIE et al. 2005) bedingt. Unter
anderen Ursachen führen mechanische Ventilationen, Pneumonien, Hypotensionen
und Traumata zum Ischämie/Reperfusion-induzierten Lungenschaden (DE PERROT
et al. 2003).
Eine Studie von CASALS et al. (1998) belegt in Lungentransplantationsversuchen
bei Hunden eine signifikant erniedrigte SP A Konzentration und erhöhte
Konzentrationen von C-reaktivem Protein (ein Akute- Phase- Protein) nach
Reperfusion (CASALS et al. 1998).
HOHLFELD et al. (1998) zeigten, dass die SA/LA ratio bei Patienten mit Transplantat
signifikant höher und die Oberflächenaktivität signifikant niedriger war als bei
gesunden Probanden. Die biophysikalischen Beeinträchtigungen des Surfactants
schienen zu persistieren, was eine funktionelle Beeinträchtigung der AE II als
Ursache haben könnte (HOHLFELD et al. 1998).
HAMM et al. (1996) subsummierten einen Zusammenhang zwischen der
verschlechterten Funktion der AE II nach Lungentransplantationen und der
Ischämiezeit. Eine Surfactantsubstitution könnte die Funktion der AE II nach
Lungentransplantationen durch eine Feedbackhemmung erhalten (HAMM et al.
1996).
29
Literaturübersicht
Eine tierexperimentelle, transplantationsassoziierte Studie von KNUDSEN et al.
(2011) zeigte, dass nach Ischämie und Reperfusion die Lamellenkörper in den AE II
zwar signifikant reduziert, aber vergrößert waren. Dies könnte auf eine gesteigerte
Neusynthese oder ein verstärktes Recycling von inaktiven Surfactantkomponenten
hinweisen. Eine vermehrte Exozytose von Lamellenkörpern in die Alveole wurde
vermutet, die den Verlust an intraalveolärem Surfactant zu kompensieren vermochte
(KNUDSEN et al. 2011).
Auch die Studie von MÜHLFELD et al. (2010) zum Ischämie/Reperfusion-induzierten
Lungenschaden bei Ratten zeigte einen Anstieg der inaktiven Surfactantsubtypen
nach Ischämie/Reperfusion (Ratten ohne exogene Surfactantbehandlung), jedoch
nicht bei mit exogenem Surfactant behandelten Ratten. Korreliert war das Auftreten
der inaktiven Surfactantsubtypen mit einer herabgesetzten Oxygenierung und einer
Bildung von intra-alveolären Ödemen. Hintergrund der Studie war die Frage, in wie
weit eine exogene Surfactanapplikation den endogenen Surfactantpool beeinflusst.
Die Hypothese war, dass sich eine prä-ischämische exogene Surfactantsubstitution
vor allem auf die Stabilisierung und Erhöhung des aktiven, endogenen intraalveolären Surfactantpool auswirkt. Ödembildung und Schäden an der BlutLuftschranke könnten dadurch reduziert werden (MÜHLFELD et al. 2010).
In einer vorangegangenen Studie von MÜHLFELD et al. (2009) wurde bereits
gezeigt, dass bei Ratten im Falle des durch Ischämie/Reperfusion induzierten
Lungenschadens die prä-ischämische, exogene Surfactantgabe die Bildung von
intraalveoläre Ödemen und den Schaden an der Blut-Luftschranke mildern könnte
(MÜHLFELD et al. 2009).
Als weiterer therapeutischer Ansatz wird auch eine Kombinationstherapie aus
exogenem Surfactant und Keratinozyten-Wachstumsfaktor (Palmiferin, ΔN23-KGF)
im Rattenmodell in Erwägung gezogen (SADOVSKI et al. 2008; MÜHLFELD et al.
2010).
Durch Therapie mit Keratinozyten Growth Factor (Palmiferin, ΔN23-KGF) vor der
Lungenexplantation kann die intraalveoläre Ödembildung nach einer Transplantation
signifikant reduziert werden (SADOVSKI et al. 2008).
30
Literaturübersicht
In einer tierexperimentellen Studie mit Schweinen von INCI et al. (2011) diente
Surfactant
der
Beurteilung
der
Qualität
des
Lungenparenchyms
für
eine
Transplantation nach Herztod. Mittelfristig kann die Nutzung der Surfactantqualität
als Marker möglicherweise den Spenderpool erhöhen. In dieser Studie zu
Surfactantalterationen nach Herztod wurde bei Hausschweinen belegt, dass nach
zwei Stunden warmer Ischämiezeit die BALF- Proteinkonzentration und die
Oberflächenspannung
signifikant
erhöht
waren
und
die
Sauerstoffsättigung
signifikant niedriger war (INCI et al. 2011).
2.3
Surfactant bei Tieren
In den Ausführungen von BERNHARD et al. (2004) wird erläutert, dass die Strömung
der Luft grundsätzlich bei Säugetieren während des Atmungsvorgangs in zwei
Richtungen erfolgt, wird allerdings in den peripheren Strukturen, wie bspw.
Bronchiolen und Alveolen, herabgesetzt. Kleine Partikel (<1 µm) können dadurch die
Bronchiolen passieren und sich in den Alveolen absetzen, so dass eine erste Phase
der Wirtsabwehr durch v.a. Alveolarmakrophagen, SP-A und (Phospholipid-)
Regulatoren, wichtig ist. Beim Vogel dagegen bleibt die Luftströmung durch
Parabronchen, Atria und die gaswechselnden Kapillaren konstant und kontinuierlich
während der In- und Exspiration. Gewährleistet wird dies einerseits durch das
konstante
Öffnen
und
Schließen
des
Klappensystems
zwischen
Mesobronchen/Luftsäcken und Parabrochen und andererseits durch einen während
der In- und Exspiration wechselnden cranio-caudalen Druckgradienten (BERNHARD
et al. 2004).
BERNHARD et al. (2001 a) erklären, dass die Oberflächenspannung von
Säugersurfactant sich von Vogelsurfactant beträchtlich unterscheidet. Während beim
Schwein minimale Oberflächenspannungen von kleiner 5 mN/m unter dynamischer
Kompression erreicht werden, sind diese bei Lungen von Enten und Hühnern
aufgrund ihres tubulären Aufbaus wesentlich höher (BERNHARD et al. 2001 a).
Die Studie von BERNHARD et al. (2001 a) zeigte auch, dass der Surfactantsubtyp
tm im Surfactant von Enten und Hühnern gänzlich fehlte. Des Weiteren konnten SP-A
31
Literaturübersicht
und SP-C im Surfactant von Enten und Hühnern nicht nachgewiesen werden,
während SP-B in etwa gleichen (Huhn) oder in höheren Konzentrationen (Ente) als
beim Schwein vorkamen (BERNHARD et al. 2001 a).
BERNHARD
et
al.
(2004)
erklären,
dass
SP-B
u.a.
für
eine
schnelle
Oberflächenadsorption des Surfactant wichtig ist und daher sowohl in Säuger- als
auch in Vogellungen benötigt wird. Für die geringe Oberflächenspannung in den
Alveolen und einer Reintegration von Phospholipiden in den Surfactantfilm nach
starker Kompression ist SP-C verantwortlich. Solche Vorgänge sind in der rigiden,
tubulären Vogellunge von untergeordneter Bedeutung (BERNHARD et al. 2004).
Allerdings merkt ZENG et al. (1998) an, dass SP A in den Epithelzellen der
Mesobronchien von Hühnerküken (Tag 3 nach Schlupf) nachweisbar war. In den
Epithelzellen der peripheren Luftwege (inklusive Parabronchien und Luftkapillaren)
konnte SP A jedoch nicht detektiert werden. Die Studie sah darin einen Hinweis, dass
SP A für die Lagerung, Verarbeitung und Funktion von Surfactant in Vogellungen
nicht wesentlich ist (ZENG et al. 1998).
Auf elektronenmikroskopischer Ebene stellt sich lavagierter Surfactant von Enten und
Hühnern als oligo- und multilamelläre Struktur dar, während porziner Surfactant
Lamellenkörper, amorphes und granuläres Material und tm aufweist (BERNHARD et
al. 2001 a).
Eine kalifornisch-deutsche Studie von SPRAGG et al. (2004) berichtet, dass die
BALF von Flossenfüßern signifikant höhere Phospholipidkonzentrationen und einen
höheren Phosphatidylcholinanteil hat, wodurch die Reexpansion der Alveolen nach
Tieftauchgängen optimiert wird. Gelelektrophoretische Messungen ergaben bei
Elefantenseelöwen im Vergleich zum Menschen signifikant höhere Konzentrationen
an SP-B. Zu berücksichtigen ist jedoch, dass bei Meeressäugern nur die cranialen
Lungenlappen lavagiert werden konnten. Die LA Surfactantfraktion und die SP-B und
-C liegen in höheren Konzentrationen bei Elefantenseelöwen und kalifornischen
Seelöwen als beim Menschen vor. Die LA Fraktion trägt mit ihren aktiven
Surfactantsubtypen
maßgeblich
zur
Oberflächenspannungsreduktion
bei.
Die
minimale Oberflächenspannung ist allerdings beim Elefantenseelöwen signifikant
größer als bei anderen Flossenfüßern und beim Menschen. Erklärend könnte ein
32
Literaturübersicht
höherer Anteil an Neutralfetten genannt werden (SPRAGG et al. 2004).
Summa summarum lassen sich bei den verschiedenen Vertebratenspezies und
während
der
postnatalen
Entwicklung
Anpassungsprozesse
bezüglich
der
Zusammensetzung des Surfactants erkennen, die durch die anatomischen und
physiologischen Begebenheiten vorgegeben werden (SPRAGG et al. 2004).
POSTLE et al. (2001) subsummierten, dass einfach ungesättigte, anionische
Phospholipide ein gemeinsames Merkmal von Säugetiersurfactant sind. Untersucht
wurde Surfactant vom Menschen und von verschiedenen Tierarten wie Kaninchen,
Meerschweinchen und Ratten (POSTLE et al. 2001).
2.4
Surfactant beim Schwein
Die Studie von BERNHARD et al. (1997) belegt, dass Surfactant der luftleitenden
Atemwege
(Trachealaspirate)
beim
Schwein
ähnliche
Phospholipid-
und
Phosphatidylcholinkonzentrationen wie Surfactant aus BALF zeigt, was darauf
hinweist, dass auch trachealer Surfactant aus den Alveolen stammt. In den porzinen
Trachealaspiraten sind höhere minimale und maximale Oberflächenspannungen als
in der BALF zu verzeichnen. Im Gegensatz dazu findet man in Pharyngealaspiraten
menschlicher, neugeborener Säuglinge große Mengen an oberflächenaktiven
Surfactants. Beim Schwein wurden die SP-B und C nicht und SP-A nur in geringen
Konzentrationen im porcinen, trachealen Surfactant nachgewiesen, wobei der
Gesamtproteingehalt erhöht war. Surfactant der luftleitenden Wege könnte bei der
mukoziliären Clearance eine wichtige Rolle spielen. Es wird vermutet, dass
reduzierte oberflächenaktive Eigenschaften bei einer pathologisch-veränderten
mukoziliären Clearance mit chronisch-eitrigen Prozessen im Zusammenhang stehen
(BERNHARD et al. 1997).
SOERENSEN et al. (2005) zeigten, dass bei Schweinen mit akuter und chronischer
Bronchopneumonie eine höhere SP-D- Immunreaktivität im Surfactant vorkommt und
dass SP-D in bronchusassoziiertem, lymphatischem Gewebe mit Dendritschen
Zellen interagierte. SP-D wird daher als Schnittstelle zwischen angeborenem und
erworbenem Immunsystem eingestuft (SOERENSEN et al. 2005).
33
Literaturübersicht
In einer umfassenden Studie von NIENHOFF (1998) wurde die BALF von
Kontrollschweinen und Schweinen mit akuten Pneumoniesymptomen untersucht. Die
Alkalische Phosphatase war bei den erkrankten Schweinen signifikant erhöht, die
Laktatdehydrogenase und die Proteinkonzentrationen wiesen keine signifikanten
Unterschiede auf (NIENHOFF 1998).
Eine deutsch-niederländische Studie von RAU et al. (2004) unterstreicht die bessere
Oberflächenaktivität des Surfactants neugeborener Saugferkel im Vergleich zu
älteren Schweinen.Bei den Saugferkeln konnten erhöhte Konzentrationen an SP-B,
C und Phospholipiden (Phosphatidylcholin 16:0/14:0 bzw. 16:0/16:1) nachgewiesen
werden. Mit zunehmendem Alter kam es zu einem Rückgang der Phosphatidylcholin16:0/16:0-Konzentationen.
Dieses
Phospholipid,
DPPC,
stellte
unter
den
Surfactantphospholipiden die bedeutendste Substanz dar, die die minimale
Oberflächenspannung in der Endexspiration minimiert. Eine hohe Konzentration an
Arachidonsäurehaltigen-Phospholipiden im Surfactant der Saugferkel stimulierte den
alveolären Eicosanoidmetabolismus. Grundsätzlich zeigte die Studie an Schweinen
unterschiedlichen Alters eine Anpassung auf molekularer Ebene an die sich
ändernden, respiratorischen Begebenheiten während der Lungenentwicklung (RAU
et al. 2004).
Im Minipig-Modell von HOHLFELD et al. (1999 b) wiesen nach Ischämie und
Reperfusion der linken Lunge Schweine ohne exogene Surfactantbehandlung eine
deutlich höhere SA/LA ratio und höhere minimale Oberflächenspannungen im
Surfactant auf. Reperfusionsbedingt kam es als Folge der Störung der Funktion des
Kapillarendothels zu einem Einstrom von Plasmaproteinen in den Alveolarraum.
Plasmaproteine wie Albumin, Fibrinogen und Hämoglobin wurden hauptsächlich für
die beeinträchtigte Surfactantfunktion verantwortlich gemacht (HOHLFELD et al.
1999 b).
Bei an Pneumonie erkrankten Schweinen in der Dissertation von DELBECK (1995)
war die Anzahl der neutrophilen Granulozyten mit der Gesamtzellzahl in der BALF
korreliert bzw. stieg mit dem Logarithmus der Gesamtzellzahl an. Erklärend wurde
hier die stark gehäufte Invasion von neutrophilen Granulozyten aus dem Blut
genannt (DELBECK 1995).
34
Literaturübersicht
Die Anzahl der polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten dient als sensitiver
Marker zur Differenzierung von gesunden und lungenkranken Schweinen (GANTER
u. HENSEL 1997).
2.5
Erkrankungen des Respirationstrakts beim Schwein
Im Jahr 2011 wurden in Deutschland rund 59,7 Millionen Schweine geschlachtet, was
einer Schweinefleischerzeugung von
etwa
5,6
Millionen Tonnen
entspricht
(STATISTISCHES BUNDESAMT 2013).
Folglich
führen
Erkrankungen
zu
massiven
wirtschaftlichen
Verlusten,
die
Verbraucherschutz und die wirtschaftliche Existenz gefährden (HENNIG-PAUKA
2007).
In einer spanischen Studie von CASAL et al. (2007) setzten rund 58 % der
untersuchten Betriebe
(n=62) antimikrobielle
Substanzen
prophylaktisch bei
Mastschweinen ein. 26 % der Farmen verwendeten mindestens zwei Wirkstoffe. 92
Farmen gaben unter tierärztlicher Anleitung bei respiratorischen Symptomen
Antibiotika ohne zuvor eine gesicherte Krankheitsdiagnose zu stellen (CASAL et al.
2007).
2.5.1
Porcine Respiratory Disease Complex (PRDC)
Es handelt sich um einen Erkrankungskomplex mit multiplen Infektionen des pozinen
Respirationstraktes, der ca. 6-24 Wochen alte Schweine betrifft (GROSSE-BEILAGE
et al. 2013, S. 235).
Stallklima (Temperaturschwankungen, hohe Luftfeuchte und Schadgaskonzentration
wie bspw. Kohlenstoffdioxid, Ammoniak und Methan), Management (Hygienstatus)
(Fütterung,
Herdengröße,
Haltungsbedingungen),
Genetik
und
bestehende
Erkrankungen beeinflussen den Erkrankungsfortschritt (WHITE 2011 a).
Genannte nicht-infektiöse Faktoren sind entscheidend für die Initialisierung der
Respirationserkrankung, ihnen gegenüber steht eine Vielzahl von viralen und
bakteriellen Erregern als infektiöse Agentien (OPRIESSNIG et al. 2011).
35
Literaturübersicht
Als virale Erreger sind das Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,
das Porzine Influenzavirus (H1N1, HN2, H1N2) und in einigen Ländern auch das
Porzine Herpesvirus 1 mit hoher Relevanz und bspw. das Porzine Circovirus Typ 2
mit geringerer Relevanz zu nennen (OPRIESSNIG et al. 2011). Als bakterielle
Erreger mit hoher Relevanz gelten Mycoplasma hyopneumoniae, A.pp., Bordetella
bronchiseptica, Actinobacillus suis und Salmonella spp. sowie Hämophilus parasuis,
Trueperella
pyogenes,
Mycoplasma
hyorhinis,
Pasteurella
multocida
und
Streptococcus suis mit eher untergeordneter Bedeutung (OPRIESSNIG et al. 2011).
Mycoplasma hyopneumoniae und das Porcine Reproductive and Respiratory
Syndrome Virus nehmen aufgrund ihrer Nachweishäufigkeit im Zusammenhang mit
dem PRCD eine Sonderstellung ein (THACKER et al. 1999).
Das klinische Bild ist dominiert durch Husten, angestrengter Atmung, Fieber,
Anorexie, Lethargie, Nasen- und Augenausfluss, Hautverfärbungen im Bereich der
Extremitäten, Gewichtsverlust, Todesfälle und letztlich verschlechterter Mastleistung
(WHITE 2011 b).
2.5.2
Porzine Pleuropneumonie
Verbreitung und Bedeutung
Grundsätzlich ist von einer weltweiten Verbreitung der Erkrankung auszugehen, die
eine beträchtliche wirtschafliche Relevanz hat (ZIMMERMANN u. PLONAIT 2004, S.
131).
In den letzen Jahren nimmt die Infektion mit A.pp. in Betrieben mit intensiver
Schweineproduktion eine zunehmende Rolle ein (HEINRITZI 2006, S. 144).
Im Jahr 1964 wurde in einer umfassenden Studie von R. Shope über die
experimentelle
Übertragung,
Ätiologie
und
Pathologie
der
ansteckenden
Lungenbrustfellseuche berichtet (SHOPE 1964).
Gemäß einer spanischen Studie lag bei etwa 27 % der Schlachtschweine eine
Pleuritis vor, die gemäß Scoring-System zu ca. 50 % auf eine A.pp. Infektion
zurückzuführen war (FRAILE et al. 2010).
Zunächst wurde das Bakterium als Hämophilus pleupneumoniae bezeichnet.
36
Literaturübersicht
Nachdem die DNA-Homologie zu Actinobacillus lignieresii bekannt wurde, wurde das
Bakterium in Actinobacillus pleuropneumoniae umbenannt (GOTTSCHALK 2012, S.
653).
Die infektionsbedingte Pneumonie bringt massive wirtschaftliche Konsequenzen mit
sich: eine schlechte Futterverwertung von chronisch infizierten Tieren und hohe
Kosten für Arzneimittel (STRAW et al. 1985), darunter Breitspektrumantibiotika
(SANFORD u. JOSEPHSON 1981) und eine erhöhte Mortalität (30- 50%) (QUINN et
al. 2002, S. 133).
Ätiologie und Pathogenese
A.pp., der Erreger der ansteckenden Lungen- und Brustfellentzündung des
Schweines (EWERS u. WIELER 2011, S. 229), ist ein gramnegatives, amotiles und
stäbchenförmiges Bakterium (EWERS u. WIELER 2011, S. 226). Taxonomisch
gehört es in die Familie der Pasteurellaceae (EWERS u. WIELER 2011, S. 221).
Die Nikotinamiddinukleotid (NAD) abhängigen Biovar-1 zugeordnete Stämme gelten
als virulenter als die NAD unabhängigen Biovar-2 zugeordneten (EWERS u. WIELER
2011, S. 229).
Eine Unterteilung erfolgt anhand der Serovare, Biovare und des Vorkommens von
ApX-Toxinen, es sind 15 Serovartypen bekannt (EWERS u. WIELER 2011, S. 229),
alle Serovare besitzen das Apx IV Toxingen(EWERS u. WIELER 2011, S. 228). Die
Serotypen (1, 5, 9, und 11) mit den Apx Toxingenen I und II und Serotyp 10 mit Apx I
zeigen eine stärkere Virulenz als andere Serovartypen(EWERS u. WIELER 2011, S.
229).
Es sind zahlreiche Virulenzfaktoren, wie Exotoxine, die Ausbildung einer Kapsel,
Lipopolysaccharide, Typ-4-Fimbrien und äußere Membranproteine, bekannt (EWERS
u. WIELER 2011, S. 228).
Als weitere bedeutsame virulenzfördernde Eigenschaft ist die Eisengewinnung aus
porzinem Hämin und Hämoglobin (ARCHAMBAULT et al. 2003), aus Hämoglobin
(BÉLANGER et al. 1995) und aus Transferrin (GERLACH et al. 1992) zu nennen
(ähnlich dargestellt in HENNIG-PAUKA 2007).
Für das Weiterleben nach Phagozytose in Makrophagen sind bspw. die
Kohlenwasserstoffbestandteile von Kapsel und Lipopolysacchariden, die freie
37
Literaturübersicht
Sauerstoffradikale binden, essentiell (EWERS u. WIELER 2011, S. 230).
Kapselpolysaccharide und/oder Lipopolysaccharide sind wesentliche Faktoren für die
Serumresistenz (EWERS u. WIELER 2011, S. 230).
Serotypendifferenzierung
erfolgt
mittels
Bestimmung
von
Kapsel-
und
Lipopolysacchariden (GOTTSCHALK 2012, S. 654). Die Oligosaccharidkernregion
der Lipopolysaccharide stellt einen wichtigen Adhäsionsfaktor für A.pp. an
Wirtszellen dar (GOTTSCHALK 2012, S. 656).
EWERS u. WIELER (2011, S. 228) beschreiben, dass die RTX-Toxine (repetitive
glyzinreiche
Sequenzen)
für
die
massive
Entzündungsreaktion
und
den
Gewebsschaden maßgeblich verantwortlich sind. Das Bakterium erzeugt je nach
Serotyp bis zu vier verschiedene RTX-Toxine (Apx I-IV), die den Ca2+-abhängigen,
porenbildenden, zytolytischen Proteintoxinen gramnegativer Bakterien zugeordnet
werden. Apx I hat stark hämolytische und zytotoxische Eigenschaften, Apx II zeichnet
sich durch schwächere hämolytische und moderat zytotoxische Eigenschaften aus.
Apx III ist nicht an der Hämolyse beteiligt, gilt aber als stark zytotoxisch. Eine
schwache Hämolyse löst auch das Apx IV-Toxin aus, Zytotoxizität wurde bisher nicht
getestet, was vor allem auf einer fehlenden in-vitro-Produktion zu begründen ist
(EWERS u. WIELER 2011, S. 228).
EWERS u. WIELER (2011, S. 230) erörtern, dass RTX-Toxine die Funktion von
Makrophagen und polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten beeinträchtigen.
Chemotaktische und phagozytotische Funktionen der Makrophagen werden bereits
in sublytischen Dosen beeinflusst. Der oxidative Stoffwechsel in Makrophagen und
polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten wird angeregt. ApX I und III erweisen
sich in hohen Dosen hochgradig toxisch und ApXII moderat toxisch für
Alveolarmakrophagen und polymorphkernige neutrophile Granulozyten (EWERS u.
WIELER 2011, S. 230).
Obwohl es zum Ausbruch der Erkrankung keiner prädisponierenden Faktoren
braucht, besteht dennoch eine Verbindung von Stressfaktoren mit erhöhten
Erkrankungsinzidenzen (EWERS u. WIELER 2011, S. 229).
Der Krankheitsausbruch und die Erregerverbreitung werden durch hohe Tierzahlen,
ungünstiges Stallklima mit schwankenden Umgebungstemperaturen und hoher
38
Literaturübersicht
relativer Luftfeuchte mit ungenügender Ventilation bevorteilt (GOTTSCHALK 2012, S.
658).
Bei der Erregerverbreitung spielen Aerosole und der direkte Tierkontakt die
wesentliche Rolle, wobei beim Schwein die Tonsillen den Hauptkolonisationsort
darstellen (MACINNES et al. 2008).
Als Zielzellen gelten vor allem die Zellen des unteren Respirationstraktes (Zellen der
terminalen Bronchioli, Alveolarepithel), die Kolonisierung des Erregers an der
Eintrittspforte wird u.a. durch das Fehlschlagen der mukoziliären Clearance
begünstigt (EWERS u. WIELER 2011, S. 229).
Klinik und Pathologie
Der nur für das Schwein pathogene Erreger, A.pp., löst perakute, akute, chronische
und subklinische Krankheitsverläufe mit hoher Morbidität und Mortalität aus
(HEINRITZI 2006, S. 144).
Meist zeigt sich die Infektion beim Schwein zwischen der 6. und 20. Lebenswoche
(EWERS u. WIELER 2011, S. 230).
Die Erkrankungsschweregrade sind abhängig von der Erregermenge (SEBUNJA et
al. 1983).
Die klinischen Bilder variieren stark in Abhängigkeit von der Virulenz des
Bakterienstammes, der Infektionsdosis und der Abwehrlage des Schweins (EWERS
u. WIELER 2011, S. 230).
WEISS u. RUDOLPH (2007, S. 66) beschreiben, dass die sich entwickelnde
Pleuropneumonie im akuten Zustand durch fibrinöse, hämorrhagisch-nekrotisierende
Veränderungen gekennzeichnet ist, während im chronischen Stadium adhäsive
Pleuritis, Sequestration und Induration im Vordergrund stehen. Des Weiteren bildet
sich eine umfangreiche adhäsive Pleuritis aus (WEISS u. RUDOLPH 2007, S. 66).
Die Läsionen sind vor allem in den dorsocaudalen Lungenbereichen lokalisiert
(FRANK et al. 1992, LÓPEZ 2009, S. 502) wobei theoretisch alle Lungenlappen
betroffen sein können (LÓPEZ 2009, S. 502).
Nach einer Infektion werden oft eine hohe Mortalität und Morbidität beobachtet und
erkrankte, noch lebende Schweine entwickeln sich zu Kümmerern mit chronischen
Lungenläsionen (MACINNES et al. 2008).
39
Literaturübersicht
Als Erregerreservoir gelten chronisch infizierte Trägertiere (EWERS u. WIELER 2011,
S. 226). Nach der Infektion besteht ein immunologischer Schutz in Bezug auf
homologe A.pp. Serotypen, eine Reinfektion mit heterologen Serotypen ist jedoch
möglich (CRUIJSEN et al. 1995).
40
Material und Methoden
3. Material und Methoden
3.1
Surfactantcharakterisierung beim Schwein
3.1.1
Infektionsversuche mit Scoring im Rahmen des
FUGATO-RePoRI- Projektes
3.1.1.1
Versuchstiere
Die
stammten
Tiere
aus
einem
vorausgegangenen
Projekt
(Funktionelle
GenomAnalyse im Tierischen Organismus (FUGATO) – Resistance to Porcine
Respiratory Tract Infections (RePoRI). Das Projekt (FUGATO-RePoRI) wurde vom
Bundesministerium
für
Bildung
und
Forschung
(BMBF)
gefördert
(Förderkennzeichen: 0315129A-D).1)
Wie beschrieben in REINER et al. (2014) wurden hierzu F2 Schweine
(Kreuzungstiere der Linien Deutsche Landrasse x Hampshire) verwendet, die in der
Klinik für kleine Klauentiere, der Tierärztlichen Hochschule Hannover, geboren und
im
Alter
von
vier
Wochen
abgesetzt
worden
sind.
Die
Tierversuchsgenehmigungsnummer lautete 33.9-42502-04-05/919. Die Haltung der
Ferkel fand im Rahmen der gesetzlichen Vorschriften mit standardisierter Haltung
statt. Alle Ferkel sind negativ auf A.pp. spezifische Antikörper (Apx IIA nach LEINER
et al. 1999 und Apx IV A nach DREYFUS et al. 2004) gestestet worden. Zudem fand
eine labordiagnostische Untersuchung auf Mycoplasma hyopneumoniae und PRRSV
(HerdChek®, IDEXX laboratories, Wetbrook, Maine, USA) mittels Antikörper-ELISA
und auf Influenza A Virus durch Hämagglutinationshemmungstest statt, wie
beschrieben in REINER et al. (2014).
1)
laut persönlicher Mitteilung von Frau Dr. Doris Höltig, 16.11.2013, Hannover
41
Material und Methoden
3.1.1.2
Aerosolinfektion
Grundsätzlich kommt die Aerosolinfektion der natürlichen Infektion am nächsten und
kann somit bevorzugt für Läuferschweine verwendet werden (HENNIG-PAUKA
2007). Die Ferkel wurden im Alter von sieben Wochen via Aerosolinfektion mit einem
A.pp.-Stamm (Serotyp 7) infiziert (REINER et al. 2014).
Die Aerosolinfektion erfolgte wie bei HÖLTIG et al. (2009) etabliert (REINER et al.
2014).
3.1.1.3
Klinische und pathomorphologische Erhebungen
Für die Erhebung von statistisch-auswertbaren, quantitativen Daten war von HÖLTIG
(2009) ein Scoring-System entwickelt worden, das eine objektive Bewertung der
Erkrankungsschweregrade
ermöglicht.
Die
Ergebnisse
der
klinischen,
ultrasonographischen und röntgenologischen Scores waren hierbei untereinander als
auch mit den Sektionsbefunden (Lung Lesion Score, LLS) positiv korreliert
(p<0,0001) (HÖLTIG 2009).
Daran knüpfen die folgenden Untersuchungen im vorangegangenen FUGATORePoRI- Projekt an.
Vor der Infektion und sieben Tage nach der Infektion [p. Inf.] wurden alle Schweine
klinisch untersucht, selbstverständlich gingen nur klinisch gesunde Tiere in den
Versuch (REINER et al. 2014).
Das
in
HÖLTIG
(2009)
beschriebene
klinische,
ultrasonographische
und
röntgenologische Scoring und Lung Lesion Scoring (LLS) kamen als Basis für die
Untersuchungen in REINER et al. (2014) zum Einsatz.
Der Erreger konnte kulturell reisoliert werden (REINER et al. 2014).
Die sonographische Untersuchung lieferte v.a. in Betracht auf die Pleura und das
oberflächliche Lungenparenchym gut auswertbare Ergebnisse (HÖLTIG 2009).
Es kam ein 8 MHz Linearschallkopf (LOGIQ™ Book XP, Fa. GE Medical Systems,
Chalfont St.Giles, Großbritannien) zum Einsatz, geschallt wurde bei lateraler
Lagerung des Ferkels jeder Interkostalraum von dorsal nach ventral (HÖLTIG 2009).
42
Material und Methoden
Die Arbeit von HÖLTIG (2009) etablierte die Untersuchungen wie folgt: bei der
sonographischen Untersuchung wurden Parameter wie Kometenschweifartefakte,
Konsolidierungen, Pleuraergüsse, ein echogenes Grundmuster, hyperechogene
Bereiche, Abszesse/Nekrosen und die diffuse Unterbrechung des pleuralen
Reflexbandes evaluiert. Es wurden Punkte für pathologische Veränderungen je nach
Parameter von „0“ bis „8“ vergeben und aufaddiert. Hierbei wurde jeweils die rechte
und linke Lunge in fünf Bereiche unterteilt. Die röntgenologische Untersuchung stellte
auch die tieferen Lungenbereiche zufriedenstellend dar, so dass auch hier ein
Scoring-System etabliert werden konnte. Als abweichende Parameter wurden diffuse
Verschattungen, Bronchographie oder gut abgegrenzte, total verdichtete Bereiche
definiert. Als physiologisch galt die Darstellung des Herz- und Zwerchfellschattens.
Die Aufnahmen erfolgten in zwei Ebenen (latero-lateral und dorso-ventral; Convix
Generator 360, Fa. Picker Int., München, Deutschland). Auch hierbei fand eine
Unterteilung der jeweils rechten und linken Lunge in vier Bereiche statt. Mit
steigenden Ausprägungsgrad der pathologischen Veränderungen wurden Punkte von
„0“ bis „3“ vergeben, aufaddiert und der Score für den jeweiligen Untersuchungstag
berechnet (HÖLTIG 2009).
Bei
den
Auswertungen
konnte
somit
umfassend
ein
Bild
des
Lungengesundheitszustandes gewonnen werden. Um diesen weiter zu quantifizieren
wurden die drei „klinischen“ Scores (klinisch, sonographisch und röntgenologisch) in
einem Respiratory Health Score (RHS) zusammengefasst (REINER et al. 2014),
(RHS etabliert in HÖLTIG et al. (2009)).
Dier RHS zeigte sowohl in der akuten als auch in der chronischen Krankheitsphase
eine exzellente Korrelation zu den Sektionsbefunden (HÖLTIG 2009).
HÖLTIG (2009) zeigte durch die Berechnungen des RHS ebenfalls, dass die
Schwere des Krankheitsbildes und der Lungenveränderungen in der Lunge vor allem
durch den Verlauf der akuten Krankheitsphase bestimmt werden. Bemerkenswert
war also, dass Faktoren des unmittelbar wirkenden, angeborenen Immunsystems
entscheidend für Krankheitsschweregrad und Krankheitsverlauf waren (HÖLTIG
2009).
Des Weiteren konnte eine genetische Krankheitsresistenz in der genannten Arbeit
43
Material und Methoden
(HÖLTIG (2009)) gezeigt werden: Schweine der Rasse Hampshire zeigten sich als
nur gering unempfänglich für eine A.pp. Infektion, wobei Schweine der Rassen
Deutsche Landrasse, Piétrain und Large White nahezu gleiche Empfänglichkeiten
aufwiesen (HÖLTIG 2009).
REINER et al. (2014) erörtert, dass im Rahmen der Sektionen am siebten Tag p. inf.
für jedes Tier ein „Lung Lesion Score“ erhoben wurde. Anatomisch-pathologische
Befunde wurden in einem Schema der porzinen Lunge vermerkt. Die einzelnen
Lungenlappen wurden in Dreiecke unterteilt. Es konnte ein maximaler Lung Lesion
Score von „35“ erreicht werden, also „5“ Punkte maximal für jeden Lappen (REINER
et al. 2014; LLS zuerst beschrieben in HANNAN et al. 1982).
Abb. 3.1.1:
Versuchsdesign im Rahmen des FUGATO-REPORI-Projektes,
teilweise bereits publiziert in REINER et al. (2014)
44
Material und Methoden
3.1.2
Bronchoalveoläre Lavage im Rahmen des FUGATO-RePoRIProjektes
3.1.2.1
Spülmethode
Die Schweine wurden jeweils sieben Tage vor der Infektion und am Tag 7 nach der
Infektion einer bronchoalveolären Lavage (BAL), durchgeführt von Fr. Dr. Doris
Höltig, unterzogen.2)
Die BAL diente der Gewinnung von „Lungenspülproben“. Unter Anästhesie (Ketamin
(20 mg/kg KGW i.m; Ursotamin®, Fa. Serum-Werk-Bernburg AG, Deutschland) und
Azaperon (2 mg/kg KGW; Stresnil®, Fa. Janssen-Cilag GmbH, Neuss, Deutschland))
wurde mithilfe eines flexiblen Bronchoskops der Bronchus trachealis mit insgesamt
100 ml einer 154 mmol Kochsalzlösung gespült (modifiziert nach HENNIG-PAUKA et
al. 2007).
Wie in KIPPER (1990) beschrieben, war das Ferkel in einer hängenden Matte fixiert
und der Oberkiefer nach oben ausgebunden [s. Abb. 3.1.2.]. Mit einem Laryngoskop
(Heine Optotechnik, Herrsching, Deutschland) wurde das Bronchoskop, geschützt im
Maul durch einen zylindrischen Plastikmaulkeil mit zentraler Öffnung, in die Trachea
vorgeschoben (KIPPER 1990).
Das Bronchoskop wurde dabei in die sogenannte „wedge position“ gebracht, so dass
das Lumen des Bronchus‘ abgedichtet war (GANTER 1996).
Es wurde nacheinander 5x 20 ml Kochsalzlösung mit einer Einmalspritze in den
Arbeitskanal
des
Bronchoskops
eingegeben
und
mithilfe
der
Saugpumpe
(Endo_aspirator, system endo-parts, Fa. Georg Pauldrach, Hannover, Deutschland)
in eine Gaswaschflasche nach Drechsel (Fa. Gebrüder Rettberg GmbH, Göttingen,
Deutschland) unter einem Absaugdruck von 0,2-0,5 bar wieder abgesaugt (HENNIGPAUKA et al. 2007).
2)
Persönliche Mitteilung von Frau Dr. Doris Höltig, 16.11.2013, Hannover
45
Material und Methoden
a.)
Abb. 3.1.2:
a.)
b.)
Beispielhaft Ferkel in Anästhesie mit ausgebundenem Kiefer
während Laryngoskopie, wie beschrieben in KIPPER (1990)
b.)
Beispielhaft Bronchoskopie, wie beschrieben in KIPPER
(1990)
3.1.2.2
Zytologische Untersuchung
Vorab wurde im klinikeigenen Labor nach der Methode modifiziert nach GANTER
(1996) (durchgeführt unter Anweisung von Prof. Dr. Martin Ganter von den
Labormitarbeiterinnen der Tierärztlichen Hochschule Hannover, Klinik für kleine
Klauentiere) das Gesamtvolumen der BALF im Messzylinder bestimmt. Ein Teil der
BALF wurde für die zytologische Untersuchung verwendet. Die Gesamtzellzahl
wurde mit der Neubauer-Zählkammer ermittelt. Zur prozentualen Bestimmung der
Lymphozyten, neutrophilen Granulozyten und Makrophagen wurde die BALF bei 200
x g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert (modifiziert nach GANTER 1996).
Der physiologischen Kochsalzlösung wurde so viel Sediment hinzugegeben bis eine
geringe, optisch sichtbare Trübung entstand (SCHERF 2010).
Dieser Ansatz wurde erneut zentrifugiert (200 x g, 10 Minuten, Multifuge® 4 KR
Heraeus, Kendro® Laboratory Products GmbH, Langenselbold, Deutschland)
(GANTER 1996).
46
Material und Methoden
Mithilfe eines Zentrifugeneinsatzes wurden zwei Zytospots auf einem Objektträger
erzeugt. Nach schneller Trocknung am Ventilator wurden die Objektträger nach
Pappenheim gefärbt (GANTER 1996). Je 400 Zellen wurden bei tausendfacher
Vergrößerung auf Integrität untersucht und differenziert (modifiziert nach GANTER
1996).
3.1.2.3
Surfactantgewinnung - und aufbereitung
Der zellfreie Überstand der Lavageflüssigkeit wurde bei -80 °C in Kryoröhrchen
eingelagert.
Im Surfactantlabor der Medizinischen Hochschule Hannover (Klinik für Pädiatrische
Pneumologie,
Allergologie
und
Neonatologie)
wurden,
modifiziert
nach
MOTTAGHIAN (1999), die bei -80 °C gelagerten Proben zunächst im Kühlschrank
bei 4 °C über Nacht aufgetaut und danach je 5-10 ml in Ultrazentrifugengefäße
gegeben. Durch die Ultrazentrifugation (26.000 x g, 1 Stunde und 50 Minuten, 4 °C)
erhielt man die Surfactantpellets, die in 100 µl 1,5 mmol/l Calciumchloridlösung
(Calciumchlorid gelöst in 154 mmol/l NaCl-Lösung) (Calciumchlorid, fein gekörnt,
rein, Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) resuspendiert wurden (modifiziert
nach MOTTAGHIAN 1999).
Um eine spätere, einheitliche Ermittlung der minimalen Oberflächenspannung zu
gewährleisten, wurde der Phospholipidgehalt der Proben nach MOTTAGHIAN (1999)
bestimmt: es wurde mit drei angesetzten Volumina gearbeitet: Phosphatstandard (50
µl;
Kaliumdihydrogenphosphat
zur
Analyse,
Fa.
Merck
KGaA,
Darmstadt,
Deutschland), Leerwert (nur Perchlorsäure und Wasserstoffperoxid) und Probe (5-10
µl vom resuspendierten Surfactantpellet). Alle drei Ansätze wurden mit 500 µl 70
%iger Perchlorsäure (Perchlorsäure, A.C.S. Reagenz, ca. 70 %ige Lösung in
Wasser, Fa. Sigma-Aldrich® Laborchemikalien GmbH, Seelze, Deutschland) und 200
µl 30 %iger Wasserstoffperoxidlösung (Suprapur®, Hydrogenperoxide 30 %, Fa.
Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) versetzt und bei 190 °C im Wärmeblock für
35 Minuten verascht. Nun wurde in alle drei Ansätze 4 ml Aqua bidestillata, 500 µl
Ammoniummolybdat (Ammoniumheptamolybdat zur Analyse, Fa. Merck KGaA,
Darmstadt, Deutschland; zur Bildung eines Phosphomolybdatkomplexes) und 200 µl
47
Material und Methoden
10 %ige Ascorbinsäure (L(+)- Ascorbinsäure, Fa. Merck KGaA, Darmstadt,
Deutschland; zur Reduktion des Phosphomolybdatkomplexes) hinzupipettiert,
gemischt (zur Entstehung einer Blaufärbung, deren Extinktion proportional zum
Phosphatgehalt der Probe ist) und bei 95 °C für 10 Minuten im Thermoblock
inkubiert. Im Anschluss wurden die Proben im Wasserbad abgekühlt und es erfolgte
eine photometrische Bestimmung (Photometer Nanocolor 100 D, Fa. MachereyNagel GmbH und Co. KG, Düren, Deutschland) des Phospholipidgehaltes bei 800
nm gegen den Leerwert (MOTTAGHIAN 1999).
Wichtig bei diesem Verfahren ist, dass sich bei der kolorimetrischen, quantitativen
Messung nach Farbumschlag keine Veränderung der Extinktion mehr darstellte
(OHLER 2010).
Der Phospholipidgehalt der Proben wurde nach MOTTAGHIAN (1999) berechnet,
indem die Extinktion der Proben mit der Extinktion des Phosphatstandards in
Relation gesetzt wurde. Für die funktionelle Analyse des Surfactants sollte der
Phospholipidgehalt einheitlich 3 mg/ml betragen. Um dies zu gewährleisten wurde
eine zuvor berechnete Menge 1,5 mmol/l Calciumchloridlösung der Suspension
hinzugefügt (MOTTAGHIAN 1999). Diese Arbeiten wurden von Frau Christa Acevedo
(Mitarbeiterin im Surfactantlabor der Medizinischen Hochschule Hannover (Klinik für
Pädiatrische Pneumologie, Allergologie und Neonatologie)) durchgeführt.
3.1.2.4
Für
Aufbereitung der Lavageflüssigkeit für die Elektronenmikroskopie
die
elektronenmikroskopischen
Untersuchungen
wurden
ebenfalls
ultrazentrifugierte Proben benötigt, die im Anschluss wieder bei -80 °C tiefgefroren
und zur weiteren Aufbereitung in das Institut für Funktionelle und Angewandte
Anatomie der Medizinischen Hochschule Hannover gebracht wurden.
Für die elektronenmikroskopische Untersuchung wurden die Proben aufgetaut und
über Nacht in Fixierungslösung (1,5 % Glutaraldehyd (Glutardialdehyd solution 25 %,
Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) und 1,5 % Paraformaldehyd (Emprove®
exp. DAC Paraformaldehyde, Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) in 0,15 Μ
HEPES
(N-(2-Hydroxethyl)piperazine-N‘-2-ethane
sulfonic
acid,
Fa.
SERVA
Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland) Puffer (1:1)) immersionsfixiert
48
Material und Methoden
(OCHS et al. 2006). Zwischen den einzelnen Schritten (auch im Folgenden) wurden
die Pellets erneut zentrifugiert (10000 x g, 5 Minuten). Im nächsten Schritt wurden
die Proben in 0,15 Μ HEPES Puffer (2 x 6 min) und 0,1 Μ Natrium-Cacodylat Puffer
(Cacodylic
acid
Na-salt,
Fa.
SERVA
Electrophoresis
GmbH,
Heidelberg,
Deutschland) (4 x 6 min) gewaschen (modifiziert nach SCHMIEDL et al. 2004).
Zur Postfixierung gab man die Proben in 1 % Osmiumtetroxid (Osminumtetroxide,
WAK-Chemie Medical GmbH, Bad Homburg, Deutschland) und 0,2 Μ NatriumCacodylat Puffer (1:1) für zwei Stunden (OCHS et al. 2006). Danach wusch man die
Pellets in 0,1 Μ Natrium-Cacodylat Puffer (4 x 5 min) und destilliertem Wasser (2 x 5
min) erneut (MÜHLFELD et al. 2013, S. 373-374).
Die en bloc Kontrastierung wurde über Nacht mit einer Kontrastierungslösung
bestehend aus gleichen Teilen Uranylacetat (Uranyl acetate – 2 H2O, Fa. SERVA
Electrophoresis
GmbH,
Heidelberg,
Deutschland)
und
destilliertem
Wasser
(halbgesättigt, ca. 4 %ig) bei einer Temperatur von 4 °C vollzogen, dieser Vorgang
garantiert die Stabilisierung der gesättigten Phospholipide (wie beschrieben in
SCHMIEDL et al. 2004).
Am nächsten Tag wurden die Pellets erneut in destilliertem Wasser gewaschen (2 x 5
min) (modifiziert nach MÜHLFELD et al. 2013, S. 374). Für die Dehydratation kamen
aufsteigende Acetonkonzentrationen je 70 %, 90 % und 100 % zum Einsatz,
schließlich wurden die Pellets mithilfe von Epon (bestehend aus Dodecenyl succinic
acid anhydride , Methyl nadic anhydride, 2, 4 ,6 - Tris (dimethylaminomethyl)phenol,
Glycid ether 100, Fa. SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland) und
Aceton (Acetone, BAKER analyzed®, Fa. J.T. Baker, AvantorTM Performance
Materials, Deventer, Niederlande) eingebettet (modifiziert nach OCHS et al. 2006).
Dabei wählte man zunächst ein Gemisch von Epon und Aceton im Verhältnis 1:1 für
eine Stunde, im Weiteren gab man auf die Proben frisches Epon über Nacht
(modifiziert nach MÜHLFELD et al. 2013, 374). Abschließend wurden die Proben
erneut mit frischem Epon begossen, umgebettet in Flachbettförmchen und für 24
Stunden bei 40 °C und anschließend 48 Stunden bei 60 °C im Wärmeschrank
gelagert (modifiziert nach MÜHLFELD et al. 2013, 374). Der quaderförmige
Harzblock trimmte man unter einer Lupenlampe mit einer Rasierklinge, so dass
49
Material und Methoden
gerade eben das Präparat auf der Oberfläche sichtbar wurde (MEIER-STIEGEN
2004). Zunächst fertigte man Semidünnschnitte (Stärke 1 µm) an, die mit
Toluidinblau (Certistain®, Toluidinblau O, Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland)
gefärbt wurden (modifiziert nach MEIER-STIEGEN 2004).
Die anschließende lichtmikroskopische Begutachtung diente der Orientierung, ob
sicher im Präparat angeschnitten worden war und gab einen ersten Überblick über
die Strukturen (MEIER-STIEGEN 2004).
Modifiziert nach SCHMIEDL et al. (2004) wurden im Weiteren ca. 60-70 nm dicke
Schnitte mithilfe des Ultramikrotoms Leica EM UC7 (Fa. Leica Mikrosysteme GmbH,
Wien, Österreich) durchgeführt. Pro Schnitttiefe fertigte man jeweils bis zu fünf
Einzelschnitte, die unmittelbar hintereinander geschnitten worden waren, an. Zudem
wurden Schnitte von drei Schnitttiefen, die jeweils einen Abstand von circa 70 nm
hatten, angefertigt. Im letzten Schritt gab man die Ultradünnschnitte jeweils auf einen
Single Slot Grid. Kontrastierung wurde mittels Uranylacetat für 15 Minuten und
Bleicitrat (Blei II -nitrat, tri-Natriumcitrat-Dihydrat, Fa. Merck KGaA, Darmstadt,
Deutschland) für 2 Minuten erreicht. Die Single Slot Grids bewahrte man in
Gridboxen bei Raumtemperatur auf (modifiziert nach SCHMIEDL et al. 2004).
Diese Arbeiten wurden von den technischen Mitarbeiterinnen der Medizinischen
Hochschule Hannover, Institut für Funktionelle und Angewandte Anatomie,
durchgeführt, dabei dienten die dortigen Laborprotokolle als Basis.
3.1.3
Elektronenmikroskopie
3.1.3.1
Fragestellung
HSIA et al. (2010) erläutern, dass um bei der quantitativen Beurteilung von
Lungenstrukturen objektive/ unvoreingenommene Daten (unbiased data) zu erhalten,
jegliche Form von methodologischem Fehler ausgeschlossen werden muss. Eine
effektive Variante um unbiased data zu erhalten, ist der studiendesign-basierte
Zugang. Hierbei wird jeder Versuchsschritt (Aufbereitung, Sampling, Analyse) kritisch
und wiederholend beurteilt, um somit objektiv-wissenschaftlich und nicht intuitiv zu
50
Material und Methoden
arbeiten. Als Stereologie definiert man unter Verwendung mathematischer Formeln
die Darstellung physikalischer Eigenschaften von irregulären 3D Strukturen. Dabei
werden 2D Schnitte verwendet und physikalische oder optische, bildgebende
Verfahren kommen zum Einsatz. Das konkrete Messen der Strukturen wird als
Morphometrie bezeichnet (HSIA et al. 2010).
Der intraalveoläre und intrazelluläre Surfactantpool kann durch die Kombination von
Elektronenmikroskopie und Stereologie qualitativ und quantitativ umfassend
analysiert werden (OCHS 2010). Struktursubtypen des intraalveolären Surfactants
können stereologisch durch Punkt- oder Schnittpunktzählverfahren analysiert werden
(OCHS et al. 1999). Zudem stellt sich dieses Verfahren als wertvolles Instrument dar,
um pathologische Alterationen und Behandlungseffekte in experimentellen Studien
zu erforschen (OCHS 2010).
Das Prinzip des „uniform random sampling“ wird dadurch verwirklicht, dass jede
(Ziel-) Struktur die Chance hat, gesampelt zu werden (HOWARD u. REED 2010, S.
3). Das sollte für jede Ebene des Sampling-Verfahrens gelten (HOWARD u. REED
2010, S. 5).
Zusammenfassend soll durch die Elektronenmikroskopie mit anschließendem
Punktzählverfahren die Verteilung von aktiven und inaktiven Surfactantsubtypen, also
der morphologisch-funktionelle Status des Surfactants von gesunden und mit A.pp.
infizierten Schweinen, charakterisiert werden (in Anlehnung an WEIBEL et al. 2007;
OCHS et al. 1999). Nur auf elektronenmikroskopischer Ebene lässt sich die
morphologische Komplexität des Surfactants erfassen (OCHS 2010).
3.1.3.2
Elektronenmikroskopische Auswertung
Die elektronenmikroskopischen Auswertungen erfolgten als Blindstudie und im Sinne
des „systematic random sampling“ nach HOWARD und REED (2010, S.19-29).
Um das Sampling-Verfahren zu verbessern (die totale Variabilität sollte von der
biologischen Variabilität und nicht von stereologischen Messungen bestimmt werden)
(OCHS et al. 2006), wurden stets mehr als 200 Treffer pro Schnitt erfasst (modifiziert
nach OCHS et al. 2006; HOWARD u. REED 2010, S. 7).
51
Material und Methoden
Modifiziert nach SCHMIEDL et al. (2003) wurden die Ultradünnschnitte am
Transmissionselektronenmikroskop
(Morgagni
268,
Fa.
FEITM,
Eindhoven,
Niederlande) mithilfe der Software iTEM (Olympus SIS GmbH, Münster, Germany)
durchgemustert und auszuwertende Testfelder mit der Digitalkamera (Veleta CCD,
Fa. Olympus SIS GmbH, Münster, Germany, Auflösung: 2048 x 2048 pixel)
dokumentiert. Das Transmissionselektronenmikroskop wurde dabei auf eine 18.000
fache Vergrößerung eingestellt. Die Zahl der Aufnahmen variierte zwischen 20-60
Aufnahmen pro Single Slot Grid je nach Größe des Schnittes, wobei 3-5 Grids pro
Tier ausgewertet wurden (modifiziert nach SCHMIEDL et al. 2003).
Der Abstand zwischen den Aufnahmen betrug 200 μm bzw. 150 μm für Abzisse und
Ordinate je nach Größe des Schnittes im Grid.
Orientiert wurde sich an der Mikroskop-eigenen, räumlichen Messung, so dass man
sich in definierten Intervallen nach dem Prinzip des „systematic random sampling“
bewegte (FEHRENBACH u. OCHS 1998, S. 446).
Diese Aufnahmen wurden im Anschluss mit der Onlinesoftware STEPanizer©
stereology Tool Version1 [URL: http://www.stepanizer.com/] (in Anlehnung an
TSCHANZ et al. 2011) ausgewertet [s. Abb. 3.1.3]. Hierfür wurde ein Protokoll
ausgearbeitet [siehe Anhang 4].
Zunächst wurde mit einer modellbasierten Befundbeschreibung gearbeitet. Dabei
wurde morphologisch zwischen lamellenkörperartigen-Vesikeln (lbl; kompaktes
Zentrum,
Lamellen
nur
peripher
erkennbar)
dicht
oder
locker
gepackt,
multilamellären Vesikeln (mlv) dicht oder locker gepackt, unilamellären Vesikeln (ulv),
lamellären Vesikeln mit 2-3 Lamellen (lv 2-3), tubulärem Myelin (tm) und Zelldetritus
(überwiegend ausgefallenes Protein oder lamelläre Membranen) unterschieden
(modifiziert nach FEHRENBACH et al. 1998).
52
Material und Methoden
Abb. 3.1.3:
Punktzählverfahren im STEPanizer© stereology tool
Die Abbildung zeigt das Layout des Zählfensters im STEPanizer©.
Nach TSCHANZ et al. (2011) sind die relevanten Areale von dem Zählrahmen
begrenzt. Alle Strukturen zwischen durchgezogener und gestrichelter Linie werden
gezählt, falls sie durch den grünen Zählpunkt oder von der roten Linie getroffen
werden. Strukturen, die auf der durchgezogenen Linie (verbotene Linie) liegen,
werden nicht gezählt. Strukturen auf der gestrichelten Linie werden mitgezählt
(TSCHANZ et al. 2011).
53
Material und Methoden
3.1.3.3
Stereologische Parameter wie Volumendichte,
Oberflächendichte und das Volumen-/Oberflächenverhälnis‘
Zur Quantifizierung der verschiedenen Subtypen des intraalveolären Surfactants
wurden folgende stereologische Parameter ermittelt: die Volumendichten und die
Volumen-Oberflächen-Verhältnisse (modifiziert nach SCHMIEDL et al. 2004).
Folgende Formeln fanden Verwendung:

