Erbliche Muskelerkrankungen - Morbus Duchenne / Becker - Gliedergürtel-Muskeldystrophien - Maligne Hyperthermie Dystrophinopathien Muskeldystrophie Duchenne Muskeldystrophie Becker Einschlusskörpermyopathie 2 Einschlusskörpermyopathie 3 Einschlusskörpermyopathie IBMPFD1 Einschlusskörpermyopathie IBMPFD2 Einschlusskörpermyopathie IBMPFD3 Envelopathien/Emery-Dreyfuss-Muskeldystrophien Emerinopathie; Laminopathie Gliedergürteldystrophien Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 1A Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 1B Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 1C Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 1D Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 1E Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 1F Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 1G Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 1H Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2A Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2B Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2C Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2D Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2E Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2F Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2G Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2H Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2I Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2J Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2K Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2L Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2M Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2N Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2O Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2P Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2Q Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2R Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2S Kardiomyopathien (>50 Formen) Dilatative Kardiomyopathie (MYBPC3) Dilatative Kardiomyopathie (LMNA) Dilatative Kardiomyopathie (SGCD) Kongenitale Myasthenien Kongenitale Myasthenie (MUSK) Kongenitale Myasthenie (RAPSN) >6 weitere Formen Kongenitale Myopathien Bethlem-Myopathie Fukuyama-MDC Muscle-Eye-Brain disease Walker-Warburg Syndrom Walker-Walker Syndrom Kongenitale Muskeldystrophie Typ 1B Kongenitale Muskeldystrophie Typ 1C Kongenitale Muskeldystrophie Typ 1D Myotubuläre Myopathie Nemaline Myopathie 1 Nemaline Myopathie 2 Nemaline Myopathie 3 Nemaline Myopathie 4 Nemaline Myopathie 5 Nemaline Myopathie 6 Nemaline Myopathie 7 Nemaline Myopathie 8 Ullrich-Myopathie Myofibrilläre Myopathien Myofibrilläre Myopathie 1 Myofibrilläre Myopathie 2 Myofibrilläre Myopathie 3 Myofibrilläre Myopathie 4 Myofibrilläre Myopathie 5 Myofibrilläre Myopathie 6 Myotonien/Myot. Dystrophien Kongenitale Muskeldystrophie Typ 1A Hypokaliämische periodische Paralyse 1 Hypokaliämische periodische Paralyse 2 Myotone Dystrophie 1 Myotone Dystrophie 2 Myotonia congenita Thomsen Paramyotonia congenita Proximale myotone Myopathie DM2/PROMM Myotonia congenita Becker Struktur-Myopathien Central-Core-Myopathie Multiminicore-Myopathie Maligne Hyperthermie 1-6 Rigid-Spine-Syndrom Weitere Muskeldystrophien Fazioskapulohumerale Muskeldystrophie 1 Fazioskapulohumerale Muskeldystrophie 2 Okulopharyngeale Muskeldystrophie Einschlusskörper-Myopathien ad erbliche Muskelleiden Pseudohypertrophie Lordosis, scapulae alatae Gower Manöver DMD / BMD: klinische Aspekte DMD BMD • 1:3500 neugeborene Jungen • spätes Laufen, im 3.