Dystrophin - Ruhr-Universität Bochum

Erbliche Muskelerkrankungen
- Morbus Duchenne / Becker
- Gliedergürtel-Muskeldystrophien
- Maligne Hyperthermie
Dystrophinopathien
Muskeldystrophie Duchenne
Muskeldystrophie Becker
Einschlusskörpermyopathie 2
Einschlusskörpermyopathie 3
Einschlusskörpermyopathie IBMPFD1
Einschlusskörpermyopathie IBMPFD2
Einschlusskörpermyopathie IBMPFD3
Envelopathien/Emery-Dreyfuss-Muskeldystrophien Emerinopathie;
Laminopathie
Gliedergürteldystrophien
Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 1A
Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 1B
Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 1C
Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 1D
Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 1E
Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 1F
Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 1G
Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 1H
Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2A
Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2B
Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2C
Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2D
Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2E
Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2F
Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2G
Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2H
Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2I
Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2J
Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2K
Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2L
Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2M
Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2N
Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2O
Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2P
Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2Q
Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2R
Gliedergürtel-Muskeldystrophie-Typ 2S
Kardiomyopathien (>50 Formen) Dilatative Kardiomyopathie (MYBPC3)
Dilatative Kardiomyopathie (LMNA)
Dilatative Kardiomyopathie (SGCD)
Kongenitale Myasthenien
Kongenitale Myasthenie (MUSK)
Kongenitale Myasthenie (RAPSN)
>6 weitere Formen
Kongenitale Myopathien
Bethlem-Myopathie
Fukuyama-MDC
Muscle-Eye-Brain disease
Walker-Warburg Syndrom
Walker-Walker Syndrom
Kongenitale Muskeldystrophie Typ 1B
Kongenitale Muskeldystrophie Typ 1C
Kongenitale Muskeldystrophie Typ 1D
Myotubuläre Myopathie
Nemaline Myopathie 1
Nemaline Myopathie 2
Nemaline Myopathie 3
Nemaline Myopathie 4
Nemaline Myopathie 5
Nemaline Myopathie 6
Nemaline Myopathie 7
Nemaline Myopathie 8
Ullrich-Myopathie
Myofibrilläre Myopathien
Myofibrilläre Myopathie 1
Myofibrilläre Myopathie 2
Myofibrilläre Myopathie 3
Myofibrilläre Myopathie 4
Myofibrilläre Myopathie 5
Myofibrilläre Myopathie 6
Myotonien/Myot. Dystrophien Kongenitale Muskeldystrophie Typ 1A
Hypokaliämische periodische Paralyse 1
Hypokaliämische periodische Paralyse 2
Myotone Dystrophie 1
Myotone Dystrophie 2
Myotonia congenita Thomsen
Paramyotonia congenita
Proximale myotone Myopathie DM2/PROMM
Myotonia congenita Becker
Struktur-Myopathien
Central-Core-Myopathie
Multiminicore-Myopathie
Maligne Hyperthermie 1-6
Rigid-Spine-Syndrom
Weitere Muskeldystrophien
Fazioskapulohumerale Muskeldystrophie 1
Fazioskapulohumerale Muskeldystrophie 2
Okulopharyngeale Muskeldystrophie
Einschlusskörper-Myopathien
ad
erbliche
Muskelleiden
Pseudohypertrophie
Lordosis,
scapulae
alatae
Gower
Manöver
DMD / BMD:
klinische Aspekte
DMD
BMD
• 1:3500 neugeborene Jungen
• spätes Laufen, im 3.-5. LJ Symptome
• Lebenserwartung 20 Jahre
• progressive Skelettmuskel-Dystrophie
• pseudohypertr. Waden, „Engelsflügel“
•  Creatinkinase im Blut
• Herzmuskel affiziert, EKG!
• 1/3 mentale Retardierung
• glatte Muskulatur, Retina betroffen
• 1:35000 neugeborene Jungen
• mildere Symptome, bes. frühkindl.