Vv Subtyp [%]
Σ PSubtyp
=
x 100 %
Σ Paller Surfactantsubtypen
(Formel nach HOWARD u. REED
2010, S. 57; SCHMIEDL et al. 2003)

Volumen-/Oberflächenverhältnis
V/S-Ratio (ulv bzw. lbl) [µm]
Σ P ulv bzw. lbl x Testlinienlänge [µm] /2
Σ=LSP ulv bzw. lbl x 2
=
(Formel nach WEIBEL 1979)
„Σ P bzw. LSP“ waren die Summe aller Punkte (P) bzw. Linienschnittpunkte (LSP),
die über Punktzählverfahren im STEPanizer© ausgezählt werden konnten (in
Anlehnung an TSCHANZ et al. 2011). Unter Surfactantsubtyp wurden ulv, lv 2-3, mlv
dicht gepackt, mlv locker gepackt, lbl jeweils dicht oder locker gepackt und tm
verstanden (modifiziert nach SCHMIEDL et al. 2003). Artefakte, schwarze Areale,
Strukturen am Präparatende oder auf der durchgezogenen Linie wurden vom
Referenzraum subtrahiert (modifiziert nach TSCHANZ et al. 2011). Die STEPanizer©
Software berechnete selbständig die Testlinienlänge, wenn man vorher skaliert hatte.
Die Skalierung erfolgte vor der eigentlichen Auszählung. Auf dem ersten Bild musste
ein Messbalken sein und dessen Abmessung musste im STEPanizer in µm
angegeben werden (TSCHANZ et al. 2011).
54
Material und Methoden
Für die Bestimmung der Oberflächendichte wurden jeweils die Linienschnittpunkte
mit ulv, repräsentativ für inaktive Surfactantsubtypen (SCHMIEDL et al. 2003), und
lbl, repräsentativ für aktive Surfactantsubtypen (FEHRENBACH et al. 1998; GROSS
u. NARINE 1989 a), ausgezählt (in Anlehnung an SCHMIEDL et al. 2004). Das
Volumen-Oberflächenverhältnis gab demenstprechend Veränderungen der Größe
des jeweiligen Subtyps an (SCHMIEDL et al. 2004).
In Anlehnung an den in der Literatur beschriebene Surfactantmorphologie (GROSS
u. NARINE 1989 a; GROSS u. NARINE 1989 b; SCHMIEDL et al. 2003 und 2004,
FEHRENBACH et al. 1998) wurden vier Gruppen von Surfactantsubtypen gebildet:
1.
ulv
2.
mlv
3.
lbl
4.
tm.
55
Material und Methoden
3.1.4
Biophysikalische Untersuchung des Surfactants:
Pulsating Bubble Surfactometrie
GOERKE u. CLEMENTS (1986) erläutern, dass es prinzipiell an einer LuftFlüssigkeitsgrenze eine Oberflächenspannung gibt, da die Moleküle innerhalb der
Flüssigkeitsoberfläche ein höheres energetisches Niveau als in der Hauptmasse
haben. Das Schrumpfen der Oberfläche der Luft-Flüssigkeitsgrenze kommt dadurch
zustande, dass die Moleküle von der Oberfläche in die Hauptmasse übergehen, wie
beispielsweise bei Wassertropfen (sphärische Struktur mit einer verringerten
Oberfläche und kleinstmöglicher Oberflächenenergie) (GOERKE u. CLEMENTS
1986).
Um die Funktion des Surfactants evaluieren zu können, wurde die minimale
Oberflächenspannung, in Anlehnung an ENHORNING (1977) und MOTTAGHIAN
(1999), gemessen.
Die Messungen wurden an der Klinik für pädiatrische Pneumologie, Allergologie und
Neonatologie der Medizinischen Hochschule Hannover durch Frau Christa Acevedo
durchgeführt.
Dazu wurde ein Pulsating Bubble SurfactometerTM (PBS) (Fa. Electronetics
Corporation, Amherst, New York, United States of America) verwendet [Abb. 3.1.4
und 3.1.5] (MOTTAGHIAN 1999).
In die Messkammer, die durch ein umgebendes Wasserbad (entgastes Aqua
bidestillata) auf 37 °C erwärmt wurde, wurden 38 µl des vorbereiteten Surfactants in
ein Spezialröhrchen gegeben (modifiziert nach MOTTAGHIAN 1999).
MOTTAGHIAN (1999) zufolge wurde durch eine mechanische Kolbenbewegung eine
Blase geformt. Eine optische Kontrolle der Lage der Blase war erforderlich, da die
Blase an der minimalen Begrenzung auf der optischen Skala liegen sollte [Abbildung
3.1.6]. Nach einer Adsorptionszeit von 10 Sekunden an der Luft-Flüssigkeitsgrenze
pulsierte die Blase mit 20 Hysteresen pro Minute mit einer Zyklusdauer von je 3
Sekunden. Während des Vorgangs hatte die Blase einen minimalen Radius von 0,4
mm (= Exspiration) und einen maximalen Radius von 0,55 mm (= Inspiration). Diese
zyklischen Variationen der Blasengröße wurden durch den im Gerät integrierten
Pulsator sichergestellt. Die Ein- und Ausatmung wird durch den Wechsel zwischen
56
Material und Methoden
dem
minimalen
und
maximalen
Radius
simuliert.
Der
Indikator
für
die
Surfactantadsorption bei Blasenexpansion ist hierbei die Oberflächenspannung bei
maximalem Blasenradius. Die Adsorption bei Filmkompression wird durch die
Oberflächenspannung bei minimalem Blasenradius dargestellt. Die Druckmessung
über der Blase erfolgte durch einen Differenzdruckaufnehmer. Nachdem ein SteadyState erreicht ist, kann die Oberflächenspannung über das LaPlace’sche Gesetz
berechnet werden (MOTTAGHIAN 1999).
Dieses Gesetz setzt eine sphärische Oberfläche des Alveolus voraus, so dass gilt:
ΔP= 2 x γ / R. Der Differenzdruck (ΔP) ist abhängig von der Oberflächenspannung
des Alveolarfilms (γ) und dem Radius des Alveolus (R) (ENHORNING 2008).
BERNHARD et al. (2001 b) erklären, dass beim Menschen und beim Schwein
Hysteresekurven
gemessen
worden
sind,
bei
denen
sich
eine
minimale
Oberflächenspannung von <5 mN/m nach 10 Zyklen eingestellt hat. Bei Enten und
Hühnern stellten sich minimale Oberflächenspannungen von 20 mN/m selbst nach
100 Pulsationen ein (BERNHARD et al. 2001 b).
MOTTAGHIAN (1999) erläutert, dass die computerbasierte Auswertung der Daten
sich auf eine Programmversion von Frieling von Dettmar und Coldewey gründete, die
1990/1991 für das Fraunhofer Institut für Toxikologie und Aerosolforschung entwickelt
worden war. Mithilfe des Programms konnte eine graphische Auswertung
durchgeführt werden [s. Abb. 3.1.7]. Bei der dargestellten Hysteresekurve wurde auf
der Abszisse die Oberfläche der Blase in mm² und auf der Ordinate die minimale
Oberflächenspannung in mN/m angegeben. Auch die Funktion der Zeit in Sekunden
gegen die Oberflächenspannung in mN/m wurde ausgewertet. Es konnte der
Zeitpunkt der Erreichung des Steady-States abgelesen werden (Kurve verläuft dann
nahezu parallel zur Zeitachse) (MOTTAGHIAN 1999).
57
Material und Methoden
Abb. 3.1.4: PBS
Abb. 3.1.5:
PBS schematisch (ENHORNING 1977)
ENHORNING (1977) erklärt dazu, dass durch die Kolbenbewegungen in der
Messkammer eine Blase erzeugt wird. Der Durck in der Flüssigkeit, die die Blase
umgibt, wird mit einem Differenzdruckaufnehmer gemessen. Dieser gibt den
Druckgradienten auf der Blasenoberfläche an. Mithilfe des Druckgradienten und des
Blasenradius‘ kann die Oberflächenspannung bestimmt werden (ENHORNING
1977).
58
Material und Methoden
Abb. 3.1.6:
Blick durch das Okular des Pulsating Bubble SurfactometersTM:
Es erfolgte eine optische Kontrolle der Blase bezüglich ihrer Begrenzungen, die
beiden inneren Eichmarken berühren die Blase tangential (MOTTAGHIAN 1999).
Diese Abbildung wurde freundlicherweise von Frau Christa Acevedo zur Verfügung
gestellt.
59
Material und Methoden
Abb. 3.1.7:
PBS Output eines Kontrollschweines:
MOTTAGHIAN (1999) erörtert hierzu: Hysteresekurve: Es wurde die Fläche der
Blase [mm2] gegen Oberflächenspannung [mN/m] aufgetragen. Das Programm
ermittelt nach manueller Eingabe des Steady-States den Mittelwert, die Varianz und
die Standardabweichung aller Zyklen nach Erreichen des Steady-States. Zudem
wurde die Zeit [sec] gegen Oberflächenspannung [mN/m] aufgetragen Der SteadyState ist durch die nahezu horizontalen Linienverläufe der minimalen und maximalen
Oberflächenspannungen zu erkennen, die sich auf bestimmte Werte eingependelt
haben. Adsorptionsplot: Hierin wird die Abnahme der Oberflächenspannung nach
zehn Sekunden angezeigt und erlaubt vorab eine grobe Aussage über die
Funktionstüchtigkeit des Films (MOTTAGHIAN 1999).
60
Material und Methoden
3.2
Charakterisierung von immersionsfixiertem Lungenparenchym
beim Schwein (Lungengesunde- und A.pp. infizierte Schweine)
3.2.1
Versuchstiere
Für diese Studie wurden neun Ferkel der Deutschen Landrasse aus einer
Versuchsreihe von BRAUER (2012) (Infizierte- und Kontrolltiere) und HENNIGPAUKA et al. (2012) (nur drei Kontrolltiere, infizierte Tiere vollständig) mit einem
Einstallungsalter von 6,5 Wochen verwendet.
Schweine der Deutschen Landrasse hatten sich als empfänglicher bezüglich der
Infektion mit A.pp. erwiesen als andere Rassen (HÖLTIG 2009).
HENNIG-PAUKA et al. (2012) erörtert, dass die Tiere unter standardisierten
Bedingungen im Rahmen der gesetzlichen Vorschriften gehalten wurden. Die
Tierversuchsgenehmigungsnummer lautete 33-42502-05/941. Die Schweine kamen
aus einem Basiszuchtbetrieb, der durch routinemäßige Untersuchungen als frei von
toxinbildenden Pasteurella-multocida-Stämmen, A.pp., dem Virus des Porzinen
Reproduktiven und Respiratorischen Syndroms sowie Endo- und Ektoparasiten galt
(HENNIG-PAUKA et al. 2012).
3.3.2
Aerosolinfektion im Rahmen der Infektionsstudien von BRAUER
(2012) und HENNIG-PAUKA et al. (2012)
Die Aerosolinfektion entsprach nahezu dem unter 3.1.2.1 beschriebenen Prozedere.
Auf eine Gruppe von vier Schweinen kam 13 ml Kultursuspension (ca. 2x10 5
Koloniebildende Einheiten A.pp.) wurden innerhalb von zwei Minuten unter einem
Druck von 2 bar vernebelt (BRAUER et al. 2012).
3.2.3
Klinische, computertomographische, hämatologische und
pathomorphologische Erhebungen im Rahmen der
Infektionsstudien von BRAUER (2012) und HENNIG-PAUKA et al.
(2012)
Die klinischen und pathomorphologischen Erhebungen erfolgten nahezu wie unter
3.1.1.3 beschrieben (vgl. BRAUER (2012)).
61
Material und Methoden
Am Tag 21 wurden Bilder vom Thorax der Schweine mit dem Single-Slice-SpiralComputertomograph der dritten Generation (Philips Tomoscan M, Fa. Philips Medical
Systems, Hamburg, Deutschland) unter Neuroleptanalgesie angefertigt, das
Versuchsdesign und die Ergebnisse sind bei BRAUER (2012) beschrieben. In
craniocaudaler Richtung wurden Transversalschnitte beginnend bei der Apertura
thoracis bis zum Diaphragma aufgenommen. Mit Hilfe der Computersoftware e-Film
(Fa. eFilm Medical Inc., Toronto, Ontario, Canada) wurde für die CT-Aufnahmen ein
klassisches Lungenfenster von 1500 Houndsfield-Einheiten (HE) Weite und -600 HE
Länge konstruiert (BRAUER et al. 2011 und 2012).
Die Ferkel lebten bis zum Tag 21 p. inf., wurden dann euthanasiert und seziert wie in
3.1.1.3 beschrieben. Nach Berechnung des Lung Lesion Scores, wie beschrieben in
BRAUER et al. (2012), wurde Lungenparenchym zum Erregernachweis auf A.pp.
(kulturelle Untersuchung, PCR und biochemische Untersuchung) entnommen
(BRAUER et al. 2012 und HENNIG-PAUKA et al. 2012).
Modifiziert nach NERBAS (2008) wurde, um einen Status des roten und weißen
Blutbildes zu erlangen, den Schweinen an Tag 0 und 21 aus der Vena cava cranialis
bzw. Vena jugularis externa Blut (Monovette®, Fa. Sarstedt AG und Co., Nümbrecht,
Deutschland) abgenommen. Ein „rotes Blutbild“ und die Gesamtzellzahl wurden mit
dem Hämatologiegerät (celltac α Modell MEK-6450K, Fa. Nihon Kohden Corporation,
Tokyo, Japan) ermittelt. Zur Differenzierung der Leukozyten und Formveränderungen
der Erythrozyten wurden die Blutausstriche nach Pappenheim gefärbt (modifiziert
nach NERBAS 2008). Eine BAL wurde am Tag 0 und 21 nach der Infektion
durchgeführt und wurde, wie in 3.1.2. beschrieben, zytologisch untersucht. Die für die
Lungenparenchymuntersuchungen ausgewählten Kontrolltiere wogen am Tag der
Sektion im Median 17,6 kg und die ausgewählten infizierten Tiere 20,4 kg. Die
hämatologischen
und
bronchoskopischen
Daten
wurden
im
Rahmen
der
Infektionsstudien von Carsten Brauer und Isabel Hennig-Pauka erhoben, aus denen
auch folgende Veröffentlichungen resultierten: BRAUER (2012) und HENNIG-PAUKA
et al. (2012).
62
Material und Methoden
3.2.4
Präparationstechnik
Es wurde für die sich anschließenden histologischen Untersuchungen stets der
rechte Lobus caudalis verwendet, es wurde ein Stück Lungenparenchym im Bereich
des Bronchus lobaris‘ an der Abzweigungsstelle des Bronchus segmentalis‘
entnommen
(BRAUER
(2012)
und
gemäß
in
dieser Arbeit
verwendetem
Sektionsprotokoll).
3.2.5
Fixierung, Einbettung und Anfertigung von Gewebedünnschnitten
Die mit Formol nach LILLIE (BÜCHL- ZIMMERMANN et al. 2010, S. 90) fixierten
Lungenparenchymproben wurden zunächst, wie modifiziert beschrieben in HENNIGPAUKA et al. (2012), über eine aufsteigende Alkoholreihe entwässert und zweimal
jeweils für eine Stunde in Xylol gegeben und für 12 Stunden in 60 °C heißes Paraffin
(Paraplast Plus, Fa. Tyco Healthcare, Neustadt, Deutschland) verbracht. Nach
Zugabe einer zweiten Portion frischem Paraffin wurden die Proben in Paraffin
ausgegossen, welches bei Raumtemperatur aushärtete. Die Paraffinproben wurden
mikrotomisch auf eine Stärke von 5 µm geschnitten und auf Objektträger
aufgezogen. Nach der Trocknung im Brutschrank erfolgte die Entparaffinierung durch
das Intermedium Xylol und über eine absteigende Alkoholreihe wurden die Proben in
Aqua destillata überführt. Die Paraffinschnitte wurden Hämalaun-Eosin (HE)
(Standardrezept, modifiziert nach RIEDELSHEIMER u. WELSCH 2010, S. 214) und
nach Masson-Goldner (modifiziert nach RIEDELSHEIMER u. WELSCH 2010, S.
217) gefärbt. Diese Arbeiten wurden von Frau Gudrun Wirth, Anatomisches Institut
der Tierärztlichen Hochschule Hannover, nach den dortigen Laborprotokollen
durchgeführt. Das in diesem Kapitel beschriebene Prozedere fand modifiziert nach
HENNIG-PAUKA et al. (2012) statt. Die Proben wurden im Rahmen der
Infektionsstudien von Carsten Brauer und Isabel Hennig-Pauka aufgearbeitet, aus
denen auch folgende Veröffentlichungen resultierten: BRAUER (2012) und HENNIGPAUKA et al. (2012).
63
Material und Methoden
3.2.6
Protokoll der lichtmikroskopischen Auswertung und die
Berechnungen stereologischer Parameter
Die mikroskopische Darstellung der immersionssfixierten Lungenparenchymschnitte
erfolgte am Lichtmikroskop (Zeiss, Photomikroskop Axiophot, Fa. Carl Zeiss AG,
Oberkochen, Deutschland) der Medizinischen Hochschule Hannover, Institut für
Funktionelle und Angewandte Anatomie, es wurde mit 5 facher Objektivvergrößerung
und 10 facher Okularvergrößerung gearbeitet und die Paraffinschnitte im Sinne des
„systematic random sampling“ durchgemustert und fotographiert (Mikroskopische
Farbkamera: Olympus XC50, Inventarnummer: 1001041990), wie beschrieben in
FEHRENBACH u. OCHS (1998, S. 446).
Mithilfe einer Computersoftware (Olympus cell^b Imaging Software for Life Science
Microscopy, Fa. Olympus Europa SE und CO. KG, Hamburg, Deutschland) konnten
die Aufnahmen entsprechend ihrer Vergrößerung skaliert werden.
Das „systematic random sampling“-Verfahren beinhaltete ein mäanderförmiges
Abfahren des Präparates in definierten Abständen (gemäß Linealraster auf
Objekttisch) (FEHRENBACH u. OCHS 1998, S. 446). Somit konnten pro Lobus
caudalis 25-40 Aufnahmen gemacht werden.
Diese Aufnahmen wurden im Anschluss mit der Onlinesoftware STEPanizer©
stereology Tool Version1 (TSCHANZ et al. 2011) ausgewertet. Hierzu wurde im
Parameterfenster eine Monitorauflösung von 1280x1024, eine Auswahl von „Line
pairs, Number of titles: 4, Sub Sampling: no, Line width: 2, T-Bar: 0, Show: alle
ankreuzen“ gewählt.
Modifiziert nach BEHRENS (2011) arbeitete man nach dem Prinzip des
Punktzählverfahrens, wobei eine Unterscheidung zwischen Parenchym (untergliedert
in Alveolarluftraum und Alveolarsepten) und Non-Parenchym (Bronchien und
Gefäße) getroffen wurde. Zudem wurden die Linienschnittpunkte mit den
Alveolarsepten ausgezählt. Die Auswertung erfolgte als Blindstudie (modifiziert nach
BEHRENS 2011). Zur Quantifizierung von möglichen Veränderungen innerhalb des
Lungenparenchyms wurden folgende Parameter modifiziert nach SCHMIEDL et al.
(2007) bestimmt:
64
Material und Methoden

die Volumendichte des Non-Parenchyms [%],

die Volumendichte des Parenchyms [%],

die Volumendichte des Alveolarluftraums [%],

die Volumendichte der Alveolarsepten [%],

die Oberflächendichte (Sv) der Alveolarsepten [1/µm],

das Volumen-Oberflächenverhältnis (V/S) [µm] und

die Volumendichte von pathologisch verändertem Gewebe [%].
Das Volumen-Oberflächenverhältnis der Alveolarsepten ist ein Maß für die
Alveolarseptendicke (BEHRENS 2011).
Die folgenden Formeln fanden dabei Verwendung modifiziert nach BEHRENS (2011):

Vv Non-Parenchym [%] =
Σ PNon-Parenchym
x 100%
(Σ PParenchym + Σ PNon-Parenchym + Σ Ppathologisch verändertes Gewebe)
(Vorangegangene Formel modifiziert nach BEHRENS 2011)

Vv Parenchym [%]
=
Σ PParenchym
x 100%
(Σ PParenchym + Σ PNon-Parenchym + Σ Ppathologisch verändertes Gewebe)
(Vorangegangene Formel modifiziert nach BEHRENS 2011)

Vv Alveolarluftraum [%] =
Σ PAlveolarluftraum
x 100%
Σ PParenchym
(Vorangegangene Formel nach BEHRENS 2011)

Vv Alveolarsepten [%]
=
Σ PAlveolarsepten
Σ PParenchym
(Vorangegangene Formel nach BEHRENS 2011)
65
x 100%
Material und Methoden

Sv Alveolarsepten [1/µm]
=
Σ LSPSepten x 2
(Σ PParenchym) x Testlinienlängehalbe [µm]
(Vorangegangene Formel nach WEIBEL 1979, S. 121)

V/S Alveolarsepten [µm]
=
Vv Septen
Sv Septen
(Vorangegangene Formel nach BEHRENS 2011)