-5. LJ Symptome • Lebenserwartung 20 Jahre • progressive Skelettmuskel-Dystrophie • pseudohypertr. Waden, „Engelsflügel“ • Creatinkinase im Blut • Herzmuskel affiziert, EKG! • 1/3 mentale Retardierung • glatte Muskulatur, Retina betroffen • 1:35000 neugeborene Jungen • mildere Symptome, bes. frühkindl. • selten spätes Gehen lernen • >20 J. Rennen, Treppensteigen • im mittleren Lebensalter Gehen • Creatinkinase im Blut • oft Lernprobleme • fertil Dystrophin-Protein DMD / BMD: „Selbstheilung“ durch alternative mRNAs ? alternative Dystrophin mRNAs: 1. alternative Promotoren 2. alternatives Spleißen 3. alternative Polyadenylierung Dystrophin-Promotoren + -Isoformen gesamt B, Gehirn M, Muskel P, Purkinje-Zelle R, Retina S, Schwann-Zelle G, allgemein Dystrophin + interagierende Proteine Dp260 Dp140 Exon ProteinHomologie Dystrophin 427 kD ab1 Dp116 ab2 ActinBindung rod Domänen ß-Dystroglycan/SyntrophinDp71 Bindung ab3 ab2 ab1 Dystrophinopathie Protein (427kD): 0.002 % der Muskelmasse Therapie DMD: symptomatisch, simple Genersatz-Therapie modifier Gen-Effekt Golden Retriever Muskeldystrophie dystrophischer Zebrafisch escaper betroffen Jagged 1 Überexpression gesunder Zebrafisch escaper affiziert Chromos. 24 Jagged 1 Kandidatenregion Dystrophinopathie Stammzell-Therapie Gentherapie-Strategien chromosomale DNA Gen-Ausbesserung mit Insertions- oder episomalen Vectoren cDNA-Expression (µdystrophin or µUTRN) zufällige Integration, geringe Transduktions-Effizienz genomische DNA prä-mRNA reife mRNA Genom-Editieren mit programmierbaren Nukleasen target-spezifische Modifikation unerforschte Verabreichungsform, off-target Mutagenese exon skipping mit antisense Oligonukleotiden systemische Verabreichung transiente und Nebeneffekte „mis-“Translation von Stopcodons Protein PTC124 read-through systemische Verabreichung PTC124 (Ataluren) + AON nonsense Mutationen Translationsstop - Therapie: PTC124 read-through Stop-Codon wird „fehl“-translatiert - Dystrophin-Produktion in Zellkultur - verbesserte Muskelfunktion im Mausmodell - klinische Phase II-Studien Exon-skipping mit AON (antisense-Oligonukleotid) - klinische Studien fortgeschritten Vor- und Nachteile viraler Vektoren bei DMD-Gentherapie Vektor VerpackInfektion nicht- Hauptrisiko bei genGenombarkeitsteilungsfähiger therapeutischer Integration stabile Expression Limit Zellen Anwendung Retrovirus ∼8 kb ja nein Lentivirus ∼8 kb ja ja Leukämie, Rekombination mit HIV Herpes simplex virus ∼150 kb nein ja Zytotoxizität + Immunogenität Adenovirus (Helfer Virusabhängig) ∼30 kb nein ja immunoges virales Capsid ja inhibiert mit neutralisierendem Antikörper Adeno-assoz. Virus (AAV) ∼4 kb nein Leukämie targeting vectors classic targeting vector BAC targeting vector Helper-dependent adenovirus targeting vector AAV targeting vector DSB-mediated targeting vector piggyBac targeting vector single-strand oligonucleotide (ssODN) DSB: double strand break BAC: bacterial artificial chromosome AAV: adeno-associated virus TR: terminal repeat ITR: inverted terminal repeat Vor-/Nachteile verschiedener Genommanipulations-Techniken programmierbare DNANuklease Erkennungsmotiv Konstruktherstellung Sequenztargetability meganuclease homing endonuclease LAGLIDADG motifs sehr kompliziert ↓↓ ZFNs Zinkfinger-Domänen kompliziert ↓ TALENs TAL effector RVD domain relativ kompliziert ↑↑ CRISPR-Cas9 crRNA (DNA-RNA heteroduplex) „einfach“ ↑ ZFNs: Zinkfinger Nukleasen TALENs: Transcription activator-like effector nucleases TAL effector RVD: transcription activator–like effector repeat-variable diresidues CRISPR: clustered regularly interspaced short palindromic repeat Cas9: CRISPR-associated 9 crRNA: CRISPR RNA CRISPR-Cas9 CRISPR: clustered regularly interspaced short palindromic repeat Cas9: CRISPR-associated 9 