• selten spätes Gehen lernen
• >20 J.  Rennen, Treppensteigen
• im mittleren Lebensalter Gehen 
•  Creatinkinase im Blut
• oft Lernprobleme
• fertil
Dystrophin-Protein
DMD / BMD: „Selbstheilung“
durch alternative mRNAs ?
alternative Dystrophin mRNAs:
1. alternative Promotoren
2. alternatives Spleißen
3. alternative Polyadenylierung
Dystrophin-Promotoren + -Isoformen
gesamt
B, Gehirn
M, Muskel
P, Purkinje-Zelle
R, Retina
S, Schwann-Zelle
G, allgemein
Dystrophin + interagierende Proteine
Dp260
Dp140
Exon
ProteinHomologie
Dystrophin
427 kD
ab1
Dp116
ab2
ActinBindung
rod Domänen
ß-Dystroglycan/SyntrophinDp71
Bindung
ab3
ab2
ab1
Dystrophinopathie
Protein (427kD): 0.002 % der Muskelmasse
Therapie DMD: symptomatisch,
 Genersatz-Therapie
modifier Gen-Effekt
Muskeldystrophie Golden Retriever
dystrophischer Zebrafisch
escaper
betroffen
Jagged 1
Überexpression
gesunder Zebrafisch
escaper affiziert
Chromos. 24
Jagged 1
Kandidatenregion
Dystrophinopathie
Stammzell-Therapie
Gentherapie-Strategien
chromosomale DNA
Gen-Ausbesserung
mit Insertions- oder episomalen Vectoren
 cDNA-Expression (µdystrophin or µUTRN)
 zufällige Integration, geringe Transduktions-Effizienz
genomische DNA
prä-mRNA
reife mRNA
Genom-Editieren
mit programmierbaren Nukleasen
 target-spezifische Modifikation
 unerforschte Verabreichungsform, off-target Mutagenese
exon skipping
mit antisense Oligonukleotiden
 systemische Verabreichung
 transiente und Nebeneffekte
„mis-“Translation von Stopcodons
Protein
PTC124  read-through
 systemische Verabreichung
PTC124 (Ataluren) + AON
nonsense Mutationen  Translationsstop
- Therapie: PTC124  read-through
 Stop-Codon wird „fehl“-translatiert
-  Dystrophin-Produktion in Zellkultur
- verbesserte Muskelfunktion im Mausmodell
- klinische Phase I- / II-Studien
Exon-skipping mit AON (antisense-Oligonukleotid)
- klinische Studien fortgeschritten
Vor- und Nachteile viraler Vektoren
bei DMD-Gentherapie
VerpackbarkeitsLimit
GenomIntegration
Retrovirus
∼8 kb
ja
nein
Lentivirus
∼8 kb
ja
ja
Leukämie, Rekombination mit HIV
Herpes
simplex virus
∼150 kb
nein
ja
Zytotoxizität +
Immunogenität
Adenovirus
(Helfer Virusabhängig)
∼30 kb
nein
ja
immunoges virales
Capsid
ja
inhibiert mit
neutralisierendem
Antikörper
Vektor
Adeno-assoz.