Vv pvG [%]
Σ Ppathologisch verändertes Gewebe
=
x 100%
(Σ PParenchym + Σ PNon-Parenchym + Σ Ppathologisch verändertes Gewebe)
(Vorangegangene Formel modifiziert nach BEHRENS 2011)
3.2.7
Auswertung der computertomographischen Transversalschnitte
von Schweinelungen
3.2.7.1
Punktzählverfahren im STEPanizer
Die computertomographischen Transversalschnitte der Schweinelungen wurden in
der Studie von BRAUER et al. (2012) erhoben. Diese Aufnahmen (ca. 50-55 pro Tier)
wurden in die Onlinesoftware STEPanizer© stereology Tool Version1, wie
beschrieben in TSCHANZ et al. (2011), eingelesen. Die Feineinstellung der Software
lautete wie folgt: line pairs, Nbr of tiles 196, no subsampling, line with 2, T – bar 0,
wobei „frame“, „circle“ und „testsystem“ aktiviert waren und die Farben in ihrer
Originaleinstellung beibehalten wurden. Als Resultat erhielt man 392 Testlinien mit je
zwei Zählpunkten pro Aufnahme.
In Anlehnung an OCHS (2006) kam wiederum das Punktzählverfahren zum Einsatz.
Die Differenzierung der Strukturen beinhaltete eine Unterteilung in Lungenparenchym
und non-Parenchym. Lungenparenchym war als makroskopisch unverändertes
Gewebe
definiert
und
als
non-Parenchym
stellten
sich
Strukturen
des
Bronchialsystems und große Gefäße dar. Testlinienpunkten auf grundsätzlich
66
Material und Methoden
anderen Bereichen des Tierkörpers wurden nicht miteingebunden. Zusätzlich
konnten pathologische Strukturen ausgezählt werden (in Anlehnung an OCHS 2006).
Nach BRAUER et al. (2012) galten nur jene Strukturen als pathologisch, wenn man
im CT-Bild innerhalb eines 1,2 cm2 großen, zirculären Bereich einen mittleren Wert
für die Dichte von größer als -550 HU hatte. Diese wurde aufgrund der
Absorptionsdichte der Pixel innerhalb der bestimmten Fläche berechnet. Diese
Auswertung wurde vorab mit der Bildbefundungs- und Bildverarbeitungssoftware für
die medizinische Diagnostik, e-Film, vorgenommen (BRAUER et al. 2012).
3.2.7.2
Berechnung des funktionellen Lungenparenchymvolumens
der Schweinelungen nach dem Cavalieri Prinzip
Die Berechnung des funktionellen Lungenparenchymvolumens der Schweinelungen
erfolgte nach folgender Formel (modifiziert nach SCHNEIDER u. OCHS 2013, S.
270-271):

Funktionelles Lungenparenchymvolumen [cm3] =
Zählpunkte auf Lungenparenchym x t x a(p)
Zählpunkte Lungenparenchym = in 3.2.7.1 via STEPanizer ermittelt
t=
Schichtdicke der CT-Bilder (0,7 cm)
a(p) = Fläche pro Punkt (p) in cm2
(Formel modifiziert nach SCHNEIDER u. OCHS 2013, S. 270-271).
3.2.7.3
Funktionelles Volumen der Alveolarsepten
Die Berechnung des funktionellen Volumens der Alveolarsepten der Schweinelungen
erfolgte nach folgender Formel (modifiziert nach OCHS 2006; HSIA et al. 2010):

3
Funktionelles Volumen der Alveolarsepten [cm ] =
Funktionelles Lungenparenchymvolumen x Volumendichte Parenchym x Volumendichte Alveolarsepten
Zu 3.2.7.3: Die Volumendichte des Parenchyms wurde wie in 3.2.6. beschrieben
ermittelt, allerdings mussten die stereologisch-ermittelten Dichten noch durch „100“
dividiert werden.
67
Material und Methoden
3.2.7.4
Die
Funktionelle Oberfläche der Alveolarsepten
Berechnung
der
funktionellen
Oberfläche
der
Alveolarsepten
der
Schweinelungen erfolgte nach folgender Formel (modifiziert nach SCHNEIDER u.
OCHS 2013, S. 282):

Funktionelle Oberfläche der Alveolarsepten [cm2] =
Funktionelles
Lungenparenchymvolumen
x
Volumendichte
Parenchym
x
Oberflächendichte Alveolarsepten
Die Volumendichte des Parenchyms und die Oberflächendichte der Alveolarsepten
wurden wie in 3.2.6 beschrieben ermittelt, allerdings mussten die stereologischermittelten Volumendichten noch durch „100“ dividiert werden.
3.2.7.5
Funktionelles
Parenchymvolumen
pathologisch
veränderter
Strukturen
Die
Berechnung
des
funktionellem
Parenchymvolumens
von
pathologisch
veränderten Strukturen der Schweinelungen erfolgte nach folgender Formel
(modifiziert nach OCHS 2006; HSIA et al. 2010):