crRNA: CRISPR RNA tracrRNA: trans crRNA sgRNA: single guide RNA Gentherapie + induz. pluripot. Stammzellen Gen knockout Gen repariert reprogrammieren somatische Zellen Reporter-Zellen differenzieren iPS-Zellen Zellmarkierung Tiermodell differenzierte Zellen iPS: induzierte pluripotente StammGFP: grünes Fluoreszenz-Protein Luc: Luciferase Medikamententests ex vivo: induzierte pluripotente Stammzellen DMD- / BMD-Diagnose DNA-Sequenzanalyse + MLPA, in situ Hybridisierung Deletionen Proteinanalyse • Western blot • Immunohistochemie RNA-Analyse • RT-PCR /arrays • Protein Truncation Test (PTT) nonsense Mutationen DMD / BMD: Genetik • X chromosomal rezessiv • Xp21; 2.3 Mb; 79 Exons • 14 kb Transcripte; gewebsspezifische Isoformen • 1/3 Punktmutationen • 2/3 Deletionen/ Rearrangements/ Insertionen • 1/3 Neumutationen DMD / BMD: Deletionen hotspot für Deletionen Intron 44 Exon 44 • Deletionen sehr variabel • DMD: meist Leserahmen • BMD: meist Leserahmen + Dystrophin-Mutationen Dystrophin-Genvariationen Variation n= Position 5‘ UTR Substitution http://www.dmd.nl/DMD_deldup.html; aktual. 11.4.2017 kodierend intron. 3‘UTR 20248 120 4000 15926 202 Deletion 2521 3 635 1668 215 Duplikation 2119 6 213 1541 359 Insertion 465 2 25 434 4 Insertion + Deletion 100 59 41 2 Variationen in 1 Allel 200 komplex + unbekannt 175 25828 2 131 4932 19612 780 DMD / BMD: Punktmutationen • BMD: meist missense Mutationen im N-/C-Terminus oder Punktmutationen in Spleissstellen ohne Leserahmenstörung • DMD: meist nonsense Mutationen (überall im Gen verteilt) oder LeserahmenStörung durch Indel etc. kompensatorische Proteine kompensator. Mechanismen + therapeut. Strategien MembranStabilisatoren DystroglycanGlykosylierung kompensator. Proteine Suppression des vorzeitigen Stopcodons (PTC 124) AS-Ersatz normal Stopkodon ErsatzProtein Spleißosom normales Protein DMD-Deletion, trunkiert Exon übersprungen Spleißen Exon A U 1 U 2 Intron 1 Exon A sf sf U 1 Exon B Exon B Intron 2 U 2 Exon C + Exon C Intron 1 Intron 2 Sso – mediated splice switching Exon A U 1 Exon A sf Exon B Intron 1 sso Exon C Mutation + Intron 2 Intron 1 sf Exon B U 2 sf Exon C M. Duchenne/Becker ♀♀ 1 : 50 000 000 unsymmetrische X-Inaktivierung 45X 2 Mutationen Konduktorin: Cardiomyopathie? X-Chromosomen Inaktivierung Zygote XpXm XpXm Xp Xp XpXm Xm Xm Xm Xm frühe Teilungen Xp Xp zufällige XInaktivierung Inaktivierungsmuster wird vererbt an alle Tochterzellen Mosaik t(X;4)(p21;q31) Chr. 4 der(4) X-Chr. der(X) Deletion / Duplikation + 1. MLPA Deletion / Duplikation - DMD StufenDiagnostik DMD bestätigt, dann - ist Mutter Konduktorin? - multidisziplinäre Versorgung - DMD-Register Mutation + 2. Sequenzieren best. Exons Mutation φ Dystrophinopathie 3. Dystrophin-Protein, Muskelbiopsie normales Dystrophin-Protein φ (normales) Dystrophin-Protein DMD bestätigt, dann - multidisziplinäre Versorgung - optionale RNA-Analyse ? - DMD-Register versch. Dystrophin-Mutationen verursachen… normal Start Translation Translationsstop Dystrophin mRNA wird in Dystrophin protein translatiert DMD Leserahmen-Mutation prämature Translationsstops Einbau falscher Aminosäuren nach Deletion und prämature Translations-Trunkation Nonsense-Mutation prämature Trunkation der Protein-Translation; Leserahmen ok M. Becker in frame-Mutation Translation bis zum natürlichen Stopcodon; intern verkürztes, teil-funktionelles Protein versch. Dystrophin-Mutationen verursachen… Deletion eines oder mehrerer Exons (68%) Duplikation eines oder mehrerer Exons (11%) Punktmutationen (20%) Nonsense-Mutationen (10%) kl. Insertions-/Deletions-Mutationen (10%) Spleißstellen-Mutationen (3%) Exon fehlt in mRNA Conclusiones DMD / BMD Gendiagnostik komplex - meist definitive Ergebnisse Genanalysen kausale Pathogenese besser verstanden + neue therapeutische Optionen ? Gliedergürtelmuskel-Dystrophien Gliedergürtelmuskel-Dystrophien (LGMD) • progressive Leiden der Skelettmuskeln • initiale Symptome bei Kind / Erwachsenen • initiale Pathologie im Schultergürtel • meist Creatinkinase im Blut • Histologie: Dystrophie der Muskelfasern LGMD - Differentialdiagnose • alle Muskelleiden mit proximaler Komponente – – – – – – neurogene Muskelatrophie metabolische + mitochondriale Myopathien inflammatorische Myopathien myasthenische Syndrome congenitale Strukturmyopathien andere LGMD - Differentialdiagnose -Sarkoglykanopathie Autosomal dominante LGMD Form Chromos. Protein LGMD1A 5q31 Myotilin LGMD1B, ADEDMD... 1q21 Lamin A/C LGMD1C 3p25 Caveolin 3 LGMD1E 7q DNAJB6 LGMD1F 7q32 Transportin 3 LGMD1G 4q21 HNRNPDL LGMD1H 3p23 ? heterogenous nuclear ribonucleoprotein D-like protein {aktualisiert 12.4.2017} Form Chromosom Protein LGMD2A LGMD2B LGMD2C-2F LGMD2G LGMD2H LGMD2I LGMD2J LGMD2K LGMD2L LGMD2M LGMD2N LGMD2O LGMD2P LGMD2Q LGMD2R LGMD2S LGMD2T LGMD2U LGMD2W LGMD2X LGMD2Y LGMD2Z 15q 2p 13q, 17q, 4q, 5q 17q 9q 19q 2q 9q 11p 9q 14q 1p 3p 8q 2q 4q 3p 7p21 2q14 6q21 1q25 3q13 Calpain 3 Dysferlin Sarkoglykans TCAP TRIM32 Fukutin-rel. protein Titin POMT-1 ANO5 FKTN POMT2 POMGNT1 DAG1 Plectin DES TRAPPC11 GMPPB ISPD LIMS2 BVES TOR1AIP1 POGLUT1 {aktualisiert 12.4.2017} 6 J.: 9 J.: • auffälliges Gangbild • Zehengang • Stolpern & Fallneigung • Muskelschwäche Schulter- + Beckengürtel • Kniebeugen unmöglich, Treppensteigen A.D. Labor: Creatinkinase GOT GPT LDH 6360 U/l 138 U/l 156 U/l 1070 U/l Myosonographie & Elektromyogramm: Myopathie Biopsie m. vastus lateralis: HE Immunohistologie Western blot Diagnose: dystrophischer Muskel Muskelfaser schwach pos. für Dys-1, negativ für Dys-2 Dystrophin <5% Morbus Duchenne Molekulargenetik: Deletion im Dystrophin-Gen bis 12 J.: Symptome; 12 J. Gehen, Muskelkraft 17 J.: Stehen Kontrakturen Hüfte, Knie-, Armgelenke Lungenfunktion o.B., CK 617 U/l atypischer M. Duchenne-Verlauf Diagnose-Reevaluation Rebiopsie: • aktiver dystrophischer Prozess • einzelne Fasern negat. für Dys 2-Antikörper • Dys 1- + 3-Antikörper o.B. • α-Sarkoglykanprotein • β-, ɣ-, ẟ-Sarkoglykan o.B. Arg77Cys Tyr134TER Erbliche Muskelerkrankungen - Morbus Duchenne / Becker - Gliedergürtel-Muskeldystrophien - Maligne Hyperthermie Maligne Hyperthermie Maligne Hyperthermie MALIGNANT HYPERTHERMIA, SUSCEPTIBILITY TO, MHS1 (RYR1) MALIGNANT HYPERTHERMIA, SUSCEPTIBILITY TO, MHS2 MALIGNANT HYPERTHERMIA, SUSCEPTIBILITY TO, MHS3 19q13.1 17q11.2-q24 7q21-q22 MALIGNANT HYPERTHERMIA, SUSCEPTIBILITY TO, MHS4 3q13.1 MALIGNANT HYPERTHERMIA, SUSCEPTIBILITY TO, MHS5 (CACNA1S) 1q32 MALIGNANT HYPERTHERMIA, SUSCEPTIBILITY TO, MHS6 5p NATIVE AMERICAN MYOPATHY 4 CONTRACTURES, CONGENIT., TORTICOLLIS, MALIGNANT HYPERTHERMIA 7 RYR1 Gen + Protein Calzium Homer Triadin FKBP12 S1000A1 Calmodulin DHPR LIZ Motive (Phosphorylierung) SPRY Domänen) Mutations hotspots Protein N-Terminus C-Terminus Rigor °C CO2 Laktat RYR1 – Proteinmodell Tiermodelle für MH Central Core Disease (CCD) • congenitale Myopathie • RYR-Mutationen • Mutationsanalyse: 41 Exons • Vererbung - autosomal dominant - selten autosomal rezessiv Interaktion zwischen Dihydropterin-Reduktase (DHPR) und RYR1 zur Ca2+-Freisetzung MembranDepolarisation terminale Zysterne T-Tubulus Central core disease 90% Mutationen im RYR1 Gen… …in den gleichen Bereichen wie bei MH Erbliche Muskelerkrankungen werden zunehmend besser verstanden, aber wann kommt die kausale Therapie für die vielen verschiedenen Ausprägungsformen?