Virus (AAV)
∼4 kb
stabile
Expression
nein
Infektion nichtteilungsfähiger
Zellen
major risk in gene
therapy application
Leukämie
targeting vectors
classic targeting vector
BAC targeting vector
Helper-dependent adenovirus targeting vector
AAV targeting vector
DSB-mediated targeting vector
piggyBac targeting vector
single-strand oligonucleotide (ssODN)
DSB: double strand break
BAC: bacterial artificial chromosome
AAV: adeno-associated virus
TR: terminal repeat
ITR: inverted terminal repeat
Vor- und Nachteile von
Genommanipulations-Techniken
programmierbare
Nuklease
DNAErkennungsmotiv
Konstruktherstellung
Sequenztargetability
meganuclease
homing endonuclease LAGLIDADG motifs
sehr kompliziert
↓↓
ZFNs
Zinkfinger-Domänen
kompliziert
↓
TALENs
TAL effector RVD
domain
relativ kompliziert
↑↑
CRISPR-Cas9
crRNA (DNA-RNA
heteroduplex)
„einfach“
↑
ZFNs: Zinkfinger Nukleasen
TALENs: Transcription activator-like effector nucleases
TAL effector RVD: transcription activator–like effector repeat-variable diresidues
CRISPR: clustered regularly interspaced short palindromic repeat
Cas9: CRISPR-associated 9
crRNA: CRISPR RNA
CRISPR-Cas9
CRISPR: clustered regularly interspaced short palindromic repeat
Cas9: CRISPR-associated 9
crRNA: CRISPR RNA
tracrRNA: trans crRNA
sgRNA: single guide RNA
Genetik + induz. pluripot. Stammzellen
Gen knockout
Gen repariert
reprogrammieren
somatische
Zellen
Reporter-Zellen
differenzieren
iPS-Zellen
Zellmarkierung
Tiermodell
differenzierte Zellen
iPS: induzierte pluripotente StammGFP: grünes Fluoreszenz-Protein
Luc: Luciferase
Medikamententests
ex vivo: induzierte pluripotente Stammzellen
iPS Zell-mediierte Therapie
DMD / BMD: Genetik
• X chromosomal rezessiv
• Xp21; 2.3 Mb; 79 Exons
• 14 kb Transcripte; gewebsspezifische Isoformen
• 1/3 Punktmutationen
• 2/3 Deletionen/ Rearrangements/ Insertionen
• 1/3 Neumutationen
DMD / BMD: Deletionen
hotspot für Deletionen
Intron 44
Exon 44
• Deletionen sehr variabel
• DMD: meist Leserahmen • BMD: meist Leserahmen +
Dystrophin-Mutationen
Dystrophin-Genvariationen
Variation
n=
Position
5‘ UTR
Substitution
http://www.dmd.nl/DMD_deldup.html; aktual. 8.11.16
kodierend intron.
3‘UTR
20248
120
4000
15926
202
Deletion
2521
3
635
1668
215
Duplikation
2119
6
213
1541
359
Insertion
465
2
25
434
4
Insertion + Deletion
100
59
41
2 Variationen in 1 Allel
200
komplex + unbekannt
175

25828
2
131
4932
19612
780
DMD / BMD: Punktmutationen
• BMD: meist missense Mutationen im
N-/C-Terminus oder Punktmutationen in
Spleissstellen ohne Leserahmenstörung
• DMD: meist nonsense Mutationen (überall
im Gen verteilt) oder LeserahmenStörung durch Indel etc.
kompensatorische
Proteine 
kompensator.
Mechanismen
+ therapeut.
Strategien
MembranStabilisatoren
DystroglycanGlykosylierung 
kompensator.
Proteine 
Suppression des vorzeitigen
Stopcodons (PTC 124)
AS-Ersatz
normal
Stopkodon
ErsatzProtein
Spleißosom
normales Protein
DMD-Deletion, trunkiert
Exon übersprungen
Spleißen
Exon A
U
1
U
2
Intron 1
Exon A
sf
sf
U
1
Exon B
Exon B
Intron 2
U
2
Exon C
+
Exon C
Intron 1
Intron 2
Sso – mediated splice switching
Exon A
U
1
Exon A
sf
Exon B
Intron 1
sso
Exon C
Mutation
+
Intron 2
Intron 1
sf
Exon B
U
2
sf
Exon C
DMD / BMD Diagnose
DNA-Sequenzanalyse
+ MLPA, in situ Hybridisierung  Deletionen
Proteinanalyse
• Western blot
• Immunohistochemie
RNA-Analyse
• RT-PCR /arrays
• Protein Truncation Test (PTT)  nonsense Mutationen
M. Duchenne/Becker ♀♀




1 : 50 000 000
unsymmetrische X-Inaktivierung
45X
2 Mutationen
 Konduktorin: Cardiomyopathie?