3
Funktionelles Parenchymvolumen von pathologisch veränderten Strukturen [cm ] =
Funktionelles Lungenparenchymvolumen x Volumendichte pathologisch verändertes Gewebe
Die Volumendichte des pathologisch-veränderten Gewebes wurde wie in 3.2.6
beschrieben ermittelt, allerdings mussten die stereologisch-ermittelten Dichten noch
durch „100“ dividiert werden.
68
Material und Methoden
3.3
Charakterisierung von perfusionsfixierten Lungenparenchym
beim Schwein
3.3.1
Versuchstiere
Die drei untersuchten Ferkel wurden in der Klinik für kleine Klauentiere am
13.07.2012 geboren. Die Tiere waren gegen Mycoplasma hyopneumoniae (1 ml
Impflösung/Tier i.m. laut Hersteller, J Stamm, Isolat B-3745, Ingelvac Mycoflex®, Fa.
Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Ingelheim, Deutschland) und Porzines
Circovirus Typ 2 (1 ml Impflösung/Tier i.m. laut Hersteller, ORF2 Protein, Ingelvac
Circoflex®, Fa. Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Ingelheim, Deutschland)
geimpft.
Die Haltung der Ferkel fand im Rahmen der gesetzlichen Vorschriften der
Tierschutzgesetzgebung statt (Gruppenhaltung, 8 m2/10 Tiere, Standarddiät)
(HÖLTIG 2009).
Da die Tiere im Rahmen des Versuchs getötet wurden, wurde dies in einer
Tötungsanzeige (Tierkategorie: 112, Organentnahme am toten Tier zum Zwecke der
Untersuchung
isolierter
Organe/Gewebe/Zellen)
dem
Nds.
Landesamt
für
Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit in Oldenburg angezeigt. Durch eine
umfassende, klinische Untersuchung nach HÖLTIG (2009) wurden die Tiere als
lungengesund beurteilt. Die Ferkel wogen im Median 14,3 kg.
3.3.2
Versuchsablauf 3)
Die drei acht Wochen alten Ferkel (Rasse: Bundeshybridzuchtprogramm) wurden in
Anästhesie (20 mg/kg KGW i.m Ketamin, Ursotamin®, Fa. Serum-Werk-Bernburg AG,
Deutschland) und 2 mg/kg KGW i.m. Azaperon, Stresnil®, Fa. Janssen-Cilag GmbH,
Neuss, Deutschland) versetzt (Anästhesie modifiziert nach HÖLTIG 2009). Über
einen Ohrvenenkatheter wurde Natrium-Heparin (400 I.E./kg KGW; Heparin-
69
Material und Methoden
Rotexmedica, Fa. Rotexmedica GmbH, Trittau, Deutschland) verabreicht, um eine
Koagulation des Blutes in den Lungengefäßen zu verhindern. Im Anschluss daran
wurden die Ferkel intubiert und eine Inhalationsanästhesie mit 3-5 Vol. % Isofluran
(Isofluran CP®, Fa. cp-pharma Handelsgesellschaft mbH, Burgdorf, Deutschland) in
Sauerstoff bzw. Luft, in Rückenlage durchgeführt. Durch den Ohrvenenkatheter
wurde Pentobarbital (0,2 ml / kg KGW laut Hersteller; Euthadorm®, 400 mg / ml, Fa.
cp-pharma Handelsgesellschaft mbH, Burgdorf, Deutschland) zur Euthanasie
verabreicht. Über das Narkosegerät Dräger Cato edition (Fa. Dräger-Medical
Deutschland GmbH, Lübeck, Deutschland) konnte weiterhin eine definierte,
druckkontrollierte Beatmung stattfinden (Beatmungsdrücke: PINSP 20 hPa, PEEP 5
hPa). Das Isoflurangas wurde post mortem abgestellt, damit das Lungenparenchym
geschont wurde. Am Ende der Inspiration wurde mit einer Arterienklemme der Tubus
in der Trachea abgeklemmt, so dass bei der nachfolgenden Thoraxeröffnung ein
Kollabieren
der
Lungen
verhindert
wurde
und
die
Lunge
im
definierten
Inspirationszustand (PINSP 20 hPa) verblieb. Zur Eröffnung des Brustkorbes wurden
die Rippen mit einer oszillierenden Säge durchtrennt und somit die Brusthöhle mit
Lungen und Trachea freigelegt. Mit Arterienklemmen wurden die Aorta und die Vena
cava cranialis und caudalis abgeklemmt. Das Herz-Lungenpaket wurde entnommen
und auf ein Tablett gelegt, hierbei war es von zentraler Bedeutung, die Lungen nicht
zu verletzen (Abb. 3.3.1-3). Um die Lungen isoliert perfundieren zu können, wurde im
Weiteren das Herz abpräpariert. Der Truncus pulmonalis wurde lang am
Lungenpräparat belassen. Zudem verblieb das Dach des linken Atriums mit den
Lungenvenen am Lungenpräparat. So wurde für die Fixierungslösung ein Abfluss
über das linke Atrium geschaffen und die Lösung konnte in einem 10 l Eimer
aufgefangen
werden.
Durch
den
Truncus
pulmonalis
Organtransplantationskanüle „XVIVO Lung Cannula Set
AB,
Göteborg
Schweden),
gekoppelt
an
wurde
eine
TM
“ (Fa. XVIVO Perfusion
entsprechendes
Infusionsbesteck
„Transplantationsset 4-fach ohne SG 0, DSO Modell Mitte DSO Mainz“ (Fa. Medos®
Medizintechnik AG, Stolberg, Deutschland) in Richtung Lunge geschoben und am
Truncus pulmonalis mithilfe eines Kabelbinders festgebunden. Somit wurde ein
Arbeitskanal für die Fixierungslösung geschaffen. Dabei wurde der Truncus
70
Material und Methoden
pulmonalis möglichst herznah abgesetzt. Die Lunge wurde zusätzlich mit 1 l
Kochsalzlösung (Natriumchlorid-Lösung 0,9 % WDT, Fa. Wirtschaftsgenossenschaft
deutscher Tierärzte eG, Garbsen, Deutschland) versetzt mit Natrium-Heparin (400
I.E./kg KGW; Heparin-Rotexmedica, Fa. Rotexmedica GmbH, Trittau, Deutschland)
gespült. Die Fixantien (4 % Paraformaldehyd und 0,1 % Glutaraldehyd) wurden in
einen Infusionsbeutel gegeben und dieser in ca. 30 cm Höhe aufgehangen.
Hierdurch konnte die Lunge mit 2 l pro Tier kalter Perfusionslösung luftblasenfrei
perfusionsfixiert werden. Die durch das linke Atrium abfließende Perfusionslösung
wurde in einem 10 l Eimer aufgefangen, so dass man die perfusionsfixierte Lunge
zusätzlich darin fixieren konnte. Es mussten auf die perfusionsfixierten Lungen
zusätzlich Kissen (in Plastikfolie eingeschweißter handelsüblicher Aquarienkies,
43x21 cm) zur Beschwerung und dazwischen Gasetücher „Gazin®, 7,5x7,5 cm
Mullkompressen“ (Lohmann und Rauscher International GmbH und Co KG,
Rengsdorf, Deutschland) gelegt werden. Der gesamte Versuchsablauf wurde auf der
Basis der persönlichen Mitteilung von Fr. Dr. Schnapper durchgeführt.3)
3)
laut persönlicher Mitteilung von Fr. Dr. Anke Schnapper, Hannover am 17.10.2013,
(Dabei diente als Grundlage SCHNAPPER et al. 2012)
71
Material und Methoden
Abb. 3.3.1:
Nahezu vollständig kollabierte Lunge
ohne definierte Blähung
Abb. 3.3.2:
Überblähtes Lungenparenchym durch falsche
Einstellung des Beatmungsdruckes (>40 mbar),
beim späteren Sampling floss viel Flüssigkeit
von der Schnittfläche ab
72
Material und Methoden
Abb. 3.3.3:
Entnommene Lungen mit definierter Blähung durch
Klemmung der Trachea am Ende der Inspiration
73
Material und Methoden
3.3.3
Samplingverfahren der perfusionsfixierten Lungen 4)
Um die Lunge mit möglichst wenigen Schneidkompressionsartefakten schneiden zu
können, wurde die Lunge in einen Plexiglaskasten mit Agar versetzt. Dazu wurden
24 g Agar (Agar-Agar, Kobe I Artikel-Nummer 5210.1, Fa. CARL ROTH GMBH + CO.
KG, Karlsruhe, Deutschland) benötigt, der mit 800 ml Aqua destillata aufgefüllt
wurde. Das Gemisch wurde in der Mikrowelle bei 800 Watt 15 Minuten zum Kochen
gebracht und anschließend im Kühlraum bei 6 °C auf ca. 45 °C abgekühlt. Der
Plexiglaskasten wurde mit Frischhaltefolie ausgelegt und zusätzlich wurde auf die
Unterseite eine Kunststoffplatte gelegt, um ein Stumpfwerden der Klinge zu
verhindern. Der Boden der Plexiglasschale wurde mit Agar ausgegossen bis dieser
gut bedeckt war. Jetzt wurde zentral die Lunge in den Kasten verbracht, mit dem
restlichen Agar (40-45 °C) bis zur vollständigen Bedeckung begossen und auf ca. 35
°C abgekühlt. Im Folgenden konnte die in den Agar verbrachte Lunge aus dem
Plexiglaskasten gelöst in die Schneidapperatur der Forschungswerkstatt der
Medizinischen Hochschule Hannover (17,5x38,5 cm² Gesamtgröße) verbracht
werden. Die Schneidapperatur besaß rechts und links an den langen Seiten Schlitze,
durch die die Klinge (FEATHER®, FEATHER TRIMMING BLADE No. 260, Fa. pfm
medical org, Köln, Deutschland) geführt werden konnte. Für diese Lungengröße
(Gewicht der Tiere von 12 – 16 kg) wurden Schneidabstände von einem bis zwei
Schlitzen (je nach Lungengröße) gewählt, welche einer Scheibendicke von ca. 0,55
cm - 1,25 cm (je nach Lungengröße) entsprachen. Von jeder geschnittenen
Lungenscheibe mit
Agarumhüllung wurden einheitlich entweder die abgewandte
oder zugewandte Seite mit einem 25 cm Lineal als Maßstab fotographiert. Die
Lungenschnitte mit Agarumhüllung standen nach Randomisierung entweder für die
Elektronenmikroskopie (für nachfolgende Arbeiten) oder für lichtmikroskopische
Auswertungen zur Verfügung. Auf die Lungenscheiben wurde eine Schablone mit
kreisförmigen Aussparungen im selben Abstand (je nach Lungengröße: 2 cm oder 3
cm) aus einer Höhe von ca. 20 cm geworfen. In die kreisförmige Aussparung der
Schablone
wurde
als
Markierung
eine
Nadel
gesteckt
und
ein
Stück
Lungenparenchym rechts oberhalb für die Elektronenmikroskopie und links unterhalb
für die Lichtmikroskopie mit einem Skalpell herausgeschnitten.4)
74
Material und Methoden
Die Probengewinnung erfolgte nach dem
Prinzip der „systematic uniform
Randomisierung“. Jede (Ziel-)Struktur der gesamten Lunge hat hierbei dieselbe
Chance gesampelt zu werden (KNUDSEN et al. 2011).
Die Probenblöcke wurden in die entsprechenden Fixantien überführt. Für die
Einbettung der ca. 0,5 cm² großen Probenblöcke zur lichtmikroskopischen
Untersuchung wurden die Proben in 0,1 % Glutaraldehyd und 4 % Paraformaldehyd
verbracht. Die Proben wurden zur weiteren Aufbereitung auf 4 °C gekühlt. Das
beschriebene Verfahren wurde laut persönlicher Mitteilung von Fr. Dr. Schnapper
durchgeführt.4)
4)
laut persönlicher Mitteilung von Fr. Dr. Anke Schnapper, Hannover am
17.10.2013
Das Verfahren ist in ähnlicher Weise auch bei KNUDSEN et al. (2011)
beschrieben.
Abb. 3.3.4:
Schneidapperatur zum exakten Schneiden der Lungen (von der
Forschungswerkstatt der Medizinischen Hochschule Hannover
konstruiert)
75
Material und Methoden
3.3.4
Aufbereitung der Proben für die lichtmikroskopische
Untersuchung
Einbettung des Lungenparenchyms und Anfertigung der Gewebedünnschnitte
Diese Arbeiten wurden von Frau Andrea Herden, Institut für Funktionelle und
Angewandte Anatomie der Medizinischen Hochschule Hannover, durchgeführt. Des
Prozedere entsprach weitgehend dem unter 3.2.5 beschriebenen.
3.3.5
Protokoll der lichtmikroskopischen Auswertung
Verfahren wie in 3.2.6.
3.3.6
Berechnung der stereologischen Parameter
Verfahren wie in 3.2.6.
3.4
Statistik 5)
Zur statistischen Auswertung der Daten kam, wie häufig üblich, die Statistik-Software
SAS® Version 9.1 2006 (Fa. SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) zum Einsatz.
3.4.1
Statistische Auswertumg von vor und nach der Infektion
erhobenen Daten
Gemäß SACHS u. HEDDERICH (2009, 464-468) wurde zum Vergleich der Daten,
die vor und nach der Infektion erhoben worden waren, der Vorzeichen Rang-Test von
Wilcoxon (Wilcoxon matched pairs signed rank test) durchgeführt Es wurde
untersucht, ob sich die Parameter (Vv und Sv der Surfactantsubtypen, V/S ratio von
ulv und tm, minimale Oberflächenspannung, klinischer/ultrasonographischer und
röntgenologischer Score, Respiratory Health Score, etc.) jeweils vor und nach der
Infektion signifikant unterscheiden (SACHS u. HEDDERICH 2009, 464-468).
76
Material und Methoden
Die Rangkorrelationskoeffizienten nach SPEARMAN
wurden berechnet, um
Zusammenhänge zwischen klinischen, funktionellen und stereologischen Parametern
vor und nach der Infektion zu analysieren (KREIENBROCK u. SCHACH 2005, S. 8890).
3.4.2
Statistische Auswertung der Daten, die nach Immersions- oder
Perfusionsfixierung lichtmikroskopisch erhoben wurden
Laut SACHS u. HEDDERICH (2009, 451-458) wurde für den statistischen Vergleich
der Daten, die nach „Immersionsfixierung“ und die nach „Perfusionsfixierung“
erhoben worden waren, der Wilcoxon Rangsummentest für zwei unabhängige
Stichproben verwendet. Es wurden zwei unabhängige Zufallsstichproben von
Messwerten verglichen (SACHS u. HEDDERICH 2009, 451-458).
Die Rangkorrelationskoeffizienten nach SPEARMAN
wurden berechnet, um
Zusammenhänge zwischen klinischen und stereologischen Parametern bei der
„Immersionsfixierung“ zu analysieren (KREIENBROCK u. SCHACH 2005, S. 88-90).
5)
Ein besonderer Dank geht an dieser Stelle an Herrn Dr. Beyerbach, der bei
der statistischen Auswertung der Daten geholfen hat.
77
Manuskript
4. Manuskript:
Characterization of the inflammation-caused alterations
of surfactant in pigs infected by
Actinobacillus pleuropneumoniae
Diana Busley1■
Email: [email protected]
■
Corresponding author
Matthias Ochs2,3
Email: [email protected]
Doris Hoeltig1
Email: [email protected]
Martin Ganter1
Email: [email protected]
Christa Acevedo4
Email: [email protected]
Andreas Schmiedl2,3*
Email: [email protected]
Isabel Hennig-Pauka5*
Email: [email protected]
1
Clinic of Swine and Small Ruminants, Forensic Medicine and Ambulatory Service,
University of Veterinary Medicine Hannover, Bischofsholer Damm 15, 30173
Hannover, Germany
2
Institute of Functional and Applied Anatomy, Hannover Medical School, Carl-NeubergStr. 1, 30625 Hannover, Germany
78
Manuskript
3
Biomedical Research in Endstage und Obstructive Lung Disease Hannover
(BREATH), Member of the German Center for Lung Research (DZL), Hannover,
Germany
4
Department of Pediatric Pulmonology and Neonatology, Hannover Medical School,
Carl- Neuberg-Str. 1, 30625 Hannover, Germany
5
Clinic for Swine, Department for Farm Animals and Veterinary Public Health,
University of Veterinary Medicine, Vienna, Veterinärplatz 1, A-1210 Vienna, Austria
*
Equal contributors.
Abstract
Background
Pathogen caused alterations are analyzed during experimental aerosolic infection using
Actinobacillus pleuropneumoniae (A.pp.) as the challenge organism. In this study a functional
and ultrastructural analysis of porcine surfactant was performed in five pigs seven days prior
to and seven days after infection with A.pp. serotype 7. Surfactant was isolated from
bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and examined for its functional properties in a Pulsating
Bubble SurfactometerTM. Surfactant subtypes were characterized using a transmission
electron microscope (TEM) and quantified stereologically.
Results
TEM analysis of surfactant resulted in an unexpected distribution of the surfactant subtypes.
Inactive forms, which are usually increased in other species during inflammation, were most
abundant in pigs prior to infection. The active surfactant component had a tendency to lower
volume densities and the inactive subtype to higher volume densities in infected pigs,
although all pigs had severe inflammatory lung alterations. The minimal surfactant surface
tension after infection was only slightly increased and did not show any tendencies or
significances.
Conclusions
Summa summarum, infected swine exhibited a tendency to more active surfactant subtypes
in the BALF (p=0.0625) than controls and may therefore adapted effectively to inflammatory
lung disorders. This might be one possible explanation for the observation, that pigs do not
show clinical signs during this stage of infection in spite of severe lung tissue alterations.
79
Manuskript
Keywords
Actinobacillus pleuropneumoniae, surfactant, brochoalveolar lavage fluid, stereology,
minimal surface tension, clinical and lung lesion score
Background
Porcine respiratory disease
The species swine shows several similarities to human anatomy and physiology
(Swindle and Smith 2008), so that swine becomes more and more important as an
animal model for studying human diseases (Swindle and Smith 2008, Hohlfeld et al.
1999 a, Trachsel et al. 2011, Rogers et al. 2008). Nevertheless, both species -swine
and human- have its own functional anatomy (Schwegler 2002 a, König and Liebich
2012 a). For this reason pig disease models should be thoroughly characterized in
order to define limitations regarding the comparability with humans.
In contrast to the human lung (Schwegler 2002 b, p. 229), the porcine lung is
subdivided into seven lung lobes, which are separated from each other by connective
tissue (König and Liebich 2012 b, p. 382). For this reason naturally occurring
pneumonia is often found in specific localizations in the lung next to nearly unaffected
lung tissue (Reinhold 2002). Different substances in the porcine epithelial lining fluid
have been described previously, as glycoproteins (Kahlisch et al. 2009), antimicrobial
peptides (Hennig-Pauka et al. 2007 a) and acute phase proteins (Hiss et al. 2008).
It was found, that swine are well equipped with naturally occurring antimicrobial
substances, considered to be the first line of defense after microbial invasion
(Hennig-Pauka et al. 2012).
The so called porcine respiratory disease complex (PRDC) still cause high economic
losses in modern pork production (White 2011). For this reason research in
respiratory tract diseases in swine focuses on the development of new vaccine
candidates and therapeutics as well as on virulence factors and strategies fighting
the respective pathogens (modified according to Hennig-Pauka et al. 2012).
80
Manuskript
The fact, that the species swine is an important model for human diseases (Swindle
and Smith 2008, Rogers et al. 2008), demanded precise knowledge of the lung milieu
in healthy and infected pigs.
Knowledge about local inflammatory reactions and innate immune defense
mechanisms in the porcine lung might be important for the future development of
diagnostic tools as well as for preventive and therapeutic measures (Hennig-Pauka
et al. 2012).
In addition, this knowledge is indispensable for the assessment if results from swine
can be transferred to human (Rogers et al. 2008). The characterization of porcine
epithelial lining fluid and surfactant covering the airway surface is a basis for future,
practice-oriented as well as basic research (modified according to Hennig-Pauka et
al. 2012)
The Gram-negative, non-motile und non-spore-forming bacterium Actinobacillus
pleuropneumoniae (A.pp.) is not only a primary pathogen of the respiratory tract of
swine (Ewers and Wieler 2011, p. 226, 229) causing high economic losses to the pig
industry (Penrith and Henton 2004, p. 1661), but also an excellent challenge
organism for experimental infection models to study pathogen caused alterations
(Hennig-Pauka et al. 2012, Brauer et al. 2012, Höltig et al. 2009, Höltig et al. 2008).
Up to date 15 serotypes have been described (Gottschalk 2012, p. 654). In general
pigs become infected by aerosols or get direct contact, so that the tonsils are the first
colonized tissue (MacInnes et al. 2008).
Clinical signs of an acute infection are anorexia, fever, dyspnea, coughing and
sometimes mouth breathing. In chronic cases either swine show coughing of varying
intensity and intolerance of exercise or they are lacking any clinical signs (Gottschalk
2012, p. 659).
Acute
lung
lesions
are
characterized
by
fibrinous
to
fibrinonecrotic
bronchopneumonia. In chronic cases, pulmonary sequestra and reduced weight gain
dominate (Penrith and Henton 2004, p. 1661). The advantage of experimental
infection models using A.pp. as a challenge pathogen for studying pathogen caused
alterations is the reliable reproducibility of this different stages of disease (Höltig et al.
2009).
81
Manuskript
Especially subacute to chronic lung alterations were of high scientific interest,
because chronic inflammatory can be studied in lung tissue in parallel to persistence
mechanisms of pathogens (Baltes et al. 2003, Jacobsen et al. 2005).
Pulmonary surfactant
Pulmonary surfactant protects the air-liquid interface by surface tension reduction
and stabilization of the alveolus during the respiratory cycle (Clements 1997,
Enhorning 2001). To study the physical properties of pulmonary surfactant a
pulsating bubble surfactometer has been developed which simulates the spherical
structure of an alveolus (Enhorning 2008). Alterations of the surfactant surface
tension for example caused by extravasating plasma proteins could be measured
properly (Enhorning 2008).
Surfactant contains approximately 90% lipids, mainly phospholipids, and 10%
proteins (Cockshutt and Possmayer 1992, p. 340) ((including surfactant specific so
called surfactant proteins (SP) (Cockshutt and Possmayer 1992, p.342)). While the
hydrophilic SP-A and SP-D participate in immunoregulating processes (Van
Iwaarden et al. 1990; Van Iwaarden et al. 1991; Van Iwaarden 1992; Van Iwaarden
et al. 1992 a; Van Iwaarden et al. 1992 b) and belong to the innate immune system
(Wright 2004), the hydrophobic SP-B and SP-C are mainly responsible for the
biophysical stability of the surfactant layer (Cockshutt and Possmayer 1992, p. 343344). Alveolar epithelial type II cells (AEII) produce, store and secret surfactant by
exocytosis (Mühlfeld and Ochs 2010, p. 4). Lamellar bodies (LB), the storage
organelles, are secreted by exocytosis, freshly secreted LB occur in the alveolar
hypophase as densely packed lamellar body- like forms (lbl) (Ochs 2010). These
forms are converted into the lattice like structure defined as tubular myelin (tm), when
SP-A is attached to their outer lamellae (Voorhout et al. 1991). Tm is suggested to be
the direct precursor of the tension reducing surface layer (Hawgood and Poulain
2001; Ochs 2010). Unilamellar versicles (ulv) as spent (Gross and Narine 1989) and
inactive (Ochs et al. 2006) surfactant subtypes are generated from the surfactant
layer for reuptake by AEII or macrophages (Veldhuizen and Possmayer 2004, p.
359).
82
Manuskript
Intraalveolar surfactant subtype morphology reflects different stages of surfactant
metabolism (Mühlfeld and Ochs 2010, p. 4). Intraalveolar surfactant includes small
aggregates (SA) containing ulv (Mühlfeld and Ochs 2010, p. 4).) and the large
aggregates (LA) containing predominantly lbl and tm (Schmiedl et al. 2003). All
surfactant subtypes inclusively multilamellar vesicles (mlv) are also found in the
alveolar space of perfusion fixed lungs (Fehrenbach et al. 1998; Ochs et al. 1999,
Schmiedl et al. 2003).
The SA/LA ratio, obtained from centrifugation, is used for the assessment of
surfactant samples collected by BAL from patients (Hohlfeld et al. 1999 b).
Bacterial colonization of the lung parenchyma causes a massive inflammation
characterized by an infiltration of neutrophils and macrophages, platelet activation,
vascular thrombosis, hemorrhage, edema and fibrinous exsudation (Marsteller and
Fenwick 1999). The impact of antigen-induced inflammation on the surfactant system
reveals in a surfactant dysfunction (Jarjour and Enhorning 1999).
The aim of this study was to define surfactant alterations in infected pigs with airway
inflammation. We hypothesized that in infected pig lung tissue inflammation causes
functional and morphological surfactant alterations comparable to those observed in
previous studies. These previous studies, in which inflammation was discussed,
show a decrease of biophysical properties (Van Schaik et al. 1997, Hohlfeld et al.
1998, Wright et al. 2001, Meyer and Zimmerman 2002, Hite et al. 2005, Schmiedl et
al. 2003) as well as increased protein concentration (Wright et al. 2001, Van Schaik
et al. 1997) and inactive surfactant subtypes (Hohlfeld et al. 1998, Hite et al. 2005,
Schmiedl et al. 2003).
In this study functional as well as morphological surfactant parameters, as volume
density and the volume to surface ratio, were quantified in healthy and infected pigs
(according to Schmiedl et al. 2003 and 2004). Highlighting differences between swine
and human in these parameters might contribute to basic knowledge for future
research in swine as a model for human disease (according to Swindle and Smith
2008, Rogers et al. 2008) and for potential intervention strategies.
83
Manuskript
Methods
Housing, infection and examination of pigs
The five pigs examinated during this study were part of an experiment which
describes functional genes in pigs infected by A.pp. (Höltig et al. 2013; Reiner et al.
2014; FUGATO-RePoRI-Project). The project was funded by the Federal Ministry of
Education and Research, Germany under contract No. 0315129A-D.1)
Caring of piglets was performed according to the regulations of the European
Convention concerning the protection of Vertebrate animals under standardized
containment level 2 conditions (approval number: 33.9-42502-04-05/919) (Reiner et
al. 2014). Pigs of both sexes were seven weeks old (Reiner et al. 2014) and tested
negative for A. pp. using an Apx-IIA and an ApxIVA ELISA, for Mycoplasma
hyopneumoniae and Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus
(PRRSV) by antibody ELISA (HerdChek, IDEXX Laboratories, Westbrook, Maine,
USA), and for Porcine Influenza A Virus by hemagglutination inhibition test using
porcine H1N1, H1N2 and H3N2 strains (Höltig et al. 2009; Reiner et al. 2014). In the
infection trial of Reiner et al. (2014) pigs were infected after an acclimatization period
with A. pp. serotype 7 strain AP 76 aerosol as previously described Höltig et al.
(2009).
In the infection trial of Reiner et al. (2014) clinical health status of pigs was assessed
prior to infection to day 7 after infection. The clinical score was assessed as