X-Chromosomen Inaktivierung
Zygote
XpXm
XpXm
Xp
Xp
frühe Teilungen
XpXm
Xm
Xm
Xm
Xm
Xp
Xp
zufällige XInaktivierung
Inaktivierungsmuster
wird vererbt an alle
Tochterzellen
Mosaik
t(X;4)(p21;q31)
Chr. 4
der(4)
X-Chr.
der(X)
Deletion / Duplikation +
1. MLPA
Deletion / Duplikation -
DMD
StufenDiagnostik
DMD bestätigt,
dann
- ist Mutter Konduktorin?
- multidisziplinäre Versorgung
- DMD-Register
Mutation +
2. Sequenzieren best. Exons
Mutation φ Dystrophinopathie
3. Dystrophin-Protein, Muskelbiopsie
normales Dystrophin-Protein
φ (normales) Dystrophin-Protein
DMD bestätigt, dann
- multidisziplinäre Versorgung
- optionale RNA-Analyse ?
- DMD-Register
versch. Dystrophin-Mutationen verursachen…
normal
Start Translation
Translationsstop
Dystrophin mRNA wird in Dystrophin protein translatiert
DMD
Leserahmen-Mutation
prämature Translationsstops
Einbau falscher Aminosäuren nach Deletion und prämature Translations-Trunkation
Nonsense-Mutation
prämature Trunkation der Protein-Translation; Leserahmen ok
M. Becker
in frame-Mutation
Translation bis zum natürlichen Stopcodon; intern verkürztes, teil-funktionelles Protein
versch. Dystrophin-Mutationen verursachen…
Deletion eines oder mehrerer Exons (68%)
Duplikation eines oder mehrerer Exons (11%)
Punktmutationen (20%)
Nonsense-Mutationen (10%)
kl. Insertions-/Deletions-Mutationen (10%)
Spleißstellen-Mutationen (3%)
Exon fehlt in mRNA
Conclusiones DMD / BMD
Gendiagnostik komplex
- meist definitive Ergebnisse
Genanalysen  kausale Pathogenese
besser verstanden +
neue therapeutische Optionen ?
Gliedergürtelmuskel-Dystrophien
Gliedergürtelmuskel-Dystrophien
(LGMD)
• progressive Leiden der Skelettmuskeln
• initiale Symptome bei Kind / Erwachsenen
• initiale Pathologie im Schultergürtel
• meist Creatinkinase im Blut
• Histologie: Dystrophie der Muskelfasern
LGMD - Differentialdiagnose
• alle Muskelleiden mit proximaler Komponente
–
–
–
–
–
–
neurogene Muskelatrophie
metabolische + mitochondriale Myopathien
inflammatorische Myopathien
myasthenische Syndrome
congenitale Strukturmyopathien
andere
LGMD - Differentialdiagnose
-Sarkoglykanopathie
Autosomal dominante LGMD
Form
Chromos.
Protein
LGMD1A
5q31
Myotilin
LGMD1B, ADEDMD...
1q21
Lamin A/C
LGMD1C
3p25
Caveolin 3
LGMD1E
7q
DNAJB6
LGMD1F
7q32
Transportin 3
LGMD1G
4q21
HNRNPDL
LGMD1H
3p23
?
heterogenous nuclear ribonucleoprotein D-like protein
{aktualisiert 8.11.2016}
Form
Chromosom
Protein
LGMD2A
LGMD2B
LGMD2C-2F
LGMD2G
LGMD2H
LGMD2I
LGMD2J
LGMD2K
LGMD2L
LGMD2M
LGMD2N
LGMD2O
LGMD2P
LGMD2Q
LGMD2R
LGMD2S
LGMD2T
LGMD2U
LGMD2W
LGMD2X
LGMD2Y
15q
2p
13q, 17q, 4q, 5q
17q
9q
19q
2q
9q
11p
9q
14q
1p
3p
8q
2q
4q
3p
7p21
2q14
6q21
1q25
Calpain 3
Dysferlin
Sarkoglykans
TCAP
TRIM32
Fukutin-rel. protein
Titin
POMT-1
ANO5
FKTN
POMT2
POMGNT1
DAG1
Plectin
DES
TRAPPC11
GMPPB
ISPD
LIMS2
BVES
TOR1AIP1
{aktualisiert 8.11.2016}
6 J.:
9 J.:
• auffälliges Gangbild
• Zehengang
• Stolpern & Fallneigung
•  Muskelschwäche
Schulter- + Beckengürtel
• Kniebeugen unmöglich,
Treppensteigen 
A.D.