previously described in Höltig et al. (2009).
Bronchoscopy, bronchoalveolar lavage (according to Hennig-Pauka et al. 2007 b),
ultrasonographic and radiographic examinations (according to Höltig et al. 2009)
were carried out under anaesthesia with 20 mg/kg body weight (bw) ketamine i.m.
(Ursotamin®, Serum-Werk-BernburgAG, Bernburg, Germany) and 2 mg/kg bw i.m.
azaperone (Stresnil®, Janssen-Cilag GmbH, Baar, Switzerland)1).
1)
Dr. Doris Höltig, personal communication, November 11, 2013, Hannover
84
Manuskript
A 8 MHz linear scanner (LOGIQ™ Book XP, GE Medical Systems, Chalfont St. Giles,
Great Britain) was used for ultrasonography of the lungs in lateral recumbency.
Intercostal spaces were scanned from dorsal to ventral on both thorax sides (Höltig
et al. 2009; Reiner et al. 2014).
Radiography of the thorax was performed in two views (latero-lateral and dorsoventral; Convix Generator 360, Picker Int., Munich, Germany, 400 mAs, 110 kV, 1000
ms) (Höltig et al. 2009; Reiner et al. 2014).
All pigs were necropsied on day 7 after experimental infection and lungs were
removed from the thorax. Postmortal scoring for lung lesions have been described
previously (Reiner et al. 2014; Hannan et al. 1982). Briefly, pathomorphological
findings were recorded in a schematic map of the porcine lung, where different lobes
were divided into triangles. A maximal lung lesion score of 35 with a maximal score
of 5 for each each lobe was possible (Reiner et al. 2014; Hannan et al. 1982).
Bacteriological examinations followed to ensure a persistent infection with A.pp
(Reiner et al. 2014).
The clinical, ultrasonographic and radiographic scores prior to infection and at day 7
after infection were divided by their maximal reachable scores, added and divided by
three. This percentage value was the Respiratory Health Score used for the
quantification of disease susceptibility in living pigs. Scoring has been described in
detail previously (Höltig et al. 2009; Reiner et al. 2014).
85
Manuskript
Bronchoalveolar lavage
According to Hennig-Pauka et al. (2007 b), Bronchoalveolar lavage was performed
seven days prior to infection and on day 7 after infection under deep anesthesia. A
flexible bronchoscope tip was positioned into the bronchus trachealis. Throughout the
working channel 100 ml of 154 mmol sodium chloride was instilled into the bronchus.
Approximately 83 ml in controls and 84 ml in infected pigs (median) bronchoalveolar
lavage fluid (BALF) was recovered using a vaccum pump, procedure as previously
described in Hennig-Pauka et al. (2007 b). Total cell counts were determined in
native, undiluted BALF in a Neubauer-counting chamber (modified according to
Ganter and Hensel 1997).
Afterwards modified according to Ganter and Hensel (1997), BALF was centrifuged
(10 minutes, 200xg, 4 °C) and BALF sediment was used for cytological examination.
Cytospots were prepared for differential cell determination in BALF by centrifugation
of small amounts of resuspended BALF sediments in a cytocentrifuge (Multifuge® 4
KR Heraeus, Kendro® Laboratory Products GmbH, Langenselbold, Germany) with
200xg for 10 minutes. Cells were stained with a May-Grünwald-Giemsa staining
solution and 400 cells were differentiated at 1000x magnification, procedure modified
according to Ganter and Hensel (1997).
The cell-free supernatant of BALF was stored at -80 °C for the examination of
surfactant, later an ultracentrifugation (1 hour und 50 minutes, 60000xg, 4 °C) for the
preparation of surfactant pellets followed, modified according to Bernhard et al.
(2000).
For biophysical examination the surfactant pellets were resuspended in saline 154
mmol/l to which 1.5 mmol/L calcium chloride were given to guarantee standardized
phospholipid concentrations, surfactant pellets were stored at -80 °C until the
biophysical measurements succeeded (Bernhard et al. 2000).
Fixation and tissue processing
For electron microscopy fixation solution was added overnight, consisting of 1.5 %
glutaraldehyde (Glutardialdehyd solution 25 %, Fa. Merck KGaA, Darmstadt,
Germany) and 1.5 % paraformaldehyde (Emprove® exp. DAC Paraformaldehyde, Fa.
86
Manuskript
Merck
KGaA,
Darmstadt,
Germany)
in
0.15
M
HEPES
buffer
(N-(2-
Hydroxethyl)piperazine-N‘-2-ethane sulfonic acid, Fa. SERVA Electrophoresis GmbH,
Heidelberg, Germany) (Ochs et al. 2006). During procedures pellets were centrifuged
(10000 x g for five minutes) again (also during following steps). Subsequently, pellets
were washed two times for 6 minutes with 0.15 M HEPES buffer and four times for 6
minutes with 0.1 M sodium-cacodylate buffer (Cacodylic acid Na-salt, Fa. SERVA
Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany)(modified according to Schmiedl et al.
(2004)).
For
postfixation
the
samples
were
placed
in
1
%
osmium
tetroxide
(Osminumtetroxide, WAK-Chemie Medical GmbH, Bad Homburg, Germany) in 0.2 M
sodium-cacodylate buffer for 2 hours (Ochs et al. 2006).
Thereafter, pellets were washed four times for five minutes in 0.1 M sodiumcacodylate buffer and with distilled water for two times for five minutes (Mühlfeld et
al. 2013, p. 373-374). Stabilization of phospholipids and contrasting were performed
with a half-saturated aqueous uranyl acetate staining solution, containing equal parts
of uranyl acetate (Uranyl acetate – 2 H2O, Fa. SERVA Electrophoresis GmbH,
Heidelberg, Deutschland) and distilled water at 4 °C overnight (Schmiedl et al. 2004).
Subsequently, on the next day pellets were rinsed in distilled water two times for five
minutes (modified according to Mühlfeld et al. 2013, p. 374).
For dehydration, pellets were rinsed in ascending concentrations of 70 %, 90 % and
100 % acetone and, finally, pellets were immersed in epon (Dodecenyl succinic acid
anhydride, Methyl nadic anhydride, 2, 4 ,6 - Tris (dimethylaminomethyl)phenol, Glycid
ether 100, Fa. SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany) (modified
according to Ochs et al. 2006) and acetone in a proportion of 1:1 for 1 hour (modified
according to Mühlfeld et al. 2013, p. 374). Samples were left in fresh epon overnight,
then samples were immersed in epon again, put into moulds and left at 40 °C for 24
hours and at 60 °C for 48 hours in a heating cabinet (modified according to Mühlfeld
et al. 2013, p. 374). Ultrathin sections (Leica EM UC7, Leica Mikrosysteme GmbH,
Vienna, Austria) of 60-70 µm thickness were stained with uranyl acetate for 15
minutes and lead citrate (lead II -nitrate, trisodium citrate dihydrate, Fa. Merck KGaA,
87
Manuskript
Gemany, trisodium citrate dihydrate) for two minutes, ultrathin sections were stored at
room temperature in grid boxes (modified according to Schmiedl et al. 2004).
Transmission electron microscopy
Quantitative measurements were carried out on ultrathin sections of each pellet,
sections were examined in a transmission electron microscope (TEM) (Morgagni
268, FEITM, Eindhoven, Netherlands) equipped with a camera (Veleta CCD, Olympus
SIS, Münster, Germany) connected to a computer (software: iTEM (Olympus SIS
GmbH, Münster, Germany) (Schmiedl et al. 2003). Between 20 and 60 micrographs
per section were examined. Three to five sections in three different depths of cut per
pig were used (modified according to Schmiedl et al. 2003).
The distance between two micrographs (magnification: 18.000x) was 150-200 µm of
the abscissa and 150-200 µm of the ordinate.
Abscissa and ordinate were part of a measurement framework of the TEM, the
analysis was in accordance with the principle of systematic uniform random sampling
and blind study (Fehrenbach and Ochs 1998).
More than 200 counts per section were examined to ensure that the total variability
depended on the biological variability between individuals and not on the
stereological measurements (Howard and Reed 2010, p. 7).
Stereology
To characterize the ultrastructure of surfactant subtypes quantitatively a stereological
approach was chosen (Hsia et al. 2010). Stereology creates statistically valid data in
accordance with “good laboratory practice” (Knudsen and Ochs 2011). Different
surfactant subtypes were stereologically analysed by point or line intersection
counting (Schmiedl et al. 2003). This is a precise instrument to define pathological
surfactant alterations and to study treatment effects (Ochs 2010).
The volume density and volume to surface ratio of the different surfactant subtypes
were performed using the online software (according to Schmiedl et al. 2004)
STEPanizer© stereology Tool Version 1 [URL: http://www.stepanizer.com/].
88
Manuskript
Recording of the counts was performed by the keypad, each key was associated with
one stereological parameter (Tschanz et al. 2011). The following subtypeas were
characterized: tubular myelin (tm) and lamellar body-like forms (lbl) corresponding to
active forms of surfactant, unilamellar vesicles (ulv) corresponding to inactive forms
(Schmiedl et al. 2003) and structures largely corresponding to multilamellar vesicles
(mlv) (Schmiedl et al. 2003). According to Schmiedl et al. (2003) and Howard and
Reed (2010, p. 57), the volume density (VV) [%] was calculated by dividing the
counted points hitting one of the subtypes by the counted points hitting all subtypes
(mlv, ulv, lbl and tm). The resulting fraction was given as percent by multiplying with
100 (Schmiedl et al. 2003; Howard and Reed 2010, p. 57):
Vvsubtype [%]
=
P subtype x 100
P (ulv + mlv + lbl + tm)
(Schmiedl et al. 2003
Howard and Reed 2010, p. 57)
The volume to surface ratio was determined using the following formula (Weibel
1979):
V/S-ratiosubtype [µm]
=
sum of all subtype counting hits x (test line segment length / 2)
sum of all line intersections with subtype x 2
(Weibel 1979)
Pulsating bubble surfactometry
To characterize the function of surfactant the minimal surface tension was
determined using a Pulsating Bubble SurfactometerTM (PBS; Electronetics, Amherst,
NY) as described by Enhorning (1977). Briefly, a volume of 38 µl surfactant
suspension was placed in the sample chamber of the PBS at 37 ºC (modified
according to Bernhard et al. 2000). Movement of pistons inside the sample chamber
89
Manuskript
resulted in a bubble within the surfactant suspension, the correct position and
integrity of the bubble was controlled by eye during the experiment (Enhorning 1977).
According to Bernhard et al. (2000), surfactant was allowed to adsorb to the air-liquid
interface for 10 seconds. Thereafter, the bubble was pulsated with 20 oscillations per
minute. During these cycles the bubble had a minimal radius of 0.4 mm and a
maximal radius of 0.55 mm. Pressure changes during pulsation were measured by a
pressure transducer. Procedures were performed according to Bernhard et al.
(2000).
After reaching the steady state, surface tension was assessed by the law of La Place
(ΔP= 2γ/R, ΔP = difference of pressure, which is dependent on the surface tension of
the fluid covering the alveolar surface (γ) and the radius of the alveolus (R))
(Enhorning 2008).
Statistical analysis
Data were analysed using the statistical software SAS ® (SAS Institute Inc., Cary, NC,
USA). Significant differences between paired samples prior to and after infection
were calculated using the Wilcoxon Signed-Rank test (according to Sachs and
Hedderich 2009). The Spearman’s rank correlation coefficients were calculated to
determine correlations between the clinical, functional and stereological parameters
prior to and after infection (according to Kreienbrock and Schach 2005).
90
Manuskript
Results
Clinical and laboratory diagnostic findings
The clinical respiratory health scores combine the clinical parameters and were
calculated according to Hoeltig and coworkers (2009) (Reiner et al. 2014). In
euthanized pigs lung lesions were quantified according to Reiner et al. (2014). Data
used for the definition of the lung health status are shown in table 1.
In this study cell counts in bronchoalveolar lavage fluid were implemented in the
evaluation.
All pigs were severely ill during the first days after infection. A clinical improvement
took place mostly from day three on after infection without any treatment, so that no
obvious clinical signs could be recorded any more at day 7 after infection.2)
Nevertheless, all subscores as clinical, ultrosonographic and radiographic scores as
well as the overall Respiratory Health Score were statistically noticeable increased at
this point of time (table 1).2) Total BALF leucocytes as well as differential
inflammatory cell counts (lymphocytes, neutrophils and macrophages) were not
significantly increased (table 1).2)
Morphology of surfactant subtypes (Fig. 2)
Different stereological parameters of surfactant morphology were quantified in
healthy and infected pigs, as volume density of various manifestations of surfactant
and the respective volume to surface ratios.
The impact of infection onto changes in the surfactant system was analyzed after
infection. Changes comparable to human surfactant were assumed.
Surfactant of healthy pigs prior to infection showed a tendency to more inactive
surfactant components than after infection (table 1).
2)
Dr. Doris Höltig, personal communication, November 11, 2013, Hannover
Data were assessed in course of FUGATO-RePoRI
91
Manuskript
The Vvtm was statistically noticeable increased after infection (p=0.0625). The Vvlbl
showed no noticeable changes prior to or after infection and the volume to surface
ratio of lbl was nearly comparable. The Vvmlv did not significantly reveal in
differences. Therefore, the relation of ulv to tm and lbl (corresponding to the relation
of SA/LA) showed no statistical differences between healthy pigs and A.pp. infected
pigs.
LLS showed a significant negative correlation with the Vvlbl prior to infection
(p=0.0374). The data also demonstrate a significant positive correlation between the
Vvulv and the clinical score, radiographic score and RHS after infection (p=0.0374);
(clinical and lung lesion scoring published in Reiner et al. 2014).
Average minimal surface tension
There was a statistically noticeable increase in the mean minimal surface tension
after infection, although the median (4.2 mN/m) of infected pigs was not as high as
expected deduced from experiences in human medicine and other species. The
range of measured minimal surface tension is shown in table 1.
The data demonstrate significant positive correlation between macrophages in BALF
and the minimal surface tension on day 0 (r=1, p<.0001).
92
Manuskript
Discussion
Selected five pigs were part of an infection trial (FUGATO-RePoRI-Project). This
project, inter alia, included various examination methods as a sophisticated clinical
examination, radiographic and ultrasonographic scoring (according to Reiner et al.
2014).
Obviously pigs were in the stage of recovery after acute infection, when consolidation
of lung tissue alterations took place.3)
It is known from clinical infection, that several environmental factors are decisive for
the outcome of disease, e.g. stress, crowding and cold stress (Gottschalk 2012, p.
658). All these factors can be excluded in this study, where pigs were kept in a
comfortable and calm environment (Reiner et al. 2014).
The procedure of bronchoalveolar lavage causes by itself an influx of neutrophils
inside the airways, so that subsequent examinations should not be in at least four
days intervals (according to Ganter and Hensel 1997).
The decision for this point of time for sampling was, that piglet’s condition was
adequate to survive the procedure of anaesthesia and bronchoalveolar lavage. 3)
In addition, the question should be addressed, if the extent of pathomorphological,
consolidated lung alterations is correlated to changes in the surfactant system.
Neutrophils, considered to be a sensitive marker for an affection of the respiratory
tract (Ganter and Hensel 1997) were not significantly increased in the selected pigs.
However, in the BALF harvested from infected lungs the percentage of neutrophils
had a tendency to higher values. Furthermore, the percentage of macrophages,
which normally appear in higher number in healthy pigs (Ganter and Hensel 1997),
had lower values.
3)
Dr. Doris Höltig, personal communication, November 11, 2013, Hannover,
93
Manuskript
The aerosol infection model was chosen to simulate the natural route of infection with
a first contact of the pathogen to the mucosal surfaces of the upper respiratory tract
(according to MacInnes et al. 2008). This route of infection was found to be
appropriate to achieve an acute/chronic stage of disease without high lethality
(according to Höltig et al. 2009), although pigs had suffered from acute respiratory
symptoms during the prior acute stage of disease.4)
Experimental intratracheal infection usually resulted in severe, mostly fatal disease
models (Hennig-Pauka et al 2008). Bronchoalveolar lavage was performed seven
days prior to infection and on day 7 after infection.
In this stage of infection acute disease passes into the subacute stage of infection
(Baumgärtner and Schmidt 2011, p. 185), when most of the pigs do not show clinical
symptoms any longer, but have severe pathomorphological lung alterations (table
1).4)
A. pp. is able to persist in encapsulated necrotic lung tissue sequesters and in
tonsillar crypts under anaerobic conditions, these persistently infected carrier pigs are
involved in disease dissemination and are an important target for disease control
(Jacobsen et al. 2005).
Our results indicate, that surfactant of infected pigs had a tendency to higher values
of active surfactant components than in healthy pigs. Surfactant components such as
unilamellar vesicles are considered to be ‘spent’ or inactive surfactant forms
(Mühlfeld and Ochs 2010, p. 4) with little surface activity (Gross and Narine 1989).
Surfactant dysfunction could be explained by an influx of plasma proteins (Seeger et
al. 1993 a, b; Park et al. 1998) or serum proteins (Ueda et al. 1994) or “incorporation
by fibrin” (Seeger et al. 1993 a, c).
4)
Dr. Doris Höltig, personal communication, November 11, 2013, Hannover,
94
Manuskript
Another hypothesis is, that plasma proteins and surfactant lipids compete for space
at the interface, plasma proteins also might promote the displacement of lipid from
the monolayer (Keough et al. 1988).
Deduced from previous studies (Hohlfeld et al. 1998, Veldhuizen et al. 1995,
Schmiedl et al. 2003) the hypothesis of our study was, that inactive surfactant forms
would be increased in infected pigs. This hypothesis could be rejected.
One possible explanation for an increase of active componentsin diseased pigs might
be, that there was an increased compensatory production of active subtypes due to a
higher conversion rate during inflammatory processes (according to Schmiedl et al.
2003). This can be interpreted as a response mechanism in swine, reflecting
effective adaptation to inflammatory processes in this species.
However, only an adequate amount of functional surfactant within the respiratory
tract guarantees the maintenance of gas exchange throughout an intact air-blood
barrier (according to Bernhard et al. 2001 a).
In contrast to these data according to Hohlfeld et al. (1999 b), in humans with asthma
an increase of the relation of SA/LA after allergen challenge was demonstrated. This
indicated the higher conversion of active to inactive surfactant components without a
sufficient response mechanism leading to a significant increase of surfactant
precursors in the alveolar space. Physiologically, the conversion of functionally active
surfactant components is mediated by SP-A. It was shown, that BALF-SP-A levels of
patients with asthma declined, which is discussed to be one reason for a high
concentration of inactive surfactant forms (Hohlfeld et al. 1999 b).
The SA/LA ratio and altered SP levels could be considered as benchmarks for the
detection of high-risk patients in an early stage of acute lung injury (Lewis et al.
1994).
Another study in mice, infected with Respiratory Syncytial Virus, also discussed the
malfunction of surfactant explained by plasma protein influx and hydrolysis caused by
mediators of inflammatory cells (Van Schaik et al. 1997).
It has been described previously that in surfactant of healthy human a minimal
surface tension of <5 mN/m by 10 cycles occurred (Bernhard et al. 2001 b). In
95
Manuskript
contrast to that, in persons with pneumonia (Sutnick and Soloff 1964) and pneumonia
caused by bacteria the surface tension was increased (Hamm et al. 1996).
Rose and Lindberg (1968) demonstrated, that after incubation of different gramnegative bacteria species (Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas
aeruginosa, Aerobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae und Escherichia coli) with
alveolar lavage of rabbits a significant increase of surface tension appeared (Rose
and Lindberg 1968).
Rau et al. (2004) showed, that in newborn piglets the minimal surface tension was
found to be significantly lower than in adolescent pigs. This reflects a molecular
adaptation of surfactant function and biochemistry to respiratory physiology of
newborn pigs with breathing at higher rates during pulmonary development (Rau et
al. 2004). Similar to human, in surfactant of healthy swine a minimal surface tension
of < 5 mN/m by 10 cycles has been described (Bernhard et al. 2001 b). It has been
previously shown, that a low surface tension was mainly mediated by dipalmitoylphosphatidylcholin, although in piglets relatively low concentrations were measured
(Rau et al. 2004).
In our study the increase of the minimal surfactant surface tension after infection was
not as high as expected, so that the primary hypothesis could not be confirmed. In
connection with the morphology of surfactant subtypes a higher supply of functionally
active surfactant subtypes can be assumed. Freshly produced active surfactant
subtypes were probably able to reduce the surface tension of pulmonary surfactant
after infection. Furthermore a positive correlation between macrophages in BALF and
the minimal surface tension prior to infection was demonstrated.
Macrophages normally appear in higher number in healthy pigs (Ganter and Hensel
1997).
96
Manuskript
Conclusions
The changes in the composition of surfactant subtypes during the course of infection
might be explained by a higher, compensatory production of tm and lbl, as active
surfactant subtypes, in A.pp. infected pigs during inflammatory processes. These
subtypes were able to reduce the minimal surface tension properly.
The clinical data show that the pigs were already in convalescence 5), reflecting
effective and quick adaptation to inflammatory processes in this species.
Abbreviations
AEII, alveolar epithelial type II cells; A.pp., Actinobacillus pleuropneumoniae; BAL,
bronchoalveolar lavage; BALF, bronchoalveolar lavage fluid; bw, body weight; LA,
large aggregates; lb, lamellar bodies; lbl, lamellar body- like forms; LLS, Lung Lesion
Score; mlv, multilamellar vesicles; RHS, Respiratory Health Score; SA, small
aggregates; SP, surfactant protein; TEM, transmission electron microscope; tm,
tubular myelin; ulv, unilamellar versicles; Vv, volume density; V/S-ratio, volume to
surface ratio; γmin, average minimal surface tension;
Competing interests
The authors declare that they have no competing interests.
Author’s contribution
DB established the scientific protocols for the evaluation of BALF surfactant and
quantified surfactant subtypes by TEM and STEPanizer as an evaluation software.
She also drafted the manuscript. IHP helped to design the study and to draft the
manuscript. AS planned the determination of the surfactant subtypes and their
5)
Dr. Doris Höltig, personal communication, November 11, 2013, Hannover,
97
Manuskript
specific evaluation, and instructed and attended the stereological evaluation and
revise it critically. MO designed the stereological examination procedures and revised
it critically. DH carried out the clinical and pathological studies. CA measured the
surfactant function with the PBS. MG prepared the cell-free bronchoalveolar lavage
fluid supernatants and determined the cellular parameters. All authors proofread the
manuscript.
Acknowledgements
Advices given by Martin Beyerbach (Department of Biometry, Epidemiology and
Information Processing, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg 2,
30559 Hannover, Germany), has been an extraordinary help in performing the
statistic evaluations. The authors would like to acknowledge the help provided by
Mrs. Ariane Jacobi and Mrs. Anne Menzel. Special thanks are extended to the staff
of the Department of Functional and Applied Anatomy Hannover Medical School,