Labor:
Creatinkinase
GOT
GPT
LDH
6360 U/l
138 U/l
156 U/l
1070 U/l
Myosonographie & Elektromyogramm: Myopathie
Biopsie m. vastus lateralis:
HE
Immunohistologie
Western blot
 Diagnose:
dystrophischer Muskel
Muskelfaser schwach pos.
für Dys-1, negativ für Dys-2
Dystrophin <5%
Morbus Duchenne
Molekulargenetik:  Deletion im Dystrophin-Gen
bis 12 J.:
 Symptome; 12 J.  Gehen,
Muskelkraft 
17 J.:
 Stehen
Kontrakturen Hüfte, Knie-, Armgelenke
Lungenfunktion o.B., CK 617 U/l
atypischer M. Duchenne-Verlauf
 Diagnose-Reevaluation
Rebiopsie:
• aktiver dystrophischer Prozess
• einzelne Fasern negat. für Dys 2-Antikörper
• Dys 1- + 3-Antikörper o.B.
•  a-Sarkoglykanprotein
• b-, g-, d-Sarkoglykan o.B.
Arg77Cys
Tyr134TER
Erbliche Muskelerkrankungen
- Morbus Duchenne / Becker
- Gliedergürtel-Muskeldystrophien
- Maligne Hyperthermie
Maligne Hyperthermie
Maligne Hyperthermie
MALIGNANT HYPERTHERMIA, SUSCEPTIBILITY TO, MHS1 (RYR1)
MALIGNANT HYPERTHERMIA, SUSCEPTIBILITY TO, MHS2
MALIGNANT HYPERTHERMIA, SUSCEPTIBILITY TO, MHS3
19q13.1
17q11.2-q24
7q21-q22
MALIGNANT HYPERTHERMIA, SUSCEPTIBILITY TO, MHS4
3q13.1
MALIGNANT HYPERTHERMIA, SUSCEPTIBILITY TO, MHS5 (CACNA1S) 1q32
MALIGNANT HYPERTHERMIA, SUSCEPTIBILITY TO, MHS6
5p
NATIVE AMERICAN MYOPATHY 4
CONTRACTURES, CONGENIT., TORTICOLLIS, MALIGNANT HYPERTHERMIA 7
RYR1 Gen + Protein
Calzium
Homer
Triadin
FKBP12
S1000A1
Calmodulin
DHPR
LIZ Motive (Phosphorylierung)
SPRY Domänen)
Mutations hotspots
Protein
N-Terminus
C-Terminus
Rigor
°C
CO2
Laktat
RYR1 – Proteinmodell
Tiermodelle für MH
Central Core Disease (CCD)
• congenitale Myopathie
• RYR-Mutationen
• Mutationsanalyse:
41 Exons
• Vererbung
- autosomal dominant
- selten autosomal
rezessiv
Interaktion zwischen Dihydropterin-Reduktase (DHPR)
und RYR1 zur Ca2+-Freisetzung
MembranDepolarisation
terminale
Zysterne
T-Tubulus
Central core disease
90% Mutationen im RYR1 Gen…
…in den gleichen Bereichen wie bei MH
Erbliche Muskelerkrankungen
werden zunehmend besser verstanden,
aber wann kommt die kausale Therapie
für die vielen verschiedenen
Ausprägungsformen?