especially Mrs. Andrea Herden, Mrs. Susanne Fassbender and Mrs. Sabine Fiedler.
MO is supported by the DFG (SFB 587/ TP 18, OC-23/9-3 and 10-1) and the BMBF
(German Center for Lung Research DZL).
References
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98
Manuskript
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Figure legends
Figure 1 Counting of points and intersections using the STEPanizer©
Stereology tool. According to Tschanz et al. (2011), the figure shows the layout of
the counting window seen in STEPanizer©, the evaluation area is a square bordered
by lines. All structures between the continuous und the dashed lines of the square
were counted, if hit by a test line segment (red line) or by a test point (green points at
the ends of test lines). Eight test line segments with 16 test points at the end were
used to define counting hits with the different surfactant structures (Tschanz et al.
2011). In this micrograph tm and mlv could be found.
Figure 2 Proportion of volume densities of different surfactant subtypes [%] in
healthy and A.pp. infected pigs. Grey columns: surfactant seven days prior to
infection, grey dashed columns: surfactant from day 7 after infection
107
Manuskript
■
Statistically noticeable difference between the two examination days prior to
infection and 7 days after infection (Wilcoxon Sign-Ranked test, five pigs).
Figure 3 Lung lesion scores and minimal surface tension [mN/m]. The minimal
surfactant surface tension is shown seven days prior to infection and at day 7 after
infection in six pigs. For data prior to infection the ordinate depicts the surfactant
surface tension as well as the abscissa. For data after infection the ordinate depicts
the lung lesion score. The Spearman’s rank correlation coefficient between the
minimal surface tension after infection; [mN/m]) and the lung lesion score was
calculated. A correlation could not be shown (correlation coefficient 0.2, p=0.7471).
Figure 4 Surfactant of a pig prior to infection. Many ulv (arrow head) are shown.
Figure 5 Surfactant of the same pig on day 7 after infection with A.pp. Mlv are
characterized
(circle)
and
tm
is
108
indicated
by
a
triangle.
Manuskript
Table 1
Various parameter in healthy and A.pp. infected pigs
Parameter
Stage of infection with A.pp. serotype 7 strain AP76
Prior infection
After infection
Minimum Median Maximum Minimum Median Maximum
Vv ulv [%]
VV mlv [%]
Vv lbl [%]
Vv tm [%]
V/S ulv [µm]
V/S lbl [µm]
Vv [%] LA
SA/LA ratio
γmin [mN/m]
Clinical Score♦
Ultrasonographic Score♦
Radiographic Score♦
RHS [%]♦
LLS♦
Leucocytes [G/l] in BALF▲
Lymphocytes [%] in BALF▲
Segmented Neutrophils
[%] in BALF▲
Macrophages [%] in
BALF▲
p-value
23.58
58.74
2.36
0
0.49
1.11
2.79
4.96
0.69
0
0
0
0
0.35
1
35.18
62.01
2.84
0.29
0.61
1.50
2.84
12.48
1.8
0
0
0
0
0.59
2.2
38.43
71.9
5.48
0.43
0.69
1.88
5.77
13.55
2.9
0
2
0
0.33
0.82
3.5
19.23
54.02
3.24
0.48
0.48
1.01
3.72
1.30
1.6
0.93
33
9
14.54
10.08
0.51
0.7
24.4
70.09
8.47
1.89
0.65
1.69
10.67
3.04
4.2
2.2
54
12
19.76
12.89
0.54
1.5
34.61
70.41
12.61
4.8
0.87
2.26
17.41
7.03
6.0
2.9
94
19
30.97
20.87
5
4.2
0.0625■
0.8125
0.1875
0.0625■
0.3125
0.3125
0.1250
0.1250
0.1250
0.0625■
0.0625■
0.0625■
0.0625■
0.3750
0.50
0
0.2
2.7
1.5
3.5
30
0.0625■
93.7
97.5
99
68.5
92.2
97
0.1250
Vv = Volume densities of surfactant subtypes [%], V/S = Volume to surface ratio [µm], γ min = Average minimal surface tension
■
[mN/m], RHS = Respiratory Health Score [%], LLS = Lung Lesion Score, =statistically noticeable,
♦
= part of an infection trial (FUGATO-RePoRI-Project), personal communication Dr. D. Höltig, 16.11.2013 Hannover (article: Reiner et
▲
al. 2014); = part of an infection trial (FUGATO-RePoRI-Project)
109
Manuskript
Figure 1
110
Manuskript
Figure 2
111
Manuskript
Figure 3
112
Manuskript
Figure 4
Figure 5
113
Manuskript
114
Übergreifende Diskussion
5. Übergreifende Diskussion
Diese Arbeit umfasst zwei Themenbereiche: Surfactant- und Lungenparenchymcharakterisierung nach Infektion durch jeweils denselben, veterinärmedizinisch
relevanten Erreger mit Hilfe stereologischer Methoden.
Grundsätzlich können die in dieser Arbeit etablierten Modelle als eine Art Vorstudie
oder als Matrizen für weitere Studien zu infektionsbedingten Alterationen gesehen
werden.
Der Schwerpunkt der Arbeit liegt grundlagenorientiert auf den entzündungsbedingten
Veränderungen im Surfactantsystem.
5.1
Alterationen im Surfactantsystem (vgl. Manuskript)
5.1.1
Reflexion der Ergebnisse
Im folgenden Ansatz sollte, in Anlehnung an SCHMIEDL et al. (2003); VAN SCHAIK
et al. (1997), herausgestellt werden, inwieweit sich die Qualität des Surfactants
(stereologische Darstellung der Subtypen und Funktion) in pathologischen und
klinischen Parametern wiederspiegelt. Falls ein Zusammenhang besteht, könnte man
als
weiteren
Parameter
zur
Definition
des
Lungengesundheitsstatus
die
Untersuchung des Surfactants (ultrastrukturell, biophysikalisch) heranziehen.
Um die entzündungsbedingten Veränderungen zu beschreiben, wurden die
Volumendichten der Surfactantsubtypen, die Volumen-/Oberflächenverhältnisse
bestimmter Surfactantsubtypen (jeweils repräsentativ für aktive und inaktive
Strukturen) und die minimalen Oberflächenspannungen vor und nach der Infektion
bestimmt (in Anlehnung an SCHMIEDL et al. 2003).
Weitere
Bausteine
waren
die
klinischen
Parameter,
die
durch
klinische,
röntgenologische, ultrasonographische und pathomorphologische Untersuchung im
Rahmen des vorangegangenen FUGATO-RePoRI-Projektes (publiziert in REINER et
al. 2014) erhoben wurden. Zudem wurde die BALF zytologisch (ebenfalls FUGATORePoRI-Projekt) untersucht.
Zur Durchführung der Infektion wurde ein Aerosolverfahren gewählt, in dem die
115
Übergreifende Diskussion
Schweine in einer Kammer mittels Vernebelung der Bakteriensuspension aerogen
infiziert wurden (REINER et al. 2014).
Dieses Verfahren erschien besonders sinnvoll,
da es den natürlichen Infektionsweg wiederspiegelt (WEISS u. RUDOLPH 2007, S.
66).
Die klinischen und pathomorphologischen Daten sind im Rahmen des FUGATORePoRI- Projektes (publiziert in REINER et al. 2014) erhoben worden. Die klinischen
Scores
(Klinische
Ultrasonographie,
Untersuchung
Röntgen
und
mit
RHS)
Schwerpunkt
der
fünf
Respirationstrakt;
ausgewählten
Schweine
unterschieden sich statistisch auffällig (p=0,0625) vor und nach der Infektion,
während sich die zytologischen Befunde in der BALF nicht signifikant unterschieden.
Lediglich die Segmentkernigen Granulozyten in der BALF waren nach der Infektion
statistisch auffällig höher (p=0,0625)7).
Die Schweine waren im Stadion der Rekonvaleszenz und bereits in der subakuten
Entzündungsphase (zur Definition für subakut, vgl. BAUMGÄRTNER u. SCHMIDT
2011, S. 185) als sich die Konsolidierungen im Lungenparenchym manifestierten. 6)
Genau in diesem konsolidierten Lungenparenchym, den Krypten der Tonsillen und
den Epithelzellen des Respirationstraktes kann der Erreger über Wochen und
Monate nach der Infektion überleben (JACOBSEN et al. 2005).
Die Tiere zeigten in diesem Stadium bereits keine Klinik mehr6) (vgl. Anhang 1., Tab.
7.1.1) und sind stille Erregerträger und tückische Infektionsquellen (PENRITH und
HENTON 2004, S. 1661). Die Charakterisierung von Surfactant an Tag 7 der
Infektion erschien in dieser Studie besonders sinnvoll.
Die Schweine waren an diesem Tag bereits wieder stabil genug6), um eine
Neuroleptanalgesie und anschließende BAL durchzustehen.
6)
Persönliche Mitteilung von Frau Dr. Doris Höltig, 16.11.2013, Hannover
7)
Im Rahmen von FUGATO-RePoRI erhoben
116
Übergreifende Diskussion
Bei
der
Entstehung
einer
Surfactantdysfunktion
kann
pathogenetisch
die
Ausschwitzung von Plasmaproteinen (SEEGER et al. 1993 a und b; PARK et al.
1998) bzw. Serumproteinen (UEDA et al. 1994), und die „Inkorporation“ von
Surfactant durch Fibrin (SEEGER et al. 1993 b und c) genannt werden.
Des Weiteren kann es zur Verdrängung von Phospholipiden im Monolayer durch
Plasmaproteine kommen (KEOUGH et al. 1988). Bei der Beeinträchtigung der
Surfactantfunktion wird auch bestimmter oxidativer Stress (SEEGER et al. 1985) und
die Phospholipase A2 bzw. C (HOLM et al. 1991) diskutiert.
Vielen Studien, in denen u.a. ursächlich eine Entzündung (HOHLFELD et al. 1998)
bzw. direkt Entzündung als Ursache (VAN SCHAIK et al. 1997; WRIGHT et al. 2001;
SCHMIEDL et al. 2003) diskutiert wurde, zu Veränderungen im Surfactantsystem ist
gemein, dass es zu einer Verschiebung von aktiven zu inaktiven Surfactantsubtypen
(HOHLFELD et al. 1998; SCHMIEDL et al. 2003) und verschlechterten funktionellen
Eigenschaften kommt (VAN SCHAIK et al. 1997; HOHLFELD et al. 1998; WRIGHT et
al. 2001; SCHMIEDL et al. 2003).
Diese Beobachtungen bestimmten die Hypothese, auf die diese Studie mit der
Messung der Funktion und der Morphometrie des Surfactants aufbaute.
Die morphometrisch ermittelten Volumendichten [%] der Surfactantsubtypen ergaben
eine stark tendenzielle Verschiebung von inaktiven zu aktiven Surfactantsubtypen
nach der Infektion. So waren die ulv nach der Infektion mit einem p von 0,0625
erniedrigt und die tms nach der Infektion mit einem p von 0,0625 erhöht. Die lbl
waren nach Infektion größer, allerdings nicht statistisch signifikant. Die SA/LA ratio
war nach der Infektion im Median (allerdings nicht signifikant) erniedrigt, was auf eine
beginnende Verschiebung von aktiven zu inaktiven Subtypen hindeutet.
Zudem war der LLS signifikant negativ mit der Volumendichte [%] der lbl vor der
Infektion korreliert (p=0,0374). Die Volumendichte der ulv [%] nach der Infektion war
signifikant positiv korreliert mit dem klinischen Score nach der Infektion, dem
röntgenologischen Score nach der Infektion und dem RHS nach der Infektion
(p=0,0374) (LLS und klinische Daten publiziert in REINER et al. 2014).
Surfactantsubtypen, wie ulv, werden als verbrauchte Strukturen, lbl und tm hingegen
als aktive, frische Surfactantsubtypen angesehen (FEHRENBACH et al. 1998;
117
Übergreifende Diskussion
GROSS u. NARINE 1989 a).
Des Weiteren waren die stabkernigen Granulozyten im Blut nach der Infektion
signifikant negativ korreliert mit der Volumendichte des tms [%] nach der Infektion
(p=0,0374), jedoch signifikant positiv korreliert mit dem klinischen Score und dem
RHS nach der Infektion.
Stabkernige Granulozyten gehören zu den unreifen Granulozyten (MORITZ et al.
2014, S.102). Diese Form gelangt bei einem stark gesteigerten Bedarf an weißen
Blutzellen in den peripheren Geweben über die Blutbahn vom Knochenmark zu den
Zielgeweben. Dies ist bei akuter Inflammation der Fall (MORITZ et al. 2014, S. 105).
118
Übergreifende Diskussion
Abb. 5.1.1
Schematische Darstellung des Surfactantmetabolismus (aus
MÜHLFELD u. OCHS 2010, S. 4)
MÜHLFELD u. OCHS (2010, S. 4) beschreiben, dass in den AE II die
Surfactantproteine via Transskription, Translation (rER = rauhes endoplasmatische
Reticulum) und posttranslationaler Weiterverarbeitung am Golgi-Apparat und in den
multivesikulären Körperchen (MVB) gebildet werden. Für SP-A ist bekannt, dass es
in kleinen Vesikeln und/oder MVB zur Zelloberfläche gelangt und dort sezerniert wird.
SP-B und C werden in sogenannten composite bodies (CB) gebildet. Aus den CB
gehen die reifen Lk hervor. Diese werden
über Exozytose in die wässrige
Hypophase (HY) sezerniert. Die LB werden umstrukturiert und bilden tubuläre
Myelinfiguren (TM), von denen ausgehend sich der Surfactantfilm (SF) bildet.
Zusammenfassend werden die HY und der SF als alveolar lining layer (ALL)
bezeichnet. Verbrauchter Surfactant erscheint als unilamelläre Vesikel (UV). Diese
können von Alveolarmakrophagen oder von AE II aufgenommen und weiter
verarbeitet werden. Letzlich ist auch eine Beseitigung über die Luftwege möglich
(MÜHLFELD u. OCHS 2010, S. 4).
In einer humanmedizinischen Studie mit Asthmapatienten wurde eine erhöhte SA/LA
Ratio nach Allergenexposition nachgewiesen, was eine erhöhte Konversion von
119
Übergreifende Diskussion
aktiven zu inaktiven Subtypen bedeutet (HOHLFELD et al. 1999 a).
LEWIS et al. (1994) lösten beim Schaf einen Septikämie-bedingten akuten
Lungenschaden aus, der zu einer Erhöhung der SA/LA-Ratio und zu einer Reduktion
der SP A, B und C führte Die Ergebnisse können in der Humanmedizin als
Orientierungspfeiler für die Detektion von Patienten mit hohem Risiko für eine akute
Lungenschädigung genutzt werden (LEWIS et al. 1994).
OULTON et al. (1999) beschrieben eine 76-kDa Serinprotease, die als Convertase
den
heavy-aggregate
alveolären
Surfactant
zu
light
aggregate,
nicht
oberflächenaktiven Formen katabolisiert. Die Lamellenkörper in den AE II werden als
Herkunft der Konvertase vermutet (OULTON et al. 1999).
Die Ergebnisse dieser Arbeit könnten dahingehend diskutiert werden, dass es
infektionsbedingt zu einer gesteigerten, kompensatorischen Produktion von aktivem
Surfactant als Reaktion auf eine gesteigerte Konversion gekommen ist (in Anlehnung
an SCHMIEDL et al. 2003).
Dieser Vorgang könnte einen generellen Mechanismus beim Schwein darstellen, der
in der subakuten Krankheitsphase eine effektive Adaptation auf die Entzündung bei
dieser Spezies darstellt.
Funktionell aktive Surfactantsubtypen überwogen bei den infizierten Tieren. Die
Frage bleibt offen, ob diese auch oberflächenaktiv waren.
Um dieser Frage nachzugehen, wurden die minimalen Oberflächenspannungen
bestimmt (in Anlehnung an SCHMIEDL et al. 2003).
Die
zur
Bestimmung
der
Funktion
herangezogenen
minimalen
Oberflächenspannungen erwiesen sich nach der Infektion als erhöht, allerdings lag
keine Signifikanz oder ein Trend vor. Zudem muss relativiert werden, dass ein
deutlicher Anstieg über 5 mN/m, (physiologischer Bereich: <5 mN/m, wie
beschrieben in BERNHARD et al. 1997; BERNHARD et al. 2001 a; BERNHARD et
al. 2001 b), ausgeblieben ist. Der Median der minimalen Oberflächenspannung der
infizierten Tiere an Tag 7 lag bei 4,2 mN/m, die Range war zwischen 1,6 mN/m und 6
mN/m.
Studien aus der Humanmedizin belegen erhöhte Oberflächenspannungen bei
120
Übergreifende Diskussion
Pneumonien (SUTNICK u. SOLOFF 1964) bzw. bei bakteriell bedingten Pneumonie
(HAMM et al. 1996).
ROSE und LINDBERG (1968) zeigten, dass es nach Inkubation von bestimmten
gram- negativen Bakterien (Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas
aeruginosa, Aerobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae und Escherichia coli) mit
Lavagen des bronchoalveolären Raumes von Kaninchen zu einem signifikanten
Anstieg der Oberflächenspannung kam (ROSE u. LINDBERG 1968).
In einer Studie mit Saugferkeln von RAU et al. (2004) erwies sich die Funktion des
Surfactants der Saugferkel als signifikant besser als die adulter Tiere. Diese wurde
als ein Beweis dafür angesehen, dass sich auf molekularer Ebene die
Surfactantfunktion- und biochemie an die Physiologie des Atmungsapparates
während der Lungenentwicklung anpasst. Saugferkel haben höhere Atemfrequenzen
als adulte Tiere (RAU et al. 2004).
Der menschlichen Physiologie sehr ähnlich zeigte das Surfactant vom gesunden
Schwein eine minimale Oberflächenspannung <5 mN/m auf 10 Zyklen (BERNHARD
et al. 2001 b).
Ergänzend kann gesagt werden, dass sich in der vorliegenden Studie die Anzahl der
Makrophagen
in
der
BALF
signifikant
positiv
mit
der
minimalen
Oberflächenspannung an Tag 0 korrelieren ließ.
Makrophagen dominieren normalerweise bei lungengesunden Schweinen in der
BALF (GANTER u. HENSEL 1997).
Zusammenfassend ist zu sagen, dass ein Anstieg der Oberflächenspannung über
den physiologischen Grenzwert (im Median) ausgeblieben ist. Trotzdem passt das
Ergebnis
der
Funktionsanalyse
zum
morphologischen
Bild
der
Surfactantsubtypenverteilung. Der frisch sezernierte Surfactant war in der Lage die
Oberflächenspannung herabzusetzen.
Das Surfactantsystem des Schweines scheint effektiv auf entzündliche, A.pp.
bedingte Veränderungen in der Lunge zu reagieren. Dies zeigte sich in der
Produktion von frischem, oberflächenaktiven Surfactant nach der Infektion. Die
Hypothese des Zusammenhangs zwischen morphometrischem Bild und Funktion
des Surfactants dieser Spezies konnte somit bestätigt werden.
121
Übergreifende Diskussion
Allerdings muss kritisch angemerkt werden, dass sich die Tiere sich im Stadium der
Rekonvaleszenz und in der subakuten Entzündungsphase befanden.8)
Es lagen zwar noch pathologische Veränderungen und ein kultureller Nachweis von
A.pp. im Lungenparenchym vor (REINER et al. 2014), dennoch ist für eine
abschließende Beurteilung die Untersuchung des Surfactants zu einem früheren
Zeitpunkt sinnvoll. Trotzdem ist es in der vorliegenden Studie erstaunlich, wie schnell
sich das Surfactantsystem beim Schwein zu regenerieren vermochte.
5.1.2
Reflexion der angewandten Methoden und Ausblick
COSTABEL (2005) erläutert, dass die BAL als ein adäquates Verfahren erscheint,
das wenig invasiv ist und selbst bei schwer kranken Patienten durchgeführt werden
kann. Durch die Untersuchung der BALF lässt sich einfacher eine Aussage über den
Lungengesundheitsstatus treffen als durch die Untersuchung von Bioptaten
(COSTABEL 2005).
Bei der Durchführung der BAL beim Schwein ist allerdings eine Allgemeinanästhesie
unumgänglich (GANTER et al. 1993).
In dieser Arbeit wurden ergänzend neue Daten zum auch in der Humanmedizin
vermehrt genutzten Modelltier Schwein (TRACHSEL et al. 2011, HOHLFELD et al.
1999 b, ROGERS et al. 2008) gesammelt.
OCHS (2010) beschreibt, dass der intraalveoläre und intrazelluläre Surfactantpool
durch die Kombination von Elektronenmikroskopie und Stereologie qualitativ und
quantitativ umfassend analysiert werden kann. Diese Verfahren stellen sich als
wertvolle Instrumente dar, um pathologische Alterationen und Behandlungseffekte in
experimentellen Studien zu erforschen (OCHS 2010).
8)
Persönliche Mitteilung von Frau Dr. Doris Höltig, 16.11.2013, Hannover
122
Übergreifende Diskussion
Das Kernstück dieser Arbeit basiert auf der tierexperimentellen Methode der BAL.
SCHMIEDL (2007) erklärt, dass leider bei der konventionell gewonnenen BALF keine
Information über Lokalisation und Verteilungsmuster von Surfactant verfügbar ist.
Eine Variante intraalveolären und intrazellulären Surfactant zu lokalisieren ist die
Perfusionsfixierung von Lungenparenchym (s. beispielhaft unter Kapitel 3.3.), da
diese die Mikroorganisation des Surfactants nicht beeinträchtigt (SCHMIEDL 2007).
In Lungenparenchymproben kann hingegen ultrastrukturell der intrazelluläre
Surfactantpool erfasst werden (OCHS 2010). In folgenden Arbeiten wäre es folglich
sinnvoll, sich intrazelluläre Surfactantalterationen anzuschauen.
Des
Weiteren
könnte
man
die
Surfactantproteine
(SP-A)
mittels
Immunelektronenmikroskopie in ihrer Verteilung mithilfe von stereologischen
Methoden untersuchen (vgl. beispielhaft in SCHMIEDL et al. 2005).
Experimentelle Studien zur therapeutischen Surfactantsubstitution beim Schwein,
wie sie beim Menschen bei bspw. ARDS (WALMRATH et al. 2008) oder beim
Neonatalem Atemnotsyndrom (PARMIGIANI u. SOLARI 2003) beschrieben wurden,
erscheinen nach den Ergebnissen dieser Arbeit nicht sinnvoll zu sein, da diese
Tierart vermutlich Surfactantalterationen relativ schnell zu regenerieren vermag.
123
Übergreifende Diskussion
5.2
Charakterisierung der infektionsbedingten Parenchymalterationen
5.2.1
Reflexion der Ergebnisse
Im ersten Teil der Arbeit wurde auf die ultrastrukturellen Veränderungen im Surfactant
aus der BALF eingegangen. Zudem wurden die entzündungsbedingten Alterationen
auch auf Lungenparenchymebene mittels stereologischer Methoden charakterisiert
(in Anlehnung an BEHRENS 2011).
Es wurde mit einer Kontrollgruppe und einer Gruppe A.pp.- infizierter Schweine
gearbeitet (vgl. BRAUER 2012; HENNIG-PAUKA et al. 2012):
1) für die Erhebungen der klinischen, pathomorphologischen Daten ((BRAUER 2012
(beide Gruppen); HENNIG-PAUKA et al. 2012 (nur drei Kontrolltiere, infizierte Tiere
vollständig)),
2) für die histologischen Daten (im Rahmen der Infektionsstudien von BRAUER
(2012) (alle Tiere) bzw. HENNIG-PAUKA et al. (2012) (nur drei Kontrolltiere, alle
infizierten Tiere)), und
3) für die
stereologischen und computertomographisch stereologischen Daten
(BRAUER et al. 2012).
Das Infektionsmodell (A.pp. Serotyp 7, Infektion über Aerosole in einer Kammer)
wurde ähnlich wie Surfactantalterationen gewählt (BRAUER 2012). Die klinische
Untersuchung
orientierte
sich
nahezu
an
HÖLTIG
(2009)
und
für
die
pathomorphologischen Erhebungen wurde der LLS, wie beschrieben in BRAUER et
al. (2012), ermittelt.
BRAUER (2012) (beide Gruppen) und HENNIG-PAUKA et al. (2012) (nur drei
Kontrolltiere, infizierte Tiere vollständig) zeigten bereits, dass ein signifikanter
Unterschied (p=0,02) zwischen dem klinischen Score der Kontroll- und infizierten
Tiere an Tag 21 bestand. Der klinische Score lag bei den Kontrolltieren bei 0,3
(Range: 0,1 bis 0,7) und bei den A.pp.- infizierten Tieren bei 0,96 (Range: 0,81 bis
2,06; s. Anhang 2., Tabelle 7.2.1). Die Sektion der chronisch infizierten Tiere fand am
Tag 21 nach der Infektion statt. Die infizierten Tiere hatten geringgradige LLS
(Range: 4,39 bis 12,33; Median: 6,335; s. Anhang 2., Tabelle 7.2.1 und Tabelle 7.2.2.
Es bestand im Wilcoxon Rangsummentest kein signifikanter Unterschied im LLS
124
Übergreifende Diskussion
zwischen
beiden
Gruppen
(p=0,1084).
Diese
Daten
stammen
aus
den
Infektionsstudien von BRAUER (2012) (beide Gruppen) und HENNIG-PAUKA et al.
(2012) (nur drei Kontrolltiere, infizierte Tiere vollständig).
Der eingesetzte A.pp. Stamm soll laut Literatur vor allem chronische Veränderungen
auslösen (HÖLTIG et al. 2008).
Großflächige, fibrinöse Pleuropneumonie im Bereich der Hauptlappen sind
charakteristisch für eine Infektion mit A.pp. (LÓPEZ 2009, S. 502).
Abszessbildung der Nekroseherde durch Sekundärinfektion, Indurationen, adhäsive
Pleuritis und Sequestrationen (sind beschrieben WEISS u. RUDOLPH 2007, S. 66).
Pathologisch-anatomisch zeigten sich bei den infizierten Tieren verschiedenste
Verwachsungen der Lungenlappen mit umliegenden Strukturen, Sequester und
Pleuritis (BRAUER 2012 (beide Gruppen); HENNIG-PAUKA et al. 2012 (nur drei
Kontrolltiere, infizierte Tiere vollständig)). Zudem konnten Pneumonien mit Abszessoder Sequesterbildung pathohistologisch diagnostiziert werden (HENNIG-PAUKA et
al. 2012) (s. Anhang 2., Tabelle 7.2.1 und 7.2.2).
Die histologischen Präparate sind im Rahmen der Infektionsstudien von BRAUER
(2012) (alle Tiere) bzw. HENNIG-PAUKA et al. (2012) (alle infizierten Tiere, nur drei
Kontrolltiere) entnommen worden.
Bei den
histologisch-stereologischen
Untersuchungen
zeigten
sich
bei der
Volumendichte des Parenchyms [%], des Non-Parenchyms [%], der Alveolarsepten
[%] und des Alveolarluftraumes [%] und der Oberflächendichte der Alveolarsepten
[1/µm] keine signifikanten Unterschiede zwischen Kontrolltieren und A.pp- infizierten
Tieren. Lediglich die Alveolarseptendicke [µm] war statistisch auffällig größer bei den
infizierten Tieren (s. Anhang 2., Tabelle 7.2.1 und Abb. 7.2.1-3). Zudem erwiesen sich
die mithilfe des CTs bestimmten funktionellen Volumina von Parenchym [cm3],
Alveolarsepten [cm3] und pathologisch veränderten Strukturen [cm3] sowie die
Oberfläche der Alveolarsepten [cm2] als nicht signifikant unterschiedlich zwischen
den Tiergruppen (vgl. Anhang 2., Abb. 7.2.6-8 und Tabelle 7.1.1).
Volumen und Oberfläche der Alveolarsepten sind letztendlich als Maß für die
Gasaustauschfunktion
bzw.
Gasaustauschfläche
zu
sehen
(modifiziert
nach
BEHRENS 2011). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass keine Alveolarsepten
125
Übergreifende Diskussion
infektionsbedingt verloren gegangen sind. Aufgrund der tendentiell erhöhten
Alveolarseptendicke
(interstitieller
kann
Raum
und
eine
infektionsbedingte
/oder
Schwellung
Alveolarepithel,
der
Septen
Kapillarendothel)
nicht
ausgeschlossen werden.
Erklärend für die histologisch-computertomographischen Ergebnisse könnte es zwei
Hypothesen geben:
a.)
Die strukturellen Veränderungen im Lungenparenchym traten nur innerhalb
der nur sporadisch auftretenden fokalen Läsionen auf. Das Lungenparenchym
außerhalb der Läsionen zeigte keine strukturellen Veränderungen, so dass
sich bei der Auswertung des gesamten Parenchyms nach dem „systematic
random sampling“ Verfahren nach FEHRENBACH u. OCHS (1998, S. 446).
keine signifkanten Unterschiede ergaben.
b.)
Und/oder die Genesung der Tiere war bereits weit vorangeschritten.
Für
b.)
spricht,
dass
die
infizierten
Tiere
im
letzten
Drittel
des
Untersuchungszeitraumes nur noch geringgradige, klinische Symptome zeigten (vgl.
Infektionsstudie von BRAUER (2012)).
Für
die
Hypothese
a.)
spricht,
dass
sich
die
via
CT
bestimmten
Lungenparenchymvolumina statistisch auffällig (p=0,066) unterschieden haben (s.
Anhang 2., Tabelle 7.2.1 und Abb. 7.2.6.). Die infizierten Tiere hatten geringere
Lungenparenchymvolumina (Median: 566,96 cm³; Range: 539,71 cm³ bis 643,50
cm³) als die Kontrolltiere (Median: 665,56 cm³; Range: 544,90 cm³ bis 678,53 cm³)
am
Tag
der
Sektion.
Lungenparenchymvolumina
Bei
wurde
der
stereologischen
pathologisch
Berechnung
verändertes
der
Gewebe
herausgerechnet, da eine Zuordnung zu Parenchym bzw. Non-Parenchym aufgrund
der pathologischen Veränderung nicht mehr möglich war, so dass nur gesundes
Parenchym miteinbezogen wurde. Infektionsbedingt wiesen die infizierten Tiere aber
weniger gesundes Parenchym auf, das ausgezählt werden konnte. Dieses Ergebnis
zeigt, dass durch die CT-Analysen die funktionellen Lungenparenchymvolumina und
die pathologischen Veränderungen umfassender dargestellt werden konnten.
Epidemiologisch bedeutsam ist die Persistenz von A.p.p. in sequestriertem
Lungenparenchym über Wochen bis Monate, wodurch klinisch gesunde Trägertiere
126
Übergreifende Diskussion
entstehen (JACOBSEN et al. 2005).
Obwohl die Tiere zunächst stark erkrankten, welches durch den signifikanten
Unterschied im klinischen Score zwischen Kontrollen und infizierten Schweinen
erkennbar
wurde,
wiesen
die
infizierten
Tiere
gegen
Ende
des
Untersuchungszeitraumes nur noch geringgradige, klinische Symptome auf (vgl.
Infektionsstudie von BRAUER 2012).
Nur
die
CT-Analyse
der
Lungenvolumina
und
die
pathomorphologische
Untersuchung stellten die pathologischen Veränderungen wie bereits erwähnt
heraus.
Die stereologische Bestimmung von Volumina anhand von digitalen CT-Bildern nach
Infektion mit einem schweinespezifischen Erreger wurde in der Tiermedizin zum
ersten Mal durchgeführt. Zur Abgleich dieser Daten wurden die Lungenvolumina für
die Kontrolltiere nach PENZLIN (2005) (Lungenvolumen [l] = 0,046 x Körpergewicht
[kg]1,06) berechnet. Die Mediane beider Methoden unterschieden allerdings um
296,06
cm3 (p=0,0625).
Bei
der
Berechnung
von
PENZLIN
(2005)
wird
wahrscheinlich das Non- Parenchym miteinbezogen, so dass man größere Volumina
erhält. Bei den stereologischen Schätzungen dieser Arbeit spielten allerdings für die
Ermittlung des funktionellen Lungenparenchymvolumens u.a. nur die Punkte auf
Parenchym im CT- Bild mitein (vgl. 3.2.7).
Innerhalb der Tiergruppen wurde jeweils der Rangkorrelationskoeffizienten nach
SPEARMAN
zwischen
verschiedenen
Parametern
berechnet.
CT
und
Lichtmikroskopie ergaben als unterschiedliche Methoden mit einem auf der
Stereologie basiertem Quantifizierungsverfahren logische und nachvollziehbare
Korrelationen bei den Kontrolltieren und bei den A.pp. infizierten Tieren, was für die
Korrektheit beider Methoden in diesem Zusammenhang spricht (s. auch Anhang 2,
Tabelle 7.2.2 und 3).
5.2.2
Methodenkritik und Ausblick
Die Probenentnahme für die Lichtmikroskopie erfolgte an einer definierten Stelle im
cranialen Bereich des rechten Lobus caudalis (s. Material und Methoden 3.2.4.).
Denn aus der Literatur ist bekannt, dass am häufigsten die caudodorsalen Bereiche
127
Übergreifende Diskussion
der Lungen pathologisch durch A.pp. verändert werden (LÓPEZ 2009, S. 502).
Die Methodik beinhaltete folglich, dass nicht alle Lungenlappen in das Ergebnis
eingingen. Diese Arbeit zielte auf die Etablierung und beispielhafte Anwendung eines
spezifischen Auswertemodells, in Anlehnung an SCHMIEDL et al. (2007) und
BEHRENS (2011), vgl. Material und Methoden 3.2, ab und zielte nicht auf
vollständige Repräsentativität. Somit sind die Daten nicht repräsentativ für die ganze
Lunge. Ausgehend
von
diesem
Modell
können
aber
jegliche
Form
von
infektionsbedingten Lungenveränderungen analysiert werden.
Das gewählte, stereologische Verfahren liefert dabei objektive (unbiased) Daten
(HSIA et al. 2010). Zudem könnte bei zukünftigen Studien die Qualität der CT- Bilder
optimiert werden.
Des Weiteren ist anhand dieses Modells auch die stereologische Ermittlung des
totalen Lungenvolumens möglich, man muss lediglich in den CT-Bildern aich die
Punkte auf Parenchym und Non-Parenchym auszählen. Folgende Formel nach
SCHNEIDER u. OCHS (2013, S. 270-271) kann dann Anwendung finden:
Totales Lungenvolumen =
Zählpunkte auf Lungenparenchym- und Non-Parenchym x t x a(p)
(Zählpunkte Lungenparenchym- und non-parenchym, t = Schichtdicke der CT-Bilder, a(p) = Fläche pro Punkt (p))
(Formel nach SCHNEIDER u. OCHS 2013, S. 270-271).
Dieses Verfahren wäre noch umfangreicher und in der humanmedizinischen
Stereologie üblicher (vgl. OCHS 2006).
Außerdem müsste die Berechnung von pathologisch verändertem Gewebe noch
optimiert werden. In dieser Arbeit nahm man an, dass die pathologischen Strukturen
vom Parenchym ausgingen. Dies konnte man allerdings nicht mehr nachvollziehen.
128
Übergreifende Diskussion
5.3
Strukturelle Charakterisierung von porzinem, perfusionsfixierten
Lungenparenchym
5.3.1
Reflexion der Ergebnisse
Grundsätzlich soll die Fixierung die Strukturen vor Brüchen oder Rissen beim
Einbetten und beim späteren Schneiden schützen und den autolytischen Prozess
aufhalten (BOZZOLA u. RUSSELL 1999, S. 19).
Bei der chemischen Fixierung gibt es verschiedene Vorgehensweisen (BÜCHLZIMMERMANN et al. 2010, S. 88-89), in dieser Arbeit wurde mit der
Immersionsfixierung und Perfusionsfixierung (s. Material und Methoden 3.2 und 3.3)
gearbeitet.
BÜCHL- ZIMMERMANN et al. (2010, S. 88) beschreiben, dass bei der
Immersionsfixierung das Lungenparenchym direkt in die Fixierungslösungen
gegeben wurde. Die Fixantien durchwandern das Parenchym unterschiedlich stark.
Ein Teil der Fixierungslösung läuft mit der eindringenden Front mit, ein Teil wird
vernetzt und ein Teil wird wieder ausgeschwemmt. Folglich kann es hierbei vermehrt
zu Artefaktbildungen, wie Schrumpfung, Quellung oder Substanzflucht, kommen.
Artefaktbildung kann durch die bedachte Auswahl der Fixierungslösung, der Probe
per se und der Fixanzienmenge minimiert werden (BÜCHL- ZIMMERMANN et al.
2010, S. 88).
Des Weiteren führen die bei der Präparation entstandenen Veränderungen im
Blutdruck zu Volumenveränderungen des Gewebes und Alterationen durch das
Fehlen von Sauerstoff und spontane post morten-Veränderungen treten auf (HAYAT
1981, S. 256).
Für das gewöhnliche, lichtmikroskopische Arbeiten wird als Einbettmedium glycol
methacrylate und nicht Paraffin empfohlen, denn bei der Einbettung mit Paraffin ist
das Auftreten von Schrumpfartefakten wahrscheinlicher (FEHRENBACH u. OCHS
1998, S. 442).
Ein möglicher Grund für die Wahl der Immersionsfixierung kann sein, dass die
Strukturen zu klein für eine Perfusionsfixierung sind (BOZZOLA u. RUSSELL 1999,
S. 25). Allerdings können auch besonders große Organe, wie Gehirn oder Niere, bei
129
Übergreifende Diskussion
der Perfusionsfixierung ungleiche Fixierungsergebnisse zeigen (HAYAT 1981, S.
211).
BOZZOLA u. RUSSELL (1999, S. 25) erörtern, dass für die Immersionsfixierung für
Elektronenmikroskopie empfohlen wird, dass Gewebsstücke maximal 1 mm Dicke
aufweisen. Ansonsten kann das Fixans Glutaraldehyd das Gewebe nicht rechtzeitig
vor Einsetzen der Autolyse durchdringen. Des Weiteren dürfen die Gewebsstücke
nicht austrocknen. Die eingesetzte Fixanzienmenge soll das Volumen des
Gewebsstückes um das 5 bis 10fache übersteigen (BOZZOLA u. RUSSELL 1999, S.
25).
Bei der Charakterisierung der A.pp. bedingten Lungenparenchymalterationen fiel bei
der qualitativ-lichtmikroskopischen Untersuchung auf, dass das Lungenparenchym
nach Infektion stärker kollabiert war (vgl. Abb. 7.2.9-10).
Um der Fragestellung nachzugehen, in wie weit Strukturerhaltung bei porzinem
Lungenparenchym fixierungsbedingt ist, wurde Lungenparenchym vom Schwein mit
unterschiedlichen, chemischen Fixierungsmethoden (Immersion und Perfusion)
untersucht.
Bei der Perfusionsfixierung gelangt das Fixans über die Gefäße in das Parenchym.
In
den
meisten
Geweben
sind
die
Zellen
nur
wenige
µm
von
der
Blutgefäßversorgung entfernt (BOZZOLA u. RUSSELL 1999, S. 26).
Wichtig ist, dass das Blutgefäßsystem vor der Fixierung mit physiologischer Lösung
von Blutzellen befreit wird (LANG 2013).
Nach BÜCHL- ZIMMERMANN et al. (2010, S. 89) liefert diese Methode exzellente
Fixierungsergebnisse.
GIL (1971) erörtert, dass die Strukturerhaltung des alveolar lining layers durch
Perfusionsfixierung der Lunge über die Arteria pulmonalis am besten geeignet ist.
Durch den unmittelbaren Beginn der Fixierung kommt es nur zu geringgradigen
Veränderungen in den zellulären Strukturen, da sich das Fixans über das
Gefäßsystem und Kapillargebiet schnell im Gewebe ausbreiten kann (HAYAT 1981,
S. 209).
TRACHSEL et al. (2011) haben in einer humanmedizinischen Studie ein GroßtierModell der Perfusionsfixierung in einem, über Perfusionspumpen druckkonstant
130
Übergreifende Diskussion
gehaltenem System („closed loop perfusion fixation“) beim Schwein etabliert. Dieses
Verfahren
garantiert
eine
qualitativ
hochwertige
Strukturerhaltung
des
Lungenparenchyms in situ (TRACHSEL et al. 2011). Der materielle Aufwand ist bei
diesem Verfahren allerdings höher (vgl. TRACHSEL et al. 2011). Diese Arbeit wählte
deshalb einen Kompromiss. Die Fixierungslösung wurde nach der ca. 10 minütigen
hydrostatisch kontrollierten Perfusion für die spätere Immersionsfixierung der Lunge
über Nacht in einem Eimer aufgefangen. Mit diesem modifizierten Verfahren wurde
die Strukturerhaltung der Lunge im Vergleich zur Immersionsfixierung untersucht
(vgl. 3.3. Material und Methoden). Die immersionsfixierten, lichtmikroskopischen
Proben sind im Rahmen der Infektionsstudien von C. Brauer und I. Hennig-Pauka
entnommen worden, aus denen u.a. die Dissertation von C. Brauer (2012) resultierte.
Statistisch auffällig war die Volumendichte des Luftraumes [%] (p=0,0736). Diese lag
bei den immersionsfixierten Lungen bei einem Median von 53,54 % (Range: 44,18 %
bis 72,84 %) und bei den perfusionsfixierten Lungen bei einem Median von 74,03 %
(Range: 63,1 % bis 78,65 %) [s. Anhang 3., Abb. 7.3.1].
Die Volumendichte der Alveolarsepten [%] war ebenfalls statistisch auffällig
(p=0,0736) und zeigte bei den immersionsfixierten Lungen einen Median von 46,46
% (Range: 27,16 % bis 55,82 %) und bei den perfusionsfixierten Lungen einen
Median von 25,97 % (Range: 21,35 % bis 36,91 %) [s. Anhang 3., Abb. 7.3.1].
Bei
den
perfusionsfixierten
Lungen
konnten
also
im
Vergleich
zur
Immersionsfixierung tendentiell mehr Alveolarlufträume und weniger Alveolarsepten
ermittelt werden, was auf eine bessere Strukturerhaltung hindeutet (in Anlehnung an
BÜCHL- ZIMMERMANN et al. 2010, S. 89).
Diese stereologisch ermittelten Daten bestätigen in dieser Arbeit die These der
besseren Strukturerhaltung bei Perfusionsfixierung. Das hierbei gewählte Verfahren
der Fixierung erwies sich als qualitativ (vgl. Abb. 7.3.3-4) und quantitativ sinnvolle
Alternative zur Immersionsfixierung.
Die
Immersionsfixierung
ist
allerdings
wesentlich
weniger
personalintensiv,
kostengünstiger und leichter durchzuführen, so dass man abwägen sollte, in wie weit
eine optimierte Strukturerhaltung für die entsprechende Fragestellung notwendig ist
(modifiziert nach BÜCHL- ZIMMERMANN et al. 2010, S. 87).
131
Übergreifende Diskussion
Für elektronenmikroskopische Studien ist eine Perfusionsfixierung jedoch dringend
zu empfehlen (HAYAT 1981, S. 209).
5.3.2
Methodenkritik und Ausblick
Leider stand nur eine geringe Tierzahl begründet durch das komplexe und relativ
teure Verfahren zur Verfügung.
Die beschriebene Perfusionsfixierung bei Schweinelungen könnte genutzt werden,
um diese Art der chemischen Fixierung beim Schwein in der Tiermedizin weiter zu
etablieren,
wenn eine optimierte Strukturerhaltung für die Fragestellung erforderlich ist
(modifiziert nach BÜCHL- ZIMMERMANN et al. 2010, S. 87).
132
Literaturverzeichnis
6. Literaturverzeichnis
(bitte bedenken: das Manuskript in Kapitel 4 hat ein eigenes Literaturverzeichnis)
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Infect. Immun. 69(2), 758-64
WU, H., A. KUZMENKO, S. WAN, L. SCHAFFER, A. WEISS, J. H. FISHER, K. S.
KIM u. F. X. MCCORMACK (2003):
Surfactant proteins A and D inhibit the growth of Gram-negative bacteria by
increasing membrane permeability.
J. Clin. Invest. 111(10), 1589-1602.
ZENG, X., K. E. YUTZEY u. J. A. WHITSETT (1998):
Thyroid transcription factor-1, hepatocyte nuclear factor-3beta and surfactant protein
A and B in the developing chick lung
J. Anat. 193 (Pt 3), 399-408.
ZIMMERMANN, W., u. H. PLONAIT (2004):
Erkrankungen des Atmungsapparates
in: K.- H. WALDMANN u. M. WENDT (Hrsg.) : Lehrbuch der Schweinekrankheiten.
4. Aufl., Verlag Parey in MVS Medizinverlage Stuttgart, Stuttgart, S. 112-150
162
Anhang
7. Anhang
Anhang 1. mit Tabelle 7.1.1:
Klinischer Score
Tier
kummuliert über
▲
sieben
Untersuchungstage
1
1,00
„Alterationen im Surfactantsystem:
Klinik, Pathomorphologie und kulturelle Untersuchung“
Klinischer
Score an
▲
LLS
Befunde der Pathomorphologie an Tag 7▲
Tag 7▲
0
an Tag
7▲
Verklebungen des linken Hauptlappens mit der Pleura costalis,
Lungenlymphknoten mgr. vergrößert
Kulturelle
Untersuchung an
Tag 7▲
20,39
positiv
20,87
positiv
12,89
positiv
10,64
positiv
10,08
positiv
Großflächige Verklebungen zwischen den linken Haupt- und Spitzenlappen, sowie
2
2,76
0
der Pleura visceralis mit der Pleura diaphragmatica und costalis verklebt, rechter
Hauptlappen nicht von der Pleura costalis zu lösen
Mgr. Verklebungen der Pleura visceralis und der Pleura paritalis,
3
2,20
0
hgr. Verklebungen beider Lobi caudales mit der Pleura costalis,
Lungenlymphknoten hgr. vergrößert
▲
4
0,93
0
5
2,9
0
Mgr. Verklebungen zwischen der Pleura parietalis (v.a. costalis) und visceralis,
Lungenlymphknoten hgr. vergrößert
Rechter Spitzenlappen mgr. mit der Pleura costalis verklebt, linker Hinterlappen
mit der Pleura diaphragmatica und costalis veklebt
In Infektionsstudie des FUGATO-RePoRI-Projektes und REINER et al. (2014)
163
Anhang
Anhang 2.
Tabelle 7.2.1:
„ Stereologische Charakterisierung von immersionsfixiertem Lungenparenchym beim Schwein
(Lungengesunde und A.pp.- infizierte Schweine)“
Stereologische und klinische Charakterisierung der Lungenparenchymalterationen
nach Infektion mit A.pp.
Parameter
Vv Parenchym [%]
Vv Luftraum [%]
Vv Septen [%]
Vv Non-Parenchym [%]
Vv pathologisch verändertes Gewebe [%]
Sv Alveolarseptum [1/µm]
▲
V/S-Ratio [µm]
♦
BALF Neutrophile Granulozyten [%]
♦
BALF Makrophagen [%]
Funktionelles Lungenparenchymvolumen [cm³]
Funktionelles Volumen pathologisch veränderter
Strukturen [cm³]
Funktionelles Lungenparenchymvolumen pro kg
KGW [cm³/kg]
Funktionelles Volumen der Alveolarsepten [cm³]
Funktionelle Oberfläche der Alveolarsepten
[cm²]
1
Klinischer Score Tag 21
●
LLS
●
Anmerkung zur Sektion
Status
Kontrollgruppe (n=5)
Infizierte Tiere (n=4)
Minimum
Median
Maximum
Minimum
Median
Maximum
73,02
78,16
83,21
12,52
74,60
85,11
44,18
53,54
72,84
41,31
44,92
51,58
27,16
46,46
55,82
48,42
55,08
58,69
16,79
21,84
26,98
8,27
17,58
30,54
0
0
0
0
0
79,21
0,042
0,048
0,06
0,01
0,035
0,062
6,75
7,83
11,5
9,28
13,25
48
5,2
9,95
15,5
7
9,1
25
75,7
78,25
81
67
81
88,5
544,90
665,56
678,53
539,71
566,96
643,50
p-Wert
0,7133
0,1113
0,1113
0,5403
0,3711
0,5403
■
0,0662
0,2454
0,5614
■
0,0662
0
0
0
0
0
428,53
0,3711
30,56
31,21
41,86
24,99
30,29
31,82
0,1779
131,96
213,39
289,35
32,80
229,44
317,25
0,9025
181364,38
258554,86
327729,86
6773,41
210913,8
273841,63
0,2703
0,1
0
0,3
3,57
0,7
7,04
Keine Veränderungen im Lobus caudalis
●
0,81
0,96
2,06
4,39
6,335
12,33
Darunter Verwachsungen, Pleuritis,
sequesterartige
Umfangsvermehrungen, schlecht
belüftetes Parenchym
0,02*
0,1084
Die Daten stammen aus der Infektionsstudie von BRAUER (2012) (beide Gruppen vollständig) bzw. HENNIG-PAUKA et al. (2012) (alle infizierten Tiere, nur drei
Tiere der Kontrollgruppe). * Im Wilcoxon Rangsummentest signifikant.
■
▲
Im Wilcoxon Rangsummentest statistisch auffällig. Der Parameter entspricht der Alveolarseptendicke (BEHRENS 2011).
1
Die Daten stammen aus der Infektionsstudie von BRAUER (2012).
♦ Im Rahmen der Studie (Tierversuchsgenehmigungsnummer: 33-42502-05/941) erhoben, aus der auch folgende Manuskripte resultierten: BRAUER et al. (2012)
und HENNIG-PAUKA et al. (2012), BALF leider nur von vier der fünf Kontrolltiere vollständig auswertbar
164
Anhang
Tabelle 7.2.2:
Pathomorphologische und histopathologische Charakterisierung der Lungenparenchymalterationen
nach Infektion mit A.pp.
Tier
1
●
LLS
4,39
Befunde der Pathomorphologie
●
Histopathologie Hauptlappen
▲
Lungenlymphknoten umfangsvermehrt, rechterseits: ggr. Verwachsungen von Herzbeutel und
Mgr., interstitielle, lympho-histiozytäre
Pleura, ggr. Verwachsungen der Mittellappen mit der Pleura parietalis, 3x3 cm große
Pneumonie; katarrhalisch-eitrige und
Verwachsungen zwischen den Hauptlappen und des Zwerchfells, 3x3 cm große Verwachsungen
abszedierende Bronchopneumonie
zwischen Hauptlappen und Pleura parietalis
(rechter Hauptlappen)
Ggr., interstitielle, lympho-histiozytäre
2
12,33
Rechts: Hauptlappen großflächig mit Pleura verwachsen; links: Verwachsungen von Herzbeutel
Pneumonie; hgr., katarrhalisch-eitrige und
mit Pleura, Mittellappen vollständig mit Pleura verwachsen
abszedierende Pneumonie (rechter
Hauptlappen)
Rechts: Hauptlappen mit hgr. Pleuritis, zusätzlich Verwachsungen mit Mittelllappen und
3
6,32
Zwerchfell, Spitzenlappen ggr. Verwachsen mit der Pleura parietalis, Lobus accessorius mit
Herzbeutel verwachsen
4
●
▲
6,35
Mgr., interstitielle, lympho-histiozytäre
Pneumonie (rechter Hauptlappen); hgr.,
eitrig-abszedierende Pneumonie mit
Sequesterbildung (Lobus accessorius)
Verwachsungen aller Hauptlappen zur Pleura parietalis und an mehreren Stellen zum Zwerchfell
Hgr., fibrosierende, eitrige Pneumonie
großflächige Verwachsungen; rechter Hauptlappen mit umschriebenen Sequester
(linker Hauptlappen)
Die Daten stammen aus der Infektionsstudie von BRAUER (2012) und HENNIG-PAUKA et al. (2012).
Die Daten stammen aus der Infektionsstudie von HENNIG-PAUKA et al. (2012).
165
Anhang
Tabelle 7.2.3:
Ausgewählte Korrelationen (Lichtmikroskopie) in der Kontrollgruppe (n=5)
Parameter
Vv Parenchym [%]
Vv Alveolarluftraum [%]
Vv Alveolarsepten [%]
Funktionelles
Lungenparenchymvolumen
[cm³]
Vv Non-Parenchym [%]
-1; <.0001
0,6; 0,2848
-0,6; 0,2848
0,3; 0,6238
Vv Alveolarsepten [%]
0,6; 0,2848
-1;<.0001
1
-0,1;0,87
Funktionelles Volumen
der Alveolarsepten [cm²]
0,3; 0,6238
-0,9; 0,0374
0,9; 0,0374
0,2; 0,7471
Es erfolgte eine Berechnung des Spearman‘schen Rangkorrelationskoeffizienten, Signifikanzen sind grau unterlegt.
Anmerkung:
die lichtmikroskopischen Proben sind im Rahmen der Infektionsstudien von BRAUER (2012) (alle Tiere) bzw. HENNIG-PAUKA et
al. (2012) (nur drei Tiere) entnommen worden.
166
Anhang
Tabelle 7.2.4:
Ausgewählte Korrelationen (Lichtmikroskopie bzw. CT) bei den A.pp.- infizierten Schweinen (n=4)
Parameter
Vv Parenchym [%]
Vv Alveolarluftraum
[%]
Vv Alveolarsepten
[%]
Pathologisch
verändertes
Gewebe [%]
V/S Ratio [µm]
Vv Alveolarsepten
[%]
1; <.0001
-1; <.0001
1
-0,77; 0,2254
-0,8; 0,22
Sv Alveolarsepten
[1/µm]
0,8; 0,2
-0,8; 0,2
0,8; 0,2
-0,77; 0,2254
-1; <.0001
1; <.0001
-1; <.0001
1; <.0001
-0,77; 0,22
-0,8; 0,2
-0,77; 0,22
0,77; 0,22
-0,77; 0,22
1; <.0001
0,77; 0,22
Funktionelles
Volumen der
Alveolarsepten
[cm²]
Funktionelles
Volumen
Pathologisch
verändertes
Gewebe [cm³]
Es erfolgte eine Berechnung des Spearman‘schen Rangkorrelationskoeffizient, Signifikanzen sind grau unterlegt.
Anmerkung:
die lichtmikroskopischen Proben sind im Rahmen der Infektionsstudien von BRAUER (2012) bzw. HENNIG-PAUKA et al. (2012)
entnommen worden.
167
Anhang
Abb. 7.2.1:
Verteilung der stereologisch erarbeiteten Volumendichten bei Kontrolltieren und infizierten Tieren am Tag der
Sektion. Der Wilcoxon Rangsummentest lieferte keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden
Gruppen.
Anmerkung:
die lichtmikroskopischen Proben sind im Rahmen der Infektionsstudien von BRAUER (2012) (alle Tiere) bzw.
HENNIG-PAUKA et al. (2012) (nur drei Kontrolltiere, alle infizierten Tiere) entnommen worden.
168
Anhang
■
Abb. 7.2.2: Oberflächendichten [1/µm] der
Abb.7.2.3: V/S-Ratio [µm] bei Kontrolltieren
Alveolarsepten bei Kontrolltieren und
und infizierten Tieren. Im Wilcoxon
infizierten Tieren. Im Wilcoxon
Rangsummentest zeigte sich ein statistisch
Rangsummentest zeigten sich keine
auffälliger Unterschied bezüglich der Dicke
signifikanten Unterschiede.
der Alveolarsepten.
Anmerkung:
die lichtmikroskopischen Proben sind im Rahmen der Infektionsstudien von BRAUER (2012) (alle Tiere) bzw. HENNIG-PAUKA et
al. (2012) (nur drei Kontrolltiere, alle infizierten Tiere) entnommen worden.
169
Anhang
Abb.7.2.4:
Vergleichende Darstellung der zytologischen Untersuchung der BALF der Kontrolltiere (vier der fünf
Tiere) und infizierten Schweine am Tag der Sektion. Der Wilcoxon Rangsummentest wurde berechnet und ergab keine
signifikanten Unterschiede zwischen Kontrollen und Infizierten.
Im Rahmen der Studie (Tierversuchsgenehmigungsnummer: 33-42502-05/941) erhoben, aus der auch folgende Manuskripte resultierten:
BRAUER et al. (2012) und HENNIG-PAUKA et al. (2012)
170
Anhang
Abb.7.2.5:
Vergleichende Darstellung der Blutwerte der Kontrolltiere und infizierten Schweine am Tag 21 (Tag der
Sektion). Der Wilcoxon Rangsummentest wurde berechnet und ergab keine Signifikanzen.
Anmerkung: Im Rahmen der Studie (Tierversuchsgenehmigungsnummer: 33-42502-05/941) erhoben, aus der auch folgende Manuskripte
resultierten: BRAUER et al. (2012) und HENNIG-PAUKA et al. (2012)
171
Anhang
Abb. 7.2.6:
Vergleichende Darstellung der stereologisch ermittelten Daten der Kontrolltiere und infizierten
Schweine am Tag 21 (Tag der Sektion). Der Wilcoxon Rangsummentest wurde berechnet und ergab keine
Signifikanzen.
■ = Das funktionelle Lungenparenchymvolumen war vor der Infektion statistisch auffällig (p=0,066) größer.
Anmerkung: Die verwendeten CT-Bilder stammen aus der Infektionsstudie von BRAUER (2012) und die lichtmikroskopischen Proben sind im
Rahmen der Infektionsstudien von BRAUER (2012) (alle Tiere) bzw. HENNIG-PAUKA et al. (2012) (nur drei Kontrolltiere, alle infizierten Tiere)
entnommen worden.
172
Anhang
Abb.7.2.7:
Via Stereologie ermittelte funktionelle Oberfläche der Alveolarsepten vergleichend für Kontrolltiere und
infizierte Schweine am Tag 21 (Tag der Sektion). Der Wilcoxon Rangsummentest wurde berechnet und ergab
keine Signifikanzen.
Anmerkung:
Die verwendeten CT-Bilder stammen aus der Infektionsstudie von BRAUER (2012) und die lichtmikroskopischen Proben sind im
Rahmen der Infektionsstudien von BRAUER (2012) (alle Tiere) bzw. HENNIG-PAUKA et al. (2012) (nur drei Kontrolltiere, alle
infizierten Tiere) entnommen worden.
173
Anhang
Abb. 7.2.8:
Funktionelles Parenchymvolumen pathologisch veränderter Strukturen vergleichend für Kontrolltiere und infizierte
Schweine am Tag 21. Der Wilcoxon Rangsummentest wurde berechnet und ergab keine Signifikanzen.
Anmerkung:
Die verwendeten CT-Bilder stammen aus der Infektionsstudie von BRAUER (2012) und die lichtmikroskopischen Proben sind im
Rahmen der Infektionsstudien von BRAUER (2012) (alle Tiere) bzw. HENNIG-PAUKA et al. (2012) (nur drei Kontrolltiere, alle
infizierten Tiere) entnommen worden.
174
Anhang
Abb. 7.2.9:
Immersionsfixiertes Lungenparenchym eines
Kontrolltieres, HE-Färbung
Anmerkung:
Die histologische Probe ist im Rahmen der Infektionsstudie von BRAUER
(2012) gewonnen worden.
175
Anhang
Abb. 7.2.10: Immersionsfixiertes Lungenparenchym eines A.pp.
infizierten Tieres (21 Tag p.inf.), HE-Färbung
Anmerkung: Die histologische Probe stammt aus der Infektionsstudie von BRAUER (2012).
176
Anhang
Anhang 3. Vergleich zwischen Immersions- und Perfusionsfixierung von Lungenparenchym beim Schwein
Abb. 7.3.1:
Verteilung der stereologisch berechneten Volumendichten von immersionsfixiertem Lungenparenchym und
perfusionsfixiertem Lungenparenchym (schraffiert). ■ Der Wilcoxon Rangsummentest zeigte statistisch
auffällige Unterschiede bei der Volumendichte des Alveolarluftraums und der Alveolarsepten [%] zwischen
Immersions- und Perfusionsfixierung.
Anmerkung: Die immersionsfixierten Proben sind im Rahmen der Infektionsstudie von BRAUER (2012) (vollständig) bzw. HENNIG-PAUKA et al.
(2012) (nur drei Tiere der Kontrollgruppe) erhoben worden.
177
Anhang
Abb. 7.3.2:
Vergleich der Oberflächendichte [1/µm] zwischen Immersions- und
Perfusionsfixierung (schraffiert).
Anmerkung: Die lichtmikroskopischen Proben sind im Rahmen der Infektionsstudie von BRAUER
(2012) (vollständig) bzw. HENNIG-PAUKA et al. (2012) (nur drei Tiere der Kontrollgruppe) erhoben
worden.
178
Anhang
Histologische Darstellung der Strukturerhaltung am Beispiel zweier Kontrolltiere
Abb. 7.3.3:
Perfusionsfixiertes Lungenparenchym eines
Abb. 7.3.4:
Nahezu vollständig kollabierte Lunge
ohne definierte Blähung am Ende
Kontrolltieres, HE-Färbung
der Inspiration, Lungenparenchym eines Kontrolltieres,
HE-Färbung
179
Anhang
Anhang 4.
Protokoll über die Surfactant-Auswertung
(Einstellungen TEM/ STEPanizer© stereology tool)
TEM:

Vergrößerung: 18.000 x

Variation der Anzahl der Bilder pro Schnitt, meist 20-60 Bilder

Abstand von 200 μm /150 μm zwischen Bildaufnahmen
STEPanizer© stereology tool:

Parameter Fenster: Monitorauflösung 768x1024, Auswahl: Line pairs, Number
of titles: 4, Sub sampling: no Line width:2, T-Bar:0, Show: alle ankreuzen
Nummern im STEPanizer© stereology tool / Definition der Subtypen:

1. ulv, eine Lamelle bis zwei Lamellen in Auflösung, unterschiedlicher Größe

2. mlv

3. lbl

4. tm

5. LSP mit ulv, Schnittpunkt gezählt jeweils an äußerer Lamelle

6. LSP mit lbl, Schnittpunkt gezählt jeweils an äußerer Lamelle

7. Zelldetritus
(Protokoll modifiziert nach SCHMIEDL et al. 2003 und
SCHMIEDL et al. 2004)
180
Zusammenfassung
8. Zusammenfassung
Diana Busley (2014):
Charakterisierung
der
entzündungsbedingten
Surfactant-
und
Lungenparenchymalterationen beim Schwein nach Infektion mit Actinobacillus
pleuropneumoniae
In dieser Arbeit wurde mittels Bronchoalveolärer Lavage (BAL) gewonnnener
Surfactant vom Schwein vor und sieben Tage nach der Infektion mit Actinobacillus
pleuropneumoniae untersucht. Die Schweine wurden hierfür aerogen in einer
Aerosolkammer im Rahmen des FUGATO-RePoRI-Projektes infiziert.9)
Die Untersuchungen umfassten umfangreiche
morphometrische
Analysen
der
ultrastrukturelle, stereologisch-
Volumendichten
und
des
Volumen-
/Oberflächenverhältnis‘ [µm] der Surfactantsubtypen. Ziel war hierbei die Verteilung
von aktiven und inaktiven Surfactantsubtypen vor und nach der Infektion zu
charakterisieren. Des Weiteren wurde die minimale Oberflächenspannung [mN/m]
des Surfactants mittels Pulsating-Bubble-Surfactometrie jeweils vor und nach der
Infektion bestimmt.
Zudem
wurden
Atmungsapparats,
klinische
Daten
röntgenologische
durch
die
klinische
Untersuchungen,
Untersuchung
des
ultrasonographische
Untersuchungen, Berechnung des RHS und pathomorphologische Untersuchungen
(Lung lesion score) und die zytologische Untersuchung der bronchoalveolären
Lavageflüssigkeit (BALF) im Rahmen des FUGATO-RePoRI-Projektes erhoben. Die
klinischen Daten, die vor der Infektion erhoben wurden, waren statistisch auffällig
unterschiedlich zu denen, die nach der Infektion erhoben wurden (FUGATO-RePoRIProjekt).9)
9)
Persönliche Mitteilung von Frau Dr. Doris Höltig, 16.11.2013, Hannover, teilpubliziert
in REINER et al. (2014)
181
Zusammenfassung
Bei der zytologischen Untersuchung der BALF zeigten sich keine signifikanten
Unterschiede.10)
Die morphometrisch ermittelten Volumendichten der Surfactantsubtypen ergaben
nach der Infektion eine tendenzielle Verschiebung von inaktiven zu aktiven
Surfactantsubtypen. Es zeigte sich eine höhere, allerdings nicht signifikant höhere,
minimale Oberflächenspannung [mN/m] nach der Infektion, somit blieb ein erwarteter
hoher Anstieg über den Referenzwert aus. Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass es
infektionsbedingt zu einer gesteigerten, kompensatorischen Produktion von aktivem
Surfactant als Reaktion auf eine entzündungsbedingte, gesteigerte Konversion kam.
Um
die
infektionsbedingten
Alterationen
auf
Lungenparenchymebene
zu
charakterisieren, wurden weitere stereologisch-morphometrische Untersuchungen
auf lichtmikroskopischer und computertomographischer Ebene bei zwei weiteren
Tiergruppen durchgeführt.
Statistisch wurden die makroskopischen Lungenveränderungen (Lung Lesion Score)
von Kontrolltieren und A.pp.- infizierten Schweinen am Tag 21 p. inf. verglichen. Es
ergaben sich keine signifikanten Unterschieden (Infektionsstudie von BRAUER
(2012) und HENNIG-PAUKA et al. (2012)).
Bei den histologisch-stereologischen Untersuchungen zeigten sich bezüglich der
Volumendichte des Parenchyms [%], des Non-Parenchyms [%], der Alveolarsepten
[%] und des Alveolarluftraumes [%], der Oberflächendichte der Alveolarsepten [1/µm]
und der Septendicke [µm] ebenfalls keine signifikanten Unterschiede zwischen
Kontrolltieren und A.pp- infizierten Tieren. Auch erwiesen sich die mithilfe des CTs
bestimmten funktionellen Volumina von Alveolarsepten [cm3] und pathologisch
veränderten Strukturen [cm3] sowie die Oberfläche der Alveolarsepten [cm 2] als nicht
signifikant unterschiedlich zwischen den Tiergruppen. Die mittels CT bestimmten
Lungenparenchymvolumina [cm³] stellten sich als statistisch auffällig unterschiedlich
(p=0,066) zwischen Kontrolltieren und infizierten Tieren heraus.
10)
Persönliche Mitteilung von Frau Dr. Doris Höltig, 16.11.2013, Hannover (FUGATO-RePoRIProjekt), teilpubliziert in REINER et al. (2014)
182
Zusammenfassung
Die CT-Analyse der Lungenvolumina ergab einen Hinweis auf pathologische
Veränderungen bei den infizierten Tieren,
die inzwischen keine klinischen Symptome mehr zeigten (Daten im Rahmen der
Dissertation von BRAUER (2012) erhoben).
CT und Lichtmikroskopie als zwei unterschiedliche Methoden, die mit einem auf
Stereologie basiertem Quantifizierungsverfahren kombiniert wurden, ergaben logisch
nachvollziehbare Korrelationen zwischen Parametern bei den Kontrolltieren und den
A.pp. infizierten Tieren.
Bei der Charakterisierung der A.pp. bedingten Lungenparenchymalterationen konnte
qualitativ-lichtmikroskopisch festgestellt werden, dass das Lungenparenchym nach
Infektion scheinbar über einen geringeren Luftraum verfügte. Um der Fragestellung
nachzugehen, in wie weit Strukturerhaltung des porzinen Lungenparenchyms durch
die
Fixierungsmethode
Lungenparenchym
vom
bestimmt
wird,
Schwein
wurde
nach
im
letzten
Teil
unterschiedlichen,
der
Arbeit
chemischen
Fixierungsmethoden (Immersion und Perfusion) untersucht. Die stereologischmorphometrischen Daten bestätigen in dieser Arbeit die These der besseren
Strukturerhaltung bei Perfusionsfixierung. Das hierbei gewählte Verfahren der
Fixierung erwies sich für die qualitative und quantitative Auswertung von
Gewebsstrukturen als sinnvolle Alternative zur Immersionsfixierung.
183
Summary
9. Summary
Diana Busley (2014)
Characterisation of the inflammation-caused alterations of surfactant and lung
parenchyma in pigs infected by Actinobacillus pleuropneumoniae
This study focused on the examination of surfactant in healty and A.pp. infected pigs
(seven days after infection).
Surfactant was harvested by bronchoalveolar lavage (BAL). Pigs were infected in an
aerosol chamber in the course of the FUGATO-RePoRI-project.11)
Extensive ultrastructural examinations were performed: the volume densities of the
surfactant subtypes [%] and the volume to surface ratio of specific surfactant
subtypes [µm]. The aim of this study was to define the proportion of active and
inactive surfactant subtypes prior to and after infection. Furthermore, the minimal
surface tension [mN/m] was measured prior to and after infection using a Pulsating
Bubble Surfactometer.
Clinical data were recorded as the clinical examination of the respiratory tract,
radiographical examinations, ultrasonography, calculations of the RHS and
pathological examination (Lung Lesion Scoring) as well as the cytologic examination
of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) in the course of the FUGATO-RePoRI-project.
Clinical data after infection differed statistically noticeable from data prior to infection.
Cytological findings in BALF did not differ significantly.11)
The morphometrically determined data of the volume densities of the surfactant
subtypes demonstrated a tendency to a shift from inactive to active surfactant
subtypes after infection. A not significantly increase of the minimal surface tension
[mN/m] occurred after infection, but was not as high as expected, because the
reference value was not exceeded in the most pigs.
11)
Dr. Doris Höltig, personal communication, November 11, 2013, Hannover,
partly published in REINER et al. (2014)
184
Summary
An increased, infection-related compensatory production of fresh and active
surfactant in A.pp. infected pigs could be assumed by a higher conversion.
Inflammatory alterations in lung parenchyma were investigated by light microscopy
and computer tomography combined with a stereological-morphometric approach in
additional groups of piglets.
Lung Lesion Scores of the control group and of the A.pp. infected group on day 21
after infection did not show significant differences (infection trial of BRAUER (2012)).
The histological-stereological examination of the volume density of parenchyma [%],
non-parenchyma [%], alveolar septa [%] and the alveolar air space [%] and the
surface density of the alveolar septa [1/µm] did also not reveal a statistical
significance. Furthermore, the functional volumes of lung parenchyma [cm3], alveolar
septa [cm3] and pathological altered structures [cm3] as well as the functional surface
of alveolar septa [cm2] were not significantly different between both groups. However,
functional lung volumes which were calculated based onto CT were statistically
noticeable different (p=0.066) between control and infected group. CT analysis of the
functional lung volumes revealed inflammatory lung alterations in infected pigs,
which did not show clinical signs any longer (data based on doctoral thesis of
BRAUER (2012))
Both methods, light microscopy and CT, resulted in valuable data which partly
correlate with each other.
Qualitative light microscopical analysis revealed a decreased airspace in lung
parenchyma in A.pp. infected pigs. To assess the influence of the fixation method
onto the conservation of porcine lung parenchyma different chemical fixation were
compared. The stereological-morphometric data evaluation resulted in a superior
preservation of lung structures by perfusion fixation. For the qualitative and
quantitative characterization of lung structures perfusion fixation was found to be an
alternative to immersion fixation.
185
Danksagung
10. Danksagung
Ich möchte mich herzlich bei
Fr. Prof. Dr. Isabel Hennig-Pauka
Hrn. Prof. Dr. Dr. Andreas Schmiedl
Hrn. Prof. Dr. M. Ochs und Hrn. Prof. Dr. K.- H. Waldmann
der Friedrich-Ebert-Stiftung,
v.a. Prof. Dr. Hermann Frister, Dr. Ursula Bitzegeio, Katja Reszel und
Jana Hartmann
Fr. Tierärztin Ariane Jacobi
Fr. Tierärztin Anne Menzel
Fr. Tierärztin Carina Helmer
Fr. PD Dr. Anke Schnapper
Fr.Dr. Esther Humann-Ziehank
Fr. Dr. Doris Höltig
Fr. Christa Acevedo Hernandez
Fr. Andrea Herden, Susanne Faßbender und Sabine Fiedler
Fr. Elke Siever und Gudrun Wirth
Hrn. Jan-Phillip Schneider, Dr. Mark Kühnel und Dr. Roman Grothausmann
Fr. Dr. Melanie Gundlach
Hrn. Dr. Martin Beyerbach
meiner Familie und Jens Eberling (für das geisteswissenschaftliche Denken)
bedanken!!!
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